JPH01132397A - アポエクオリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術の分野］ 本発明は組換えＤＮＡの手法を用いるカルシュラム受容
発光蛋白エクオリンの蛋白部分（アポエクオリン）の菌
体外での培養に関する製造法及び該培養の濾液からアポ
エクオリン精製法に関する。

［従来の技術とその問題点］ 天然のエクオリンは、米国ワシントン州フライデー、ハ
ーバ−島近郊に生育する発光オワンクラゲの全周辺に存
在する細胞内に存在する発光蛋白質であり、約５トンの
クラゲより精製エクオリンが　２００ｆｆ１ｇ程度得ら
れているのみである。

この発光蛋白エクオリンは、Ｃａ’＋イオンと特異的に
結合して発光することにより、種々の分析に利用されて
来た。しかし、その供給量が十分でないため、その有効
性（微弱発光利用による分析）が十分に活用されていな
い。

そこで我々は、組換えＤＮＡの手法を用いてエクオリン
の蛋白質部分（アポエクオリン）を産生させ、還元剤、
基質等との混合によりエクオリン活性を有する再生エク
オリンを作成することに成功している（特願昭８Ｏ−２
８０２５ｉＩｆ号、同６１−２４９０９８号）。

しかし、未だアポエクオリンを大量に産生させ、精製す
るには到っていなかった。そこで菌体外発現ベクターｐ
ｉＰ−ＨＥ　（特願昭１３１−２４８０８８号）を用い
て種々培養条件の検討を行い、アポエクオリンを菌体外
、すなわち培養濾液に菌体内と同程度（２０ｇｇ〜５０
ｐ　ｇ　／ｍｌ　）のアポエクオリンの産生を検出する
ことができた。

以上の記述から明らかなように、本発明の目的は、アポ
エクオリンの菌体外生産方法とその精製法を提供するこ
とである。

［問題点を解決するための手段］ 本発明（二発明）は、下記（１）および（２）の主要構
成と（３）〜（４）の実施態様的構成を有する。

（１）菌体外発現ベクターｐｉＰ−ＨＥを大陽菌にトラ
ンスフオームした菌株を培養し、培養液を菌体と培養濾
液に分離して培養濾液を取得することを特徴とするアポ
エクオリンの製造法。

（２）菌体外発現ベクターｐｉＰ−ＨＥを大陽菌にトラ
ンスフオームした菌株を培養し、培養液を菌体と培養濾
液に分離して得られた培養濾液に酸類を添加してそのｐ
Ｈが４．７以下となる如く処理して白色法Ｖを取得する
ことを特徴とするアポエクオリンの製造法。

（３）白色沈澱を緩衝液に溶解し、還元剤を添加して還
元処理することを特徴とする前記第（２）項に記載の製
造法。

（４）還元処理されたアポエクオリンフラクションを陰
イオン交換クロマトグラフィー法により吸着処理する前
記第（３）項に記載の製造法。

（５）陰イオン交換クロマトグラフィー法により吸着処
理して取得されたアポエクオリンをゲル濾過法により処
理する前記第　（４）項に記載の製造法。

本発明（二発明）の構成と効果につき以下に詳述する。

本発明に使用する菌株は、菌体外発現ベクターｐｉＰ−
ＨＥを大陽菌にトランスフオームした菌株である。該ｐ
ｉＰ−ＨＥに関しては、本発明者らの発明になる特願昭
８１−２４９０８８号（以下先順ということがある）に
詳述されているが、その構成を説明するｐｉＰ−ＨＥ構
築工程図は、第１図のとおりである。

同図において、ｐＵＣ８は高コピーのクローニングベク
ターであり、ｐＡＱ４４０はクラゲ発光蛋白エクオリン
のクローンプラスミドである。両者から図に示すように
ｐｉ０８ＨＥを作成し、これにｐＩＮＩＩ［ＩＩ３ｏｍ
ｐＡ−１から切り出したボブロチインのプロモーター　
（Ｉｐｐ、Ｐ）、ラクトースオペロンのプロモーターと
オペレーター（］ｑｃＰＯ）及びシグナルペプチド領域
を含むフラグメントをｐｉＱ８−ＨＥの５ｃａＩ／Ｈｉ
ｎｄｌＶ部分に挿入しｐｉＰ−ＨＥを構成する。

ｐｉＰ−ＨＥの大陽菌へのトランスフオーム方法につい
ては、公知の方法に従う。好ましい大陽菌としては０１
２１０若しくはＬＥ３９２を挙げることができる。

Ａ、−′１菌の拍′　　（製造条件） ｐｉＰ−ＨＥを有する大陽菌を適当な培地（例えばＬ−
培地）で培養する。培養条件は限定されないが、例えば
３７℃−昼夜振とう培養する。培地中には、適当量（例
えば５０ｇｇ／ｍＪＬ）のアンピシリンを話加するのが
好ましい。

かくして得られた培養液の一部を約１００倍量のＭ９培
地（注０組成例は後述の実施−参照）に加えて振とう培
養する。該培地には、好ましくは少量の０．２％カザミ
ノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製品）を添加する。

培養温度は３０〜４２℃、好ましくは４０℃で、培養時
間は１２〜２０時間程度である。

以上の培養により培養液中の菌体外部分に大量のアポエ
クオリンが産生される。産生されたアポエクオリンの確
認は、後述の実施例に係る第２図に示すように、分子量
マーカーと天然のエクオリンを基準としてＳＯ３−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により可能である。同図
において１〜５は、それぞれ に分子量マーカー ２　：　ｐＵ０８を含む大陽菌菌体（２００ｕ、ｕ相当
）３　：　ｐｉＰ−ＨＥを含む大陽菌菌体（同上）４　
：　ｐｉＰ−ＨＥを含む大陽菌の培養濾液（５０に文相
当） ５：天然のエクオリン（５ＩＬｇ） を示す。

第２図は、明らかに菌体外に大量のアポエクオリンが検
出されていることを示している。

後述の実施例に係る第３図は、１２．５重量％の５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲルを用いて上述の培養物につい
てアポエクオリンの生成の確認を行ったものである。同
図において −・−は、ｐｉＰ−ＨＥを有する大陽菌（［１１２１０
）の生成を −０−は、菌体内のエクオリン活性をそして−Ｗ−は、
培養濾液のエクオリン活性を示す。同図から、取得精製
には十分な量のアポエクオリンが生成していることが明
らかである。

Ｂ、菌」づ久３ＪＬ法 上述Ａで得られた培養液を公知方法で分離して菌体と培
養濾液とする。該分離方法は限定されないが、好ましく
は高速遠心機を用い、好ましくは５〜１５分程度遠心処
理して菌体を分離し培養濾液を取得する。処理温度は、
上述の培養温度以下０℃以上であればよく、通常は室温
（１５〜２５℃）で支障なく実施できる。得られた培養
源、液のエクオリン活性・については上述Ａに述べた。

Ｃ０培″°からの７ポエクオリンの１ 」二連Ｂで得られた培養濾液を次のように酸性処理する
ことにより、濃縮されたアポエクオリンを取得する。該
酸性処理とは、培養濾液に酸類を添加してそのＰＨを５
以下１程度、好ましくは４．７以下に子ることである。

使用する酸の種類は限定されないが、好ましくは弱酸、
殊に水溶性の有機酸が好ましい。

その具体例としては希塩酸、希硫酸のような無機酸、ト
リクロロ酢酸、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、醋酸のよう
な脂肪族モノカルボン酸、修酸、マレイン酸のような脂
肪族ポリカルボン酸、安息香酸、ケイ皮酸のような芳香
族カルボン酸、アスコルビン酸、クエン酸のような脂肪
族オキシカルボン酸を挙げることができる。

か覧る酸類と培養濾液の混合方法は限定されないが、好
ましくは撹拌下の培養濾液に、酸類若しくはその水溶液
等を滴下して該濾液のｐＨを徐々に低下せしめる（注、
酸類添加前のｐＨはおおむね６．８〜７．２程度である
）。以上のような酸処理は、０〜４０℃、好ましくは０
〜１５°Ｃで５分〜２時間行い、終了後１〜３０時間、
好ましくは５〜１５時ｒＩＩｉＯ〜４℃で放置する。

アポエクオリンは白色沈澱となって、上述のＰＨの低下
処理中から析出するが、酸処理後の放置により沈澱が完
結し、収率が向上する。かくして得られた沈澱（濃縮ア
ポエクオリン）を培養濾液と分離して取得する。分離方
法は限定されないが、通常遠心分離法が採用される。

Ｄ、還うヒ剤」Ｌ理 上述のＣで得られた濃縮アポエクオリンを適当な緩衝液
（例えば１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈｆｌｌ：Ｉ（ｐＨ７
，８）、　１０ｍＭＥＤＴＡを含むもの）に溶解させ該
溶液に所定の還元剤を添加する。か覧る還元剤としては
２−メルカプトエタノールを挙げることができるが、勿
論間等に使用できる他の還元剤を使用してもよい。

還元条件は、還元剤濃度が濃縮アポエクオリン溶液中で
１〜３０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＫとなるように還
元剤を添加混合し、０〜１５℃、好ましくは０〜５℃で
添加後１〜１０時間、好ましくは２〜６時間放置して還
元を進行させる。かくして還元処理されたアポエクオリ
ンフラクションが得られる。

このように還元剤処理することにより、アポエクオリン
内に生成している　−８−８−結合を−ＳＨＨ３−と解
離させることになる。この還元剤処理を行うことにより
、陰イオン交換クロマトグラフィー法によるアポエクオ
リンの収量（回収率）が３０％以上よくなる。さらには
分離がよくなる。

Ｅ、ｒイオン　　クロマトグラフ　−２１この工程は、
アポエクオリンの濃縮、精製を目的とする。上述のＤで
得られた還元処理アポエクオリンを陰イオン交換樹脂に
吸着させる。具体的クロマトグラフィー法は限定されな
いが、好ましくは、ＤＥＡＥ−多孔性セルローズ球状粒
子（セルロファインは商品名）によるカラムクロマトグ
ラフィー法を用いる。

使用するカラムは、予め所定量のＥＤＴＡおよび２−メ
ルカプトエタノールを含む緩衝液（例えば３０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣ：ｌバッファー、ｐＨ７，６）で平衡化して
おく。

該カラムに上述の還元剤処理アポエクオリンを吸着させ
、つづいて前述の緩衝液で洗浄し、洗浄された液の吸光
度が一定値（０，０１（２８０ｎｍ）　）に次のアポエ
クオリンの溶出と分注を行う。

すなわち、アポエクオリンの溶出は０→０．４ＨのＭａ
ｉｌの直線濃度勾配で行い、一定量（例えば各８ｍ　ｌ
　）で分注する。溶出流速は限定されないが、例えば１
０〜４０ｍ　ｌ　／　ｈｒ、好ましくは２０〜３０ｍ１
／ｈｒである。後述の実施例に係る第４図は、以上のよ
うなカラムクロマトグラフィーの結果を示す。

図において、 −・−：エクオリン活性、 −＋＋＋＋　：　Ｎ５Ｃ１の塩濃度勾配、・・−−−：
０Ｄ２８０での吸光度 を示す。同図から、塩濃度が０．１５〜０．２Ｍの部分
の溶出物にエクオリン活性が検出されている。後述の実
施例に係る第５図は該部分のアポエクオリンの純度を１
２．５重量％の５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法で検定した結果を示す。

図において、Ｍは分子量マーカーを示す。各フラクショ
ンにおけるアポエクオリンの純度は、デンシトメーター
（島津製作所■製ｄｕａｌ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ｃ
ｈｒｏｍａｔｏ　５ｃａｎｎｅｒ　Ｃ５−９３０）　テ
測定する。後述実施例では、フラクションの最高濃度の
ものは純度９５％以上であった。

Ｆ、ゲル濾過 上述Ｅで得られたアポエクオリンについて更に高純度の
ものが必要の場合には、本工程を実施する。

例えば、セファデックスＧ−１００（ファルマシャ社■
製）　（１，８Ｘ　１００ｃｍ）のカラムを１０ｍＭ　
ＥＤＴＡ、１ｍＭメルカプトエタノールを含む３Ｑｌ　
７ｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，［ｌ）バッファーで平衡化
した後、上述ＥのＤＥＡＥ−イオンクロマトグラフィー
より溶出したアポエクオリンを供給して処理する。流出
速度は限定されないが、例えば２〜１０ｍｕ／ｈｒ、好
ましくは５ｍ文／ｈｒである・ ［発明の効果］ 以上に示された本発明の方法は、蛋白精製において非常
に有効であり、重要な点である。培養液に合成培地を用
いることにより、不純物の混入をふせぐことも可能であ
り、培養濾液にアポエクオリンを分泌生産させることに
より、以下の精製が容易となる。すなわち、培養濾液の
蛋白質の６０％以上はアポエクオリンであり、容易な濃
縮法として、酸性処理を利用することにより培養濾液か
らの濃縮が可能となった。

さらに２−メルカプトエタノール等の還元剤で処理を行
った後、陰イオン交換体（ＤＥＡＥ・セルロファイン）
クロマトグラフィー法により、純度９５％以上のアポエ
クオリンを２００ｍＫＬの培養濾液から約７ｍｇ得た。

この収量は約　１５０ｋｇのクラゲより分離したアポエ
クオリンに相当する。

菌体外分泌ベクターによるアポエクオリンの産生条件の
確立及び精製法の確立により、大量のエクオリンの調製
の道が可能となり、その波及効果は大きい。

以下、実施例により本発明を説明する。

［実施例］ 菌体外発現ベクター（ｐｉＰ−ＨＥ）を大陽菌にトラン
スフオームした菌株を用いる。好ましい大陽菌としては
０１２１０　、　ＬＥ３９２などである。ｐｉＰ−ＨＥ
のプラスミドを第１図に示す。

以下上記菌株を用いて発現させるアポエクオリンの製造
法と精製法について述べる。

（１）大陽菌の培養条件（製造条件） ｐｉＰ−ＨＥを有する大陽菌を５０ｇｇ／＋ｎＪＪのア
ンピシリンを含む適当な培地（たとえばＬ−培地：１文
中にバクトドリプトン１０ｇ；イーストエキストラクト
５ｇ；塩化ナトリウム５ｇ）　１０ＩＩ１文にて３７℃
で一昼夜、振とう培養を行う。

この培養液２ｍ文を２００ｆｆｉ立の０．２％カザミノ
酸（Ｄｉｆｃｏ社）を含むＭ９培地（Ｎａ２ＨＰＯ＊　
６　ｇ；　ＫＨ２ＰＯ４３ｇ；　ＮａＣｌ　０．５ｇ；
　　ＮＨ４Ｃ１１ｇ；　０．２％グルコース：２　ｍＷ
　ＭｇＣｌ２；　　０．１ｍＭ　ＧａＣｌ２を１文中に
含）に加え振とう培養を行う。培養温度は４０℃である
。培養時間は２０時間である。

第２図に菌体内外に生成するアポエクオリンと菌体外の
生育の関係を示した。明らかに菌体外に大量のアポエク
オリンが検出されている。１２．５％の５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲルでアポエクオリンの生成を確認したの
が第３図である。

培養濾液に２０〜５０ＪＬｇ／ｍ４のアポエクオリンが
生成していることがわかり、アポエクオリンの精製には
十分の量である。

（２）菌体の分離法 培養液から菌体と培養濾液の分離を行う。すなわち、高
速遠心機（８０００Ｘ　ｇ、　１０分）遠心分離を行い
菌体を分離する。

（３）培養濾液からアポエクオリンの濃縮法菌体と分離
した培養濾液を酸性処理を行う。酸性処理とは培養濾液
のｐＨを４．７以下にすることである。ｐＨを下げるた
めに酸類としてＩＮの酢酸を用い、撹拌を行いながらｐ
Ｈ４，２にする。ｐＨが下がるにつれてアポエクオリン
の自沈を生じるが、４℃で一昼夜放置することにより好
回収率が得られる。

一昼夜放置した上記白沈澱を遠心分離（９ｏｏｏｘｇ、
１０分）で分離する。この沈澱が濃縮アポエクオリンで
ある。

（４）還元剤処理 濃縮アポエクオリンを１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ（
ｐＨ７，８）。

１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含むバッファーに溶解し、還元剤
を添加する。好ましい還元剤としては２−メルカプトエ
タノールを最終濃度が１０ｍＭとなるように添加を行い
、２時間以上、４°Ｃで放置を行う。

（５）陰イオン交換クロマトグラフィー還元剤存在下で
還元剤処理されたアポエクオリンフラクシせンを、略イ
オン交換クロマトフィーに吸着を行う。ＤＥＡＥ−セル
ロファイン（多孔性セルローズ球状粒子の商品名）　Ａ
３００（ｆ、ＯＸ　１８ｃｍ）カラムクロマトグラフィ
ー法を用いた。

使用するカラムはあらかじめ１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１
　ｍＷ２−メルカプトエタノールを含む３０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）バッファーで平衡化を行っ
ておき、還元剤処理アポエクオリンを吸着させたのち、
同一バッファーで洗浄を行い、吸光度が０．０１（２８
０ｎｍ）以下になったことを確認した後、０→０．４Ｍ
のＭａｉｌの直緑濃度勾配でアポエクオリンを溶出し、
各８　ｍ　ｌで分注する。溶出流速は２４ｍＪｌ／ｈｒ
である。

第４図にクロマトグラフィーの結果を示す。塩濃度が０
．１５〜０．２Ｎにエクオリン活性が検出されている。

この部分にアポエクオリンが存在することになり、純度
を１２．５％の５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲルを検出
したのが第５図である。フラクション３０〜３３におい
て、デンシトメーター（島津ｄｕａ　１−ｗａｖｅ！ｅ
ｎｇｔｈ　ｃｈｒｏｍａｔｏｓｃａｎｎｅｒ　Ｃ９−８
３０）で得られた純度は８５％以上である。

（１）〜（５）の精製段階での収率をまとめたものが下
記第１表である。２００ｍＪｌの培養濾液より、９５％
以上のアポエクオリンが約７ｍｇ得られた。

表　ｌ　　アポエクオリンの精製のまとめ注、　　村：
　Ｉ）ＥＡＥＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ−ＡＢＯ３ただし
、天然のエクオリン１ルｇは４ＸＩＯ５ｒｌｕ（相対発
光値）となる。

【図面の簡単な説明】

第１〜５図は、本発明の詳細な説明図である。 第１図は、本発明に使用する発現分泌ベクターｐｉＰ−
ＨＥの構築説明図である。 第２図は、ｐｉＰ−ＨＥを有する大陽菌によるアポエク
オリンの産生の確認を示す図である。 第３図は、ｐｉＰ−ＨＥを有する大陽菌の培養時間とア
ポエクオリン生成の関係を示す図である。 第４図は、アポエクオリンのＩＩＥＡＥ−多孔性セルロ
ーズ球状粒子によるクロマトグラフィーの結果を示す図
である。 第５図は、アポエクオリンの５Ｏ９−ポリアクリルアミ
ド電気泳動によるアポエクオリンの純度の確認結果を示
す図である。 以」二

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）菌体外発現ベクターｐｉＰ−ＨＥを大陽菌にトラ
   ンスフォームした菌株を培養し、培養液を菌体と培養濾
   液に分離して培養濾液を取得することを特徴とするアポ
   エクオリンの製造法。
2. （２）菌体外発現ベクターｐｉＰ−ＨＥを大陽菌にトラ
   ンスフォームした菌株を培養し、培養液を菌体と培養濾
   液に分離して得られた培養濾液に酸類を添加してそのｐ
   Ｈが４．７以下となる如く処理して白色沈澱を取得する
   ことを特徴とするアポエクオリンの製造法。
3. （３）白色沈澱を緩衝液に溶解し、還元剤を添加して還
   元処理することを特徴とする特許請求の範囲第（２）項
   に記載の製造法。
4. （４）還元処理されたアポエクオリンフラクションを陰
   イオン交換クロマトグラフィー法により吸着処理する特
   許請求の範囲第（３）項に記載の製造法。
5. （５）陰イオン交換クロマトグラフィー法により吸着処
   理して取得されたアポエクオリンをゲル濾過法により処
   理する特許請求の範囲第（４）項に記載の製造法。