JPS6277332A - 蛋白質の回収 - Google Patents
蛋白質の回収Info
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- JPS6277332A JPS6277332A JP61209746A JP20974686A JPS6277332A JP S6277332 A JPS6277332 A JP S6277332A JP 61209746 A JP61209746 A JP 61209746A JP 20974686 A JP20974686 A JP 20974686A JP S6277332 A JPS6277332 A JP S6277332A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は精製され、かつ生物学的に活性な形態において
蛋白質を回収する方法に関し、蛋白質は最初微生物中に
不溶性で、生物学的に不活性な封入体として生成され、
この微生物は蛋白質の発現を指示する組換え型DNA発
現ベクターにより形質転換されたものである。より詳細
には、本発明は蛋白質の凝集および沈殿の結果、処理中
に生しる損失を最小とすることにより改良された収率を
もってこの種蛋白質を回収する方法に関する。
蛋白質を回収する方法に関し、蛋白質は最初微生物中に
不溶性で、生物学的に不活性な封入体として生成され、
この微生物は蛋白質の発現を指示する組換え型DNA発
現ベクターにより形質転換されたものである。より詳細
には、本発明は蛋白質の凝集および沈殿の結果、処理中
に生しる損失を最小とすることにより改良された収率を
もってこの種蛋白質を回収する方法に関する。
組換え型DNA技術は、外来の(異種)DNAを微生物
に持ち込むベクターの挿入を、それが異種DNAを発現
させる方法において行わせるものであり、すなわち、そ
のベクターは微生物に非相同DNAシーケンスの一部に
より暗号づけされる蛋白質の生成を指示する遺伝インス
トラクションを含有するものである。発酵槽中で形質転
換性微生物を成長させ、かつそれらを非相同DNAが発
現される条件下に置くことにより、有益な蛋白質を比較
的低コストで大量に生成することができる。
に持ち込むベクターの挿入を、それが異種DNAを発現
させる方法において行わせるものであり、すなわち、そ
のベクターは微生物に非相同DNAシーケンスの一部に
より暗号づけされる蛋白質の生成を指示する遺伝インス
トラクションを含有するものである。発酵槽中で形質転
換性微生物を成長させ、かつそれらを非相同DNAが発
現される条件下に置くことにより、有益な蛋白質を比較
的低コストで大量に生成することができる。
不幸なことに、形質転換性微生物中で生成される多くの
非相同蛋白質は宿主細胞雰囲気において、それら固有の
三次元配座に折たたまれない。発現蛋白質の不適切なフ
ォールディングは数種類の不利な結果を伴う。第一に、
不適当に折たたまれた蛋白質は凝集体を生ずる傾向があ
り、これは宿主細胞中で不溶である。これら不溶性凝集
体は「封入体」あるいはまた、ときに「リフラクチル(
refractile)体」と称される細胞中で認識可
能である。封入体の生成もまた、分子内ジスルフィド結
合の生成を経由する蛋白質のオリゴマー化により部分的
に行わせることができる。不適切に折たたまれた蛋白質
は不?容性であるばかりでなく、それらはまた生物学的
に不活性である。宿主細胞内の発現の結果、不溶性で生
物学的に不活性な封入体を生成する非相同蛋白質の代表
例として、ウシ成長ホルモンおよびブタ成長ホルモンの
ような動物成長ホルモンを挙げることができる。
非相同蛋白質は宿主細胞雰囲気において、それら固有の
三次元配座に折たたまれない。発現蛋白質の不適切なフ
ォールディングは数種類の不利な結果を伴う。第一に、
不適当に折たたまれた蛋白質は凝集体を生ずる傾向があ
り、これは宿主細胞中で不溶である。これら不溶性凝集
体は「封入体」あるいはまた、ときに「リフラクチル(
refractile)体」と称される細胞中で認識可
能である。封入体の生成もまた、分子内ジスルフィド結
合の生成を経由する蛋白質のオリゴマー化により部分的
に行わせることができる。不適切に折たたまれた蛋白質
は不?容性であるばかりでなく、それらはまた生物学的
に不活性である。宿主細胞内の発現の結果、不溶性で生
物学的に不活性な封入体を生成する非相同蛋白質の代表
例として、ウシ成長ホルモンおよびブタ成長ホルモンの
ような動物成長ホルモンを挙げることができる。
有益な蛋白質を生成するために、不適切に折たたまれた
封入体蛋白質をそれら固有の配座に転化させる必要があ
り、そうすることによりそれらは可溶性となり、かつ生
物学的に活性となる。更に、汚染された細胞細片ならび
に宿主細胞蛋白質を除去するために蛋白質を精製する必
要がある。封入体蛋白質をそれらの可溶性、固有配座に
転化し、かつその蛋白質を精製して化学的に受容可能な
生成物とするために、数多くの案が提案されて来た。
封入体蛋白質をそれら固有の配座に転化させる必要があ
り、そうすることによりそれらは可溶性となり、かつ生
物学的に活性となる。更に、汚染された細胞細片ならび
に宿主細胞蛋白質を除去するために蛋白質を精製する必
要がある。封入体蛋白質をそれらの可溶性、固有配座に
転化し、かつその蛋白質を精製して化学的に受容可能な
生成物とするために、数多くの案が提案されて来た。
提案された全ての案は、初期の展開(unfoldin
g)または変性ステップにより特徴づけられており、蛋
白質分子を展開し、かつそれらを可溶性とするために、
封入体蛋白質は強度性剤〔ときには、ケイオドローブ(
chao trope)と称される〕によって処理され
る。塩酸グアニジンがこの目的のために最も一般的に使
用される強力変性剤である。回収プロセスにおける次の
工程で、変性剤が除去されるので展開蛋白質分子をそれ
ら固有の配座に再フォールディングすることができ、こ
の工程はまた、本明細書中で「リネーチュアレーション
(renaturation) jとも称する。
g)または変性ステップにより特徴づけられており、蛋
白質分子を展開し、かつそれらを可溶性とするために、
封入体蛋白質は強度性剤〔ときには、ケイオドローブ(
chao trope)と称される〕によって処理され
る。塩酸グアニジンがこの目的のために最も一般的に使
用される強力変性剤である。回収プロセスにおける次の
工程で、変性剤が除去されるので展開蛋白質分子をそれ
ら固有の配座に再フォールディングすることができ、こ
の工程はまた、本明細書中で「リネーチュアレーション
(renaturation) jとも称する。
米国特許第4,511,503号は上に説明したタイプ
の典型的な回収案を開示している。精製および/または
収率向上を指向する付加的処理工程を含むこの案に関す
る数多くの変更も提案された。このように、たとえば米
国特許第4,511゜502号は可溶化蛋白質/変性剤
溶液を分子篩を通過させるか、あるいは高速で遠心分離
させてより高分子量の成分を除去する方法を開示してい
る。
の典型的な回収案を開示している。精製および/または
収率向上を指向する付加的処理工程を含むこの案に関す
る数多くの変更も提案された。このように、たとえば米
国特許第4,511゜502号は可溶化蛋白質/変性剤
溶液を分子篩を通過させるか、あるいは高速で遠心分離
させてより高分子量の成分を除去する方法を開示してい
る。
米国特許第4,518,526号は形質転換性細胞培養
物を、十分なイオン強度を有する緩衝液で処理して宿主
細胞蛋白質の大部分を可溶化する一方、異種蛋白質を不
溶性のままとする方法を開示している。次に、これらの
細胞を溶解させ、可溶化宿主細胞蛋白質を含有する上澄
み液を除去し、そして不溶性封入体を強度性剤中で可溶
化させる。
物を、十分なイオン強度を有する緩衝液で処理して宿主
細胞蛋白質の大部分を可溶化する一方、異種蛋白質を不
溶性のままとする方法を開示している。次に、これらの
細胞を溶解させ、可溶化宿主細胞蛋白質を含有する上澄
み液を除去し、そして不溶性封入体を強度性剤中で可溶
化させる。
封入体蛋白質を、それらの可溶性、固有配座に転化させ
るための変性/リネーチュアレーション案を開示してい
る他の刊行物には、PCT公告間83104.418号
、欧州特許出願公告第0123 928号、欧州特許出
願公告第0121775号、欧州特許出願公告第0 1
16 778号、および欧州特許出願公告第01145
07号がある。
るための変性/リネーチュアレーション案を開示してい
る他の刊行物には、PCT公告間83104.418号
、欧州特許出願公告第0123 928号、欧州特許出
願公告第0121775号、欧州特許出願公告第0 1
16 778号、および欧州特許出願公告第01145
07号がある。
回収プロセスの成る地点で、望ましくない宿主細胞蛋白
質のような異物を除去するために可溶化蛋白質を精製工
程にかけることが必要である。イオン交換クロマトグラ
フィー、親和クロマトグラフィー等を含む蛋白質精製に
関する慣用技術がこの目的のために通常用いられる。精
製工程は、成る場合には変性剤の除去に先立って行われ
、また他の場合には変性剤の除去に引き続いて行われる
。
質のような異物を除去するために可溶化蛋白質を精製工
程にかけることが必要である。イオン交換クロマトグラ
フィー、親和クロマトグラフィー等を含む蛋白質精製に
関する慣用技術がこの目的のために通常用いられる。精
製工程は、成る場合には変性剤の除去に先立って行われ
、また他の場合には変性剤の除去に引き続いて行われる
。
理論的には上に論述した変性/り不−ヂュアレーション
案が、異物を含まない可溶性で生物学的に活性な形態を
もって封入体蛋白質を回収するという問題番こ関し、容
易な解決をもたらす。しかしながら、これら案の実際上
の実施では低収率および不経済な操作の問題で悩まされ
て来た。
案が、異物を含まない可溶性で生物学的に活性な形態を
もって封入体蛋白質を回収するという問題番こ関し、容
易な解決をもたらす。しかしながら、これら案の実際上
の実施では低収率および不経済な操作の問題で悩まされ
て来た。
これらの問題は殆ど可溶化蛋白質が再凝集することに由
来し、これは変性剤除去の結果蛋白質が不適当に再フォ
ールディングされるか、あるいは精製の行われる条件が
蛋白質を可溶状態に維持する能力を妨げることに基因す
るものである。我々は、グアニジン可溶化と引き続くグ
アニジン除去の採用が蛋白質を再フォールディングし、
かつイオン交換クロマトグラフィーカラムに対する精製
が封入体中に存在する所望蛋白質量を基準とじて約4%
乃至約12%を回収するということを見出した。これら
の収量は経済的な観点から最小の受容可能値と考えられ
るものより遥かに低いものである。
来し、これは変性剤除去の結果蛋白質が不適当に再フォ
ールディングされるか、あるいは精製の行われる条件が
蛋白質を可溶状態に維持する能力を妨げることに基因す
るものである。我々は、グアニジン可溶化と引き続くグ
アニジン除去の採用が蛋白質を再フォールディングし、
かつイオン交換クロマトグラフィーカラムに対する精製
が封入体中に存在する所望蛋白質量を基準とじて約4%
乃至約12%を回収するということを見出した。これら
の収量は経済的な観点から最小の受容可能値と考えられ
るものより遥かに低いものである。
本発明は、実質的に改良された収率をもって不溶性封入
体から精製し、可溶化した生物学的活性蛋白質を回収す
る方法を提供するものである。本発明方法において、再
凝集蛋白質を含む側ストリーム沈殿物がクロマトグラフ
精製を伴う主プロセス・ストリームから回収される。次
いで、それらは回収されたサイドストリーム蛋白質の溶
液が主プロセス・ストリーム中の蛋白質溶液と相溶性で
ある条件下で再可溶化され、かつ主プロセス・ストリー
ムに復帰させる。
体から精製し、可溶化した生物学的活性蛋白質を回収す
る方法を提供するものである。本発明方法において、再
凝集蛋白質を含む側ストリーム沈殿物がクロマトグラフ
精製を伴う主プロセス・ストリームから回収される。次
いで、それらは回収されたサイドストリーム蛋白質の溶
液が主プロセス・ストリーム中の蛋白質溶液と相溶性で
ある条件下で再可溶化され、かつ主プロセス・ストリー
ムに復帰させる。
本発明の一実施態様においては、不溶性蛋白質凝集体を
、可溶性、精製蛋白質および不溶性蛋白質凝集体双方を
含有する精製用カラム流出液から単離し、単離された蛋
白質凝集体を変性剤中で可溶化し、この溶液をより弱い
変性剤を含む溶液に対し透析して蛋白質を部分的にリネ
ーチュアレーションし、部分的にリネーチュアレーショ
ンした蛋白質の溶液を変性剤を含まない緩衝液に対し透
析して変性剤を除去すると共に蛋白質のり不−チュアレ
ーションを完了させ、そしてリネーチュアレーションし
た蛋白質溶液を精製用カラムから得た可溶性、精製蛋白
質と混合する。
、可溶性、精製蛋白質および不溶性蛋白質凝集体双方を
含有する精製用カラム流出液から単離し、単離された蛋
白質凝集体を変性剤中で可溶化し、この溶液をより弱い
変性剤を含む溶液に対し透析して蛋白質を部分的にリネ
ーチュアレーションし、部分的にリネーチュアレーショ
ンした蛋白質の溶液を変性剤を含まない緩衝液に対し透
析して変性剤を除去すると共に蛋白質のり不−チュアレ
ーションを完了させ、そしてリネーチュアレーションし
た蛋白質溶液を精製用カラムから得た可溶性、精製蛋白
質と混合する。
本発明の他の実施態様においては、蛋白質凝集体を可溶
性、精製蛋白質および不溶性蛋白質凝集体双方を含有す
る精製用カラム流出液から単離し1、!i[lされた蛋
白質凝集体を変性剤中で可溶化し、この溶液を変性剤を
含まない緩衝液に対し直接透析して可溶性蛋白質および
不溶性蛋白質凝集体双方を含有する溶液を入手し、不溶
性蛋白質凝集体をこの溶液から除去し、そして可溶性蛋
白質を含有する溶液を精製用カラムから得た可溶性、蛋
白質溶液と混合する。
性、精製蛋白質および不溶性蛋白質凝集体双方を含有す
る精製用カラム流出液から単離し1、!i[lされた蛋
白質凝集体を変性剤中で可溶化し、この溶液を変性剤を
含まない緩衝液に対し直接透析して可溶性蛋白質および
不溶性蛋白質凝集体双方を含有する溶液を入手し、不溶
性蛋白質凝集体をこの溶液から除去し、そして可溶性蛋
白質を含有する溶液を精製用カラムから得た可溶性、蛋
白質溶液と混合する。
リネーチュアレーションした蛋白質凝集体の2段透析を
伴う本発明の前者の実施態様は、可溶性蛋白質の若干の
ものが弱結合物質の形態を有しているが、可溶性蛋白質
の75%程度の高い回収をもたらす。リネーチュアレー
ションした蛋白質凝集体の1段透析を伴う本発明の後者
の実施態様は、可溶性蛋白質の実質的により低い回収を
もたらすが、得られた可溶性蛋白質の殆ど全ては弱結合
物質の形態を有している。いずれの場合にも、回収され
た側ストリーム凝集体の精製および回収工程への導入は
可溶性、生物学的活性蛋白質における実質的増加をもた
らす。
伴う本発明の前者の実施態様は、可溶性蛋白質の若干の
ものが弱結合物質の形態を有しているが、可溶性蛋白質
の75%程度の高い回収をもたらす。リネーチュアレー
ションした蛋白質凝集体の1段透析を伴う本発明の後者
の実施態様は、可溶性蛋白質の実質的により低い回収を
もたらすが、得られた可溶性蛋白質の殆ど全ては弱結合
物質の形態を有している。いずれの場合にも、回収され
た側ストリーム凝集体の精製および回収工程への導入は
可溶性、生物学的活性蛋白質における実質的増加をもた
らす。
先に説明したように、本発明は形質転換性微生物中で不
溶性、生物学的不活性封入体として生成された蛋白質の
回収に関する精製および活性化プロセスにおいて得られ
る可溶性、生物学的活性蛋白質の合計収量を改良する方
法を提供するものである。本発明の方法は形質転換性微
生物、すなわち非相同蛋白質についての遺伝子暗号づけ
の発現を指示する組換え型DNAベクターで形質転換さ
せた微生物内で、不溶性、生物学的不活性封入体の形態
で生成される凡ゆる蛋白質を回収するために利用するこ
とができる。本発明の具体的実施態様において、高収率
で回収される蛋白質は動物成長ホルモン、たとえばウシ
成長ホルモン(bGH)またはブタ成長ホルモン(pG
)I)である。
溶性、生物学的不活性封入体として生成された蛋白質の
回収に関する精製および活性化プロセスにおいて得られ
る可溶性、生物学的活性蛋白質の合計収量を改良する方
法を提供するものである。本発明の方法は形質転換性微
生物、すなわち非相同蛋白質についての遺伝子暗号づけ
の発現を指示する組換え型DNAベクターで形質転換さ
せた微生物内で、不溶性、生物学的不活性封入体の形態
で生成される凡ゆる蛋白質を回収するために利用するこ
とができる。本発明の具体的実施態様において、高収率
で回収される蛋白質は動物成長ホルモン、たとえばウシ
成長ホルモン(bGH)またはブタ成長ホルモン(pG
)I)である。
ここで理解すべきは、本明細書中で言及される蛋白質一
般に−・たとえば、ホルモンおよび酵素−あるいは具体
的な蛋白質、たとえばbGl(およびpGHは天然蛋白
質の完全なアミノ酸シーケンスを有する分子種に対する
限定を意図するものではないことである。゛それどころ
か、削除したシーケンスの様々な部分を有する蛋白質の
破片の包含ならびに分子の生物学的活性を破壊しない、
それら天然のシーケンスにおける各種の置換または変形
を伴うそれらの破片の包含をもまた、意図するものであ
る。
般に−・たとえば、ホルモンおよび酵素−あるいは具体
的な蛋白質、たとえばbGl(およびpGHは天然蛋白
質の完全なアミノ酸シーケンスを有する分子種に対する
限定を意図するものではないことである。゛それどころ
か、削除したシーケンスの様々な部分を有する蛋白質の
破片の包含ならびに分子の生物学的活性を破壊しない、
それら天然のシーケンスにおける各種の置換または変形
を伴うそれらの破片の包含をもまた、意図するものであ
る。
bGllおよびpicoの遺伝子は発現ベクター上にク
ローンされ、かつ利用されてエシェリヒア・コリ(E、
coli)宿主細胞を形質転換する。欧州特許出願公
告筒0 103 395号はΔ9 (Ser)bGH(
その9N−末端アミノ酸以下のbG)Iで、かつN−末
端において付加的セリン残基を有するもの)についてλ
PLプロモーターオペレータの制tn 下で暗号づけす
る第1のプラスミドを含むエシェリヒア・コリの形質転
換性菌株の構造であって、バクテリオファージmuに由
来するシャインーダルガーノ領域を有するものを説明し
ている。この形質転換体はまた、c1857感温性リプ
レッサー蛋白質の生成について暗号づけする第2のプラ
スミド、pc1857をも含有している。リプレッサー
蛋白質は温度を約42°Cに上昇させることにより不活
性化させることができ、それによりΔ9 (Ser)b
G)lの発現を誘導する。このタイプの形質転換性菌株
、エシェリヒア・コリHBI 01 (PL −mu
−Δ9 (Scr)bGHおよびpc1857)はメリ
ーランド州、ロソクヴイルのジ・アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション(The American
Type Cu1ture C。
ローンされ、かつ利用されてエシェリヒア・コリ(E、
coli)宿主細胞を形質転換する。欧州特許出願公
告筒0 103 395号はΔ9 (Ser)bGH(
その9N−末端アミノ酸以下のbG)Iで、かつN−末
端において付加的セリン残基を有するもの)についてλ
PLプロモーターオペレータの制tn 下で暗号づけす
る第1のプラスミドを含むエシェリヒア・コリの形質転
換性菌株の構造であって、バクテリオファージmuに由
来するシャインーダルガーノ領域を有するものを説明し
ている。この形質転換体はまた、c1857感温性リプ
レッサー蛋白質の生成について暗号づけする第2のプラ
スミド、pc1857をも含有している。リプレッサー
蛋白質は温度を約42°Cに上昇させることにより不活
性化させることができ、それによりΔ9 (Ser)b
G)lの発現を誘導する。このタイプの形質転換性菌株
、エシェリヒア・コリHBI 01 (PL −mu
−Δ9 (Scr)bGHおよびpc1857)はメリ
ーランド州、ロソクヴイルのジ・アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション(The American
Type Cu1ture C。
11ection)に受は入れ番号No、 53030
により表示、エシェリヒア・コリ、IMCNo、 1を
もって寄託されている。
により表示、エシェリヒア・コリ、IMCNo、 1を
もって寄託されている。
Δ7pGI+ (その最初の7N−末端アミノ酸以下
のブタ成長ホルモン)の生成について暗号づけする類似
の形質転換性菌株の構造は欧州特許出願公告第0 10
4 920号中に記載されている。
のブタ成長ホルモン)の生成について暗号づけする類似
の形質転換性菌株の構造は欧州特許出願公告第0 10
4 920号中に記載されている。
このタイプの形質転換性菌株、エシェリヒア・コ1月I
BI O1(PL−mu−△7pG11およびpc18
57)はメリーランド州、ロノクヴイルのジ・アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに受は入れ番号
No、 53031により表示、エシェリヒア・コリ、
IMCNo、 2をもって寄託されている。
BI O1(PL−mu−△7pG11およびpc18
57)はメリーランド州、ロノクヴイルのジ・アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに受は入れ番号
No、 53031により表示、エシェリヒア・コリ、
IMCNo、 2をもって寄託されている。
エシェリヒア・コリ、IMCNo、 1およびエシェリ
ヒア・コリ、IMCNo、 2はそれぞれΔ9 (Se
r)bGllおよびΔ7pGHの多産のプロプユーザ(
producer)である。両者の場合共、発現蛋白質
は顕微鏡下で可視である不溶性、生物学的不活性封入体
の形態である細胞内に封鎖されている。
ヒア・コリ、IMCNo、 2はそれぞれΔ9 (Se
r)bGllおよびΔ7pGHの多産のプロプユーザ(
producer)である。両者の場合共、発現蛋白質
は顕微鏡下で可視である不溶性、生物学的不活性封入体
の形態である細胞内に封鎖されている。
本発明による回収方法の好ましい実施態様は以下の図表
Iおよび図表■を参照することによって、より良く理解
することができる。図表1を参照すれば、発酵槽中で成
長し、かつ封入体の形態で蛋白質を蓄積した形質転換性
細胞が、機械的、化学的または酵素的に溶解されて、細
胞内に封入されている封入体の単離を行っている。この
封入体は遠心分離および緩衝液中の洗浄によって細胞物
質の残りの大部分から分離させ、湿潤封入体ペーストを
生成することができる。
Iおよび図表■を参照することによって、より良く理解
することができる。図表1を参照すれば、発酵槽中で成
長し、かつ封入体の形態で蛋白質を蓄積した形質転換性
細胞が、機械的、化学的または酵素的に溶解されて、細
胞内に封入されている封入体の単離を行っている。この
封入体は遠心分離および緩衝液中の洗浄によって細胞物
質の残りの大部分から分離させ、湿潤封入体ペーストを
生成することができる。
皿[」
細胞
封入体ペースト
リネーヂュアレーションした蛋白質溶液Gu=グアニジ
ン 封入体ペースト 羊ど生蛋白rし猾夜 リネーチュアレーションした蛋白m8液精製蛋白質 湿潤封入体ペースト中の封入体蛋白質は、強変性剤を含
む緩衝液中への抽出により可溶化させる。
ン 封入体ペースト 羊ど生蛋白rし猾夜 リネーチュアレーションした蛋白m8液精製蛋白質 湿潤封入体ペースト中の封入体蛋白質は、強変性剤を含
む緩衝液中への抽出により可溶化させる。
本明細書中で用いるように術語「強変性剤」はグアニジ
ンまたは尿素変性剤を指称し、これらは漆度約6M乃至
約8Mにおいて封入体蛋白質を完全に、しかし可逆的に
変性することが可能である。
ンまたは尿素変性剤を指称し、これらは漆度約6M乃至
約8Mにおいて封入体蛋白質を完全に、しかし可逆的に
変性することが可能である。
この目的のための好ましい変性剤にはグアニジン塩類、
特に塩酸グアニジンがある。所望により、洗剤、たとえ
ばドデシル硫酸すl・リウム(SDS)または「トライ
トン(Triton) X I OOJをン農度約1%
で強変性剤として使用することができる。
特に塩酸グアニジンがある。所望により、洗剤、たとえ
ばドデシル硫酸すl・リウム(SDS)または「トライ
トン(Triton) X I OOJをン農度約1%
で強変性剤として使用することができる。
英国特許出願GB2 138 004号中に開示される
ように、9.0乃至11.5の範囲に及ぶp Hを有す
るアルカリ水溶液もまた、強変性剤として利用可能であ
る。
ように、9.0乃至11.5の範囲に及ぶp Hを有す
るアルカリ水溶液もまた、強変性剤として利用可能であ
る。
封入体蛋白質の強変性剤への抽出は、蛋白質分子を非フ
ォールディングさせ、そして可溶とする。
ォールディングさせ、そして可溶とする。
この時点で、溶液は、たとえば遠心分離により透明にし
て凡ゆる懸濁不溶解物質を除去する。
て凡ゆる懸濁不溶解物質を除去する。
次に変性剤を、たとえば何倍容量もの変性剤を含まない
緩衝液に対して透析させることにより除去して、蛋白質
をリネーチュアレーションする。
緩衝液に対して透析させることにより除去して、蛋白質
をリネーチュアレーションする。
リネーチュアレーションした蛋白質を含む緩衝液は、リ
ネーチュアレーション工程中に生成されるかも知れない
凡ゆる再凝集物質を除去するために遠心分離させること
が可能である。次いで、リネーチュアレーションした封
入体蛋白質をクロマトグラフ法により精製する。
ネーチュアレーション工程中に生成されるかも知れない
凡ゆる再凝集物質を除去するために遠心分離させること
が可能である。次いで、リネーチュアレーションした封
入体蛋白質をクロマトグラフ法により精製する。
蛋白質についての、如何なる慣用のクロマトグラフ法精
製手段も利用可能である。たとえば、蛋白質は親和力ク
ロマトグラフィー、サイズ・エクスクル−ジョン(si
z+B 6xclusion)クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィーまたは他の凡ゆる知られ、
かつ従来使用されているクロマトグラフ技法により精製
することができる。これらの技法は単一で、もしくは次
々に利用してもよい。図表■及び図表Hに示したように
、可溶化蛋白質を精製する好ましい方法はアニオン交換
クロマトグラフィーである。好ましいアニオン交換カラ
ムには、「0八E−セファデックス(Sephadex
) A25jrDEAEセフアロース(Sepharo
se) CI、−6B。
製手段も利用可能である。たとえば、蛋白質は親和力ク
ロマトグラフィー、サイズ・エクスクル−ジョン(si
z+B 6xclusion)クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィーまたは他の凡ゆる知られ、
かつ従来使用されているクロマトグラフ技法により精製
することができる。これらの技法は単一で、もしくは次
々に利用してもよい。図表■及び図表Hに示したように
、可溶化蛋白質を精製する好ましい方法はアニオン交換
クロマトグラフィーである。好ましいアニオン交換カラ
ムには、「0八E−セファデックス(Sephadex
) A25jrDEAEセフアロース(Sepharo
se) CI、−6B。
DE−53jセルロース、rDE−52Jセルロース、
IDE−51Jセルロース、「セルフイン(cellu
fine)へ門」、[インジオン(I nd 1on)
DEAE j、[インジオン〇へE」または「ゼタフ
゛レソフ゛(Zetaprep)QAE jがある。ア
ニオン交換クロマトグラフィーによる精製は慣用の方法
により行われる。精製用カラムからの溶離によって、可
成りの量の蛋白質の再凝集が通常は生ずることになる。
IDE−51Jセルロース、「セルフイン(cellu
fine)へ門」、[インジオン(I nd 1on)
DEAE j、[インジオン〇へE」または「ゼタフ
゛レソフ゛(Zetaprep)QAE jがある。ア
ニオン交換クロマトグラフィーによる精製は慣用の方法
により行われる。精製用カラムからの溶離によって、可
成りの量の蛋白質の再凝集が通常は生ずることになる。
その結果、カラムからの流出液は可溶および不溶性蛋白
質双方を含む濁った溶液を含有している。カラム中に残
る如何なる連行蛋白質凝集体をも除去するために、この
カラムを緩衝液で洗浄することが可能である。
質双方を含む濁った溶液を含有している。カラム中に残
る如何なる連行蛋白質凝集体をも除去するために、この
カラムを緩衝液で洗浄することが可能である。
再び図表1を参照すると、不溶性、再凝集蛋白質は好ま
しくは遠心分離により精製用カラム流出液から単離され
る。次に、再凝集蛋白質(側ストリーム蛋白質)を含ん
で成る沈殿物は再可溶化させる。
しくは遠心分離により精製用カラム流出液から単離され
る。次に、再凝集蛋白質(側ストリーム蛋白質)を含ん
で成る沈殿物は再可溶化させる。
我々は、蛋白質が一度精製されると、再凝集した蛋白質
の可溶化は、湿潤封入体ペーストからの最初の可溶化に
ついて必要とされるよりも低い流度において若干弱い変
性剤を用いることにより、あるいは強変性剤を使用する
ことにより達成し得ることを見出した。封入体を可溶化
するのに一般に塩酸グアニジン6乃至8Mを必要とする
のに対しく尿素溶液は一般に封入体を可溶化することば
できない)、精製用カラム流出液から得た凝集かつ精製
した蛋白質は塩酸グアニジン3−6Mまたは尿素溶液6
−8M中で満足に可溶化することができる。塩酸グアニ
ジンは広範な試薬なので、比較的弱い変性剤を用いて精
製用カラム流出液から側ストリーム凝集体を再可溶化す
るその能力が、回収工程を経済的に有効なものとする。
の可溶化は、湿潤封入体ペーストからの最初の可溶化に
ついて必要とされるよりも低い流度において若干弱い変
性剤を用いることにより、あるいは強変性剤を使用する
ことにより達成し得ることを見出した。封入体を可溶化
するのに一般に塩酸グアニジン6乃至8Mを必要とする
のに対しく尿素溶液は一般に封入体を可溶化することば
できない)、精製用カラム流出液から得た凝集かつ精製
した蛋白質は塩酸グアニジン3−6Mまたは尿素溶液6
−8M中で満足に可溶化することができる。塩酸グアニ
ジンは広範な試薬なので、比較的弱い変性剤を用いて精
製用カラム流出液から側ストリーム凝集体を再可溶化す
るその能力が、回収工程を経済的に有効なものとする。
更に、蛋白質を可溶化するための比較的弱い変性剤の使
用が、変性剤の除去による再凝集の危険を減少させ、そ
れによって収率を高めることができる。
用が、変性剤の除去による再凝集の危険を減少させ、そ
れによって収率を高めることができる。
側ストリーム蛋白質を再可溶化させるに際して使用する
好ましい変性剤は、グアニジン−〇CI 3−6Mで
ある。典型的に、不溶性側ストリーム蛋白質はグアニジ
ン−HC13M中に蛋白質の40νo1. /グラムを
もって溶解される。溶解は一般に2−3時間以内で完了
する。所望により還元剤、たとえば5酵のグルタチオン
を添加して、分子内ジスルフィド結合の生成を阻止して
もよいが、我々は、殆ど分子内ジスルフィド結合が生し
ないので、これは一般に不要であることを見出した。
好ましい変性剤は、グアニジン−〇CI 3−6Mで
ある。典型的に、不溶性側ストリーム蛋白質はグアニジ
ン−HC13M中に蛋白質の40νo1. /グラムを
もって溶解される。溶解は一般に2−3時間以内で完了
する。所望により還元剤、たとえば5酵のグルタチオン
を添加して、分子内ジスルフィド結合の生成を阻止して
もよいが、我々は、殆ど分子内ジスルフィド結合が生し
ないので、これは一般に不要であることを見出した。
図表■に示した本発明の実施態様によれは、イ1−製用
力ラム流出液からの変性蛋白質擬集体は段階的な方法に
おいてリネーチュアされる。第1のステップにおいて、
蛋白質を部分的に再フォールディングさせるために、変
性蛋白質の溶液を、比較的薄い変性剤を含む何倍容量も
の緩衝液に対して透析する。典型的に、希薄変性剤溶液
ば3−6Mの尿素であり、好ましくは尿素約3.5Mで
ある。
力ラム流出液からの変性蛋白質擬集体は段階的な方法に
おいてリネーチュアされる。第1のステップにおいて、
蛋白質を部分的に再フォールディングさせるために、変
性蛋白質の溶液を、比較的薄い変性剤を含む何倍容量も
の緩衝液に対して透析する。典型的に、希薄変性剤溶液
ば3−6Mの尿素であり、好ましくは尿素約3.5Mで
ある。
次いで、より弱い変性剤を除去し、かつ蛋白質をその固
有の配座に可断たたみさせるために、部分的に可断たた
みされた蛋白質および希薄変性剤を含有する溶液を、変
性剤を含まない緩衝液に対して透析させる。
有の配座に可断たたみさせるために、部分的に可断たた
みされた蛋白質および希薄変性剤を含有する溶液を、変
性剤を含まない緩衝液に対して透析させる。
好ましいのは、部分的にリネーチュアレーションした蛋
白質を含む溶液を第1にNaCl約0.1乃至1.0M
を含有する変性剤を伴わない緩衝液に対して透析し、引
き続いてNaClを含まない緩衝液に対して第2の透析
を行うものである。NaCl含有緩衝液への中間の透析
は、生物学的に活性ではない可溶性蛋白質凝集体の選択
的沈殿を行わせる一方、生物学的に活性な単量体蛋白質
の可成りの部分を可断たたみさせる。
白質を含む溶液を第1にNaCl約0.1乃至1.0M
を含有する変性剤を伴わない緩衝液に対して透析し、引
き続いてNaClを含まない緩衝液に対して第2の透析
を行うものである。NaCl含有緩衝液への中間の透析
は、生物学的に活性ではない可溶性蛋白質凝集体の選択
的沈殿を行わせる一方、生物学的に活性な単量体蛋白質
の可成りの部分を可断たたみさせる。
我々は、側ストリーム蛋白質の回収中に、工程中で利用
するpHおよび温度を制御することにより再凝集を阻止
し得ることを見出した。好ましいのは、緩衝液が約9.
0乃至約10.0の範囲のpHを有し、かつ該液の温度
が約4℃乃至約10℃に維持されることである。この範
囲で使用される好ましい緩衝液はエタノールアミンHC
I 、グリシンNaOHおよびコーネル(cornel
l)緩衝液(炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液)である。
するpHおよび温度を制御することにより再凝集を阻止
し得ることを見出した。好ましいのは、緩衝液が約9.
0乃至約10.0の範囲のpHを有し、かつ該液の温度
が約4℃乃至約10℃に維持されることである。この範
囲で使用される好ましい緩衝液はエタノールアミンHC
I 、グリシンNaOHおよびコーネル(cornel
l)緩衝液(炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液)である。
回収した側ス[・リーム蛋白質の主プロセス・ストリー
ムへの再導入を行わせるためには、それに対し回収され
た側ストリーム蛋白質が透析される最終緩衝液が再導入
の時点で主プロセス・ストリーム中で使用される緩衝液
と相溶性を有するか、好ましくは同一物質であることが
必須である。回収された側ストリーム蛋白質の最終緩衝
液をクロマトグラフィーカラム溶出緩衝液と整合させる
ことにより、2つの流れをこの時点で混合して可溶性で
、生物学的活性蛋白質の高められた収率を得ることがで
きる。
ムへの再導入を行わせるためには、それに対し回収され
た側ストリーム蛋白質が透析される最終緩衝液が再導入
の時点で主プロセス・ストリーム中で使用される緩衝液
と相溶性を有するか、好ましくは同一物質であることが
必須である。回収された側ストリーム蛋白質の最終緩衝
液をクロマトグラフィーカラム溶出緩衝液と整合させる
ことにより、2つの流れをこの時点で混合して可溶性で
、生物学的活性蛋白質の高められた収率を得ることがで
きる。
図表■を参照すると、例示された実施態様と図表1の実
施態様との木質的な差異は再可溶化された側ストリーム
蛋白質がリネーチュアレーションされる方法中に存在す
ることが理解できる。図表n中に示される実施態様にお
いて、再可溶化された蛋白質凝集体は変性剤を含まない
緩衝液乙こ対して直接透析することにより、すなわ中間
段階の希薄変性剤を用いることなくリネーチュアレーシ
ョンされる。
施態様との木質的な差異は再可溶化された側ストリーム
蛋白質がリネーチュアレーションされる方法中に存在す
ることが理解できる。図表n中に示される実施態様にお
いて、再可溶化された蛋白質凝集体は変性剤を含まない
緩衝液乙こ対して直接透析することにより、すなわ中間
段階の希薄変性剤を用いることなくリネーチュアレーシ
ョンされる。
この方法はリネーチュアレーション・プロセス中に、若
干の蛋白質の再凝集をもたらすが、我々は溶液中に残留
する蛋白質が本質的には全てJjj−量体であることを
見出した。従って、本実施7%様において側ストリーム
中ら回収される可溶性蛋白質は、そのダラム当たりの生
物学的活性について、図表rに示す実施態様において回
収された蛋白質よりも若干高いレベルを有する可能性が
ある。変性剤を含まない緩衝液に対する透析に引き続い
て、得られた溶液を遠心分離し、そして可溶性、生物学
的活性蛋白質を含有する上澄み液を、主プロセス・スト
リーム中の可溶性リネーチュアレーション蛋白質内に再
導入する。沈殿物中の再凝集蛋白質を図示のように再循
環することができる。
干の蛋白質の再凝集をもたらすが、我々は溶液中に残留
する蛋白質が本質的には全てJjj−量体であることを
見出した。従って、本実施7%様において側ストリーム
中ら回収される可溶性蛋白質は、そのダラム当たりの生
物学的活性について、図表rに示す実施態様において回
収された蛋白質よりも若干高いレベルを有する可能性が
ある。変性剤を含まない緩衝液に対する透析に引き続い
て、得られた溶液を遠心分離し、そして可溶性、生物学
的活性蛋白質を含有する上澄み液を、主プロセス・スト
リーム中の可溶性リネーチュアレーション蛋白質内に再
導入する。沈殿物中の再凝集蛋白質を図示のように再循
環することができる。
以下の実施例は本発明の実施を更に例示することを意図
するものであるが、いずれにしても本発明の範囲に関す
る限定を意図するものではない。
するものであるが、いずれにしても本発明の範囲に関す
る限定を意図するものではない。
爽ル桝−上
Δ9 (Set)bGHについて暗号づけするプラスミ
ドならびにプラスミドpc1857により形質転換され
たエシェリヒア・コリ宿主菌株、MC1061をΔ9
(Ser)bGH−生成条件下で培養した。これらの細
胞を溶解し、かつΔ9 (Ser)bGI−含有封入体
を遠心分離により沈殿させた。異物を除去するための洗
浄操作に引き続いて、封入体を、グアニジン11c18
Mおよび還元グルタチオン5mMを含有する(40容量
)のグリシンNa0II(p H9,8) 50mM中
に熔解させた。次いで、可溶化封入体を尿素3.5M、
スクロース10%、還元グルタチオン1、OmMおよび
酸化グルタチオン0.1mMを含有し、そしてpH9,
8であるグリシンNa0t(50mMに対し透析して(
蛋白質を部分的に勇断たたみし)、引ぎ続きスクロース
10%を含み、pH9,8であるエタノールアミンHC
160mMに対して透析(を行って蛋白質を完全に勇断
たたみ)した。沈殿した蛋白質を遠心分離により除去し
、その上澄み液のp Hを9.0に言周整した。次に、
サンプルマンDE−52セルロースカラム(最大充填量
、蛋白質7g/樹脂リットル)に対し充填するが、該カ
ラムはスクロース5%を含み、pH9.0のエタノール
アミン60mMにより予め平衡させたものとする。成長
ホルモン含有画分(カラムの漏出画分中に流出したもの
)をpH9.8に調節し、そして「アミ] 7 (Am
icon)DC − 5 0 LIFJ rrfi外濾
過外画過装置して略10倍に濃縮した。次いで、濃縮成
長ホルモンサンプルを遠心分離し、上澄み液は下流の仕
上げ工程のために残し、そして沈殿物は再循環のために
残した。
ドならびにプラスミドpc1857により形質転換され
たエシェリヒア・コリ宿主菌株、MC1061をΔ9
(Ser)bGH−生成条件下で培養した。これらの細
胞を溶解し、かつΔ9 (Ser)bGI−含有封入体
を遠心分離により沈殿させた。異物を除去するための洗
浄操作に引き続いて、封入体を、グアニジン11c18
Mおよび還元グルタチオン5mMを含有する(40容量
)のグリシンNa0II(p H9,8) 50mM中
に熔解させた。次いで、可溶化封入体を尿素3.5M、
スクロース10%、還元グルタチオン1、OmMおよび
酸化グルタチオン0.1mMを含有し、そしてpH9,
8であるグリシンNa0t(50mMに対し透析して(
蛋白質を部分的に勇断たたみし)、引ぎ続きスクロース
10%を含み、pH9,8であるエタノールアミンHC
160mMに対して透析(を行って蛋白質を完全に勇断
たたみ)した。沈殿した蛋白質を遠心分離により除去し
、その上澄み液のp Hを9.0に言周整した。次に、
サンプルマンDE−52セルロースカラム(最大充填量
、蛋白質7g/樹脂リットル)に対し充填するが、該カ
ラムはスクロース5%を含み、pH9.0のエタノール
アミン60mMにより予め平衡させたものとする。成長
ホルモン含有画分(カラムの漏出画分中に流出したもの
)をpH9.8に調節し、そして「アミ] 7 (Am
icon)DC − 5 0 LIFJ rrfi外濾
過外画過装置して略10倍に濃縮した。次いで、濃縮成
長ホルモンサンプルを遠心分離し、上澄み液は下流の仕
上げ工程のために残し、そして沈殿物は再循環のために
残した。
沈殿した物質を、還元グルタチオン5mMを含有するグ
リシンNaOHll液液(p H9.8 ) 5 0m
M中の40容量(ml/g)のグアニジンIIC13M
内に?容解させた。溶解時間は25℃で4時間であった
。(この時点までの全先行工程ならびに全ての後行工程
は4−10℃で行われた。)この可溶化沈殿物を、スク
ロース5%、還元グルタチオン50mMを含有するグリ
シンNaOH (pH9.8 ) 5 0mM中の1
0容量の尿素3.5Mに対して透析し、引き続きスクロ
ース5%およびNaCI I Mを含有する10容量の
60mMエタノールアミンに対し透析した。最終透析は
、NaCIを伴わないこの同一エタノールアミン緩衝液
に対し行われた。次に、このサンプルを10分間に亘り
10.OOOxgで遠心分離し、そして得られた上澄み
液をブラッドフォード(Bradford)法( r
Anal.Biochem. j 、7 2 : 2
4 8 − 2 5 4(1 9 7 6年〕)を用い
て可溶性蛋白質につき分析した。この物質はまた、rs
Ds −PAGEJおよびrYM−100j隔膜限外濾
過により(高分子量異物の存在に関する試験として)分
析された。この物質はジェー・ロス(J.Roth)に
より[酵素学の方法(Methods of Enzy
mology ) J 3 7 : 6 6−81
C1975年〕中に記載されるように、ラット肝臓レセ
プター結合アフセイによって適切な折たたみ/三次構造
に関し試験された。
リシンNaOHll液液(p H9.8 ) 5 0m
M中の40容量(ml/g)のグアニジンIIC13M
内に?容解させた。溶解時間は25℃で4時間であった
。(この時点までの全先行工程ならびに全ての後行工程
は4−10℃で行われた。)この可溶化沈殿物を、スク
ロース5%、還元グルタチオン50mMを含有するグリ
シンNaOH (pH9.8 ) 5 0mM中の1
0容量の尿素3.5Mに対して透析し、引き続きスクロ
ース5%およびNaCI I Mを含有する10容量の
60mMエタノールアミンに対し透析した。最終透析は
、NaCIを伴わないこの同一エタノールアミン緩衝液
に対し行われた。次に、このサンプルを10分間に亘り
10.OOOxgで遠心分離し、そして得られた上澄み
液をブラッドフォード(Bradford)法( r
Anal.Biochem. j 、7 2 : 2
4 8 − 2 5 4(1 9 7 6年〕)を用い
て可溶性蛋白質につき分析した。この物質はまた、rs
Ds −PAGEJおよびrYM−100j隔膜限外濾
過により(高分子量異物の存在に関する試験として)分
析された。この物質はジェー・ロス(J.Roth)に
より[酵素学の方法(Methods of Enzy
mology ) J 3 7 : 6 6−81
C1975年〕中に記載されるように、ラット肝臓レセ
プター結合アフセイによって適切な折たたみ/三次構造
に関し試験された。
可溶性物質の略60%の回収が、可溶化したDE−52
沈殿物から達成された。この物質の約75%がrYM−
100」 (分子量100,000カツトオフ)限外隔
膜を通過し、そのサンプル中に少量の高分子量物質のみ
を示した。(この方法は通常、単量体成長ホルモンの実
際量よりも低い評価を与える。) rSDS−IAGEJの結果もまた、標本中にユニの高
分子量異物を示した。このサンプルのレセプター結合活
性は重量基準割合(天然bGll 、標準活性約53%
を有する)で僅かに減少したが、これは標本中の少量の
異物に基因するものと考えられる。
沈殿物から達成された。この物質の約75%がrYM−
100」 (分子量100,000カツトオフ)限外隔
膜を通過し、そのサンプル中に少量の高分子量物質のみ
を示した。(この方法は通常、単量体成長ホルモンの実
際量よりも低い評価を与える。) rSDS−IAGEJの結果もまた、標本中にユニの高
分子量異物を示した。このサンプルのレセプター結合活
性は重量基準割合(天然bGll 、標準活性約53%
を有する)で僅かに減少したが、これは標本中の少量の
異物に基因するものと考えられる。
実施例 ■
Δ9 (Ser)bGIIをDE−52カラムに対する
精製を含むこの工程に至るまで実施例Iに記載したのと
同一の方法により生成かつ処理した。このポストDE−
52カラムbGH沈殿物を単離し、かつ還元グルタチオ
ン5mMを含有するグリシンNa叶緩衝液(p H9,
8) 50mM中の(40容景)グ了ニシン1101
3M内に溶解させた。
精製を含むこの工程に至るまで実施例Iに記載したのと
同一の方法により生成かつ処理した。このポストDE−
52カラムbGH沈殿物を単離し、かつ還元グルタチオ
ン5mMを含有するグリシンNa叶緩衝液(p H9,
8) 50mM中の(40容景)グ了ニシン1101
3M内に溶解させた。
これらのサンプルはスクロース5%を含有するグリシン
Na0II (pH9,8) 50mM中の尿素3.
5Mに対して透析した。この透析に引き続き、これらサ
ンプルはスクロース5%を含みNaClを含有しないp
H9,8のエタノールアミン緩衝液60mMに対し透析
した。この透析の後、この物質を10分間に亘り10,
000xgで遠心分離し、かつ上澄み液を実施例Iにお
けるように分析した。(3Mのグアニジン溶解ステップ
を除き全工程は4−10℃で行った。) グアニジン3Mの勇断たたみした後、この物質の本質的
に全ては可溶性のままであったが、「5DS−PAGE
JおよびrYM−100J限外濾過は、この物質が可成
りの量の高分子FJ−El集体を含むことを示した。こ
の物質のレセプター結合活性は(基準重h1当たりで)
対照標準bGI+の25%であり、これは多分高分子量
異物の比較的低活性を反映しているのであろう。たとえ
、この物質がそれ(ボス1−DE 52?W縮−遠心
分舗ステップ)からもたらされるプロセス・ストリーム
中に再導入するには凝集され過ぎていたとしても、この
物質をDE−52クロマトグラフイーステツプにおいて
、その工程の更に上流に再導入することはできる。
Na0II (pH9,8) 50mM中の尿素3.
5Mに対して透析した。この透析に引き続き、これらサ
ンプルはスクロース5%を含みNaClを含有しないp
H9,8のエタノールアミン緩衝液60mMに対し透析
した。この透析の後、この物質を10分間に亘り10,
000xgで遠心分離し、かつ上澄み液を実施例Iにお
けるように分析した。(3Mのグアニジン溶解ステップ
を除き全工程は4−10℃で行った。) グアニジン3Mの勇断たたみした後、この物質の本質的
に全ては可溶性のままであったが、「5DS−PAGE
JおよびrYM−100J限外濾過は、この物質が可成
りの量の高分子FJ−El集体を含むことを示した。こ
の物質のレセプター結合活性は(基準重h1当たりで)
対照標準bGI+の25%であり、これは多分高分子量
異物の比較的低活性を反映しているのであろう。たとえ
、この物質がそれ(ボス1−DE 52?W縮−遠心
分舗ステップ)からもたらされるプロセス・ストリーム
中に再導入するには凝集され過ぎていたとしても、この
物質をDE−52クロマトグラフイーステツプにおいて
、その工程の更に上流に再導入することはできる。
失施炎−1
Δ9 (Ser)bGIIをDB−52カラムを含むこ
の工程に至るまで実施例IおよびHに記載するように調
整し、かつ処理し、そしてDE−52カラムからの沈殿
物を再び還元グルクチオン5ml″Iを含有するグリシ
ンNa0II (pH9,8) 50mM中のグアニジ
ンHCl3M内に溶解させたく25℃)。この可溶化さ
せた沈殿物を5゛Cで、スクロース5%を含むpH9,
8の2x20容量の60+nMエタノールアミンI(c
1に対し透析した。これらの勇断たたみしたサンプルを
10分間に亘り10,000xgで遠心分離し、そして
実施例■およびHにおけるように分析した。
の工程に至るまで実施例IおよびHに記載するように調
整し、かつ処理し、そしてDE−52カラムからの沈殿
物を再び還元グルクチオン5ml″Iを含有するグリシ
ンNa0II (pH9,8) 50mM中のグアニジ
ンHCl3M内に溶解させたく25℃)。この可溶化さ
せた沈殿物を5゛Cで、スクロース5%を含むpH9,
8の2x20容量の60+nMエタノールアミンI(c
1に対し透析した。これらの勇断たたみしたサンプルを
10分間に亘り10,000xgで遠心分離し、そして
実施例■およびHにおけるように分析した。
この方法によっては、可溶性蛋白質の比較的低い回収が
達成されたが(溶液中に3Mグアニジン可溶化物質15
%が残留した)、rSDS −PAGEJおよびrYM
−100J限外濾過により判定したとき、この物質は全
体的に単量体Δ9 (Ser)bGHであった(@外濾
過により90%以上が透過可能であり、これは天然のb
GHスタンダードにより得られるものと同程度に良好な
ものである)。この物質はまた、ラット肝臓隔膜レセプ
ター結合アッセイにおいて活性85%を示し、かつそれ
が、もたらされる所(ポス)DE−5Hffi縮/遠心
分k[上澄み液)からのプロセス・ストリーム中に直接
再導入させることができた。
達成されたが(溶液中に3Mグアニジン可溶化物質15
%が残留した)、rSDS −PAGEJおよびrYM
−100J限外濾過により判定したとき、この物質は全
体的に単量体Δ9 (Ser)bGHであった(@外濾
過により90%以上が透過可能であり、これは天然のb
GHスタンダードにより得られるものと同程度に良好な
ものである)。この物質はまた、ラット肝臓隔膜レセプ
ター結合アッセイにおいて活性85%を示し、かつそれ
が、もたらされる所(ポス)DE−5Hffi縮/遠心
分k[上澄み液)からのプロセス・ストリーム中に直接
再導入させることができた。
Claims (18)
- (1)形質転換性微生物中で生成された封入体から純粋
で、生物学的に活性な蛋白質を回収する方法であって、
封入体蛋白質は変性剤中で可溶化され、変成剤の除去に
よってリネーチュアレーションされ、そしてカラムクロ
マトグラフィーにより精製される方法において、 (a)不溶性蛋白質凝集体をクロマトグラフィーカラム
流出液から単離する工程と、 (b)単離された蛋白質凝集体を、変性剤を含有する緩
衝液中で可溶化する工程と、 (c)この再可溶化蛋白質凝集体の溶液を、より弱い変
性剤を含む緩衝液に対し透析してその蛋白質を部分的に
リネーチュアレーションする工程と、 (d)この部分的にリネーチュアレーションした蛋白質
の溶液を、変性剤を含まない緩衝液に対し透析して生物
学的に活性な蛋白質溶液を生成させる工程と、 を具備する方法。 - (2)部分的にリネーチュアレーションした蛋白質の溶
液を、最初NaCl約0.1乃至1.0Mを含有する変
性剤を含まない緩衝液に対して透析し、次にNaClを
含有せず、変性剤を伴わない緩衝液に対して透析する特
許請求の範囲第1項記載の方法。 - (3)更に、工程(d)で得た溶液と、クロマトグラフ
ィーカラム流出液として得られた生物学的に活性な蛋白
質とを組合わせる工程を含む特許請求の範囲第1項記載
の方法。 - (4)クロマトグラフィーカラム流出液から単離された
蛋白質凝集体を、塩酸グアニジン3−6Mおよび尿素6
−8Mから選択される変性剤の緩衝液中に再可溶化させ
る特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (5)より弱い変性剤の緩衝液が、濃度3.5Mを有す
る尿素溶液である特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (6)蛋白質が動物成長ホルモンである特許請求の範囲
第1項記載の方法。 - (7)蛋白質がウシ成長ホルモンおよびブタ成長ホルモ
ンから選択される特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (8)工程(b)、(c)および(d)中の変性および
リネーチュアレーションがpH約9乃至10を有する緩
衝液内で行われる特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (9)工程(b)、(c)および(d)についての変性
およびリネーチュアレーション溶液が、温度約4℃乃至
約10℃に維持される特許請求の範囲第8項記載の改良
方法。 - (10)クロマトグラフィーカラムがアニオン交換カラ
ムである特許請求の範囲第1項記載の改良方法。 - (11)形質転換性微生物中で生成された封入体から純
粋で、生物学的に活性な蛋白質を回収する方法であって
、封入体蛋白質は変性剤中で可溶化され、変性剤の除去
によってリネーチュアレーションされ、そしてカラムク
ロマトグラフィーにより精製される方法において、 (a)不溶性蛋白質凝集体をクロマトグラフィーカラム
流出液から単離する工程と、 (b)単離された蛋白質凝集体を、変性剤を含有する緩
衝液中で可溶化する工程と、 (c)この再可溶化蛋白質凝集体の溶液を、変性剤を含
まない緩衝液に対し透析して生物学的に活性な蛋白質を
含有する溶液を生成させる工程と、(d)この溶液から
再凝集された蛋白質を除去する工程と、 を具備する方法。 - (12)更に、工程(d)で得た溶液と、クロマトグラ
フィーカラム流出液として得られた生物学的に活性な蛋
白質とを組合わせる工程を含む特許請求の範囲第11項
記載の方法。 - (13)クロマトグラフィーカラム流出液から単離され
た蛋白質凝集体を、塩酸グアニジン3−6Mおよび尿素
6−8Mから選択される変性剤の緩衝液中に再可溶化さ
せる特許請求の範囲第11項記載の方法。 - (14)蛋白質が動物成長ホルモンである特許請求の範
囲第11項記載の方法。 - (15)蛋白質がウシ成長ホルモンおよびブタ成長ホル
モンから選択される特許請求の範囲第11項記載の方法
。 - (16)工程(b)および(c)における変性およびリ
ネーチュアレーション溶液がpH約9乃至約10を有す
る特許請求の範囲第11項記載の方法。 - (17)工程(b)および(c)についての変性および
リネーチュアレーション溶液が、温度約4℃乃至約10
℃に維持される特許請求の範囲第11項記載の方法。 - (18)クロマトグラフィーカラムがアニオン交換カラ
ムである特許請求の範囲第11項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US773671 | 1985-09-09 | ||
US06/773,671 US4656255A (en) | 1985-09-09 | 1985-09-09 | Protein recovery |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6277332A true JPS6277332A (ja) | 1987-04-09 |
JP2646081B2 JP2646081B2 (ja) | 1997-08-25 |
Family
ID=25098959
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61209746A Expired - Lifetime JP2646081B2 (ja) | 1985-09-09 | 1986-09-08 | 生物学的に活性な蛋白質の回収方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4656255A (ja) |
EP (1) | EP0215625B1 (ja) |
JP (1) | JP2646081B2 (ja) |
AT (1) | ATE113960T1 (ja) |
CA (1) | CA1267497A (ja) |
DE (1) | DE3650135T2 (ja) |
DK (1) | DK430486A (ja) |
IE (1) | IE67259B1 (ja) |
IL (1) | IL79972A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02503384A (ja) * | 1987-05-11 | 1990-10-18 | カイロン コーポレイション | 微生物から精製され、酸化され、再生された組換えインターロイキン‐2を回収する方法 |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5340926A (en) * | 1983-03-25 | 1994-08-23 | Celltech, Limited | Process for the recovery of recombinantly produced protein from insoluble aggregate |
BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
US5332805A (en) * | 1984-02-03 | 1994-07-26 | Celltech Limited | Process for the recovery of recombinantly produced chymosin from insoluble aggregate |
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