JPH01132397A - アポエクオリンの製造法 - Google Patents
アポエクオリンの製造法Info
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- JPH01132397A JPH01132397A JP62291640A JP29164087A JPH01132397A JP H01132397 A JPH01132397 A JP H01132397A JP 62291640 A JP62291640 A JP 62291640A JP 29164087 A JP29164087 A JP 29164087A JP H01132397 A JPH01132397 A JP H01132397A
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
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-
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- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
[技術の分野]
本発明は組換えDNAの手法を用いるカルシュラム受容
発光蛋白エクオリンの蛋白部分(アポエクオリン)の菌
体外での培養に関する製造法及び該培養の濾液からアポ
エクオリン精製法に関する。
発光蛋白エクオリンの蛋白部分(アポエクオリン)の菌
体外での培養に関する製造法及び該培養の濾液からアポ
エクオリン精製法に関する。
[従来の技術とその問題点]
天然のエクオリンは、米国ワシントン州フライデー、ハ
ーバ−島近郊に生育する発光オワンクラゲの全周辺に存
在する細胞内に存在する発光蛋白質であり、約5トンの
クラゲより精製エクオリンが 200ff1g程度得ら
れているのみである。
ーバ−島近郊に生育する発光オワンクラゲの全周辺に存
在する細胞内に存在する発光蛋白質であり、約5トンの
クラゲより精製エクオリンが 200ff1g程度得ら
れているのみである。
この発光蛋白エクオリンは、Ca’+イオンと特異的に
結合して発光することにより、種々の分析に利用されて
来た。しかし、その供給量が十分でないため、その有効
性(微弱発光利用による分析)が十分に活用されていな
い。
結合して発光することにより、種々の分析に利用されて
来た。しかし、その供給量が十分でないため、その有効
性(微弱発光利用による分析)が十分に活用されていな
い。
そこで我々は、組換えDNAの手法を用いてエクオリン
の蛋白質部分(アポエクオリン)を産生させ、還元剤、
基質等との混合によりエクオリン活性を有する再生エク
オリンを作成することに成功している(特願昭8O−2
8025iIf号、同61−249098号)。
の蛋白質部分(アポエクオリン)を産生させ、還元剤、
基質等との混合によりエクオリン活性を有する再生エク
オリンを作成することに成功している(特願昭8O−2
8025iIf号、同61−249098号)。
しかし、未だアポエクオリンを大量に産生させ、精製す
るには到っていなかった。そこで菌体外発現ベクターp
iP−HE (特願昭131−248088号)を用い
て種々培養条件の検討を行い、アポエクオリンを菌体外
、すなわち培養濾液に菌体内と同程度(20gg〜50
p g /ml )のアポエクオリンの産生を検出する
ことができた。
るには到っていなかった。そこで菌体外発現ベクターp
iP−HE (特願昭131−248088号)を用い
て種々培養条件の検討を行い、アポエクオリンを菌体外
、すなわち培養濾液に菌体内と同程度(20gg〜50
p g /ml )のアポエクオリンの産生を検出する
ことができた。
以上の記述から明らかなように、本発明の目的は、アポ
エクオリンの菌体外生産方法とその精製法を提供するこ
とである。
エクオリンの菌体外生産方法とその精製法を提供するこ
とである。
[問題点を解決するための手段]
本発明(二発明)は、下記(1)および(2)の主要構
成と(3)〜(4)の実施態様的構成を有する。
成と(3)〜(4)の実施態様的構成を有する。
(1)菌体外発現ベクターpiP−HEを大陽菌にトラ
ンスフオームした菌株を培養し、培養液を菌体と培養濾
液に分離して培養濾液を取得することを特徴とするアポ
エクオリンの製造法。
ンスフオームした菌株を培養し、培養液を菌体と培養濾
液に分離して培養濾液を取得することを特徴とするアポ
エクオリンの製造法。
(2)菌体外発現ベクターpiP−HEを大陽菌にトラ
ンスフオームした菌株を培養し、培養液を菌体と培養濾
液に分離して得られた培養濾液に酸類を添加してそのp
Hが4.7以下となる如く処理して白色法Vを取得する
ことを特徴とするアポエクオリンの製造法。
ンスフオームした菌株を培養し、培養液を菌体と培養濾
液に分離して得られた培養濾液に酸類を添加してそのp
Hが4.7以下となる如く処理して白色法Vを取得する
ことを特徴とするアポエクオリンの製造法。
(3)白色沈澱を緩衝液に溶解し、還元剤を添加して還
元処理することを特徴とする前記第(2)項に記載の製
造法。
元処理することを特徴とする前記第(2)項に記載の製
造法。
(4)還元処理されたアポエクオリンフラクションを陰
イオン交換クロマトグラフィー法により吸着処理する前
記第(3)項に記載の製造法。
イオン交換クロマトグラフィー法により吸着処理する前
記第(3)項に記載の製造法。
(5)陰イオン交換クロマトグラフィー法により吸着処
理して取得されたアポエクオリンをゲル濾過法により処
理する前記第 (4)項に記載の製造法。
理して取得されたアポエクオリンをゲル濾過法により処
理する前記第 (4)項に記載の製造法。
本発明(二発明)の構成と効果につき以下に詳述する。
本発明に使用する菌株は、菌体外発現ベクターpiP−
HEを大陽菌にトランスフオームした菌株である。該p
iP−HEに関しては、本発明者らの発明になる特願昭
81−249088号(以下先順ということがある)に
詳述されているが、その構成を説明するpiP−HE構
築工程図は、第1図のとおりである。
HEを大陽菌にトランスフオームした菌株である。該p
iP−HEに関しては、本発明者らの発明になる特願昭
81−249088号(以下先順ということがある)に
詳述されているが、その構成を説明するpiP−HE構
築工程図は、第1図のとおりである。
同図において、pUC8は高コピーのクローニングベク
ターであり、pAQ440はクラゲ発光蛋白エクオリン
のクローンプラスミドである。両者から図に示すように
pi08HEを作成し、これにpINII[II3om
pA−1から切り出したボブロチインのプロモーター
(Ipp、P)、ラクトースオペロンのプロモーターと
オペレーター(]qcPO)及びシグナルペプチド領域
を含むフラグメントをpiQ8−HEの5caI/Hi
ndlV部分に挿入しpiP−HEを構成する。
ターであり、pAQ440はクラゲ発光蛋白エクオリン
のクローンプラスミドである。両者から図に示すように
pi08HEを作成し、これにpINII[II3om
pA−1から切り出したボブロチインのプロモーター
(Ipp、P)、ラクトースオペロンのプロモーターと
オペレーター(]qcPO)及びシグナルペプチド領域
を含むフラグメントをpiQ8−HEの5caI/Hi
ndlV部分に挿入しpiP−HEを構成する。
piP−HEの大陽菌へのトランスフオーム方法につい
ては、公知の方法に従う。好ましい大陽菌としては01
210若しくはLE392を挙げることができる。
ては、公知の方法に従う。好ましい大陽菌としては01
210若しくはLE392を挙げることができる。
A、−′1菌の拍′ (製造条件)
piP−HEを有する大陽菌を適当な培地(例えばL−
培地)で培養する。培養条件は限定されないが、例えば
37℃−昼夜振とう培養する。培地中には、適当量(例
えば50gg/mJL)のアンピシリンを話加するのが
好ましい。
培地)で培養する。培養条件は限定されないが、例えば
37℃−昼夜振とう培養する。培地中には、適当量(例
えば50gg/mJL)のアンピシリンを話加するのが
好ましい。
かくして得られた培養液の一部を約100倍量のM9培
地(注0組成例は後述の実施−参照)に加えて振とう培
養する。該培地には、好ましくは少量の0.2%カザミ
ノ酸(Difco社製品)を添加する。
地(注0組成例は後述の実施−参照)に加えて振とう培
養する。該培地には、好ましくは少量の0.2%カザミ
ノ酸(Difco社製品)を添加する。
培養温度は30〜42℃、好ましくは40℃で、培養時
間は12〜20時間程度である。
間は12〜20時間程度である。
以上の培養により培養液中の菌体外部分に大量のアポエ
クオリンが産生される。産生されたアポエクオリンの確
認は、後述の実施例に係る第2図に示すように、分子量
マーカーと天然のエクオリンを基準としてSO3−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により可能である。同図
において1〜5は、それぞれ に分子量マーカー 2 : pU08を含む大陽菌菌体(200u、u相当
)3 : piP−HEを含む大陽菌菌体(同上)4
: piP−HEを含む大陽菌の培養濾液(50に文相
当) 5:天然のエクオリン(5ILg) を示す。
クオリンが産生される。産生されたアポエクオリンの確
認は、後述の実施例に係る第2図に示すように、分子量
マーカーと天然のエクオリンを基準としてSO3−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により可能である。同図
において1〜5は、それぞれ に分子量マーカー 2 : pU08を含む大陽菌菌体(200u、u相当
)3 : piP−HEを含む大陽菌菌体(同上)4
: piP−HEを含む大陽菌の培養濾液(50に文相
当) 5:天然のエクオリン(5ILg) を示す。
第2図は、明らかに菌体外に大量のアポエクオリンが検
出されていることを示している。
出されていることを示している。
後述の実施例に係る第3図は、12.5重量%の5DS
−ポリアクリルアミドゲルを用いて上述の培養物につい
てアポエクオリンの生成の確認を行ったものである。同
図において −・−は、piP−HEを有する大陽菌([11210
)の生成を −0−は、菌体内のエクオリン活性をそして−W−は、
培養濾液のエクオリン活性を示す。同図から、取得精製
には十分な量のアポエクオリンが生成していることが明
らかである。
−ポリアクリルアミドゲルを用いて上述の培養物につい
てアポエクオリンの生成の確認を行ったものである。同
図において −・−は、piP−HEを有する大陽菌([11210
)の生成を −0−は、菌体内のエクオリン活性をそして−W−は、
培養濾液のエクオリン活性を示す。同図から、取得精製
には十分な量のアポエクオリンが生成していることが明
らかである。
B、菌」づ久3JL法
上述Aで得られた培養液を公知方法で分離して菌体と培
養濾液とする。該分離方法は限定されないが、好ましく
は高速遠心機を用い、好ましくは5〜15分程度遠心処
理して菌体を分離し培養濾液を取得する。処理温度は、
上述の培養温度以下0℃以上であればよく、通常は室温
(15〜25℃)で支障なく実施できる。得られた培養
源、液のエクオリン活性・については上述Aに述べた。
養濾液とする。該分離方法は限定されないが、好ましく
は高速遠心機を用い、好ましくは5〜15分程度遠心処
理して菌体を分離し培養濾液を取得する。処理温度は、
上述の培養温度以下0℃以上であればよく、通常は室温
(15〜25℃)で支障なく実施できる。得られた培養
源、液のエクオリン活性・については上述Aに述べた。
C0培″°からの7ポエクオリンの1
」二連Bで得られた培養濾液を次のように酸性処理する
ことにより、濃縮されたアポエクオリンを取得する。該
酸性処理とは、培養濾液に酸類を添加してそのPHを5
以下1程度、好ましくは4.7以下に子ることである。
ことにより、濃縮されたアポエクオリンを取得する。該
酸性処理とは、培養濾液に酸類を添加してそのPHを5
以下1程度、好ましくは4.7以下に子ることである。
使用する酸の種類は限定されないが、好ましくは弱酸、
殊に水溶性の有機酸が好ましい。
殊に水溶性の有機酸が好ましい。
その具体例としては希塩酸、希硫酸のような無機酸、ト
リクロロ酢酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、醋酸のよう
な脂肪族モノカルボン酸、修酸、マレイン酸のような脂
肪族ポリカルボン酸、安息香酸、ケイ皮酸のような芳香
族カルボン酸、アスコルビン酸、クエン酸のような脂肪
族オキシカルボン酸を挙げることができる。
リクロロ酢酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、醋酸のよう
な脂肪族モノカルボン酸、修酸、マレイン酸のような脂
肪族ポリカルボン酸、安息香酸、ケイ皮酸のような芳香
族カルボン酸、アスコルビン酸、クエン酸のような脂肪
族オキシカルボン酸を挙げることができる。
か覧る酸類と培養濾液の混合方法は限定されないが、好
ましくは撹拌下の培養濾液に、酸類若しくはその水溶液
等を滴下して該濾液のpHを徐々に低下せしめる(注、
酸類添加前のpHはおおむね6.8〜7.2程度である
)。以上のような酸処理は、0〜40℃、好ましくは0
〜15°Cで5分〜2時間行い、終了後1〜30時間、
好ましくは5〜15時rIIiO〜4℃で放置する。
ましくは撹拌下の培養濾液に、酸類若しくはその水溶液
等を滴下して該濾液のpHを徐々に低下せしめる(注、
酸類添加前のpHはおおむね6.8〜7.2程度である
)。以上のような酸処理は、0〜40℃、好ましくは0
〜15°Cで5分〜2時間行い、終了後1〜30時間、
好ましくは5〜15時rIIiO〜4℃で放置する。
アポエクオリンは白色沈澱となって、上述のPHの低下
処理中から析出するが、酸処理後の放置により沈澱が完
結し、収率が向上する。かくして得られた沈澱(濃縮ア
ポエクオリン)を培養濾液と分離して取得する。分離方
法は限定されないが、通常遠心分離法が採用される。
処理中から析出するが、酸処理後の放置により沈澱が完
結し、収率が向上する。かくして得られた沈澱(濃縮ア
ポエクオリン)を培養濾液と分離して取得する。分離方
法は限定されないが、通常遠心分離法が採用される。
D、還うヒ剤」L理
上述のCで得られた濃縮アポエクオリンを適当な緩衝液
(例えば100mM Tris−Hfll:I(pH7
,8)、 10mMEDTAを含むもの)に溶解させ該
溶液に所定の還元剤を添加する。か覧る還元剤としては
2−メルカプトエタノールを挙げることができるが、勿
論間等に使用できる他の還元剤を使用してもよい。
(例えば100mM Tris−Hfll:I(pH7
,8)、 10mMEDTAを含むもの)に溶解させ該
溶液に所定の還元剤を添加する。か覧る還元剤としては
2−メルカプトエタノールを挙げることができるが、勿
論間等に使用できる他の還元剤を使用してもよい。
還元条件は、還元剤濃度が濃縮アポエクオリン溶液中で
1〜30mM、好ましくは5〜15mKとなるように還
元剤を添加混合し、0〜15℃、好ましくは0〜5℃で
添加後1〜10時間、好ましくは2〜6時間放置して還
元を進行させる。かくして還元処理されたアポエクオリ
ンフラクションが得られる。
1〜30mM、好ましくは5〜15mKとなるように還
元剤を添加混合し、0〜15℃、好ましくは0〜5℃で
添加後1〜10時間、好ましくは2〜6時間放置して還
元を進行させる。かくして還元処理されたアポエクオリ
ンフラクションが得られる。
このように還元剤処理することにより、アポエクオリン
内に生成している −8−8−結合を−SHH3−と解
離させることになる。この還元剤処理を行うことにより
、陰イオン交換クロマトグラフィー法によるアポエクオ
リンの収量(回収率)が30%以上よくなる。さらには
分離がよくなる。
内に生成している −8−8−結合を−SHH3−と解
離させることになる。この還元剤処理を行うことにより
、陰イオン交換クロマトグラフィー法によるアポエクオ
リンの収量(回収率)が30%以上よくなる。さらには
分離がよくなる。
E、rイオン クロマトグラフ −21この工程は、
アポエクオリンの濃縮、精製を目的とする。上述のDで
得られた還元処理アポエクオリンを陰イオン交換樹脂に
吸着させる。具体的クロマトグラフィー法は限定されな
いが、好ましくは、DEAE−多孔性セルローズ球状粒
子(セルロファインは商品名)によるカラムクロマトグ
ラフィー法を用いる。
アポエクオリンの濃縮、精製を目的とする。上述のDで
得られた還元処理アポエクオリンを陰イオン交換樹脂に
吸着させる。具体的クロマトグラフィー法は限定されな
いが、好ましくは、DEAE−多孔性セルローズ球状粒
子(セルロファインは商品名)によるカラムクロマトグ
ラフィー法を用いる。
使用するカラムは、予め所定量のEDTAおよび2−メ
ルカプトエタノールを含む緩衝液(例えば30mMTr
is−HC:lバッファー、pH7,6)で平衡化して
おく。
ルカプトエタノールを含む緩衝液(例えば30mMTr
is−HC:lバッファー、pH7,6)で平衡化して
おく。
該カラムに上述の還元剤処理アポエクオリンを吸着させ
、つづいて前述の緩衝液で洗浄し、洗浄された液の吸光
度が一定値(0,01(280nm) )に次のアポエ
クオリンの溶出と分注を行う。
、つづいて前述の緩衝液で洗浄し、洗浄された液の吸光
度が一定値(0,01(280nm) )に次のアポエ
クオリンの溶出と分注を行う。
すなわち、アポエクオリンの溶出は0→0.4HのMa
ilの直線濃度勾配で行い、一定量(例えば各8m l
)で分注する。溶出流速は限定されないが、例えば1
0〜40m l / hr、好ましくは20〜30m1
/hrである。後述の実施例に係る第4図は、以上のよ
うなカラムクロマトグラフィーの結果を示す。
ilの直線濃度勾配で行い、一定量(例えば各8m l
)で分注する。溶出流速は限定されないが、例えば1
0〜40m l / hr、好ましくは20〜30m1
/hrである。後述の実施例に係る第4図は、以上のよ
うなカラムクロマトグラフィーの結果を示す。
図において、
−・−:エクオリン活性、
−++++ : N5C1の塩濃度勾配、・・−−−:
0D280での吸光度 を示す。同図から、塩濃度が0.15〜0.2Mの部分
の溶出物にエクオリン活性が検出されている。後述の実
施例に係る第5図は該部分のアポエクオリンの純度を1
2.5重量%の5O5−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法で検定した結果を示す。
0D280での吸光度 を示す。同図から、塩濃度が0.15〜0.2Mの部分
の溶出物にエクオリン活性が検出されている。後述の実
施例に係る第5図は該部分のアポエクオリンの純度を1
2.5重量%の5O5−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法で検定した結果を示す。
図において、Mは分子量マーカーを示す。各フラクショ
ンにおけるアポエクオリンの純度は、デンシトメーター
(島津製作所■製dual−wavelength c
hromato 5canner C5−930) テ
測定する。後述実施例では、フラクションの最高濃度の
ものは純度95%以上であった。
ンにおけるアポエクオリンの純度は、デンシトメーター
(島津製作所■製dual−wavelength c
hromato 5canner C5−930) テ
測定する。後述実施例では、フラクションの最高濃度の
ものは純度95%以上であった。
F、ゲル濾過
上述Eで得られたアポエクオリンについて更に高純度の
ものが必要の場合には、本工程を実施する。
ものが必要の場合には、本工程を実施する。
例えば、セファデックスG−100(ファルマシャ社■
製) (1,8X 100cm)のカラムを10mM
EDTA、1mMメルカプトエタノールを含む3Ql
7ris−HCI(pH7,[l)バッファーで平衡化
した後、上述EのDEAE−イオンクロマトグラフィー
より溶出したアポエクオリンを供給して処理する。流出
速度は限定されないが、例えば2〜10mu/hr、好
ましくは5m文/hrである・ [発明の効果] 以上に示された本発明の方法は、蛋白精製において非常
に有効であり、重要な点である。培養液に合成培地を用
いることにより、不純物の混入をふせぐことも可能であ
り、培養濾液にアポエクオリンを分泌生産させることに
より、以下の精製が容易となる。すなわち、培養濾液の
蛋白質の60%以上はアポエクオリンであり、容易な濃
縮法として、酸性処理を利用することにより培養濾液か
らの濃縮が可能となった。
製) (1,8X 100cm)のカラムを10mM
EDTA、1mMメルカプトエタノールを含む3Ql
7ris−HCI(pH7,[l)バッファーで平衡化
した後、上述EのDEAE−イオンクロマトグラフィー
より溶出したアポエクオリンを供給して処理する。流出
速度は限定されないが、例えば2〜10mu/hr、好
ましくは5m文/hrである・ [発明の効果] 以上に示された本発明の方法は、蛋白精製において非常
に有効であり、重要な点である。培養液に合成培地を用
いることにより、不純物の混入をふせぐことも可能であ
り、培養濾液にアポエクオリンを分泌生産させることに
より、以下の精製が容易となる。すなわち、培養濾液の
蛋白質の60%以上はアポエクオリンであり、容易な濃
縮法として、酸性処理を利用することにより培養濾液か
らの濃縮が可能となった。
さらに2−メルカプトエタノール等の還元剤で処理を行
った後、陰イオン交換体(DEAE・セルロファイン)
クロマトグラフィー法により、純度95%以上のアポエ
クオリンを200mKLの培養濾液から約7mg得た。
った後、陰イオン交換体(DEAE・セルロファイン)
クロマトグラフィー法により、純度95%以上のアポエ
クオリンを200mKLの培養濾液から約7mg得た。
この収量は約 150kgのクラゲより分離したアポエ
クオリンに相当する。
クオリンに相当する。
菌体外分泌ベクターによるアポエクオリンの産生条件の
確立及び精製法の確立により、大量のエクオリンの調製
の道が可能となり、その波及効果は大きい。
確立及び精製法の確立により、大量のエクオリンの調製
の道が可能となり、その波及効果は大きい。
以下、実施例により本発明を説明する。
[実施例]
菌体外発現ベクター(piP−HE)を大陽菌にトラン
スフオームした菌株を用いる。好ましい大陽菌としては
01210 、 LE392などである。piP−HE
のプラスミドを第1図に示す。
スフオームした菌株を用いる。好ましい大陽菌としては
01210 、 LE392などである。piP−HE
のプラスミドを第1図に示す。
以下上記菌株を用いて発現させるアポエクオリンの製造
法と精製法について述べる。
法と精製法について述べる。
(1)大陽菌の培養条件(製造条件)
piP−HEを有する大陽菌を50gg/+nJJのア
ンピシリンを含む適当な培地(たとえばL−培地:1文
中にバクトドリプトン10g;イーストエキストラクト
5g;塩化ナトリウム5g) 10II1文にて37℃
で一昼夜、振とう培養を行う。
ンピシリンを含む適当な培地(たとえばL−培地:1文
中にバクトドリプトン10g;イーストエキストラクト
5g;塩化ナトリウム5g) 10II1文にて37℃
で一昼夜、振とう培養を行う。
この培養液2m文を200ffi立の0.2%カザミノ
酸(Difco社)を含むM9培地(Na2HPO*
6 g; KH2PO43g; NaCl 0.5g;
NH4C11g; 0.2%グルコース:2 mW
MgCl2; 0.1mM GaCl2を1文中に
含)に加え振とう培養を行う。培養温度は40℃である
。培養時間は20時間である。
酸(Difco社)を含むM9培地(Na2HPO*
6 g; KH2PO43g; NaCl 0.5g;
NH4C11g; 0.2%グルコース:2 mW
MgCl2; 0.1mM GaCl2を1文中に
含)に加え振とう培養を行う。培養温度は40℃である
。培養時間は20時間である。
第2図に菌体内外に生成するアポエクオリンと菌体外の
生育の関係を示した。明らかに菌体外に大量のアポエク
オリンが検出されている。12.5%の5DS−ポリア
クリルアミドゲルでアポエクオリンの生成を確認したの
が第3図である。
生育の関係を示した。明らかに菌体外に大量のアポエク
オリンが検出されている。12.5%の5DS−ポリア
クリルアミドゲルでアポエクオリンの生成を確認したの
が第3図である。
培養濾液に20〜50JLg/m4のアポエクオリンが
生成していることがわかり、アポエクオリンの精製には
十分の量である。
生成していることがわかり、アポエクオリンの精製には
十分の量である。
(2)菌体の分離法
培養液から菌体と培養濾液の分離を行う。すなわち、高
速遠心機(8000X g、 10分)遠心分離を行い
菌体を分離する。
速遠心機(8000X g、 10分)遠心分離を行い
菌体を分離する。
(3)培養濾液からアポエクオリンの濃縮法菌体と分離
した培養濾液を酸性処理を行う。酸性処理とは培養濾液
のpHを4.7以下にすることである。pHを下げるた
めに酸類としてINの酢酸を用い、撹拌を行いながらp
H4,2にする。pHが下がるにつれてアポエクオリン
の自沈を生じるが、4℃で一昼夜放置することにより好
回収率が得られる。
した培養濾液を酸性処理を行う。酸性処理とは培養濾液
のpHを4.7以下にすることである。pHを下げるた
めに酸類としてINの酢酸を用い、撹拌を行いながらp
H4,2にする。pHが下がるにつれてアポエクオリン
の自沈を生じるが、4℃で一昼夜放置することにより好
回収率が得られる。
一昼夜放置した上記白沈澱を遠心分離(9oooxg、
10分)で分離する。この沈澱が濃縮アポエクオリンで
ある。
10分)で分離する。この沈澱が濃縮アポエクオリンで
ある。
(4)還元剤処理
濃縮アポエクオリンを100mM Tris−MCI(
pH7,8)。
pH7,8)。
10mM EDTAを含むバッファーに溶解し、還元剤
を添加する。好ましい還元剤としては2−メルカプトエ
タノールを最終濃度が10mMとなるように添加を行い
、2時間以上、4°Cで放置を行う。
を添加する。好ましい還元剤としては2−メルカプトエ
タノールを最終濃度が10mMとなるように添加を行い
、2時間以上、4°Cで放置を行う。
(5)陰イオン交換クロマトグラフィー還元剤存在下で
還元剤処理されたアポエクオリンフラクシせンを、略イ
オン交換クロマトフィーに吸着を行う。DEAE−セル
ロファイン(多孔性セルローズ球状粒子の商品名) A
300(f、OX 18cm)カラムクロマトグラフィ
ー法を用いた。
還元剤処理されたアポエクオリンフラクシせンを、略イ
オン交換クロマトフィーに吸着を行う。DEAE−セル
ロファイン(多孔性セルローズ球状粒子の商品名) A
300(f、OX 18cm)カラムクロマトグラフィ
ー法を用いた。
使用するカラムはあらかじめ10mM EDTA、 1
mW2−メルカプトエタノールを含む30mM Tr
is−HCI(pH7,6)バッファーで平衡化を行っ
ておき、還元剤処理アポエクオリンを吸着させたのち、
同一バッファーで洗浄を行い、吸光度が0.01(28
0nm)以下になったことを確認した後、0→0.4M
のMailの直緑濃度勾配でアポエクオリンを溶出し、
各8 m lで分注する。溶出流速は24mJl/hr
である。
mW2−メルカプトエタノールを含む30mM Tr
is−HCI(pH7,6)バッファーで平衡化を行っ
ておき、還元剤処理アポエクオリンを吸着させたのち、
同一バッファーで洗浄を行い、吸光度が0.01(28
0nm)以下になったことを確認した後、0→0.4M
のMailの直緑濃度勾配でアポエクオリンを溶出し、
各8 m lで分注する。溶出流速は24mJl/hr
である。
第4図にクロマトグラフィーの結果を示す。塩濃度が0
.15〜0.2Nにエクオリン活性が検出されている。
.15〜0.2Nにエクオリン活性が検出されている。
この部分にアポエクオリンが存在することになり、純度
を12.5%の5O5−ポリアクリルアミドゲルを検出
したのが第5図である。フラクション30〜33におい
て、デンシトメーター(島津dua 1−wave!e
ngth chromatoscanner C9−8
30)で得られた純度は85%以上である。
を12.5%の5O5−ポリアクリルアミドゲルを検出
したのが第5図である。フラクション30〜33におい
て、デンシトメーター(島津dua 1−wave!e
ngth chromatoscanner C9−8
30)で得られた純度は85%以上である。
(1)〜(5)の精製段階での収率をまとめたものが下
記第1表である。200mJlの培養濾液より、95%
以上のアポエクオリンが約7mg得られた。
記第1表である。200mJlの培養濾液より、95%
以上のアポエクオリンが約7mg得られた。
表 l アポエクオリンの精製のまとめ注、 村:
I)EAECellulofine−ABO3ただし
、天然のエクオリン1ルgは4XIO5rlu(相対発
光値)となる。
I)EAECellulofine−ABO3ただし
、天然のエクオリン1ルgは4XIO5rlu(相対発
光値)となる。
第1〜5図は、本発明の詳細な説明図である。
第1図は、本発明に使用する発現分泌ベクターpiP−
HEの構築説明図である。 第2図は、piP−HEを有する大陽菌によるアポエク
オリンの産生の確認を示す図である。 第3図は、piP−HEを有する大陽菌の培養時間とア
ポエクオリン生成の関係を示す図である。 第4図は、アポエクオリンのIIEAE−多孔性セルロ
ーズ球状粒子によるクロマトグラフィーの結果を示す図
である。 第5図は、アポエクオリンの5O9−ポリアクリルアミ
ド電気泳動によるアポエクオリンの純度の確認結果を示
す図である。 以」二
HEの構築説明図である。 第2図は、piP−HEを有する大陽菌によるアポエク
オリンの産生の確認を示す図である。 第3図は、piP−HEを有する大陽菌の培養時間とア
ポエクオリン生成の関係を示す図である。 第4図は、アポエクオリンのIIEAE−多孔性セルロ
ーズ球状粒子によるクロマトグラフィーの結果を示す図
である。 第5図は、アポエクオリンの5O9−ポリアクリルアミ
ド電気泳動によるアポエクオリンの純度の確認結果を示
す図である。 以」二
Claims (5)
- (1)菌体外発現ベクターpiP−HEを大陽菌にトラ
ンスフォームした菌株を培養し、培養液を菌体と培養濾
液に分離して培養濾液を取得することを特徴とするアポ
エクオリンの製造法。 - (2)菌体外発現ベクターpiP−HEを大陽菌にトラ
ンスフォームした菌株を培養し、培養液を菌体と培養濾
液に分離して得られた培養濾液に酸類を添加してそのp
Hが4.7以下となる如く処理して白色沈澱を取得する
ことを特徴とするアポエクオリンの製造法。 - (3)白色沈澱を緩衝液に溶解し、還元剤を添加して還
元処理することを特徴とする特許請求の範囲第(2)項
に記載の製造法。 - (4)還元処理されたアポエクオリンフラクションを陰
イオン交換クロマトグラフィー法により吸着処理する特
許請求の範囲第(3)項に記載の製造法。 - (5)陰イオン交換クロマトグラフィー法により吸着処
理して取得されたアポエクオリンをゲル濾過法により処
理する特許請求の範囲第(4)項に記載の製造法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62291640A JP2592623B2 (ja) | 1987-11-18 | 1987-11-18 | アポエクオリンの製造法 |
US07/272,900 US5139937A (en) | 1987-11-18 | 1988-11-18 | Process for producing apoaequorin |
DE8888119212T DE3880440T2 (de) | 1987-11-18 | 1988-11-18 | Verfahren zur herstellung von apoaequorin. |
EP88119212A EP0316933B1 (en) | 1987-11-18 | 1988-11-18 | A process for producing apoaequorin |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62291640A JP2592623B2 (ja) | 1987-11-18 | 1987-11-18 | アポエクオリンの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01132397A true JPH01132397A (ja) | 1989-05-24 |
JP2592623B2 JP2592623B2 (ja) | 1997-03-19 |
Family
ID=17771567
Family Applications (1)
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