JPH022386A - 天然形ヒト生長ホルモンを高純度で製造する方法 - Google Patents
天然形ヒト生長ホルモンを高純度で製造する方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ンパク質の製法に関する。殊に本発明は天然形ヒト生長
ホルモン( h G 11 )を精製された形で製造す
る改良された方法及びこのホルモンをヒトの治療に用い
るという用途にかかわるものである。
ホルモン( h G 11 )を精製された形で製造す
る改良された方法及びこのホルモンをヒトの治療に用い
るという用途にかかわるものである。
hGHはひとの一生を通じ脳下垂体の前葉で、ことに成
人に至る而の時期に多量産生されるアミノ酸191個の
タンパク質である。
人に至る而の時期に多量産生されるアミノ酸191個の
タンパク質である。
この生長ホルモンは前駆体の形で合成され、変化を受け
た後、細胞から分泌される。
た後、細胞から分泌される。
hGHは該ホルモンの欠乏に関連する小人症の治療に屡
々用いられ、また肥満症の治療及び火傷や創傷の治療に
も用いられる。
々用いられ、また肥満症の治療及び火傷や創傷の治療に
も用いられる。
数年前までは、該ホルモンの得られる源は死体の脳下垂
体であり、これから複雑かつコスト高な方法によって少
量抽出されていたにすぎなかった。
体であり、これから複雑かつコスト高な方法によって少
量抽出されていたにすぎなかった。
最近になって組換えDN八人法よって形質転換した宿主
微生物を用いる発酵によってhGHを製造する方法が開
発された。
微生物を用いる発酵によってhGHを製造する方法が開
発された。
特に、英国特許第2,055.982号明細書及びヨー
ロッパ特許第20,147号明細書には、191個のア
ミノ酸の成熟タンパクをコード付けするDNAの構造配
列を含有するプラスミドを包含する大腸菌(Esche
richia coli)の形質転換株を用いてhGH
を製造する方法が記載され請求されている。このDNA
構造配列は転写及び翻訳の過程で必要なプロモータ及び
リボゾーム認識部位の下流に位置し、メチオニンをコー
ド付けするへTGトリプレットに並置されている。
ロッパ特許第20,147号明細書には、191個のア
ミノ酸の成熟タンパクをコード付けするDNAの構造配
列を含有するプラスミドを包含する大腸菌(Esche
richia coli)の形質転換株を用いてhGH
を製造する方法が記載され請求されている。このDNA
構造配列は転写及び翻訳の過程で必要なプロモータ及び
リボゾーム認識部位の下流に位置し、メチオニンをコー
ド付けするへTGトリプレットに並置されている。
メチオニンはすべてのタンパク質の翻訳の開始シグナル
であるので、その存在は必須なのである。
であるので、その存在は必須なのである。
従ってこれら公知の方法では、アミノ末端にメチオニン
(Met)を有する天然形hGHのアミノ酸配列によっ
て構成される生成物を製造している。
(Met)を有する天然形hGHのアミノ酸配列によっ
て構成される生成物を製造している。
このようなアミノ酸の存在はヒト生長ホルモンの活性に
影響を与えないようにみえる[ケー・ンー・オルノンは
か(Olson K.C. et al.)]の論文[
ネイチュア(Nature) 293, 408 (1
981)コものの、免疫学的データによればNet:h
GHの治療を受けた患者のうち可成り大きなパーセンテ
イジで、この生長ホルモンに対する抗体が出現し、それ
以上の治療を止めざるを得なかった。
影響を与えないようにみえる[ケー・ンー・オルノンは
か(Olson K.C. et al.)]の論文[
ネイチュア(Nature) 293, 408 (1
981)コものの、免疫学的データによればNet:h
GHの治療を受けた患者のうち可成り大きなパーセンテ
イジで、この生長ホルモンに対する抗体が出現し、それ
以上の治療を止めざるを得なかった。
この結果として、天然形のものと全く同じタンパク質を
得る必要性が生じたのである。
得る必要性が生じたのである。
組換えタンパク質からことにhGllからメチオニンを
インビボ又はインビトロで除去する各種方法が当業界に
おいて提案されて来た。インビボ法のひとつとしては、
大腸菌(E. coli)又は枯草菌(Bacillu
s subtilis)の細胞膜を通してのタンパク質
の移動の活性化に応答するシグナル配列の使用によるも
のがあげられる。
インビボ又はインビトロで除去する各種方法が当業界に
おいて提案されて来た。インビボ法のひとつとしては、
大腸菌(E. coli)又は枯草菌(Bacillu
s subtilis)の細胞膜を通してのタンパク質
の移動の活性化に応答するシグナル配列の使用によるも
のがあげられる。
一般にこの方法は、ひとつのシグナル配列(リーダー配
列)をコード付けする配列に5′末端で融合した成熟h
GHをコードするヌクレオチド配列を含有するハイブリ
ッドプラスミドの作製及びこのハイブリッドプラスミド
による宿主細胞の形質転換を包含するものである。
列)をコード付けする配列に5′末端で融合した成熟h
GHをコードするヌクレオチド配列を含有するハイブリ
ッドプラスミドの作製及びこのハイブリッドプラスミド
による宿主細胞の形質転換を包含するものである。
適宜この形質転換細胞を培養することにより、この細胞
は融合タンパク質すなわちhGHとシグナル配列とによ
り構成されたタンパク質を産生ずる。
は融合タンパク質すなわちhGHとシグナル配列とによ
り構成されたタンパク質を産生ずる。
次いでこのシグナル配列を特定のエンドベプチダ−ゼに
よって細胞膜レベルで除去し、成熟したタンパク質を細
胞周辺腔又は外囲環境に放出させる。
よって細胞膜レベルで除去し、成熟したタンパク質を細
胞周辺腔又は外囲環境に放出させる。
ことに、タンパク質OmpAのリーダー配列[エイチ・
エム・ンウングほか(I(stung H,M、 et
al、)’IIの論文ロバイオテクノロジイ(Bio
technology)4.991]及び大腸菌(E、
coli)のエンドトキシンが、形質転換大腸菌細胞
からの成熟hGHの製造に用いられ、バチルス・アミロ
リクファンエンス(Bacillusamyloliq
uefaciens)のニュートラルタンパク質のノブ
ナル配列が枯草菌(B、 s’ubtilis)細胞か
らのhGHの製造に用いられた。
エム・ンウングほか(I(stung H,M、 et
al、)’IIの論文ロバイオテクノロジイ(Bio
technology)4.991]及び大腸菌(E、
coli)のエンドトキシンが、形質転換大腸菌細胞
からの成熟hGHの製造に用いられ、バチルス・アミロ
リクファンエンス(Bacillusamyloliq
uefaciens)のニュートラルタンパク質のノブ
ナル配列が枯草菌(B、 s’ubtilis)細胞か
らのhGHの製造に用いられた。
しかしなめtら、これらの公知方法は、一方においては
ヒトに対して病原性のある大腸菌を用いることに由来す
る欠点があり、他方においては枯草菌によるタンパク質
の部分的処理によりアミノ末端に1ないし4個の残留ア
ミノ酸を含有するhGHに由来する欠点がある。
ヒトに対して病原性のある大腸菌を用いることに由来す
る欠点があり、他方においては枯草菌によるタンパク質
の部分的処理によりアミノ末端に1ないし4個の残留ア
ミノ酸を含有するhGHに由来する欠点がある。
メチオニンをインビトロで除去する第2の方法は、合成
生成物が天然形タンパク質と酵素処理で除去できる長い
か或いは短いペプチド配列で構成されるようにひとつの
タンパク質にコード付けする遺伝子の変成から成るもの
である。一般にこの方法は、もし加水分解に用いられる
酵素によって攻撃にさらされる残留アミノ酸が問題のタ
ンパク質中に存在すると、多かれ少なかれこのタンパク
質自体が劣化せしめられ、その結果収率が減することと
なる。
生成物が天然形タンパク質と酵素処理で除去できる長い
か或いは短いペプチド配列で構成されるようにひとつの
タンパク質にコード付けする遺伝子の変成から成るもの
である。一般にこの方法は、もし加水分解に用いられる
酵素によって攻撃にさらされる残留アミノ酸が問題のタ
ンパク質中に存在すると、多かれ少なかれこのタンパク
質自体が劣化せしめられ、その結果収率が減することと
なる。
従って、目的の生成物とアミノ末端ペプチドとの間の接
続点において排他的に融合タンパク質を加水分解するよ
うにする特定の処理を提供することが本発明の基本的要
求である。
続点において排他的に融合タンパク質を加水分解するよ
うにする特定の処理を提供することが本発明の基本的要
求である。
因子Xaすなわちクローニングの複合過程に含有される
血液セリンプロテアーゼはグリシンーアルジニン(Gl
y −Arg)配列を認識し、ことにイソロイノン−グ
ルタミン酸−グリンンーアルジニン(lie−Glu
−Gly −Arg)テトラペプチドに非常に大きな親
和性を有する。
血液セリンプロテアーゼはグリシンーアルジニン(Gl
y −Arg)配列を認識し、ことにイソロイノン−グ
ルタミン酸−グリンンーアルジニン(lie−Glu
−Gly −Arg)テトラペプチドに非常に大きな親
和性を有する。
近年になってナガイとその共同研究者[Nagai。
K、 et al、(1985)、 Proc、 Na
tl、 Acad、 Sci、 USA82、7252
]は、アミノ末端部が、微生物プロテアーゼの作用から
目的タンパク質を防護するように位置している融合生成
物が、正しく、ことにl1eGlu−Gly−^rg配
列が接続点に位置する場合に正しく処理されたことを示
した。
tl、 Acad、 Sci、 USA82、7252
]は、アミノ末端部が、微生物プロテアーゼの作用から
目的タンパク質を防護するように位置している融合生成
物が、正しく、ことにl1eGlu−Gly−^rg配
列が接続点に位置する場合に正しく処理されたことを示
した。
融合タンパク質の正しい処理、従って天然形のhGHの
産生を可能にする一方、これら従来法は、このようにし
て得られた生成物の精製が困難であるという欠点を有す
る。
産生を可能にする一方、これら従来法は、このようにし
て得られた生成物の精製が困難であるという欠点を有す
る。
事実、hGHの前駆体は組換え細胞によって生じたタン
パク質のプールから、及び酵素による加水分解の後に得
られたホルモンからのいずれからも分離が困難である。
パク質のプールから、及び酵素による加水分解の後に得
られたホルモンからのいずれからも分離が困難である。
従って本発明の目的は、精製された形で天然形hGHを
製造する改良された方法を提供するにある。
製造する改良された方法を提供するにある。
本発明のもうひとつの目的はこのホルモンをヒトの治療
に用いることにある。
に用いることにある。
本発明の他の目的は、このようにして得られたホルモン
の治療上の有効量を含有する薬剤を提供するにある。
の治療上の有効量を含有する薬剤を提供するにある。
本発明のさらに他の目的は、以下の明細書本文及び実施
例の記載を読むことにより明瞭となろう。
例の記載を読むことにより明瞭となろう。
本発明は、hGHのN末端に融合したテトラペプチドl
ie−Glu−Gly−Argのアミノ末端群に、成る
長さ成るアミノ酸配列のペプチドを存在させることによ
り、このホルモンを天然形でしかも高純度で得るように
できるという知見に基くものである。
ie−Glu−Gly−Argのアミノ末端群に、成る
長さ成るアミノ酸配列のペプチドを存在させることによ
り、このホルモンを天然形でしかも高純度で得るように
できるという知見に基くものである。
事実、位置lにメチオニンをまだ残し、かつ少なくとも
ひとつの酸すなわちアミノ酸(グルタミン酸、アスパラ
ギン酸)、ひとつの塩基性アミノ酸(アルギニン、リシ
ン)又はヒスチジンを含有するこのペプチドは、公知の
クロマトグラフィーですべてのタンパク質から及び酸素
による加水分解生成物から分離容易な特性を有するha
n而駆面を与えるのである。
ひとつの酸すなわちアミノ酸(グルタミン酸、アスパラ
ギン酸)、ひとつの塩基性アミノ酸(アルギニン、リシ
ン)又はヒスチジンを含有するこのペプチドは、公知の
クロマトグラフィーですべてのタンパク質から及び酸素
による加水分解生成物から分離容易な特性を有するha
n而駆面を与えるのである。
さらに、このペプチド鎖は因子Xaによる切断の特性に
影響を与えず、このようにして融合タンパク質の正しい
処理及び正しいアミノ酸配列を有するホルモンの産生を
可能とすることがわかった。
影響を与えず、このようにして融合タンパク質の正しい
処理及び正しいアミノ酸配列を有するホルモンの産生を
可能とすることがわかった。
ことに、本発明方法は以下の過程を包含するものである
。
。
(a)ハイブリッドプラスミドにより形質転換された枯
草菌(B、 5ubtilis)の培養による因子Xa
によって認識されたテトラペプチドの上流側に位置する
特定の長さ及びアミノ酸配列のペプチドを含有するヒト
生長ホルモン前駆体の製造、(b)このように形質転換
した細胞のりシンによる溶解及び前駆体を含有する上澄
み液の分離、(c)イオン交換樹脂又は1MAc上のク
ロマトグラフィーによる前駆体の精製、及びイオン強度
勾配による前駆体の溶出、 (d)因子Xaでこのように精製した前駆体の加水分解
、及び (e)イオン交換クロマトグラフィー又は1ilAcに
より加水分解混合物からの高純度の天然形ホルモンの分
離。
草菌(B、 5ubtilis)の培養による因子Xa
によって認識されたテトラペプチドの上流側に位置する
特定の長さ及びアミノ酸配列のペプチドを含有するヒト
生長ホルモン前駆体の製造、(b)このように形質転換
した細胞のりシンによる溶解及び前駆体を含有する上澄
み液の分離、(c)イオン交換樹脂又は1MAc上のク
ロマトグラフィーによる前駆体の精製、及びイオン強度
勾配による前駆体の溶出、 (d)因子Xaでこのように精製した前駆体の加水分解
、及び (e)イオン交換クロマトグラフィー又は1ilAcに
より加水分解混合物からの高純度の天然形ホルモンの分
離。
本発明方法によれば、ハイブリッドプラスミドはhGH
而駆面をコート付けする合成遺伝子を発現ベクター内に
適当に挿入することにより過程(a)で形成された。
而駆面をコート付けする合成遺伝子を発現ベクター内に
適当に挿入することにより過程(a)で形成された。
この目的に好適なベクターは当業界で既知のものから選
ぶことができる。
ぶことができる。
使用して好適だったものは、ベクターpsM214AT
CC67320であった。このベクターは枯草菌内で非
常に安定しており異種タンパク質の効率よい発現を誘起
することができることを特徴とする。
CC67320であった。このベクターは枯草菌内で非
常に安定しており異種タンパク質の効率よい発現を誘起
することができることを特徴とする。
イタリー国特許出願第19551 A/87号に記載さ
れ請求されているこのベクターは、カナマイシン耐性、
アンピシリン耐性及びクロラムフェニコール耐性をそれ
ぞれコード付けするKm、 Bla及びCat遺伝子を
枯草菌及び大腸菌内で複製することを可能とするpUB
llo及びpBR322の複製開始点及びBla遺伝子
及びCat遺伝子の配列を含有するジシストロニックメ
ッセンノヤーR)IA(mRNA)の転写を目的とする
強力な合成プロモーター、及び最後にCat遺伝子の下
流側に位置する大腸菌のラムダファーノのT。ターミネ
ータ−を包含する。
れ請求されているこのベクターは、カナマイシン耐性、
アンピシリン耐性及びクロラムフェニコール耐性をそれ
ぞれコード付けするKm、 Bla及びCat遺伝子を
枯草菌及び大腸菌内で複製することを可能とするpUB
llo及びpBR322の複製開始点及びBla遺伝子
及びCat遺伝子の配列を含有するジシストロニックメ
ッセンノヤーR)IA(mRNA)の転写を目的とする
強力な合成プロモーター、及び最後にCat遺伝子の下
流側に位置する大腸菌のラムダファーノのT。ターミネ
ータ−を包含する。
このベクターから、EcoRI制限酵素及びHindI
II制限酵素を伴うBla遺伝子を除去し、次いでこの
部位に異種遺伝子を導入することにより、この異種遺伝
子の転写がこの単独のプロモーターの存在により保証さ
れるハイブリッドプラスミドの作製をクロラムフェニコ
ールでの選択と共に可能となるのである。
II制限酵素を伴うBla遺伝子を除去し、次いでこの
部位に異種遺伝子を導入することにより、この異種遺伝
子の転写がこの単独のプロモーターの存在により保証さ
れるハイブリッドプラスミドの作製をクロラムフェニコ
ールでの選択と共に可能となるのである。
従って本発明によれば、異種遺伝子はヒト生長ホルモン
の前駆体をコード付けする異種遺伝子である。
の前駆体をコード付けする異種遺伝子である。
殊にこの遺伝子は、hG)lのアミノ酸17−191を
コード付けする530塩基対DNAフラグメントと、以
下の配列を有するポリペプチドをコード付けする合成オ
リゴヌクレオチドとの融合により得られたちのである。
コード付けする530塩基対DNAフラグメントと、以
下の配列を有するポリペプチドをコード付けする合成オ
リゴヌクレオチドとの融合により得られたちのである。
(aa) −11e−Glu−Gly−Arg−hGt
l、16ここで(aa)は位置1のアミノ酸が常にメチ
オニンであり、少なくともひとつの塩基性アミノ酸残分
(アルギニン又はリシン)(^rgs Lys)、又は
少なくとらひとつの酸性アミノ酸残分(グルタミン酸又
はアスパラギン酸XGlu、 Asp)又はヒスチジン
(His)を包含するアミノ酸配列であり、nは2ない
し10の値である。
l、16ここで(aa)は位置1のアミノ酸が常にメチ
オニンであり、少なくともひとつの塩基性アミノ酸残分
(アルギニン又はリシン)(^rgs Lys)、又は
少なくとらひとつの酸性アミノ酸残分(グルタミン酸又
はアスパラギン酸XGlu、 Asp)又はヒスチジン
(His)を包含するアミノ酸配列であり、nは2ない
し10の値である。
11e−Glu−Gly−Argは因子Xaで認識され
るテトラペプチドであり、hGH,□8はヒト生長ホル
モンの16個のアミノ酸のアミノ末端配列である。従っ
て、また本発明の非制限的実施例を与えるために、合成
オリゴヌクレオチドを、a−a配列が配列Met −G
lu −Glu −Leu −Met−であるポリペプ
チドをコード付けするものとして合成した。
るテトラペプチドであり、hGH,□8はヒト生長ホル
モンの16個のアミノ酸のアミノ末端配列である。従っ
て、また本発明の非制限的実施例を与えるために、合成
オリゴヌクレオチドを、a−a配列が配列Met −G
lu −Glu −Leu −Met−であるポリペプ
チドをコード付けするものとして合成した。
本発明によれば、 530bpDNAフラグメントが、
プラスミドpsM209をFnuDII制限酵素及び旧
ndlI[制限酵素で消化し、この消化混合物をポリア
クリルアミドゲル上での電気泳動により分離することに
より得られた。
プラスミドpsM209をFnuDII制限酵素及び旧
ndlI[制限酵素で消化し、この消化混合物をポリア
クリルアミドゲル上での電気泳動により分離することに
より得られた。
上述のプラスミドpsM209は、市販のプラスミドp
Uc9(ベーリンガー)から、当業界で知られている従
来方法により得られたものである。
Uc9(ベーリンガー)から、当業界で知られている従
来方法により得られたものである。
殊に、hGHのcDNAがプラスミドpUC9中でサブ
クローニングされて中間プラスミドpWH^41が得ら
れ、次いでこの中間プラスミドが従来通り処理されてh
GII遺伝子の下流側に位置するSma I制限部位を
除去され、Hindl11部位を置換された[イタリー
国特許出願第20345 A/86号(特願昭62−1
09916号)のプラスミドpsM209の作製に関す
る記載を参照されたい]。
クローニングされて中間プラスミドpWH^41が得ら
れ、次いでこの中間プラスミドが従来通り処理されてh
GII遺伝子の下流側に位置するSma I制限部位を
除去され、Hindl11部位を置換された[イタリー
国特許出願第20345 A/86号(特願昭62−1
09916号)のプラスミドpsM209の作製に関す
る記載を参照されたい]。
次いでフラグメントは旧恩てホスホリル化した合成オリ
ゴヌクレオチド及びBla遺伝子を除去するようEco
RI酵素及び旧ndlI[酵素で消化したベクターps
M214でリガーゼ処理した。
ゴヌクレオチド及びBla遺伝子を除去するようEco
RI酵素及び旧ndlI[酵素で消化したベクターps
M214でリガーゼ処理した。
このリゲーション反応は、一般に知られている技術によ
ってT4 DN^リガーゼ酵素の存在の下に行われた。
ってT4 DN^リガーゼ酵素の存在の下に行われた。
この酵素反応の終りに当って、全混合物がCaCl2.
での処理によってコンピテントとした大腸菌を形質転換
するのに用いられた[マンデル・エム(Mandel
M、)及びヒガ(Higa)(1970) : J、
Mo1Bio1.53.154]。
での処理によってコンピテントとした大腸菌を形質転換
するのに用いられた[マンデル・エム(Mandel
M、)及びヒガ(Higa)(1970) : J、
Mo1Bio1.53.154]。
次いで形質転換細胞がクロラムフェニコールを添加して
選択性とした適当な培養培地上で30℃ないし40℃の
温度において選別された。正しく挿入された合成遺伝子
を含有するハイブリッドプラスミドをこのようにして単
離したのである。
選択性とした適当な培養培地上で30℃ないし40℃の
温度において選別された。正しく挿入された合成遺伝子
を含有するハイブリッドプラスミドをこのようにして単
離したのである。
次いでプラスミド(pSM2)4)がコンタンテ(Co
ntente)及びデュブノ−(Dubnau)法[M
ol。
ntente)及びデュブノ−(Dubnau)法[M
ol。
Gen、 Genet、 167、258 (1979
)コによってコンピテントとした枯草菌細胞を形質転換
するのに用いられた。
)コによってコンピテントとした枯草菌細胞を形質転換
するのに用いられた。
この目的のためには、特性(hpr−1spr−)を有
する枯草菌の各種菌株を用いることができる。この場合
にはB、 5ubtilis 5M511g (rec
+、hpv−1spr−1leuSpyrD1)が好適
に用いられた。
する枯草菌の各種菌株を用いることができる。この場合
にはB、 5ubtilis 5M511g (rec
+、hpv−1spr−1leuSpyrD1)が好適
に用いられた。
次いで形質転換細胞を、vY液体培地[ビール・インフ
ユージジン・ブロス(DIFCO)、イースト・エクス
トラクトCDIFCO)]にクロラムフェニコールを添
加したものの中で37℃又は大略37℃の温度で成育さ
せた。
ユージジン・ブロス(DIFCO)、イースト・エクス
トラクトCDIFCO)]にクロラムフェニコールを添
加したものの中で37℃又は大略37℃の温度で成育さ
せた。
次いでこれらの形質転換細胞を遠沈によって上澄み液か
ら分離し、一般に知られている技術のひとつによりリシ
ン溶解し、最後に溶菌物を分析してhGI(前駆体の存
在を決定した。実際には溶菌物は、ポリアクリルアミド
ゲル上にのせ、電気泳動後タンパク質をクマシーブルー
染色[ゲル・エレクトロホレシス・オブ・プロテインス
:ア・プラクティカル6アプローチ(Gel Elec
trophoresisof Proteins:^P
ractical Approach:l、ビー・デイ
−・ヘイムズ(B、D、Hames)及びデイ−・リッ
クウッド(D、Rickvood)編、アイアールエル
・プレス・リミテッド(IRL Press Lim1
ted)刊コ又はインミュープロット[トウビンほか(
Tovbin et al、)(1979)。
ら分離し、一般に知られている技術のひとつによりリシ
ン溶解し、最後に溶菌物を分析してhGI(前駆体の存
在を決定した。実際には溶菌物は、ポリアクリルアミド
ゲル上にのせ、電気泳動後タンパク質をクマシーブルー
染色[ゲル・エレクトロホレシス・オブ・プロテインス
:ア・プラクティカル6アプローチ(Gel Elec
trophoresisof Proteins:^P
ractical Approach:l、ビー・デイ
−・ヘイムズ(B、D、Hames)及びデイ−・リッ
クウッド(D、Rickvood)編、アイアールエル
・プレス・リミテッド(IRL Press Lim1
ted)刊コ又はインミュープロット[トウビンほか(
Tovbin et al、)(1979)。
P、N、^、S、、 vol、76 n、 9.435
0−43541のいずれかによって染色することによっ
て可視化する。
0−43541のいずれかによって染色することによっ
て可視化する。
このようにして得られた結果は、標準天然形hGII(
Calbiochem)よりも若干ゆっくり泳動し、抗
hG11抗体と反応する大略23000ダルトンのタン
パク質が細胞リシン溶解の上澄み液に存在することを示
した。
Calbiochem)よりも若干ゆっくり泳動し、抗
hG11抗体と反応する大略23000ダルトンのタン
パク質が細胞リシン溶解の上澄み液に存在することを示
した。
本発明によれば、haHd駆体は溶菌物の上澄み液から
精製された。
精製された。
既知のイオン交換又はIMACクロマトグラフィーがこ
の目的のために用いられた[ベレウ・エムほか(Bel
ew M、 et al、)(1987) : Ana
lytical Bi。
の目的のために用いられた[ベレウ・エムほか(Bel
ew M、 et al、)(1987) : Ana
lytical Bi。
chemistry 164.457コ。アニオン樹脂
又はカチオン樹脂を用いるイオン交換法は、ペプチド鎖
中に存在する酸性及び/又は塩基性アミノ酸の正又は負
の電荷の存在を利用してhG)l前駆体をカラムに結合
せしめる技術であり、IMAC法は、ヒスチジン及びそ
の他のアミノ酸の金属イオンに対する親和性を利用する
技術である。実際には、細胞をリシン溶解し溶菌物を遠
心分離した後、上澄み液はこの前駆体と強く結合するD
EAEセルロース又はセファデックス(Sephade
x)から選んだ樹脂を充填したクロマトグラフカラムに
通した。
又はカチオン樹脂を用いるイオン交換法は、ペプチド鎖
中に存在する酸性及び/又は塩基性アミノ酸の正又は負
の電荷の存在を利用してhG)l前駆体をカラムに結合
せしめる技術であり、IMAC法は、ヒスチジン及びそ
の他のアミノ酸の金属イオンに対する親和性を利用する
技術である。実際には、細胞をリシン溶解し溶菌物を遠
心分離した後、上澄み液はこの前駆体と強く結合するD
EAEセルロース又はセファデックス(Sephade
x)から選んだ樹脂を充填したクロマトグラフカラムに
通した。
次いでタンパク質は、イオン化傾向を有する溶離液を用
いてカラムから溶出せしめた。
いてカラムから溶出せしめた。
NaC06度0.1ないし0.5Mの緩衝液が好適に用
いられた。
いられた。
このようにしてカラムから純度大略60%の前駆体が9
0%以上の収率で取り出すことができた。
0%以上の収率で取り出すことができた。
本発明方法の1実施例によれば、タンパク質懸濁液は6
0%まで飽和させた硫酸アンモニウムを添加することに
よって濃縮し、hGH前駆体を精製するに先立ってタン
パク質を沈殿仕しめる。次いでこのタンパク質は緩衝液
中で可溶性とし、イオン交換クロマトグラフィー又はI
MACにより精製される。
0%まで飽和させた硫酸アンモニウムを添加することに
よって濃縮し、hGH前駆体を精製するに先立ってタン
パク質を沈殿仕しめる。次いでこのタンパク質は緩衝液
中で可溶性とし、イオン交換クロマトグラフィー又はI
MACにより精製される。
本発明によれば、このようにして精製された前駆体は再
び緩衝液中に@濁せしめられ、因子Xaを用い因子Xa
/hGH前駆体の分子比1/2ないし1 /lo。
び緩衝液中に@濁せしめられ、因子Xaを用い因子Xa
/hGH前駆体の分子比1/2ないし1 /lo。
で加水分解せしめられた。
この酵素反応は室温(20−25℃)において、反応が
完結するか又は殆ど完結するに必要な時間待われた。
完結するか又は殆ど完結するに必要な時間待われた。
次いで反応混合物は次のクロマトグラフィーのために好
適な緩衝液に対して透析され、成熟ホルモン、加水分解
されなかった前駆体及び残留汚染分としてのタンパク質
を含有する混合物が再びイオン交換クロマトグラフィー
又はIMACによって精製された。
適な緩衝液に対して透析され、成熟ホルモン、加水分解
されなかった前駆体及び残留汚染分としてのタンパク質
を含有する混合物が再びイオン交換クロマトグラフィー
又はIMACによって精製された。
残留タンパク質及び前駆体はこのようにしてカラムに吸
着され、他方結合されなかった成熟ホルモンは90%以
上の収率でカラムから溶出された。
着され、他方結合されなかった成熟ホルモンは90%以
上の収率でカラムから溶出された。
サンガー・エフほか(Sanger、 F、 et a
l、)の技法(Proc、 Natl、^cad、 S
ci、 IJSA 74.5463(1977)]によ
って行われたアミノ酸配列の分析は、このようにして精
製したホルモンが正しい配列を有することを示した。
l、)の技法(Proc、 Natl、^cad、 S
ci、 IJSA 74.5463(1977)]によ
って行われたアミノ酸配列の分析は、このようにして精
製したホルモンが正しい配列を有することを示した。
さらに、電気泳動分析の結果、このホルモンは100%
又は大略100%の純度を示した。
又は大略100%の純度を示した。
以下に示す実施例は本発明を限定するものではなく単に
例示するためのものである。
例示するためのものである。
例1
作製
アミノ酸17からアミノ酸191までのヒト生長ホルモ
ン(hGH)をコード付けするDNA配列が、イタリー
国特許出願第20345 A/86号(特願昭6L−1
099916号)に記載されたプラスミドpsM209
から単離された。この単離はアミノ酸16及び17の間
のDNAレベルで切断するFnuDI[制限酵素及び停
止コドンの下流で切断する旧ndlII制限酵素でこの
プラスミドを処理することによる。
ン(hGH)をコード付けするDNA配列が、イタリー
国特許出願第20345 A/86号(特願昭6L−1
099916号)に記載されたプラスミドpsM209
から単離された。この単離はアミノ酸16及び17の間
のDNAレベルで切断するFnuDI[制限酵素及び停
止コドンの下流で切断する旧ndlII制限酵素でこの
プラスミドを処理することによる。
この目的のため、psM20950μ9を、6 mM
Tris11CQpH7,4,6mM NaCl2.6
mM MgCQt16mMメルカプトエタノールを含有
する反応混合物200μρ中においてFnuD U (
Biolabs)50ユニツト(U)で37℃において
1時間切断した。
Tris11CQpH7,4,6mM NaCl2.6
mM MgCQt16mMメルカプトエタノールを含有
する反応混合物200μρ中においてFnuD U (
Biolabs)50ユニツト(U)で37℃において
1時間切断した。
この酵素を70’Cで10分間脱活性化処理した後、溶
液を50+nM Tris−HCQpH8,o、10m
M MgCQl、50mMNaCQの濃度にもたらし、
Hindln (Boehringer)500の存在
下で37℃、1時間培養した。
液を50+nM Tris−HCQpH8,o、10m
M MgCQl、50mMNaCQの濃度にもたらし、
Hindln (Boehringer)500の存在
下で37℃、1時間培養した。
この酵素を70°Cにおいて10分間脱活性化処理した
後、消化混合物を6%アクリルアミドゲルの上に乗せ、
130ボルトの電圧を3時間印加してDNAを分離した
。次いで、アミノ酸17からアミノ酸191までhGH
をコード付けする配列を含有する大略530塩基対(b
p)のバンドをマクサム(Maxam)及びギルバート
(Gilbert)によって記載されたように[メソッ
ズ・イン・エンザイモロノイー(Methods in
Enzymology) vol、 65.499−5
60(1980)]として溶出せしめた。
後、消化混合物を6%アクリルアミドゲルの上に乗せ、
130ボルトの電圧を3時間印加してDNAを分離した
。次いで、アミノ酸17からアミノ酸191までhGH
をコード付けする配列を含有する大略530塩基対(b
p)のバンドをマクサム(Maxam)及びギルバート
(Gilbert)によって記載されたように[メソッ
ズ・イン・エンザイモロノイー(Methods in
Enzymology) vol、 65.499−5
60(1980)]として溶出せしめた。
次いで下記の配列を有するDNAのフラグメントがンス
テム・ワン・DNA・ノンセサイザー(SysteII
lOne DNA SynthesiserXBeck
man)によって合成された。
テム・ワン・DNA・ノンセサイザー(SysteII
lOne DNA SynthesiserXBeck
man)によって合成された。
+l +2 +3 14 +5 +511et
G l uG 1uLeuilet l leG l
uG lyArgPheProThr l 1ePro
LeuAATTCTTATGG^^GAACTTATG
ATCGAGGGTAGGAAGGGTTGGTAAG
GGAAT(iAATACCTTCTTGAATACT
AGCTCCCATCCTTCCCAACCATTCC
CTTA+7 +8 +9 +to÷I++12+
13+14+15+16Ser^rgLeuPhaAs
pAsn^lalletLeuArgAGGTCCGA
AAAACTGTTCCGAATGCAGGGTCCA
GGCTTTTTGACAAGGCTTACCTCCに
のDNAフラグメントはhGHの最初の6個のアミノ酸
及びアミノ酸Met−Glu−Glu−Leu−Met
lle Glu Gly−^rgをコード付けする
。後音はエンコードしたペプチドフラグメントのアミノ
末端に位置する。次いでこのDNAフラグメントlμ9
を、66mM Tris−HCl2 pH7,5、l
mM ATP、 I mMスペルミノン、10mM
MgCQl、15mMジチオスレイトール(DTT)、
ボウバイン・セラム・アルブミン0.2J11?/xQ
及びT4キナーゼ(Biolabs) 2 Llを含有
する緩衝液lOμQ中で37℃、1時間加リン酸処理し
た。次いで酵素を65℃で10分間脱活性化した。
G l uG 1uLeuilet l leG l
uG lyArgPheProThr l 1ePro
LeuAATTCTTATGG^^GAACTTATG
ATCGAGGGTAGGAAGGGTTGGTAAG
GGAAT(iAATACCTTCTTGAATACT
AGCTCCCATCCTTCCCAACCATTCC
CTTA+7 +8 +9 +to÷I++12+
13+14+15+16Ser^rgLeuPhaAs
pAsn^lalletLeuArgAGGTCCGA
AAAACTGTTCCGAATGCAGGGTCCA
GGCTTTTTGACAAGGCTTACCTCCに
のDNAフラグメントはhGHの最初の6個のアミノ酸
及びアミノ酸Met−Glu−Glu−Leu−Met
lle Glu Gly−^rgをコード付けする
。後音はエンコードしたペプチドフラグメントのアミノ
末端に位置する。次いでこのDNAフラグメントlμ9
を、66mM Tris−HCl2 pH7,5、l
mM ATP、 I mMスペルミノン、10mM
MgCQl、15mMジチオスレイトール(DTT)、
ボウバイン・セラム・アルブミン0.2J11?/xQ
及びT4キナーゼ(Biolabs) 2 Llを含有
する緩衝液lOμQ中で37℃、1時間加リン酸処理し
た。次いで酵素を65℃で10分間脱活性化した。
B )psM274の作製(第1図)
プラスミドpsM214 ATCC673202u9を
、50mMTris−ticρpl(7,5,6mM
MgCQt、50mM NaCQを含有する緩衝液20
μQ中において、EcoRI及びHindIIIそれぞ
れ2Uと37℃で1時間消化させた。次いで酵素はこの
消化混合物を65℃に10分間保つことによって脱活性
化させた後、0.8%アーガロースゲル上で100ボル
トを2時間印加した[マニアナイス(Maniatis
)ほか(1982)、モレキュラー・クローニング・ア
・ラボラトリ−・マニュアル(Molecularcl
oning : A Laboratory Manu
al)、コールドΦスプリングHハーバ−(Cold
Spring Harbor)]。
、50mMTris−ticρpl(7,5,6mM
MgCQt、50mM NaCQを含有する緩衝液20
μQ中において、EcoRI及びHindIIIそれぞ
れ2Uと37℃で1時間消化させた。次いで酵素はこの
消化混合物を65℃に10分間保つことによって脱活性
化させた後、0.8%アーガロースゲル上で100ボル
トを2時間印加した[マニアナイス(Maniatis
)ほか(1982)、モレキュラー・クローニング・ア
・ラボラトリ−・マニュアル(Molecularcl
oning : A Laboratory Manu
al)、コールドΦスプリングHハーバ−(Cold
Spring Harbor)]。
次いで大略6500塩基対(bp)の最大バンドを既知
技術[上述のマニアナイス(Maniatis)ほか(
+9112)]によって溶出せしめた。
技術[上述のマニアナイス(Maniatis)ほか(
+9112)]によって溶出せしめた。
6500bpのフラグメント1.5μ9、psM209
の530bpフラグメント400n9、及び前記A)に
おいて述べたように加リン酸処理した合成フラグメント
50n9を、66mM Tris−HC(! pH7,
6,1mil ATP、 io+nM MgC+!t、
10mM DTTを含有する緩衝液150μσ中に混合
し、T4DNAリガーゼ2Uの存在の下に14℃で18
時間リガーゼ処理した。このリガーゼ処理混合物5μQ
を、50mM CaCLとの処理によりコンピテントと
した市販の大腸菌E、 coli JMIOI(BRL
)細胞200μQを形質転換するのに用いた[マンデル
・エム(Mandel、 M、)及びヒガ(I(iga
)(1970)J、 Mo1. Biol、 53.1
54]。
の530bpフラグメント400n9、及び前記A)に
おいて述べたように加リン酸処理した合成フラグメント
50n9を、66mM Tris−HC(! pH7,
6,1mil ATP、 io+nM MgC+!t、
10mM DTTを含有する緩衝液150μσ中に混合
し、T4DNAリガーゼ2Uの存在の下に14℃で18
時間リガーゼ処理した。このリガーゼ処理混合物5μQ
を、50mM CaCLとの処理によりコンピテントと
した市販の大腸菌E、 coli JMIOI(BRL
)細胞200μQを形質転換するのに用いた[マンデル
・エム(Mandel、 M、)及びヒガ(I(iga
)(1970)J、 Mo1. Biol、 53.1
54]。
次いでこの形質転換物は、細胞をクロラムフェニコール
(CM)20μ9を含有するし寒天培地プレート[10
9/Qトリプトン(DIFCO)、5g/Qバクト・イ
ースト・エクストラクト(DIFCO)及び109#!
NaCQ]上にひろげ37℃で12時間保持すること
で選んだ。
(CM)20μ9を含有するし寒天培地プレート[10
9/Qトリプトン(DIFCO)、5g/Qバクト・イ
ースト・エクストラクト(DIFCO)及び109#!
NaCQ]上にひろげ37℃で12時間保持すること
で選んだ。
Cm耐性のコロニーから、所要のプラスミドpSM27
4(第1図)を担持するものを単離した。このプラスミ
ドのヌクレオチドの配列はサンガー・エフほか(San
ger F、 et al、)法[Proc、 Nat
l、^cadSci、 03人74.5463(197
7)]iこよってチエツクされた。
4(第1図)を担持するものを単離した。このプラスミ
ドのヌクレオチドの配列はサンガー・エフほか(San
ger F、 et al、)法[Proc、 Nat
l、^cadSci、 03人74.5463(197
7)]iこよってチエツクされた。
例2
コンタンテ(Contente)及びデュブノー(Du
br+au)(1979)(Mo1. Gen、 Ge
net 167.251−259)によって記載された
ようにしてコンピテントとした5M5118B、5ub
tilis細胞(rec+、npr−1spr−1le
u、 pyrDl)をプラスミドPSM274で形質転
換させ、この形質転換体をクロラムフェニコール5μg
/3!12を含有スるTBAB寒天プレート(トリブト
ーゼ血液寒天ベース)上で選んだ。
br+au)(1979)(Mo1. Gen、 Ge
net 167.251−259)によって記載された
ようにしてコンピテントとした5M5118B、5ub
tilis細胞(rec+、npr−1spr−1le
u、 pyrDl)をプラスミドPSM274で形質転
換させ、この形質転換体をクロラムフェニコール5μg
/3!12を含有スるTBAB寒天プレート(トリブト
ーゼ血液寒天ベース)上で選んだ。
分析した12個の形質転換体中わずか7個がプラスミド
pSM274の存在に対してプラスであった。
pSM274の存在に対してプラスであった。
SYS118(pSM274) B、 5ubti!i
s菌株中の合成hGH遺伝子の発現を確認するために、
これをクロラムフェニコール5μ9/yQ含有するvY
培地[ビール・インフユーノヨン・ブロス(DIFCO
)259/Q、イースト・エクストラクト(DIFCO
) 5 g/ Qコニ0峠中で培養した。次いでこの培
養基!峠を遠沈(12000rHX 15分間)して細
胞を集め、これを30mM Tris−i1c12t)
H7,5,50mM NaC(を含有する緩衝液5厘Q
で2回洗浄し、それからETi衝液ζ20%サクローズ
、50mMTris−HCi! pH7,6,50mM
EDTA)looμQ中に再懸濁せしめた。次いでリ
ゾツィーム5y+g/mQを含有する溶液20μQをこ
のようにして得た@濁液に添加し、37℃で15分間保
持した。次いで125mM Tris−HCQpH6,
8,3%ドデンルスルホン酸ナトリウム(SDS)、3
%ベーターメルカプトエタノール及び20%グリセロー
ルを含有する緩衝液130μgをこの混合物に添加し、
このようにして得た混合物を95℃で3分間保持した。
s菌株中の合成hGH遺伝子の発現を確認するために、
これをクロラムフェニコール5μ9/yQ含有するvY
培地[ビール・インフユーノヨン・ブロス(DIFCO
)259/Q、イースト・エクストラクト(DIFCO
) 5 g/ Qコニ0峠中で培養した。次いでこの培
養基!峠を遠沈(12000rHX 15分間)して細
胞を集め、これを30mM Tris−i1c12t)
H7,5,50mM NaC(を含有する緩衝液5厘Q
で2回洗浄し、それからETi衝液ζ20%サクローズ
、50mMTris−HCi! pH7,6,50mM
EDTA)looμQ中に再懸濁せしめた。次いでリ
ゾツィーム5y+g/mQを含有する溶液20μQをこ
のようにして得た@濁液に添加し、37℃で15分間保
持した。次いで125mM Tris−HCQpH6,
8,3%ドデンルスルホン酸ナトリウム(SDS)、3
%ベーターメルカプトエタノール及び20%グリセロー
ルを含有する緩衝液130μgをこの混合物に添加し、
このようにして得た混合物を95℃で3分間保持した。
溶菌物を12.5%5DS−アクリルアミドゲルに加え
[ラエムリ(Laemmli);(1970)Natu
re。
[ラエムリ(Laemmli);(1970)Natu
re。
277:680]、2Sffi^で3時間電気泳動させ
た後、タンパク質をクマシーブルー染色[ゲル・エレク
トロホレミス・オブ・プロテインズ:ア・プラクティカ
ル・アプローチ(Gel Electrophores
is ofProteins : A Practic
al Approach)、ビー6デイ・ヘイムズ(B
、 D、 1anes)及びデイ・リックウッド(D、
Rickvood)!、アイアールエル・プレス・リ
ミテッド(IRL Press Lim1ted)刊]
又はニトロセルロース・フィルター[シュライア−(S
hleiher)及びノニル(Shull)45μyt
孔径トウビン(Towbin)]への移転かによって表
示する。
た後、タンパク質をクマシーブルー染色[ゲル・エレク
トロホレミス・オブ・プロテインズ:ア・プラクティカ
ル・アプローチ(Gel Electrophores
is ofProteins : A Practic
al Approach)、ビー6デイ・ヘイムズ(B
、 D、 1anes)及びデイ・リックウッド(D、
Rickvood)!、アイアールエル・プレス・リ
ミテッド(IRL Press Lim1ted)刊]
又はニトロセルロース・フィルター[シュライア−(S
hleiher)及びノニル(Shull)45μyt
孔径トウビン(Towbin)]への移転かによって表
示する。
ウサギ抗hGH抗体(Miles)及びヤギ耐つサギI
gG抗体をバーオキンダーゼと共に用いるトウビンはか
(P、N、A、S、 1979. vol、 76、n
、 9.43504354)によって記載されたような
フィルターの処理によってhG)lの存在が明らかにさ
れた。
gG抗体をバーオキンダーゼと共に用いるトウビンはか
(P、N、A、S、 1979. vol、 76、n
、 9.43504354)によって記載されたような
フィルターの処理によってhG)lの存在が明らかにさ
れた。
シマシーブルー染色後、大略23000ダルトンの見掛
けの分子量を有するタンパク質があられれ、これが標準
の天然形hGH(Calbiochem)よりもゆっく
りと泳動する。これは大略62%の全可溶性タンパク質
(第2図)をあられす。
けの分子量を有するタンパク質があられれ、これが標準
の天然形hGH(Calbiochem)よりもゆっく
りと泳動する。これは大略62%の全可溶性タンパク質
(第2図)をあられす。
このタンパク質は免疫分析(第3図)で示すように抗h
GH抗体と反応する。生産されたhGH前駆体の量は、
この菌株が培養物1リツトル当たりウェットセルペース
ト大略4gを含むような実験室条件下で培養された場合
18111g/リットルと推定された。
GH抗体と反応する。生産されたhGH前駆体の量は、
この菌株が培養物1リツトル当たりウェットセルペース
ト大略4gを含むような実験室条件下で培養された場合
18111g/リットルと推定された。
例3
A)成熟hGHの精製
グリセリン処理しかつ一80℃で保存したSYSllg
(psM274)B、 5ubtilisの培養物を、
クロラムフェニコール5μ9/廣σを含有するし寒天プ
レート上で各別のコロニーを形成せしめるように使用し
た。
(psM274)B、 5ubtilisの培養物を、
クロラムフェニコール5μ9/廣σを含有するし寒天プ
レート上で各別のコロニーを形成せしめるように使用し
た。
ついでひとつのコロニーを、クロラムフェニコール5μ
g/mQ補ったvY培地1σ中に接種j−た。
g/mQ補ったvY培地1σ中に接種j−た。
この培養基を37°Cで18時時間表う培養し、次いで
ツルパル(Sorvall)遠心分離機(GS30−夕
、6500rpm)で14℃において10分間7100
gで遠沈した。
ツルパル(Sorvall)遠心分離機(GS30−夕
、6500rpm)で14℃において10分間7100
gで遠沈した。
このようにして回収した細胞は、10+nM Tris
llC(! pH8,0、l mV EDTA、 25
%サクローズ緩衝液121中に再懸濁させ、ついでリゾ
チーム40yq/rxρを含有するTE溶液(10mM
Tris−HCl2 pH8,0,1mM EDTA
)IxQを加えた。この懸濁液を37℃で45分間培養
し、次いで水浴中に移し、フェニル−メチル−スルホニ
ル−フルオライド(PMSF)を最終0度が1mMにな
るまで加えた後、均質なMi!13iaが得られるまで
音波処理し1こ。
llC(! pH8,0、l mV EDTA、 25
%サクローズ緩衝液121中に再懸濁させ、ついでリゾ
チーム40yq/rxρを含有するTE溶液(10mM
Tris−HCl2 pH8,0,1mM EDTA
)IxQを加えた。この懸濁液を37℃で45分間培養
し、次いで水浴中に移し、フェニル−メチル−スルホニ
ル−フルオライド(PMSF)を最終0度が1mMにな
るまで加えた後、均質なMi!13iaが得られるまで
音波処理し1こ。
次いでこの@濁液を4℃において30分間+200Or
pm(ツルパル遠心分離機、5S−340−ター)で遠
沈し、上澄み液を回収し、これを20mM Tris−
HCQpH7,5、l mV P!+!SFの溶液に対
して透析した。
pm(ツルパル遠心分離機、5S−340−ター)で遠
沈し、上澄み液を回収し、これを20mM Tris−
HCQpH7,5、l mV P!+!SFの溶液に対
して透析した。
DEAEセルロースの20X1.6cx力ラムQhat
man DE52)を4℃において30mM Tris
−HCl2. 1 mM PMSF pH7,5で平衡
化しく流速30R(!/hr)、次いで過程A)で用意
したタンパク質溶液を負荷した。
man DE52)を4℃において30mM Tris
−HCl2. 1 mM PMSF pH7,5で平衡
化しく流速30R(!/hr)、次いで過程A)で用意
したタンパク質溶液を負荷した。
このカラムを平衡化緩衝液3倍量で洗浄した後、0.1
mM NaCQ、 20mM Tris−HCQpH7
,51衝液2001+2で溶出仕しめた。
mM NaCQ、 20mM Tris−HCQpH7
,51衝液2001+2で溶出仕しめた。
この塩濃度は融合タンパク質の大略90%を溶出せしめ
るに十分である。
るに十分である。
次いで20111111 Trys−HCQs O,5
mM NaCρI)H7、5で洗浄して残留タンパク質
を除去する。
mM NaCρI)H7、5で洗浄して残留タンパク質
を除去する。
C)イオン交換クロマトグラフィー
融合タンパク質を含有するフラクションは組換えられ、
20d NaHPO,/Na、IIPO,pH6,7緩
衝液に対して透析し、次いで同じ緩衝液で平衡化したD
EAEセルロースの15Xlcffカラムに負荷した。
20d NaHPO,/Na、IIPO,pH6,7緩
衝液に対して透析し、次いで同じ緩衝液で平衡化したD
EAEセルロースの15Xlcffカラムに負荷した。
残らなかったタンパク質を洗い出した後、融合タンパク
質をこの平衡化緩衝液中の0.1mM NaCQで溶出
せしめた。
質をこの平衡化緩衝液中の0.1mM NaCQで溶出
せしめた。
hGH前駆体を含有するフラクションが回収され、硫酸
アンモニウム(60%飽和)が添加され、存在する全タ
ンパク質を沈降せしめた。次いでこの沈降物が回収され
、50mM Tris−HCρpHLO1100mM
NaCQ及びl mM CaCQ2溶液6i&中に溶解
せしめた。次いでゼオチーセン・エイチー ン−(Th
eogersen 11.c、)(1978)(Bio
chem、 J、 175.613)に記載されている
ように調製し精製した血液因子Xaプロテアーゼを、因
子Xa/hGH前駆体分子比1:10で溶液に加えた。
アンモニウム(60%飽和)が添加され、存在する全タ
ンパク質を沈降せしめた。次いでこの沈降物が回収され
、50mM Tris−HCρpHLO1100mM
NaCQ及びl mM CaCQ2溶液6i&中に溶解
せしめた。次いでゼオチーセン・エイチー ン−(Th
eogersen 11.c、)(1978)(Bio
chem、 J、 175.613)に記載されている
ように調製し精製した血液因子Xaプロテアーゼを、因
子Xa/hGH前駆体分子比1:10で溶液に加えた。
この酵素反応は混合物を室温(20−25℃)に24時
間保って行われた。
間保って行われた。
hG8前駆体の90%がこのようにして消化され、シス
テム80シーケンサ−(Beckman)で行われた最
初の10個のアミノ酸の解析によって示されるように天
然杉配列を有するホルモンに変換された。過量の塩を除
去するために試料はpH6,7NaH2PO4/Na+
HPO42mV緩衝液に対して透析された。
テム80シーケンサ−(Beckman)で行われた最
初の10個のアミノ酸の解析によって示されるように天
然杉配列を有するホルモンに変換された。過量の塩を除
去するために試料はpH6,7NaH2PO4/Na+
HPO42mV緩衝液に対して透析された。
D)天然形hG■の精製
過程C)で記載した方法を用いた。これらの条件下では
、溶出緩衝液中のNaCl2濃度の100mMまでの増
加によって溶出せしめ得る、因子Xaにより消化されな
い前駆体及び汚染分のタンパク質とは異なり、天然形ヒ
ト生長ホルモンはカラムによって保留されなかった。
、溶出緩衝液中のNaCl2濃度の100mMまでの増
加によって溶出せしめ得る、因子Xaにより消化されな
い前駆体及び汚染分のタンパク質とは異なり、天然形ヒ
ト生長ホルモンはカラムによって保留されなかった。
このようにして得たhGHは98%の純度であった。
このhGIlの純度は、続いてRP−)IPLC(C3
)カラムを通しアセトニトリル勾配で溶出せしめること
により100%の値又は大略100%の値まで高めるこ
とができる。hGHの正確な配列は純粋なhGH50μ
9を用いモデル890Aベツクマン自動シーケンサ−を
使用することによるアミノ末端配列の決定によって確め
られた。PTHアミノ酸はホーン・デイ他(Hawke
。
)カラムを通しアセトニトリル勾配で溶出せしめること
により100%の値又は大略100%の値まで高めるこ
とができる。hGHの正確な配列は純粋なhGH50μ
9を用いモデル890Aベツクマン自動シーケンサ−を
使用することによるアミノ末端配列の決定によって確め
られた。PTHアミノ酸はホーン・デイ他(Hawke
。
D、 et al) [Anal、 Biochem、
120.302 (1982)]に記載された方法を
わずか変更した方法で解析された。予想どおり最初の1
0個のアミノ酸配列はPhePro Thr lle
Pro Leu Ser Arg Leu Pheであ
った。
120.302 (1982)]に記載された方法を
わずか変更した方法で解析された。予想どおり最初の1
0個のアミノ酸配列はPhePro Thr lle
Pro Leu Ser Arg Leu Pheであ
った。
第1図はプラスミドpSM214の作製過程を示す略図
である。第2図は枯草菌(B、5ubtilis)細胞
からの可溶性及び不溶性タンパク質の全部を含有するク
マノーブルー染色した5DS−PAGE電気泳動の結果
をあられす図であって、1は5M511g (psM2
14)可溶性タンパク質フラクション、2はSMSll
g(psM214)不溶性タンパク質フラクション、3
は5M3118 (93M274)可溶性タンパク質フ
ラクンヨン、4は5M5118 (93M274)不溶
性タンパク質フラクション、5はmet−hGH,6は
分子量標準を示す。第3図は枯草菌細胞の可溶性及び不
溶性タンパク質の全部のウェスタンプロットの結果を示
す図であって、1は5M311g (psM214)可
溶性タンパク質フラクノヨン、2は5M311g (p
sM214)不溶性タンパク質フラクション、3は5M
311g (93M274)可溶性タンパク質フラクノ
ヨン、4は5M5l18 (93M274)不溶性タン
パク質フラクション、5はmet−hGHを示ず。 FIG、2 F!G、3
である。第2図は枯草菌(B、5ubtilis)細胞
からの可溶性及び不溶性タンパク質の全部を含有するク
マノーブルー染色した5DS−PAGE電気泳動の結果
をあられす図であって、1は5M511g (psM2
14)可溶性タンパク質フラクション、2はSMSll
g(psM214)不溶性タンパク質フラクション、3
は5M3118 (93M274)可溶性タンパク質フ
ラクンヨン、4は5M5118 (93M274)不溶
性タンパク質フラクション、5はmet−hGH,6は
分子量標準を示す。第3図は枯草菌細胞の可溶性及び不
溶性タンパク質の全部のウェスタンプロットの結果を示
す図であって、1は5M311g (psM214)可
溶性タンパク質フラクノヨン、2は5M311g (p
sM214)不溶性タンパク質フラクション、3は5M
311g (93M274)可溶性タンパク質フラクノ
ヨン、4は5M5l18 (93M274)不溶性タン
パク質フラクション、5はmet−hGHを示ず。 FIG、2 F!G、3
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 天然形ヒト生長ホルモンを高純度で製造する方法に
おいて、 a)因子Xaで認識されるテトラペプチドと、2個ない
し10個のアミノ酸残分で形成され配位1のアミノ酸が
メチオニンであり他のアミノ酸の少なくともひとつが酸
性のもの、塩基性のもの及び/又はヒスチジンから選ば
れたものであるペプチドとにより構成されたアミノ酸鎖
がアミノ末端に存在することによって特徴付けられるヒ
ト生長ホルモン前駆体を、ハイブリッドプラスミドによ
って形質転換された枯草菌(Bacillussubt
ilis)細胞の培養により合成し、 b)この形質転換細胞をリシン溶解し前記前駆体を含有
する上澄み液を回収し、 c)クロマトグラフィーによりこの上澄み液から前記前
駆体を精製し、 d)因子Xaでの処理によりこのように精製した前記前
駆体を加水分解し、 e)クロマトグラフィーによりこの加水分解混合物から
ヒト生長ホルモンを精製する、 ことを包含する製法。 2 請求項1記載の製法において、要件a)の枯草菌が
B.subtilis SMS118であることを特徴
とする製法。 3 請求項1記載の製法において、前以てEcoR I
及びHindIII制限酵素で消化した発現ベクターPS
M214 ATCC67320を、ヒト生長ホルモンの
前駆体をコード付けする遺伝子に合体させることによっ
て前記ハイブリッドプラスミドを要件a)において得る
ことを特徴とする製法。 4 請求項3記載の製法において、前記遺伝子が、因子
Xaによって認識されるテトラペプチドをコード付けす
る配列及び前記ペプチドをコード付けする配列を5′末
端で融合した、天然形ホルモンをコード付けするヌクレ
オチド配列により構成されていることを特徴とする製法
。 5 請求項4記載の製法において、前記アミノ末端ペプ
チドが配列Met−Glu−Glu−Ile−Met、
ここでMetはメチオニン、Gluはグルタミン酸、I
leはイソロイシンである、を有することを特徴とする
製法。 6 請求項1記載の製法において、前記要件c)および
e)における精製をイオン交換クロマトグラフィーまた
はIMACによって行うことを特徴とする製法。 7 請求項1記載の製法において、前記酵素加水分解が
因子Xa/前駆体の分子比が1/2ないし1/100で
室温20−25℃において実施されることを特徴とする
製法。 8 動物に対し治療上有効である、請求項1に記載の方
法によって製造したホルモンを含有する薬剤。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT23148/87A IT1223577B (it) | 1987-12-22 | 1987-12-22 | Procedimento migliorato per la preparazione dell'ormone della crescita umano naturale in forma pura |
IT23148A/87 | 1987-12-22 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH022386A true JPH022386A (ja) | 1990-01-08 |
Family
ID=11204294
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63324756A Pending JPH022386A (ja) | 1987-12-22 | 1988-12-22 | 天然形ヒト生長ホルモンを高純度で製造する方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5047333A (ja) |
EP (1) | EP0321940B1 (ja) |
JP (1) | JPH022386A (ja) |
AT (1) | ATE101649T1 (ja) |
DE (1) | DE3887856T2 (ja) |
ES (1) | ES2061619T3 (ja) |
IT (1) | IT1223577B (ja) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ236819A (en) * | 1990-02-03 | 1993-07-27 | Max Planck Gesellschaft | Enzymatic cleavage of fusion proteins; fusion proteins; recombinant dna and pharmaceutical compositions |
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