JPH022386A - 天然形ヒト生長ホルモンを高純度で製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ンパク質の製法に関する。殊に本発明は天然形ヒト生長
ホルモン（　ｈ　Ｇ　１１　）を精製された形で製造す
る改良された方法及びこのホルモンをヒトの治療に用い
るという用途にかかわるものである。

ｈＧＨはひとの一生を通じ脳下垂体の前葉で、ことに成
人に至る而の時期に多量産生されるアミノ酸１９１個の
タンパク質である。

この生長ホルモンは前駆体の形で合成され、変化を受け
た後、細胞から分泌される。

ｈＧＨは該ホルモンの欠乏に関連する小人症の治療に屡
々用いられ、また肥満症の治療及び火傷や創傷の治療に
も用いられる。

数年前までは、該ホルモンの得られる源は死体の脳下垂
体であり、これから複雑かつコスト高な方法によって少
量抽出されていたにすぎなかった。

最近になって組換えＤＮ八人法よって形質転換した宿主
微生物を用いる発酵によってｈＧＨを製造する方法が開
発された。

特に、英国特許第２，０５５．９８２号明細書及びヨー
ロッパ特許第２０，１４７号明細書には、１９１個のア
ミノ酸の成熟タンパクをコード付けするＤＮＡの構造配
列を含有するプラスミドを包含する大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の形質転換株を用いてｈＧＨ
を製造する方法が記載され請求されている。このＤＮＡ
構造配列は転写及び翻訳の過程で必要なプロモータ及び
リボゾーム認識部位の下流に位置し、メチオニンをコー
ド付けするへＴＧトリプレットに並置されている。

メチオニンはすべてのタンパク質の翻訳の開始シグナル
であるので、その存在は必須なのである。

従ってこれら公知の方法では、アミノ末端にメチオニン
（Ｍｅｔ）を有する天然形ｈＧＨのアミノ酸配列によっ
て構成される生成物を製造している。

このようなアミノ酸の存在はヒト生長ホルモンの活性に
影響を与えないようにみえる［ケー・ンー・オルノンは
か（Ｏｌｓｏｎ　Ｋ．Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．）］の論文［
ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ）　２９３，　４０８　（１
９８１）コものの、免疫学的データによればＮｅｔ：ｈ
ＧＨの治療を受けた患者のうち可成り大きなパーセンテ
イジで、この生長ホルモンに対する抗体が出現し、それ
以上の治療を止めざるを得なかった。

この結果として、天然形のものと全く同じタンパク質を
得る必要性が生じたのである。

組換えタンパク質からことにｈＧｌｌからメチオニンを
インビボ又はインビトロで除去する各種方法が当業界に
おいて提案されて来た。インビボ法のひとつとしては、
大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の細胞膜を通してのタンパク質
の移動の活性化に応答するシグナル配列の使用によるも
のがあげられる。

一般にこの方法は、ひとつのシグナル配列（リーダー配
列）をコード付けする配列に５′末端で融合した成熟ｈ
ＧＨをコードするヌクレオチド配列を含有するハイブリ
ッドプラスミドの作製及びこのハイブリッドプラスミド
による宿主細胞の形質転換を包含するものである。

適宜この形質転換細胞を培養することにより、この細胞
は融合タンパク質すなわちｈＧＨとシグナル配列とによ
り構成されたタンパク質を産生ずる。

次いでこのシグナル配列を特定のエンドベプチダ−ゼに
よって細胞膜レベルで除去し、成熟したタンパク質を細
胞周辺腔又は外囲環境に放出させる。

ことに、タンパク質ＯｍｐＡのリーダー配列［エイチ・
エム・ンウングほか（Ｉ（ｓｔｕｎｇ　Ｈ，Ｍ、　ｅｔ
　ａｌ、）’ＩＩの論文ロバイオテクノロジイ（Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）４．９９１］及び大腸菌（Ｅ、
　ｃｏｌｉ）のエンドトキシンが、形質転換大腸菌細胞
からの成熟ｈＧＨの製造に用いられ、バチルス・アミロ
リクファンエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑ
ｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のニュートラルタンパク質のノブ
ナル配列が枯草菌（Ｂ、　ｓ’ｕｂｔｉｌｉｓ）細胞か
らのｈＧＨの製造に用いられた。

しかしなめｔら、これらの公知方法は、一方においては
ヒトに対して病原性のある大腸菌を用いることに由来す
る欠点があり、他方においては枯草菌によるタンパク質
の部分的処理によりアミノ末端に１ないし４個の残留ア
ミノ酸を含有するｈＧＨに由来する欠点がある。

メチオニンをインビトロで除去する第２の方法は、合成
生成物が天然形タンパク質と酵素処理で除去できる長い
か或いは短いペプチド配列で構成されるようにひとつの
タンパク質にコード付けする遺伝子の変成から成るもの
である。一般にこの方法は、もし加水分解に用いられる
酵素によって攻撃にさらされる残留アミノ酸が問題のタ
ンパク質中に存在すると、多かれ少なかれこのタンパク
質自体が劣化せしめられ、その結果収率が減することと
なる。

従って、目的の生成物とアミノ末端ペプチドとの間の接
続点において排他的に融合タンパク質を加水分解するよ
うにする特定の処理を提供することが本発明の基本的要
求である。

因子Ｘａすなわちクローニングの複合過程に含有される
血液セリンプロテアーゼはグリシンーアルジニン（Ｇｌ
ｙ　−Ａｒｇ）配列を認識し、ことにイソロイノン−グ
ルタミン酸−グリンンーアルジニン（ｌｉｅ−Ｇｌｕ　
−Ｇｌｙ　−Ａｒｇ）テトラペプチドに非常に大きな親
和性を有する。

近年になってナガイとその共同研究者［Ｎａｇａｉ。

Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８２、７２５２
］は、アミノ末端部が、微生物プロテアーゼの作用から
目的タンパク質を防護するように位置している融合生成
物が、正しく、ことにｌ１ｅＧｌｕ−Ｇｌｙ−＾ｒｇ配
列が接続点に位置する場合に正しく処理されたことを示
した。

融合タンパク質の正しい処理、従って天然形のｈＧＨの
産生を可能にする一方、これら従来法は、このようにし
て得られた生成物の精製が困難であるという欠点を有す
る。

事実、ｈＧＨの前駆体は組換え細胞によって生じたタン
パク質のプールから、及び酵素による加水分解の後に得
られたホルモンからのいずれからも分離が困難である。

従って本発明の目的は、精製された形で天然形ｈＧＨを
製造する改良された方法を提供するにある。

本発明のもうひとつの目的はこのホルモンをヒトの治療
に用いることにある。

本発明の他の目的は、このようにして得られたホルモン
の治療上の有効量を含有する薬剤を提供するにある。

本発明のさらに他の目的は、以下の明細書本文及び実施
例の記載を読むことにより明瞭となろう。

本発明は、ｈＧＨのＮ末端に融合したテトラペプチドｌ
ｉｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇのアミノ末端群に、成る
長さ成るアミノ酸配列のペプチドを存在させることによ
り、このホルモンを天然形でしかも高純度で得るように
できるという知見に基くものである。

事実、位置ｌにメチオニンをまだ残し、かつ少なくとも
ひとつの酸すなわちアミノ酸（グルタミン酸、アスパラ
ギン酸）、ひとつの塩基性アミノ酸（アルギニン、リシ
ン）又はヒスチジンを含有するこのペプチドは、公知の
クロマトグラフィーですべてのタンパク質から及び酸素
による加水分解生成物から分離容易な特性を有するｈａ
ｎ而駆面を与えるのである。

さらに、このペプチド鎖は因子Ｘａによる切断の特性に
影響を与えず、このようにして融合タンパク質の正しい
処理及び正しいアミノ酸配列を有するホルモンの産生を
可能とすることがわかった。

ことに、本発明方法は以下の過程を包含するものである
。

（ａ）ハイブリッドプラスミドにより形質転換された枯
草菌（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の培養による因子Ｘａ
によって認識されたテトラペプチドの上流側に位置する
特定の長さ及びアミノ酸配列のペプチドを含有するヒト
生長ホルモン前駆体の製造、（ｂ）このように形質転換
した細胞のりシンによる溶解及び前駆体を含有する上澄
み液の分離、（ｃ）イオン交換樹脂又は１ＭＡｃ上のク
ロマトグラフィーによる前駆体の精製、及びイオン強度
勾配による前駆体の溶出、 （ｄ）因子Ｘａでこのように精製した前駆体の加水分解
、及び （ｅ）イオン交換クロマトグラフィー又は１ｉｌＡｃに
より加水分解混合物からの高純度の天然形ホルモンの分
離。

本発明方法によれば、ハイブリッドプラスミドはｈＧＨ
而駆面をコート付けする合成遺伝子を発現ベクター内に
適当に挿入することにより過程（ａ）で形成された。

この目的に好適なベクターは当業界で既知のものから選
ぶことができる。

使用して好適だったものは、ベクターｐｓＭ２１４ＡＴ
ＣＣ６７３２０であった。このベクターは枯草菌内で非
常に安定しており異種タンパク質の効率よい発現を誘起
することができることを特徴とする。

イタリー国特許出願第１９５５１　Ａ／８７号に記載さ
れ請求されているこのベクターは、カナマイシン耐性、
アンピシリン耐性及びクロラムフェニコール耐性をそれ
ぞれコード付けするＫｍ、　Ｂｌａ及びＣａｔ遺伝子を
枯草菌及び大腸菌内で複製することを可能とするｐＵＢ
ｌｌｏ及びｐＢＲ３２２の複製開始点及びＢｌａ遺伝子
及びＣａｔ遺伝子の配列を含有するジシストロニックメ
ッセンノヤーＲ）ＩＡ（ｍＲＮＡ）の転写を目的とする
強力な合成プロモーター、及び最後にＣａｔ遺伝子の下
流側に位置する大腸菌のラムダファーノのＴ。ターミネ
ータ−を包含する。

このベクターから、ＥｃｏＲＩ制限酵素及びＨｉｎｄＩ
ＩＩ制限酵素を伴うＢｌａ遺伝子を除去し、次いでこの
部位に異種遺伝子を導入することにより、この異種遺伝
子の転写がこの単独のプロモーターの存在により保証さ
れるハイブリッドプラスミドの作製をクロラムフェニコ
ールでの選択と共に可能となるのである。

従って本発明によれば、異種遺伝子はヒト生長ホルモン
の前駆体をコード付けする異種遺伝子である。

殊にこの遺伝子は、ｈＧ）ｌのアミノ酸１７−１９１を
コード付けする５３０塩基対ＤＮＡフラグメントと、以
下の配列を有するポリペプチドをコード付けする合成オ
リゴヌクレオチドとの融合により得られたちのである。

（ａａ）　−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｈＧｔ
ｌ、１６ここで（ａａ）は位置１のアミノ酸が常にメチ
オニンであり、少なくともひとつの塩基性アミノ酸残分
（アルギニン又はリシン）（＾ｒｇｓ　Ｌｙｓ）、又は
少なくとらひとつの酸性アミノ酸残分（グルタミン酸又
はアスパラギン酸ＸＧｌｕ、　Ａｓｐ）又はヒスチジン
（Ｈｉｓ）を包含するアミノ酸配列であり、ｎは２ない
し１０の値である。

１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇは因子Ｘａで認識され
るテトラペプチドであり、ｈＧＨ，□８はヒト生長ホル
モンの１６個のアミノ酸のアミノ末端配列である。従っ
て、また本発明の非制限的実施例を与えるために、合成
オリゴヌクレオチドを、ａ−ａ配列が配列Ｍｅｔ　−Ｇ
ｌｕ　−Ｇｌｕ　−Ｌｅｕ　−Ｍｅｔ−であるポリペプ
チドをコード付けするものとして合成した。

本発明によれば、　５３０ｂｐＤＮＡフラグメントが、
プラスミドｐｓＭ２０９をＦｎｕＤＩＩ制限酵素及び旧
ｎｄｌＩ［制限酵素で消化し、この消化混合物をポリア
クリルアミドゲル上での電気泳動により分離することに
より得られた。

上述のプラスミドｐｓＭ２０９は、市販のプラスミドｐ
Ｕｃ９（ベーリンガー）から、当業界で知られている従
来方法により得られたものである。

殊に、ｈＧＨのｃＤＮＡがプラスミドｐＵＣ９中でサブ
クローニングされて中間プラスミドｐＷＨ＾４１が得ら
れ、次いでこの中間プラスミドが従来通り処理されてｈ
ＧＩＩ遺伝子の下流側に位置するＳｍａ　Ｉ制限部位を
除去され、Ｈｉｎｄｌ１１部位を置換された［イタリー
国特許出願第２０３４５　Ａ／８６号（特願昭６２−１
０９９１６号）のプラスミドｐｓＭ２０９の作製に関す
る記載を参照されたい］。

次いでフラグメントは旧恩てホスホリル化した合成オリ
ゴヌクレオチド及びＢｌａ遺伝子を除去するようＥｃｏ
ＲＩ酵素及び旧ｎｄｌＩ［酵素で消化したベクターｐｓ
Ｍ２１４でリガーゼ処理した。

このリゲーション反応は、一般に知られている技術によ
ってＴ４　ＤＮ＾リガーゼ酵素の存在の下に行われた。

この酵素反応の終りに当って、全混合物がＣａＣｌ２．
での処理によってコンピテントとした大腸菌を形質転換
するのに用いられた［マンデル・エム（Ｍａｎｄｅｌ　
Ｍ、）及びヒガ（Ｈｉｇａ）（１９７０）　：　Ｊ、　
Ｍｏ１Ｂｉｏ１．５３．１５４］。

次いで形質転換細胞がクロラムフェニコールを添加して
選択性とした適当な培養培地上で３０℃ないし４０℃の
温度において選別された。正しく挿入された合成遺伝子
を含有するハイブリッドプラスミドをこのようにして単
離したのである。

次いでプラスミド（ｐＳＭ２）４）がコンタンテ（Ｃｏ
ｎｔｅｎｔｅ）及びデュブノ−（Ｄｕｂｎａｕ）法［Ｍ
ｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１６７、２５８　（１９７９
）コによってコンピテントとした枯草菌細胞を形質転換
するのに用いられた。

この目的のためには、特性（ｈｐｒ−１ｓｐｒ−）を有
する枯草菌の各種菌株を用いることができる。この場合
にはＢ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ　５Ｍ５１１ｇ　（ｒｅｃ
＋、ｈｐｖ−１ｓｐｒ−１ｌｅｕＳｐｙｒＤ１）が好適
に用いられた。

次いで形質転換細胞を、ｖＹ液体培地［ビール・インフ
ユージジン・ブロス（ＤＩＦＣＯ）、イースト・エクス
トラクトＣＤＩＦＣＯ）］にクロラムフェニコールを添
加したものの中で３７℃又は大略３７℃の温度で成育さ
せた。

次いでこれらの形質転換細胞を遠沈によって上澄み液か
ら分離し、一般に知られている技術のひとつによりリシ
ン溶解し、最後に溶菌物を分析してｈＧＩ（前駆体の存
在を決定した。実際には溶菌物は、ポリアクリルアミド
ゲル上にのせ、電気泳動後タンパク質をクマシーブルー
染色［ゲル・エレクトロホレシス・オブ・プロテインス
：ア・プラクティカル６アプローチ（Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：＾Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ：ｌ、ビー・デイ
−・ヘイムズ（Ｂ、Ｄ、Ｈａｍｅｓ）及びデイ−・リッ
クウッド（Ｄ、Ｒｉｃｋｖｏｏｄ）編、アイアールエル
・プレス・リミテッド（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍ１
ｔｅｄ）刊コ又はインミュープロット［トウビンほか（
Ｔｏｖｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）（１９７９）。

Ｐ、Ｎ、＾、Ｓ、、　ｖｏｌ、７６　ｎ、　９．４３５
０−４３５４１のいずれかによって染色することによっ
て可視化する。

このようにして得られた結果は、標準天然形ｈＧＩＩ（
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）よりも若干ゆっくり泳動し、抗
ｈＧ１１抗体と反応する大略２３０００ダルトンのタン
パク質が細胞リシン溶解の上澄み液に存在することを示
した。

本発明によれば、ｈａＨｄ駆体は溶菌物の上澄み液から
精製された。

既知のイオン交換又はＩＭＡＣクロマトグラフィーがこ
の目的のために用いられた［ベレウ・エムほか（Ｂｅｌ
ｅｗ　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、）（１９８７）　：　Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６４．４５７コ。アニオン樹脂
又はカチオン樹脂を用いるイオン交換法は、ペプチド鎖
中に存在する酸性及び／又は塩基性アミノ酸の正又は負
の電荷の存在を利用してｈＧ）ｌ前駆体をカラムに結合
せしめる技術であり、ＩＭＡＣ法は、ヒスチジン及びそ
の他のアミノ酸の金属イオンに対する親和性を利用する
技術である。実際には、細胞をリシン溶解し溶菌物を遠
心分離した後、上澄み液はこの前駆体と強く結合するＤ
ＥＡＥセルロース又はセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ）から選んだ樹脂を充填したクロマトグラフカラムに
通した。

次いでタンパク質は、イオン化傾向を有する溶離液を用
いてカラムから溶出せしめた。

ＮａＣ０６度０．１ないし０．５Ｍの緩衝液が好適に用
いられた。

このようにしてカラムから純度大略６０％の前駆体が９
０％以上の収率で取り出すことができた。

本発明方法の１実施例によれば、タンパク質懸濁液は６
０％まで飽和させた硫酸アンモニウムを添加することに
よって濃縮し、ｈＧＨ前駆体を精製するに先立ってタン
パク質を沈殿仕しめる。次いでこのタンパク質は緩衝液
中で可溶性とし、イオン交換クロマトグラフィー又はＩ
ＭＡＣにより精製される。

本発明によれば、このようにして精製された前駆体は再
び緩衝液中に＠濁せしめられ、因子Ｘａを用い因子Ｘａ
／ｈＧＨ前駆体の分子比１／２ないし１　／ｌｏ。

で加水分解せしめられた。

この酵素反応は室温（２０−２５℃）において、反応が
完結するか又は殆ど完結するに必要な時間待われた。

次いで反応混合物は次のクロマトグラフィーのために好
適な緩衝液に対して透析され、成熟ホルモン、加水分解
されなかった前駆体及び残留汚染分としてのタンパク質
を含有する混合物が再びイオン交換クロマトグラフィー
又はＩＭＡＣによって精製された。

残留タンパク質及び前駆体はこのようにしてカラムに吸
着され、他方結合されなかった成熟ホルモンは９０％以
上の収率でカラムから溶出された。

サンガー・エフほか（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　ｅｔ　ａ
ｌ、）の技法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＩＪＳＡ　７４．５４６３（１９７７）］によ
って行われたアミノ酸配列の分析は、このようにして精
製したホルモンが正しい配列を有することを示した。

さらに、電気泳動分析の結果、このホルモンは１００％
又は大略１００％の純度を示した。

以下に示す実施例は本発明を限定するものではなく単に
例示するためのものである。

例１ 作製 アミノ酸１７からアミノ酸１９１までのヒト生長ホルモ
ン（ｈＧＨ）をコード付けするＤＮＡ配列が、イタリー
国特許出願第２０３４５　Ａ／８６号（特願昭６Ｌ−１
０９９９１６号）に記載されたプラスミドｐｓＭ２０９
から単離された。この単離はアミノ酸１６及び１７の間
のＤＮＡレベルで切断するＦｎｕＤＩ［制限酵素及び停
止コドンの下流で切断する旧ｎｄｌＩＩ制限酵素でこの
プラスミドを処理することによる。

この目的のため、ｐｓＭ２０９５０μ９を、６　ｍＭ　
Ｔｒｉｓ１１ＣＱｐＨ７，４，６ｍＭ　ＮａＣｌ２．６
ｍＭ　ＭｇＣＱｔ１６ｍＭメルカプトエタノールを含有
する反応混合物２００μρ中においてＦｎｕＤ　Ｕ　（
Ｂｉｏｌａｂｓ）５０ユニツト（Ｕ）で３７℃において
１時間切断した。

この酵素を７０’Ｃで１０分間脱活性化処理した後、溶
液を５０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱｐＨ８，ｏ、１０ｍ
Ｍ　ＭｇＣＱｌ、５０ｍＭＮａＣＱの濃度にもたらし、
Ｈｉｎｄｌｎ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）５００の存在
下で３７℃、１時間培養した。

この酵素を７０°Ｃにおいて１０分間脱活性化処理した
後、消化混合物を６％アクリルアミドゲルの上に乗せ、
１３０ボルトの電圧を３時間印加してＤＮＡを分離した
。次いで、アミノ酸１７からアミノ酸１９１までｈＧＨ
をコード付けする配列を含有する大略５３０塩基対（ｂ
ｐ）のバンドをマクサム（Ｍａｘａｍ）及びギルバート
（Ｇｉｌｂｅｒｔ）によって記載されたように［メソッ
ズ・イン・エンザイモロノイー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　ｖｏｌ、　６５．４９９−５
６０（１９８０）］として溶出せしめた。

次いで下記の配列を有するＤＮＡのフラグメントがンス
テム・ワン・ＤＮＡ・ノンセサイザー（ＳｙｓｔｅＩＩ
ｌＯｎｅ　ＤＮＡ　ＳｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒＸＢｅｃｋ
ｍａｎ）によって合成された。

＋ｌ　　＋２　　＋３　１４　　＋５　　＋５１１ｅｔ
Ｇ　ｌ　ｕＧ　１ｕＬｅｕｉｌｅｔ　ｌ　ｌｅＧ　ｌ　
ｕＧ　ｌｙＡｒｇＰｈｅＰｒｏＴｈｒ　ｌ　１ｅＰｒｏ
ＬｅｕＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＧ＾＾ＧＡＡＣＴＴＡＴＧ
ＡＴＣＧＡＧＧＧＴＡＧＧＡＡＧＧＧＴＴＧＧＴＡＡＧ
ＧＧＡＡＴ（ｉＡＡＴＡＣＣＴＴＣＴＴＧＡＡＴＡＣＴ
ＡＧＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣ
ＣＴＴＡ＋７　＋８　　＋９　　＋ｔｏ÷Ｉ＋＋１２＋
１３＋１４＋１５＋１６Ｓｅｒ＾ｒｇＬｅｕＰｈａＡｓ
ｐＡｓｎ＾ｌａｌｌｅｔＬｅｕＡｒｇＡＧＧＴＣＣＧＡ
ＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣＣＧＡＡＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＡ
ＧＧＣＴＴＴＴＴＧＡＣＡＡＧＧＣＴＴＡＣＣＴＣＣに
のＤＮＡフラグメントはｈＧＨの最初の６個のアミノ酸
及びアミノ酸Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ
ｌｌｅ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ−＾ｒｇをコード付けする
。後音はエンコードしたペプチドフラグメントのアミノ
末端に位置する。次いでこのＤＮＡフラグメントｌμ９
を、６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２　ｐＨ７，５、ｌ　
ｍＭ　ＡＴＰ、　　Ｉ　ｍＭスペルミノン、１０ｍＭ　
ＭｇＣＱｌ、１５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、
ボウバイン・セラム・アルブミン０．２Ｊ１１？／ｘＱ
及びＴ４キナーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）　２　Ｌｌを含有
する緩衝液ｌＯμＱ中で３７℃、１時間加リン酸処理し
た。次いで酵素を６５℃で１０分間脱活性化した。

Ｂ　）ｐｓＭ２７４の作製（第１図） プラスミドｐｓＭ２１４　ＡＴＣＣ６７３２０２ｕ９を
、５０ｍＭＴｒｉｓ−ｔｉｃρｐｌ（７，５，６ｍＭ　
ＭｇＣＱｔ、５０ｍＭ　ＮａＣＱを含有する緩衝液２０
μＱ中において、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩそれぞ
れ２Ｕと３７℃で１時間消化させた。次いで酵素はこの
消化混合物を６５℃に１０分間保つことによって脱活性
化させた後、０．８％アーガロースゲル上で１００ボル
トを２時間印加した［マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ
）ほか（１９８２）、モレキュラー・クローニング・ア
・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌ
ｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ
ａｌ）、コールドΦスプリングＨハーバ−（Ｃｏｌｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）］。

次いで大略６５００塩基対（ｂｐ）の最大バンドを既知
技術［上述のマニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ほか（
＋９１１２）］によって溶出せしめた。

６５００ｂｐのフラグメント１．５μ９、ｐｓＭ２０９
の５３０ｂｐフラグメント４００ｎ９、及び前記Ａ）に
おいて述べたように加リン酸処理した合成フラグメント
５０ｎ９を、６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！　ｐＨ７，
６，１ｍｉｌ　ＡＴＰ、　ｉｏ＋ｎＭ　ＭｇＣ＋！ｔ、
１０ｍＭ　ＤＴＴを含有する緩衝液１５０μσ中に混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２Ｕの存在の下に１４℃で１８
時間リガーゼ処理した。このリガーゼ処理混合物５μＱ
を、５０ｍＭ　ＣａＣＬとの処理によりコンピテントと
した市販の大腸菌Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩ（ＢＲＬ
）細胞２００μＱを形質転換するのに用いた［マンデル
・エム（Ｍａｎｄｅｌ、　Ｍ、）及びヒガ（Ｉ（ｉｇａ
）（１９７０）Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　５３．１
５４］。

次いでこの形質転換物は、細胞をクロラムフェニコール
（ＣＭ）２０μ９を含有するし寒天培地プレート［１０
９／Ｑトリプトン（ＤＩＦＣＯ）、５ｇ／Ｑバクト・イ
ースト・エクストラクト（ＤＩＦＣＯ）及び１０９＃！
　ＮａＣＱ］上にひろげ３７℃で１２時間保持すること
で選んだ。

Ｃｍ耐性のコロニーから、所要のプラスミドｐＳＭ２７
４（第１図）を担持するものを単離した。このプラスミ
ドのヌクレオチドの配列はサンガー・エフほか（Ｓａｎ
ｇｅｒ　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、）法［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、＾ｃａｄＳｃｉ、　０３人７４．５４６３（１９７
７）］ｉこよってチエツクされた。

例２ コンタンテ（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ）及びデュブノー（Ｄｕ
ｂｒ＋ａｕ）（１９７９）（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅ
ｎｅｔ　１６７．２５１−２５９）によって記載された
ようにしてコンピテントとした５Ｍ５１１８Ｂ、５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ細胞（ｒｅｃ＋、ｎｐｒ−１ｓｐｒ−１ｌｅ
ｕ、　ｐｙｒＤｌ）をプラスミドＰＳＭ２７４で形質転
換させ、この形質転換体をクロラムフェニコール５μｇ
／３！１２を含有スるＴＢＡＢ寒天プレート（トリブト
ーゼ血液寒天ベース）上で選んだ。

分析した１２個の形質転換体中わずか７個がプラスミド
ｐＳＭ２７４の存在に対してプラスであった。

ＳＹＳ１１８（ｐＳＭ２７４）　Ｂ、　５ｕｂｔｉ！ｉ
ｓ菌株中の合成ｈＧＨ遺伝子の発現を確認するために、
これをクロラムフェニコール５μ９／ｙＱ含有するｖＹ
培地［ビール・インフユーノヨン・ブロス（ＤＩＦＣＯ
）２５９／Ｑ、イースト・エクストラクト（ＤＩＦＣＯ
）　５　ｇ／　Ｑコニ０峠中で培養した。次いでこの培
養基！峠を遠沈（１２０００ｒＨＸ　１５分間）して細
胞を集め、これを３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｉ１ｃ１２ｔ）
Ｈ７，５，５０ｍＭ　ＮａＣ（を含有する緩衝液５厘Ｑ
で２回洗浄し、それからＥＴｉ衝液ζ２０％サクローズ
、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｉ！　ｐＨ７，６，５０ｍＭ
　ＥＤＴＡ）ｌｏｏμＱ中に再懸濁せしめた。次いでリ
ゾツィーム５ｙ＋ｇ／ｍＱを含有する溶液２０μＱをこ
のようにして得た＠濁液に添加し、３７℃で１５分間保
持した。次いで１２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱｐＨ６，
８，３％ドデンルスルホン酸ナトリウム（ＳＤＳ）、３
％ベーターメルカプトエタノール及び２０％グリセロー
ルを含有する緩衝液１３０μｇをこの混合物に添加し、
このようにして得た混合物を９５℃で３分間保持した。

溶菌物を１２．５％５ＤＳ−アクリルアミドゲルに加え
［ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）；（１９７０）Ｎａｔｕ
ｒｅ。

２７７：６８０］、２Ｓｆｆｉ＾で３時間電気泳動させ
た後、タンパク質をクマシーブルー染色［ゲル・エレク
トロホレミス・オブ・プロテインズ：ア・プラクティカ
ル・アプローチ（Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓ
ｉｓ　ｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ　：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）、ビー６デイ・ヘイムズ（Ｂ
、　Ｄ、　１ａｎｅｓ）及びデイ・リックウッド（Ｄ、
　Ｒｉｃｋｖｏｏｄ）！、アイアールエル・プレス・リ
ミテッド（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）刊］
又はニトロセルロース・フィルター［シュライア−（Ｓ
ｈｌｅｉｈｅｒ）及びノニル（Ｓｈｕｌｌ）４５μｙｔ
孔径トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）］への移転かによって表
示する。

ウサギ抗ｈＧＨ抗体（Ｍｉｌｅｓ）及びヤギ耐つサギＩ
ｇＧ抗体をバーオキンダーゼと共に用いるトウビンはか
（Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　１９７９．　ｖｏｌ、　７６、ｎ
、　９．４３５０４３５４）によって記載されたような
フィルターの処理によってｈＧ）ｌの存在が明らかにさ
れた。

シマシーブルー染色後、大略２３０００ダルトンの見掛
けの分子量を有するタンパク質があられれ、これが標準
の天然形ｈＧＨ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）よりもゆっく
りと泳動する。これは大略６２％の全可溶性タンパク質
（第２図）をあられす。

このタンパク質は免疫分析（第３図）で示すように抗ｈ
ＧＨ抗体と反応する。生産されたｈＧＨ前駆体の量は、
この菌株が培養物１リツトル当たりウェットセルペース
ト大略４ｇを含むような実験室条件下で培養された場合
１８１１１ｇ／リットルと推定された。

例３ Ａ）成熟ｈＧＨの精製 グリセリン処理しかつ一８０℃で保存したＳＹＳｌｌｇ
（ｐｓＭ２７４）Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓの培養物を、
クロラムフェニコール５μ９／廣σを含有するし寒天プ
レート上で各別のコロニーを形成せしめるように使用し
た。

ついでひとつのコロニーを、クロラムフェニコール５μ
ｇ／ｍＱ補ったｖＹ培地１σ中に接種ｊ−た。

この培養基を３７°Ｃで１８時時間表う培養し、次いで
ツルパル（Ｓｏｒｖａｌｌ）遠心分離機（ＧＳ３０−夕
、６５００ｒｐｍ）で１４℃において１０分間７１００
ｇで遠沈した。

このようにして回収した細胞は、１０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ
ｌｌＣ（！　ｐＨ８，０、ｌ　ｍＶ　ＥＤＴＡ、　２５
％サクローズ緩衝液１２１中に再懸濁させ、ついでリゾ
チーム４０ｙｑ／ｒｘρを含有するＴＥ溶液（１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２　ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ
）ＩｘＱを加えた。この懸濁液を３７℃で４５分間培養
し、次いで水浴中に移し、フェニル−メチル−スルホニ
ル−フルオライド（ＰＭＳＦ）を最終０度が１ｍＭにな
るまで加えた後、均質なＭｉ！１３ｉａが得られるまで
音波処理し１こ。

次いでこの＠濁液を４℃において３０分間＋２００Ｏｒ
ｐｍ（ツルパル遠心分離機、５Ｓ−３４０−ター）で遠
沈し、上澄み液を回収し、これを２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＱｐＨ７，５、ｌ　ｍＶ　Ｐ！＋！ＳＦの溶液に対
して透析した。

ＤＥＡＥセルロースの２０Ｘ１．６ｃｘ力ラムＱｈａｔ
ｍａｎ　ＤＥ５２）を４℃において３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ２．　１　ｍＭ　ＰＭＳＦ　ｐＨ７，５で平衡
化しく流速３０Ｒ（！／ｈｒ）、次いで過程Ａ）で用意
したタンパク質溶液を負荷した。

このカラムを平衡化緩衝液３倍量で洗浄した後、０．１
ｍＭ　ＮａＣＱ、　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱｐＨ７
，５１衝液２００１＋２で溶出仕しめた。

この塩濃度は融合タンパク質の大略９０％を溶出せしめ
るに十分である。

次いで２０１１１１１１　Ｔｒｙｓ−ＨＣＱｓ　Ｏ，５
ｍＭ　ＮａＣρＩ）Ｈ７、５で洗浄して残留タンパク質
を除去する。

Ｃ）イオン交換クロマトグラフィー 融合タンパク質を含有するフラクションは組換えられ、
２０ｄ　ＮａＨＰＯ，／Ｎａ、ＩＩＰＯ，ｐＨ６，７緩
衝液に対して透析し、次いで同じ緩衝液で平衡化したＤ
ＥＡＥセルロースの１５Ｘｌｃｆｆカラムに負荷した。

残らなかったタンパク質を洗い出した後、融合タンパク
質をこの平衡化緩衝液中の０．１ｍＭ　ＮａＣＱで溶出
せしめた。

ｈＧＨ前駆体を含有するフラクションが回収され、硫酸
アンモニウム（６０％飽和）が添加され、存在する全タ
ンパク質を沈降せしめた。次いでこの沈降物が回収され
、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣρｐＨＬＯ１１００ｍＭ　
ＮａＣＱ及びｌ　ｍＭ　ＣａＣＱ２溶液６ｉ＆中に溶解
せしめた。次いでゼオチーセン・エイチー　ン−（Ｔｈ
ｅｏｇｅｒｓｅｎ　１１．ｃ、）（１９７８）（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　Ｊ、　１７５．６１３）に記載されている
ように調製し精製した血液因子Ｘａプロテアーゼを、因
子Ｘａ／ｈＧＨ前駆体分子比１：１０で溶液に加えた。

この酵素反応は混合物を室温（２０−２５℃）に２４時
間保って行われた。

ｈＧ８前駆体の９０％がこのようにして消化され、シス
テム８０シーケンサ−（Ｂｅｃｋｍａｎ）で行われた最
初の１０個のアミノ酸の解析によって示されるように天
然杉配列を有するホルモンに変換された。過量の塩を除
去するために試料はｐＨ６，７ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ＋
ＨＰＯ４２ｍＶ緩衝液に対して透析された。

Ｄ）天然形ｈＧ■の精製 過程Ｃ）で記載した方法を用いた。これらの条件下では
、溶出緩衝液中のＮａＣｌ２濃度の１００ｍＭまでの増
加によって溶出せしめ得る、因子Ｘａにより消化されな
い前駆体及び汚染分のタンパク質とは異なり、天然形ヒ
ト生長ホルモンはカラムによって保留されなかった。

このようにして得たｈＧＨは９８％の純度であった。

このｈＧＩｌの純度は、続いてＲＰ−）ＩＰＬＣ（Ｃ３
）カラムを通しアセトニトリル勾配で溶出せしめること
により１００％の値又は大略１００％の値まで高めるこ
とができる。ｈＧＨの正確な配列は純粋なｈＧＨ５０μ
９を用いモデル８９０Ａベツクマン自動シーケンサ−を
使用することによるアミノ末端配列の決定によって確め
られた。ＰＴＨアミノ酸はホーン・デイ他（Ｈａｗｋｅ
。

Ｄ、　ｅｔ　ａｌ）　［Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　１２０．３０２　（１９８２）］に記載された方法を
わずか変更した方法で解析された。予想どおり最初の１
０個のアミノ酸配列はＰｈｅＰｒｏ　Ｔｈｒ　ｌｌｅ　
Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅであ
った。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＳＭ２１４の作製過程を示す略図
である。第２図は枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）細胞
からの可溶性及び不溶性タンパク質の全部を含有するク
マノーブルー染色した５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果
をあられす図であって、１は５Ｍ５１１ｇ　（ｐｓＭ２
１４）可溶性タンパク質フラクション、２はＳＭＳｌｌ
ｇ（ｐｓＭ２１４）不溶性タンパク質フラクション、３
は５Ｍ３１１８　（９３Ｍ２７４）可溶性タンパク質フ
ラクンヨン、４は５Ｍ５１１８　（９３Ｍ２７４）不溶
性タンパク質フラクション、５はｍｅｔ−ｈＧＨ，６は
分子量標準を示す。第３図は枯草菌細胞の可溶性及び不
溶性タンパク質の全部のウェスタンプロットの結果を示
す図であって、１は５Ｍ３１１ｇ　（ｐｓＭ２１４）可
溶性タンパク質フラクノヨン、２は５Ｍ３１１ｇ　（ｐ
ｓＭ２１４）不溶性タンパク質フラクション、３は５Ｍ
３１１ｇ　（９３Ｍ２７４）可溶性タンパク質フラクノ
ヨン、４は５Ｍ５ｌ１８　（９３Ｍ２７４）不溶性タン
パク質フラクション、５はｍｅｔ−ｈＧＨを示ず。 ＦＩＧ、２ Ｆ！Ｇ、３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　天然形ヒト生長ホルモンを高純度で製造する方法に
   おいて、 ａ）因子Ｘａで認識されるテトラペプチドと、２個ない
   し１０個のアミノ酸残分で形成され配位１のアミノ酸が
   メチオニンであり他のアミノ酸の少なくともひとつが酸
   性のもの、塩基性のもの及び／又はヒスチジンから選ば
   れたものであるペプチドとにより構成されたアミノ酸鎖
   がアミノ末端に存在することによって特徴付けられるヒ
   ト生長ホルモン前駆体を、ハイブリッドプラスミドによ
   って形質転換された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔ
   ｉｌｉｓ）細胞の培養により合成し、 ｂ）この形質転換細胞をリシン溶解し前記前駆体を含有
   する上澄み液を回収し、 ｃ）クロマトグラフィーによりこの上澄み液から前記前
   駆体を精製し、 ｄ）因子Ｘａでの処理によりこのように精製した前記前
   駆体を加水分解し、 ｅ）クロマトグラフィーによりこの加水分解混合物から
   ヒト生長ホルモンを精製する、 ことを包含する製法。 ２　請求項１記載の製法において、要件ａ）の枯草菌が
   Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＳＭＳ１１８であることを特徴
   とする製法。 ３　請求項１記載の製法において、前以てＥｃｏＲ I
   及びＨｉｎｄIII制限酵素で消化した発現ベクターＰＳ
   Ｍ２１４　ＡＴＣＣ６７３２０を、ヒト生長ホルモンの
   前駆体をコード付けする遺伝子に合体させることによっ
   て前記ハイブリッドプラスミドを要件ａ）において得る
   ことを特徴とする製法。 ４　請求項３記載の製法において、前記遺伝子が、因子
   Ｘａによって認識されるテトラペプチドをコード付けす
   る配列及び前記ペプチドをコード付けする配列を５′末
   端で融合した、天然形ホルモンをコード付けするヌクレ
   オチド配列により構成されていることを特徴とする製法
   。 ５　請求項４記載の製法において、前記アミノ末端ペプ
   チドが配列Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ、
   ここでＭｅｔはメチオニン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｉ
   ｌｅはイソロイシンである、を有することを特徴とする
   製法。 ６　請求項１記載の製法において、前記要件ｃ）および
   ｅ）における精製をイオン交換クロマトグラフィーまた
   はＩＭＡＣによって行うことを特徴とする製法。 ７　請求項１記載の製法において、前記酵素加水分解が
   因子Ｘａ／前駆体の分子比が１／２ないし１／１００で
   室温２０−２５℃において実施されることを特徴とする
   製法。 ８　動物に対し治療上有効である、請求項１に記載の方
   法によって製造したホルモンを含有する薬剤。