JP2022082668A - 改善された再プログラム方法及び細胞培養基盤 - Google Patents
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-
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Abstract
Description
本出願は、35U.S.C.§119(e)に基づき、参照により全体が本明細書に組み込まれる2014年3月4日出願の米国仮特許出願第61/947,979号の利益を主張する。
本出願に関連する配列表は、紙面の代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、FATE_122_01WO_ST25.txtである。テキストファイルは、8KBであり、2015年3月4日に作成され、本明細書の出願と同時にEFS-Webを介して電子的に提出されている。
背景
FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される。
FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
(a)Wnt経路アゴニストと;
(b)MEK阻害剤と;
(c)ROCK阻害剤とを含み、
TGFβR阻害剤を含まない組成物。
(項目2)
前記Wnt経路アゴニストは、GSK3阻害剤である、項目1に記載の前記組成物。
(項目3)
前記GSK3阻害剤は、CHIR99021またはBIOである、項目2に記載の前記組成物。
(項目4)
前記MEK阻害剤は、PD98059またはPD032901である、項目1に記載の前記組成物。
(項目5)
前記ROCK阻害剤は、チアゾビビンまたはY27632である、項目1に記載の前記組成物。
(項目6)
前記GSK3阻害剤は、CHIR99021であり、前記MEK阻害剤は、PD032901であり、前記ROCK阻害剤は、チアゾビビンである、項目1に記載の前記組成物。
(項目7)
bFGFまたはLIFをさらに備える、項目1から6のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目8)
bFGF及びLIFをさらに含む、項目1から6のいずれか一項に記載の前記組成物。(項目9)
項目1に記載の前記組成物を含み、
TGFβR阻害剤を含まない培養培地。
(項目10)
1つ以上の多能性細胞を培養する方法であって、前記1つ以上の多能性細胞を、項目9に記載の細胞培養培地中で培養することを含む前記方法。
(項目11)
前記1つ以上の多能性細胞は、胚幹細胞(ESC)または人工多能性幹細胞(iPSC)である、項目10に記載の前記方法。
(項目12)
前記1つ以上の多能性細胞は、iPSCである、項目10に記載の前記方法。
(項目13)
前記組成物は、多能性細胞の集団を含む、項目10に記載の前記方法。
(項目14)
多能性細胞の前記集団は、多能性細胞の均質集団である、項目13に記載の前記方法。(項目15)
多能性細胞の前記集団の少なくとも95%は、SSEA4-FITC及びTRA1-81またはTRA1-60を発現する、項目13に記載の前記方法。
(項目16)
多能性細胞の前記集団の最大5%は、α-平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、またはFoxA2を発現する、項目13に記載の前記方法。
(項目17)
前記多能性細胞は、TGFβR阻害剤を含む細胞培養培地中で事前に培養されている、項目10に記載の前記方法。
(項目18)
前記多能性細胞を前記細胞培養培地中で培養することは、前記培養された細胞の自発的分化を低減する、項目13に記載の前記方法。
(項目19)
前記培養された細胞における1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目18に記載の前記方法。
(項目20)
前記1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目19に記載の前記方法。
(項目21)
前記培養された細胞において、2つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における2つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目18に記載の前記方法。
(項目22)
前記2つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目21に記載の前記方法。
(項目23)
前記培養された細胞において、3つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における3つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目18に記載の前記方法。
(項目24)
前記3つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目23に記載の前記方法。
(項目25)
前記培養された細胞において、5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目18に記載の前記方法。
(項目26)
前記5つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目25に記載の前記方法。
(項目27)
前記多能性細胞を前記細胞培養培地中で培養することは、多能性の基底状態を維持または誘引する、項目18に記載の前記方法。
(項目28)
前記1つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも5継代の間維持される、項目27に記載の前記方法。
(項目29)
前記1つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも10継代の間維持される、項目27に記載の前記方法。
(項目30)
前記1つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも50継代の間維持される、項目27に記載の前記方法。
(項目31)
前記1つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも100継代の間維持される、項目27に記載の前記方法。
(項目32)
継代の間、前記1つ以上の多能性細胞を解離させることをさらに含む、項目10から31のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目33)
継代の間、前記1つ以上の多能性細胞の生存率が維持される、項目32に記載の前記方法。
(項目34)
前記1つ以上の多能性細胞は、正常核型を含む、項目10から33のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目35)
前記1つ以上の多能性細胞は、フィーダーを含まない環境内で培養される、項目10から34のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目36)
前記1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される、項目10から35のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目37)
前記1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される、項目10から35のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目38)
前記1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される、項目10から35のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目39)
多能性細胞をフィーダーを含まない培養に適合させる方法であって、
(a)フィーダー細胞の存在下で培養される1つ以上の多能性細胞を単離することと、
(b)前記1つ以上の多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で培養することとを含む前記方法。(項目40)
単一細胞として酵素的に継代された多能性細胞を培養する方法であって、
(a)1つ以上の多能性細胞を酵素的に処理して、単一多能性細胞を継代することと;
(b)フィーダーを含まない環境内で前記単一多能性細胞を培養することと;
(c)Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で、前記単一多能性細胞を培養することとを含む前記方法。
(項目41)
1つ以上の多能性細胞の自発的分化を低減する方法であって、
(a)フィーダーを含まない環境内で前記1つ以上の多能性細胞を培養することと;
(b)Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で、前記1つ以上の多能性細胞を培養することとを含む前記方法。(項目42)
人工多能性幹細胞(iPSC)を製造する方法であって、
(a)1つ以上の非多能性細胞を得ることと;
(b)前記1つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることと;
(c)TGFβR阻害剤を含まない細胞培養培地中で前記多能性細胞を培養し、それによりiPSCを生成することとを含む前記方法。
(項目43)
前記1つ以上の非多能性細胞は、体細胞を含む、項目42に記載の前記方法。
(項目44)
前記1つ以上の非多能性細胞は、成体幹細胞を含む、項目42に記載の前記方法。
(項目45)
前記1つ以上の非多能性細胞は、前記細胞内の内在性OCT4の発現を増加させることにより、多能性状態に再プログラムされる、項目42に記載の前記方法。
(項目46)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C-MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目47)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C-MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目48)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、及びNANOGからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目49)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、NANOG、ECAT1、UTF1、及びESRRBからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目50)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、ECAT1、及びUTF1からなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目51)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターである、項目46から50のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目52)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、エピソームベクターである、項目46から50のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目53)
前記細胞培養培地は、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤である前記Wnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含む、項目42から52のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目54)
前記1つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることは、前記1つ以上の非多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤である前記Wntアゴニスト;MEK阻害剤;及びTGFβR阻害剤、ならびに任意選択でROCK阻害剤と接触させることを含む、項目42から53のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目55)
前記iPSCは、iPSCの集団を含む、項目42に記載の前記方法。
(項目56)
iPSCの前記集団は、iPSCの均質集団である、項目55に記載の前記方法。
(項目57)
iPSCの前記集団の少なくとも95%は、SSEA4及びTRA1-81またはTRA1-60を発現する、項目55に記載の前記方法。
(項目58)
多能性細胞の前記集団の最大5%は、α-平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、またはFoxA2を発現する、項目55に記載の前記方法。
(項目59)
前記多能性細胞を前記細胞培養培地中で培養することは、自発的分化を低減する、または多能性の基底状態を維持もしくは誘引する、項目42から58のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目60)
1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、前記iPSCにおいて、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養されたiPSCにおける1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目59に記載の前記方法。
(項目61)
前記1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目60に記載の前記方法。
(項目62)
自発的分化の前記低減は、少なくとも5継代の間維持される、項目60に記載の前記方法。
(項目63)
自発的分化の前記低減は、少なくとも10継代の間維持される、項目60に記載の前記方法。
(項目64)
自発的分化の前記低減は、少なくとも50継代の間維持される、項目60に記載の前記方法。
(項目65)
自発的分化の前記低減は、少なくとも100継代の間維持される、項目60に記載の前記方法。
(項目66)
継代の間、前記iPSCを解離させることを含む、項目42から65のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目67)
前記iPSCの前記生存率は、継代の間維持される、項目66に記載の前記方法。
(項目68)
前記iPSCは、正常核型を含む、項目42から67のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目69)
前記iPSCは、フィーダーを含まない環境内で培養される、項目42から68のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目70)
前記iPSCのゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される、項目42から69のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目71)
前記iPSCのゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される、項目42から69のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目72)
前記iPSCのゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される、項目42から69のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目73)
項目42から72のいずれか一項に従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)。
(項目74)
基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)であって、再プログラミング因子ポリペプチドをコードする外部から導入されたポリヌクレオチドを含まない前記iPSC。
(項目75)
人工多能性幹細胞(iPSC)を製造する方法であって、
(a)1つ以上の多能性幹細胞を得ることと;
(b)TGFβR阻害剤を含まない細胞培養培地中で前記1つ以上の多能性幹細胞を培養し、それにより基底状態iPSCを生成することとを含む前記方法。
(項目76)
前記1つ以上のiPSCは、再プログラムされた体細胞を含む、項目75に記載の前記方法。
(項目77)
前記1つ以上のiPSCは、再プログラムされた成体幹細胞を含む、項目75に記載の前記方法。
(項目78)
前記1つ以上のiPSCは、前記1つ以上のiPSC内の内在性OCT4の発現を増加させることにより、多能性状態に再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。(項目79)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C-MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目80)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C-MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目81)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、及びNANOGからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目82)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、NANOG、ECAT1、UTF1、及びESRRBからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目83)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、ECAT1、及びUTF1からなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目84)
レンチウイルスベクターは、前記1つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目79から83のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目85)
エピソームベクターは、前記1つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目79から83のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目86)
前記細胞培養培地は、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤である前記Wnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含む、項目75に記載の前記方法。
(項目87)
前記1つ以上のiPSC得ることは、前記1つ以上の非多能性細胞または部分多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤である前記Wntアゴニスト;MEK阻害剤;及びTGFβR阻害剤、ならびに任意選択でROCK阻害剤と接触させ、前記1つ以上のiPSCを生成することを含む、項目75から86のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目88)
前記iPSCは、iPSCの集団を含む、項目75に記載の前記方法。
(項目89)
iPSCの前記集団は、iPSCの均質集団である、項目88に記載の前記方法。
(項目90)
iPSCの前記集団の少なくとも95%は、SSEA4及びTRA1-81またはTRA1-60を発現する、項目88に記載の前記方法。
(項目91)
前記1つ以上のiPSCは、多能性細胞の集団を再プログラムすることにより得られ、多能性細胞の前記集団の最大5%は、α-平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、またはFoxA2を発現する、項目88に記載の前記方法。
(項目92)
前記1つ以上のiPSCを前記細胞培養培地中で培養することは、自発的分化を低減する、または多能性の基底状態を維持もしくは誘引する、項目75に記載の前記方法。
(項目93)
自発的分化が低減された前記iPSCは、遺伝子発現を含み、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養されたiPSCにおける1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目92に記載の前記方法。
(項目94)
前記1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目93に記載の前記方法。
(項目95)
前記低減された自発的分化は、少なくとも5継代の間維持される、項目93に記載の前記方法。
(項目96)
前記低減された自発的分化は、少なくとも10継代の間維持される、項目93に記載の前記方法。
(項目97)
前記低減された自発的分化は、少なくとも50継代の間維持される、項目93に記載の前記方法。
(項目98)
前記低減された自発的分化は、少なくとも100継代の間維持される、項目93に記載の前記方法。
(項目99)
継代の間、前記1つ以上のiPSCを解離させることを含む、項目75から98のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目100)
継代の間、前記1つ以上のiPSCの生存率が維持される、項目90に記載の前記方法。
(項目101)
前記1つ以上のiPSCは、正常核型を含む、項目75から100のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目102)
前記1つ以上のiPSCは、フィーダーを含まない環境内で培養される、項目75から101のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目103)
前記1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される、項目75から102のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目104)
前記1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される、項目75から102のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目105)
前記1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される、項目75から102のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目106)
項目75から105のいずれか一項に従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)。
(項目107)
基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)であって、再プログラミング因子ポリペプチドをコードする外部から導入されたポリヌクレオチドを含まない前記iPSC。
(項目108)
非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムするための方法であって、前記非多能性細胞に、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする、1つ以上のポリヌクレオチド、または、(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドを導入し、それにより前記非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムすることを含む前記方法。
(項目109)
導入することは、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入すること、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドを導入することを含む、項目108に記載の前記方法。
(項目110)
導入することは、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入すること、または(ii)OCT-4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドを導入することを含む、項目108に記載の前記方法。
(項目111)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにより導入される、項目108から110のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目112)
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目111に記載の前記方法。
(項目113)
前記多能性細胞は、外因性ポリヌクレオチドを含まない、項目111に記載の前記方法。
(項目114)
前記1つ以上のポリヌクレオチドが、CRE媒介切断により切断される、項目113に記載の前記方法。
(項目115)
前記非多能性細胞に、(i)SV40LTポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または(ii)SV40LTポリペプチドを導入することをさらに含む、項目108から114のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目116)
前記非多能性細胞を、TGFβR阻害剤、Wnt経路アゴニスト、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つと接触させることをさらに含み、前記Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤である、項目108から115のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目117)
前記非多能性細胞は、TGFβR阻害剤、Wnt経路アゴニスト、MEK阻害剤、及びROCK阻害剤と接触させられ、前記Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤である、項目116に記載の前記方法。
(項目118)
Wnt経路アゴニストと、MEK阻害剤と、ROCK阻害剤とを含む培養培地中で前記多能性細胞を培養することをさらに含み、前記Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤であり、前記培養培地は、TGFβR阻害剤を含有しない、項目108から117のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目119)
(a)前記Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、(b)前記TGFβR阻害剤は、A-83-01もしくはSB431542であり、(c)前記GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または(d)前記MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である、項目116から118のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目120)
前記多能性細胞の多能性は、少なくとも5回の細胞***または少なくとも10回の細胞***の間維持される、項目118または119に記載の前記方法。
(項目121)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、少なくとも1つの2Aペプチドにより隔てられた複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される、項目108から120のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目122)
前記多シストロン性ベクターは、Oct4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む、項目121に記載の前記方法。
(項目123)
前記多能性細胞内のOct34発現のために選択することにより、前記多能性細胞を同定することをさらに含む、項目108から122のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目124)
Oct4発現のために選択することは、異所性Oct4発現のために選択することを含む、項目123に記載の前記方法。
(項目125)
培養することは、多能性幹細胞の集団を生成する、項目118から124のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目126)
多能性幹細胞の前記集団は、少なくとも70%均質、少なくとも80%均質、または少なくとも90%均質である、項目125に記載の前記方法。
(項目127)
多能性細胞の前記集団の少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%は、SSEA及びTra-181を発現する、項目125または126に記載の前記方法。
(項目128)
前記多能性細胞または多能性細胞の集団は、単一細胞継代が可能である、項目108から127のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目129)
単一細胞継代により生成された前記細胞は、正常核型を有する、項目128に記載の前記方法。
(項目130)
項目108から129のいずれか一項に記載の前記方法に従って生成される多能性細胞。
(項目131)
(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも1つの外因性ポリペプチドを含む、単離された非多能性細胞を含む組成物。
(項目132)
前記細胞が、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドの少なくとも2つをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも2つの外因性ポリペプチドを含む、項目131に記載の前記組成物。
(項目133)
前記細胞が、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドの少なくとも3つをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも3つの外因性ポリペプチドを含む、項目131に記載の前記組成物。
(項目134)
前記細胞が、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)外因性OCT4ポリペプチド、外因性ECAT1ポリペプチド、外因性UTF1ポリペプチド、外因性NANOGポリペプチド、及び外因性ESRRBポリペプチドを含む、項目131に記載の前記組成物。
(項目135)
前記細胞が、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)外因性OCT4ポリペプチド、外因性ECAT1ポリペプチド、及び外因性UTF1ポリペプチドを含む、項目131に記載の前記組成物。
(項目136)
前記細胞は、TGFβR阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つと接触させられている、項目121から135のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目137)
前記細胞は、TGFβR阻害剤、Wnt経路活性化因子、MEK阻害剤及びROCK阻害剤と接触せられており、前記Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤である、項目136に記載の前記組成物。
(項目138)
(a)前記Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、(b)前記TGFβR阻害剤は、A-83-01もしくはSB431542であり、(c)前記GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または(d)前記MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である、項目136または137に記載の前記組成物。
(項目139)
前記1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにより前記非多能性細胞に導入される、項目131から138のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目140)
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目139に記載の前記方法。
(項目141)
前記細胞は、外因性ポリヌクレオチドを含まない、項目139に記載の前記組成物。
(項目142)
前記1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、CRE媒介切断により除去される、項目141に記載の前記方法。
(項目143)
前記細胞は、(i)SV40LT抗原ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、または(ii)外因性SV40LT抗原ポリペプチドをさらに含む、項目131から142のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目144)
前記1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの2Aペプチドにより隔てられた複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される、項目131から143のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目145)
前記多シストロン性ベクターは、OCT4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む、項目144に記載の前記組成物。
(項目146)
OCT4ポリペプチドをコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、選択可能マーカーに連結している、項目131から145のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目147)
(i)OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、(ii)ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、(iii)UTF1ポリペプチドをコードするcDNA、(iv)NANOGポリペプチドをコードするcDNA、及び(v)ESRRBポリペプチドをコードするcDNAの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つからなる組成物。
(項目148)
OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、UTF1ポリペプチドをコードするcDNA、NANOGポリペプチドをコードするcDNA、及びESRRBポリペプチドをコードするcDNAからなる、項目147に記載の前記組成物。
(項目149)
OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、及びUTF1ポリペプチドをコードするcDNAからなる、項目148に記載の前記組成物。
(項目150)
各cDNAは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにコードされる、項目147から149のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目151)
OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つの再プログラミング因子ポリペプチドをコードする、1つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター。
(項目152)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、OCTポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする、項目151に記載の前記ベクター。
(項目153)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、OCTポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする、項目152に記載の前記ベクター。
(項目154)
前記ベクターは、SV40LT抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目151から153のいずれか一項に記載の前記ベクター。
(項目155)
レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAである、項目151から154のいずれか一項に記載の前記ベクター。
(項目156)
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目155に記載の前記ベクター。
(項目157)
非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムするためのキットであって、
(a)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、もしくはESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする、1つ以上のポリヌクレオチド;または
(b)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、もしくはESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチド;ならびに
(c)TGFβR阻害剤、Wnt経路活性化因子、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つを備え、前記Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤である、前記キット。
(項目158)
(i)前記1つ以上のポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードし、または、(ii)前記少なくとも1つのポリペプチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドを含む、項目157に記載の前記キット。
(項目159)
(i)前記1つ以上の1つ以上のポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする、または、(ii)前記少なくとも1つのポリペプチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドを含む、項目157に記載の前記キット。
(項目160)
(i)SV40LT抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または(ii)SV40LT抗原ポリペプチドをさらに備える、項目157から159のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目161)
前記キットは、TGFβR阻害剤と、Wnt経路活性化因子と、MEK阻害剤と、ROCK阻害剤とを備え、前記Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤である、項目157から160のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目162)
(a)前記Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、(b)前記TGFβR阻害剤は、A-83-01もしくはSB431542であり、(c)前記GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または(d)前記MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である、項目157から161のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目163)
前記少なくとも1つのポリヌクレオチドは、レンチウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにコードされる、項目157から162のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目164)
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目163に記載の前記キット。
(項目165)
前記少なくとも1つのポリヌクレオチドは、多シストロン性ベクターにコードされ、各ポリヌクレオチドは、2Aペプチドにより隔てられている、項目157から164のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目166)
前記多シストロン性ベクターは、OCT4ポリペプチドをコードする2つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目165に記載の前記キット。
(項目167)
OCT4ポリペプチドをコードする前記少なくとも1つのポリヌクレオチドは、選択可能マーカーに連結している、項目157から166のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目168)
多能性幹細胞の集団を生成するための方法であって、
a)非多能性細胞の集団を提供することと;
b)非多能性細胞の前記集団に、選択可能マーカーに連結したOCT4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することと;
c)非多能性細胞の前記集団の少なくとも一部を多能性細胞に再プログラムするのに十分な条件下で、非多能性細胞の前記集団を前記ポリヌクレオチドと共にインキュベートすることと;
d)前記選択可能マーカーを発現する細胞を選択し、それにより多能性幹細胞の集団を提供することとを含む前記方法。
(項目169)
前記ポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される、項目168に記載の前記方法。
(項目170)
前記複数のポリヌクレオチドは、2Aペプチドにより隔てられている、項目169に記載の前記方法。
(項目171)
細胞の前記集団内の細胞の少なくとも10%は、SSEA及びTRA-181を発現する、項目169に記載の前記方法。
多能性細胞の生成及び維持のための現行の方法は、自発的分化がなく、高分解能/高クローン性単一細胞継代及び大規模拡大が容易なフットプリントを含まない多能性細胞の均質培養を、依然として実現していない。基底状態多能性細胞は、これらの課題を克服する品質及び特性をもたらし得る。しかしながら、現在まで、フィーダーを含まない条件下での基底状態多能性細胞のハイスループット生成のための、信頼性のある堅牢な方法は存在しない。したがって、現行の方法は、産業または臨床グレードの多能性細胞の生成には好適となり得ない。本明細書において企図される発明は、基底状態多能性の、またはその特性を有する安定した多能性細胞の堅牢な生成の必要性に対処し、産業及び臨床用途に好適な安定した多能性細胞の製造における問題を解決する。
Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience;Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985);Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992);Guthrie and Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press,New York,1991);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,Ed.,1984);Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1985);Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984);Animal Cell Culture(R.Freshney,Ed.,1986);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984);Fire et al.,RNA Interference Technology:From Basic Science to Drug Development(Cambridge University Press,Cambridge,2005);Schepers,RNA Interference in Practice(Wiley-VCH,2005);Engelke,RNA Interference(RNAi):The Nuts&Bolts of siRNA Technology(DNA Press,2003);Gott,RNA Interference,Editing,and Modification:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology; Human
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A.Bunnell Eds.,2008);Hematopoietic Stem
Cell Protocols(Methods in Molecular Medicine)(Christopher A.Klug,and Craig T.Jordan Eds.,2001);Hematopoietic Stem Cell Protocols(Methods in Molecular Biology)(Kevin D.Bunting Ed.,2008) Neural Stem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Leslie P.Weiner Ed.,2008);Hogan et al.,Methods of Manipulating the Mouse Embyro(2nd Edition,1994);Nagy et al.,Methods of Manipulating the Mouse Embryo(3rd Edition,2002)、及びThe Zebrafish
book.A guide for the laboratory use of zebrafish(Danio rerio),4th Ed.,(Univ.of Oregon Press,Eugene,OR,2000)を参照されたい。
別段に定義されていない限り、本明細書において使用される技術的及び科学的用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の目的において、以下の用語は、以下のように定義される。
C.細胞
細胞バンキング、疾患モデリング及び細胞治療用途は、高品質多能性細胞の製造に対して益々多くの要求を課している。例えば、ハイスループットのフットプリントを含まないiPSCの誘導、及び大規模生産を可能にするシステムにおけるその拡大は、技術的に実現しにくい状態が続いている。具体的実施形態において、段階特異的培地組成物中での小分子経路阻害剤を使用した多能性細胞の迅速な並列生成、選択及び拡大を可能にする培養基盤が企図される。本明細書において企図される基盤は、完全にフィーダーを含まない環境において、最小限の再プログラミング因子を使用して効率的及び迅速化された再プログラムを補助し、多能性細胞の単一細胞培養及び拡大を可能にしながら、均質及びゲノム安定性多能性集団を維持する。さらに、本明細書において企図される培養基盤は、遺伝的背景とは無関係に、及び導入遺伝子発現とは独立して、hESC及びhiPSCを含む多能性細胞を、自発的分化の低減された状態、及び一般的な多能性の基底状態まで培養することを提供する。
TGFβ受容体(例えばALK5)阻害剤は、TGFβ受容体(例えばALK5)に対する抗体、そのドミナントネガティブ変異体、及びその発現を抑制するアンチセンス核酸を含み得る。例示的なTGFβ受容体/ALK5阻害剤は、SB431542(例えば、Inman,et al.,Molecular Pharmacology 62(1):65-74(2002)を参照されたい)、3-(6-メチル-2-ピリジニル)-N-フェニル-4-(4-キノリニル)-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミドとしても知られるA-83-01(例えば、Tojo,et al.,Cancer Science 96(11):791-800(2005)を参照されたく、例えばToicris Bioscienceから市販されている);2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジン、Wnt3a/BIO(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Dalton,et al.,WO2008/094597を参照されたい)、BMP4(Dalton、上記参照を参照されたい)、GW788388(-{4-[3-(ピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル]ピリジン-2-イル}-N-(テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)ベンズアミド)(例えば、Gellibert,et al.,Journal of Medicinal Chemistry 49(7):2210-2221(2006)を参照されたい)、SM16(例えば、Suzuki,et al.,Cancer Research 67(5):2351-2359(2007)を参照されたい)、IN-1130(3-((5-(6-メチルピリジン-2-イル)-4-(キノキサリン-6-イル)-1H-イミダゾール-2-イル)メチル)ベンズアミド)(例えば、Kim,et al.,Xenobiotica 38(3):325-339(2008)を参照されたい)、GW6604(2-フェニル-4-(3-ピリジン-2-イル-1H-ピラゾール-4-イル)ピリジン)(例えば、de Gouville,et al.,Drug News Perspective 19(2):85-90(2006)を参照されたい)、SB-505124(2-(5-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-イル-2-tert-ブチル-3H-イミダゾール-4-イル)-6-メチルピリジン塩酸塩)(例えば、DaCosta,et al.,Molecular Pharmacology 65(3):744-752(2004)を参照されたい)及びピリミジン誘導体(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Stiefl,et al.,WO2008/006583において列挙されているものを参照されたい)を含むが、これらに限定されない。さらに、「ALK5阻害剤」は、非特異的キナーゼ阻害剤を包含することを意図しないが、「ALK5阻害剤」は、ALK5に加えてALK4及び/またはALK7を阻害する阻害剤、例えばSB-431542等を包含するものとして理解されるべきである(例えば、Inman,et al.,J Mol.Pharmacol.62(1):65-74(2002)を参照されたい)。本発明の範囲を限定することを意図しないが、ALK5阻害剤は、上皮間葉転換/移行(MET)プロセスに影響すると考えられる。TGFβ/アクチビン経路は、間葉上皮移行(EMT)の駆動機構である。したがって、TGFβ/アクチビン経路の阻害は、MET(すなわち再プログラム)プロセスを促進し得る。
本明細書において使用される場合、「Wntシグナル促進剤」、「Wnt経路活性化剤」、または「Wnt経路アゴニスト」は、Wntl、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt7c、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt8c、Wnt10a、Wntl0b、Wnt11、Wnt14、Wnt15、またはWnt16の1つ以上のアゴニストを含むがこれらに限定されない、Wntシグナル伝達経路のアゴニストを指す。Wnt経路アゴニストは、以下のポリペプチド:Dkkポリペプチド、三日月型ポリペプチド(crescent polypeptide)、ケルベロスポリペプチド(cerberus polypeptide)、アキシンポリペプチド(axin polypeptide)、Frzbポリペプチド、T細胞因子ポリペプチド、もしくはドミナントネガティブ無秩序ポリペプチド(disheveled polypeptide)またはその断片の1つ以上を含むが、これらに限定されない。
GSK-3β阻害剤は、本明細書において企図される組成物における使用に好適な、特定の例示的Wnt経路アゴニストであり、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子を含み得るが、これらに限定されない。本明細書において企図されるGSK-3β阻害剤は、GSK-3β発現及び/またはGSK-3β活性を減少させ得る。本明細書において企図されるGSK-3β阻害剤の実例は、GSK-3βを標的化する抗GSK-3β抗体、ドミナントネガティブGSK-3β変異体、siRNA、shRNA、miRNA及びアンチセンス核酸を含むが、これらに限定されない。
本明細書において企図される組成物における使用に好適なERK/MEK阻害剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子を含むが、これらに限定されない。本明細書において企図されるERK/MEK阻害剤は、MEKもしくはERK発現及び/またはMEKもしくはERK活性を減少させ得る。本明細書において企図されるMEK/ERK阻害剤の実例は、MEKまたはERKを標的化する抗MEKまたは抗ERK抗体、ドミナントネガティブMEKまたはERK変異体、siRNA、shRNA、miRNA及びアンチセンス核酸を含むが、これらに限定されない。
Rho関連キナーゼ(ROCK)は、Rhoキナーゼ(そのうち、3つのアイソフォーム-RhoA、RhoB及びRhoCが存在する)の下流エフェクターに作用するセリン/トレオニンキナーゼである。本明細書において企図される組成物における使用に好適なROCK阻害剤は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子を含むが、これらに限定されない。本明細書において企図されるROCK阻害剤は、ROCK発現及び/またはROCK活性を減少させ得る。本明細書において企図されるROCK阻害剤の実例は、ROCKを標的化する抗ROCK抗体、ドミナントネガティブROCK変異体、siRNA、shRNA、miRNA及びアンチセンス核酸を含むが、これらに限定されない。
具体的実施形態において、本発明の細胞培養培地は、サイトカイン及び/または成長因子を実質的に含まない。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、血清、抽出物、成長因子、ホルモン、サイトカイン等を含むがこれらに限定されない1つ以上の補充物を含有する。
任意の好適な槽または細胞培養容器が、基本培地及び/または細胞培養補充物中の細胞培養物の担体として使用され得る。担体上には基材コーティングは必要ない。しかしながら、接着促進物質(例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、RGD含有ポリペプチド、ゼラチン等)で培養槽の表面をコーティングすることにより、細胞の付着が促進され、具体的実施形態において、本明細書において開示される細胞培養培地及び補充物の効果が向上され得る。細胞の培養及び継代に好適な基材は、当該技術分野において知られており、限定されることなく、ビトロネクチン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、エラスチン、オステオポンチン、自然発生的細胞株生成マトリックスの混合物、例えばMatrigel(商標)、ならびに合成または人工表面、例えばポリアミン単一層及びカルボキシ末端単一層を含む。
多能性細胞を培養するための現行の方法は、フィーダー細胞、またはフィーダー細胞で事前に調整され、ウシ胎仔血清を含有する培地に大きく依存するが、そのような環境は、臨床及び治療用途の細胞を生成するには不適切となり得る。例えば、そのような外的に汚染された環境において繁殖された細胞は、動物構成成分への曝露が、免疫拒絶、及び未確認の病原体の治療患者への伝染の重大なリスクを呈する可能性があり、潜在的に動物レトロウイルスを再活性化し得るため、一般に、ヒト細胞移植には不適切であるとみなされる。本明細書において企図される、フィーダーを含まない環境等の動物成分を含まない細胞培地を使用した培養系は、臨床グレード細胞株、具体的にはhESC及びhiPSC細胞株の製造を容易化する。
本明細書において企図される培養基盤により提供される利点の1つは、培養、継代、及び解離する単一基底状態多能性細胞の向上した生存能力及び生残性である。単一細胞への、例えば単一細胞懸濁液への細胞の解離は、酵素的または機械的手段により達成され得る。単一細胞への細胞の解離を可能にするための当該技術分野において知られている任意の酵素剤が、本発明の方法において使用され得る。一実施形態において、解離剤は、Trypsin/EDTA、TrypLE-Select、コラゲナーゼIV及びディスパーゼから選択される。
in vitro」(M.V.Wiles,Meth.Enzymol.225:900,1993);「Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy」(P.D.Rathjen et al.,al.,1993)において概説されている。
10.濃縮及び枯渇戦略
本明細書において企図される培養基盤を使用して製造される多能性細胞は、例えば、基底状態多能性細胞または自発的分化が低減された多能性細胞を含む多能性細胞生成物の選択または検証をさらに含んでもよい。多能性細胞は、再プログラム、ならびに本明細書において企図される組成物及び方法を用いたその後の培養の後、または、多能性細胞が再プログラムされなかった場合、多能性細胞が本明細書において企図される培養方法に移行した後に、選択及び/または検証されてもよい。細胞の多能性は、多能性に関連した、関係のある、及び検出可能な形態的、分子的及び/または生化学的変化に基づいて、特性決定及び/または選択されてもよい。
様々な例示的実施形態において、本発明は、部分的に、ポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び本明細書において企図される融合ポリペプチド、ならびにそれらを含む組成物を企図する。様々な他の例示的実施形態において、本発明は、部分的に、少なくとも1つの再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードするポリヌクレオチドで非多能性細胞を再プログラムすることを企図する。本明細書に記載の培養基盤との使用のための再プログラミング因子は、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C-MYC、SV40LT、hTERT、SALL4、GLIS、ESRRB、DPPA2、ECAT1、SOX1、SOX3、KLF2、KLF5、L-MYC、N-MYC、LRH1及びUTF1を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のような再プログラミング因子の配列を含む。
本発明は、部分的に、ポリペプチド、融合ポリペプチド、及びポリペプチドを発現するベクターを含む組成物を企図する。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、異なるように指定されない限り、交換可能に、及び従来の意味に従って、すなわちアミノ酸の配列として使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチド及び他の変異体を含む。ポリペプチドは、様々な周知の組換え及び/または合成技術のいずれかを使用して調製され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは、全長タンパク質配列、全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含んでもよく、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等、ならびに、自然発生的及び非自然発生的の両方の当該技術分野において知られている他の修飾を含んでもよい。
and Ryan,2004.Traffic,5(8);616-26を参照されたい)。
asigna)ウイルス(TaV)2Aペプチド、ブタテッショウウイルス-1(PTV-1)2Aペプチド、タイロウイルス2Aペプチド、ならびに脳心筋炎ウイルス2Aペプチドからなる群から選択される。
iPSCの長期維持及び拡大のための培地基盤の特定
概要
SMC4補充培養物中のレンチウイルス誘導hiPSC株の大多数は、未分化細胞の均質集団を維持するが、株のサブセットにおける導入遺伝子再プログラミング因子のサイレンシングは、長期培養において様々な程度の自発的分化を示した(図1A及びB)。したがって、残留導入遺伝子発現とは無関係の継続的FF培養及び単一細胞の酵素的継代中の多能性の維持のための条件を特定するために、様々な細胞培養構成成分を評価した。再プログラム及び維持プロセスの異なる段階における固有の経路を標的化する複数段階培養系が、hiPSC生成の効率的及び堅牢な手法として特定された。
長期維持の間のTGFβ経路の阻害は、サイレンシングされた導入遺伝子発現を有するhiPSC株の自発的分化における重要な因子として特定された(図1C)。自発的発現を生じることが判明したiPSC細胞株の1つを、新たな培地配合物、運命維持培地(Fate Maintenance Medium(FMM))中での培養に移行した(表1)。自発的分化が排除され、SSEA4/TRA1-81陽性細胞の均質集団が2~3継代以内に樹立された(図1A)。
単一細胞継代及びFF形式における導入遺伝子を含まないhiPSCの製造のための基盤
概要
エピソームベクター系を使用した非組み込み型再プログラム方法の効率は、特にFF環境において極めて低い(<0.001%)(Narsinh et al.,2011;O’Doherty et al.,2013)。SMC4及び再プログラムを改善することが示されている培地添加剤を含有する運命再プログラム培地(Fate Reprogramming Medium(FRM))、ならびにFMMの2つの培地を含む複数段階培養系において、エピソーム誘引を試験した(図2A及び表1)。
OCT4/SOX2/NANOG/KLF4/LIN28/MYC/SV40LT(OSNKLMT)の遺伝子の組み合わせからなるエピソーム発現系を使用して、様々な線維芽細胞をトランスフェクトした。エピソーム発現の誘引から24時間後、再プログラム培養物をERMに移行し、再プログラム反応速度を向上させる。最初の週以内に初期コロニー形成が観察され、10日目までに、SSEA4/TRA1-81陽性細胞の大規模な集団が検出された(>1%)(図8A及び8B)。14日目に、FRMにより補助された再プログラム培養物を、FRMまたはFMM培地中に分割した。21日目に、FACSを使用して、培養物中のSSEA4/TRA1-81/CD30陽性細胞を特定した(図8C)。FRM維持培養物は、分化及び未分化細胞の両方を含有し、一方FMM培養物は、ほぼ未分化細胞を含有していた(図8D)。
FMM中での導入遺伝子を含まないhiPSC株の長期継代及び拡大
概要
FF培養において単一細胞として拡大された実施例2からのhiPSCクローンを使用して、FRM及びFMMの複数段階培地基盤を使用したhiPSCの長期継代及び拡大を試験した(図3A及び3B)。
実施例2に従い再プログラムされたhiPSC株は、4~7継代までにエピソームDNAを喪失し、したがって、導入遺伝子に基づく再プログラミング因子とは独立して多能性であった(図3C)。hiPSC株は、SSEA4、TRA1-81、OCT4及びNANOGに対して陽性である未分化細胞の均質集団を維持した。さらに、これらの株は、多能性培養において一般的に利用される任意の洗浄戦略なしに、多能性特性(図3F)を維持した(図3D及び3E)。慣例的な単一細胞継代培養中に、マトリゲルが規定表面コーティングビトロネクチンで置き換えられた場合、均一hiPSC培養物の同様の拡大が観察された(図S10E~10G)。
複数段階培地基盤は、最小限の遺伝子でエピソーム再プログラムを可能にする
概要
KLF4、MYC及びLIN28等のがん遺伝子に対する依存性、または再プログラムプロセスにおいてP53をノックダウンする必要性が低減された効率的なフットプリントを含まない発現系は、多能性幹細胞治療にとって極めて有価値となるだろう(Lee et al.,2013;Okita et al.,2011;Yu et al.,2009)。複数段階培地基盤は、OSNKLMT再プログラミング因子を使用した導入遺伝子を含まないhiPSC細胞の生成及び拡大のための極めて効率的及び堅牢な基盤を示したため、基盤の堅牢性を、再プログラミング因子の必要性に対して測定した。
遺伝子発現の組み合わせ及び用量を変更するために、OCT4/NANOG/SOX2(ONS)、OCT4/SOX2(OS)またはOCT4/OCT4(2xO)を含む最小限の遺伝子セットを含有するいくつかのエピソーム発現カセットを構築した(図5A)。線維芽細胞株をOCT4、NANOG、SOX2、及びSV40LTの組み合わせでトランスフェクトし、FRM/FMM基盤を使用して培養した。SV40LT単独では、再プログラムの13日目にいかなる真のSSEA4/TRA1-81陽性細胞も生成されなかったが、トランスフェクト後の細胞生残性が改善された(図5B及び11A)。様々な再プログラミング因子の組み合わせは、再プログラムプロセスの初期において、SSEA4/TRA1-81陽性集団の発生により示されるように効率的な再プログラムをもたらした(13日目までに、OCT4/SOX2/SV40LTの場合>0.5%、OCT4/NANOG/SOX2/SV40LTの場合>3.5%;図5B)。さらなる日数再プログラムされた培養物は、SSEA4/TRA1-81陽性集団を大幅に増加させた(16日目までに、OCT4/SOX2/SV40LTの場合>4.0%;図11B)。驚くべきことに、観察された再プログラムされた細胞のパーセンテージは、がん遺伝子KLF4及びMYCを含有するレンチウイルス及びエピソーム誘引系に匹敵した(図2B、5B及び11B)。
FMM基盤は基底状態多能性を補助する
概要
FMM基盤をさらに評価するために、現行の方法により再プログラムされた体細胞の遺伝子発現特性を、本明細書において企図されるFMM基盤を使用して再プログラムされた体細胞の遺伝子発現特性と比較した。小分子による培養物と従来通り維持されたhiPSC培養物(Hanna et al.,2010b;Saha and Jaenisch,2009)との間の遺伝子発現の差を評価した。
1組の実験において、小分子媒介培養と従来の培養との間で遺伝子発現パターンを評価した。小分子培養においてレンチウイルス誘引hiPSCクローンFTi111を生成及び維持したが、多能性であることが示された。i)フィーダー細胞を有する従来の培地、及びii)フィーダー細胞を有する、またはFF表面上の小分子阻害剤含有培地(図12A及び12B)を含む様々な培養環境内に、クローンを直接解凍した。従来の培養におけるhiPSCコロニーは、ROCK阻害剤であるチアゾビビンの存在下でのみ回収され、その後、回収された細胞を塊での培養に変換した(図12B及び12C)。培養条件の各セットは、固有のコロニー形態(図12D)、及び多能性マーカーの遺伝子発現の異なるパターン(図12E)を示した。フィーダー細胞上の従来通り支持された培養は、小分子において維持された対応する培養物よりも、従来の培養において維持されたhESC対照H1及びHUES9によく類似していた(図12E)。これらのデータは、小分子媒介培養と従来の培養との間に異なる遺伝子発現パターンが存在することを示していた。
小分子培養におけるhiPSC維持
誘導hiPSC(OCT4/NANOG/SOX2、OCT4/ECAT1/UTF1、またはOCT4/ECAT1/UTF1/ESRRB/NANOGを含む再プログラミング因子の様々な組み合わせで誘引された線維芽細胞または血球)を、培養物のコンフルエンスが75~90%に達したら、単一細胞として慣例的に継代した。単一細胞解離のために、hiPSCをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Mediatech)で1回洗浄し、Accutase(Millipore)で37℃で3~5分間処理し、続いて滴下して、単一細胞解離を確実とした。次いで、単一細胞懸濁液を従来の培地と同体積で混合し、225gで4分間遠心分離し、運命維持培地(Fate Maintenance Medium(FMM))中に再懸濁させ、hESC定性マトリゲル(Corning)コーティング表面上に播種した。マトリゲルは、製造者の指示に従って調製及び表面のコーティングに使用した。継代は典型的に1:3~1:6であり、組織培養プレートは事前にマトリゲルで37℃で1~4時間コーティングし、2日から3日毎にFMMを供給した。細胞培養物を、37℃及び5%CO2に設定された加湿インキュベータ内に維持した。従来の培地は、DMEM/F12(Mediatech)、20%ノックアウト血清代替物(Life Technologies)、1×Glutagro(Mediatech)、1×非必須アミノ酸(NEAA)(Mediatech)、1×Pen/Strep(Mediatech)、及び100μMのβ-メルカプトエタノールからなる。FMMは、5μMのチアゾビビン(施設内で合成)、0.4μMのPD0325901(Biovision)、1μMのCHIR99021(Biovision)、100ng/mLのbFGF(Life Technologies)、及び10ng/mLのhLIF(Millipore)が補充された従来の培地からなる。FMMにおいて拡大された培養物のフロー分析及び形態を、図18A~D及び19A~Bに示す。FMMにおいて拡大された細胞はまた、図20A~Dに示されるように、複数の継代にわたって正常核型を示した。
小分子培養における最小限の遺伝子を用いた再プログラム
再プログラムを開始させるために、伝統的な組み込みレンチウイルスであるNILを使用したレンチウイルス形質導入により、またはエピソームベクターによるエレクトロポレーションにより、再プログラミング因子の異所性発現を誘引した。図14A~Bに示されるように、レンチウイルス発現系は、EF1αプロモーター、特異的遺伝子の組み合わせ(表3)、及び組み込まれた導入遺伝子のCRE媒介切断を可能とする3’末端におけるLOXP部位を含む、いくつかの特徴からなっていた。CRE切断後、誘導されたhiPSCゲノムはもはや導入遺伝子を含有せず、本質的にフットプリントを含んでいなかった。図14C~Fに示されるように、エピソームコンストラクトは、EF1αプロモーター及び固有の再プログラミング因子を含む、固有の特徴を有していた。トランスフェクト後、エピソームコンストラクトは核内に位置し、ゲノム内に組み込まれないトランス媒介様式で作用した。
再プログラミング因子の影響及びそれらの化学量論
ヒト線維芽細胞を、いくつかの再プログラミング因子を含有するレンチウイルスに遠心感染させた。抗生物質選択因子を含有しないレンチウイルスプラスミドを使用して、全ての試料をOCT4、SOX2、NANOG、及びSV40LTに感染させた。細胞を、ピューロマイシン選択カセット及び様々な再プログラミング因子を含有する単一レンチウイルスプラスミドに同時感染させた。これらの因子は、OCT4-P2A-SOX2、OCT4-P2A-NANOG-T2A-SOX2、またはOCT4-P2A-OCT4のいずれかを含んでいた。感染から2日後、50/50培地中の500ng/mLのピューロマイシン(Life Technologies)を各ウェルに添加した。5日目、ピューロマイシン選択から3日後に、ピューロマイシンを含まないFRMに培地を変更した。14日目に、培地をFMMに切り替えた。24日目と27日目との間に、SSEA4+/TRA181+集団に対してフロー分析を行った。増加したOCT4発現が、再プログラム効率を大幅に改善することが観察された(図23A)。
実験手順
従来の培養系におけるhiPSCの維持
従来通り培養されたhiPSCを、マイトマイシンC処理MEF(Millipore)フィーダー細胞上で維持し、DMEM/F12(Mediatech)、20%v/vのノックアウト血清代替物(Life Technologies)、1%v/vの非必須アミノ酸(Mediatech)、2mMのL-グルタミン(Mediatech)、100μMのβ-メルカプトエタノール(Life Technologies)及び10ng/mLのbFGF(Life Technologies)を含有する従来の培地(文章内では従来の培地と呼ばれる)で培養した。コンフルエントとなったら、従来通り培養されたhiPSCを、1mg/mLのコラゲナーゼIV(Life Technologies)を使用して37℃で7分間酵素的に解離させ、続いて小片まで機械的解離を行い(集塊継代(clump passaging)と呼ばれる)、回収して、従来の培地を毎日添加しながら、5~7日毎に、新しく播種されたフィーダー細胞上に1:3~1:4で希釈継代した。過度の自発的分化が見られる場合、コロニーを手作業で採取し、Insulin Syringe(Becton Dickinson)のチップを使用して小片に切断し、新しく播種されたフィーダー細胞に移した。細胞培養物を、37℃及び5% CO2に設定された加湿インキュベータ内に維持した。
再プログラムを開始させるために、レンチウイルス形質導入またはエピソームベクタートランスフェクションにより、再プログラミング因子の異所性発現を誘引した。続いて、レンチウイルストランスフェクションを、以前に説明された通りに行った(Valamehr et al.,2012)。簡潔に説明すると、出発細胞を、マトリゲル(BD Biosciences)コーティング表面上で、6ウェルプレートのウェル当たり1×105細胞で播種した。指定されない限り、全てのマトリゲルコーティングは、マトリゲル溶液(25mLのDMEM/F12中に再懸濁された1アリコートのマトリゲル)を組織培養表面に添加し、37℃で2~4時間のインキュベーションを行うことからなる。レンチウイルス発現導入遺伝子OCT4/SOX2/KLF4を生成する293T細胞からの上清を、1:2(1部のレンチウイルス上清:1部の線維芽細胞培地)の希釈率で出発細胞に添加し、4μg/mLポリブレン(Millipore)を補充し、37℃及び5% CO2に12~16時間移した。線維芽細胞培地:DMEM(Mediatech)、10%のFBS(Life Technologies)、1×glutamax(Life Technologies)、1×非必須アミノ酸(Mediatech)。レンチウイルスによるインキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄し、線維芽細胞培地を供給した。トランスフェクションから48時間後、1部のFRM(またはSMC4)及び1部の線維芽細胞培地を含有する50/50培地に培養培地を切り替えた。通常は感染後4日目から6日目の間に、培養物がより大きな槽に継代されると、培地は完全にFRM(またはSMC4)に切り替えられた。継代は、マトリゲルコーティング表面上へのAccutaseによる解離からなる(後述の通り)。培養物は、次の適用までFRM(またはSMC4)中で維持した。
293T(ATCC)を、抗生物質を含まない線維芽細胞培地中に維持し、80%超のコンフルエンスに到達させなかった。線維芽細胞培地は、DMEM(Mediatech)、10%のウシ胎仔血清(FBS)(Life Technologies)、1×Glutagro(Mediatech)、及び1×NEAA(Mediatech)からなっていた。まずPBSで洗浄し、続いて0.05%トリプシン(Mediatech)と共に37℃で4分間インキュベーションすることにより、細胞を継代した。解離した細胞を線維芽細胞培地中に再懸濁させ、225gで4分間遠心分離し、所望のプレート上に播種した。組み込みレンチウイルスを生成するために、293Tを、1日目に各ウイルス調製用の10cmの皿当たり3.5×106細胞で継代した。2日目に、トランスフェクションの1時間前に培地を10mLの新鮮な線維芽細胞培地に変更した。CalPhos
Kit(Clontech)を使用してDNAをトランスフェクトした。トランスフェクションのために、関心のある遺伝子(複数を含む)を含有する5μgのレンチウイルスクローニングプラスミド、3.2μgのパッケージングプラスミドpPAX、630ngのパッケージングプラスミドpMDG、87μLのカルシウム溶液、及び700μLまでの水を合わせた。1mLの血清用ピペットを使用して気泡を形成しながら、700μLのHBS溶液を添加した。これを室温で15分間インキュベートし、次いで293Tの10cmプレートに滴下により添加した。3日目に、ウイルス上清を除去し、廃棄し、15mLの新鮮な線維芽細胞培地をプレートに添加した。4日目、トランスフェクションから48時間後に、ウイルス上清を回収し、4℃で保存した。15mLの線維芽細胞培地をプレートに添加した。5日目、トランスフェクションから72時間後に、ウイルス上清を回収し、4日目の上清に添加した。0.45μmのフィルタを使用してこのウイルスプールを濾過し、Lenti-X GoStix(Clontech)を使用して力価を確認した。ウイルスを、感染に使用するか、またはアリコートとして-80℃で凍結した。非組み込みレンチウイルス(NIL)(Invivogen)を生成するために、各ウイルス調製用のT75フラスコを使用して、製造者の指示に従いプロトコルを行った。ウイルス上清を、トランスフェクションから48、72、及び96時間後に回収し、プールし、濾過し、上述のように力価を測定した。NILウイルスを、感染に使用するか、またはアリコートとして-80℃で凍結した。
誘導hiPSCを、培養物のコンフルエンスが75~90%に達したら、単一細胞として慣例的に継代した。過度のコンフルエンスは、分化をもたらし得ることに留意されたい。単一細胞解離のために、hiPSCをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Mediatech)で1回洗浄し、Accutaseで37℃で3~5分間処理し、続いて滴下して、単一細胞解離を確実とした。次いで、単一細胞懸濁液を従来の培地と同体積で混合し、225gで4分間遠心分離し、FMM中に再懸濁させ、マトリゲルコーティング表面上に播種した。継代は典型的に1:4~1:8であり、移された組織培養プレートは事前にマトリゲルで37℃で2~4時間コーティングし、1日おきにFMMを供給した。細胞培養物を、37℃及び5% CO2に設定された加湿インキュベータ内に維持した。FMM及びFRM用の培地配合物を、表1に記載する。SMC4培養は、以前に議論されている(Valamehr et al.,2012)。簡潔に説明すると、小分子0.4mMのPD0325901(Biovision)、1mMのCHIR99021(Biovision)、5mMのチアゾビビン及び2mMのSB431542(Biovision)を、従来の培養培地に添加し、プロトコルに従って継代する。
単一細胞解離(上述)再プログラムプールを、ハンク平衡塩溶液(MediaTech)、4%のウシ胎仔血清(Invitrogen)、1×ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech)及び10mMのHepes(Mediatech)を含有する冷却された染色緩衝液中に再懸濁させた。SSEA4-FITC、TRA1-81-Alexa Fluor-647及びCD30-PE(BD Biosciences)を含む複合化した一次抗体を、細胞溶液に添加し、氷上で15分間インキュベートした。全ての抗体は、100万細胞当たり100μLの染色緩衝液中7~10μLで使用した。溶液を染色緩衝液中で1回洗浄し、225gで4分間遠心分離し、10μM のチアゾビビンを含有する染色緩衝液中に再懸濁させ、フローサイトメトリーソーティングのために氷上で維持した。上記のゲーティング戦略を使用して、FACS Aria II(BD Biosciences)でフローサイトメトリーソーティングを行った。ソーティングされた細胞は、ウェル当たり3及び9イベントの濃度で、100μMノズルを使用して96ウェルプレート内に直接排出された。我々は、ソーティングされたイベントが必ずしもソーティング後の各ウェルにおいて観察される実際の細胞の数と相関するわけではないこと、及び、ウェル当たり3細胞が、個々のコロニーを含有する好ましい数のウェルの提供したことに気付いたため、ウェル当たり3細胞のソーティングが、我々にとって好ましい濃度であった。各ウェルを、5μg/mLのフィブロネクチン及び1×ペニシリン/ストレプトマイシン(Mediatech)が補充された200μLのFMMで事前に充填し、5×マトリゲルで一晩事前にコーティングした。5×マトリゲル事前コーティングは、1アリコートのマトリゲルを5mLのDMEM/F12に添加し、次いで一晩4℃でインキュベートして適切に再懸濁させ、最後にウェル当たり50μLで96ウェルプレートに添加し、続いて37℃で一晩インキュベートすることを含む。各ウェルに培地を添加する直前に、5×マトリゲルを吸引する。ソーティングの完了後、インキュベーションの前に、96ウェルプレートを225gで1~2分間遠心分離する。プレートを、撹乱されない状態で7日間静置した。7日目に、150μLの培地を各ウェルから除去し、100μLのFMMで置き換えた。ソーティング後10日目に、さらなる100μLのFMMをウェルに再供給した。コロニー形成は、早くも2日目に検出され、ソーティングから7~10日の間にほとんどのコロニーが拡大された。第1の継代において、ウェルをPBSで洗浄し、30μLのAccutaseで37℃で約10分間解離させた。Accutase処理の延長の必要性は、長期間培養物中で待機状態であったコロニーの緊密度を反映している。細胞が解離していることが観察された後、200μLのFMMを各ウェルに添加し、数回滴下してコロニーを分解する。解離したコロニーを、5×マトリゲルで事前にコーティングされた96ウェルプレートの別のウェルに移し、次いで、インキュベーションの前に225gで2分間遠心分離する。この1:1の継代は、初期コロニーを広げるために行う。3~5分間のAccutase処理、及びFMM中の1×マトリゲルで事前にコーティングされたより大きなウェル内への1:4の拡大により、その後の継代を慣例的に行う。Guava EasyCyte 8 HT(Millipore)でフローサイトメトリー分析を行い、FCS Express 4(De Novo Software)を使用して分析した。
Pico Pure RNA Isolation Kit(Life Technologies)を使用して、全RNAを単離した。iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)を使用して、相補的DNA(cDNA)を100ngの単離された全RNAから逆転写した。次いで、cDNAを、TaqMan PreAmp Master Mix Kit(Life Technologies)及び0.2×濃度のプールされたTaqManアッセイを使用した、22の特異的標的遺伝子及び2つの参照対照遺伝子の事前増幅に使用した。製造者のプロトコルに記載の標準サイクリング条件による14サイクルの増幅を使用して、cDNAからの特異的標的増幅(STA)を行った。事前増幅されたcDNA反応(n=48)を1:5で希釈し(無菌水中)、リアルタイム定量PCR反応用のテンプレートとして使用した。48.48動的アレイ(Fluidigm)をNanoFlex IFC Controller MX(Fluidigm)を使用して投入し、TaqManアッセイを2回投入し、BioMark
Real-Time PCR System(Fluidigm)を使用してリアルタイム反応を行った。BioMark Real-Time PCR Analysisソフトウェア(Fluidigm)を使用して結果を分析した。32を超えるサイクル閾値(Ct)を有する試料は、計算から除外した。2回のアッセイから平均Ctを計算し、6つの対照MEF細胞株(MEF上のOSK hiPSC及びH1 ESC)の中央値に対する2つの参照遺伝子(GAPDH及びHPRT1)の平均を使用して、デルタ-デルタCts(ΔΔCt)を計算した。相対的遺伝子発現(RQ)の結果は、ヒートマップ形式でExcel(Microsoft)で表示される。
QIAamp(登録商標)DNA Mini Kit及びProteinase K digestion(Qiagen)を使用して、ゲノムDNAを単離した。Taq PCR Master Mix Kit(Qiagen)を使用し、導入遺伝子特異的プライマーセット(以下の表5)(Yu et al.,2007)を用いて100ngのゲノムDNAを増幅した。PCR反応は、以下のように35サイクルの間行った:94℃で30秒間(変性)、60~64℃で30秒間(アニール)及び72℃で1分間(伸長)。レンチウイルス法を用いて生成された線維芽細胞及びhiPSCからのゲノムDNAを、陰性対照として使用した。エピソームコンストラクトのDNAを、陽性対照として使用した。
4%v/vのパラホルムアルデヒド(Alfa Aesar)を使用して細胞を固定し、0.2%v/vのTween(PBST)(Fisher Scientific)を含有するPBSで3回洗浄し、PBS中0.15%v/vのTritonX-100(Sigma-Aldrich)を使用して25℃で1時間透過処理した。透過処理後、細胞をPBST(Fisher Scientific)中1%v/vのBSA(Invitrogen)(PBSTB)で25℃で30分間ブロックした。PBSTBを穏やかに除去した後、細胞を、PBSTB中の一次抗体と共に、4℃で一晩インキュベートした。この試験において使用された一次抗体は、OCT4(Santa Cruz)、NANOG(Santa Cruz)、TRA160(Millipore)、TRA1-81(Millipore)、SSEA4(Millipore)、β-IIIチューブリン(TUJ1、R&D Systems)、α-平滑筋アクチン(Sigma)、FoxA2(R&D Systems)、Sox17(R&D Systems)、ネスチン(Abcam)及びα-1-フェトプロテイン(Dako)を含む。一晩のインキュベーション後、細胞をPBSTで3回洗浄し、PBSTB中に1:250で希釈された二次抗体(Alexa Fluor 488または555;Life Technologies)で、37℃で1時間染色した。細胞をPBST中で3回洗浄し、Hoechst染料(Invitrogen)で染色した。H3K27me3染色分析のために、hiPSCをカバースリップ上で72~96時間成長させ、PBS中4%のパラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Science、EMS)で25℃で15分間固定した。PBS中0.1%のTriton X-100で25℃で1時間細胞透過処理を行い、次いで細胞をブロック溶液(PBS中1%のBSA)と共に、25℃で30分間インキュベートした。ブロック後、カバースリップを、ブロック溶液中の抗トリメチルヒストンH3(Lys27)抗体(Millipore 07-449、H3K27me3)の1:1600希釈物と共に、4℃で一晩インキュベートした。二次抗体は、Alexa Fluor 555ヤギ抗ウサギIgG(Life Technologies、A21429)であった。核をDAPIで対比染色し、Axio Observer Inverted Microscope(Carl Zeiss)で観察した。画像をAxioVS40 v4.8.1.0(Carl Zeiss Imaging Solutions Gmbh)で記録した。
DMEM/F12(Mediatech)、20%のウシ胎仔血清(Invitrogen)、1%の非必須アミノ酸(Mediatech)、2mMのL-グルタミン(Mediatech)及び100μMのβ-メルカプトエタノールを含有する分化培地中で、hiPSCをEBとして分化させた。簡潔に説明すると、EB形成のために、hiPSCを、FMM中に播種し、翌日従来の培地に切り替え、細胞をプライミングした。従来の培地中で3~4日後、培養物を、Accutase(Millipore)で単一細胞解離し、10μMのY27632を含む分化培地中に100,000細胞/mLの最終濃度まで再懸濁させた。EB形成にはチアゾビビンの代わりにROCK阻害剤Y27632が使用されることに留意されたい。V底96ウェル非組織培養プレート(Nunc)内で100μL/ウェルで細胞を播種し、950gで5分間遠心分離した。翌日、P1000を使用して、緊密な「ボール状集塊」を、分化培地中約30~40EB/ウェルで超低結合性6ウェルプレート(Corning)に移した。7日後、EBを1:1でマトリゲルコーティング6ウェルプレートに移し、3日毎に分化培地を供給した。培養物中で3週間後、細胞を固定及び染色した。一定方向単層分化のために、hiPSCをFMM中のマトリゲルコーティングウェル上に播種し、翌日50%及び90%のコンフルエンスとした。両方の密度を、分化するように誘引した。神経誘引のために、FMM培地を、10μMのSB431542及び100nMのLDN-193189(共にSMAD阻害剤、Biovision)が補充されたhESC培地で置き換えた。2日後、分化培地に2つのSMAD阻害剤に加えて3μMのCHIR99021(Biovision)を補充した。2日後、細胞を固定し、ネスチン(Abcam)用に染色した。中胚葉分化のために、培地を、1×B27培地添加剤(Life Technologies)、3μMのCHIR99021、4ng/mlのbFGF及び10ng/mlのBMP4が補充されたRPMI(Mediatech)で置き換えた。培地を1日おきに交換し、4日目に細胞を固定し、αSMA(Sigma)用に染色した。Human Pluripotent Stem
Cell Functional Identification Kit(R&D Systems)を使用して、内胚葉分化を行った。hiPSCを内胚葉分化培地で3日間インキュベートし、固定し、SOX17(R&D Systems)用に染色した。
PicoPure RNA Isolation kit(Life Technologies)を使用して、製造者の推奨プロトコルを用い、RNAを抽出した。Nanodrop 2000 Spectrophotometer(Thermo Scientific)を使用して、全RNAを定量した。簡潔に説明すると、MessageAmp II aRNA Amplification Kit(Applied Biosystems/Ambion、Austin、TX)用の標準プロトコルを使用し、任意選択の第2ラウンド増幅を利用して、およそ100ngの全RNAからビオチニル化aRNAを調製し、次いでMessageAmp II Biotin Enhanced Kit(Applied Biosystems/Ambion、Austin、TX)を使用して、ビオチン標識化aRNA内に転写した。Affymetrix推奨に従って、ビオチン標識化aRNAを精製及び断片化した。20μgの断片化aRNAを使用して、Human Genome U133-plus-2.0チップ(Affymetrix Inc.Santa Clara、CA)に45℃で16時間ハイブリダイズした。Affymetrix Fluidics Station 450でアレイを洗浄及び染色し、Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7Gを使用して走査した。生の発現データファイルは、Gene Expression Omnibus(GSE50868)上で利用可能である。Affymetrix Expression Consoleソフトウェアを使用して、初期分析設定を用いて画像データを分析した。対数スケールのロバストマルチアレイ分析(RMA、Affymetrix)によりアレイを正規化し、Spotfire for Genomics 4.5(Tibco Spotfire、Palo Alto、CA)で可視化した。Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID v6.7)を使用して、差別的に発現したプローブの生物学的経路濃縮分析を、遺伝子オントロジー(GO)データベース(GO生物学的プロセスに対する単一濃縮及びp値<0.01)に対して行った。ユークリッド距離測定による完全連結クラスタリング法を使用して、Log2発現レベルに基づいて試料間の遺伝子発現プロファイルを比較するために階層的クラスタ分析を行った(Spotfire for Genomics 4.5)。クラスタ分析用のプローブセットは、発現レベルにおける全体的差異(><2.5倍)または基底もしくは準安定を定義する標的化遺伝子リスト上の存在により選択した。X染色体遺伝子発現比較のために、RMA正規化Affymetrix遺伝子チップ強度を、2^[RMA log2強度]を考慮することにより一次式値に変換した。一次式比を、ナイーブ発現セットをプライミングした発現セットで除した値として計算した。X染色体にマッピングされた全てのプローブセットに対する発現比を、強調表示された2倍超または未満の濃縮比のプローブセットにより、Spotfire 4.5で可視化した。
WiCell Research Institute(Madison、WI)により、20から40のGバンド中期細胞に対して細胞遺伝学的分析が行われた。
200μLの溶液(100μLのFMM及び100μLのマトリゲル)当たり50万及び300万細胞の濃度の単一細胞解離hiPSCを、NOD/SCID/γヌルマウスに皮下注射した。5~6週間後(300万細胞注射)及び7~8週間後(50万細胞注射)、奇形腫をPBS中に採取し、4%パラホルムアルデヒド中で室温で一晩固定し、その後処理のために70%エタノール中で室温で維持した。切片化ならびにヘマトキシリン及びエオシン染色のために、試料をUCSD Histology Core Facilityに提出した。Nikon DS-Fi1カメラを装備したNikon Eclipse TS100顕微鏡を使用して、切片の検査、解釈、及び撮像を行った。
標準偏差に関する統計評価にはスチューデントt検定を使用した。StepOne Software v2.2(Life Technologies)を使用して、qRTPCRデータに関するRQ最小及び最大値(エラーバー)を決定した。
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- 明細書に記載の方法等。
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