DE4129533A1

DE4129533A1 - Mutierter wachstumsfaktorrezeptor als arzneimittel und seine verwendung zur behandlung von krebs

Info

Publication number: DE4129533A1
Application number: DE19914129533
Authority: DE
Inventors: Norbert Redemann; Axel Ullrich
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1991-09-05
Filing date: 1991-09-05
Publication date: 1993-03-11
Also published as: NO940778D0; AU669857B2; MX9205084A; FI941053A0; WO1993005148A1; NZ244239A; AU2518592A; JPH07502884A; EP0667899A1; CA2117073A1; CN1071586A; FI941053A; PT100844A; NO940778L

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft mutierte Wachstumfaktorrezeptoren mit therapeutischen Eigenschaften, Arzneimittel enthaltend mindestens einen mutierten Wachstumsfaktorrezeptor und die Verwendung des bzw. der mutierten Rezeptoren zur Behandlung von Krebs.

Zellwachstum ist ein sorgfältig regulierter Prozeß in Abhängigkeit von den speziellen Bedürfnissen eines Organismus. Bei einem jungen Organismus überwiegt die Zellteilungsrate die Absterberate von Zellen, was zu einer Größenzunahme des Organismus führt. Bei einem ausgewachsenen Organismus sind die Neubildung von Zellen und der Zelltod so ausgewogen, daß ein "Fließgleichgewicht" entsteht. In seltenen Fällen bricht jedoch die Kontrolle der Zellvermehrung zusammen, und die Zellen beginnen zu wachsen und sich zu teilen, obwohl in dem Organismus kein spezieller Bedarf für eine höhere Anzahl von Zellen dieses Typs besteht. Dieses unkontrollierte Zellwachstum ist die Ursache von Krebs. Faktoren, die das unkontrollierte Zellwachstum hervorrufen können, sind oftmals chemischer Natur, können jedoch auch physikalischer Art, wie beispielsweise radioaktive Strahlung, sein.

Zur Therapie von Krebs stehen gegenwärtig im wesentlichen zwei Alternativen zur Verfügung. Entweder es gelingt, die Krebszellen durch einen operativen Eingriff vollständig aus dem erkrankten Organismus zu entfernen, oder es wird versucht, die entarteten Zellen im Organismus unschädlich zu machen, wie beispielsweise durch Verabreichung von Medikamenten oder durch physikalische Therapieverfahren, wie Bestrahlung.

Bei der Chemotherapie werden häufig Medikamente eingesetzt, die in irgendeiner Form in den DNS-Stoffwechsel eingreifen und schnell wachsende Zellen, die eine höhere DNS-Stoffwechselleistung erbringen müssen, stärker schädigen als Zellen, die sich nicht oder nur langsam teilen. Ein schwerwiegender Nachteil vieler Chemotherapien ist jedoch die geringe Spezifität der verwendeten Wirkstoffe, was zur Folge hat, daß auch gesunde Zellen bei der Chemotherapie geschädigt werden. Diese geringe Spezifität der Wirkstoffe fordert weiterhin, daß deren Dosierung jeweils so erfolgen muß, daß möglichst wenig gesunde Zellen bei gleichzeitiger Abtötung der Krebszellen geschädigt werden. Dies ist oftmals nicht möglich, und der krebskranke Patient stirbt aufgrund der sich immer weiter ausbreitenden Krebszellen, die im Endstadium den Ausfall lebenswichtiger Funktionen herbeiführen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines weiteren Wirkstoffs mit wertvollen therapeutischen Eigenschaften, sowie eines Arzneimittels enthaltend den Wirkstoff, wobei der Wirkstoff bzw. das Arzneimittel besonders vorteilhaft sind bei der Behandlung von Krebserkrankungen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch einen mutierten Wachstumsfaktorrezeptor als Arzneimittel, sowie durch ein Arzneimittel enthaltend mindestens einen mutierten Wachstumsfaktorrezeptor.

Gemäß der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß mutierte Wachstumsfaktorrezeptoren wertvolle therapeutische Eigenschaften besitzen, und daß sie insbesondere zur Behandlung von Krebserkrankungen geeignet sind.

Wachstumsfaktorrezeptoren spielen bei der Entstehung und Vermehrung von menschlichen Krebszellen eine entscheidende Rolle. Bei gesunden Zellen sind die Wachstumsfaktorrezeptoren an der Kontrolle des Zellwachstums beteiligt. Das eigentliche Signal zur Zellteilung ist der Wachstumsfaktor, der in Abhängigkeit von den Bedürfnissen des Organismus gebildet wird. Der Rezeptor übernimmt die Funktion der Signalübertragung, d. h. er ist an der Umsetzung des extrazellulären Wachstumssignals in Zellteilungsaktivität im Innern der Zelle beteiligt. Bei vielen Wachstumsfaktorrezeptoren stellt deren Fähigkeit, nach Bindung des Wachstumsfaktors an die extrazelluläre Domäne Phosphatreste an Tyrosinreste in Proteinen zu übertragen, eine entscheidende Rolle dar. Diese Rezeptoren werden auch als Rezeptortyrosinkinasen bezeichnet. Eine Übersicht über Rezeptortyrosinkinasen befindet sich in Yarden, Y. and Ullrich A., Rev. Biochem. 1988, 57, 443-78. Die Dimerisierung dieser Wachstumsfaktorrezeptoren nach Bindung des Wachstumsfaktors ist ein weiterer wichtiger Vorgang bei dem Prozeß der Signalübertragung. Die Umwandlung eines extrazellulären Signals in ein intrazelluläres Signal unter Vermittlung von Wachstumsfaktorrezeptoren mit Tyrosinkinaseaktivität läßt sich in die folgenden fünf Stufen zerlegen:
1. Die Bindung des Wachstumsfaktors (auch als Ligand bezeichnet) an die extrazelluläre Domäne des Rezeptors induziert eine Konformationsänderung; diese bewirkt
2. Dimerisierung von Rezeptoren mit veränderter Konformation; mit
3. gleichzeitiger Induktion einer allosterischen Änderung der zytoplasmatischen Domäne, durch die wiederum die Kinaseaktivität induziert wird;
4. Transphosphorylierung von Tyrosinresten in dem Rezeptordimer, die wiederum eine aktivierte Rezeptorkonformation erzeugt und stabilisiert; und
5. Phosphorylierung von Polypeptidsubstraten und Wechselwirkung mit zellulären Faktoren.

Eine Überfunktion dieser Signalübertragungskette kann zu einer überhöhten Teilungsaktivität der entsprechenden Zelle führen und im Extremfall zu einer entarteten Krebszelle. Eine Übersicht über Wachstumsfaktorrezeptoren und deren Funktion bei der Signalübertragung von dem extrazellulären in das intrazelluläre Milieu, sowie der mögliche Einfluß mutierter Rezeptoren auf die Krebsentstehung ist in Ullrich, A. und Schlessinger, J. (1990) Cell 61, 203-212 gegeben.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die oben erläuterte fünfstufige Signalübertragungskette durch einen mutierten Wachstumsfaktorrezeptor blockiert bzw. gehemmt werden kann, wenn die mutierten Rezeptoren gemeinsam mit den Wildtyprezeptoren von einer Zelle exprimiert werden. Somit eignen sich mutierte Wachstumsfaktorrezeptoren als Arzneimittel, mit denen Krankheiten therapiert werden können, die im Zusammenhang mit einer gesteigerten Übertragung von Wachstumssignalen in das Zellinnere durch entsprechende Rezeptoren stehen.

Eine bevorzugte Rezeptormutante besitzt die Tyrosinkinaseaktivität des Wildtyprezeptors nicht mehr. Diese Mutante ist nicht mehr in der Lage, nach Ligandenbindung Tyrosinreste in dem Rezeptordimer oder in Polypeptidsubstraten zu phosphorylieren. Somit ist die Umsetzung des extrazellulären Wachstumssignals in ein intrazelluläres Signal blockiert bzw. teilweise gehemmt.

Bereits eine Punktmutation in dem Wildtyprezeptor kann ausreichen, daß der Wildtyp-Rezeptor nicht mehr funktionsfähig ist, wenn er durch die Punktmutation die Tyrosinkinaseaktivität verloren hat. Eine solche Punktmutante ist als Arzneimittel bevorzugt.

Weiterhin bevorzugt ist ein mutierter Rezeptor, der eine Deletion in der Tyrosinkinasedomäne trägt, die zu einem Verlust der Tyrosinkinaseaktivität führt.

Es ist bevorzugt, daß der durch eine Deletion in der zytoplasmatischen Domäne mutierte Rezeptor die Transmembranregion jedoch noch enthält. Mutierte Rezeptoren mit vorhandener Transmembranregion führen zu einer wirkungsvolleren Hemmung der Wachstumssignalübertragung und zeigen somit bessere therapeutische Wirkung als Rezeptoren ohne Transmembranregion, wie beispielsweise Mutanten, die nur aus den extrazellulären Domänen bestehen.

Besonders geeignet als Arzneimittel sind Mutanten der Rezeptortyrosinkinasen, wie beispielsweise der EGF-, PDGF- oder NGF-Rezeptoren.

Ganz besonders geeignet ist ein mutierter Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF).

Bei einer besonders bevorzugten Mutante des EGF-Rezeptors befindet sich an der Aminosäureposition 721 der Wildtyp-Rezeptorsequenz, eine Punktmutation. Bei einer bevorzugten Mutante ist der Lysinrest an Position 721 durch einen Alaninrest in der Mutante ersetzt. Diese Mutante ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH nach dem Budapester Vertrag hinterlegt unter DSM 6678. Bei einer weiteren bevorzugten EGF-Rezeptormutante sind die 533 C-terminalen Aminosäuren des Wildtyp-Rezeptors deletiert. Diese Mutante ist hinterlegt unter DSM 6679.

Die Rezeptormutanten sind nach den üblichen gentechnologischen Verfahren, wie beispielsweise in Sambrook, J. et al (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press beschrieben, ausgehend von den Wildtyp-Rezeptoren herstellbar.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel enthält mindestens einen der oben beschriebenen mutierten Wachstumsfaktorrezeptoren und die üblichen Hilfs- und Trägerstoffe.

Besonders bevorzugt ist ein Arzneimittel, das den bzw. die Rezeptormutanten in Liposomen verpackt enthält. Um die Liposomen selektiv an das Zielgewebe, zu bringen, ist es vorteilhaft, wenn die Liposomen Antikörper in ihrer Membran enthalten, wobei die Antikörper spezifische Epitope der Zielzellen erkennen und selektiv an diese binden. Somit gelangen die Rezeptormutanten selektiv zu dem Zielgewebe und können dort ihre erwünschte Wirkung entfalten.

Weiterhin bevorzugt ist ein Arzneimittel, das den bzw. die Rezeptoren in Form von einem bzw. mehreren rekombinanten retroviralen Vektoren enthält. Die rekombinanten Vektoren enthalten Nukleinsäurefragmente, die für den bzw. die Rezeptoren codieren. Nach Verabreichung des Arzneimittels an den Patienten infizieren die Retroviren die Zielzelle und führen in dieser zur Expression der Rezeptormutanten. Die Verabreichung von in Liposomen verpackten Wirkstoffen ist heute eine gängige Verabreichungsform.

Ein besonders bevorzugtes Arzneimittel enthält die für EGF-Rezeptormutanten codierenden retroviralen Vektoren pNTK-HER-K721A und/oder pNTK-HERCD-533, die hinterlegt sind bei der DSM unter DSM 6678 bzw. DSM 6679.

Die oben beschriebenen mutierten Rezeptoren bzw. die diese enthaltenden Arzneimittel sind besonders geeignet zur Behandlung von Krebs. Dabei sind solche Krebsarten besonders gut therapierbar, die Folge einer Überfunktion von Wachstumsfaktorrezeptoren sind. Zu diesen Krebsarten zählen insbesondere Brust-, Ovarien- und Lungenkarzinome. Die Rolle von Oberflächenrezeptoren bei diesen Krebserkrankungen werden ausführlich beschrieben in Slamon, D.J. et al (1987), Science, 235, 177-182 und (1989) Science, 244, 707-712 sowie in Kern, J.A. et al (1990), Cancer Res., 50, 5184-5191.

Ohne an eine bestimmte Therorie gebunden zu sein nimmt man an, daß die beschriebenen Rezeptormutanten ihre Wirkung in den Zielzellen entfalten, indem die Mutanten neben dem Wildtyp-Rezeptor in die Membran der Zielzellen eingebaut werden, und die Rezeptormutante dann die Funktion des Wildtyp-Rezeptors beeinträchtigt.

Anhand von Mutanten des EGF-Rezeptors als Modell wird die vorliegende Erfindung näher erläutert.

Der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGF-Rezeptor), beschrieben in Ullrich, A. et al (1984), Nature, 309, 418-425, ist ein 170 kD Glycoprotein mit Tyrosinkinaseaktivität. Die molekularen Vorgängen bei der Bindung des Liganden bis hin zu der Stimulierung der Kinaseaktivität sind ausführlich beschrieben in Ullrich, A. und Schlessinger, J. (1990), Cell, 61, 203 bis 212. Während EGF normalerweise eine mitogene Antwort in Fibroplasten hervorruft, führt eine Überfunktion der Signalübertragung durch den EGF-Rezeptor durch überexprimierte Rezeptoren zu einer liganden-abhängigen Transformation von NIH 3T3 Mauszellen, wie beschrieben in Riedel, H. et al (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 1477-1481 und in Di Fiore, P. P. et al (1987) Cell, 51, 1063-1070. Intensive klinische Untersuchungen stützen die Funktion dieses Rezeptors in der Ausbildung verschiedener Karzinome, wie Brust-, Ovarien- und Lungenzellkarzinomen, wie beschrieben in Slamon, D.J. et al (1987), Science, 235, 177-182 und (1989) Science, 244, 707-712 und in Kern J.A. et al (1990), Cancer Res., 50, 5184-5191.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die Expression von EGF-Rezeptormutanten, die keine Tyrosinkinaseaktivität mehr besitzen, in transformierten Krebszellen, die den EGF-Wildtyp-Rezepter exprimieren, den transformierten Phänotyp rückgängig machen kann.

Material und Methoden Herstellen von rekombinanten Retroviren

Die retroviralen Expressionsvektoren pN2, pNTK2 und pNTK-HERc sind ausführlich beschrieben in Keller, G. et al, (1985), Nature, 318, 149-154; Stewart, C.L. et al, (1987) EMBO J., 6, 383-388; von Rüden, T. und Wagner, E.F. (1988), EMBO J., 7, 2749-2756. pNTK-HER-K 721A wurde hergestellt durch Klonieren eines Bgl II-Fragments von CMVHER-K721A in pNTK-HERc. pNTK-HERCD-533 wurde hergestellt durch Erzeugen einer ClaI-Stelle an beiden Seiten des 2 kb großen Fragments XbaI/XhoI von pLSXNA 8, beschrieben in Livneh, E. et al, J. Biol. Chem, 260, 12490-12497, mittels üblicher Klonierungsverfahren, wie beschrieben in Sambrook, J. et al (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, und anschließend wurde das 2 kb ClaI Fragment mit ClaI gespaltenem pNTK2 ligiert. Das NTK-HERCD-566 Konstrukt wurde hergestellt durch Klonieren eines ClaI Fragments von CVNHERXCD in die ClaI-Stelle von pNTK2. Das Konstrukt ist hinterlegt unter DSM 6680. Ecotrophe rekombinante Retroviren wurden hergestellt aus der Helfervirus-freien Produzentenlinie GP+E-86, beschrieben in Markowitz D. (1988) J. Virol., 62, 1120-1124. Stabile GP+E-86 Produzentenlinien wurden erzeugt mittels eines modifizierten Infektionsprotokolls, wie beschrieben in Miller, A.D. und Buttimore, C. (1986) Mol. Cell. Biol., 6, 2895-2902. Amphotrophes Virus mit niedrigem Titer wurde hergestellt durch transiente Transfektion von retroviralen Expressionsplasmiden in die Helfervirus-freie Verpackungszellinie PA317, beschrieben in Miller, A.D. et al (1985) Mol. Cell. Biol., 5, 431-437, und wurde verwendet, um sekundäre Verpackungszellen GP+E-86 zu infizieren, gefolgt von einer Selektion von Klonen der Produzentenlinie GP+E-86 in G418 (1 mg/ml). Der Virustiter wurde bestimmt durch Infizieren von NIH 3T3-Zellen mit Verdünnungsreihen von Retrovirus, die zellfreie GP+E-86 Überstände enthielten, und Bestimmung der Anzahl der G418 resistenten Kolonien. Ein Retrovirus (ψ2TGFα), das das Gen für den Turmorwachstumsfaktor α (TGFα) enthält, ist beschrieben in Blasband, A. J. (1990), Oncogene, 5, 1213-1221.

Gen-Transfer mittels Retroviren

Subkonfluente NIH 3T3-Zellen (10⁵ Zellen/6 cm-Platte) wurden mit Überständen von GP+E-86 Zellen, die hohe Titer an NTK-HERc Vitus freisetzen (5·10⁵ G418® koloniebildende Einheiten pro ml), für 4 bis 12 Stunden in Anwesenheit von 4 µg/ml Polybrene (Aldrich) inkubiert und anschließend in Überstand von GP+E-86 Zellen, die hohe Titer an entweder N2, NTK-HERK721A, NTK-HERCD-533 oder NTK-HERCD-566 Viren freisetzen. Der Expressionsspiegel der Rezeptoren wurde gesteigert durch mehrere Infektionsrunden, wie beschrieben in Bordignon, C. et al (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6748-6752. In den beschriebenen Experimenten wurde die Infektion einmal ausgeführt mit 1 ml eines verdünnten Überstands (1,25·10⁵ koloniebildende Einheiten) oder 1 bis 4 mal mit dem gleichen Volumen unverdünnten Überstands (5·10⁵ koloniebildende Einheiten) von GP+E-86 Zellen, die hohe Titer von entweder N2, NTK-HERK721A, NTK-HERCD-533 oder NTK-HERCD-566 Viren freisetzen.

Rezeptorphosphorylierung in intakten Zellen

Die wie oben infizierten Zellen wurden in 10 cm-Platten bis zu 90%iger Konfluenz kultiviert, gewaschen und für 16 Stunden in methioninfreiem DMEM (Gibco), ergänzt mit 1% FCS enthaltend 50 µCi/ml³⁵S-Methionin (Amersham), kultiviert. Die Zellen wurden für 10 min mit 20 ng/ml EGF (Amgen Corp.) stimuliert und in 0,5 ml Lysepuffer (50 mM Hepes pH 7,2, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 10% Glyerzin, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 10 mg/ml Aprotinin, 100 µM Natriumorthovanadat) bei 4°C lysiert. Die Lysate wurden in einer Eppendorf-Zentrifuge bei rund 12 000 g für 10 min bei 4° C zentrifugiert. Die Überstände wurden dann mit einem Überschuß an monoklonalem Antikörper 108.1, beschrieben in Honegger, A.M.,Ullrich, A. and Schlessinger, J. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 86, S. 925-929, und Protein A-Sepharose für 4 Stunden bei 4°C inkubiert. Immunpräzipitate wurden zweimal mit HNTG (20 mM Hepes pH 7,3, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 und 10% Glyzerin) gewaschen. Das Pellet wurde in Probepuffer resuspendiert, für 5 min gekocht und anhand von SDS-PAGE (7,5%) analysiert. Die Proteine wurden elektrophoretisch auf Nitrozellulose übertragen und anschließend mit einem monoklonalen Mausantikörper gegen Phosphotyrosin (5 E2), beschrieben in Fendly, B.M. et al (1990) Cancer Research, 50, 1550-1558, inkubiert. Zum Nachweis wurde der Nitrozellulosefilter mit einem Peroxidase-gekoppelten Ziege-Anti-Maus-Antikörper inkubiert, gefolgt von einer ECL-Substrat-Reaktion (Amersham). Nach der Dtektion der ECL-Substratreaktion mit Kodak X-Omat-Film wurden die Nitrozellulosefilter mit PBS, enthaltend 0,2% Tween20, gewaschen. Anschließend wurden die ³⁵S-Methionin-markierten Proteine mittels Autoradiographie nachgewiesen. Die Dichte der Banden wurde durch Densitometrie ermittelt.

[³H]-Thymidin-Einbau

Subkonfluente NIH 3T3 Zellen (10⁵ Zellen/6 cm-Platte) wurden wie beschrieben koinfiziert mit NTK-HERc, gefolgt von 4 Infektionsrunden mit entweder N2, NTK-HERK721A, NTK-HERCD-533 oder NTK-HERCD-566. Die Zellen wurden aufgeteilt auf 12-Loch Costarplatten. Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zellmonolayer für 24 Stunden in 0,5 ml DMEM, 0,5% FCS ausgehungert, und 18 Stunden nach EGF-Zusatz wurden die Zellen mit 0,5 µCi Methyl-[³H] -thymidin (Amersham) für 4 Stunden markiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und anschließend mit 10% TCA für 1 Stunde auf Eis präzipitiert. Das Präzipitat wurde mit 10% TCA gewaschen und in 200 µl 0,2 N NaOH/0,2% SDS wieder aufgelöst. Die Lysate wurden neutralisiert, und die eingebaute Radioaktivität durch Scintillationszählung quantitativ bestimmt.

Transformations-Tests

Um die Fähigkeit von NIH 3T3 Zellen zur Koloniebildung in Weichagar zu untersuchen, wurden subkonfluente NIH 3T3 Zellen (10⁵ Zellen /6cm-Platte) mit NTK-HERC, gefolgt von 4 Runden der Infektion mit entweder N2, NTK-HERK721A, NTK-HERCD-533, oder NTK-HERCD-566 infiziert. In den Fällen, in denen eine autokrine Stimulierung zu erzeugen war, wurden die Zellen infiziert mit ψ 2TGFα-Virus (5·10⁴ G418® koloniebildende Einheiten pro ml). NIH 3T3 Zellen (10⁵) wurden in 6 cm-Platten ausplattiert in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 10 ng/ml EGF in 3 ml Medium zum Überschichten (top layer) aus MEM, enthaltend 10% FCS und 0,2% Agar (Gibco). Die Bodenschicht enthielt MEM, 10% FCS und 0,4% Agar. Sichtbare Kolonien wurden nach 4 Wochen gezählt.

Für Focibildungstests wurden subkonfluente NIH 3T3 Zellen (10⁵ Zellen/6cm-Platte) koinfiziert mit NTK-HERc (1·10⁴ G418® koloniebildende Einheiten pro ml), gefolgt von 4 Runden der Infektion mit entweder N2, NTK-HERK721A, NTK-HERCD-533, oder NTK-HERCD-566 Viren. In einigen Experimenten wurden die Zellen superinfiziert mit ψ-2TGFα-Virus (1·10³ G418® koloniebildende Einheiten pro ml). Infizierte Zellen wurden auf 6cm-Platten mit DMEM, enthaltend 4% FCS, in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 10 ng/ml EGF kultiviert. Das Medium wurde alle 3 Tage gewechselt. Die Platten wurden mit Kristallviolett angefärbt und die Foci wurden am Tag 18 gezählt.

Legenden zu den Figuren

Fig. 1: Schematische Darstellung des menschlichen EGF-Wildtyp-Rezeptors und mutierte EGF-Rezeptoren. Die Lage von cysteinreichen Domänen (cys), der Tyrosinkinase (TK)- und der Transmembran(TM)-Domäne sind angegeben. Die Mutante HERK721A trägt eine Punktmutation an Position 721 (ein Austausch von Lysin gegen Alanin), während HERCD 533 und HERCD-566 C-terminale Deletionen von 533 bzw. 566 Aminosäuren tragen. Die Mutanten sind ausführlich beschrieben in Livneh, E., et al (1986) J. Biol. Chem., 260, 12490-12497 und Honegger, A.M., et al (1987) Cell, 51, 199-209.

Fig. 2 (A): Tyrosinphosphorylierung des Wildtyp- und mutierten EGF-Rezeptors. Zellen, die entweder den Wildtyp-Rezeptor alleine oder den Wildtyp-Rezeptor und mutierte Rezeptoren coexprimieren, wurden übernacht mit [³⁵S]-Methionin markiert und anschließend in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 2 ng/ml EGF für 10 min inkubiert. Die Zellen wurden in Lösung gebracht und mit Anti-EGF-Rezeptor-Antikörper (mAb 108) präzipitiert, durch SDS-PAGE getrennt und immunologisch mit Anti-Phosphotyrosin-Antikörpern (5E2) analysiert, gefolgt von einer ECL-Substratreaktion.

(B): Expression des EGF-Rezeptors auf NIH 3T3 Zellen. Zellen, die entweder den Wildtyp-Rezeptor alleine oder den Wildtyp-Rezeptor und mutierte Rezeptoren coexprimieren, wurden übernacht mit [³⁵S]-Methionin markiert und anschließend in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 20 ng/ml EGF für 10 min inkubiert. Die Zellen wurden in Lösung gebracht und mit Anti-EGF-Rezeptor-Antikörper (mAb108) präzipitiert, getrennt mit Hilfe von SDS-PAGE und immunologisch mit einem Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (5E2) nachgewiesen, gefolgt von einer ECL-Substrat-Reaktion. Das ECL-Substrat wurde abgewaschen mit PBS, enthaltend 0,2% Tween 20, und die [³⁵S]-Methionin-markierten Proteine wurden durch Autoradiographie nachgewiesen.

Fig. 3: EGF-simulierter [³H]-Thymidin-Einbau. In Zellen, die entweder den Wildtyp-Rezeptor alleine (gestrichelte Linie) oder Wildtyp-Rezeptor und mutierte Rezeptoren coexprimierten, wie in A: Wildtyp-EGF-Rezeptor + K721A, B: Wildtyp EGF-Rezeptor +CD-533, C: Wildtyp EGF-Rezeptor + CD-566 wurden in 12-Loch Costarplatten bis zur Konfluenz kultiviert und für 2 Tage in DMEM, enthaltend 0,5% FCS, ausgehungert. 10% FCS oder verschiedene EGF-Konzentrationen wurden zugesetzt und 18 Stunden nach dem EGF-Zusatz wurde [³H]-Thymidin (0,5 µCi/ Loch) für 4 Stunden zugesetzt, und dessen Einbau in DNA wurde bestimmt. Die mitogene Antwort wurde aufgezeichnet, um die Beziehung zwischen Dosis und Antwort aufzuzeigen. Die Werte wurden um den basalen Thymigin-Einbau korrigiert, und die maximal beobachtete Antwort auf EGF wurde als 100% definiert. Die ausgefüll ten Dreiecke geben den halbmaximalen Thymidin-Einbau an.

Ergebnisse

Zellen, die den Wildtyp-Rezeptor alleine oder zusammen mit den mutierten Rezeptoren exprimieren, wurden mit [³⁵S]-Methionin markiert, inkubiert in der Anwesenheit oder Abwesenheit von EGF für 10 min, lysiert und immunpräzipitiert mit einem Maus-Antikörper gegen humanen EGF-Rezeptor (mAb108). Die Proben wurden mit SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulosefilter übertragen, und die Tyrosinphosphorylierung wurde nachgewiesen mit Hilfe des phosphotyrosinspezifischen Mausantikörpers 5E2 (Fig. 2A). Die Menge des in dem Immunpräzipitat vorhandenen Rezeptors wurde durch Autoradiographie desselben Nitrozellulosefilters nachgewiesen (Fig. 2B).

Wie in Fig. 2A, Spuren b und c, gezeigt, induziert der EGF-Zusatz zu intakten NIH 3T3 Zellen, die mit dem Virus, enthaltend den Wildtyp EGF-Rezeptor, infiziert sind, eine starke Tyrosinphosphorylierung der 170 kD EGF-Rezeptorbande. Durch Phosphorylierung nimmt die Wanderungsgeschwindigkeit des EGF-Rezeptors in der SDS-PAGE, verglichen mit dem unphosphorylierten EGF-Rezeptor, ab, wie ersichtlich aus Fig. 2B, Spuren b und c. Der Spiegel der EGF-stimulierten Phosphorylierung des Wildtyp-Rezeptors wurde nicht verringert durch die Coexpression der löslichen extrazellulären Domäne des EGF-Rezeptors, wie durch das NTK-HERCD-566 Virus Genom codiert, selbst wenn die extrazelluläre Domäne in 4fachem Überschuß zu dem Wildtyp-Rezeptor exprimiert wurde (Fig. 2A, Spuren d bis f; Fig. 2B, Spuren d bis f).

Im Gegenteil, in einem analogen Experiment, bei dem ein Virus, das die membranständige EGF-Rezeptor-Deletionsmutante HERCD-533 (Fig. 1) exprimiert, verwendet wurde, erfolgte eine starke dosisabhängige Hemmung der EGF-induzierten Phosphorylierung des Wildtyp-EGF-Rezeptors (Fig. 2A, Spuren g bis i), obwohl der Spiegel des 170 kD EGF-Rezeptorproteins konstant blieb (Fig. 2B, Spuren g bis i). Die Intensität der Tyrosin-phosphorylierten Banden nahm von 100% auf 71% bzw. 30% ab. Unter diesen Bedingungen zeigte der EGF-Rezeptor die gleichen elektrophoretischen Eigenschaften wie ein nicht-phosphorylierter Rezeptor (Fig. 2B, Spur i), was in Übereinstimmung mit seinem Zustand der Tyrosinphosphorylierung, nachgewiesen durch mAb 5E2 (Fig. 2A, Spur i), ist.

Wenn der Wildtyp-Rezeptor mit der kinasenegativen Mutante HERK721A coexprimiert wurde, wurde eine gesteigerte Tyrosinphosphorylierung der 120 kD-Bande nachgewiesen (Fig. 2A, Spuren k bis m). Die Intensität des Signals der Tyrosinphosphorilierung des Rezeptors wuchs von 251% auf 337% bzw. 450% an, gemäß der densitometrischen Analyse der Autoradiographien. Da der Wildtyp-Rezeptor und die Kinase-negative Mutante von gleicher Größe sind, stellt das erhöhte 170 kD-Signal in Fig. 2B, Spuren k bis m, die Summe der Phosphorylierung beider Rezeptoren dar, da der mutierte Rezeptor durch den Wildtyp-Rezeptor transphoryliert werden kann.

Hemmung der EGF-induzierten Zellteilungsrate

EGF stimuliert die Zellteilung in NIH 3T3 Fibroblasten, die den EGF-Rezeptor exprimieren, wie beschrieben in Riedel, H. et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 1477-1481 und Prywes, R. et al (1986) EMBO J., 5, 2179- 2190. Der Einfluß von mutierten Rezeptoren auf die von dem EGF-Wildtyp-Rezeptor kontrollierte Zellteilung wurde anhand der Induktion der DNA-Synthese bestimmt.

Die DNA-Synthese wurde in Zellen, die mit dem NTK-HERc Virus und der N2-Virus-Kontrolle infiziert waren, als [³H]-Thymidin-Einbau bestimmt,und die Synthese war maxi mal stimuliert bei 2 ng/ml EGF, mit einer halbmaximalen Stimulierung (ED₅₀) bei 0,66 ng/ml (Fig. 3). Ähnlich zu früheren Ergebnissen, wie beschrieben in Honegger, A.M. et al (1988) EMBO J., 7, 3045-3052, und Riedel, H., et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 1477-1481, führten höhere EGF-Konzentrationen zu niedrigeren Spiegeln des [³H]-Thymidin-Einbaus, wie in Fig. 3 angezeigt. Die Coexpression des EGF-Rezeptors mit HERCD-533 und HERK721A führte nach vier Runden der Infektion mit den entsprechenden Viren zu einer deutlichen Verschiebung der dosisabhängigen Kurve zu höheren EGF-Konzentrationen hin (Fig. 3A und B). Dies zeigt an, daß die Zellen weniger empfindlich gegenüber dem Wachstumsfaktor geworden sind, verglichen mit HERc/N2-Zellen. Sowohl die Deletionsmutante HERCD-533 wie auch die Punktmutante HERK721A (Fig. 1) zeigten ähnliche Effekte auf das von dem EGF-Wildtyp-Rezeptor vermittelte Zellteilungssignal und verursachten eine zehnfache Zunahme der ED₅₀ auf 6,6 ng/ml EGF. Im Gegensatz dazu hatte die Superinfektion mit NTK-HERCD-566 Virus keinen signifikanten Effekt auf die von dem Wildtyp-Rezeptor stimulierte DNA-Synthese durch EGF (Fig. 3C).

Antionkogene Aktivität der EGF-Rezeptormutanten

Es ist bekannt, daß die Überexpression des EGF-Rezeptors eine EGF-abhängige Zelltransformation von NIH 3T3 Zellen verursacht,wie beschrieben in Di Fiore,P.P. et al (1987), Cell, 51, 1066-1070, Velu, T.J. et al (1987), Science, 237, 1408-1410 und Riedel, H. et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 1477-1481. Um zu untersuchen, ob das transformierende Potential von überexprimiertem EGF-Rezeptor gehemmt werden kann durch EGF-Rezeptormutanten, wurde EGF-Rezeptor coexprimiert mit Rezeptormutanten, und anschließend wurde ihre Fähigkeit, Kolonien in Weichagar oder Foci in einer Monolayer-Zellkultur zu erzeugen, untersucht. Die Stimulation von überexprimiertem EGF-Rezeptor wurde entweder durch EGF-Zusatz zu dem Medium erzielt, oder durch Infektion mit einem Virus (ψ2TGFα), das eine TGF-α DNA trägt, um ein autokrines Aktivierungssystem zu erzeugen (Tabelle; 1 durchschnittliche Werte aus vier Experimenten sind gezeigt).

Nach Infektion mit dem NTK-HERc Virus und der N2-Kontrolle bildeten NIH 3T3 Zellen ungefähr 250 Kolonien in Weich-Agar in der Anwesenheit von 10 ng/ml EGF. Durch Coinfektion mit ψ2TGFα-Virus wurde die Bildung von 148 Kolonien unter ansonsten identischen Bedingungen (Tabelle 1) erzielt. Jedoch wenn die mit dem EGF-Rezeptor infizierten Zellen mit entweder NTK-HER-K721A oder NTK-HERCD-533 Viren superinfiziert wurden, wurde die koloniebildende Kapazität fast vollständig unterdrückt. Die Coexpression des EGF-Rezeptors mit der extrazellulären Domäne HERCD-566 reduzierte die koloniebildende Fähigkeit um ungefähr 50% bei Stimulation mit 10 ng/ml EGF in der Agar-Schicht, und um ungefähr 33% bei Stimulation durch das autokrine TGF nach Infektion mit ψ2TGFα-Virus.

Auf ähnliche Weise wurde das Fokus-bildende Potential des NTK-HERc-Virus in NIH 3T3 Monolayer-Kulturen bestimmt, entweder in der Anwesenheit von 10 ng/ml EGF, was zu 920 Foci pro 10⁶ Viren führte, oder nach Coinfektion mit ψ2TGFα-Virus, was zu 480 Foci pro 10⁶ NTK-HERC Viren führte. Superinfektion mit NTK-HERK721A oder NTK-HERCD-533 Viren unterdrückte die Anzahl der Foci um 100% bzw. 90%, wenn die Stimulation mit EGF erfolgte, und um 75% bzw. 71% bei Stimulation mit dem ψ2TGFα-Virus (Tabelle 2).

Zellen, die den EGF-Wildtyp-Rezeptor und HERCD566 coexprimierten, zeigten die gleiche Anzahl an Foci wie Zellen, die den EGF-Rezeptor exprimierten und mit dem Kontrollvirus N2 infiziert waren. Dieses Ergebnis wurde sowohl bei der Stimulation mit EGF wie auch mit dem ψ2TGFα Virus beobachtet.

Aus den obigen Ausführungen ist ersichtlich, daß die EGF-Rezeptormutanten sowohl ein deutliches antiproliferatives wie auch antionkogenes Potential besitzen und somit hervorragend für die Behandlung von Krebs geeignet sind.

Tabelle 1

Koloniebildung in Weichagar

Die Kolonien wurden nach 4 Wochen gezählt. Die Werte stellen Durchschnittswerte aus vier unabhängigen Experimenten dar. CFU bedeutet Kolonie-bildende Einheiten.

Tabelle 2

NIH 3T3 Focusbildung

Die Foci wurden nach 14-16 Tagen gezählt. Die Werte stellen Durchschnittswerte aus vier unabhängigen Experimenten dar. CFU bedeutet Kolonie-bildende Einheiten.

Claims

1. Mutierter Wachstumsfaktorrezeptor als Arzneimittel.

2. Mutierter Rezeptor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er die Tyrosinkinaseaktivität des Wildtyp-Rezeptors nicht mehr besitzt.

3. Mutierter Rezeptor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Punktmutante des Wildtyp-Rezeptors ist.

4. Mutierter Rezeptor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Deletion in der Tyrosinkinasedomäne trägt.

5. Mutierter Rezeptor nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zytoplasmatische Domäne deletiert, die Transmembranregion jedoch vorhanden ist.

6. Mutierter Rezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß er eine mutierte Rezeptortyrosinkinase ist.

7. Mutierter Rezeptor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er ein mutierter EGF-Rezeptor ist.

8. Mutierter Rezeptor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er an der Aminosäureposition 721 der Wildtyp-Rezeptorsequenz eine Punktmutation trägt.

9. Mutierter Rezeptor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er an Position 721 einen Alanin-Rest besitzt.

10. Mutierter Rezeptor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die 533 C-terminalen Aminosäuren des Wildtyp-Rezeptors deletiert sind.

11. Arzneimittel enthaltend mindestens einen mutierten Wachstumsfaktorrezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und übliche Hilfs- und Trägerstoffe.

12. Arzneimittel nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es den bzw. die Rezeptoren in Liposomen verpackt enthält.

13. Arzneimittel nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß es den bzw. die Rezeptoren in Form von einem bzw. mehreren rekombinanten retroviralen Vektoren, die für den bzw. die Rezeptoren codierende Nukleinsäurefragmente tragen, enthält.

14. Arzneimittel nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es die retroviralen Vektoren pNTK-HER-K721A und/oder pNTK-HERCD-533, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter DSM 6678 bzw. DSM 6679, enthält.

15. Arzneimittel nach mindestens einem der Ansprüche 11 bis 14 zur Behandlung von Krebs.

16. Verwendung des mutierten Rezeptors nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Behandlung von Krebs.

17. Verwendung nach Anspruch 16 zur Behandlung von Krebsarten, die Folge einer Überfunktion von Wachstumsfaktorrezeptoren sind.

18. Verwendung nach Anspruch 17 zur Behandlung von Brust-, Ovarien- und/oder Lungenkarzinomen.