JPS6277332A - 蛋白質の回収 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は精製され、かつ生物学的に活性な形態において
蛋白質を回収する方法に関し、蛋白質は最初微生物中に
不溶性で、生物学的に不活性な封入体として生成され、
この微生物は蛋白質の発現を指示する組換え型ＤＮＡ発
現ベクターにより形質転換されたものである。より詳細
には、本発明は蛋白質の凝集および沈殿の結果、処理中
に生しる損失を最小とすることにより改良された収率を
もってこの種蛋白質を回収する方法に関する。

組換え型ＤＮＡ技術は、外来の（異種）ＤＮＡを微生物
に持ち込むベクターの挿入を、それが異種ＤＮＡを発現
させる方法において行わせるものであり、すなわち、そ
のベクターは微生物に非相同ＤＮＡシーケンスの一部に
より暗号づけされる蛋白質の生成を指示する遺伝インス
トラクションを含有するものである。発酵槽中で形質転
換性微生物を成長させ、かつそれらを非相同ＤＮＡが発
現される条件下に置くことにより、有益な蛋白質を比較
的低コストで大量に生成することができる。

不幸なことに、形質転換性微生物中で生成される多くの
非相同蛋白質は宿主細胞雰囲気において、それら固有の
三次元配座に折たたまれない。発現蛋白質の不適切なフ
ォールディングは数種類の不利な結果を伴う。第一に、
不適当に折たたまれた蛋白質は凝集体を生ずる傾向があ
り、これは宿主細胞中で不溶である。これら不溶性凝集
体は「封入体」あるいはまた、ときに「リフラクチル（
ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ）体」と称される細胞中で認識可
能である。封入体の生成もまた、分子内ジスルフィド結
合の生成を経由する蛋白質のオリゴマー化により部分的
に行わせることができる。不適切に折たたまれた蛋白質
は不？容性であるばかりでなく、それらはまた生物学的
に不活性である。宿主細胞内の発現の結果、不溶性で生
物学的に不活性な封入体を生成する非相同蛋白質の代表
例として、ウシ成長ホルモンおよびブタ成長ホルモンの
ような動物成長ホルモンを挙げることができる。

有益な蛋白質を生成するために、不適切に折たたまれた
封入体蛋白質をそれら固有の配座に転化させる必要があ
り、そうすることによりそれらは可溶性となり、かつ生
物学的に活性となる。更に、汚染された細胞細片ならび
に宿主細胞蛋白質を除去するために蛋白質を精製する必
要がある。封入体蛋白質をそれらの可溶性、固有配座に
転化し、かつその蛋白質を精製して化学的に受容可能な
生成物とするために、数多くの案が提案されて来た。

提案された全ての案は、初期の展開（ｕｎｆｏｌｄｉｎ
ｇ）または変性ステップにより特徴づけられており、蛋
白質分子を展開し、かつそれらを可溶性とするために、
封入体蛋白質は強度性剤〔ときには、ケイオドローブ（
ｃｈａｏ　ｔｒｏｐｅ）と称される〕によって処理され
る。塩酸グアニジンがこの目的のために最も一般的に使
用される強力変性剤である。回収プロセスにおける次の
工程で、変性剤が除去されるので展開蛋白質分子をそれ
ら固有の配座に再フォールディングすることができ、こ
の工程はまた、本明細書中で「リネーチュアレーション
（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）　ｊとも称する。

米国特許第４，５１１，５０３号は上に説明したタイプ
の典型的な回収案を開示している。精製および／または
収率向上を指向する付加的処理工程を含むこの案に関す
る数多くの変更も提案された。このように、たとえば米
国特許第４，５１１゜５０２号は可溶化蛋白質／変性剤
溶液を分子篩を通過させるか、あるいは高速で遠心分離
させてより高分子量の成分を除去する方法を開示してい
る。

米国特許第４，５１８，５２６号は形質転換性細胞培養
物を、十分なイオン強度を有する緩衝液で処理して宿主
細胞蛋白質の大部分を可溶化する一方、異種蛋白質を不
溶性のままとする方法を開示している。次に、これらの
細胞を溶解させ、可溶化宿主細胞蛋白質を含有する上澄
み液を除去し、そして不溶性封入体を強度性剤中で可溶
化させる。

封入体蛋白質を、それらの可溶性、固有配座に転化させ
るための変性／リネーチュアレーション案を開示してい
る他の刊行物には、ＰＣＴ公告間８３１０４．４１８号
、欧州特許出願公告第０１２３　９２８号、欧州特許出
願公告第０１２１７７５号、欧州特許出願公告第０　１
１６　７７８号、および欧州特許出願公告第０１１４５
０７号がある。

回収プロセスの成る地点で、望ましくない宿主細胞蛋白
質のような異物を除去するために可溶化蛋白質を精製工
程にかけることが必要である。イオン交換クロマトグラ
フィー、親和クロマトグラフィー等を含む蛋白質精製に
関する慣用技術がこの目的のために通常用いられる。精
製工程は、成る場合には変性剤の除去に先立って行われ
、また他の場合には変性剤の除去に引き続いて行われる
。

理論的には上に論述した変性／り不−ヂュアレーション
案が、異物を含まない可溶性で生物学的に活性な形態を
もって封入体蛋白質を回収するという問題番こ関し、容
易な解決をもたらす。しかしながら、これら案の実際上
の実施では低収率および不経済な操作の問題で悩まされ
て来た。

これらの問題は殆ど可溶化蛋白質が再凝集することに由
来し、これは変性剤除去の結果蛋白質が不適当に再フォ
ールディングされるか、あるいは精製の行われる条件が
蛋白質を可溶状態に維持する能力を妨げることに基因す
るものである。我々は、グアニジン可溶化と引き続くグ
アニジン除去の採用が蛋白質を再フォールディングし、
かつイオン交換クロマトグラフィーカラムに対する精製
が封入体中に存在する所望蛋白質量を基準とじて約４％
乃至約１２％を回収するということを見出した。これら
の収量は経済的な観点から最小の受容可能値と考えられ
るものより遥かに低いものである。

本発明は、実質的に改良された収率をもって不溶性封入
体から精製し、可溶化した生物学的活性蛋白質を回収す
る方法を提供するものである。本発明方法において、再
凝集蛋白質を含む側ストリーム沈殿物がクロマトグラフ
精製を伴う主プロセス・ストリームから回収される。次
いで、それらは回収されたサイドストリーム蛋白質の溶
液が主プロセス・ストリーム中の蛋白質溶液と相溶性で
ある条件下で再可溶化され、かつ主プロセス・ストリー
ムに復帰させる。

本発明の一実施態様においては、不溶性蛋白質凝集体を
、可溶性、精製蛋白質および不溶性蛋白質凝集体双方を
含有する精製用カラム流出液から単離し、単離された蛋
白質凝集体を変性剤中で可溶化し、この溶液をより弱い
変性剤を含む溶液に対し透析して蛋白質を部分的にリネ
ーチュアレーションし、部分的にリネーチュアレーショ
ンした蛋白質の溶液を変性剤を含まない緩衝液に対し透
析して変性剤を除去すると共に蛋白質のり不−チュアレ
ーションを完了させ、そしてリネーチュアレーションし
た蛋白質溶液を精製用カラムから得た可溶性、精製蛋白
質と混合する。

本発明の他の実施態様においては、蛋白質凝集体を可溶
性、精製蛋白質および不溶性蛋白質凝集体双方を含有す
る精製用カラム流出液から単離し１、！ｉ［ｌされた蛋
白質凝集体を変性剤中で可溶化し、この溶液を変性剤を
含まない緩衝液に対し直接透析して可溶性蛋白質および
不溶性蛋白質凝集体双方を含有する溶液を入手し、不溶
性蛋白質凝集体をこの溶液から除去し、そして可溶性蛋
白質を含有する溶液を精製用カラムから得た可溶性、蛋
白質溶液と混合する。

リネーチュアレーションした蛋白質凝集体の２段透析を
伴う本発明の前者の実施態様は、可溶性蛋白質の若干の
ものが弱結合物質の形態を有しているが、可溶性蛋白質
の７５％程度の高い回収をもたらす。リネーチュアレー
ションした蛋白質凝集体の１段透析を伴う本発明の後者
の実施態様は、可溶性蛋白質の実質的により低い回収を
もたらすが、得られた可溶性蛋白質の殆ど全ては弱結合
物質の形態を有している。いずれの場合にも、回収され
た側ストリーム凝集体の精製および回収工程への導入は
可溶性、生物学的活性蛋白質における実質的増加をもた
らす。

先に説明したように、本発明は形質転換性微生物中で不
溶性、生物学的不活性封入体として生成された蛋白質の
回収に関する精製および活性化プロセスにおいて得られ
る可溶性、生物学的活性蛋白質の合計収量を改良する方
法を提供するものである。本発明の方法は形質転換性微
生物、すなわち非相同蛋白質についての遺伝子暗号づけ
の発現を指示する組換え型ＤＮＡベクターで形質転換さ
せた微生物内で、不溶性、生物学的不活性封入体の形態
で生成される凡ゆる蛋白質を回収するために利用するこ
とができる。本発明の具体的実施態様において、高収率
で回収される蛋白質は動物成長ホルモン、たとえばウシ
成長ホルモン（ｂＧＨ）またはブタ成長ホルモン（ｐＧ
）Ｉ）である。

ここで理解すべきは、本明細書中で言及される蛋白質一
般に−・たとえば、ホルモンおよび酵素−あるいは具体
的な蛋白質、たとえばｂＧｌ（およびｐＧＨは天然蛋白
質の完全なアミノ酸シーケンスを有する分子種に対する
限定を意図するものではないことである。゛それどころ
か、削除したシーケンスの様々な部分を有する蛋白質の
破片の包含ならびに分子の生物学的活性を破壊しない、
それら天然のシーケンスにおける各種の置換または変形
を伴うそれらの破片の包含をもまた、意図するものであ
る。

ｂＧｌｌおよびｐｉｃｏの遺伝子は発現ベクター上にク
ローンされ、かつ利用されてエシェリヒア・コリ（Ｅ、
　ｃｏｌｉ）宿主細胞を形質転換する。欧州特許出願公
告筒０　１０３　３９５号はΔ９　（Ｓｅｒ）ｂＧＨ（
その９Ｎ−末端アミノ酸以下のｂＧ）Ｉで、かつＮ−末
端において付加的セリン残基を有するもの）についてλ
ＰＬプロモーターオペレータの制ｔｎ　下で暗号づけす
る第１のプラスミドを含むエシェリヒア・コリの形質転
換性菌株の構造であって、バクテリオファージｍｕに由
来するシャインーダルガーノ領域を有するものを説明し
ている。この形質転換体はまた、ｃ１８５７感温性リプ
レッサー蛋白質の生成について暗号づけする第２のプラ
スミド、ｐｃ１８５７をも含有している。リプレッサー
蛋白質は温度を約４２°Ｃに上昇させることにより不活
性化させることができ、それによりΔ９　（Ｓｅｒ）ｂ
Ｇ）ｌの発現を誘導する。このタイプの形質転換性菌株
、エシェリヒア・コリＨＢＩ　０１　　（ＰＬ　−ｍｕ
−Δ９　（Ｓｃｒ）ｂＧＨおよびｐｃ１８５７）はメリ
ーランド州、ロソクヴイルのジ・アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ
　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ。

１１ｅｃｔｉｏｎ）に受は入れ番号Ｎｏ、　５３０３０
により表示、エシェリヒア・コリ、ＩＭＣＮｏ、　１を
もって寄託されている。

Δ７ｐＧＩ＋　　（その最初の７Ｎ−末端アミノ酸以下
のブタ成長ホルモン）の生成について暗号づけする類似
の形質転換性菌株の構造は欧州特許出願公告第０　１０
４　９２０号中に記載されている。

このタイプの形質転換性菌株、エシェリヒア・コ１月Ｉ
ＢＩ　Ｏ１（ＰＬ−ｍｕ−△７ｐＧ１１およびｐｃ１８
５７）はメリーランド州、ロノクヴイルのジ・アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションに受は入れ番号
Ｎｏ、　５３０３１により表示、エシェリヒア・コリ、
ＩＭＣＮｏ、　２をもって寄託されている。

エシェリヒア・コリ、ＩＭＣＮｏ、　１およびエシェリ
ヒア・コリ、ＩＭＣＮｏ、　２はそれぞれΔ９　（Ｓｅ
ｒ）ｂＧｌｌおよびΔ７ｐＧＨの多産のプロプユーザ（
ｐｒｏｄｕｃｅｒ）である。両者の場合共、発現蛋白質
は顕微鏡下で可視である不溶性、生物学的不活性封入体
の形態である細胞内に封鎖されている。

本発明による回収方法の好ましい実施態様は以下の図表
Ｉおよび図表■を参照することによって、より良く理解
することができる。図表１を参照すれば、発酵槽中で成
長し、かつ封入体の形態で蛋白質を蓄積した形質転換性
細胞が、機械的、化学的または酵素的に溶解されて、細
胞内に封入されている封入体の単離を行っている。この
封入体は遠心分離および緩衝液中の洗浄によって細胞物
質の残りの大部分から分離させ、湿潤封入体ペーストを
生成することができる。

皿［」 細胞 封入体ペースト リネーヂュアレーションした蛋白質溶液Ｇｕ＝グアニジ
ン 封入体ペースト 羊ど生蛋白ｒし猾夜 リネーチュアレーションした蛋白ｍ８液精製蛋白質 湿潤封入体ペースト中の封入体蛋白質は、強変性剤を含
む緩衝液中への抽出により可溶化させる。

本明細書中で用いるように術語「強変性剤」はグアニジ
ンまたは尿素変性剤を指称し、これらは漆度約６Ｍ乃至
約８Ｍにおいて封入体蛋白質を完全に、しかし可逆的に
変性することが可能である。

この目的のための好ましい変性剤にはグアニジン塩類、
特に塩酸グアニジンがある。所望により、洗剤、たとえ
ばドデシル硫酸すｌ・リウム（ＳＤＳ）または「トライ
トン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　Ｉ　ＯＯＪをン農度約１％
で強変性剤として使用することができる。

英国特許出願ＧＢ２　１３８　００４号中に開示される
ように、９．０乃至１１．５の範囲に及ぶｐ　Ｈを有す
るアルカリ水溶液もまた、強変性剤として利用可能であ
る。

封入体蛋白質の強変性剤への抽出は、蛋白質分子を非フ
ォールディングさせ、そして可溶とする。

この時点で、溶液は、たとえば遠心分離により透明にし
て凡ゆる懸濁不溶解物質を除去する。

次に変性剤を、たとえば何倍容量もの変性剤を含まない
緩衝液に対して透析させることにより除去して、蛋白質
をリネーチュアレーションする。

リネーチュアレーションした蛋白質を含む緩衝液は、リ
ネーチュアレーション工程中に生成されるかも知れない
凡ゆる再凝集物質を除去するために遠心分離させること
が可能である。次いで、リネーチュアレーションした封
入体蛋白質をクロマトグラフ法により精製する。

蛋白質についての、如何なる慣用のクロマトグラフ法精
製手段も利用可能である。たとえば、蛋白質は親和力ク
ロマトグラフィー、サイズ・エクスクル−ジョン（ｓｉ
ｚ＋Ｂ　６ｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィーまたは他の凡ゆる知られ、
かつ従来使用されているクロマトグラフ技法により精製
することができる。これらの技法は単一で、もしくは次
々に利用してもよい。図表■及び図表Ｈに示したように
、可溶化蛋白質を精製する好ましい方法はアニオン交換
クロマトグラフィーである。好ましいアニオン交換カラ
ムには、「０八Ｅ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ
）　Ａ２５ｊｒＤＥＡＥセフアロース（Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）　ＣＩ、−６Ｂ。

ＤＥ−５３ｊセルロース、ｒＤＥ−５２Ｊセルロース、
ＩＤＥ−５１Ｊセルロース、「セルフイン（ｃｅｌｌｕ
ｆｉｎｅ）へ門」、［インジオン（Ｉ　ｎｄ　１ｏｎ）
　ＤＥＡＥ　ｊ、［インジオン〇へＥ」または「ゼタフ
゛レソフ゛（Ｚｅｔａｐｒｅｐ）ＱＡＥ　ｊがある。ア
ニオン交換クロマトグラフィーによる精製は慣用の方法
により行われる。精製用カラムからの溶離によって、可
成りの量の蛋白質の再凝集が通常は生ずることになる。

その結果、カラムからの流出液は可溶および不溶性蛋白
質双方を含む濁った溶液を含有している。カラム中に残
る如何なる連行蛋白質凝集体をも除去するために、この
カラムを緩衝液で洗浄することが可能である。

再び図表１を参照すると、不溶性、再凝集蛋白質は好ま
しくは遠心分離により精製用カラム流出液から単離され
る。次に、再凝集蛋白質（側ストリーム蛋白質）を含ん
で成る沈殿物は再可溶化させる。

我々は、蛋白質が一度精製されると、再凝集した蛋白質
の可溶化は、湿潤封入体ペーストからの最初の可溶化に
ついて必要とされるよりも低い流度において若干弱い変
性剤を用いることにより、あるいは強変性剤を使用する
ことにより達成し得ることを見出した。封入体を可溶化
するのに一般に塩酸グアニジン６乃至８Ｍを必要とする
のに対しく尿素溶液は一般に封入体を可溶化することば
できない）、精製用カラム流出液から得た凝集かつ精製
した蛋白質は塩酸グアニジン３−６Ｍまたは尿素溶液６
−８Ｍ中で満足に可溶化することができる。塩酸グアニ
ジンは広範な試薬なので、比較的弱い変性剤を用いて精
製用カラム流出液から側ストリーム凝集体を再可溶化す
るその能力が、回収工程を経済的に有効なものとする。

更に、蛋白質を可溶化するための比較的弱い変性剤の使
用が、変性剤の除去による再凝集の危険を減少させ、そ
れによって収率を高めることができる。

側ストリーム蛋白質を再可溶化させるに際して使用する
好ましい変性剤は、グアニジン−〇ＣＩ　　３−６Ｍで
ある。典型的に、不溶性側ストリーム蛋白質はグアニジ
ン−ＨＣ１３Ｍ中に蛋白質の４０νｏ１．　／グラムを
もって溶解される。溶解は一般に２−３時間以内で完了
する。所望により還元剤、たとえば５酵のグルタチオン
を添加して、分子内ジスルフィド結合の生成を阻止して
もよいが、我々は、殆ど分子内ジスルフィド結合が生し
ないので、これは一般に不要であることを見出した。

図表■に示した本発明の実施態様によれは、イ１−製用
力ラム流出液からの変性蛋白質擬集体は段階的な方法に
おいてリネーチュアされる。第１のステップにおいて、
蛋白質を部分的に再フォールディングさせるために、変
性蛋白質の溶液を、比較的薄い変性剤を含む何倍容量も
の緩衝液に対して透析する。典型的に、希薄変性剤溶液
ば３−６Ｍの尿素であり、好ましくは尿素約３．５Ｍで
ある。

次いで、より弱い変性剤を除去し、かつ蛋白質をその固
有の配座に可断たたみさせるために、部分的に可断たた
みされた蛋白質および希薄変性剤を含有する溶液を、変
性剤を含まない緩衝液に対して透析させる。

好ましいのは、部分的にリネーチュアレーションした蛋
白質を含む溶液を第１にＮａＣｌ約０．１乃至１．０Ｍ
を含有する変性剤を伴わない緩衝液に対して透析し、引
き続いてＮａＣｌを含まない緩衝液に対して第２の透析
を行うものである。ＮａＣｌ含有緩衝液への中間の透析
は、生物学的に活性ではない可溶性蛋白質凝集体の選択
的沈殿を行わせる一方、生物学的に活性な単量体蛋白質
の可成りの部分を可断たたみさせる。

我々は、側ストリーム蛋白質の回収中に、工程中で利用
するｐＨおよび温度を制御することにより再凝集を阻止
し得ることを見出した。好ましいのは、緩衝液が約９．
０乃至約１０．０の範囲のｐＨを有し、かつ該液の温度
が約４℃乃至約１０℃に維持されることである。この範
囲で使用される好ましい緩衝液はエタノールアミンＨＣ
Ｉ　、グリシンＮａＯＨおよびコーネル（ｃｏｒｎｅｌ
ｌ）緩衝液（炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液）である。

回収した側ス［・リーム蛋白質の主プロセス・ストリー
ムへの再導入を行わせるためには、それに対し回収され
た側ストリーム蛋白質が透析される最終緩衝液が再導入
の時点で主プロセス・ストリーム中で使用される緩衝液
と相溶性を有するか、好ましくは同一物質であることが
必須である。回収された側ストリーム蛋白質の最終緩衝
液をクロマトグラフィーカラム溶出緩衝液と整合させる
ことにより、２つの流れをこの時点で混合して可溶性で
、生物学的活性蛋白質の高められた収率を得ることがで
きる。

図表■を参照すると、例示された実施態様と図表１の実
施態様との木質的な差異は再可溶化された側ストリーム
蛋白質がリネーチュアレーションされる方法中に存在す
ることが理解できる。図表ｎ中に示される実施態様にお
いて、再可溶化された蛋白質凝集体は変性剤を含まない
緩衝液乙こ対して直接透析することにより、すなわ中間
段階の希薄変性剤を用いることなくリネーチュアレーシ
ョンされる。

この方法はリネーチュアレーション・プロセス中に、若
干の蛋白質の再凝集をもたらすが、我々は溶液中に残留
する蛋白質が本質的には全てＪｊｊ−量体であることを
見出した。従って、本実施７％様において側ストリーム
中ら回収される可溶性蛋白質は、そのダラム当たりの生
物学的活性について、図表ｒに示す実施態様において回
収された蛋白質よりも若干高いレベルを有する可能性が
ある。変性剤を含まない緩衝液に対する透析に引き続い
て、得られた溶液を遠心分離し、そして可溶性、生物学
的活性蛋白質を含有する上澄み液を、主プロセス・スト
リーム中の可溶性リネーチュアレーション蛋白質内に再
導入する。沈殿物中の再凝集蛋白質を図示のように再循
環することができる。

以下の実施例は本発明の実施を更に例示することを意図
するものであるが、いずれにしても本発明の範囲に関す
る限定を意図するものではない。

爽ル桝−上 Δ９　（Ｓｅｔ）ｂＧＨについて暗号づけするプラスミ
ドならびにプラスミドｐｃ１８５７により形質転換され
たエシェリヒア・コリ宿主菌株、ＭＣ１０６１をΔ９　
（Ｓｅｒ）ｂＧＨ−生成条件下で培養した。これらの細
胞を溶解し、かつΔ９　（Ｓｅｒ）ｂＧＩ−含有封入体
を遠心分離により沈殿させた。異物を除去するための洗
浄操作に引き続いて、封入体を、グアニジン１１ｃ１８
Ｍおよび還元グルタチオン５ｍＭを含有する（４０容量
）のグリシンＮａ０ＩＩ（ｐ　Ｈ９，８）　５０ｍＭ中
に熔解させた。次いで、可溶化封入体を尿素３．５Ｍ、
スクロース１０％、還元グルタチオン１、ＯｍＭおよび
酸化グルタチオン０．１ｍＭを含有し、そしてｐＨ９，
８であるグリシンＮａ０ｔ（５０ｍＭに対し透析して（
蛋白質を部分的に勇断たたみし）、引ぎ続きスクロース
１０％を含み、ｐＨ９，８であるエタノールアミンＨＣ
１６０ｍＭに対して透析（を行って蛋白質を完全に勇断
たたみ）した。沈殿した蛋白質を遠心分離により除去し
、その上澄み液のｐ　Ｈを９．０に言周整した。次に、
サンプルマンＤＥ−５２セルロースカラム（最大充填量
、蛋白質７ｇ／樹脂リットル）に対し充填するが、該カ
ラムはスクロース５％を含み、ｐＨ９．０のエタノール
アミン６０ｍＭにより予め平衡させたものとする。成長
ホルモン含有画分（カラムの漏出画分中に流出したもの
）をｐＨ９．８に調節し、そして「アミ］　７　（Ａｍ
ｉｃｏｎ）ＤＣ　−　５　０　ＬＩＦＪ　ｒｒｆｉ外濾
過外画過装置して略１０倍に濃縮した。次いで、濃縮成
長ホルモンサンプルを遠心分離し、上澄み液は下流の仕
上げ工程のために残し、そして沈殿物は再循環のために
残した。

沈殿した物質を、還元グルタチオン５ｍＭを含有するグ
リシンＮａＯＨｌｌ液液（ｐ　Ｈ９．８　）　５　０ｍ
Ｍ中の４０容量（ｍｌ／ｇ）のグアニジンＩＩＣ１３Ｍ
内に？容解させた。溶解時間は２５℃で４時間であった
。（この時点までの全先行工程ならびに全ての後行工程
は４−１０℃で行われた。）この可溶化沈殿物を、スク
ロース５％、還元グルタチオン５０ｍＭを含有するグリ
シンＮａＯＨ　（ｐＨ９．８　）　　５　０ｍＭ中の１
０容量の尿素３．５Ｍに対して透析し、引き続きスクロ
ース５％およびＮａＣＩ　Ｉ　Ｍを含有する１０容量の
６０ｍＭエタノールアミンに対し透析した。最終透析は
、ＮａＣＩを伴わないこの同一エタノールアミン緩衝液
に対し行われた。次に、このサンプルを１０分間に亘り
１０．ＯＯＯｘｇで遠心分離し、そして得られた上澄み
液をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法（　　ｒ
Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ｊ　、７　２　：　２　
４　８　−　２　５　４（１　９　７　６年〕）を用い
て可溶性蛋白質につき分析した。この物質はまた、ｒｓ
Ｄｓ　−ＰＡＧＥＪおよびｒＹＭ−１００ｊ隔膜限外濾
過により（高分子量異物の存在に関する試験として）分
析された。この物質はジェー・ロス（Ｊ．Ｒｏｔｈ）に
より［酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ　）　Ｊ　３　７　：　６　６−８１　　
Ｃ１９７５年〕中に記載されるように、ラット肝臓レセ
プター結合アフセイによって適切な折たたみ／三次構造
に関し試験された。

可溶性物質の略６０％の回収が、可溶化したＤＥ−５２
沈殿物から達成された。この物質の約７５％がｒＹＭ−
１００」　（分子量１００，０００カツトオフ）限外隔
膜を通過し、そのサンプル中に少量の高分子量物質のみ
を示した。（この方法は通常、単量体成長ホルモンの実
際量よりも低い評価を与える。） ｒＳＤＳ−ＩＡＧＥＪの結果もまた、標本中にユニの高
分子量異物を示した。このサンプルのレセプター結合活
性は重量基準割合（天然ｂＧｌｌ　、標準活性約５３％
を有する）で僅かに減少したが、これは標本中の少量の
異物に基因するものと考えられる。

実施例　■ Δ９　（Ｓｅｒ）ｂＧＩＩをＤＥ−５２カラムに対する
精製を含むこの工程に至るまで実施例Ｉに記載したのと
同一の方法により生成かつ処理した。このポストＤＥ−
５２カラムｂＧＨ沈殿物を単離し、かつ還元グルタチオ
ン５ｍＭを含有するグリシンＮａ叶緩衝液（ｐ　Ｈ９，
８）　　５０ｍＭ中の（４０容景）グ了ニシン１１０１
３Ｍ内に溶解させた。

これらのサンプルはスクロース５％を含有するグリシン
Ｎａ０ＩＩ　（ｐＨ９，８）　　５０ｍＭ中の尿素３．
５Ｍに対して透析した。この透析に引き続き、これらサ
ンプルはスクロース５％を含みＮａＣｌを含有しないｐ
Ｈ９，８のエタノールアミン緩衝液６０ｍＭに対し透析
した。この透析の後、この物質を１０分間に亘り１０，
０００ｘｇで遠心分離し、かつ上澄み液を実施例Ｉにお
けるように分析した。（３Ｍのグアニジン溶解ステップ
を除き全工程は４−１０℃で行った。） グアニジン３Ｍの勇断たたみした後、この物質の本質的
に全ては可溶性のままであったが、「５ＤＳ−ＰＡＧＥ
ＪおよびｒＹＭ−１００Ｊ限外濾過は、この物質が可成
りの量の高分子ＦＪ−Ｅｌ集体を含むことを示した。こ
の物質のレセプター結合活性は（基準重ｈ１当たりで）
対照標準ｂＧＩ＋の２５％であり、これは多分高分子量
異物の比較的低活性を反映しているのであろう。たとえ
、この物質がそれ（ボス１−ＤＥ　　５２？Ｗ縮−遠心
分舗ステップ）からもたらされるプロセス・ストリーム
中に再導入するには凝集され過ぎていたとしても、この
物質をＤＥ−５２クロマトグラフイーステツプにおいて
、その工程の更に上流に再導入することはできる。

失施炎−１ Δ９　（Ｓｅｒ）ｂＧＩＩをＤＢ−５２カラムを含むこ
の工程に至るまで実施例ＩおよびＨに記載するように調
整し、かつ処理し、そしてＤＥ−５２カラムからの沈殿
物を再び還元グルクチオン５ｍｌ″Ｉを含有するグリシ
ンＮａ０ＩＩ　（ｐＨ９，８）　５０ｍＭ中のグアニジ
ンＨＣｌ３Ｍ内に溶解させたく２５℃）。この可溶化さ
せた沈殿物を５゛Ｃで、スクロース５％を含むｐＨ９，
８の２ｘ２０容量の６０＋ｎＭエタノールアミンＩ（ｃ
１に対し透析した。これらの勇断たたみしたサンプルを
１０分間に亘り１０，０００ｘｇで遠心分離し、そして
実施例■およびＨにおけるように分析した。

この方法によっては、可溶性蛋白質の比較的低い回収が
達成されたが（溶液中に３Ｍグアニジン可溶化物質１５
％が残留した）、ｒＳＤＳ　−ＰＡＧＥＪおよびｒＹＭ
−１００Ｊ限外濾過により判定したとき、この物質は全
体的に単量体Δ９　（Ｓｅｒ）ｂＧＨであった（＠外濾
過により９０％以上が透過可能であり、これは天然のｂ
ＧＨスタンダードにより得られるものと同程度に良好な
ものである）。この物質はまた、ラット肝臓隔膜レセプ
ター結合アッセイにおいて活性８５％を示し、かつそれ
が、もたらされる所（ポス）ＤＥ−５Ｈｆｆｉ縮／遠心
分ｋ［上澄み液）からのプロセス・ストリーム中に直接
再導入させることができた。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）形質転換性微生物中で生成された封入体から純粋
   で、生物学的に活性な蛋白質を回収する方法であって、
   封入体蛋白質は変性剤中で可溶化され、変成剤の除去に
   よってリネーチュアレーションされ、そしてカラムクロ
   マトグラフィーにより精製される方法において、 （ａ）不溶性蛋白質凝集体をクロマトグラフィーカラム
   流出液から単離する工程と、 （ｂ）単離された蛋白質凝集体を、変性剤を含有する緩
   衝液中で可溶化する工程と、 （ｃ）この再可溶化蛋白質凝集体の溶液を、より弱い変
   性剤を含む緩衝液に対し透析してその蛋白質を部分的に
   リネーチュアレーションする工程と、 （ｄ）この部分的にリネーチュアレーションした蛋白質
   の溶液を、変性剤を含まない緩衝液に対し透析して生物
   学的に活性な蛋白質溶液を生成させる工程と、 を具備する方法。
2. （２）部分的にリネーチュアレーションした蛋白質の溶
   液を、最初ＮａＣｌ約０．１乃至１．０Ｍを含有する変
   性剤を含まない緩衝液に対して透析し、次にＮａＣｌを
   含有せず、変性剤を伴わない緩衝液に対して透析する特
   許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）更に、工程（ｄ）で得た溶液と、クロマトグラフ
   ィーカラム流出液として得られた生物学的に活性な蛋白
   質とを組合わせる工程を含む特許請求の範囲第１項記載
   の方法。
4. （４）クロマトグラフィーカラム流出液から単離された
   蛋白質凝集体を、塩酸グアニジン３−６Ｍおよび尿素６
   −８Ｍから選択される変性剤の緩衝液中に再可溶化させ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。
5. （５）より弱い変性剤の緩衝液が、濃度３．５Ｍを有す
   る尿素溶液である特許請求の範囲第１項記載の方法。
6. （６）蛋白質が動物成長ホルモンである特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
7. （７）蛋白質がウシ成長ホルモンおよびブタ成長ホルモ
   ンから選択される特許請求の範囲第１項記載の方法。
8. （８）工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）中の変性および
   リネーチュアレーションがｐＨ約９乃至１０を有する緩
   衝液内で行われる特許請求の範囲第１項記載の方法。
9. （９）工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）についての変性
   およびリネーチュアレーション溶液が、温度約４℃乃至
   約１０℃に維持される特許請求の範囲第８項記載の改良
   方法。
10. （１０）クロマトグラフィーカラムがアニオン交換カラ
    ムである特許請求の範囲第１項記載の改良方法。
11. （１１）形質転換性微生物中で生成された封入体から純
    粋で、生物学的に活性な蛋白質を回収する方法であって
    、封入体蛋白質は変性剤中で可溶化され、変性剤の除去
    によってリネーチュアレーションされ、そしてカラムク
    ロマトグラフィーにより精製される方法において、 （ａ）不溶性蛋白質凝集体をクロマトグラフィーカラム
    流出液から単離する工程と、 （ｂ）単離された蛋白質凝集体を、変性剤を含有する緩
    衝液中で可溶化する工程と、 （ｃ）この再可溶化蛋白質凝集体の溶液を、変性剤を含
    まない緩衝液に対し透析して生物学的に活性な蛋白質を
    含有する溶液を生成させる工程と、（ｄ）この溶液から
    再凝集された蛋白質を除去する工程と、 を具備する方法。
12. （１２）更に、工程（ｄ）で得た溶液と、クロマトグラ
    フィーカラム流出液として得られた生物学的に活性な蛋
    白質とを組合わせる工程を含む特許請求の範囲第１１項
    記載の方法。
13. （１３）クロマトグラフィーカラム流出液から単離され
    た蛋白質凝集体を、塩酸グアニジン３−６Ｍおよび尿素
    ６−８Ｍから選択される変性剤の緩衝液中に再可溶化さ
    せる特許請求の範囲第１１項記載の方法。
14. （１４）蛋白質が動物成長ホルモンである特許請求の範
    囲第１１項記載の方法。
15. （１５）蛋白質がウシ成長ホルモンおよびブタ成長ホル
    モンから選択される特許請求の範囲第１１項記載の方法
    。
16. （１６）工程（ｂ）および（ｃ）における変性およびリ
    ネーチュアレーション溶液がｐＨ約９乃至約１０を有す
    る特許請求の範囲第１１項記載の方法。
17. （１７）工程（ｂ）および（ｃ）についての変性および
    リネーチュアレーション溶液が、温度約４℃乃至約１０
    ℃に維持される特許請求の範囲第１１項記載の方法。
18. （１８）クロマトグラフィーカラムがアニオン交換カラ
    ムである特許請求の範囲第１１項記載の方法。