JP4386722B2 - アシル化されたポリペプチドの製造方法 - Google Patents
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Description
(i) 所望のポリペプチドの前駆体分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むホスト細胞を、前記前駆体分子の発現に適切な条件下で培養すること(ここで前記前駆体分子は所望のポリペプチドとN末伸長とを含み、前記N末伸長はリジン切断部位で所望のポリペプチドから切断可能である);
(ii) 当該発現された前駆分子を培養ブロスから分離すること;
(iii) 当該N末伸長におけるLys切断部位のε-アミノ基をアシル化することなく、当該所望のポリペプチドにおける少なくとも1のリジンのε-アミノ基を選択的にアシル化すること;
(iv) 当該N末伸長を当該アシル化された前駆体分子から酵素による切断によって取り除くこと;および
(v) 当該アシル化されたポリペプチドを適切な手段によって単離すること。
Glu-Glu-Ala-His-Lys(配列番号1);Glu-(Glu-Ala)2-His-Lys(配列番号2);Glu-(Glu-Ala)3-His-Lys(配列番号3);Glu-Glu-Gly-His-Lys(配列番号4);Glu-His-Pro-Lys(配列番号5);Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys(配列番号6);Glu-Glu-His-Cys-Lys(配列番号7);Glu-Glu-His-His-Lys(配列番号8);Glu-His-His-His-Lys(配列番号9);Glu-His-Ala-His-Lys(配列番号10);Glu-Gly-Ala-His-Lys(配列番号11);Glu-His-Gly-His-Gly-Lys(配列番号12);Glu-Glu-Ala-His-Glu-Leu-Lys(配列番号13);Glu-Glu-Ala-His-Glu-Ile-Lys(配列番号14);Glu-Glu-Ala-His-Glu-Val-Lys(配列番号15);Glu-Glu-Ala-His-Glu-Met-Lys(配列番号16);Glu-Glu-Ala-His-Glu-Phe-Lys(配列番号17);Glu-Glu-Ala-His-Glu-Tyr-Lys(配列番号18);Glu-Glu-Ala-His-Glu-Trp-Lys(配列番号19);Gln-Asp-Ala-His-Lys(配列番号24);Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys(配列番号30);Asp-Thr-His-Lys(配列番号34);Glu-His-His-Gly-His-Gly-Lys(配列番号36);Asp-Ser-His-Lys(配列番号37);Gln-Asp-Thr-His-Lys(配列番号38);Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys(配列番号39)Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys(配列番号40);Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys(配列番号41);Trp-His-Trp-Leu-Lys(配列番号42);Glu-Glu-Trp-His-Trp-Leu-Lys(配列番号43);Glu-Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys(配列番号44)Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys(配列番号47);Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys(配列番号48);Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys(配列番号49)である。
Xn------X1-Lys
ここで、Lysは切断部位であり、Xn------X1 は、2-14 アミノ酸残基の長さのペプチド配列であり、当該Lys切断部位における遊離ε-アミノ基が上述の工程(iii)においてアシル化されるのを防ぐまたは最小化する機能を有するペプチド配列である。Xn------X1 は更に発現された所望のポリペプチドを内部蛋白質分解性の切断から保護し、且つ発酵並びに下流の分離および精製工程中の当該N末伸長分子の微小繊維化により生じる沈殿を防ぐ。Xn------X1 における当該アミノ酸残基は更に選択されて、そのC末端(Lys)での当該N末伸長の最適な切断が達成される。更に、当該伸長のN末端におけるアミノ酸残基も選択され、切断は、酵母細胞において、上流のシグナルリーダー配列から KEX 切断部位(Lys,Arg)で最適化される。当該ペプチド配列が、少なくとも1の必要とされる目的を、少なくとも1の X が His または Glu または Asp であるという条件と、当該伸長のN末端から第2番目のアミノ酸残基が好ましくは Ala または Pro ではないという条件つきで満たす限り、Xn------X1 における当該アミノ酸残基は、原則としてLys以外の何れのアミノ酸残基でもよい。
Glu-Glu-Ala-His-Lys(配列番号1);Glu-(Glu-Ala)2-His-Lys(配列番号2);Glu-(Glu-Ala)3-His-Lys(配列番号3);Glu-Glu-Gly-His-Lys(配列番号4);Glu-His-Pro-Lys(配列番号5);Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys(配列番号6);Glu-Glu-His-Cys-Lys(配列番号7);Glu-Glu-His-His-Lys(配列番号8);Glu-His-His-His-Lys(配列番号9);Glu-His-Ala-His-Lys(配列番号10);Glu-Gly-Ala-His-Lys(配列番号11);Glu-His-Gly-His-Gly-Lys(配列番号12);Glu-Glu-Ala-His-Glu-Leu-Lys(配列番号13);Glu-Glu-Ala-His-Glu-Ile-Lys(配列番号14);Glu-Glu-Ala-His-Glu-Val-Lys(配列番号15);Glu-Glu-Ala-His-Glu-Met-Lys(配列番号16);Glu-Glu-Ala-His-Glu-Phe-Lys(配列番号17);Glu-Glu-Ala-His-Glu-Tyr-Lys(配列番号18);Glu-Glu-Ala-His-Glu-Trp-Lys(配列番号19);Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Pro-Lys(配列番号20);Glu-Glu-Gly-Asn-Glu-Thr-Glu-Pro-Lys(配列番号21);Glu-Glu-Gly-Asn-Asp-Thr-Glu-Pro-Lys(配列番号22);Glu-Glu-Gly-Asn-Thr-Thr-Glu-Pro-Lys(配列番号23);Gln-Asp-Ala-His-Lys(配列番号24);Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(配列番号26);Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys(配列番号29);Glu-Glu-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys(配列番号30);Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys(配列番号31);Glu-Glu-Leu-Asp-Gly-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys(配列番号32);Glu-Glu-Leu-Asp-Ala-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys(配列番号33);Asp-Thr-His-Lys(配列番号34);Asp-Ala-His-Lys(配列番号35);Glu-His-His-Gly-His-Gly-Lys(配列番号36);Asp-Ser-His-Lys(配列番号37);Gln-Asp-Thr-His-Lys(配列番号38);Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys(配列番号39);Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys(配列番号40);Glu-Ala-Gln-Asp-Thr-His-Lys(配列番号41);Trp-His-Trp-Leu-Lys(配列番号42);Glu-Glu-Trp-His-Trp-Leu-Lys(配列番号43);Glu-Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Trp-His-Trp-Leu-Lys(配列番号44);Glu-Glu-Ala-Glu-Lys(配列番号45);Glu-Glu-Gly-Glu-Pro-Lys(配列番号46);Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys(配列番号47);Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys(配列番号48);Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Gln-Asp-Ala-His-Lys(配列番号49)である。
N末伸長-Lys-Z3-Z4-*ポリペプチド*
ここで、Lysは切断部位、当該N末伸長は2-14 アミノ酸残基を上述の通りに有し、Z3 は当該所望のポリペプチドにおけるN末アミノ酸残基であり且つ His または Tyr であり、Z4 は当該所望のポリペプチドにおけるN末端の隣のアミノ酸残基であり且つ Ala、Ser または Glyであり、*ポリペプチド* は当該所望のポリペプチドの残りの配列である。
用語「優先的にアシル化する」とは、アシル化が、当該分子における1以上の好ましい位置で、その同じ分子における別の位置でよりも実質的により高い程度で行われることを含むこと、およびそのようなアシル化プロセスを意味する。従って、当該好ましい位置でのアシル化は、全体のアシル化の少なくとも50%、好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは90−100%である。本方法において、当該N末伸長におけるリジン切断部位のε-アミノ基のアシル化は、可能な限り避けるか、または最小化されるべきであり、これはこの位置でのアシル化が、続いて起こる所望の最終産物からの当該N末伸長の切断を妨げて収率低下を招くためである。
N末が伸長された Arg34GLP-1(7-37) の発現
ホスト株 ME1719 は二倍体株であり、2 つのアスパラギン酸プロテアーゼ活性を欠く表現型、即ち、一または二塩基アミノ残基のC末側を切断するYPS1(以前は YAP3 と称した)(Egel-Mitani ら、YEAST 6: 127-137,1990)、およびPEP4、例えば、プロテアーゼ B 、カルボキシペウチダーゼ Y、アミノペプチダーゼ I、RNase、アルカリホスファターゼ、酸トレハラーゼ(acid threhalase)およびエキソポリホスファターゼなどの他のプロテアーゼの活性に反応する液胞系プロテアーゼ A、を有する。更に、その表現形はグルコースを含む培地で成長した形質転換体においてグルコースを利用可能にするトリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子(TPI)を破壊した。ME1719 の遺伝子的背景は、MATa/αΔyps1::ura3/Δyps1::URA3 pep4-3/pep4-3 Δtpi::LEU2/Δtpi::LEU2 leu2/leu2 Δura3/Δura3 である。
二価または三価金属イオンの存在または不在における EEAHK(配列番号1)-Arg34GLP-1(7-37)のアシル化
GLP-1類似体を例1記載した通りに作成した。当該発酵ブロスを遠心分離によって不純物を取り除き、2620mLの上澄を7900mLに希釈し、pHをpH3.1 に調整した。最終伝導率は 4.9 mS/cm であった。100mLのファルマシア・ストリームライン(登録商標)(Pharmacia StreamlinR) SP コード no.17-0993-05 充填した 2.6x100cm のカラムを平衡状態に保ち、当該製造業者の推奨(ファルマシアパンフレット 18-1124-26、膨張ゲル吸着、原理と方法)に従って 0.025M クエン酸塩緩衝液 pH3.1を用いて流動化し、続いて 0.5M トリスベースにより 0.5ml/min の流れで溶出した。GLP-1類似体を含むフラクションは分析 RP-HPLC により、希 H2SO4 で pH7.4の0.010M トリス、0.015M Na2SO4 中の CH3CN の勾配を用いて確認した。プールした試料の量は、361mgのGLP-1類似体を含む 100mLであり、その純度は 72.4%であった。当該試料は更に予備 RP-HPLC により精製した。バッファー系は、A バッファー、0.010M トリス、0.015M Na2SO4および20%エタノール v/v 希 H2SO4で pH7.5、並びに 70%のエタノールからなる B バッファーからなる。90mg GLP1 類似体に対応するアリコートを、マケレイ−ネイゲル(Macherey-Nagel),D,から入手したヌクレオシル(Nucleosil)300Å、7μm、C4を充填した HPLC カラム(250 x 20)mm に添加し、10%B で平衡状態に置き、当該試料を10%Bから90%B までの一次勾配(linear gradient)で、総量 720mLで、流出速度は毎分 6mLで溶出した。当該溶出を214nmと276nm でモニターした。GLP1 類似体を含有する当該試料をプールし、1 体積の水で希釈し、pH5 に調整し、4℃に冷却した。その沈殿物を遠心により単離し、凍結乾燥した。286mg が採取され、最終純度は 98%であった。
2当量以上の Zn2+ の添加は、当該試料の沈殿に関連した。しかしながら、その収率は、2当量の Zn2+をアシル化のために余剰のアシル化試薬と共に使用した場合に改善した。即ち、52%の収率は、7%の脱アミド化されたアシル化産物と共に得られ、これは Zn2+ 不在時に得られた 42.4%の収率と 5.1%の脱アミド化産物の場合と比較すると勝っている。
EEAHK(配列番号1)-Arg34GLP-1(7-37)を2当量 のアシル化試薬を添加することによって 2当量 Zn2+ の存在下で 15分間上述の通りにアシル化した。総量 15μLを分析 RP-HPLC カラムに対して TFA/CH3CN/H20 バッファー系を使用して添加した。57μgに相当する精製産物は、合成収率の 46%に相当する。当該産物を乾燥し、続いて 0.025mL0.1m NaOH に 0℃で溶解し、20分間インキュベートした。メチルエステルで加水分解した後、当該試料に更に、15μL 0.1m HClおよび5μL 0.1m トリス HClを添加し、pH 指示紙は約 pH8.0を示した。当該試料に次に 10μL CH3CNを添加し、続いて 1μL 1mg/mLアクロモバクター・リチクス・プロテアーゼ I(Achromobacter lyticus protease I、EC 3.4.21.50)を添加し、30分間室温でインキュベートした。総量 10μLをRP-HPLC 装置に上述の通りに添加し、66.2%に相当する最も顕著な 3 ピークを更に特徴づけし、所望の生成物と全く一致することを確認した。その結果を以下の表4に示す。
EEAEK(配列番号45)-Arg34GLP-1(7-37)のアシル化およびALP 処理
GLP-1前駆体 EEAEK(配列番号43)-Arg34GLP-1(7-37)を上記の通りに酵母において発現し、発酵上澄中でイオン強度 7 に調整し、陽イオンカラム SP セファロース・ファスト・フロー XL(SP Sepharose Fast Flow XL、アマシャム ファルマシア)に結合することにより回収した。当該前駆体は、勾配 0-100%の 50mM 蟻酸 + 50mM 蟻酸中の 1M NaCl で溶離した。10 カラム体積後、当該カラムを2 体積の 50mM 蟻酸で洗浄し、続いて 0.5 M グリシン pH 9 で 3.5 カラム体積分で溶離した。そのフラクションをMALDI-MS で分析し、当該前駆体のプールを確認した。これらのプールを、逆相 HPLC ZORBAX 300SB-CN カラム(9.4x250mm)に添加した。溶離は、バッファーA(0.1%TFA)中で勾配 30-70%のバッファーB(0.1%TFA/80%エタノール)を用いて実施した。フラクションは UV パターンと MALDI-MS により同定した。プールを回収し、そのエタノールを真空で蒸発し、当該生成物を凍結乾燥した。
EELDARLEALK(配列番号33)-Arg34GLP-1(7-37)、EEAHEYK(配列番号18)-Arg34GLP-1(7-37)およびDDDDK(配列番号26)-Arg34GLP-1(7-37) のアシル化と切断
GLP-1前駆体 EELDARLEALK(配列番号33)-Arg34GLP-1(7-37)、EEAHEYK(配列番号18)-Arg34GLP-1(7-37)およびDDDDK(配列番号26)-Arg34GLP-1(7-37)を全て酵母において発現させ、例3に記載の通りに精製した
アシル化を例3に記載の通りに実施した。1.3当量のヘキサデカノイル-/-グルタミン酸-α-tert-ブチルエステル-γ-スクシニルイミジルエステルを使用した。HPLCとMALDI-MS分析により、アシル化混合物中で直接の ALP による加水分解後には、全ての場合において、〜 15-30%の未反応基質と約 20%のジアシル化産物(Lys6、Lys26)が示された。この結果は表5に示す。
Claims (3)
- ポジションLys26でアシル化されたArg34GLP1(7-37)の製造方法であって、
(i) Arg34GLP1(7-37)の前駆体分子を酵母細胞中で発現させること(ここで、前記前駆体分子はN末伸長を含み、前記N末伸長はリジン切断部位でArg34GLP1(7-37)から切断される);
(ii) 当該発現した前駆体分子を培養ブロスから分離すること;
(iii) 当該N末伸長における1以上のアミノ酸残基が当該Arg34GLP1(7-37)のN末端における1以上のアミノ酸残基と共に金属イオン配位結合部位を確立可能であること又は当該前駆体分子のN末伸長が当該Arg34GLP1(7-37)に対してN末のリジン切断部位と塩架橋を確立可能な少なくとも1の負に荷電したアミノ酸残基を含むことによって、当該N末伸長におけるリジン切断部位のε-アミノ基をアシル化することなく、Arg34GLP1(7-37)ペプチドにおけるLys26のε−アミノ基を優先的にアシル化すること;
(iv) 当該N末伸長を、当該アシル化された前駆体分子から酵素による切断によって取り除くこと;および
(v) 当該ポジションLys26でアシル化されたArg34GLP1(7-37)ペプチドを適切な手段により単離すること;
を含み、
当該N末伸長はGlu-Glu-Ala-His-Lys(配列番号1); Glu-Glu-Ala-His-Glu-Tyr-Lys(配列番号18); Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(配列番号26); Glu-Glu-Leu-Asp-Ala-Arg-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys(配列番号33) and Glu-Glu-Ala-Glu-Lys(配列番号45)からなる群から選択される方法。 - 請求項1に記載の方法であって、当該アシル化工程(iii)が、金属イオンの存在下で、有機溶媒中または水と有機溶媒の混合物中で行われる方法。
- 請求項1に記載の方法であって、当該アシル化工程が pH が 7〜12 の間で行われる方法。
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