JPS63102695A - 大腸菌の菌体外分泌ベクタ−を用いる発光蛋白エクオリンの製造法 - Google Patents
大腸菌の菌体外分泌ベクタ−を用いる発光蛋白エクオリンの製造法Info
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- JPS63102695A JPS63102695A JP24909886A JP24909886A JPS63102695A JP S63102695 A JPS63102695 A JP S63102695A JP 24909886 A JP24909886 A JP 24909886A JP 24909886 A JP24909886 A JP 24909886A JP S63102695 A JPS63102695 A JP S63102695A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術の分野〕
本発明は発光蛋白エクオリンの遺伝子を用いてのエクオ
リン活性を有する蛋白質の製造法に関する。更に詳しく
は、大腸菌の菌体外分泌ベクターを用いて、大腸菌菌体
外へエクオリン活性を有する蛋白を分泌製造する方法に
関する。
リン活性を有する蛋白質の製造法に関する。更に詳しく
は、大腸菌の菌体外分泌ベクターを用いて、大腸菌菌体
外へエクオリン活性を有する蛋白を分泌製造する方法に
関する。
エクオリンは、米国ワシントン州フライデーハーバ−島
近郊に生息する発光クラゲより分はされたカルシウム受
容発光蛋白質である。
近郊に生息する発光クラゲより分はされたカルシウム受
容発光蛋白質である。
エクオリン1分子に2分子(あるいは3分子)のCa2
”イオンが結合することによりエクオリン分子中に含
まれる活性化状態にあるセレンテラジンが酸化され、光
と CO2を放出する。この発光には、Ca2°イオン
が不可欠なことより、エクオリンを用いてCa2・を特
異的に定量検出すること(が可能である。 Ca2°イ
オンの検出限界は10−9M程度である。
”イオンが結合することによりエクオリン分子中に含
まれる活性化状態にあるセレンテラジンが酸化され、光
と CO2を放出する。この発光には、Ca2°イオン
が不可欠なことより、エクオリンを用いてCa2・を特
異的に定量検出すること(が可能である。 Ca2°イ
オンの検出限界は10−9M程度である。
現在までに、細胞膜の興奮、筋収縮、細胞の分泌活動、
伝達物質の遊離、ホルモンの作用若しくは細胞間の連結
、融合などの多くの細胞機能の発現に細胞内Ca2・イ
オンが重要な役割を果していることが、広く認められて
いる。これらの細胞機能と細胞内Ca2 ’イオンとの
関係を明らかにするためには、細胞内Ca2・濃度の経
時的定量が必要となってくる。細胞内Ca2 ”イオン
の相対的、経時的変化の測定には、実験系が比較的単純
でSN比のよいCa2 ’イオンのシグナルが記録でき
るためエクオリンが用いられる。
伝達物質の遊離、ホルモンの作用若しくは細胞間の連結
、融合などの多くの細胞機能の発現に細胞内Ca2・イ
オンが重要な役割を果していることが、広く認められて
いる。これらの細胞機能と細胞内Ca2 ’イオンとの
関係を明らかにするためには、細胞内Ca2・濃度の経
時的定量が必要となってくる。細胞内Ca2 ”イオン
の相対的、経時的変化の測定には、実験系が比較的単純
でSN比のよいCa2 ’イオンのシグナルが記録でき
るためエクオリンが用いられる。
しかしながら、エクオリンの天然からの分離は発光クラ
ゲ10トンから200mg程度にすぎず、生産量は十分
でなく、一定の供給が保証されていない。
ゲ10トンから200mg程度にすぎず、生産量は十分
でなく、一定の供給が保証されていない。
本発明者らは、前述の問題を解決すべく、研究を行い、
遺伝子工学の手法を用い、クラゲ発光蛋白エクオリンの
cDNAクローンを取得し、このcDNAクローンプラ
スミドをpAQ440と名付けた(特願昭59−178
125号)0次いで、この遺伝子(pAQ440)を大
腸菌の発現プロモーターを有するプラスミドに挿入し、
トランスフォーメーションした菌体を用い、天然型及び
融合型の発光蛋白エクオリンを大腸菌体内で、俺率的に
生産することが出きた(#願昭80−280259号)
。
遺伝子工学の手法を用い、クラゲ発光蛋白エクオリンの
cDNAクローンを取得し、このcDNAクローンプラ
スミドをpAQ440と名付けた(特願昭59−178
125号)0次いで、この遺伝子(pAQ440)を大
腸菌の発現プロモーターを有するプラスミドに挿入し、
トランスフォーメーションした菌体を用い、天然型及び
融合型の発光蛋白エクオリンを大腸菌体内で、俺率的に
生産することが出きた(#願昭80−280259号)
。
しかしながら、該エクオリン蛋白の安定生産の為には、
大腸菌の菌体外に該蛋白を分泌せしめるような発現ベク
ターが要望される。
大腸菌の菌体外に該蛋白を分泌せしめるような発現ベク
ターが要望される。
木発明者らは、上述の要望を満足すべく研究の結果、上
述のpAQ440を用い、大腸菌の外膜蛋白A分泌用遺
伝子及びリボ蛋白(lpp)のプロモーターと接続する
ことにより、エクオリン活性を有するエクオリン蛋白を
大腸菌の菌体外に放出する分泌型発現ベクターを構築し
、該ベクターを利用することにより、大腸菌の菌体内で
生産されたエクオリン蛋白を大腸菌4体外に爺率的に放
出し生産させることに成功した。
述のpAQ440を用い、大腸菌の外膜蛋白A分泌用遺
伝子及びリボ蛋白(lpp)のプロモーターと接続する
ことにより、エクオリン活性を有するエクオリン蛋白を
大腸菌の菌体外に放出する分泌型発現ベクターを構築し
、該ベクターを利用することにより、大腸菌の菌体内で
生産されたエクオリン蛋白を大腸菌4体外に爺率的に放
出し生産させることに成功した。
以上の記述から明らかなように本発明の目的は、該分泌
型発現ベクターならびに該ベクターにクローニングして
得られたプラスミドを大腸菌にトランスホーメートする
ことにより、エクオリン蛋白の菌体外分泌による製造法
を提供することである。
型発現ベクターならびに該ベクターにクローニングして
得られたプラスミドを大腸菌にトランスホーメートする
ことにより、エクオリン蛋白の菌体外分泌による製造法
を提供することである。
本発明は、下記(1)の主要構成と(2)および(3)
の実施態様的構成を有する。
の実施態様的構成を有する。
(1)クラゲ発光蛋白エクオリンの生合成を特定する遺
伝子(pAQ440)を用いて菌体外分泌ベクターにク
ローニングして得られたプラスミドを大腸菌にトランス
ホーメートすることによりエクオリン活性な有する蛋白
質を該大腸菌の菌体外に分泌させることを特徴とする大
腸菌の菌体外分泌ベクターを用いる発光蛋白エクオリン
の製造法。
伝子(pAQ440)を用いて菌体外分泌ベクターにク
ローニングして得られたプラスミドを大腸菌にトランス
ホーメートすることによりエクオリン活性な有する蛋白
質を該大腸菌の菌体外に分泌させることを特徴とする大
腸菌の菌体外分泌ベクターを用いる発光蛋白エクオリン
の製造法。
(2)大腸菌のリボ蛋白(1pp)のプロモーターの下
流に大腸菌の外膜蛋白A(ompA)の分泌の為のシグ
ナルペプチドをコードする遺伝子及びエクオリン遺伝子
(pAQ440)を接続したプラスミドを用いる前記第
(1)項に記載の製造法。
流に大腸菌の外膜蛋白A(ompA)の分泌の為のシグ
ナルペプチドをコードする遺伝子及びエクオリン遺伝子
(pAQ440)を接続したプラスミドを用いる前記第
(1)項に記載の製造法。
(3)シグナルペプチドをコードする遺伝子として大腸
菌のβ−ラクターゼのシグナルペプチドを有する発現ベ
クターを用いる前記第(1)項に記載の方法。
菌のβ−ラクターゼのシグナルペプチドを有する発現ベ
クターを用いる前記第(1)項に記載の方法。
本発明の構成と効果につき以下に詳述する。
先づ、クラゲ発光蛋白エクオリンの生合成を特定する遺
伝子(pAQ440)の取得については、上述のように
本発明者らによる特願昭59−178125号(特開昭
8l−1355H号)に詳述されている。
伝子(pAQ440)の取得については、上述のように
本発明者らによる特願昭59−178125号(特開昭
8l−1355H号)に詳述されている。
このpAQ440を用いる菌体外分泌ベクターの構築法
については後述の実施例1(イ)に例示されているよう
に、例えば、高コピーのクローニングベクターpUc
8の…R−HindI[[部分をそれぞれの制限酵素で
消化後、その部分にcDNAクローンpAQ440J:
り得られたエクオリンcDNA…R−Hind mフラ
グメントをサブクローニングすることによりpiQHE
を取得する。
については後述の実施例1(イ)に例示されているよう
に、例えば、高コピーのクローニングベクターpUc
8の…R−HindI[[部分をそれぞれの制限酵素で
消化後、その部分にcDNAクローンpAQ440J:
り得られたエクオリンcDNA…R−Hind mフラ
グメントをサブクローニングすることによりpiQHE
を取得する。
次に、該ベクターへのクローニングによるプラスミドの
取得については後述の実施例1(o)に例示さレテイル
ヨうに、piQ 8 HE(7) Sca I −Hi
ndm消化後、その部分にpIN−mo閣pAIよりI
PPプロモーター及びompA遺伝子を含む5cal
−Hindmフラグメントを挿入することにより、pi
PHEを取得する。
取得については後述の実施例1(o)に例示さレテイル
ヨうに、piQ 8 HE(7) Sca I −Hi
ndm消化後、その部分にpIN−mo閣pAIよりI
PPプロモーター及びompA遺伝子を含む5cal
−Hindmフラグメントを挿入することにより、pi
PHEを取得する。
該プラスミドの大腸菌へのトランスホーメーション方法
は、公知方法に従う、該大腸菌を用いてのエクオリン蛋
白の生産方法は、後述の実施例2に例示されているよう
に、該大腸菌を所定の培養液中で培養し、該培養液に発
現誘導試薬を加えて所定の該試薬濃度とし更に所定条件
(温度、時間)で培養した培養物を遠心集菌し洗浄する
。
は、公知方法に従う、該大腸菌を用いてのエクオリン蛋
白の生産方法は、後述の実施例2に例示されているよう
に、該大腸菌を所定の培養液中で培養し、該培養液に発
現誘導試薬を加えて所定の該試薬濃度とし更に所定条件
(温度、時間)で培養した培養物を遠心集菌し洗浄する
。
かくして得られた菌体から、公知方法(Neiet a
l、J、Biol Chell、 240巻3885−
3i392(1985) )に従ってスフェロプラスト
を作成する。
l、J、Biol Chell、 240巻3885−
3i392(1985) )に従ってスフェロプラスト
を作成する。
このスフェロプラストを公知方法で破壊し、菌体、スフ
ェロプラストならびに処理剤菌体の夫々についてアクア
リンの酵素活性を測定する。
ェロプラストならびに処理剤菌体の夫々についてアクア
リンの酵素活性を測定する。
後述実施例2の表1にも示されているように菌体のスフ
ェロプラスト以外に処理菌体上清に該活性の大部分(例
えば95%以上)が見出されることにより、エクオリン
が菌体外に分泌されていることが明らかである。
ェロプラスト以外に処理菌体上清に該活性の大部分(例
えば95%以上)が見出されることにより、エクオリン
が菌体外に分泌されていることが明らかである。
以下実施例によって本発明を説明する。
実施例1:lppプロモーター及びompAのシグナル
ペプチドをコードする遺伝子へのエクオリンcDNA遺
伝子の挿入(図1−a)(イ)piQ8HHの作成 高コピーのクローニングベクターpUc 8のEcoR
I −Hindm部分を、それぞれの制限酵素で消化後
その部分にcDNAクローンpAQ440より得られた
エクオリンcDNAのEcoRI −)1indmフラ
グメントを、サブクローニングを行うことにより、pi
QHEを作成した。
ペプチドをコードする遺伝子へのエクオリンcDNA遺
伝子の挿入(図1−a)(イ)piQ8HHの作成 高コピーのクローニングベクターpUc 8のEcoR
I −Hindm部分を、それぞれの制限酵素で消化後
その部分にcDNAクローンpAQ440より得られた
エクオリンcDNAのEcoRI −)1indmフラ
グメントを、サブクローニングを行うことにより、pi
QHEを作成した。
(a)piPHHの作成
piQ 8HEの謹I−…dm消化後、その部分にpl
N −mompAIよりIpPプロモーター及びo+*
pA遺伝子な含む5eal −Hindmフラグメント
を挿入しpiPHEを作成した。
N −mompAIよりIpPプロモーター及びo+*
pA遺伝子な含む5eal −Hindmフラグメント
を挿入しpiPHEを作成した。
上記の方法で作成したpiPHEは、シグナルペプチド
を有するエクオリン蛋白を生産することができる0図1
−bに、シグナルペプチドとエクオリン遺伝子の構造示
す。
を有するエクオリン蛋白を生産することができる0図1
−bに、シグナルペプチドとエクオリン遺伝子の構造示
す。
実施例2:大腸菌を用いてのエクオリンの生産方法
前述の発現分泌ベクターにクローニングして作成したプ
ラスミドp 1P)IEを3.■1(JA221)株に
トランスフォーメイションを行いエクオリン活性を有す
る蛋白を生産させた。
ラスミドp 1P)IEを3.■1(JA221)株に
トランスフォーメイションを行いエクオリン活性を有す
る蛋白を生産させた。
すなわち、100層8/諺文度のアンビミリンを含むL
Bbroth 10m文に1/100 i12時間培
養の上記菌体(プラスミドpiPHEを含む)を添加後
37℃2時間培養し、該培養液に発現誘導試薬IPTG
(isopropyl−β−thiogaloitop
yranosiole)を最絆濃度1mMになるよう添
加し、さらに37℃で4時間培養した。
Bbroth 10m文に1/100 i12時間培
養の上記菌体(プラスミドpiPHEを含む)を添加後
37℃2時間培養し、該培養液に発現誘導試薬IPTG
(isopropyl−β−thiogaloitop
yranosiole)を最絆濃度1mMになるよう添
加し、さらに37℃で4時間培養した。
以上のようにして得られた培養物を500Orpmで1
0分間(H4tachi RP200−ター)遠心集菌
後、M8培地で洗浄する。
0分間(H4tachi RP200−ター)遠心集菌
後、M8培地で洗浄する。
そしてNei らの方法(J、 Biol、 Chel
l、 240巻3685−3H2(1fllEi5)
)に従って、菌体からスフェロプラストを作成した。す
なわち、冷0.03M Tris−HCI(pH8,1
)で2度洗浄後、20%5ucrase−0,03MT
ris−HCI(pH8,1)、1mMEDTAを含む
溶液10m1を加え、10分間ゆっくりと振とう後13
,00Orpmで10分間遠心後、沈殿に冷水10膳文
を加え10分間ゆっくり振とう後、同様に遠心後沈殿に
スフェロプラストが得られる。このものに、1.5+s
文のTris−HCIp)l 7.8.10mMEDT
Aにとかしスフェロプラストは超音波処理で破壊し、ア
クアリンの酵素活性を測定した。
l、 240巻3685−3H2(1fllEi5)
)に従って、菌体からスフェロプラストを作成した。す
なわち、冷0.03M Tris−HCI(pH8,1
)で2度洗浄後、20%5ucrase−0,03MT
ris−HCI(pH8,1)、1mMEDTAを含む
溶液10m1を加え、10分間ゆっくりと振とう後13
,00Orpmで10分間遠心後、沈殿に冷水10膳文
を加え10分間ゆっくり振とう後、同様に遠心後沈殿に
スフェロプラストが得られる。このものに、1.5+s
文のTris−HCIp)l 7.8.10mMEDT
Aにとかしスフェロプラストは超音波処理で破壊し、ア
クアリンの酵素活性を測定した。
その結果を表1に示す、明らかに、菌体のスフェロプラ
スト以外(処理菌体上清)にその活性の95%以上が検
出され、エクオリンを菌体外にて産生することが可能と
なった。
スト以外(処理菌体上清)にその活性の95%以上が検
出され、エクオリンを菌体外にて産生することが可能と
なった。
(表1) 酵、素話性の測定
註0表で、r、1.u、は相対発光値であり、1 r、
lu、= 1.9X 103ベクトルに相当する。
lu、= 1.9X 103ベクトルに相当する。
測定はラボサイエンス社のルミノフォトメーター(TO
4000)を用い、基質セレンテラジン0.2ng。
4000)を用い、基質セレンテラジン0.2ng。
5鉢文の2−メルカプトエタノールを酵素粗抽出液(1
00gJl)に添加し、30mM CaCl2を 10
0pu注入し、測定した。
00gJl)に添加し、30mM CaCl2を 10
0pu注入し、測定した。
図1 (a)は、本発明の菌体外分泌ベクターへのエク
オリン遺伝子の挿入方法を説II したちのである。 同図において、 IpPP:リボプロティンのプロモータ一部分1acP
o:β−ガラクトミダーゼのプロモータ一部分とオペレ
ータ一部分 7 :ompAのシグナルペプチドの遺伝子部分を示
す。 図1(b)は、本発明に係るシグナルペプチドとエクオ
リン遺伝子の構造を説明したものである。 同図において、 はシグナルペプチド(21アミノ酸)を、以上 図1
オリン遺伝子の挿入方法を説II したちのである。 同図において、 IpPP:リボプロティンのプロモータ一部分1acP
o:β−ガラクトミダーゼのプロモータ一部分とオペレ
ータ一部分 7 :ompAのシグナルペプチドの遺伝子部分を示
す。 図1(b)は、本発明に係るシグナルペプチドとエクオ
リン遺伝子の構造を説明したものである。 同図において、 はシグナルペプチド(21アミノ酸)を、以上 図1
Claims (3)
- (1)クラゲ発光蛋白エクオリンの生合成を特定する遺
伝子(pAQ440)を用いて菌体外分泌ベクターにク
ローニングして得られたプラスミドを大腸菌にトランス
ホーメートすることによりエクオリン活性を有する蛋白
質を該大腸菌の菌体外に分泌させることを特徴とする大
腸菌の菌体外分泌ベクターを用いる発光蛋白エクオリン
の製造法。 - (2)大腸菌のリボ蛋白(lpp)のプロモーターの下
流に大腸菌の外膜蛋白A(ompA)の分泌の為のシグ
ナルペプチドをコードする遺伝子及びエクオリン遺伝子
(pAQ440)を接続したプラスミドを用いる特許請
求の範囲第(1)項に記載の製造法。 - (3)シグナルペプチドをコードする遺伝子として大腸
菌のβ−ラクターゼのシグナルペプチドを有する発現ベ
クターを用いる特許請求の範囲 第(2)項に記載の方法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP24909886A JPS63102695A (ja) | 1986-10-20 | 1986-10-20 | 大腸菌の菌体外分泌ベクタ−を用いる発光蛋白エクオリンの製造法 |
GB8724178A GB2197652B (en) | 1986-10-20 | 1987-10-15 | Extracellular secretion of aequorin in escherichia coli |
DE19873735380 DE3735380C2 (de) | 1986-10-20 | 1987-10-19 | Verfahren zur Herstellung von Photoprotein Äquorin unter Verwendung eines Expressionsvektors, der an der Außenseite des Bakterienkörpers von Escherichia coli abgeschieden werden soll |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP24909886A JPS63102695A (ja) | 1986-10-20 | 1986-10-20 | 大腸菌の菌体外分泌ベクタ−を用いる発光蛋白エクオリンの製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63102695A true JPS63102695A (ja) | 1988-05-07 |
Family
ID=17187938
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP24909886A Pending JPS63102695A (ja) | 1986-10-20 | 1986-10-20 | 大腸菌の菌体外分泌ベクタ−を用いる発光蛋白エクオリンの製造法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63102695A (ja) |
DE (1) | DE3735380C2 (ja) |
GB (1) | GB2197652B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01132397A (ja) * | 1987-11-18 | 1989-05-24 | Chisso Corp | アポエクオリンの製造法 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0376580A (ja) * | 1989-08-17 | 1991-04-02 | Japan Tobacco Inc | 大腸菌発現ベクターとそれを利用した抗ウイルス性タンパク質の製造方法 |
CN107904254B (zh) * | 2017-11-28 | 2021-11-23 | 大连大学 | 一种应用大肠杆菌胞外生产n-糖基化重组蛋白的方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61135586A (ja) * | 1984-08-24 | 1986-06-23 | Chisso Corp | 発光蛋白アクアリン遺伝子を有するプラスミドおよび該発光蛋白の生合成法 |
JPS61224989A (ja) * | 1984-12-31 | 1986-10-06 | ユニヴア−シテイ・オブ・ジヨ−ジア・リサ−チ・フアウンデイシヨン・インコ−ポレイテツド | アポエクオリンを発現しうる組換えdnaベクタ− |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59176125A (ja) * | 1983-03-26 | 1984-10-05 | Matsushita Electric Works Ltd | 絶縁トロリ−の製法 |
JP2551746B2 (ja) * | 1983-07-19 | 1996-11-06 | サントリー株式会社 | 改良プラスミドベクタ−およびその利用 |
DE3484950D1 (de) * | 1983-08-23 | 1991-09-26 | Mitsubishi Chem Ind | Plasmidvektoren. |
JPS6439990A (en) * | 1987-08-05 | 1989-02-10 | Chisso Corp | Fused gene by bonding aequorin gene to functional gene |
-
1986
- 1986-10-20 JP JP24909886A patent/JPS63102695A/ja active Pending
-
1987
- 1987-10-15 GB GB8724178A patent/GB2197652B/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-10-19 DE DE19873735380 patent/DE3735380C2/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPS61135586A (ja) * | 1984-08-24 | 1986-06-23 | Chisso Corp | 発光蛋白アクアリン遺伝子を有するプラスミドおよび該発光蛋白の生合成法 |
JPS61224989A (ja) * | 1984-12-31 | 1986-10-06 | ユニヴア−シテイ・オブ・ジヨ−ジア・リサ−チ・フアウンデイシヨン・インコ−ポレイテツド | アポエクオリンを発現しうる組換えdnaベクタ− |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPH01132397A (ja) * | 1987-11-18 | 1989-05-24 | Chisso Corp | アポエクオリンの製造法 |
JP2592623B2 (ja) * | 1987-11-18 | 1997-03-19 | チッソ株式会社 | アポエクオリンの製造法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB2197652B (en) | 1990-08-29 |
DE3735380C2 (de) | 1994-03-10 |
GB8724178D0 (en) | 1987-11-18 |
GB2197652A (en) | 1988-05-25 |
DE3735380A1 (de) | 1988-04-21 |
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