DE3850878T2

DE3850878T2 - Elastase-inhibierungspolypeptide und verfahren zur herstellung durch genetische rekombination.

Info

Publication number: DE3850878T2
Application number: DE3850878T
Authority: DE
Inventors: Takashi Kamimura; Kenichi Masuda; Eiko Ohtsuka; Masahiro Okada; Takashi Sugiyama
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1987-12-28
Filing date: 1988-12-28
Publication date: 1994-11-10
Anticipated expiration: 2008-12-29
Also published as: DE3850878D1; KR910007573B1; JP2574048B2; ATE109156T1; KR900700500A; WO1989006239A1; CA1340877C; ES2015366A6; EP0346500A4; EP0346500A1; EP0346500B1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Elastase-inhibierendes Polypeptid und ein für dessen Herstellung geeignetes verschmolzenes Protein sowie ein Verfahren zur Herstellung des Elastaseinhibierenden Polypeptids aus diesem verschmolzenen Protein. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein zur Herstellung des verschmolzenen Proteins verwendetes Gen für ein verschmolzenes Protein, ein Plasmid zur Expression, und einen dieses tragenden Mikroorganismus.

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK

Fortschritte in der DNA-Rekombinationstechnik haben die Herstellung von klinisch oder wirtschaftlich wertvollen Proteinen (im folgenden als gewünschtes Protein bezeichnet) in Zellen von Mikroorganismen ermöglicht. Wenn solche Proteine unter Verwendung von Zellen von Mikroorganismen als Wirtszellen erzeugt werden, wird zuerst ein codierendes Gen für ein gewünschtes Protein aus verschiedenen Zellen isoliert oder chemisch synthetisiert und das Gen dann in Wirtszellen exprimiert, was die Erzeugung des gewünschten Proteins zur Folge hat. Nichtsdestotrotz gibt es Hindernisse oder Probleme bei der Expression des Gens und der Herstellung des gewünschten Proteins, und daher müssen zuerst die obengenannten Probleme gelöst werden, bevor das gewünschte Protein oder ein Teil hiervon effizient und in gewerblich praktikablem Umfang produziert werden kann.
Beispielsweise wird bei dem Versuch, ein Protein mit einem verhältnismäßig niedrigen Molekulargewicht herzustellen, etwa ein Peptid oder Protein mit höchstens 100 Aminosäureresten, das erzeugte Peptid oder Protein in den Zellen der Mikroorganismen als Fremdstoff erkannt und leicht von verschiedenen Arten von eiweißspaltenden Enzymen hydrolisiert, was die effiziente Produktion des gewünschten Proteins oft unmöglich macht. Daher sind schon viele Ansätze zur Lösung solcher Probleme versucht worden.
Von einem dieser Ansätze ist bekannt, daß ein Gen für ein verschmolzenes Protein durch Verknüpfen eines Gens für ein gewünschtes Protein und eines Gens für ein von dem gewünschten Protein verschiedenen Protein (als Trägerprotein bezeichnet) gebildet wird, gefolgt von der Expression des Gens für das verschmolzene Protein in Zellen von Mikroorganismen für die Erzeugung des gewünschten Proteins.
Als ein Ausführungsbeispiel dafür ist ein Verfahren bekannt, bei welchem ein codierendes Gen für ein gewünschtes Protein mit einem endogenen codierenden Gen für ein Zellprotein von Mikroorganismen oder einen Teil hiervon verknüpft wird, und das konstruierte Gen in Zellen von Mikroorganismen exprimiert wird. Bei diesem Verfahren kann ein verschmolzenes Protein, welches ein mit dem gesamten Zellprotein eines Mikroorganismus oder mit einem Teil davon verschmolzenes gewünschtes Protein umfaßt, das nicht intrazellulär hydrolisiert wird, erhalten werden. Solche für den obengenannten Zweck als Trägerprotein verwendeten Proteine von Mikroorganismen umfassen β-Galactosidase (S. Tanaka et al., Nucl. Acids Res. 10, 1741-1754, 1982), β-Lactamase (P. Cornelis et al., Mol. Gen. Genet. 186, 507-511, l982), Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (A. Hobden et al., WPI 87-88509/13), alkalische Phosphatase (Offenlegungsschrift der japanischen Patentanmeldung Nr. 58-225098). Außerdem ist Staphylococcus-Protein A (Offenlegungsschrift der japanischen Patentanmeldung Nr. 62-190087; T. Moks et al., Biochemistry 26, 5239-5244, 1987) als ein Beispiel für ein Trägerprotein, welches nicht nur ein gewünschtes Protein vor proteolytischer Zersetzung schützt, sondern auch eine Reinigung des gewünschten Proteins erleichtert, bekannt.
Als ein zweites Ausführungsbeispiel hiervon ist ein Verfahren bekannt, bei welchem ein ein gewünschtes Protein codierendes Gen, verknüpft mit einem Gen eines exogenen Proteins oder einem Teil hiervon exprimiert wird, das selbst ein Fremdeiweiß ist, doch in den Zellen nicht als Fremdstoff erkannt wird. Bei diesem Verfahren wird ein mit dem gewünschten Protein verschmolzenes exogenes Protein oder ein Teil hiervon erhalten, welches hochstabil ist. Beispiele solcher exogener Proteine sind β-Interferon (I. Ivanov et al., FEBS Lett. 210, 56-60, 1987), α&sub1;-Antitrypsin (Van der Straten A et al., Bioscience Reports 6, 363-373, 1986) und so weiter.
Solchermaßen erhaltene, ein gewünschtes Protein und Trägerprotein umfassende verschmolzene Proteine verlieren manchmal gänzlich die biologische Aktivität des gewünschten Proteins, oder die biologische Aktivität des gewünschten Proteins wird vermindert. Andererseits können die verschmolzenen Proteine, selbst wenn sie eine biologische Aktivität des gewünschten Proteins haben, biologische Aktivitäten des Trägerproteins wie beispielsweise Antigenität aufweisen und daher können die verschmolzenen Proteine als solche nicht klinisch verwendet werden. Demgemäß muß das gewünschte Protein von dem verschmolzenen Protein abgespalten werden. Zu diesem Zweck wird eine Aminosäuresequenz einer Verknüpfung zwischen einem Trägerprotein und einem gewünschten Protein (im folgenden als ein Kopplungspeptid bezeichnet) mit Erfolg so vorgesehen, daß die Verknüpfung an spezifischer Stelle gespalten wird, und nach der Herstellung des verschmolzenen Proteins in den Zellen wird das gewünschte Protein von dem verschmolzenen Protein abgespalten.
Im allgemeinen wird ein in Zellen von Mikroorganismen hergestelltes verschmolzenes Protein so vorgesehen, daß ein Trägerprotein einen N-endständigen Teil eines verschmolzenen Proteins bildet. Eine solche Struktur kann durch Abspaltung bei einem Kopplungspeptid ein gewünschtes Protein liefern, welches weder das Trägerprotein noch den N-endständigen Aminosäurerest, Methionin, aufweist und daher unter dem klinischen Gesichtspunkt vorteilhaft ist.
Solche stellenspezifischen Spaltungsmethoden umfassen chemische Spaltungsmethoden, welche chemische Reagenzien verwenden, und biologische Spaltungsmethoden, welche Enzyme verwenden. Die chemischen Spaltungsmethoden umfassen das Cyan-Brom-Verfahren, Hydroxylamin-Verfahren, Ameisensäure-Verfahren, NBS (N-Bromosuccinimid-Verfahren), Lithium-Methylamin-NBS-Verfahren, Brom- Chlorwasserstoffsäure-Verfahren und dergleichen.
Das Cyan-Brom-Verfahren wird am häufigsten verwendet und Itakura et al haben erfolgreich ein gewünschtes Protein hergestellt, nämlich Somatostatin, aus mit Somatostatin verschmolzener Escherichia coli-β-Galactosidase unter Verwendung von Cyan-Bromid (K. Itakura et al., Science 198, 1056, 1977; Offenlegungsschrift der japanischen Patentanmeldung Nr. 54-163600). Cyan-Bromid hydrolisiert eine Peptidbindung an einem Methioninrest unter einer bestimmten Bedingung. Um ein verschmolzenes Protein an einer spezifischen Stelle zu spalten, muß daher das gewünschte Protein einen Methioninrest an seinem N-endständigen Ende aufweisen und kein Methioninrest darf in einer Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins enthalten sein, und daher ist die Anwendung von Cyan-Bromid zwangsläufig eingeschränkt.
Zu den enzymatischen Verfahren gehört das Endopeptidase-Verfahren. Endopeptidase erkennt eine oder mehrere spezifische Aminosäuren in einer inneren Aminosäuresequenz und spaltet eine Peptidbindung bevorzugt an einer Carboxyl-Stelle einer spezifischen Aminosäure. Im folgenden wird eine Aminosäure oder Aminosäuresequenz, welche von Endopeptidase spezifisch erkannt wird, als eine "erkannte Aminosäure" bzw. "erkannte Aminosäuresequenz" bezeichnet. Die verschiedenen Endopeptidasen, welche zur Spaltung eines verschmolzenen, von Zellen eines Mikroorganismus erzeugten Proteins zur Herstellung eines gewünschten Proteins verwendet werden, umfassen die folgenden:
Trypsin zur Erzeugung von menschlichem Calcitonin aus Tryptophan-Synthease (WO 84/00380);
Trypsin zur Erzeugung von β-Endorphin aus einer mit 48,3-Endorphin verschmolzenen β-Galactosidase;
Rinder-Enteropeptidase zur Erzeugung von Enkephalin aus mit β-Galactosidase verschmolzenem Enkephalin (V. N. Dobrynin et al., Bioory-Khim 13, 119-121, 1987);
Enterokinase zur Erzeugung von menschlichem atrio-natriuretischem Faktor (h-ANF) aus mit h-ANF verschmolzener Chloramphenicol-Acetyltransferase unter Verwendung von Val-Asp-Asp- Asp-Asp-Lys als erkannte Aminosäuresequenz (A. Hobden et al., WPI 87-088509/13);
zur Erzeugung von β-Globin aus mit C11 verschmolzenem ß-Globin verwendeter Faktor Xa, oder menschliches Calcitonin-Glycin aus mit Calcitonin-Glycin verschmolzener Chloramphenicol-Acetyltransferase unter Verwendung von (Ile/Leu/Pro/Ala)-(Glu/Asp/ Gln/Asn)-Gly-Arg als eine erkannte Aminosäuresequenz (Offenlegungsschrift der japanischen Patentanmeldung Nr. 61-135591); und V8-Protease unter Verwendung von Glu-X als eine erkannte Aminosäuresequenz, Faktor Xa unter Verwendung von Glu-Gly-Arg als eine erkannte Sequenz, Thrombin unter Verwendung von Arg-Ala-Leu-Leu-Ala-Gly-Pro-Arg oder Gly-Pro-Arg, welche alle zur Erzeugung von atrio-natriuretischem Peptid (ANP) aus mit rec A-Protein verschmolzenem ANP verwendet werden (Offenlegungsschrift der japanischen Patentanmeldung Nr. 62-135500).
Ein Verfahren, bei welchem ein gewünschtes Protein als ein verschmolzenes Protein mit einem Trägerprotein in Zellen von Mikroorganismen erzeugt wird, bietet ein sehr wirksames Mittel der Herstellung des gewünschten Proteins. Jedoch stellt ein Verfahren, bei welchem ein Zellprotein von Mikroorganismen als Trägerprotein verwendet wird, kein Verfahren für eine hinreichend wirtschaftliche Produktion dar, da dieses Verfahren einen geringeren Grad der Expression eines verschmolzenen Proteins schafft. Andererseits ist bei der Verwendung eines exogenen Proteins als Trägerprotein das erhaltene verschmolzene Protein normalerweise als löslicher Bestandteil im Zellplasma oder Randbereich des Mikroorganismus vorhanden und daher muß ein kompliziertes Trenn- und Reinigungsverfahren zur Isolierung des verschmolzenen Proteins angewendet werden.
Zusätzlich zu den obengenannten Problemen treten bei dem verschmolzene Proteine verwendenden Ansatz noch weitere Probleme auf. Das heißt, ein gewünschtes Protein als solches, welches als ein verschmolzenes Protein erzeugt wurde, ist nutzlos. Die Erzeugung eines gewünschten Proteins aus einem verschmolzenen Protein ist erforderlich und deshalb ist die Wahl eines eine Verschmelzungsstelle bildenden Kopplungspeptids wichtig. Eine Verschmelzung via Methionin, die durch Cyan-Bromid gespalten wird, ist insofern unvorteilhaft, als sie eine begrenzte Anwendbarkeit hat und ein universelles, durch ein Enzym spaltbares Kopplungspeptid erforderlich ist. Wenn eine von einem Enzym spaltbare Aminosäuresequenz (erkannte Aminosäuresequenz) verwendet wird, unter Bedingungen (primäre Aminosäuresequenz, sekundäre und tertiäre Struktur etc.), unter welchen ein Trägerprotein und ein gewünschtes Protein vorhanden sind, kann die Erzeugung eines gewünschten Proteins schwierig sein und daher kann das Ausmaß der Spaltung und korrekten Freisetzung nur schwer vorhergesehen werden. Die Wahl eines verschmolzenen Proteins mit einer erkannten Aminosäuresequenz, welche an einer spezifischen Stelle ein gewünschtes Protein freisetzt, beeinflußt nicht nur die chemische bzw. enzymatische Behandlung für die Spaltung, sondern auch die Expression, Erzeugung und Ansammlung des verschmolzenen Proteins. Gegenwärtig sind keine verschmolzenen Proteinsysteme mit einem Trägerprotein und Kopplungspeptid bekannt, welche alle obengenannten Bedingungen erfüllen.
Menschlicher sekretorischer Leukozyten-Protease-Inhibitor (im folgenden als SLPI bezeichnet) ist ein inhibitorisches Protein für von menschlichen polymorphkernigen Leukozyten erhaltene Elastase und in menschlicher Schleimflüssigkeit wie beispielsweise den Sekreten der Ohrspeicheldrüsen, Bronchialsekret, Spermaplasma, Zervixschleim usw. vorhanden. Eine Aminosäuresequenz dieses aus einem Sekret einer Ohrspeicheldrüse isolierten Proteins wurde bestimmt (R. C. Thompson et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83, 6692-6696; japanische Offenlegungsschrift Nr. 62-501291 einer PCT-Anmeldung); und ein Gen für dieses Protein wurde aus der Gen-Bibliothek einer menschlichen Ohrspeicheldrüse isoliert und die Sequenz bestimmt (R. C. Thompson et al., Nucl. Acid Res. 14, 7883-7896, 1986; japanische Offenlegungsschrift Nr. 62-501262 einer PCT-Anmeldung).
SLPI inhibiert eine Elastase aus menschlichen polymorphkernigen Leukozyten und wird daher voraussichtlich als ein Behandlungsmittel eingesetzt werden, um Emphyseme zum Stillstand zu bringen, wobei angenommen wird, daß diese durch Hydrolisieren von Elastin durch Elastase verursacht werden. Nichtsdestotrotz zeigt SLPI gleichzeitig sowohl eine Elastase-inhibierende Aktivität als auch eine Pankreas-Trypsin-inhibierende Aktivität, und daher wird befürchtet, daß SLPI eine physiologisch wichtige Trypsin-artige Serin-Protease wie beispielsweise Trypsin, Plasmin, Kallikrein, Thrombin und dergleichen inhibieren könnte und daher, falls SLPI als solches verabreicht würde, das System der Blutgerinnung und Fibrinolyse etc. beeinflussen könnte, und es ist schwierig, es als ein Behandlungsmittel bei Menschen anzuwenden.
EP 232523 offenbart die Herstellung des C-endständigen Bereichs des CUSI-1-Proteins. In D1 gibt es keinen Hinweis darauf, daß die Entfernung des N-ständigen Endes eine verringerte Trypsininhibierende Aktivität bewirkt.
WO 86/03519 offenbart die Rekombinations-Herstellung des ganzen SLPI-Proteins.
Stetler et al beschreiben in Nucleic Acid Res. 14 (20) 7883- 7896 (1986), daß von den SLPI-Genen das Exon III den Bereich AA 57-106 von SLPI codiert, welcher der Elastase-inhibierenden Aktivität entspricht.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Demgemäß sieht die vorliegende Erfindung ein neuartiges Elastase-inhibierendes Polypeptid vor, wobei die Elastase-inhibierende Aktivität (eine Chymotrypsin-ähnliche Serin-Proteasen inhibierende Aktivität) von SLPI erhalten bleibt, während eine Trypsin-ähnliche Serin-Proteasen inhibierende Aktivität von SLPI merklich verringert ist, sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung und als Voraussetzung dafür ein ideales Trägerprotein, wobei gleichzeitig die Bedingungen erfüllt werden, daß zum einen bei der mikrobiellen Erzeugung eines gewünschten Proteins mittels Gen-Technologie ein verschmolzenes Trägerprotein in hohem Ausmaß exprimiert werden kann, und daß zum anderen ein Folgeverfahren, das Isolieren und Reinigen des verschmolzenen Proteins umfassendes Verfahren einfacher auszuführen ist, und ein Kopplungspeptid, welches ein zuverlässiges Spalten an dem Verknüpfungspunkt und Freisetzen des gewünschten Proteins in intakter Form ermöglicht.
Demgemäß schafft die vorliegende Erfindung im allgemeinen ein Elastase-inhibierendes Polypeptid oder Homopolymer hiervon mit einer Aminosäuresequenz entsprechend der Formel (I):
oder einem Teil der Formel (I), worin eine oder mehr als eine Aminosäure vom N-ständigen Ende der in Klammern stehenden Aminosäuresequenz entfernt wird, worin X Gly repräsentiert oder fehlt und n eine ganze Zahl von 1 bis 10 repräsentiert, dadurch gekennzeichnet, daß die Trypsin-ähnliche Serin-Protease-inhibierende Aktivität des Polypeptids 1/100 der Elastase-inhibierenden Aktivität nicht übersteigt.
Die vorliegende Erfindung schafft außerdem ein verschmolzenes Protein, welches als Zwischenprodukt bei der Herstellung des oben bezeichneten Polypeptids nützlich ist, entsprechend der Formel (II'):
Y - B - Z&sub2; (II')
worin Y ein Trägerprotein, welches ein menschliches Wachstumshormon oder ein Fragment hiervon enthält, repräsentiert;
worin Z&sub2; ein Elastase-inhibierendes Polypeptid repräsentiert, welches einen C-endständigen Bereich eines menschlichen sekretorischen Leukozyten-Protease-Inhibitors (SLPI) gemäß Formel (I) umfaßt und welches eine Elastase-inhibierende Aktivität aufweist, wobei die Aktivität zur Inhibierung von Trypsin-ähnlichen Serin-Proteasen kleiner oder gleich 1/100 der Elastaseinhibierenden Aktivität ist;
worin eine oder mehr als eine Aminosäure entfernt wird und B ein Kopplungspeptid oder Homopolymer hiervon mit einer Aminosäuresequenz repräsentiert, welche chemisch oder biologisch gespalten werden kann unter Bedingungen, bei welchen das gewünschte Protein nicht denaturiert wird;
worin B an eine Aminosäure mit N-endständigem Ende in Z&sub2; gebunden ist.
Die vorliegende Erfindung sieht überdies ein Verfahren zur Herstellung eines Elastase-inhibierenden Polypeptids oder Homopolymers hiervon entsprechend der Formel (I) in Anspruch 1 vor, worin X Gly repräsentiert, umfassend den Schritt der Behandlung eines verschmolzenen Proteins gemäß der Formel (IV):
worin Y und Z die Bedeutungen wie im Zusammenhang mit der Formel (II) definiert haben, n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und worin Gly in der Formel (IV) mit einem N-endständigen Asn in Z verknüpft ist, mit Hydroxylamin oder einem Analogen hiervon.
Die vorliegende Erfindung sieht auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder eines Homopolymeren hiervon entsprechend Formel (I) aus Anspruch 1 vor, worin X fehlt, umfassend den Schritt der Behandlung eines verschmolzenen Proteins gemäß der Formel (V):
Y - B' - Z (V)
worin Y und Z die Bedeutungen aufweisen, wie sie für Formel (II) definiert wurden, worin
oder -(-Leu-Val-Pro-Arg-)n- repräsentiert, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, und worin Asn in Z mit Arg in B' mittels Thrombin oder einem Analogen hiervon verknüpft ist.
Die vorliegende Erfindung schafft außerdem ein Gen, umfassend ein für ein als Trägerprotein fungierendes menschliches Wachstumshormon oder ein Fragment hiervon codierendes Gen, welches mit einem für ein gewünschtes Protein oder ein Teil hiervon codierenden Gen über ein ein Kopplungspeptid oder Homopolymer hiervon codierendes Gen verknüpft ist, wobei das Kopplungspeptid oder das Homopolymer hiervon eine Aminosäuresequenz aufweist, welche chemisch oder biologisch unter einer Bedingung spaltbar ist, unter der das gewünschte Protein nicht denaturiert wird. Als Beispiel für das gewünschte Protein seien ein Elastase-inhibierendes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Formel (III) oder ein Teil hiervon, welche eine Elastaseinhibierende Aktivität zeigen, oder eine biologisch hierzu äquivalente Aminosäuresequenz genannt.
Die vorliegende Erfindung sieht auch ein das oben genannte Gen tragende Plasmid und Zellen von Mikroorganismen, welche das Plasmid tragen, vor.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 stellt eine primäre Aminosäuresequenz von SLPI dar, worin die einzelnen Aminosäuren jeweils durch Einbuchstabensymbole dargestellt sind;
Fig. 2 stellt eine Sequenz eines Gens mit synthetischer Struktur für ein (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptid mit vorzugsweise in E. coli verwendeten Codons dar, wobei (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI ein Polypeptid bedeutet, welches eine Aminosäuresequenz vom 55. Asn bis zum 107. Ala von SLPI umfaßt;
in Fig. 3 sind chemisch synthetisierte Oligonucleotid-Fragmente (1) bis (6) dargestellt;
in Fig. 4 sind synthetische Oligonucleotid-Fragmente (7) bis (10) dargestellt, welche für ein Kopplungspeptid codieren, das ein für ein (Met&supmin;¹Phe¹-Phe¹³&sup9;)-Fragment eines menschlichen Wachstumshormons (ein Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz vom ersten Phe bis zum 139. Phe eines menschlichen Wachstumshormons mit einem zusätzlichen Met am N-endständigen Ende) codierendes Gen und ein für (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI codierendes Gen verknüpft;
Fig. 5 stellt ein Schema für die Bildung eines Plasmids zur Expression eines Gens für ein verschmolzenes Protein dar (Beispiele 2 und 3);
Fig. 6 zeigt ein Spektrum einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) eines exprimierten verschmolzenen Proteins (Beispiel 4);
Fig. 7 stellt ein Spektrum einer SDS-PAGE dar, welches durch eine Behandlung des verschmolzenen Proteins mit Thrombin (Beispiel 5) oder mit Hydroxylamin (Beispiel 6) erhalten wurde;
Fig. 8 repräsentiert das Ergebnis einer Analyse einer Mischung, welche durch Behandlung eines S-sulfonierten verschmolzenen Proteins mit Thrombin erhalten worden war; dabei sind die Haupt-Maxima nach der Reihenfolge der Elution als Banden 1 bis 5 bezeichnet;
Fig. 9 stellt ein Spektrum einer SPS-PAGE der Maxima 1 bis 5 aus Fig. 8 dar;
Fig. 10 repräsentiert ein Elutions-Profil einer Umkehrphasen- HPLC eines in Beispiel 11 hergestellten, rückgefalteten (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI;
Fig. 11 repräsentiert eine HPLC-Analyse eines Haupt-Maximums aus Fig. 10 unter denselben Bedingungen für die HPLC wie in Fig. 10 gezeigt.

DIE BESTE METHODE ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG

Die betreffenden Erfinder bestätigten ursprünglich, daß ein Polypeptid, welches ungefähr einen Bereich der C-endständigen Hälfte von SLPI, beginnend ab dem ersten Ser und endend an dem 107. Ala, umfaßt, im wesentlichen keine Aktivität zur Inhibierung von Trypsin-ähnlicher Serin-Protease aufweist, während es eine Elastase-inhibierende Aktivität behält. Die Menge des das vorliegende Polypeptid bildenden SLPI ist nicht kritisch. Zwei bis zehn Wiederholungen des erfindungsgemäßen Polypeptids können ein Homopolymer bilden.
Diese Polypeptide werden von der Formel (I) repräsentiert:
worin X Gly repräsentiert oder fehlt und n eine ganze Zahl von 1 bis 10 repräsentiert, oder ein Teil hiervon, welche eine Elastase-inhibierende Aktivität und eine Aktivität zur Inhibierung von Trypsin-ähnlicher Serin-Protease aufweist, welchletztere 1/100 der Elastase-inhibierenden Aktivität nicht übersteigt, oder eine hierzu biologisch gleichwertige Aminosäuresequenz.
Gemäß den Verfahren, welche zur Spaltung eines verschmolzenen Proteins bei der Herstellung des vorliegenden Polypeptids verwendet werden, ist ein Aminoende des Polypeptids entweder Asn, wobei X fehlt, oder mit Asn verknüpftes Gly, wobei X Gly repräsentiert.
Anzumerken ist, daß die vorliegende Erfindung außer dem Polypeptid mit der obengenannten Aminosäuresequenz auch Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz umfaßt, bei welcher eine oder mehr als eine Aminosäure entfernt ist, sofern sie die obengenannte biologische Aktivität aufweisen.
Diese Proteine können nicht durch ein herkömmliches Verfahren wie beispielsweise einer Behandlung von SLPI mit einem eiweißspaltenden Enzym hergestellt werden, sondern nur durch eine Gen-Expression in Zellen von Mikroorganismen mittels einer Gen-Rekombinationstechnologie der vorliegenden Erfindung. Das heißt, da das gewünschte Protein ein Protein mit niedrigem Molekulargewicht ist, kann es nur durch das vorliegende Verfahren hergestellt werden, wobei das gewünschte Protein genetisch in Form eines verschmolzenen Proteins, welches beispielsweise ein menschliches Wachstumshormon als Trägerprotein enthält, hergestellt wird und das verschmolzene Protein mittels eines Enzyms wie etwa Thrombin oder mittels Chemikalien wie Hydroxylamin gespalten wird, um das gewünschte Protein zu erzeugen.
Demgemäß schafft die vorliegende Erfindung ein verschmolzenes Protein entsprechend der obengenannten Formel (II'), welches als ein Zwischenprodukt für die Herstellung des obengenannten Elastase-inhibierenden Polypeptids von Nutzen ist. Innerhalb des von der Formel (II') repräsentierten verschmolzenen Proteins wird ein verschmolzenes Protein, worin das gewünschte Protein den 55. Asn bis zum 107. Ala des SLPI umfaßt, von der folgenden Formel (II) repräsentiert:
Y - B - Z (II),
worin Y ein Trägerprotein repräsentiert, welches ein menschliches Wachstumshormon oder ein Fragment hiervon umfaßt;
worin Z ein Polypeptid repräsentiert, welches ein Elastaseinhibierendes Polypeptid oder Homopolymere davon umfaßt mit der Sequenz entsprechend der Formel (III):
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 10 repräsentiert, oder ein Teil hiervon, welche eine Elastase-inhibierende Aktivität oder eine hierzu biologisch gleichwertige Aminosäuresequenz; und
B ein Kopplungspeptid oder Homopolymer hiervon mit einer Aminosäuresequenz repräsentiert, welche chemisch oder biologisch gespalten werden kann unter Bedingungen, bei welchen das gewünschte Protein nicht denaturiert wird; worin B an ein Asn-Aminoende in Z gebunden ist.
Das Trägerprotein in den Formeln (II') und (II) ist vorzugsweise ein menschliches Wachstumshormon oder ein Teil davon, welches ein höheres Ausmaß der Expression des verschmolzenen Proteins bewirkt und als Einschlußkörper in Zellen von Mikroorganismen vorliegt sowie leicht zu isolieren und zu reinigen ist. Das menschliche Wachstumshormon ist ein aus 191 Aminosäureresten bestehendes Polypeptid, wobei diese mit dem ersten Phe beginnen und am 191. Phe enden. Wenn ein erwünschtes Gen unter Verwendung eines Trägerproteins in E. coli exprimiert wird, muß ein exprimiertes Protein ein menschliches Methionyl- Wachstumshormon sein, da Met-Reste für das Initiatorcodon der Translation von wesentlicher Bedeutung sind. Daher muß ein solches Protein auch in den Bereich des vorliegenden Trägerproteins fallen. Außerdem fallen modifizierte menschliche Wachstumshormone, bei welchen die Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Wachstumshormons teilweise verändert ist, in den Bereich des vorliegenden Trägerproteins. Ein Beispiel eines solchen modifizierten menschlichen Wachstumshormons ist dasjenige, bei welchem das 53. Cystein durch eine andere Aminosäure ersetzt ist. Ein bevorzugter Teil eines als ein Trägerprotein verwendeten menschlichen Wachstumshormons ist ein Fragment ab dem ersten Phe bis zum 139. Phe, oder ein Fragment vom ersten Phe bis zum 122. Gln.
Ein Kopplungspeptid oder Homopolymer hiervon an einem Verknüpfungspunkt umfaßt alle erkannten Aminosäuresequenzen einschließlich bekannter Sequenzen, welche chemisch oder biologisch unter der Bedingung, daß das gewünschte Protein nicht denaturiert wird, gespalten werden können.
Zum Beispiel kann Asn-Gly (P. Bornstein, Meth. Enzymol. 47, 132, 1977) oder eine sich wiederholende Sequenz hiervon (Asn-Gly)n, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10 repräsentiert, als ein Kopplungspeptid verwendet werden, welches von Hydroxylamin gespalten werden kann, um das gewünschte Protein zu erzeugen. Außerdem kann zwar eine bekannte Aminosäuresequenz
(B. Blomback et al., BBA 115, 371-396, 1966; T. Takagi et al., Biochemistry 13, 750-756, 1974) als eine durch Thrombin spaltbare verschmolzene Aminosäuresequenz verwendet werden, doch werden vorzugsweise die kürzeren Aminosäuresequenzen Val-Pro-Arg oder Leu-Val-Pro-Arg oder sich wiederholende Sequenzen hiervon (Val-Pro-Arg)n oder (Leu-Val-Pro-Arg)n, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10 repräsentiert, verwendet, wodurch ein gewünschtes Protein ohne Beeinträchtigung einer primären Aminosäuresequenz und des sterischen Effekts des Trägerproteins und des gewünschten Proteins auf verläßliche Weise freigesetzt und abgetrennt wird. In diesem Fall wird ein C-endständiges Gly oder Arg bzw. Arg in B mit einem N-endständigen Asn in Z verknüpft.
Um das vorliegende Polypeptid der Formel (I) zu erzeugen, wird ein verschmolzenes Protein entsprechend der Formel (II) an seinem Verknüpfungspunkt B abgespalten. Wenn diese Abspaltung durch Hydroxylamin oder einem Analogen hiervon erfolgen soll, wird (Asn-Gly)n als B verwendet. Das heißt, ein verschmolzenes Protein entsprechend der obengenannten Formel (V) wird mit Hydroxylamin oder einem Analogen hiervon wie etwa Alkylhydroxylamin, Hydrazin oder dergleichen behandelt, um ein Elastase-inhibierendes Polypeptid oder Homopolymer hiervon zu erhalten, wobei X in der Formel (I) Gly ist. Wenn andererseits die Spaltung bei einem Kopplungspeptid B durch Thrombin oder einen Analogen hiervon erfolgen soll, dienen beispielsweise (Val-Pro-Arg)n oder (Leu-Val-Pro-Arg)n als B. Das heißt, ein verschmolzenes Protein entsprechend der obengenannten Formel (V) wird mit einem Thrombin oder Analogen hiervon, beispielsweise menschliches Thrombin, Rinderthrombin, Pferdethrombin, Schweinethrombin, oder dergleichen behandelt, um ein Elastase-inhibierendes Polypeptid oder Homopolymer hiervon entsprechend der Formel (I), worin X fehlt, zu erhalten.
Ein verschmolzenes Protein der Formel (II) wird gemäß einer als solchen bekannten Rekombinationsgentechnologie hergestellt. In diesem Fall wird die vorliegende Erfindung durch die Verwendung eines Gens für ein verschmolzenes Protein gekennzeichnet, umfassend ein für ein als Trägerprotein fungierendes menschliches Wachstumshormon oder ein Fragment hiervon codierendes Gen, welches mit einem für ein gewünschtes Protein oder ein Teil hiervon codierenden Gen über ein ein Peptid oder Polypeptid codierendes Gen verknüpft ist, wobei das Peptid oder das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, welche chemisch oder biologisch unter einer Bedingung spaltbar ist, unter der das gewünschte Protein nicht denaturiert wird.
Ein Verfahren für den Aufbau von Plasmiden pGH-TE und pGH-HE, welche ein verschmolzenes Protein exprimieren, umfassend ein (Met&supmin;¹Phe¹-Phe¹³&sup9;)-Fragment eines menschlichen Wachstumshormons und ein (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptidfragment, wird in Fig. 5 gezeigt.
pGH-L9, ein Plasmid zur Expression eines menschlichen Wachstumshormons (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5956, 1984) wird mittels der Restriktionsenzyme BglII und SalI aufgespalten, wobei ein Drittel eines stromabwärts liegenden Bereichs des Gens für das menschliche Wachstumshormon eliminiert wird. Auf der anderen Seite wird ein Plasmid pUC-D6, welches ein (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Gen umfaßt, mittels MluI und XhoI zerlegt, wodurch ein (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-Fragment eines SLPI-Gens erhalten wird.
Die obengenannten beiden Fragmente und die synthetischen DNA- Linker (7) und (8) bzw. (9) und (10), in Fig. 4 gezeigt, werden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase verbunden, wodurch die Plasmide pGH-TE und pGH-HE erhalten werden, welche verschmolzene Proteine exprimieren, die ein Fragment eines Wachstumshormons sowie ein (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Fragment umfassen. In Fig. 5 ist pGH-TE ein Plasmid, welches ein eine mittels Thrombin gespaltene Sequenz enthaltendes verschmolenes Protein exprimiert, und pGH-HE ist ein Plasmid, welches ein eine mittels Hydroxylamin gespaltene Sequenz enthaltendes verschmolzenes Protein exprimiert.
Ein für eine erkannte Aminosäuresequenz codierendes Gen, welches ein für ein gewünschtes Protein codierendes Gen und ein für ein menschliches Wachstumshormon oder einen Teil davon codierendes Gen verbindet, kann ein jedes Gen in demselben Leseraster wie das Gen für das menschliche Wachstumshormon oder ein Teil hiervon sein, das für eine Aminosäuresequenz codiert, vorzugsweise (Asn-Gly)n, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 10 repräsentiert, welche leicht durch eine Hydroxylamin-Behandlung gespalten werden kann, wodurch ein gewünschtes Protein erzeugt wird. Andererseits kann es jedes degenerierte Gen sein, das für eine Aminosäuresequenz codiert, vorzugsweise für (Val-Pro-Arg)n oder (Leu-Val-Pro-Arg)n, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 10 repräsentiert, welche leicht durch eine Thrombin-Behandlung gespalten werden kann, um ein gewünschtes Protein zu erzeugen.
Zum Einbinden dieses Leserasters zwischen einem für ein Trägerprotein, d. h. menschliches Wachstumshormon oder ein Teil hiervon, codierenden Gen und einer erkannten Aminosäuresequenz kann ein synthetischer DNA-Linker dazwischen angeordnet werden.
Für gewünschte Proteine codierende Gene umfassen diejenigen Gene, welche für Hormone oder Faktoren wie etwa Somatomedin, IGF-I, IGF-II, EGF (epidermaler Wachstumsfaktor), PDGF (von Thrombozyten ins Serum abgegebener Wachstumsfaktor) codieren. Außerdem umfassen sie Gene, welche für Lymphokine, Enzyme, Enzym-inhibierende Proteine codieren. Zum Beispiel Interferone, Interleukine, Neuropeptide, Darmpeptide, Blutgerinnungsfaktoren wie etwa Faktor VII, Faktor VIIIC, Faktor IX, Protein C und Protein S, α&sub1;-Antitrypsin, SLPI, TIMP (Gewebe-Inhibitor von Metallproteinase), und Proteine von Lungensurfactant. Die für ein gewünschtes Protein codierenden Gene umfassen außerdem Gene, welche für einen Antikörper oder Teile hiervon und für Komplemente oder Teile hiervon codieren.
Gewünschte Proteine können nicht nur natürlich vorkommende Proteine, sondern auch modifizierte Proteine oder Fragmente hiervon umfassen, und für die letztgenannten kann ein Gen mit der Fähigkeit zur Expression der modifizierten Proteine oder der Fragmente hiervon verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann zum Erhalten eines Elastase-inhibierenden Polypeptids oder Homopolymeren hiervon ein für die ein Carboxy-Ende aufweisende Hälfte von SLPI codierendes Gen oder ein Gen, welches zwei bis zehn Wiederholungen des obengenannten Gens umfaßt, verwendet werden.
Ein erfindungsgemäßes verschmolzenes Protein kann in ein Plasmid für die Expression eingeführt werden, indem ein geeigneter Promotor an dieses hinten angefügt wird. Verfügbare Promotoren umfassen einen Tryptophan-Operon-Promotor (trp-Promotor), Lactose-Operon-Promotor (lac-Promotor), tac-Promotor, PL-Promotor, Ipp-Promotor und dergleichen. Besonders bevorzugt ist eine 5'-flankierende pHG-L9-Sequenz, wobei ein trp-Promotor und ein optimierter Abstand zwischen einer SD-Sequenz und einem Starter-Codon ATG für die Translation verwendet werden (Offenlegungsschrift der japanischen Patentanmeldung Nr. 60-234584).
Für die effiziente Expression eines verschmolzenen Proteins werden ein trp-Promotor, eine SD-Sequenz, ein Starter-Codon für die Translation, ein für ein menschliches Wachstumshormon oder einen Teil hiervon codierendes Gen, ein für ein Kopplungspeptid codierendes Gen, ein für ein gewünschtes Gen oder einen Teil hiervon codierendes Gen und ein Terminator-Codon für die Translation in dieser Reihenfolge miteinander verbunden. Solche verbundenen Gene werden in ein geeignetes Plasmid wie beispielsweise pBR 322 oder ein verwandtes Plasmid eingebaut, wodurch ein Plasmid für die Expression eines verschmolzenen Proteins konstruiert wird. Anzumerken ist, daß vorzugsweise ein pBR 322-Plasmid verwendet wird.
Wirtszellen von Mikroorganismen zur Expression des vorliegenden verschmolzenen Proteins umfassen E. coli, Bacillus subtilis und dergleichen, wobei E. coli besonders bevorzugt wird. Das obengenannte Plasmid zur Expression eines verschmolzenen Proteins kann in eine Zelle eines Mikroorganismus, beispielsweise in eine E. coli-Zelle, mittels eines bekannten Verfahrens eingeführt werden, M.V. Norgard et al., Gene, 3, 279, 1978.
Der solchermaßen erhaltene transformierte Mikroorganismus wird gemäß einer an sich bekannten Methode kultiviert. Als Nährmedium wird ein Glucose- und Casaminosäure enthaltendes M9-Medium (T. Maniatis Hrsg., Molecular Cloning, S. 440, Spring Harbor Laboratory, New York, 1982) erwähnt, und falls die Stabilisierung eines Plasmids für die Expression in den Wirtszellen erforderlich ist, kann Ampicillin usw. zugegeben werden.
Die Zellkultur wird unter für einen transformierten Mikroorganismus geeigneten Bedingungen durchgeführt, beispielsweise unter Zuführen von Sauerstoff und Bewegen durch 2 bis 36-stundenlanges Schütteln bei 37ºC. Außerdem kann zur Anregung einer effizienten Wirkung des Promotors ein Induktionsstoff wie beispielsweise 3-β-Indolacrylsäure (wenn ein trp-Promotor verwendet wird) oder Isopropyl-β-Thiogalactosid (wenn ein tac-Promotor verwendet wird) usw. zugegeben werden.
Nach dem Kultivieren werden die transformierten Zellen eines Mikroorganismus gesammelt, beispielsweise durch Zentrifugieren, resuspendiert, z. B. in einer Phosphatpufferlösung, aufgerissen, beispielsweise mittels einer Ultraschallbehandlung, und zentrifugiert, wodurch auf einfache Weise ein verschmolzenes Protein in reiner Form erhalten wird. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß das verschmolzene Protein als solches durch eine Behandlung mit Hydroxylamin oder Thrombin gespalten und somit das gewünschte Protein erhalten werden kann. Falls erforderlich können Cystein-Reste des verschmolzenen Proteins sulfoniert werden und nachfolgend mit Thrombin behandelt werden, um ein sulfoniertes Molekül des gewünschten Proteins zu erzeugen.
Ein über eine Aminosäuresequenz verknüpftes verschmolzenes Protein, welches durch Hydroxylamin (einschließlich Analogen hiervon, d. h. Verbindungen mit einer ähnlichen Struktur und derselben Wirkung wie Hydroxylamin) spaltbar ist, wird in einer alkalischen Umgebung bei 45º C zwei bis vier Stunden lang mit Hydroxylamin behandelt, bzw. ein über eine Aminosäuresequenz verknüpftes verschmolzenes Protein, welches durch Thrombin (einschließlich Analogen hiervon, d. h. Enzymen mit einer ähnlichen Struktur und derselben biologischen Wirkung wie Thrombin) spaltbar ist, wird bei 37º C 2 bis 24 Stunden lang mit Thrombin behandelt, wodurch ein gewünschtes Protein aus dem verschmolzenen Protein gewonnen wird, und dieses wird isoliert.
Wenn ein gewünschtes Protein über Disulfid-Bindungen eine Tertiärstruktur besitzt, kann es beispielsweise durch ein von Chance et al entwickeltes Verfahren in ein biologisch aktives Molekül mit derselben Tertiärstruktur wie ein natürlich vorkommendes Protein umgewandelt werden (R.E. Chance et al, Peptides: Seventh U.S. Peptide Symposium Proceedings, DH. Rich und E. Gross, Hrsg., 721-728, Pierce Chemical Company, Rockford IL, 1981). Bei einem eine Sulfonierung einschließenden Verfahren wird ein sulfoniertes gewünschtes Protein reduziert, gefolgt von der Bildung von intramolekularen Disulfid-Bindungen, wodurch ein biologisch aktives Protein mit derselben Tertiärstruktur wie ein natürlich vorkommendes Protein hergestellt wird.
Das erfindungsgemäße (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptid, d. h. ein Elastase-inhibierendes Polypeptid, kann mittels einer geeigneten Kombination von als solchen bekannten Isolierungs- und Reinigungsverfahren aus einer Reaktionsmischung isoliert und gereinigt werden. Diese bekannten Isolierungs- und Reinigungsverfahren umfassen Verfahren, welche den Unterschied in der Löslichkeit nutzen, beispielsweise das Aussalzen und die Lösemittel-Ausfällung; Verfahren, welche hauptsächlich den Molekulargewichtsunterschied nutzen, beispielsweise Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese; Verfahren, welche den Unterschied der elektrischen Ladungen nutzen, wie beispielsweise Ionenaustauschchromatographie und Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; Verfahren, welche eine spezifische Affinität nutzen, wie beispielsweise die Affinitätschromatographie; Verfahren, welche unterschiedliches wasserabweisendes Verhalten nutzen, beispielsweise die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; Verfahren, welche unterschiedliche isoelektrische Punkte nutzen, beispielsweise isoelektrische Fokussierung.
Wie in Tabelle 4 gezeigt ist im Vergleich der inhibierenden Aktivitäten des vorliegenden Elastase-inhibierenden Polypeptids mit verschiedenen eiweißspaltenden Enzymen die Aktivität zur Inhibierung von Trypsin-ähnlichen Serin-Proteasen wie beispielsweise menschliches Thrombin, menschliches Plasmin und menschliches Kallikrein merklich verringert, obwohl die Elastase-inhibierende Aktivität von SLPI erhalten bleibt. Daher ist im Vergleich zu SLPI die Elastase-inhibierende Aktivität gegenüber Trypsin des vorliegenden (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptids verbessert, so daß das vorliegende Polypeptid als ein nützliches Medikament zur klinischen Verwendung vielversprechend ist.
Da das vorliegende Protein eine ausgezeichnete Aktivität zur Inhibierung der Elastase von polymorphkernigen Leukozyten aufweist, kann es als ein Mittel zur Behandlung von unterschiedlichen Krankheiten verwendet werden, bei welchen durch die Mittlerwirkung von Leukozytenelastase verursachte Zerstörung von Gewebe im Spiel ist, beispielweise bei Emphysemen, rheumatischer Arthritis, Glomerulonephritis, periodontale Erkrankungen und Muskelatrophie, sowie ARDS, bei Neutrophilie auftretenden, durch Neutrocyten bedingten allergischen Lungenerkrankungen, und bei Sepsis.
Das vorliegende Protein kann, falls erforderlich, zur Herstellung eines Pulvers gefriergetrocknet werden. Bei diesem Gefriertrocknen wird ein Stabilisator wie beispielsweise Sorbit, Mannit, Dextrose, Maltose, Glycerol, Humanserumalbumin oder dergleichen verwendet.
Das vorliegende Protein wird für die Behandlung der obengenannten Krankheiten in Form von pharmakologisch verträglichen Zubereitungen verwendet. Die Verabreichung erfolgt auf oralem oder parenteralem Weg, zum Beispiel intravenös, intramuskulär, perkutan, subkutan, rektal, und über die Atemwege (intratrachial, intranasal), sowie unter Verwendung eines Ionophoresegeräts.
Anzumerken ist, daß wenn in der Beschreibung und den Zeichnungen Aminosäuren und Peptide usw. durch Abkürzungen beschrieben werden, die verwendeten Symbole den von IUPAC-IUB (Kommission für die Nomenklatur in der Biologie) festgelegten bzw. den im Bereich der Technik herkömmlicherweise verwendeten Symbolen entsprechen.

Beispiele

Als nächstes wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen ausführlicher beschrieben, doch ist die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Anzumerken ist, daß die in den Beispielen angewandten verschiedenen gentechnologischen Verfahren im folgenden beschrieben sind.

(1) Spaltung von DNA mittels Restriktionsenzymen (Verfahren 1)

DNA wurde in einer Menge von 0,1 bis 1 ug in 10 ul einer Restriktionsenzym-Pufferlösung gelöst (bei Spaltung durch MluI oder PstI: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl, 0,1 mg/ml Gelatine, 60 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol; bei Spaltung durch BamHI, BglII, NdeI, SalI oder XhoI: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mg/ml Gelatine, 150 mM NaCl und 6 mM Mercaptoethanol, jeweils in ihrer Endkonzentration in einer wäßrigen Lösung), 2 bis 4 Einheiten des Restriktionsenzyms wurden der Lösung zugegeben und eine Reaktion bei 37º C eine Stunde lang durchgeführt.

(2) Agarose-Gel-Elektrophorese (Verfahren 2)

Nach der Spaltung mittels eines Restriktionsenzyms wurden 3 ul einer Lösung von 0,2l % Bromphenolblau in 50prozentigem wäßrigem Glycerol zugegeben und eine Agarose-Gel-Elektrophorese (Konzentration 0,7 bis 1%) durchgeführt.
Als eine Elektrophorese-Pufferlösung wurden 90 mM Tris-borat (pH 8,0), 2 mM wäßrige EDTA-Lösung verwendet.

(3) Rückgewinnung von DNA-Fragmenten aus dem Agarose-Gel (Verfahren 3)

Eine Agarose-Gel-Elektrophorese wurde unter Verwendung eines Agarose-Gels mit niedrigem Schmelzpunkt durchgeführt, wobei eine einer gewünschten DNA entsprechende Bande ausgeschnitten und die DNA durch ein Verfahren von L. Weislander et al, Anol. Biochem., 98, 305 (1978) zurückgewonnen wurde.

(4) Bindung unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Verfahren 4)

Zu verbindende DNA-Fragmente wurden vermischt und nach Mitfällung mittels Ethanol wurde der Niederschlag in 20 ul einer Pufferlösung für eine Bindungsreaktion (66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP) gelöst und 2 bis 10 Einheiten T4-DNA-Ligase wurden zu der Lösung gegeben und eine Reaktion 12 Stunden lang bei 16º C durchgeführt.

(5) Herstellung kompetenter Zellen und Transformation (Verfahren 5)

E. coli wurde gemäß einer Modifizierung eines CaCl&sub2;-Standardverfahrens transformiert (M.V. Norgard et al). Das heißt, 5 ml L-Medium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, pH 7,2) wurden mit einer 18 Stunden alten Kultur von E. coli HB101 geimpft und bis zu einer Trübung von 0,3 bei 600 nm (OD&sub6;&sub0;&sub0;) gezüchtet. Die Zellen wurden zweimal in einer kalten Magnesiumpufferlösung (0,1 ml NaCl, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM Tris-HCl, pH 7,6, 4º C) gewaschen und in 2 ml einer kalten Calciumpufferlösung (100 mM CaCl&sub2;&sub1; 250 mM KCl, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM Tris-HCl, pH 7,6, 4º C) resuspendiert und die Suspension bei 4º C 25 Minuten stehengelassen. Nachdem die Zellen gesammelt worden waren, wurden sie in 200 ul einer kalten Calciumpufferlösung suspendiert und die Zellsuspension mit der aus der Bindungsreaktion erhaltenen Lösung in einem Verhältnis von 10 : 1 (v/v) gemischt. Diese Mischung wurde bei 4º C 60 Minuten lang stehengelassen, 1 ml eines LBG-Mediums (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl, 0,08% Glucose, pH 7,2) wurde der Mischung zugegeben und die Zellen bei 37º C eine Stunde lang kultiviert. Die Nährlösung mit der Kultur wurde einem Selektionsmedium (L-Medium-Platte mit 30 ug/ml Ampicillin) in einem Verhältnis von 100 ul/Platte eingeimpft. Die Platte wurde über Nacht bei 37º C inkubiert, um Transformanten zu züchten.
Eine Plasmid-DNA wurde aus den resultierenden, gegen Ampicillin resistenten Kolonien durch ein Verfahren von Birnboim, H.C. und J. Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979) hergestellt und mit geeigneten Restriktionsenzymen zerlegt. Das Aufschlußmuster wurde mittels einer Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert, um einen gewünschten Klon zu erhalten.

(6) Bestimmung der DNA-Nucleotidsequenz (Methode 6)

Die Sequenzierung von DNA wurde anhand eines Verfahrens von Chen, E.Y. und Seeburg, P.H., DNA, 4, 165 (1985) unter Verwendung des DNA-Plasmids als Matrize und M13-Primer M3, RV oder pBR 322-Primer 52 (beide von Takara Shuzo, Japan) als Primer und eines M13-Sequenz-Kits (Amersham Japan) durchgeführt.

(7) Weitere Verfahren

Alle weiteren Verarbeitungen von DNA wurden anhand der Verfahren von Maniatis et al, Molecular Clonings, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982, ausgeführt.

Beispiel 1

Synthese und Sub-Klonen von Strukturgenen für das (Asn&sup5;&sup5;- Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptidfragment

Das Gen für das (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Fragment wurde auf der Basis einer Aminosäuresequenz von SLPI wie in Fig. 1 gezeigt konstruiert (R.C. Thompson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 6692, 1986; V. Seemuller et al, FEBS Lett., 199, 43, 1986), indem bei E. coli häufig verwendete Codonen gewählt und Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme an geeigneten Stellen, wie in Fig. 2 gezeigt, für den Aufbau eines gewünschten Gens vorgesehen wurden. Danach wurde die gewünschte Nucleotidsequenz in 3 Teile geteilt, wie in Fig. 3 gezeigt, um sechs Oligonucleotide zu synthetisieren. Die Oligonucleotide wurden unter Verwendung eines vollautomatischen DNA-Synthesegeräts (Applied Biosystems, Model 381A) anhand des Phosphoamidit-Verfahrens synthetisiert. Die synthetischen Oligonucleotide wurden gemäß dem Verfahren von Applied Biosystems gereinigt. Das heißt, synthetische Oligonucleotide wurden über Nacht in wäßrigem Ammoniak bei einer konstant gehaltenen Temperatur von 55º C aufbewahrt, um die Schutzgruppen der Amino-Radikale von Basen von DNA zu entfernen, und eine Fraktion der synthetischen Oligonucleotide mit höherem Molekulargewicht wurde durch Gel-Filtration unter Verwendung von feinem Sephadex G-50-Gel (Pharmacia) abgetrennt. Als nächstes wurde die Oligonucleotid- Fraktion einer Polyacrylamid-Elektrophorese (Gelkonzentration 20%, enthielt 7 M Harnstoff) unterzogen und ein Migrationsmuster durch Abschattieren mit ultravioletten Strahlen beobachtet. Eine einem gewünschten Oligonucleotid entsprechende Bande wurde herausgeschnitten und in kleine Stücke geschnitten, und zwei bis fünf ml einer DNA-Elutionspufferlösung (500 mM NH&sub4;OAc, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7,5) wurde den Gelstückchen zugegeben und das Ganze bei 37º C über Nacht geschüttelt. Eine das gewünschte Oligonucleotid enthaltende wäßrige Lösung wurde durch Zentrifugieren erhalten. Schließlich wurde die ein synthetisches Oligonucleotid enthaltende Lösung auf eine Gelfiltrationssäule angewandt (Sephadex G-50) und ein gereinigtes synthetisches Oligonucleotidpräparat erhalten. Anzumerken ist, daß die Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese wiederholt wurde, falls dies zur Verbesserung der Reinheit des synthetischen Oligonucleotids erforderlich war. Das synthetische Oligonucleotid wurde in einer Menge von 0,1 bis 1,0 ug einer Polynucleotidkinase-Reaktion in der Anwesenheit von 1 mM ATP unterworfen, um sein 5'-Ende zu phosphorylieren.
Die Phosphorylierung wurde in einer wäßrigen Lösung von 50 mM Tris-HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl&sub2; und 5 mM Dithiothreitol unter Verwendung von 5 Einheiten von Polynucleotidkinase (P-L Biochemicals) durchgeführt. Zwei synthetische, an ihrem 5'-Ende phosphorylierte Oligonucleotide entsprechend der oberen und unteren in Fig. 3 gezeigten Ketten wurden in wäßrige Lösung gegeben, vermischt und allmählich von 70º C auf Raumtemperatur abgekühlt, um die beiden Oligonucleotide zu verbinden.
Für das Sub-Klonen wurde 1 ug Plasmid pUC119 (Takara Shuzo, Japan) mit BamHI und PstI nach Verfahren 1 gespalten, die linearisierten Fragmente durch Agarose-Gel-Elektrophorese nach Verfahren 2 getrennt und das lineare Plasmid nach Verfahren 3 zurückgewonnen. Das zurückgewonnene lineare Plasmid wurde mit 6 ug der verbundenen synthetischen Fragmente (1) und (2), (3) und (4) oder (5) und (6) vermischt und nach einer Ausfällung mit Ethanol wurden sie unter Verwendung einer T4-DNA-Ligase nach Verfahren 4 miteinander verknüpft.
Die Mischung für die Bindungsreaktion wurde zu 200 ul der nach Verfahren 5 hergestellten kompetenten Zellen von E. coli zugegeben und eine Transformation nach Verfahren 5 durchgeführt. Aus Kolonien, welche auf einem selektiven Nährmedium (Verfahren 5) gezüchtet worden waren, wurde Plasmid-DNA nach Verfahren 5 hergestellt. Der Aufbau eines gewünschten, eine SLPI- Hälfte mit einem Carboxyende Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7; enthaltenden Sub- Klons pUC-D6 wurde durch Spaltung mit einem Restriktionsenzym, BamHI, SalI, MluI, NdeI, XhoI oder PstI, nach Verfahren 1 und durch Beobachten der Spaltungsmuster mittels Agarose-Gel- Elektrophorese nach Verfahren 2 bestätigt. Außerdem wurde die Sequenz der DNA durch Verfahren 6 bestimmt, wodurch eine Nucleotidsequenz des Sub-Klons bestätigt wurde.

Beispiel 2

Herstellung eines Plasmids zur Expression eines verschmolzenen Proteins, welches ein (Met&supmin;¹Phe¹-Phe¹³&sup9;)-Fragment eines menschlichen Wachstumshormons und ein (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptidfragment umfaßt, welche über eine mit Thrombin spaltbare Stelle gekoppelt sind, und eines Transformanten hiervon.
Wie in Fig. 5 gezeigt, wurde 1 ug eines Plasmids zur Expression eines Gens für ein menschliches Wachstumshormon (M. Ikehara et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5956, 1984) mit BglII und Sall gespalten und die resultierenden Fragmente durch Agarose-Gel-Elektrophorese nach Verfahren 2 getrennt und nach Verfahren 3 aus dem Gel zurückgewonnen.
Desweiteren wurden 2 ug des in Beispiel 1 erhaltenen pUC-D6 mit MluI und XhoI gespalten, die resultierenden Fragmente abgetrennt und ein DNA-Fragment von ungefähr 0,15 Kbp nach Verfahren 3 zurückgewonnen. Andererseits wurden die in Fig. 4 gezeigten DNA-Fragmente (7) und (8), welche für eine mit Thrombin spaltbare Aminosäuresequenz codieren, chemisch synthetisiert. Zunächst wurde jeweils 1 ug der beiden wie oben beschrieben rückgewonnenen DNA-Fragmente mit den verbundenen synthetischen Fragmenten (7) und (8) vermischt und nach Ausfällen mit Ethanol wurde die Verknüpfung unter Verwendung einer T4-DNA-Ligase nach Verfahren 4 durchgeführt, E. coli HB101 wurde mit der Mischung für die Bindungsreaktion durch dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 transformiert, und aus den auf einem selektiven Medium gewachsenen Kolonien wurde ein Transformant erhalten, welcher ein Plasmid pGH-TE des Gens für die Expression des Gens für das gewünschte Protein trug. Der Aufbau des Plasmids pGH-TE wurde durch dieselbe Prozedur wie in Beispiel 1 bestätigt.
Anzumerken ist, daß E. coli, welches das Plasmid pGH-TE enthielt, als Escherichia coli HB101 (pGH-TE) bezeichnet und beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FRl), Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, als internationale Hinterlegung unter dem Vertrag von Budapest als FERM BP-2168 am 1. Dezember 1988 hinterlegt wurde.

Beispiel 3

Herstellung eines Plasmids zur Expression eines verschmolzenen Proteins, welches ein (Met&supmin;¹Phe¹-Phe¹³&sup9;)-Peptid eines menschlichen Wachstumshormons und ein (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptidfragment umfaßt, welche über eine mit Hydroxylamin gespaltene Stelle gekoppelt sind, und eines Transformanten hiervon.
Wie in Fig. 5 gezeigt, wurde dieselbe Prozedur wie in Beispiel 2 beschrieben wiederholt, außer daß die in Fig. 4 gezeigten synthetischen DNA-Fragmente (9) und (10), welche eine mit Hydroxylamin spaltbare Aminosäuresequenz codieren, anstatt der synthetischen DNA-Fragmente (7) und (8) verwendet wurden, wodurch ein Plasmid pGH-HE zur Expression eines verschmolzenen Proteins sowie ein das Plasmid tragender E. coli HB101-Transformant erhalten wurden.
Anzumerken ist, daß E. coli, welches das Plasmid pGH-HE enthielt, als Escherichia coli HB101 (pGH-HE) bezeichnet und beim FRI als internationale Hinterlegung unter dem Vertrag von Budapest als FERM BP-2167 am 1. Dezember 1988 hinterlegt wurde.

Beispiel 4

Expression eines Gens für ein verschmolzenes Protein

In den Beispielen 2 bzw. 3 hergestelltes, das Plasmid pGH-TE zur Expression eines verschmolzenen Proteins tragende E. coli HB 101 und das Plasmid pGH-HE zur Expression eines verschmolzenen Proteins tragende E. coli HB 101 wurden getrennt voneinander jeweils auf ein 50 bis 100 ug/l Ampicillin enthaltendes L-Medium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl, pH 7,5, im Autoklaven behandelt) geimpft und über Nacht kultiviert.
0,2% Glucose und 5 mg/ml Casaminosäure enthaltendes M9-Medium (0,6% Na&sub2;HPO&sub4;, 0,3% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% NaCl, 0,1% wäßrige NH&sub4;Cl-Lösung, pH 7,4) wurde im Autoklaven behandelt und dem Medium wurden eine separat im Autoklaven behandelte wäßrige MgSO&sub4;-Lösung und wäßrige CaCl&sub2;-Lösung zugegeben, bis eine Endkonzentration von 2 mM bzw. 0,1 mM erreicht wurde. Diesem Medium wurde die obengenannte, über Nacht kultivierte Zellkultur bis 0,1 von OD&sub6;&sub6;&sub0; zugegeben und bei 37º C kultiviert. Als der OD&sub6;&sub6;&sub0;-Wert 0,5 erreichte, wurde 3-β-Indolacrylsäure bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 40 ug/ml zugegeben und die Kultivation unter Schütteln fortgesetzt, bis der OD&sub6;&sub6;&sub0;-Wert bei 37º C 1,0 betrug. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt und mit einer TE-Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, 4 mM EDTA, pH 7,5) gewaschen.
Die gewaschenen Zellen wurden in einem 1/10-Volumen der TE-Pufferlösung suspendiert und mittels eines Ultraschallgeräts (Kubota Shoji, Type 200M) zerrissen. Die zerrissenen Zellen wurden zentrifugiert, wodurch ein ein gewünschtes verschmolzenes Protein enthaltender Niederschlag in Form von Einschlußkörpern erhalten wurde. Der Niederschlag wurde mit einer wäßrigen Lösung von 0,5% Triton X-100 und 1 mM EDTA gewaschenem, nochmals mit einer TE-Pufferlösung gewaschen und in einer wäßrigen Lösung von 7 M Harnstoff und 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) bzw. 6 M Guanidinhydrochlorid und 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) gelöst. Die Lösung wurde gegen eine 20 mM Tris-Hl-Lösung (pH 8,0) dialysiert, wodurch eine wäßrige Lösung des gewünschten Proteins erhalten wurde, und dieser wäßrigen Lösung wurden eine Tris- HCl-Pufferlösung (pH 6,8), SDS und 2-Mercaptoethanol, Ethanol und Glycerin bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 60 mM, 2%, 4% bzw. 10% zugegeben und die Mischung wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (O. K. Laemmli, Nature, 227, 650 (1970) unterworfen. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt. In Fig. 6 repräsentiert die Zeile 1 den folgenden Molekulargewichts-Marker, Zeile 2 aus E. coli HB 101 erhaltene Proteine, Zeile 3 aus E. coli HB 101/pGH-TE erhaltene Proteine und Zeile 4 aus E. coli HB 101/pGH-HE erhaltene Proteine, wobei alle ein Elektrophoresespektrum zeigen.
Anzumerken ist, daß nachfolgend die verschmolzenen Proteine mittels Ionenaustauschchromatographie und Umkehrphasenchromatographie gereinigt wurden.
Protein Molekulargewicht
Lysozym 14400
Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor 21500
Carbonatdehydrase 31000
Ovalbumin 45000
Rinderserumalbumin 66200
Phosphorylase B 92500

Beispiel 5

Spaltung eines verschmolzenen Proteins mit Thrombin

Der in Beispiel 4 durch Kultivieren von pGH-TH-enthaltendem E. coli HB 101 erhaltenen Protein-Lösung wurde Thrombin (Sigma) in einer Menge von 1/200 Gewichtsteil, bezogen auf das Gesamtgewicht des Proteins, zugegeben und eine Reaktion 15 Stunden lang bei 37º C durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde nach denselben Verfahren wie in Beispiel 4 behandelt und einer SDS- Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterzogen. Die Ergebnisse sind in Fig. 7, Zeilen 2 bis 4, dargestellt. Dabei wurde bestätigt, daß ein verschmolzenes Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 20000 mit Thrombin gespalten wurde und zwei Banden zeigte, welche einem von einem menschlichen Wachstumshormon erhaltenen Peptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 14000 bzw. einem gewünschten (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptidfragment mit einem Molekulargewicht von ungefähr 6000 entsprachen. Anzumerken ist, daß in Fig. 7 die Zeile 1 dieselben Molekulargewichts-Marker repräsentiert wie in Fig. 6.

Beispiel 6

Spaltung eines verschmolzenen Proteins mit Hydroxylamin

Die in Beispiel 4 durch Kultivieren von pGH-HE-enthaltendem E. coli HB 101 erhaltene Protein-Lösung wurde auf Endkonzentrationen von 2 M Hydroxylamin und 0,2 M Tris (pH 9,0) eingestellt und eine Reaktion 4 Stunden lang bei 45º C durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde nach denselben Verfahren wie in Beispiel 4 behandelt und einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterzogen. Die Ergebnisse sind in Fig. 7, Zeilen 5 bis 7, dargestellt. Ein verschmolzenes Protein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 20000 wurde mit Hydroxylamin gespalten und zeigte zwei Banden, welche einem von einem menschlichen Wachstumshormon erhaltenen Peptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 14000 und einem gewünschten (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptidfragment mit einem N-endständigen Glycyl-Ende und einem Molekulargewicht von ungefähr 6000 entsprachen.

Beispiel 7

Aus dem in den Beispielen 5 und 6 erhaltenen SDS-Polyacrylamid- Gel wurde eine das gewünschte SLPI-Polypeptidfragment enthaltende Bande ausgeschnitten, das Polypeptid mit 70prozentiger Ameisensäure aus dem Gel extrahiert und der Extrakt filtriert, und nach der Filtration wurde das Filtrat unter vermindertem Druck getrocknet. Die getrocknete Probe wurde in Trifluoressigsäure gelöst, auf einem Polybrene-beschichteten Filter gemäß dem Verfahren von Applied Biosystems immobilisiert und eine Aminosäuresequenz vom N-endständigen Ende wurde bestimmt, indem PTH-Aminosäuren von dem N-endständigen Ende durch einen Protein-Sequenzierer (Applied Biosystems 740A) abgespalten und das Ergebnis mittels eines PTH-Analysators (Applied Biosystems 120A) analysiert wurden. Die Ergebnisse der Aminosäuresequenz ab dem N-ständigen Ende sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Zyklus Nr. (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Fragment Versuchsergebnis Thrombinbehandlung Hydroxyllaminbehandlung Asn Gly Pro Thr Arg
Diese Ergebnisse bestätigen, daß eine Aminosäuresequenz an einem N-endständigen Ende jedes Polypeptids wie oben erhalten mit einer Aminosäuresequenz des gewünschten (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI- Fragments übereinstimmte. Das heißt, es wurde bestätigt, daß ein (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptidfragment korrekt durch Thrombin oder Hydroxylamin freigesetzt worden war.

Beispiel 8

Die Elastase-inhibierende Wirksamkeit des obengenannten exprimierten verschmolzenen Proteins, des mit Thrombin gespaltenen Produkts und des mit Hydroxylamin gespaltenen Produkts wurden wie folgt beurteilt.

Reagenslösung

Pufferlösung: 0,1 M HEPES, 1,0 M NaCl, 0,1% PEG-600 (pH 7,5)
Elastase (Elastase aus polymorphkernigen Leukozyten aus dem menschlichen Sputum): Elastase (EPC Co., Funakoshi Yakuhin) 2 mg/ml Elastase in der Pufferlösung (Vorratslösung) wurden 30000fach in der Pufferlösung verdünnt (1,0 · 10&supmin;&sup8; M).
Substratlösung: 18 mg/ml MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA (Backem) in DSMO (Vorratslösung) wurde 10fach in der Pufferlösung verdünnt (3 · 10&supmin;³ M).
In jede Vertiefung einer ELISA-Mikroplatte mit 96 Vertiefungen wurden 140 ul der obengenannten Pufferlösung, 20 ul der Testprobenlösung und 20 ul der Elastaselösung gegeben. Diese Mischung wurde eine Stunde lang bei 37º C gerührt, danach wurden jeder Vertiefung 20 ul der Substratlösung zugegeben und eine Reaktion eine Stunde lang bei 37º C durchgeführt, um diese zu entwickeln. Die Absorption bei 405 nm wurde gemessen und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Probe Behandlung Elastase-inhibierende Aktivität
Verschmolzenes Protein zeigte eine Elastase-inhibierende Aktivität, unabhängig von der Behandlung mit Thrombin oder Hydroxylamin.

Beispiel 9

Sulfonierung des Cystein-Rests eines verschmolzenen Proteins

250 mg des in Beispiel 5 erhaltenen verschmolzenen Proteins wurden in 100 ml von 7 M Harnstoff und 0,5 M Tris-HCl (pH 8,2) gelöst und Natriumsulfit (Wako Junyaku) wurde der entstandenen Lösung bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 0,3 mM zugegeben und 30 Minuten lang bei 45º C umgesetzt. Als nächstes wurde Natriumtetrathionat (Sigma) bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 0,05 mM dazugegeben und bei 45º C 30 Minuten lang umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde in eine Dialyse- Röhre (10 K) gegeben und einmal gegen 10 l Wasser und zweimal gegen 10 l einer 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,5) dialysiert.

Beispiel 10

Spalten eines sulfonierten verschmolzenen Proteins mit Thrombin

Der in Beispiel 9 erhaltenen Lösung von sulfoniertem verschmolzenen Protein wurde Kalbsthrombin (Sigma) in einer Menge von 1/2000 Gewichtsteilen, bezogen auf das Gesamtgewicht des Proteins, zugegeben und eine Reaktion 12 Stunden lang bei 37º C durchgeführt. Die Ergebnisse det Umkehr-HPLC-Analyse für einen Aliquoten der Reaktionsmischung sind in Fig. 8 gezeigt. Außerdem wurde eine Fraktion einer jeden Bande mittels SDS-PAGE erhalten und analysiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 gezeigt. Die N-endständige Aminosäuresequenz für jede Fraktion wurde unter Verwendung eines Protein-Sequenzierers (Applied Biosystems 470A) und eines PTH-Analysators (Applied Biosystems 470A) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Banden-Nummer Zyklus-Nummer Asn Pro Thr Arg Lys Gly Ala His Leu Met Phe Ile
Anhand der oben angeführten Ergebnisse wurde festgestellt, daß das gewünschte sulfonierte Derivat des (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI- Polypeptidfragments der Bande 1 entspricht. Der Banden-Wert 1 wurde unter Verwendung einer präparativen Säule (Vydac-214 TP1010) erhalten und nach dem Lyophilisieren wurden 2 mg eines sulfonierten Derivats des (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptidfragments erhalten.

Beispiel 11

Rückfalten des sulfonierten Derivats des (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI- Polypeptidfragments in ein aktives Molekül

Zwei mg eines in Beispiel 10 erhaltenen sulfonierten Derivats des (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptidfragments wurden in 1 ml von 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) gelöst, 2-Mercaptoethanol wurde der Lösung bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 1% zugegeben und zwei Stunden lang eine Reaktion bei 45º C durchgeführt. Dieser Lösung wurde 1 ml 3 M Natriumacetat (pH 5,0) zugegeben und die Mischung in eine Dialyse-Röhre gegeben und gegen 10 l einer 50 mM Natriumacetat (pH 5,0), 10 uM oxidiertes Glutathion und 20 uM reduziertes Glutathion enthaltenden Lösung dialysiert, und danach zweimal gegen eine 50 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,5) dialysiert. Die erhaltene Lösung wurde dann einer Trennung mittels Umkehrphasen-HPLC unterworfen, wodurch 1 mg eines aktiven (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptidfragments erhalten wurde. Das Muster der Trennung durch HPLC ist in Fig. 10 gezeigt.

Beispiel 12

Assay der Serin-Protease-inhibierenden Aktivität des aktiven (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptidfragments

Das durch Rückfalten anhand des in Beispiel 11 dargestellten Verfahrens erhaltene aktive (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptidfragment wurde gemessen, um seine inhibitorische Aktivität bezüglich verschiedener Serin-Proteasen zu bestimmen. Eines dieser Assay-Ergebnisse ist im folgenden gezeigt.
Puffer: 0,1 M HEPES, 1,0 M NaCl, 0,1% PEG-6000 (pH 7,5)
Enzymlösung: Die folgenden Enzyme wurden in den obengenannten Pufferlösungen mit einer zehnmal höheren Konzentration als die in Tabelle 4 dargestellte Konzentration gelöst.
(1) Elastase von polymorphkernigen Leukozyten aus dem menschlichen Sputum (EPC Co.; Funakoshi Yakuhin)
(2) Kalbspankreas-Trypsin (Sigma)
(3) Kalbspankreas-Chymotrypsin (Sigma)
(4) Schweinepankreas-Elastase (Sigma)
(5) Thrombin aus dem menschlichen Plasma (Kabi, Daiichi Kagaku Yakuhin)
(6) Plasmin aus dem menschlichen Plasma (Kabi, Daiichi Kagaku Yakuhin)
(7) Kallikrein aus dem menschlichen Plasma (Kabi, Daiichi Kagaku Yakuhin)
Substratlösung: Für die obengenannten Enzyme (1) bis (7) wurden jeweils die folgenden Substrate (1) bis (7) in Dimethylsulfoxid bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 10 mM gelöst, um Vorratslösungen herzustellen, welche dann in der obengenannten Pufferlösung bis zum Erreichen von Konzentrationen, welche das Zehnfache der Endkonzentrationen betrugen, gelöst wurden, wodurch Substratlösungen hergestellt wurden.
Substrat Endkonzentration in der Reaktionsmischung
1) Backeut 2) Kabi; Daiichi Kagaku Yakuhin
In jede Vertiefung einer ELISA-Mikroplatte mit 96 Vertiefungen wurden 140 ul der obengenannten Pufferlösung, 20 ml einer Testprobenlösung und 20 ul der Enzymlösung gegeben. Diese Mischung wurde bei 37º C 30 Minuten lang gerührt. Danach wurden jeder Vertiefung 20 ul der Substratlösung zugegeben, die Mischung bei 37º C eine Stunde lang gerührt, um diese zu entwickeln, und die Absorption bei 405 nm gemessen. Als inhibierende Proteine wurden ein aktives (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptidfragment sowie α&sub1;-AT (Sigma) und Aprotinin (Boehringer) als positives Kontrollbeispiel verwendet. Die jeweilige inhibierende Aktivität wurde bei verschiedenen Konzentrationen dieser Proteine gemessen und eine Konzentration eines inhibierenden Proteins berechnet, bei welcher eine Inhibierung von 50% auftritt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Enzym (Konzentration) (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;) Aprotinin Elastase von polymorphkernigen Leukozyten aus dem menschl. Sputum Kalbspankreas-Trypsin Kalbspankreas-Chymotrypsin Schweinepankreas-Elastase Thrombin aus dem menschlichen Plasma Kallikrein aus dem menschlichen Plasma
Außerdem wurde eine Inhibierungskonstante Ki des vorliegenden (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI auf der Basis der obenstehenden Daten gemäß einer Methode von Dixon, M. und Webb, E.C. (1979), Enzyme, Longman, oder einer Methode von Henderson, P.J.F. (1972) Biochem. J., 127, 321-333, berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 Enzyme Dioxin-Methode Henderson-Methode Elastase von polymorphkernigen Leukozyten aus dem menschlichen Sputum Rinderpankreas-Trypsin
Wie aus Tabelle 5 ersichtlich ist, beträgt ein Verhältnis der Konstante der Inhibierung von Elastase von polymorphkernigen Leukozyten aus dem menschlichen Sputum [Ki(E)] zur Konstante der Inhibierung von Kalbspankreas-Trypsin [Ki(T)], d. h. [Ki(E)/Ki(T)], 1/100 bis 1/1000, wodurch deutlich wird, daß im Vergleich zu einem natürlich vorkommenden SLPI die Spezifizität für Elastase erhöht ist. Anzumerken ist, daß bei einem natürlich vorkommenden SLPI Ki(E) bekanntlich ungefähr äquivalent zu Ki(T) ist , R. C. Thompson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 6692 (1980).

Beispiel 13

Auswirkung von Serumalbumin auf die inhibierende Aktivität

Die Aktivität von einer aktiven Form des (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI- Polypeptidfragments zur Inhibierung von Elastase von polymorphkernigen Leukozyten aus dem menschlichen Sputum wurde anhand derselben Methode wie in Beispiel 12 in Anwesenheit von 0,8% bzw. 8% Kalbsserumalbumin gemessen. Das Kalbsserumalbumin hatte keine Wirkung auf seine Aktivität und aufgewiesen wurde jeweils eine äquivalente inhibierende Aktivität.

Beispiel 14

Wärmebeständigkeit

Nach der zweistündigen Behandlung einer Lösung eines aktiven (Asn&sup5;&sup5;-Ala¹&sup0;&sup7;)-SLPI-Polypeptidfragments in 50 mM Tris-HCl (pH 7,8) bei 50º C wurde die Aktivität zur Inhibierung von Elastase von polymorphkernigen Leukozyten aus dem menschlichen Sputum gemessen. Die Aktivität wurde auf demselben Niveau beibehalten.

INDUSTRIELLE VERWENDBARKEIT

Da das vorliegende Elastase-inhibierende Polypeptid eine hohe Elastase-inhibierende Aktivität, jedoch eine geringe Aktivität zur Inhibierung anderer Serin-Proteasen, insbesondere von Trypsin-ähnlichen Serin-Proteasen, aufweist, ist es als nützliches Behandlungsmittel zum Verhindern des Fortschreitens von Emphysemen vielversprechend.
Ferner ist das vorliegende System für die Expression eines verschmolzenen Proteins unter Verwendung eines menschlichen Wachstumshormons oder eines Teils hiervon sehr effizient und kann universell für die Herstellung eines verhältnismäßig niedermolekularen Peptids durch Gen-Rekombination verwendet werden.

Claims

1. Elastase inhibierendes Polypeptid oder Homopolymer hiervon mit einer Aminosäuresequenz gemäß Formel (I):

oder einem Teil der Formel (I), worin eine oder mehr als eine Aminosäure vom N-ständigen Ende der in Klammern stehenden Aminosäuresequenz entfernt ist, worin X Gly repräsentiert oder fehlt und n eine ganze Zahl von 1 bis 10 repräsentiert, dadurch gekennzeichnet, daß die Trypsin-ähnliche Serin-Protease inhibierende Aktivität des Polypeptids 1/100 der Elastase inhibierenden Aktivität nicht übersteigt.

2. Elastase inhibierendes Polypeptid oder Homopolymer hiervon entsprechend Anspruch 1, worin die Trypsin-ähnliche Serin- Protease inhibierende Aktivität des Polypeptids 1/1000 der Elastase inhibierenden Aktivität nicht übersteigt.

3. Elastase inhibierendes Polypeptid oder Homopolymer hiervon gemäß Anspruch 1 oder 2, worin 1 bis 8 Cystein-Reste sulfoniert sind.

4. Verschmolzenes Protein entsprechend der Formel (II):

Y - B - Z (II)

worin Y ein Trägerprotein, welches ein menschliches Wachstumshormon oder ein Fragment hiervon enthält, repräsentiert;

worin Z ein Elastase inhibierendes Polypeptid oder ein Homopolymer hiervon gemäß Anspruch 1 oder 2 repräsentiert; und

B ein Kopplungspeptid oder -polypeptid mit einer Aminosäuresequenz repräsentiert, welche chemisch oder biologisch unter Bedingungen spaltbar ist, unter denen das Protein nicht denaturiert wird; worin B mit Asn am Aminoende in Z verknüpft ist.

5. Verschmolzenes Protein nach Anspruch 4, worin in der Formel (II) 1 bis 8 Cystein-Reste sulfoniert sind.

6. Verschmolzenes Protein nach Anspruch 4, worin das Trägerprotein ein Polypeptidfragment vom ersten Aminosäurerest Phe bis zum 139. Aminosäurerest Phe eines natürlich vorkommenden menschlichen Wachstumshormons ist.

7. Verschmolzenes Protein nach Anspruch 4, worin das Trägerprotein ein Polypeptidfragment vom ersten Aminosäurerest Phe bis zum 122. Aminosäurerest Gln eines natürlich vorkommenden menschlichen Wachstumshormons ist.

8. Verschmolzenes Protein nach Anspruch 4, worin B ein Kopplungspeptid oder -polypeptid mit einer aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählten Aminosäuresequenz ist, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und Asn an einem Aminoende in Z mit Gly, Arg bzw. Arg in B verknüpft ist.

9. Verfahren zur Herstellung eines Elastase inhibierenden Polypeptids oder Homopolymeren hiervon, entsprechend der Formel (I) in Anspruch 1, worin X Gly repräsentiert, umfassend den Schritt der Behandlung eines verschmolzenen Proteins gemäß der Formel (IV):

worin Y und Z die Bedeutung, wie im Zusammenhang mit der Formel (II) definiert, haben, n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und worin Gly in der Formel (IV) mit einem N-endständigen Asn in Z verknüpft ist, mit Hydroxylamin oder einem Analogen hiervon.

10. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder eines Homopolymeren hiervon, entsprechend Formel (I) aus Anspruch 1, worin X fehlt, umfassend den Schritt der Behandlung eines verschmolzenen Proteins gemäß der Formel (V):

Y - B' - Z (V)

worin Y und Z die Bedeutungen aufweisen, wie sie für Formel (II) definiert wurden, worin

repräsentiert, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist, und worin Asn in Z mit Arg in B' mittels Thrombin oder einem Analogen hiervon verknüpft ist.

11. Gen für ein verschmolzenes Protein, umfassend ein für ein als Trägerprotein fungierendes menschliches Hormon oder ein Fragment hiervon kodierendes Gen, welches mit einem für ein gewünschtes Protein oder ein Teil hiervon kodierenden Gen über ein ein Kopplungspeptid oder Homopolymer hiervon kodierendes Gen verknüpft ist, wobei das Kopplungspeptid oder das Homopolymer hiervon eine Aminosäuresequenz aufweist, welche chemisch oder biologisch unter einer Bedingung spaltbar ist, unter der das gewünschte Protein nicht denaturiert wird.

12. Gen nach Anspruch 11, worin das Protein oder Protein hiervon ein Elastase inhibierendes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Formel (III) oder einem Teil hiervon ist, welches eine Elastase inhibierende Aktivität zeigt, oder eine biologisch hierzu äquivalente Aminosäuresequenz.

13. Gen für ein verschmolzenes Protein nach Anspruch 11, worin die Aminosäuresequenz, welche chemisch oder biologisch unter der Bedingung spaltbar ist, unter der das gewünschte Protein nicht denaturiert wird,

ist, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist.

14. Gen für ein verschmolzenes Protein nach Anspruch 11, worin das Trägerprotein ein Polypeptid von dem ersten Aminosäurerest Phe bis zum 139. Aminosäurerest Phe eines natürlich vorkommenden menschlichen Wachstumshormons ist.

15. Plasmid zur Expression eines Gens für ein verschmolzenes Protein, umfassend das Gen für ein verschmolzenes Protein gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14.

16. Transformierte Zelle eines Mikroorganismus, welche das Gen für ein verschmolzenes Protein gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14 trägt.