CN111278967A - 使用时序性和瞬时质粒载体表达***进行细胞重编程 - Google Patents

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Abstract

提供了使用载体***诱导非多能细胞重编程为具有所需特性的iPSC的方法和组合物，所述载体***提供了短暂的转基因瞬时时序性表达。还使用所提供的重编程方法和组合物提供了重编程细胞和iPSC群体或克隆细胞系。还提供了基因组工程改造的iPSC和由其再分化为包括涉及一个或多个选定的基因组基因座中的***和缺失的靶向编辑的衍生化细胞。

Description

使用时序性和瞬时质粒载体表达***进行细胞重编程
相关申请
本申请要求2017年10月11日提交的美国临时申请序列号62/571,105的优先权，其公开内容特此通过引用整体并入。
对以电子方式提交的序列表的引用
该申请通过引用并入了与该申请一起提交的ASCII文本格式的序列表的计算机可读格式(CRF)，其标题为13601-187-228_SEQ_LISTING.txt，创建于2018年10月9日，大小为9,600字节。
技术领域
本公开广泛地涉及生成人诱导多能干细胞(iPSC或iPS细胞)的领域。更具体地，本公开涉及质粒载体的组合用于高效获得具有期望特性的无足迹的iPSC的用途。
发明背景
iPSC最初是使用整合病毒***表达关键转录因子而生成的。逆转录病毒和慢病毒***，包括多顺反子和诱导型***，现已成功用于iPSC的生成。然而，由于***诱变和iPSC分化后外源基因再活化的可能而引起的永久性基因组变化，可能对通过这些方法生成的细胞的后续药物筛选和治疗应用呈现出潜在问题。实际上，已经报道了使用相同病毒***生成的iPSC克隆物之间的显著差异，当作为分化的神经球移植时，很大一部分克隆物会在啮齿动物中形成肿瘤。研究表明，使用相同病毒方法生成的iPSC一旦分化，其行为可能会有所不同。异位基因整合位点的差异可能导致不同的***突变和对转基因表达的表观遗传调控。对于包括整合***的iPSC生成方法，可能需要衍生化和筛选许多克隆物，以鉴定在多能和分化状态下均稳定的克隆物。
已经证明了用于iPSC生成的各种非整合***，包括病毒和非病毒方法。用于重编程的非整合病毒***包括腺病毒载体、仙台病毒载体和基于爱泼斯坦-巴尔病毒的附加型载体。用于重编程的非整合非病毒***的实例包括小环载体(最小DNA载体)、PiggyBac(转座子)、RNA(mRNA或miRNA)和蛋白质(重组多肽)。
在本领域中，实际需要有效地产生无足迹iPSC的同源群体，优选在“原初态”或“基态”多能性下，并且优选在限定培养条件下进行。“原初态”或“基态”的多能性赋予iPSC性质，包括但不限于高克隆度、可持续的自我更新、最小的自发分化和基因组异常以及作为解离单细胞的高生存性。本发明的方法和组合物，特别是新型质粒载体***，解决了这一需求，并在细胞重编程领域提供了其他相关的优点。
发明内容
通过使用将外源基因的存在减到最少的有效但瞬时和时序性的表达***以降低宿主基因组整合的可能性，本公开的目的是提供有效生成iPSC而不包含引入非多能细胞用于诱导重编程的外源DNA的方法和组合物。本公开的目的是提供一种组合质粒***，以有效地产生具有“原初态”或“基态”的多能性和/或高克隆性的iPSC。具有基态多能性的iPSC可使单细胞解离的iPSC长期存活并保持遗传稳定性，从而使得可以生成适于库存和操纵的克隆iPSC系，所述操纵诸如单细胞分选和/或耗竭、靶向克隆iPSC的基因组编辑和iPSC同质群体的定向再分化。因此，本公开的目的还在于提供生成单细胞衍生化iPSC克隆系或来自这些克隆系的衍生细胞的方法和组合物，所述细胞在选定位点包含一个或几个遗传修饰，包括多核苷酸的***、缺失和取代，并且所述修饰在分化、去分化、重编程、扩增、传代和/或移植后在后续衍生化细胞中保留并保持功能。
本申请的一个方面提供了一种重编程非多能细胞以生成多能细胞或其群体的方法，该方法包括用一个或多个第一质粒转染非多能细胞，其中所述第一质粒包含复制起点和编码一种或多种重编程因子但不编码EBNA或其衍生物的多核苷酸；其中所述一个或多个第一质粒中的至少一个包含编码OCT4的多核苷酸；其中一个或多个第一质粒的引入诱导重编程过程；并且任选地向非多能细胞引入以下的一种：包含编码EBNA的核苷酸序列的第二质粒，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸；EBNA mRNA；和EBNA蛋白。然后培养经转染的细胞以生成重编程细胞，该重编程细胞包含相比于起始非多能细胞的形态变化，基本上不含EBNA，仍缺乏多能细胞形态并且不包含内源OCT4表达。将重编程细胞进一步培养足够的时间时，生成一个或多个多能细胞。本文提供的重编程方法将多能细胞暴露于外源转基因表达的可能性减到最低，这些外源转基因具有整合到细胞基因组中的潜力，并且再活化以在生成衍生细胞时引起去分化或在临床环境中使用时增加肿瘤发生的倾向。
在一个实施方案中，重编程方法包括首先将质粒组合引入非多能细胞以诱导重编程。所述质粒组合包含一个或多个第一质粒，其中第一质粒包含复制起点，和编码一种或多种重编程因子但不编码EBNA或其衍生物的多核苷酸，并且其中至少一个第一质粒包含编码OCT4的多核苷酸。包含所述一个或多个第一质粒的所述质粒组合还包含第二质粒，其包含编码EBNA的核苷酸序列，但不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸。将质粒***引入非多能细胞中诱导重编程后，培养细胞以生成重编程细胞，该重编程细胞包含相比于起始非多能细胞开始的形态变化，并向其中引入质粒组合。呈现形态变化的重编程细胞变得基本上不含EBNA，仍缺乏多能细胞形态；并且不包含内源OCT4表达。在提供的重编程方法中，将所述重编程细胞进一步培养足够的时间，以生成一个或多个多能细胞。在一些实施方案中，重编程细胞的培养是在包含TGFβ抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂中的至少一种的小分子化合物的存在下进行的。在一些实施方案中，小分子化合物包含TGFβ抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂的组合。
在一些实施方案中，上述通用方法还包括解离多能细胞以获得单细胞解离的多能细胞的步骤。在一些实施方案中，使单细胞解离的多能细胞悬浮在培养基中。在一些实施方案中，通过选择并分离表达一种或多种多能性标志物的细胞来分选所述单细胞解离的多能细胞以富集表达所选标志物的多能细胞。在一些其他实施方案中，在包含GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂中的至少一种的小分子化合物的存在下，培养悬浮、分选或从中富集的多能细胞或单个解离细胞以维持多能性。在一些实施方案中，长期多能性维持至少5、10、15或20代或更多。
在一些实施方案中，上述方法用于诱导体细胞、祖细胞或多潜能细胞的重编程。在该方法的一些实施方案中，用于重编程的非多能细胞是人细胞。在该方法的一些实施方案中，用于重编程的非多能细胞是免疫细胞。在一些其他实施方案中，用于重编程的免疫细胞可以是患者特异性的、药物反应特异性的或疾病状况特异性的。在一个实施方案中，当使用所公开的方法进行非多能细胞重编程时，重编程细胞所呈现的形态变化是MET的形态变化(间质-上皮转化)。
在所述方法的一个实施方案中，重编程细胞基本上不含第二质粒携带的EBNA。在一个实施方案中，重编程细胞基本上不含第二质粒。该方法的一些实施方案提供了已受质粒组合诱导约4至10天(即质粒转染后4至10天)、5至10天、6至10天或之间的任何天数的重编程细胞。该方法的一些实施方案提供了转染后4至12天或之间的任何天数的重编程细胞。该方法的又一些实施方案提供了转染后4至14天或之间的任何天数的重编程细胞。该方法的还有一些实施方案提供了转染后4至21天或4至25天或之间的任何天数的重编程细胞。
在一些实施方案中，例如，该方法产生的多能细胞与引入同时包含oriP和EBNA的其他质粒的细胞相比，具有降低的多能性逆转或自发分化。在一些其他实施方案中，所述方法产生基本上不含质粒组合的多核苷酸的多能细胞。在一些实施方案中，产生基本上不含质粒的多核苷酸的多能细胞，无需选择所述多能细胞或使所述多能细胞广泛传代。在一个实施方案中，该方法生成具有以下至少一种特性的多能细胞：高克隆性、遗传稳定性和基态多能性。在一些实施方案中，该方法生成包含与胚外细胞相关的再活化基因的多能细胞。
在一些实施方案中，该方法涉及使用具有高丢失率的第二质粒；第二质粒对EBNA的表达是短暂、瞬时且时序性的，这是因为EBNA会迅速丢失并在细胞质中表达，并且在出现iPSC形态或内源多能性基因表达之前。在该方法的一些实施方案中，第一和第二质粒中分别包含的复制起点和/或EBNA是基于EBV的。在该方法的一些实施例中，重编程过程是在无饲养层条件下，即在无饲养层的培养基中进行的。在该方法的一些其他实施方案中，培养基中包含的ROCK抑制剂是噻唑菌素(thiazovivin)。
本申请的另一个方面提供了一种在用一个或多个第一质粒转染非多能细胞后获得的重编程细胞或其群体，其中所述第一质粒包含复制起点和编码一种或多种重编程因子但不编码EBNA或其衍生物的多核苷酸；其中所述一个或多个第一质粒中的至少一个包含编码OCT4的多核苷酸；并且任选地用以下的一种转染：包含编码EBNA的核苷酸序列的第二质粒，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸；EBNA mRNA；和EBNA蛋白；其中重编程细胞包含相比于引入质粒组合之前的非多能细胞的形态变化，并且基本上不含EBNA或其衍生物；其中所述重编程细胞不包含：(i)多能细胞形态；(ii)内源OCT4表达；并且其中所述重编程细胞能够在给定足够时间时建立稳定的多能性以产生多能细胞。在一个实施方案中，使用包含编码EBNA的核苷酸序列的第二质粒产生重编程细胞和iPSC，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸。在一个实施方案中，代替第二质粒，将EBNA mRNA与所述一个或多个第一质粒一起用于诱导重编程并产生具有所公开的特性的重编程细胞和iPSC。在另一个实施方案中，将EBNA蛋白或多肽与所述一个或多个第一质粒一起用于诱导重编程并产生具有所公开的特性的重编程细胞和iPSC。
在重编程细胞或其群体的一些实施方案中，已经将该细胞诱导了约4至10天、12天、14天、21天、25天或之间的任何天数。在一些实施方案中，在TGFβ抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂的存在下培养重编程细胞或其群体。在一些其他实施方案中，重编程细胞或其群体是从成纤维细胞诱导的，因此重编程的形态变化包括MET的形态变化(间质-上皮转化)。在一些实施方案中，重编程细胞或其群体基本上不含第一和第二质粒。在一些实施方案中，重编程细胞产生基本上不含质粒的多核苷酸的多能细胞，无需选择所述多能细胞或使所述多能细胞广泛传代。在一些其他实施方案中，重编程细胞或其群体产生了例如与引入包含oriP和EBNA的其他质粒的细胞相比，具有降低的多能性逆转或自发分化的多能细胞。在又一些其他实施方案中，重编程细胞或其群体产生具有以下至少一种特性的多能细胞：高克隆性；遗传稳定性和基态多能性。在另一个实施方案中，重编程细胞或其群体产生包含与胚外细胞相关的再活化基因的多能细胞。
因此，本申请的另一方面提供了一种包含如上所述的重编程细胞或其群体的组合物。在一些实施方案中，该组合物还包含含有TGFβ抑制剂、GSK3抑制剂，MEK抑制剂和ROCK抑制剂的培养基。在一个实施方案中，组合物的培养基中包含的ROCK抑制剂是噻唑菌素。在其他实施例中，该培养基是无培养层的。本申请的另一方面提供了通过本文公开的所述方法产生的分离的多能细胞或多能细胞系。在一些实施方案中，这样产生的分离的多能细胞或多能细胞系可以进一步基因组改造和/或再分化为非天然衍生化细胞。在一些实施方案中，由分离的多能细胞或多能细胞系再分化的非天然衍生化细胞是免疫细胞，包括但不限于CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞或祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞和免疫调节细胞。在一些实施方案中，衍生自多能细胞或多能细胞系的非天然细胞是具有以下至少一种特性的复原细胞：与其天然的细胞对应物相比，异染色质总体增加；线粒体功能改善；DNA损伤反应增强；端粒伸长和短端粒百分比降低；衰老细胞的比例减少；并且增殖、存活、持久性或记忆类功能的潜力更高。
本申请的另一方面提供了用于治疗用途的组合物，其包含通过本文所述的方法获得的多能细胞，和任选地一种或多种附加治疗剂。还提供了一种用于治疗用途的组合物，其包含通过如本文所述的方法获得的权利要求的基因组工程改造的多能细胞或衍生化非天然细胞，以及任选地一种或多种附加治疗剂。在一些实施方案中，这些用于治疗用途的组合物用于治疗有需要的受试者。本申请还提供了一种用于制造应用于基于细胞的疗法的多能细胞的组合物。在一些实施方案中，多能细胞是同种异体的，即，由来自受试者的细胞重编程的，所述受试者不同于将要接受基于细胞的疗法的受试者；或是自体的，即由来自将要接受基于细胞的疗法的同一受试者的细胞重编程的。
提供了一种包含通过所述方法获得的多能细胞的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒中包含的多能细胞是经过基因组改造的。还提供了一种包含由通过所述方法获得的多能细胞衍生的非天然细胞的试剂盒。
本申请的另一方面提供了一种用于在非多能细胞中引发重编程的体外***，其中该***包含：(1)一个或多个第一质粒，其中所述第一质粒包含复制起点和编码一种或多种重编程因子但不编码EBNA或其衍生物的多核苷酸；其中所述一个或多个第一质粒中的至少一个包含编码OCT4的多核苷酸；以及任选地(2)以下的一种：(i)包含编码EBNA的核苷酸序列的第二质粒，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸；(ii)EBNA mRNA；和(iii)EBNA蛋白。在一些实施方案中，该***的第二质粒具有高丢失率；并且其中第二质粒对EBNA的表达是短暂、瞬时和时序性的。在一些其他实施方案中，该***不在细胞核中提供EBNA复制和/或连续表达。在一个实施方案中，该***能够在短时间内且在出现多能细胞形态和诱导内源多能性基因表达之前实现EBNA的瞬时/细胞质表达。在一些实施方案中，EBNA表达的短持续时间为转染后约4、5、6、7或8天，但不超过转染后14、15、16、17、18、20、21、22、22、23、24或25天。在一些其他实施方案中，所述***还能够在短时间内且在出现多能细胞形态和诱导内源多能性基因表达之前实现一种或多种重编程因子的瞬时/细胞质表达。
在所述***的一个实施方案中，第一质粒的复制起点是选自由多瘤病毒科(Polyomavirinae)病毒、***瘤病毒科(Papillomavirinae)病毒和γ疱疹病毒亚科(Gammaherpesvirinae)病毒组成的组的复制起点。在一些实施方案中，复制起点是选自由SV40、BK病毒(BKV)、牛***瘤病毒(BPV)或爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)组成的组的复制起点。在一个特定的实施方案中，所述复制起点对应于，或衍生自野生型EBV复制起点。在一些其他实施方案中，所述***中第二质粒的EBNA是基于EBV的。在一些实施方案中，所述***提供的一个或多个第一质粒共同包含编码重编程因子的多核苷酸，所述重编程因子包括OCT4、SOX2、NANOG、KLF、LIN28、c-MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、HESRG、CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3和L1TD1中的一种或多种。在一些实施方案中，编码重编程因子的所述多核苷酸包含在第一质粒中的多顺反子构建体或非多顺反子构建体中。在多顺反子构建体的一个实施方案中，所述多顺反子构建体包含单个开放阅读框或多个开放阅读框。在所述***包含两个或更多个第一质粒的实施方案中，每个第一质粒均可包含由多核苷酸的至少一个拷贝编码的相同或不同的重编程因子。在所述***包含两个或更多个第一质粒的那些实施方案中，所述***提供对重编程因子化学计量的控制。
在所述***的一些实施方案中，所述第一质粒包含多于一个编码重编程因子的多核苷酸，其中所述相邻的多核苷酸操作性地通过编码自我裂解肽或IRES的接头序列连接。在一个实施方案中，所述自我裂解肽是选自包括F2A、E2A、P2A和T2A的组的2A肽。在另一个实施方案中，包含在第一质粒构建体中的所述2A肽可以相同或不同。在所述***的质粒包含多个2A的另一个实施方案中，相邻位置的两个2A肽是不同的。在所述***的一些其他实施方案中，所述第一质粒和所述第二质粒各自包含一个或多个用于表达重编程因子和EBNA的启动子，并且所述一个或多个启动子包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC，以及其他合适的组成型、诱导型、内源调控型或时间、组织或细胞类型特异性的启动子中的至少一种。在一个实施方案中，所述第一质粒和所述第二质粒各自均包含CAG启动子。
还提供了包含如本文所述的体外***的试剂盒。
通过以下结合附图所做的描述，本发明方法和组合物的使用的各种目的和优点将变得显而易见，在附图中，通过说明和示例的方式阐述了本发明的某些实施方案。
附图说明
专利或申请文件含有至少一张彩色附图。专利局将根据需要和必要费用的支付情况，提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1示出了在STTR(短暂的瞬时和时序性重编程)***中使用的载体1和载体2的DNA构建体，以及与载体1和2一起用于EmTTR(EBNA介导的瞬时和时序性重编程)***中的载体3的图解。
图2示出了使用EmTTR***转染成纤维细胞后15天SSEA4+/TRA181+多能性标志物表达的流式细胞术分析。
图3示出了转染后30天的多能性标志物OCT4、NANOG、TRA181和SSEA4染色，以证实使用EmTTR***出现了表达iPSC标志物的集落。
图4示出了使用STTR***转染成纤维细胞后15天对SSEA4+/TRA181+多能性标志物表达的流式细胞术分析。
图5示出了转染后30天的多能性标志物OCT4、NANOG、TRA181和SSEA4染色，以证实使用STTR***出现了表达iPSC标志物的集落。
图6显示衍生自STTR的大多数群体都维持了所有三种多能性标志物的表达，而转染后25天CD30表达的大幅下降表明，EmTTR诱导的群体似乎正在丧失多能性。
图7A-7B显示在D28上连续传代后，从EmTTR和STTR获得的iPSC集落中多能性的稳定性不同。A：两个群体中iPSC集落的形态和培养物中的分化集群。B：STTR群体保持iPSC集落的自发分化程度最小，而EmTTR群体显示出高水平的自发分化，仅存在少量iPSC集落。
图8示出了载体2中携带的EBNA的基因表达分析以及在使用STTR***对成纤维细胞进行细胞重编程期间细胞群体中的内源Oct4表达。
图9A-9D示出了使用STTR获得的用于多能性表达的iPSC的表征以及对小鼠畸胎瘤形成的证明。A.iPSC克隆物的相位图像。B.SSEA4+/TRA181+多能性标志物表达的流式分析。C.多能性标志物OCT4、NANOG、TRA181和SSEA4的克隆物的免疫荧光染色。D.iPSC克隆物分化为三个胚层的能力：内胚层、中胚层和外胚层。
图10示出了使用STTR***与其他重编程因子转染成纤维细胞后15天对SSEA4+/TRA181+多能性标志物表达的流式细胞术分析。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。出于本发明的目的，以下术语定义如下。冠词“一”、“一个(种)”和“所述(该)”在本文中用于指代一个或一个以上(即至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一个要素”意指一个要素或一个以上要素。
替代方案(例如“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一种、两者或其任何组合。术语“和/或”应理解为意指替代方案中的任一种或两者。
如本文所用，术语“约”或“大约”是指与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比，变化多达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施方案中，术语“约”或“大约”是指参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％左右的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围。
如本文所用，术语“大体上”或“基本上”是指与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施方案中，术语“基本上相同”或“大体上相同”是指与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度大致相同的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围。
如本文所用，术语“大体上上不含”和“基本上不含”可互换使用，并且当用于描述诸如细胞群体或培养基的组合物时，是指不含指定物质或其来源，例如95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含指定物质或其来源，或者通过常规方法无法检测到的组合物。术语组合物中“不含”或“基本上不含”某种成分或物质还意指此类成分或物质(1)不以任何浓度包含在组合物中，或(2)不包含在功能惰性的组合物中，但浓度较低。类似的含义可以适用于术语“不存在”，其中是指组合物中不存在特定物质或其来源。
如本文所用，术语“分离的”等是指已经与其原始环境分开的细胞或细胞群体，即分离的细胞的环境大体上不含在“未分离的”参考细胞存在的环境中发现的至少一种组分。该术语包括在其自然环境(例如组织、活检)中发现细胞时，从一些或所有组分中移出的细胞。该术语还包括在非天然存在的环境(例如培养物、细胞悬浮液)中发现细胞时，从至少一种、一些或全部组分中移出的细胞。因此，分离的细胞与至少一种组分部分或完全分开，所述组分包括在自然界发现时或在非天然存在的环境中生长、储存或生存时的其他物质、细胞或细胞群体。分离的细胞的具体实例包括部分纯化细胞、基本纯化细胞和在非天然存在的培养基中培养的细胞。分离的细胞可通过将所需细胞或其群体与环境中的其他物质或细胞分开，或从环境中去除一个或多个其他细胞群体或亚群而获得。
如本文所用，术语“纯化”等是指提高纯度。例如，可以将纯度提高到至少50％、60％,70％、80％、90％、95％、99％或100％。
在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含”、“包括”将被理解为暗示包括陈述的步骤或要素或步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或元素的组。在特定实施方案中，术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”是同义使用的。
“由......组成”意指包括且限于短语“由......组成”之后的内容。因此，短语“由......组成”表示所列出的要素是必需的或强制性的，并且不可以存在其他要素。
“基本上由......组成”意指包括该短语之后列出的所有要素，并且限于不干扰或不影响本公开中针对所列要素所规定的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由......组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但是没有其他要素是任选的，并且根据它们是否会影响所列要素的活性或作用，可以存在或可以不存在其他要素。
在整个说明书中，提及“一个实施方案”、“一实施方案”、“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某一实施方案”、“另外的实施方案”或“另一实施方案”或其组合是指：结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书中各处出现的前述短语不一定都是指同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，特定特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合。
术语“离体”通常是指在生物体外发生的活动，诸如在生物体外的人工环境中在活组织内或活组织上进行的实验或测量，优选对自然条件进行最小程度的改变。在特定的实施方案中，“离体”程序涉及取自生物体并在实验室设备中培养的活细胞或组织，通常在无菌条件下进行，并且通常持续数小时或长达约24小时，但包括长达48或72小时或更长时间，视情况而定。在某些实施方案中，可以收集和冷冻此类组织或细胞，然后解冻用于离体治疗。使用活细胞或组织进行的持续超过几天的组织培养实验或程序通常被认为是“体外”，但在某些实施方案中，该术语可以与离体互换使用。
术语“体内”通常是指在生物体内部发生的活动。
如本文所用，术语“重编程”或“去分化”或“增加细胞潜能”或“增加发育潜能”是指增加细胞多能性或使细胞去分化为低分化状态的方法或过程。例如，与非重编程状态下的相同细胞相比，具有增加的细胞多能性的细胞具有更高的发育可塑性(即，可以分化成更多细胞类型)。换句话说，已重编程的细胞是处于比非重编程状态的相同细胞更低的分化状态的细胞。与已重编程的细胞相反，“重编程细胞”是指正在进行重编程/去分化为多能状态的非多能细胞，其呈现出过渡形态(即形态变化)，但没有多能细胞的标志，包括多能干细胞形态或稳定的内源多能性基因表达，诸如OCT4、NANOG、SOX2、SSEA4、TRA181、CD30和/或CD50。重编程细胞的过渡形态将该细胞与重编程诱导之前的起始非多能细胞以及与具有胚胎干细胞标志形态的已重编程的细胞区分开。例如，当重编程成纤维细胞时，重编程细胞的形态变化包括MET(间质-上皮转化)。本领域技术人员容易理解和鉴定出经诱导重编程的各种类型的体细胞的此类过渡形态。在一些实施方案中，重编程细胞是已经被诱导重编程至少1、2、3、4、5、6、7、8天或更多天，但不超过21、22、24、26、28、30、32、35、40天或之间的任何天数的中间细胞，其中所述细胞尚未进入自我维持或自我持续的多能状态。当为细胞引入一种或多种重编程因子时，非多能细胞被诱导重编程。已被诱导重编程1、2、3或4天的重编程细胞是重编程因子转导1、2、3或4天后的细胞(转导当天是第0天)。与暴露于重编程因子外源表达之前的体细胞不同，重编程细胞可以使重编程过程进展达到稳定的多能状态，甚至在没有外源表达重编程因子存在时，只要给予足够时间也可以变成已重编程的细胞。
如本文所用，术语“诱导多能干细胞”或“iPSC”意指干细胞由分化的成体、新生儿或胎儿细胞产生，所述分化的成体、新生儿或胎儿细胞已经被诱导或改变(即，重编程)为能够分化成所有三个胚层或真皮层的组织：中胚层、内胚层和外胚层。
如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指胚胎胚泡的内细胞团的天然存在的多能干细胞。胚胎干细胞是多能的，在发育期间会产生三原胚层的所有衍生物：外胚层、内胚层和中胚层。它们不会产生胚外膜或胎盘，也不是全能的。
如本文所用，术语“多潜能干细胞”是指具有分化成一个或多个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)而不是全部三个胚层的细胞的发育潜力的细胞。因此，多潜能细胞也可以称为“部分分化的细胞”。多潜能细胞在本领域中是众所周知的，并且多潜能细胞的实例包括成体干细胞，诸如造血干细胞和神经干细胞。“多潜能”表示细胞可以形成给定谱系中许多类型的细胞，但不可以形成其他谱系的细胞。例如，多潜能造血细胞可以形成许多不同类型的血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)，但不能形成神经元。因此，术语“多潜能性”是指细胞发育潜力的程度低于全能和多能细胞的状态。
如本文所用，术语“多能”是指细胞形成身体或躯体的所有谱系(即，胚体)的能力。例如，胚胎干细胞是能够从三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)中的每一个形成细胞的一种类型的多能干细胞。多能性是发育潜能的连续体，范围从不能产生完整生物体的不完全或部分多能细胞(例如外胚层干细胞或EpiSC)到能够产生完整生物的更原始、更多能的细胞(例如，胚胎干细胞)。
多能性可以部分地通过评估细胞的多能性特征而确定。多能性特征包括但不限于：(i)多能干细胞形态；(ii)无限自我更新的潜力；(iii)多能干细胞标志物的表达，包括但不限于SSEA1(仅限小鼠)、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60、TRA1-81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30和/或CD50；(iv)分化成所有三个体细胞谱系(外胚层、中胚层和内胚层)的能力；(v)由三个体细胞谱系组成的畸胎瘤形成；以及(vi)由来自三个体细胞谱系的细胞组成的拟胚体的形成。
先前已经描述了两种类型的多能性：类似于晚期胚泡的外胚层干细胞(EpiSC)的“始发态”或“亚稳态”的多能性，和类似于早期/植入前胚泡的内细胞团的“原初态”或“基态”的多能性。虽然两种多能状态都表现出如上所述的特征，但原初态或基态相对于始发态的多能细胞还表现出：(i)女性细胞中X染色体的预灭活或再活化；(ii)在单细胞培养期间提高的克隆性和存活率；(iii)总体DNA甲基化减少；(iv)发育调控基因启动子上H3K27me3抑制性染色质标志物的沉积减少；以及(v)分化标志物的表达降低。通常认为将外源多能性基因引入体细胞，进行表达，然后使其沉默或将其从所得的多能细胞中移出的标准细胞重编程方法学具有始发态多能性的特征。在标准的多能细胞培养条件下，除非维持外源转基因表达(其中观察到基态特征)，否则此类细胞将保持为始发态。
如本文所用，术语“多能干细胞形态”是指胚胎干细胞的经典形态特征。正常的胚胎干细胞形态的特征是形状为圆形且紧凑，具有高的细胞核质比，明显存在的核仁和典型的细胞间间距。
“多能性因子”或“重编程因子”是指用于诱导或增加细胞发育潜能的试剂或试剂组合。多能性因子包括但不限于能够增加细胞发育潜能的多核苷酸、多肽和小分子。示例性的多能性因子包括例如转录因子OCT4和SOX2，以及小分子重编程剂，例如TGFβ抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂。
如本文所用，术语“分化”是非特化(“未定型”)或低特化细胞获得特化细胞(例如，血细胞或肌细胞)的特征的过程。分化或诱导分化的细胞是在细胞谱系中占据了特化(“定型”)位置的细胞。应用于分化过程时，术语“定型”是指在分化途径中进行到正常情况下将继续分化成特定细胞类型或细胞类型子集的细胞，并且在正常情况下无法分化成不同的细胞类型或复原为低分化细胞类型的时候的细胞。
多能干细胞的分化需要改变培养***，诸如改变培养基中的刺激剂或细胞的物理状态。最常规的策略是利用形成的拟胚体(EB)作为常见且关键的中间产物来启动谱系特异性分化。“拟胚体”是三维集群，已证明可模拟胚胎发育，因为它们在其三维区域内产生了许多谱系。在整个分化过程中，通常数小时至数天，简单的EB(例如，引发分化的聚集多能干细胞)继续成熟化并发育成囊性EB，此时通常数天至数周，它们进一步加工以继续分化。EB的形成是通过使多能干细胞在三维多层细胞集群中彼此靠近而起始的，通常这是通过以下几种方法之一实现的，所述方法包括使多能细胞在液滴中沉淀，将细胞沉淀到“U”底孔板中或通过机械搅拌。为了促进EB发育，多能干细胞聚集体需要进一步的分化提示，因为维持在多能培养维持培养基中的聚集体不能形成适当的EB。因而，多能干细胞聚集体需要转移至为所选谱系提供引发提示的培养基中。基于EB的多能干细胞培养通常会产生分化的细胞群体(外胚层、中胚层和内胚层胚层)，并在EB细胞集群内适度增殖。尽管证明可以促进细胞分化，但是由于在三维结构中的细胞暴露与来自环境的分化提示不一致，EB会产生处于可变分化状态的异种细胞。另外，很难产生和维持EB。而且，通过EB进行的细胞分化伴随适度的细胞扩增，这也导致分化效率较低。
相比之下，不同于“EB形成”的“聚集体形成”可用于扩增多能干细胞衍生的细胞的群体。例如，在基于聚集体的多能干细胞扩增期间，选择培养基以维持增殖和多能性。细胞增殖通常会增加形成较大聚集体的聚集体的大小，这些聚集体可常规地机械或酶促解离成较小的聚集体，以维持培养物中的细胞增殖并增加细胞数量。与EB培养不同，在维持培养物的聚集体中培养的细胞保持多能性标志物。多能干细胞聚集体需要进一步的分化提示才能诱导分化。
如本文所用，“单层分化”是指不同于通过三维多层细胞集群的分化即“EB形成”的分化方法的术语。在本文公开的其他优点中，单层分化避免了分化起始所需的EB形成。因为单层培养不能模拟胚胎发育，诸如EB形成，所以与EB中所有三个胚层分化相比，向特定谱系的分化被视为最小。
如本文所用，“解离的”细胞是指已经从其他细胞或表面(例如，培养板表面)基本分开或纯化的细胞。例如，可以通过机械或酶促方法将细胞从动物或组织解离。可替代地，体外聚集的细胞可以彼此解离，诸如通过酶促或机械方式解离成集群、单个细胞或单个细胞和集群的混合物的悬浮液。在另一个替代性实施方案中，粘附细胞从培养板或其他表面解离。因此，解离可涉及破坏细胞与细胞外基质(ECM)和衬底(例如，培养表面)的相互作用，或破坏细胞之间的ECM。
如本文所用，“饲养层细胞”或“饲养层”是描述一种类型的细胞的术语，该类型的细胞与第二类型的细胞共培养以提供第二类型的细胞可以在其中生长的环境，因为饲养层细胞提供支持第二细胞类型的生长因子和营养物。饲养层细胞任选地与它们所支持的细胞来自不同的物种。例如，某些类型的人类细胞，包括干细胞，可以受到小鼠胚胎成纤维细胞或永生化小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养物的支持。通常当与其他细胞共培养时通过辐射或用抗有丝***剂如丝裂霉素处理来灭活饲养层细胞，以防止它们使它们所支持的细胞过度生长。饲养层细胞可以包括内皮细胞、基质细胞(例如，上皮细胞或成纤维细胞)和白血病细胞。在不限制前述内容的情况下，一种特定的饲养层细胞类型可以是人类饲养层，诸如人皮肤成纤维细胞。另一种饲养层细胞类型可以是小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。一般而言，各种饲养层细胞可以部分地用于维持多能性，直接向某些谱系分化并促进成熟化为特化细胞类型，诸如效应细胞。
如本文所用，“无饲养层”(FF)环境是指基本上不含饲养层细胞和/或尚未通过培育饲养层细胞进行预先调节的环境诸如培养条件、细胞培养物或培养基。“预先调节的”培养基是指将饲养层细胞在该培养基中培育了一段时间，例如至少一天后收获的培养基。预先调节的培养基含有许多介体物质，包括生长因子和饲养层细胞分泌的细胞因子。在一些实施方案中，无饲养层的环境既不含饲养层细胞，也没有通过培养饲养层细胞进行预处理。饲养层细胞包括但不限于基质细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、人成纤维细胞、角质形成细胞和胚胎干细胞。
“培养”或“细胞培养”是指细胞在体外环境中的维持、生长和/或分化。“细胞培养基”、“培养基”(在每种情况下均为单一“培养基”)、“补充剂”和“培养基补充剂”是指培育细胞培养物的营养组合物。
“培育”或“维持”是指在组织或身体外部，例如在无菌塑料(或涂层塑料)细胞培养皿或烧瓶中支撑、繁殖(生长)和/或分化细胞。“培育”或“维持”可以利用培养基作为营养物、激素和/或其他有助于细胞增殖和/或支撑的因子的来源。
如本文所用，“传代(passage)”或“传代(passaging)”是指当细胞已经增殖到所需程度时，通过将细胞细分并平板接种到多个细胞培养表面或容器中来***培养的细胞的动作。在一些实施方案中，“传代(passage)”或“传代(passaging)”是指细分、稀释和平板接种细胞。当细胞从原代培养表面或容器传代到后续的一组表面或容器中时，后续培养物在本文中可称为“继代培养物”或“第一代”等。每个细分和平板接种到新的培养容器的动作均可被视为传代。在一些实施方案中，每1、2、3、4、5、6、7天或更多天使培养的细胞传代。在一些实施方案中，重编程后最初选择的iPSC每3-7天传代一次。
如在iPSC及从中分化的衍生化非多能细胞的基因组编辑或修饰，或非多能细胞和由其重编程的衍生化iPSC的基因组编辑或修饰的情况下所用，“功能性”是指(1)在基因水平上-成功敲入、敲除、敲减基因表达、转基因或受控的基因表达，诸如在所需细胞发育阶段的诱导型或时序性表达，这通过直接的基因组编辑或修饰，或通过经由从最初进行基因组工程改造的起始细胞分化或重编程进行“传代”来实现；或(2)在细胞水平上-经由以下方式成功去除、增加或改变细胞功能/特征：(i)在所述细胞中通过直接基因组编辑获得的基因表达修饰，(ii)通过经由从最初进行基因组工程改造的起始细胞分化或重编程进行“传代”在所述细胞中维持的基因表达修饰；(iii)由于基因表达修饰而在所述细胞中进行的下游基因调控，其仅出现在所述细胞的早期发育阶段，或仅出现在经由分化或重编程而产生所述细胞的起始细胞中；或(iv)在最初在iPSC、祖细胞或去分化细胞来源进行的基因组编辑或修饰衍生的成熟细胞产物中展示的增强或新获得的细胞功能或属性。
如本文所用，术语“遗传印记”是指有助于源细胞或iPSC中的优先治疗属性，并且可保留在源细胞衍生的iPSC和/或iPSC来源的非天然造血谱系细胞中的遗传或表观遗传信息。如本文所用，“源细胞”是可以用于通过重编程产生iPSC的非多能细胞，并且源细胞衍生的iPSC可以进一步分化为特定细胞类型，包括任何造血谱系细胞。根据上下文，源细胞衍生的iPSC及其分化的细胞有时统称为“衍生化细胞”。如本文所用，通过对供体、疾病或治疗反应特异性的选定源细胞重编程，或通过使用基因组编辑将遗传修饰的形式引入iPSC中，将赋予优先治疗属性的遗传印记并入iPSC中。在从特别选择的供体、疾病或治疗环境中获得的源细胞方面，有助于优先治疗属性的遗传印记可以包括表现出无论是否鉴定出潜在的分子事件都传代给选定源细胞的衍生细胞的可保留表型即优先治疗属性的任何特定于环境的遗传或表观遗传修饰。供体、疾病或治疗反应特异性源细胞可包含可保留在iPSC和衍生化造血谱系细胞中的遗传印记，所述遗传印记包括但不限于预先排列的单特异性TCR，例如来自病毒特异性T细胞或不变的自然杀伤T(iNKT)细胞；可追踪且理想的遗传多态性，例如，在选定供体中编码高亲和力CD16受体的点突变的纯合子；以及预定的HLA需求，即表现出单倍型且群体数量增加的选定的HLA匹配的供体细胞。如本文所用，优先治疗属性包括衍生化细胞的改善的移植、运输、归巢、存活力、自我更新、持久性、免疫反应调控和调节、存活和细胞毒性。优先治疗属性也可能与抗原靶向受体的表达；HLA呈递或其缺乏；对肿瘤微环境的抗性；旁观免疫细胞的诱导和免疫调节；提高的靶标特异性和降低的瘤外作用；对化学疗法等治疗的抗性有关。
如本文所用，“遗传修饰”是指基因编辑，包括(1)由重排、突变、遗传印迹和/或表观遗传修饰天然衍生的，或(2)通过在细胞基因组中进行***、缺失或取代进行基因组工程改造获得的那些基因编辑。如本文所用，遗传修饰还包括源特异性免疫细胞的一种或多种可保留的治疗属性，所述免疫细胞是供体、疾病或治疗反应特异性的。
如本文所用，术语“增强的治疗特性”是指与相同普通细胞类型的典型细胞相比增强的细胞治疗特性。在免疫细胞的情况下，例如，与典型、未修饰的和/或天然存在的NK细胞相比，具有“增强的治疗特性”的NK细胞将具有增强、改善和/或加强的治疗特性。免疫细胞的治疗特性可以包括，但不限于，细胞移植、运输、归巢、存活力、自我更新、持久性、免疫反应调控和调节、存活和细胞毒性。免疫细胞的治疗特性也可通过抗原靶向受体的表达；HLA呈递或其缺乏；对肿瘤微环境的抗性；旁观免疫细胞的诱导和免疫调节；提高的靶标特异性和降低的瘤外作用；对化学疗法等治疗的抗性来表现。
“整合”意指将构建体的一个或多个核苷酸稳定地***细胞基因组中，即与细胞染色体DNA内的核酸序列共价连接。“靶向整合”意指将构建体的核苷酸***细胞染色体或线粒体DNA中的预选位点或“整合位点”。如本文所用术语“整合”还指涉及在整合位点***构建体的一个或多个外源序列或核苷酸，有或无内源序列或核苷酸缺失的过程。在***位点存在缺失的情况下，“整合”还可包括用***的一个或多个核苷酸置换内源序列或缺失的核苷酸。
“构建体”是指包含要在体外或体内递送至宿主细胞的多核苷酸的大分子或分子复合物。如本文所用，“载体”是指能够指导外源遗传物质向靶细胞的递送或转移的任何核酸构建体，核酸构建体可以在所述靶细胞中复制和/或表达。如本文所用，术语“载体”包括待递送的构建体。载体可以是线性或环状分子。载体可以是整合或非整合的。载体的主要类型包括但不限于质粒、附加型载体、病毒载体、粘粒和人工染色体。病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体等。
如本文所用，术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列，例如基因、cDNA或mRNA，在生物过程中用作合成具有限定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列及其产生的生物学特性的其他聚合物和大分子的模板的固有特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物***中产生该蛋白质，则该基因编码该蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cDNA转录模板的非编码链都可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
如本文所用，术语“外源”意图是指将参考分子或参考活性引入宿主细胞中。该分子可以例如通过将编码核酸引入宿主遗传物质中来引入，例如通过整合到宿主染色体中或作为非染色体遗传物质例如质粒来引入。因此，当在提及编码核酸的表达时使用时，该术语是指将编码核酸以可表达形式引入细胞中。术语“内源”是指存在于宿主细胞中的参考分子或活性。类似地，当在提及编码核酸的表达时使用时，该术语是指包含在细胞内而不是外源引入的编码核酸的表达。
如本文所用，“目标基因”或“目标多核苷酸序列”是在置于适当调控序列的控制下时被转录成RNA并且在一些情况下在体内翻译成多肽的DNA序列。目标基因或多核苷酸可包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和合成DNA序列。例如，目标基因可以编码miRNA、shRNA、天然多肽(即在自然界中发现的多肽)或其片段；变体多肽(即，与天然多肽具有少于100％序列同一性的天然多肽突变体)或其片段；工程改造的多肽或多肽片段、治疗性肽或多肽、成像标志物、选择标志物等。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸的序列由四种核苷酸碱基组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；以及尿嘧啶(U)，当多核苷酸为RNA时代替胸腺嘧啶。多核苷酸可以包括基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸也指双链和单链分子两者。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指具有通过肽键共价连接的氨基酸残基的分子。多肽必须含有至少两个氨基酸，并且对多肽的最大氨基酸数没有限制。如本文所用，该术语既指短链，其在本领域中也通常称为肽、寡肽和寡聚物，也指较长链，其在本领域中通常称为多肽或蛋白质。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同型二聚体、异二聚体、多肽变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然多肽、重组多肽、合成多肽或其组合。
“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的缔合，使得一个核酸序列的功能受另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列或功能RNA的表达时(即，该编码序列或功能RNA在该启动子的转录控制下)时，该启动子是与该编码序列或功能RNA可操作地连接的。编码序列可以以有义或反义方向可操作地连接至调控序列。
如本文所用，术语“衔接子”是指能够在免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞)与肿瘤细胞之间形成连接；并激活免疫细胞的分子，例如融合多肽。衔接子的实例包括但不限于双特异性T细胞衔接子(BiTE)、双特异性杀伤细胞衔接子(BiKE)、三特异性杀伤细胞衔接子或多特异性杀伤细胞衔接子或与多种免疫细胞类型相容的通用衔接子。
如本文所用，术语“表面触发受体”是指能够触发或起始免疫反应例如细胞毒性反应的受体。表面触发受体可以进行工程改造，并且可以在效应细胞上表达，所述效应细胞例如T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，表面触发受体促进效应细胞与特定靶细胞例如肿瘤细胞之间的双特异性或多特异性抗体衔接，而与效应细胞的天然受体和细胞类型无关。使用这种方法，可以产生包含通用表面触发受体的iPSC，然后使这些iPSC分化成表达通用表面触发受体的各种效应细胞类型的群体。“通用”意指表面触发受体可以在任何效应细胞中表达并活化，而与细胞类型无关，并且所有表达通用受体的效应细胞都可以与具有表面触发受体可识别的相同表位的衔接子偶联或连接，而与衔接子的肿瘤结合特异性无关。在一些实施方案中，具有相同肿瘤靶向特异性的衔接子用于与通用表面触发受体偶联。在一些实施方案中，具有不同肿瘤靶向特异性的衔接子用于与通用表面触发受体偶联。以内，一种或多种效应细胞类型可以在某些情况下参与杀伤一种特定类型的肿瘤细胞，而在其他一些情况下参与杀伤两种或更多种类型的肿瘤。表面触发受体通常包含用于效应细胞激活的共刺激结构域和对衔接子表位有特异性的抗表位。双特异性衔接子一端对表面触发受体的抗表位具有特异性，而另一端对肿瘤抗原具有特异性。
如本文所用，术语“安全开关蛋白”是指设计用于防止细胞疗法的潜在毒性或其他不良影响的工程改造的蛋白质。在一些情况下，安全开关蛋白表达受条件控制以解决已将编码安全开关蛋白的基因永久性地并入到其基因组中的移植的工程化细胞的安全性问题。这种条件性调控可能是可变的，并且可包括通过小分子介导的翻译后激活以及组织特异性和/或时序性转录调控进行的控制。安全开关可以介导凋亡的诱导、蛋白合成的抑制、DNA复制、生长停滞、转录和转录后遗传调控和/或抗体介导的耗竭。在一些情况下，安全开关蛋白受外源分子(例如前药)激活，该外源分子在激活时会触发治疗性细胞的凋亡和/或细胞死亡。安全开关蛋白的实例包括但不限于***基因如半胱天冬酶9(或半胱天冬酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、B细胞CD20、改性EGFR及其任何组合。在这种策略中，在发生不良事件时施用的前药会被***基因产物激活，并杀伤转导的细胞。
如本文所用，术语“药物活性蛋白或肽”是指能够对生物体实现生物学和/或药学作用的蛋白或肽。药物活性蛋白对疾病具有治愈性或姑息性，并且可以施用以改善、缓解、减轻、逆转或降低疾病的严重程度。药物活性蛋白还具有预防性，并用于预防疾病的发作或在此类疾病或病理状况出现时降低其严重程度。药物活性蛋白包括完整的蛋白质或肽或其药物活性片段。它还包括所述蛋白质或肽的药物活性类似物或所述蛋白质或肽的片段的类似物。术语药物活性蛋白还指协同或协作作用以提供治疗益处的多种蛋白质或肽。药物活性蛋白或肽的实例包括但不限于，受体、结合蛋白、转录和翻译因子、肿瘤生长抑制蛋白、抗体或其片段、生长因子和/或细胞因子。
如本文所用，术语“信号传导分子”是指调节、参与、抑制、激活、减少或增加细胞信号转导的任何分子。信号转导是指沿着最终在细胞中触发生物化学事件的途径，通过募集蛋白质复合物，以化学修饰的形式传输分子信号。信号转导途径是本领域众所周知的，包括但不限于G蛋白偶联受体信号传导、酪氨酸激酶受体信号传导、整联蛋白信号传导、toll门控信号传导、配体门控离子通道信号传导、ERK/MAPK信号传导途径、Wnt信号传导途径、cAMP依赖性途径和IP3/DAG信号传导途径。
如本文所用，术语“靶向模态”是指遗传并入细胞中以促进抗原和/或表位特异性的分子例如多肽，所述特异性包括但不限于i)与独特的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)有关的抗原特异性，ii)与单克隆抗体或双特异性衔接子有关的衔接子特异性，iii)靶向转化细胞，iv)靶向癌干细胞，v)在不存在特定抗原或表面分子的情况下的其他靶向策略。
如本文所用，术语“特异性的”或“特异性”可用于指分子例如受体或衔接子与靶分子选择性结合的能力，与非特异性或非选择性结合大不相同。
“HLA缺陷”，包括HLA I类缺陷或HLA II类缺陷，或两者兼有，是指缺少或不再维持或已降低包含HLA I类蛋白异二聚体和/或HLA II类异二聚体的完整MHC复合物的表面表达水平，使得减小或降低的水平低于其他细胞或合成方法天然可检测到的水平的细胞。HLA I类缺陷可以通过功能性缺失HLA I类基因座(染色体6p21)的任何区域，或缺失或降低HLA I类相关基因的表达水平来实现，这些相关基因包括但不限于β-2微球蛋白(B2M)基因、TAP 1基因、TAP 2基因和Tapasin。HLA II类缺陷可通过功能性缺失或减少HLA-II相关基因来实现，这些相关基因包括但不限于RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP。尚不清楚，在本发明之前，HLA复合物缺陷或改变的iPSC是否具有进入发育、成熟并产生功能分化细胞同时保持调节活性的能力。另外，尚不清楚在本发明之前，是否可将HLA复合物缺陷型分化细胞重编程为iPSC并维持为多能干细胞，同时具有HLA复合物缺陷型。细胞重编程、维持多能性和分化过程中的意外失败可能与以下方面有关，这些方面包括但不限于发育阶段特异性基因的表达或其缺失，HLA复合物呈递的要求，引入的表面表达形式的蛋白质脱落，对适当且高效的克隆重编程的需要，以及对重新配置分化方案的需要。
如本文所用，“经修饰的HLA缺陷型iPSC”是指通过引入表达以下蛋白质的基因进一步修饰的HLA缺陷型iPSC，所述蛋白质涉及但不限于改善的分化潜力、抗原靶向、抗原呈递、抗体识别、持久性、免疫逃逸、抑制抗性、增殖、共刺激、细胞因子刺激、细胞因子产生(自分泌或旁分泌)、趋化性和细胞毒性，诸如非经典HLA I类蛋白(例如HLA-E和HLA-G)、嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)，CD16 Fc受体、BCL11b、NOTCH、RUNX1、IL15、41BB、DAP10、DAP12、CD24、CD3z、41BBL、CD47、CD113和PDL1。“经修饰的HLA缺陷型”细胞也包括除iPSC以外的细胞。
“Fc受体”(缩写为FcR)是基于它们识别的抗体类型进行分类的。例如，那些结合最常见的抗体类别IgG的受体称为Fc-γ受体(FcγR)，结合IgA的受体称为Fc-α受体(FcαR)，结合IgE的受体称为Fc-ε受体(FcεR)。FcR的类型也通过表达它们的细胞(巨噬细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、T和B细胞)和每种受体的信号传导特性来区分。Fc-γ受体(FcγR)包括几个成员，FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)，这些成员由于它们的分子结构不同，而在抗体亲和力方面也不同。
CD16已被鉴定为两种同种型，即Fc受体FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b)。CD16a是由NK细胞表达的跨膜蛋白，其结合附着在靶细胞上的单体IgG来激活NK细胞并促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。如本文所用，“高亲和力CD16”、“不可裂解性CD16”或“高亲和力的不可裂解性CD16”是指CD16的变体。野生型CD16具有较低的亲和力，并受到胞外域脱落的影响，胞外域脱落是在NK细胞活化后调节白细胞上各种细胞表面分子的细胞表面密度的蛋白水解裂解过程。F176V和F158V是具有高亲和力的示例性CD16变体；而S197P变体是CD16不可裂解形式的实例。
如本文所用，术语“过继细胞疗法”是指基于细胞的免疫疗法，如本文所用，其涉及输注自体或同种异体淋巴细胞，诸如CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞或祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞或免疫调节细胞，这些细胞是经遗传修饰或未修饰的，在所述输注之前已经离体扩增的。
如本文所用，“治疗上足够的量”在其含义内包括它所指的特定治疗和/或药物组合物提供所需治疗效果的无毒但足够和/或有效的量。所需的确切量将因受试者而异，取决于诸如患者的总体健康状况、患者的年龄以及病状的分期和严重程度等因素。在特定的实施方案中，治疗上足够的量足以和/或有效地改善、减轻和/或改良与所治疗的受试者的疾病或病状相关的至少一种症状。
如本文所用，术语“受试者”是指任何动物，优选人类患者、家畜或其他家养动物。
如本文所用，术语“治疗”等在提到需要治疗性治疗的受试者使用时，是指获得所需药理和/或生理效果，包括但不限于实现疾病症状的改良或消除。就完全或部分地预防疾病或其症状而言，所述效果可以是预防性的，和/或就实现症状的改良或消除，或者提供对疾病和/或归因于该疾病的副作用的部分或完全治愈而言，所述效果可以是治疗性的。术语“治疗”包括对哺乳动物，特别是对人类的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防该疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病或阻止其发展；(c)减轻疾病，或引起疾病消退，或完全或部分消除疾病的症状；以及(d)使个体恢复到疾病前的状态，诸如重建造血***。
I.新型重编程***及其产生的细胞
通常，本公开提供了通过使非多能细胞与至少一种重编程因子接触并且任选地在TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合(FRM；表1)存在下起始的重编程过程。
Figure BDA0002443312760000231
本发明的一个方面提供了一种使用介导瞬时和时序性转基因表达的质粒***获得无足迹的iPSC的方法。所述质粒***包含一个或多个携带复制起点和编码重编程因子但不编码EBNA的多核苷酸的第一质粒(V1)，以及包含EBNA编码多核苷酸但不含复制起点或重编程因子编码序列的第二质粒(V2)。
质粒的组合能够在转导时时序性地在细胞中实现转基因(EBNA和外源重编程因子)的细胞质表达，并产生无EBNA的中间细胞群体，这些细胞呈现过渡形态或形态变化(例如间质-上皮转化(MET))，但缺乏任何多能细胞形态或内源多能性基因表达(诸如OCT4)，却能够进入稳定的自我维持多能状态。因此，将这种不同的细胞群体称为“重编程细胞”。在引入重编程因子之前，如本文所述的重编程细胞不仅在形态上而且在功能上都不同于体细胞，因为在支持重编程过程的培养条件(例如FMM)下，给定足够的时间段，它能够重编程为多能状态。因而，本公开的一个方面提供了具有过渡形态并且能够进行重编程过程以建立稳定的多能状态的无EBNA的重编程细胞。在一些实施方案中，无EBNA的重编程细胞不含转基因。因此，所得iPSC群体和iPSC无足迹，无需针对EBNA进行选择或连续传代以消除附加型重编程所需的EBNA和转基因。此外，使用该瞬时和时序性的短暂质粒***产生的iPSC具有至少一种特性，包括改善的克隆性和遗传稳定性、高同质性、高的正常核型率、逆转或自发分化最少；并且能够在有或无饲养层的条件下实现单细胞存活和分选、长期扩增和自我更新以及单层分化。
在本领域中普遍接受的是，外源引入的重编程因子需要表达至少10-12天才能产生iPSC(Okita等人,Science(2008)；322:949-953；Brambrink等人,Cell Stem Cell(2008)；2(2):151-159；Stadtfeld等人,Cell Stem Cell(2008)；2(3):230-240)。由于非整合病毒载体介导的基因表达的瞬时性，外源转录因子的腺病毒转导有时需要重复转染。另外，使用腺病毒方法的重编程效率在小鼠中仅为0.001–0.0001％(Stadtfeld等人,Science(2008)；322:945-946)，而在人细胞中为0.0002％(Zhou等人,Stem Cells(2009)；27:2667-2674)。在仙台病毒载体介导的重编程的情况下，多重转导是不必要的，因为该病毒载体可以在长时间内连续产生大量外源蛋白，从而对转基因表达产生一定的依赖性以维持多能性。仙台病毒可以在约25天内以0.1％-1％的较高效率重编程新生儿和成体成纤维细胞以及血细胞。但是，对于病毒而言从最近重编程的iPSC中完全消失需要约10代，这被认为是基于仙台的重编程的缺点，包括DNA整合的机会增加或转基因表达而非多能基因的内源性回路支持的iPSC样克隆物的选择(Fusaki等人,Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci.(2009)；85:348-362；Seki等人,Cell Stem Cell(2010)；7:11-14；Ban等人,PNAS(2011)；108:14234-14239)。
含有启动子和转基因的质粒，其核吸收较差，不可复制，并且从转染细胞中快速丢失。当用于产生iPS细胞时，已证实质粒载体，包括小环DNA载体(最小的质粒，不含细菌DNA)，在饲养层条件下产生重编程的细胞的效率低得无法接受，并且只有通过每天重复转染才能看到有效的重编程，但往往导致宿主基因组整合转染的转基因(Okita等人,Science(2008)；322:949-953:used standard plasmid with repeated daily transfection,andobserved genome integration；obtaining 1-4integration free clones out of 10E6cells；Narsinh等人,Nat Protoc.(2011)；6(1):78-88:效率为约0.005％)。
与质粒相比，附加体可以自主地在细胞质中或与***宿主细胞的染色体一起维持和复制。应用基于爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的附加型载体，大多数情况下已显示了附加型载体介导的细胞重编程。除目标外源基因外，基于EBV的附加型载体还包含编码爱泼斯坦-巴尔核抗原1(EBNA1)蛋白的多核苷酸，并携带源自EBV的复制起点(oriP)。EBNA与细胞染色体结合，从而实现载体的核定位以及oriP拴系至姐妹染色单体上。因此，稳定表达的EBNA与oriP共同发挥作用，以复制附加型载体并将其保留在***细胞的核中，从而在细胞中提供包括EBNA在内的外源基因的稳定长期表达，从而增加了转基因整合的可能性，因为附加型载体通常持续大约4-8周(Yates等人,1984,1985；Reisman等人,1985；Sugden等人,1985)。尽管oriP/EBNA附加型载体与质粒重编程相比提高了重编程效率，但仍处于0.006％-0.1％的不满意范围内(Malik等人,Methods Mol Biol.(2013)；997:23-33)。
除了在与oriP相同的载体中连续表达EBNA之外，EBNA在其中复制并转录，还可以通过在宿主细胞基因组中整合EBNA编码序列来提供稳定表达的EBNA，以提高含有oriP和转基因的载体的转染率(Mazda等人,1997,J.Immunol.Methods；204:143-151)。但是，这种设计，如果不对细胞进行额外操作，最终将无法达到获得无足迹多能细胞的目的。
在一些实施方案中，本发明的重编程***包含至少一个第一质粒和至少一个第二质粒，其中所述第一质粒具有提供oriP和一种或多种重编程因子但不提供EBNA的构建体；其中所述第二质粒具有提供EBNA但不提供oriP或重编程因子的构建体。在一些实施方案中，重编程***包含一个以上的第一质粒，其中每个第一质粒提供相同或不同的重编程因子或其组合。使用该质粒***的重编程与本领域已知的常规质粒重编程方法的不同之处在于，不需要多次转染细胞，不需要基因组整合转基因，而且具有更高的重编程效率。与附加型重编程相比，其中将EBNA和重编程因子置于相同的表达盒中并且在相同的载体中存在oriP，一些实施方案的质粒***在细胞核中不提供EBNA复制和/或EBNA和转基因的连续表达，但仅能在短时间内且在出现多能细胞形态和诱导内源多能性基因如OCT4表达之前实现瞬时/细胞质表达。因此，本公开提供了由早期(例如，典型的21-32天重编程过程的转染后4-6天左右)不含EBNA表达的重编程细胞产生的无足迹的iPSC，消除了对iPSC进行其他必要的阳性选择或连续传代，以在游离重编程中获得无足迹的iPSC。在一些实施方案中，EBNA表达的短持续时间为转染后约4、5、6、7或8天，但不超过转染后14、15、16、17、18、20、21、22、22、23、24或25天。
复制起点(oriP)是在DNA复制起始处或附近的位点，由两个顺式作用序列组成：FR(重复序列家族)充当EBNA(爱泼斯坦-巴尔核抗原)结合位点，也是顺式启动子的转录增强子；以及DS(二重对称元件)用于在EBNA结合FR后起始DNA合成，并且受宿主细胞复制***调控。EBNA与FR位点的结合会影响oriP质粒在每个细胞复制一次的周期后的有效分配，将oriP质粒定位于细胞核，并在亲代细胞***后将质粒保留在两个子细胞中。在一个实施方案中，oriP可以是乳多空病毒科(Papovaviridae)病毒或疱疹病毒科(Herpesviridae)病毒的复制起点。在一些实施方案中，oriP可以是多瘤病毒科(Polyomavirinae)病毒、***瘤病毒科(Papillomavirinae)病毒或γ疱疹病毒亚科(Gammaherpesvirinae)病毒的复制起点。在其他一些实施方案中，oriP可以是SV40、BK病毒(BKV)、牛***瘤病毒(BPV)或爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的复制起点。在一个实施方案中，oriP对应于或衍生自EBV的野生型复制起点。在一个实施方案中，EBNA是对应于与EBV的EBNA-1相对应的野生型蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登录号：P03211；SEQ ID NO:1)的多肽或与EBV的EBNA-1相对应的野生型蛋白的衍生物。EBNA-1的衍生物是相对于相应的野生型多肽具有经修饰的氨基酸序列的多肽，所述经修饰的氨基酸序列包括EBNA-1的一个或多个氨基酸的缺失、***或取代。在一个实施方案中，与野生型EBNA相比，EBNA的衍生物包括截短。在一个实施方案中，截短的EBNA蛋白具有SEQ ID NO:2的多肽。在其他实施方案中，EBNA-1的衍生物编码与EBNA-1中的残基约1至约90、残基约1至约40、残基约41至约90、残基约91至约324(GA富集重复区)、残基约325至约377、残基约378至约386、残基约451至约608和/或残基约609至约641具有至少80％的氨基酸序列同一性的蛋白质。
在本领域中已知用于干细胞重编程的重编程因子都可以与本发明的重编程***和方法一起使用。在一个实施方案中，重编程因子包括但不限于OCT4、SOX2、NANOG、KLF、LIN28、c-MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、HESRG,CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3和L1TD1。编码这些重编程因子的多核苷酸可以包含在含有oriP但不含EBNA的相同质粒构建体(即，相同的第一质粒)中。编码这些重编程因子的多核苷酸可以包含在各自含有oriP但不含EBNA的至少两个质粒构建体(即，多个第一质粒)中。编码这些重编程因子的多核苷酸可以包含在多顺反子构建体(即，受一个启动子控制的多个编码序列)或非多顺反子构建体(多个编码序列，其中一些受一个启动子控制而一些受不同启动子控制)中。该启动子可以是例如CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC，以及其他合适的组成型、诱导型、内源调控型或时间、组织或细胞类型特异性的启动子。在一个实施方案中，所述启动子是CAG。在另一个实施方案中，所述启动子是EF1α。在一些实施方案中，多顺反子构建体可以提供单个开放阅读框(例如，多个编码序列通过诸如2A的自我裂解肽编码序列操作性连接)或多个开放阅读框(例如，多个编码序列通过内部核糖体进入位点或IRES连接)。
在本申请的质粒***的一些实施方案中，一个或多个质粒构建体(第一质粒)共同包含编码选自以下的一种或多种重编程因子的多核苷酸：OCT4、SOX2、NANOG、KLF、LIN28、c-MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、HESRG、CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3和L1TD1。在一些实施方案中，***中仅有一个第一质粒构建体并且提供所有选定的重编程因子。在一些其他实施方案中，***中存在两个或更多个提供一种或多种重编程因子的第一质粒构建体，每个构建体均包含由至少一个多核苷酸拷贝编码的相同或不同的重编程因子。在一个实施方案中，***中的所述一个或多个第一质粒构建体至少包含编码OCT4的多核苷酸。在一个实施方案中，所述一个或多个第一质粒构建体共同包含至少两个编码OCT4的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述一个或多个第一质粒构建体共同包含编码OCT4和SOX2的多核苷酸。在一个实施方案中，所述一个或多个第一质粒构建体共同包含至少一个编码OCT4但不编码c-MYC的多核苷酸。在一些实施方案中，所述一个或多个第一质粒构建体共同包含至少两个编码OCT4的多核苷酸，以及一个或多个编码ECAT1、UTF1、ESRRB、HESRG、CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3和L1TD1中的至少一种的多核苷酸。
当第一质粒构建体包含多于一个编码重编程因子的多核苷酸时，相邻的多核苷酸通过编码自我裂解肽或IRES的接头序列操作性连接。自我裂解肽可以是2A肽。该2A肽可以衍生自FMDV(手足口病病毒)、ERAV(马甲型鼻炎病毒)、PTV-1(猪捷申病毒-1)或TaV(明脉扁刺蛾病毒)，分别称为F2A、E2A、P2A和T2A。第一质粒构建体中的多个2A肽可以相同或不同。在一些实施方案中，两个最邻近的2A肽是不同的，例如：RF-2A1-RF-2A2-RF-2A1，其中2A1和2A2是不同的。
可以预先构建第一质粒构建体的文库，其中每个构建体均含有一个或多个编码不同数量、类型和/或组合的重编程因子的多核苷酸。已知重编程是一种效率低下且随机性的过程，且等待时间较长。表达的时间和水平以及重编程因子的化学计量在重编程的不同阶段和进行重编程的细胞的中间状态下驱动重编程动力，并决定重编程的完成。重编程因子化学计量还影响重编程效率，并产生品质各异的iPSC，这些品质诸如始发态与基态多能性以及相关的生物学特性，包括iPSC的克隆性、自我更新、同质性和多能性维持(与自发分化相对比)。化学计量法测量反应过程中试剂之间的定量关系，并用于测定给定反应中所需试剂的量，有时还用于测定生成的产物的量。化学计量法同时考虑了试剂的化学计量的量或试剂的化学计量比，这是完成反应的最佳试剂量或最佳比率。本申请的一个方面提供了一种***和方法，其通过允许方便地从文库中选择一种或多种第一质粒，进行混合匹配，剂量调整和共转染来评估或利用重编程因子化学计量。
本发明的重编程***的第二质粒提供了包含启动子和编码EBNA的多核苷酸的表达盒，其中该表达盒和第二质粒都不包含任何编码重编程因子的多核苷酸。第二治疗中包含的启动子可以是例如CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC，以及其他合适的组成型、诱导型、内源调控型或时间、组织或细胞类型特异性的启动子。在一个实施方案中，所述启动子是CAG。在另一个实施方案中，所述启动子是EF1α。通过用上述至少一种第一质粒和第二质粒的组合共转染非多能细胞，将独立的EBNA和oriP以及至少一种重编程因子引入非多能细胞中，以起始重编程。
在一些实施方案中，在包含TGFβ受体/ALK抑制剂、MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的小分子化合物的组合的存在下起始重编程，并且在足够的时间段后产生iPSC。在一些实施方案中，重编程是在无饲养层的条件下进行的。在特定的实施方案中，无饲养层的环境基本上不含人饲养层细胞并且未经饲养层细胞预调节，所述饲养层细胞包括但不限于小鼠胚胎成纤维细胞、人成纤维细胞、角质形成细胞和胚胎干细胞。
在一些实施方案中，诱导约7至35天、10至32天、15至31天、约17至29天、约19至27天或约21至约25天后的细胞任选地进行解离，使得细胞通过酶促或机械方式解离为单细胞悬浮液。可以将解离的细胞重悬于任何合适的溶液或培养基中以维持细胞或进行细胞分选。在一些实施方案中，解离的单细胞悬浮液包含ROCK抑制剂。在一些其他实施方案中，解离的单细胞悬浮液包含GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂。在特定的实施方案中，单细胞悬浮液包含GSK3抑制剂、MEK抑制剂和Rock抑制剂，而缺乏TFGβ抑制剂。在某些实施方案中，GSK3抑制剂是CHIR99021，MEK抑制剂是PD0325901，和/或Rock抑制剂是噻唑菌素。
在一些实施方案中，可以进一步分选解离的单细胞悬浮液。在一个实施方案中，富集提供了一种在相对较短的时间内衍生克隆iPSC集落的方法，从而提高了iPSC产生的效率。富集可以包括通过鉴定和获得表达多能性标志物的细胞来分选细胞群，从而获得富集的多能细胞群体。另一种富集方法包括耗竭表达分化标志物的细胞、未重编程的细胞或非多能细胞。在一些实施方案中，用于分选的细胞是多能细胞。在一些实施方案中，用于分选的细胞是重编程细胞。在一些实施方案中，已诱导用于分选的细胞重编程至少1、2、3、4、5、6、7、8天或更多天，但不超过25、26、28、30、32、35、40天或之间的任何天数。在一些实施方案中，已诱导用于分选的细胞重编程约21至25天、约19至23天、约17至21天、约15至约19或约16至约18天。
可以通过任何合适的细胞分选方法来分选细胞，诸如通过磁珠或流式细胞术(FACS)分选。可以基于一种或多种多能性标志物对细胞进行分选，这些标志物包括但不限于SSEA3/4、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、KLF4、SSEA1(小鼠)、CD30、SSEA5、CD90和/或CD50的表达。在各种实施方案中，基于至少两个、至少三个或至少四个多能性标志物对细胞进行分选。在某些实施方案中，基于SSEA4的表达，并且在某些特定实施方案中，基于SSEA4与TRA1-81和/或TRA1-60组合的表达对细胞进行分选。在某些实施方案中，基于SSEA4、TRA1-81或TRA1-60和/或CD30的表达对细胞进行分选。在一个实施方案中，基于SSEA4、TRA1-81和CD30对细胞进行分选。在另一个实施方案中，基于SSEA4、TRA1-60和CD30对细胞进行分选。在某些实施方案中，首先使用一种或多种分化细胞的表面标志物(包括但不限于CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46和CD7)耗竭细胞中非重编程的细胞，然后富集多能标志物，诸如SSEA4、TRA1-81和/或CD30。
重编程后，iPSC得以维持、传代和扩增。在一些实施方案中，将iPSC作为单细胞在维持培养基例如表1所示的FMM中培养，即维持、传代和扩增更长的时间。已经证明，在FMM中培养的iPSC会继续维持其未分化的、基础或原初特性；基因组稳定性，无需进行培养物清洁或选择；并且容易产生所有三个体细胞谱系，通过类胚体或单层进行体外分化(不形成类胚体)；并通过畸胎瘤形成进行体内分化。参见例如，美国申请号61/947,979和美国专利申请公开号20170073643，其公开内容通过引用并入本文。适于使用本发明的重编程***和方法进行重编程的细胞通常包括任何非多能细胞。非多能细胞包括但不限于终末分化细胞；或多潜能或祖细胞，它们不能产生所有三种类型的胚层谱系细胞。在一些实施方案中，用于重编程的非多能细胞是原代细胞，即从人或动物组织直接分离的细胞。在一些实施方案中，用于重编程的非多能细胞是源特异性细胞，例如供体特异性、疾病特异性或治疗反应特异性。在一些实施方案中，用于重编程的非多能细胞是原代免疫细胞。在一些实施方案中，用于重编程的非多能细胞本身衍生自多能细胞，包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞。在一些实施方案中，用于重编程的非多能细胞是衍生化免疫细胞，例如，iPSC衍生的非天然T-或NK-样细胞。
在一些其他实施方案中，用于重编程的非多能细胞是经基因组修饰的原代或衍生细胞。非多能细胞中包含的遗传修饰包括基因组中的***、缺失或取代，这导致基因表达的敲入、敲除或敲减。用于重编程的非多能细胞中的修饰表达可以是组成型或诱导型的(例如，发育阶段、组织、细胞或诱导物特异性的)。在一些实施方案中，所述***或取代是基因座特异性靶向整合。在一些实施方案中，用于整合的所选基因座是安全港基因座或目标内源基因座。安全港基因座可包括AAVS1、CCR5、ROSA26、胶原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、GAPDH、TCR或RUNX1，以及其他满足基因组安全港标准的基因座。为了使整合位点成为潜在的安全港基因座，理想地需要满足以下标准，包括但不限于：通过序列注释判断，不存在调控元件或基因的破坏；是基因密集区中的基因间区域，或者是以相反方向转录的两个基因之间的会聚位置；保持距离以最大程度地降低载体编码的转录激活因子与相邻基因(尤其是癌症相关基因和微RNA基因)的启动子之间进行远程相互作用的可能性；并且具有明显的泛在转录活性，如广泛的时空表达序列标签(EST)表达模式所反映的那样，表明有泛在的转录活性。对于多能细胞而言，后一种特征尤其重要，在分化过程中，染色质重塑通常会导致一些基因座沉默而其他基因座可能激活。在适于外源***的区域内，选择用于***的精确基因座应该没有重复元件和保守性序列，并且可以容易地设计出用于扩增同源臂的引物。在一个实例中，使用本发明的***和方法进行重编程的非多能细胞是在内源TCR基因座处包含CAR的T细胞，并且由于CAR整合而破坏了TCR表达。
在一个实施方案中，对遗传修饰的非多能细胞进行重编程是为了获得包含相同遗传修饰的基因组工程改造的iPSC。因而，在一些其他实施方案中，可以在重编程之后，将一个或多个此类基因组编辑引入iPSC中以获得基因组工程改造的iPSC。在一个实施方案中，用于基因组编辑的iPSC是克隆系或克隆iPS细胞群体。
在一些实施方案中，包含一种或多种靶向遗传编辑的基因组工程改造的iPSC在包含MEKi、GSKi和ROCKi而不含或基本上不含TGFβ受体/ALK5抑制剂的培养基中维持、传代和扩增，其中iPSC在所选位点保留了完好和功能性的靶向编辑。在一些实施方案中，遗传编辑引入以下的一种或多种：安全开关蛋白、靶向模态、受体、信号传导分子、转录因子、药物活性蛋白或肽、药物靶标候选物以及促进植入、运输、归巢、肿瘤浸润、存活力、自我更新、持久性和/或多能细胞和/或其衍生细胞存活的蛋白。在一个实施方案中，基因组工程改造的iPSC包含一个或多个***基因介导的安全开关，包括但不限于半胱天冬酶9(或半胱天冬酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、B细胞CD20、改性EGFR及其任何组合。在一些实施方案中，基因组工程改造的iPSC具有至少一种基因组修饰，包括引入或增加的用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的嵌合受体、归巢受体、抗炎分子、免疫检查点蛋白、细胞因子/趋化因子诱饵受体、生长因子、改变的促炎细胞因子受体、CAR或表面触发受体的表达；或降低或沉默的共刺激基因的表达。在一些实施方案中，基因组工程改造的iPSC包含高亲和力和/或不可裂解的CD16作为靶向模态。在一些其他实施方案中，基因组工程改造的iPSC中包含的靶向模态是T细胞特异性或NK细胞特异性的或与T细胞和NK细胞均相容的嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，基因组工程改造的iPSC在一个或多个内源基因中包含一个或多个外源多核苷酸或***/缺失。在一些实施方案中，内源基因中包含的***/缺失导致基因表达的破坏。在一些实施方案中，内源基因中包含的***/缺失导致编辑基因的敲除。在一些实施方案中，内源基因中包含的***/缺失导致编辑基因的敲减。在一些实施方案中，在所选位点包含一个或多个外源多核苷酸的基因组工程改造的iPSC可以进一步在所选位点包含一种或多种靶向编辑，包括***/缺失。在一些实施方案中，***/缺失包含在与免疫反应调节和介导相关的一个或多个内源基因中。在一些实施方案中，***/缺失包含在一个或多个内源检查点基因中。在一些实施方案中，***/缺失包含在一个或多个内源性T细胞受体基因中。在一些实施方案中，***/缺失包含在一个或多个内源I类MHC抑制基因中。在一些实施方案中，***/缺失包含在与主要组织相容性复合物相关的一个或多个内源基因中。在一个实施方案中，经修饰的iPS细胞在B2M、TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、RFXANK、CIITA、RFX5、RFXAP以及染色体6p21区域中的任何HLA基因中的至少一个中包含缺失或表达降低。在另一个实施方案中，经修饰的iPS细胞包含引入或增加的HLA-E或HLA-G的表达。在一些其他实施方案中，基因组工程改造的iPS细胞包含中断的TCR基因座。
iPSC的各种靶向遗传编辑方法，尤其是在单细胞水平上用多基因，以多基因座靶向策略有效地工程改造iPSC的方法，包括例如国际申请公开号WO 2017/079673中描绘的方法，其公开内容通过引用并入本文。
本发明还提供了鉴定将体细胞重编程为低分化状态的试剂的方法，以及由此鉴定的试剂。在一个实施方案中，该方法包括使用本文公开的重编程组合物和方法对体细胞进行重编程，其中至少一种载体包含候选试剂；选择有多能性细胞形态出现和至少一种内源多能性基因如OCT4诱导表达的细胞。表达适当的选择标志物的细胞的存在表明该试剂对体细胞进行了重编程。出于本申请的目的，将此类试剂认为是重编程剂。在另一个实施方案中，该方法包括使用本文公开的重编程组合物和方法使体细胞与候选试剂接触，选择表达适当的选择标志物的细胞，并且评估这样选择的细胞的多能性特征。一组完整的多能性特征的存在表明该试剂将体细胞重编程为多能性。尽管通常它们是有机分子，包括小的有机化合物，但是用于本发明的候选试剂涵盖许多化学类别。在包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、核酸和衍生物、其结构类似物或组合的生物分子中也发现了候选试剂。候选试剂可以是天然产生的、重组的或在实验室设计的。候选试剂可以从微生物、动物或植物中分离，或者可以重组产生，或通过本领域已知的化学方法合成。在一些实施方案中，使用本发明的方法从合成或天然化合物的文库中分离候选试剂。例如，许多手段可用于多种有机化合物和生物分子的随机和定向合成，包括表达随机化寡核苷酸和寡肽。替代性地，可获得或容易产生呈细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的文库。另外，天然或合成产生的文库和化合物可通过常规的化学、物理和生物化学手段容易地进行改性，并且可用于产生组合文库。可以对已知药理剂进行直接或随机的化学改性，包括酰化、烷基化、酯化、酰胺化，以产生结构类似物。有许多可商购的化合物文库，包括例如ChemBridge DIVERSetTM。
以上提到的筛选方法是基于对细胞进行的测定。这些基于细胞的测定可以以本领域中已描述的高通量筛选(HTS)形式进行。例如，Stockwell等人描述了在涉及翻译后修饰的基于哺乳动物细胞的小型化测定中对小分子的高通量筛选(Stockwell等人，1999)。同样，Qian等人描述了基于白血病细胞的用于高通量筛选抗癌剂的测定(Qian等人，2001)。两个参考文献均整体并入本文。
II.体外获得的iPSC衍生细胞
在一些实施方案中，本发明进一步提供了衍生自使用如本文公开的***和方法获得的iPSC的非多能细胞。在一些实施方案中，通过靶向编辑iPSC或通过重编程具有位点特异性整合或***/缺失的基因组工程改造的非多能细胞，对用于生成衍生化非多能细胞的iPSC进行基因组工程改造。在一些实施方案中，iPSC衍生的非多能细胞是祖细胞或完全分化的细胞。在一些实施方案中，在基因组工程改造的iPSC中包含的保持相同靶向编辑的iPSC衍生化细胞是非天然的中胚层细胞、CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞或祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞、免疫调节细胞或任何胚层谱系的任何所需细胞。在一些实施方案中，iPSC衍生的非天然免疫调节细胞包括骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)、调节性巨噬细胞、调节性树突状细胞或间充质基质细胞，它们是NK、B和T细胞的有效免疫调节因子。
除了产生无数种难以通过从供体源分离而获得的某种类型或亚型的细胞外，还证实人iPSC衍生谱系表现出胎儿期细胞的特性，使得重编程过程不仅会重置细胞命运(从特化/分化到多能性)，而且不依赖于初始体细胞供体的年龄来重置供体细胞群体的实龄特征。除了在iPSC衍生谱系(包括神经细胞、心脏或胰腺细胞)中观察到的胎儿样特性外，细胞衰老标志物还显示出可测量的变化，表明重编程过程后来自iPSC的再分化细胞得以复原。在iPSC诱导并分化为iPSC衍生的成纤维细胞样细胞后，老年供体成纤维细胞群体中表达的年龄相关参数得以重置(Miller等人，2013)。由从T细胞克隆重编程的iPSC分化而来的iPSC衍生化抗原特异性T细胞与原始T细胞克隆相比，通过伸长的端粒展示出复原。全分化细胞中指示复原过程的其他变化包括但不限于异染色质的整体增加、线粒体功能改善(ROS减少、mtDNA突变减少、超微结构的存在)、DNA损伤反应增加、端粒伸长和短端粒的百分比减小以及衰老细胞的比例减小。(Nishimura等人,2013)。在这些年龄相关的各个方面中的阳性重置产生具有更高的增殖、存活、持久性和记忆样功能潜力的非天然细胞。因此，重编程和再分化介导的复原在完全分化的iPSC衍生细胞中赋予了许多分子、表型和功能特性，尽管它们在细胞谱系上具有相似性，但非天然特性将其与原代细胞区别开来。
用于获得iPSC衍生的造血细胞谱系的适用分化方法和组合物包括例如在国际申请号PCT/US2016/044122中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。如所提供的，用于产生造血细胞谱系的方法和组合物是通过衍生自多能干细胞(包括iPSC)的确定性生血内皮(HE)，在无血清、无饲养层和/或无基质的条件下以及在可扩展的单层培养平台中，无需形成EB。可以根据提供的方法使其分化的细胞范围从多能干细胞到定向为特定终末分化细胞和转分化细胞的祖细胞，各种谱系的细胞无需经过多能中间提即可直接转变到造血命运。类似地，通过干细胞分化产生的细胞范围从多潜能干细胞或祖细胞到最终分化的干细胞，以及所有介入的造血细胞谱系。
在单层培养中从多能干细胞中分化和扩增造血谱系细胞的方法包括使多能干细胞与BMP途径的激活剂和bFGF接触。如所提供的，获得了多能干细胞衍生的中胚层细胞并使其扩增而无需从多能干细胞形成拟胚体。然后使中胚层细胞与BMP途径激活剂、bFGF和WNT途径激活剂接触，以获得具有确定性生血内皮(HE)潜能的扩增中胚层细胞，而无需从多能干细胞形成拟胚体。通过随后与bFGF和任选地与ROCK抑制剂和/或WNT途径激活剂接触，具有确定的HE潜能的中胚层细胞分化为确定的HE细胞，其在分化过程中也进行扩增。
本文提供的用于获得造血谱系细胞的方法优于EB介导的多能干细胞分化，因为EB的形成导致中等至最小的细胞扩增，不允许单层培养，这对于需要群体中的细胞均质扩增和均质分化的许多应用很重要，费力且效率低。
所提供的单层分化平台利于向确定性生血内皮分化，从而导致造血干细胞和分化后代(例如T、B、NKT、NK细胞和调节细胞)的衍生化。单层分化策略将增强的分化效率与大规模扩增相结合，使得能够为各种治疗应用递送治疗上相关数目的多能干细胞衍生的造血细胞。此外，使用本文提供的方法进行的单层培养产生功能性造血谱系细胞，其能够进行各种体外分化、离体调节以及体内长期的造血自我更新、重建和移植。如所提供的，iPSC衍生化造血谱系细胞包括但不限于确定性生血内皮细胞、造血多潜能祖细胞、造血干细胞和祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)、调节性巨噬细胞、调节性树突状细胞和间充质基质细胞。
用于指导多能干细胞分化为确定的造血谱系细胞的方法，其中该方法包括：(i)使多能干细胞与包含BMP激活剂和任选地bFGF的组合物接触，以起始由多能干细胞分化中胚层细胞并扩增；(ii)使中胚层细胞与包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂的组合物接触，其中该组合物任选地不含TGFβ受体/ALK抑制剂，以起始从中胚层细胞分化具有确定的HE潜力的中胚层细胞并扩增；(iii)使具有确定的HE潜力的中胚层细胞与组合物接触，该组合物包含ROCK抑制剂；一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IGF、EPO、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；以及任选地Wnt途径激活剂，其中所述组合物任选地不含TGFβ受体/ALK抑制剂，以起始从具有确定性生血内皮潜力的多能干细胞衍生的中胚层细胞分化确定性生血内皮细胞并扩增。
在一些实施方案中，该方法还包括使多能干细胞与包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合物接触，其中该组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂，以接种并扩增多能干细胞。在一些实施方案中，多能干细胞是iPSC或原初iPSC或包含一种或多种遗传印迹的iPSC；并且iPSC中包含的所述一种或多种遗传印迹保留在从其分化的造血细胞中。在用于指导多能干细胞分化为造血谱系细胞的方法的一些实施方案中，多能干细胞向造血谱系细胞分化没有产生拟胚体，并且是单层培养形式。
在上述方法的一些实施方案中，获得的多能干细胞衍生的确定性生血内皮细胞是CD34+。在一些实施方案中，获得的确定性生血内皮细胞是CD34+CD43-。在一些实施方案中，确定性生血内皮细胞是CD34+CD43-CXCR4-CD73-。在一些实施方案中，确定性生血内皮细胞是CD34+CXCR4-CD73-。在一些实施方案中，确定性生血内皮细胞是CD34+CD43-CD93-。在一些实施方案中，确定性生血内皮细胞是CD34+CD93-。在一些实施方案中，确定性生血内皮细胞是CD34+CD93-CD73-。
在上述方法的一些实施方案中，该方法还包括(i)使多能干细胞衍生的确定性生血内皮与组合物接触，该组合物包含ROCK抑制剂；一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO和IL7的生长因子和细胞因子；以及任选地BMP激活剂；以起始确定性生血内皮细胞分化为前T细胞祖细胞；并且任选地，(ii)使前T细胞祖细胞与组合物接触，该组合物包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子，但不含VEGF、bFGF、TPO、BMP激活剂和ROCK抑制剂，以起始前T细胞祖细胞分化为T细胞祖细胞或T细胞。在该方法的一些实施方案中，多能干细胞衍生的T细胞祖细胞是CD34+CD45+CD7+。在该方法的一些实施方案中，多能干细胞衍生的T细胞祖细胞是CD45+CD7+。在一些实施方案中，多能干细胞衍生的T细胞包含比从供体来源分离的原代T细胞比例高得多的γδT细胞。
在用于指导多能干细胞分化为造血谱系细胞的上述方法的一些实施方案中，该方法还包括(i)使多能干细胞衍生的确定性生血内皮与组合物接触，该组合物包含ROCK抑制剂；一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子；以及任选地BMP激活剂；以起始确定性生血内皮细胞分化为前NK细胞祖细胞；并且任选地，(ii)使多能干细胞衍生的前NK细胞祖细胞与组合物接触，该组合物包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，其中培养基不含VEGF、bFGF、TPO、BMP激活剂和ROCK抑制剂，以起始前NK细胞祖细胞分化为NK细胞祖细胞或NK细胞。在一些实施方案中，多能干细胞衍生的NK祖细胞是CD3-CD45+CD56+CD7+。在一些实施方案中，多能干细胞衍生的NK细胞是CD3-CD45+CD56+。在一些实施方案中，多能干细胞衍生的NK细胞任选地进一步由NKp46(CD335)、NKp30(CD337)、DNAM-1(CD226),2B4(CD244)、CD57和CD16中的一种或多种定义。
在该方法的另一个实施方案中，该方法能够通过使多能干细胞衍生的确定性HE与培养基接触而产生免疫调节细胞，所述培养基包含ROCK抑制剂、MCSF、GMCSF以及一种或多种选自IL1b、IL3、IL6、IL4、IL10、IL13、TGFβ、bFGF、VEGF,SCF和FLT3L的生长因子和细胞因子，以及任选地，AhR拮抗剂和***素途径激动剂中的一种或两种。
在一些实施方案中，衍生的免疫调节细胞包括骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)。在一实施方案中，衍生的免疫调节细胞群包括CD45+CD33+细胞。在一些实施方案中，衍生的免疫调节细胞群包含单核细胞。在一些实施方案中，单核细胞包含CD45+CD33+CD14+细胞。在其他一些其他实施方案中，衍生的免疫调节细胞群包含CD45+CD33+PDL1+细胞。本发明的一方面提供了富含iPSC衍生的免疫调节细胞的细胞群或亚群，其包含CD45+CD33+、CD45+CD33+CD14+或CD45+CD33+PDL1+细胞。在一些其他实施方案中，衍生的免疫调节细胞群包含CD33+CD15+CD14-CD11b-细胞。在一些实施方案中，包含iMDSC的衍生化免疫调节细胞群包含少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.1％的红细胞、淋巴样细胞、粒细胞、CD45-CD235+细胞、CD45+CD7+细胞或CD45+CD33+CD66b+细胞。在一些实施方案中，衍生化免疫调节细胞群基本上不含红细胞、淋巴样细胞、粒细胞、CD45-CD235+细胞、CD45+CD7+细胞或CD45+CD33+CD66b+细胞。
III.iPSC及其衍生化免疫细胞的治疗用途
在一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含iPSC和/或已经使用所公开的方法和组合物由所述iPSC衍生的免疫细胞的分离群体或亚群。在一些实施方案中，iPSC包含可保留在iPSC衍生的免疫细胞中的一种或多种靶向遗传编辑，其中基因工程改造的iPSC及其衍生细胞适合于基于细胞的过继疗法。在一个实施方案中，基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含iPSC衍生的HSC细胞。在一个实施方案中，基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含iPSC衍生的HSC细胞。在一个实施方案中，基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含iPSC衍生的proT或T细胞。在一个实施方案中，基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含iPSC衍生的proNK或NK细胞。在一个实施方案中，基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包含iPSC衍生的免疫调节细胞或骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)。在一些实施方案中，将iPSC衍生的基因工程改造的免疫细胞进一步离体调节以提高治疗潜力。在一个实施方案中，已经由iPSC衍生的基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包括数量或比率增加的原初T细胞、干细胞记忆T细胞和/或中央记忆T细胞。在一个实施方案中，已经由iPSC衍生的基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包括数量或比率增加的I型NKT细胞。在另一个实施方案中，已经由iPSC衍生的基因工程改造的免疫细胞的分离群体或亚群包括数量或比率增加的自适应NK细胞。在一些实施方案中，衍生自iPSC的基因工程改造的CD34细胞、HSC细胞、T细胞、NK细胞或骨髓衍生的抑制细胞的分离群体或亚群是同种异体的。在一些实施方案中，衍生自iPSC的基因工程改造的CD34细胞、HSC细胞、T细胞、NK细胞或MDSC的分离群体或亚群是自体的。
在一些实施方案中，用于分化的iPSC包括在效应细胞中传达所需治疗属性的遗传印记，该遗传印记保留在衍生自所述iPSC的分化造血细胞中并具有功能性。
在一些实施方案中，多能干细胞的遗传印记包括(i)在将非多能细胞重编程为iPSC期间或之后通过在多能细胞的基因组中进行基因组***、缺失或取代获得的一种或多种遗传修饰模态；或(ii)源特异性免疫细胞的一种或多种可保留的治疗属性，其是供体特异性、疾病特异性或治疗反应特异性的，并且其中多能细胞从该源特异性免疫细胞重编程，其中iPSC保留了该源治疗属性，该源治疗属性也包含在iPSC衍生化造血谱系细胞中。
在一些实施方案中，遗传修饰模态包括以下的一种或多种：安全开关蛋白、靶向模态、受体、信号传导分子、转录因子、药物活性蛋白和肽、药物靶标候选物；或促进植入、运输、归巢、存活力、自我更新、持久性、免疫反应调控和调节和/或iPSC或其衍生细胞存活的蛋白。在一些其他实施方案中，遗传修饰模态包括以下的一种或多种：(i)B2M、TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、CIITA、RFX5或RFXAP以及染色体6p21区域中任何基因的缺失或表达降低；(ii)引入或增加HLA-E、HLA-G、HACD16、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR、TCR、Fc受体或表面触发受体的表达以与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联。
在一些其他实施方案中，造血谱系细胞包含与以下一种或多种相关的源特异性免疫细胞的治疗属性：(i)抗原靶向受体表达；(ii)HLA呈递或其缺少；(iii)对肿瘤微环境的抗性；(iv)旁观免疫细胞的诱导和免疫调节；(iv)提高的靶标特异性和降低的瘤外作用；(v)对化学疗法等治疗的抗性；以及(vi)改善的归巢、持久性和细胞毒性。
在一些实施方案中，iPSC集及其衍生造血细胞包含以下的一种或多种：B2M零或低、HLA-E/G、PDL1、A2AR、CD47、LAG3零或低、TIM3零或低、TAP1零或低、TAP2零或低、Tapasin零或低、NLRC5零或低、PD1零或低、RFKANK零或低、CIITA零或低、RFX5零或低和RFXAP零或低。这些具有修饰的I和/或II类HLA的细胞具有增强的免疫检测抗性，因此具有改善的体内持久性。而且，此类细胞可避免过继细胞疗法中对HLA匹配的需要，因此可提供通用的现成治疗方案来源。
在一些实施方案中，iPSC及其衍生造血细胞包含以下的一种或多种：hnCD16(高亲和力非裂解性CD16)、HLA-E、HLA-G、41BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A2AR、CAR或TCR。此类细胞具有改善的免疫效应能力。
在一些实施方案中，iPSC及其衍生的造血细胞是抗原特异性的。
通过将本发明的免疫细胞引入适合于过继细胞疗法的受试者中可以改善多种疾病。疾病的实例包括：各种自身免疫性病症，包括但不限于斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎，皮肌炎、糖尿病(1型)、某些形式的幼年特发性关节炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病(Graves’disease)、格林巴里综合征(Guillain-Barrésyndrome)、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、某些形式的心肌炎、多发性硬化症、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多发炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、硬皮病/全身性硬化症、肖格伦综合征(
Figure BDA0002443312760000391
syndrome)、全身性红斑狼疮、某些形式的甲状腺炎、某些形式的葡萄膜炎、白癜风、肉芽肿性多血管炎(韦格纳氏)；血液***恶性肿瘤，包括但不限于急性和慢性白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合症；实体瘤，包括但不限于脑部、***、乳腺、肺、结肠、子宫、皮肤、肝脏、骨、胰腺、卵巢、睾丸、膀胱、肾脏、头、颈、胃、子宫颈、直肠、喉或食道的肿瘤；以及感染，包括但不限于HIV-(人类免疫缺陷病毒)、RSV-(呼吸道合胞病毒)、EBV-(爱泼斯坦-巴尔病毒)、CMV-(巨细胞病毒)、腺病毒和BK多瘤病毒相关病症。
根据一些实施方案，本发明进一步提供用于治疗用途的组合物，其包含通过本文公开的方法和组合物制备的多能细胞衍生化造血谱系细胞，其中所述药物组合物还包含药学上可接受的培养基。在一个实施方案中，用于治疗用途的组合物包含通过本文公开的方法和组合物制备的多能细胞衍生的T细胞。在一个实施方案中，用于治疗用途的组合物包含通过本文公开的方法和组合物制备的多能细胞衍生的NK细胞。在一个实施方案中，用于治疗用途的组合物包含通过本文公开的方法和组合物制备的多能细胞衍生的CD34+HE细胞。在一个实施方案中，用于治疗用途的组合物包含通过本文公开的方法和组合物制备的多能细胞衍生的HSC。在一个实施方案中，用于治疗用途的组合物包含通过本文公开的方法和组合物制备的多能细胞衍生的MDSC。
另外，在一些实施方案中，本发明通过将所述组合物引入适合于过继细胞疗法的受试者中来提供上述治疗组合物的治疗用途，其中所述受试者患有自身免疫性病症；血液***恶性肿瘤；实体瘤；或与HIV、RSV、EBV、CMV、腺病毒或BK多瘤病毒相关的感染。
分离的多能干细胞衍生化造血谱系细胞可具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞、HSC、B细胞、骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)、调节性巨噬细胞、调节性树突状细胞或间充质基质细胞。在一些实施方案中，分离的多能干细胞衍生化造血谱系细胞具有约95％至约100％的T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞、HSC、B细胞、骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)、调节性巨噬细胞、调节性树突状细胞或间充质基质细胞。在一些实施方案中，本发明提供了具有纯化的T细胞、NK细胞、NKT细胞、CD34+HE细胞、proT细胞、proNK细胞、HSC、B细胞、骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)、调节性巨噬细胞、调节性树突状细胞或间充质基质细胞的治疗组合物，例如具有约95％的T细胞、NK细胞、NKT细胞、proT细胞、proNK细胞、CD34+HE细胞、HSC、B细胞、骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)、调节性巨噬细胞、调节性树突状细胞或间充质基质细胞的组合物来治疗需要细胞疗法的受试者。
使用本文公开的实施方案的衍生化造血谱系细胞进行的治疗可以在出现症状时进行，或用于预防复发。术语“治疗”等在本文中通常用于意指获得期望的药理和/或生理作用。就完全或部分预防疾病而言，所述作用可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的不利影响而言，所述作用可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物疾病的任何治疗，并且包括：预防疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中发生；抑制该疾病，即阻止其发展；或缓解该疾病，即致使疾病消退。治疗剂或组合物可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用。对持续性疾病的治疗也特别令人感兴趣，其中所述指令使患者的不良临床症状稳定或减轻。在特定的实施方案中，需要治疗的受试者患有可以通过细胞疗法治疗、改善和/或改良至少一种相关症状的疾病、病状和/或损伤。某些实施方案考虑到需要细胞疗法的受试者包括但不限于进行骨髓或干细胞移植的候选者，已接受化学疗法或放射疗法的受试者，患有或处于患有过度增殖性病症或癌症(例如过度增殖性病症或造血***癌症)的风险中的受试者，患有或处于患有肿瘤(例如实体瘤)的风险中的受试者，患有或处于患有病毒感染与病毒感染相关的疾病的风险中的受试者。
包含所公开的衍生化造血谱系细胞的治疗组合物可以在其他治疗之前、期间和/或之后在受试者中施用。因而，组合治疗的方法可以涉及在使用附加治疗剂之前、期间和/或之后施用或制备iPSC衍生化免疫细胞。如上所述，所述一种或多种附加治疗剂包括肽、细胞因子、促***原、生长因子、小RNA、dsRNA(双链RNA)、单核血细胞、饲养层细胞、饲养层细胞组分或其替代因子、包含一种或多种目标多核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(IMiD)。iPSC衍生化免疫细胞的施用在时间上可以与附加治疗剂的施用间隔数小时、数天或甚至数周。另外地或可替代地，该施用可以与其他生物活性剂或模态组合，例如但不限于抗肿瘤剂、非药物疗法如手术。
在一些实施方案中，所述附加治疗剂包括抗体或抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体可以是人源化抗体、人源化单克隆抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段与病毒抗原特异性结合。在其他实施方案中，所述抗体或抗体片段与肿瘤抗原特异性结合。在一些实施方案中，所述肿瘤或病毒特异性抗原激活施用的iPSC衍生化造血谱系细胞以增强其杀伤能力。在一些实施方案中，适于作为所施用的iPSC衍生化造血谱系细胞的附加治疗剂的组合治疗的抗体包括但不限于抗CD20(利妥昔单抗(retuximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、乌妥昔单抗(ublituximab)、奧卡拉妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥奴珠单抗(obinutuzumab))、抗Her2(曲妥珠单抗(trastuzumab))、抗CD52(阿妥莫单抗(alemtuzumab))、抗EGFR(西妥昔单抗(certuximab))和抗CD38(达拉木单抗(daratumumab)、艾沙昔单抗(isatuximab)、MOR202)及其人源化和Fc修饰的变体。
在一些实施方案中，附加治疗剂包含一种或多种化学治疗剂或放射性部分。化学治疗剂是指细胞毒性抗肿瘤剂，即优先杀伤肿瘤细胞或破坏快速增殖细胞的细胞周期，或发现可根除癌干细胞，并在治疗上用于预防或减少肿瘤细胞生长的化学剂。化学治疗剂有时也称为抗肿瘤或细胞毒性药物或药剂，并且在本领域中是众所周知的。
在一些实施方案中，化学治疗剂包括蒽环类、烷化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺、甲基三聚氰胺、氮芥、亚硝基脲、抗生素、抗代谢物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶、鬼臼毒素、含铂试剂、干扰素和白介素。示例性的化学治疗剂包括但不限于烷化剂(环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、美法林、苯丁酸氮芥、六甲基嘧胺、噻替派、白消安、卡莫司汀、洛莫司丁、司莫司汀)、抗代谢物(甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟嘧啶、阿糖孢苷、6-巯基鸟嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁)、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、长春地辛)、表鬼臼毒素(依托泊苷、依托泊苷原醌和替尼泊苷)、抗生素(柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌、双蒽、放线菌素D、普卡霉素、嘌呤霉素和短杆菌肽D)、细胞松弛素B、依米丁、美登素和安吖啶。其他药剂包括氨鲁米特、顺铂、卡铂、丝裂霉素、六甲蜜胺、环磷酰胺、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BCNU)、伊立替康(CPT-11)、阿来曲单抗、六甲蜜胺、阿那曲唑、L-天冬酰胺酶、阿扎胞苷、贝伐单抗、贝沙罗汀、博来霉素、硼替佐米、白消安、卡鲁睾酮、卡培他滨、塞来昔布、西妥昔单抗、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、达卡巴嗪、地尼白介素、地尔雌烯雌酚、多西他赛、屈他雄酮、表柔比星、埃洛替尼、雌莫司汀、依托泊苷、炔雌醇、依西美坦、氟尿苷、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟他米特、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、戈舍瑞林、羟基脲、替伊莫单抗、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素α(2a、2b)、伊立替康、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、二氯甲基二乙胺、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、甲氧沙林、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、诺龙、诺非特单抗(nofetumomab)、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸、培美曲塞、培加酶、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、聚苯丙生、卟吩姆钠、丙卡巴肼、奎纳克林、利妥昔单抗、沙格司亭、链脲菌素、它莫西芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替派、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维甲酸、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、长春瑞滨和唑来膦酸。其他合适的药剂是经批准供人类使用的那些，包括将被批准作为化学治疗剂或放射治疗剂的并且是本领域已知的那些。可以通过许多标准医生和肿瘤学家的参考文献中的任一个(例如，Goodman和Gilman的《治疗学的药理学基础》(The Pharmacological Basis ofTherapeutics)，第9版，McGraw-Hill,N.Y.,1995)，或通过美国国家癌症研究所网站(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)提及此类药剂，两个参考文献均会不时更新。
诸如沙利度胺、来那度胺和泊马度胺等免疫调节药物(IMiD)会刺激NK细胞和T细胞。如本文所提供的，IMiD可以与iPSC衍生的治疗性免疫细胞一起用于癌症治疗。
如本领域的普通技术人员将理解的，基于本文的方法和组合物衍生自iPSC的自体和同种异体造血谱系细胞均可用于如上所述的细胞疗法。对于自体移植，衍生化造血谱系细胞的分离群体与患者完全或部分HLA匹配。在另一个实施方案中，衍生化造血谱系细胞与受试者没有HLA匹配。
在一些实施方案中，治疗性组合物中衍生化造血谱系细胞的数量是每个剂量至少0.1x105个细胞、至少1x105个细胞、至少5x105个细胞、至少1x106个细胞、至少5x106个细胞、至少1x107个细胞、至少5x107个细胞、至少1x108个细胞、至少5x108个细胞、至少1x109个细胞或至少5x109个细胞。在一些实施方案中，治疗组合物中衍生化造血谱系细胞的数量是每个剂量约0.1x105个细胞至约1x106个细胞；每个剂量约0.5x106个细胞至约1x107个细胞；每个剂量约0.5x107个细胞至约1x108个细胞；每个剂量约0.5x108个细胞至约1x109个细胞；每个剂量约1x109个细胞至约5x109个细胞；每个剂量约0.5x109个细胞至约8x109个细胞；每个剂量约3x109个细胞至约3x1010个细胞，或介于之间的任何范围。通常，对于60kg的患者，1x108个细胞/剂可转换为1.67x106个细胞/kg。
在一个实施方案中，治疗性组合物中衍生化造血谱系细胞的数量是部分或单条脐血中的免疫细胞的数量，或者是至少0.1x105个细胞/kg体重，至少0.5x105个细胞/kg体重，至少1x105个细胞/kg体重，至少5x105个细胞/kg体重，至少10x105个细胞/kg体重，至少0.75x106个细胞/kg体重，至少1.25x106个细胞/kg体重，至少1.5x106个细胞/kg体重，至少1.75x106个细胞/kg体重，至少2x106个细胞/kg体重，至少2.5x106个细胞/kg体重，至少3x106个细胞/kg体重，至少4x106个细胞/kg体重，至少5x106个细胞/kg体重，至少10x106个细胞/kg体重，至少15x106个细胞/kg体重，至少20x106个细胞/kg体重，至少25x106个细胞/kg体重，至少30x106个细胞/kg体重，1x108个细胞/kg体重，5x108个细胞/kg体重或1x109个细胞/kg体重。
在一个实施方案中，将一个剂量的衍生化造血谱系细胞递送至受试者。在一个说明性实施方案中，提供给受试者的细胞的有效量为至少2x106个细胞/kg，至少3x106个细胞/kg，至少4x106个细胞/kg，至少5x106个细胞/kg，至少6x106个细胞/kg，至少7x106个细胞/kg，至少8x106个细胞/kg，至少9x106个细胞/kg或至少10x106个细胞/kg，或更多个细胞/kg，包括所有中间的细胞剂量。
在另一个说明性的实施方案中，提供给受试者的细胞的有效量为约2x106个细胞/kg，约3x106个细胞/kg，约4x106个细胞/kg，约5x106个细胞/kg，约6x106个细胞/kg，约7x106个细胞/kg，约8x106个细胞/kg，约9x106个细胞/kg或约10x106个细胞/kg，或更多个细胞/kg，包括所有中间的细胞剂量。
在另一个说明性实施方案中，提供给受试者的细胞的有效量为约2x106个细胞/kg至约10x106个细胞/kg，约3x106个细胞/kg至约10x106个细胞/kg，约4x106个细胞/kg到约10x106个细胞/kg，约5x106个细胞/kg至约10x106个细胞/kg，2x106个细胞/kg至约6x106个细胞/kg，2x106个细胞/kg至约7x106个细胞/kg，2x106个细胞/kg至约8x106个细胞/kg，3x106个细胞/kg至约6x106个细胞/kg，3x106个细胞/kg至约7x106个细胞/kg，3x106个细胞/kg至约8x106个细胞/kg，4x106个细胞/kg至约6x106个细胞/kg，4x106个细胞/kg至约7x106个细胞/kg，4x106个细胞/kg至约8x106个细胞/kg，5x106个细胞/kg至约6x106个细胞/kg，5x106个细胞/kg至约7x106个细胞/kg，5x106个细胞/kg至约8x106个细胞/kg或6x106个细胞/kg至约8x106个细胞/kg，包括所有中间的细胞剂量。
将必然根据被治疗的受试者的状况而发生一些剂量变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定适用于个体受试者的适当剂量。
在一些实施方案中，衍生化造血谱系细胞的治疗用途是单剂量治疗。在一些实施方案中，衍生化造血谱系细胞的治疗用途是多剂量治疗。在一些实施方案中，多剂量治疗是每天、每3天、每7天、每10天、每15天、每20天、每25天、每30天、每35天、每40天、每45天或每50天或介于之间的任何天数一个剂量。
包含本发明的衍生化造血谱系细胞群的组合物可以是无菌的，并且可以适合并准备好施用给人类患者(即，可以不进行任何进一步处理就施用)。准备好施用的基于细胞的组合物意指该组合物在移植或施用给受试者之前不需要任何进一步的治疗或操作。在其他实施方案中，本发明提供了衍生化造血谱系细胞的分离群体，其在与一种或多种药剂一起施用之前扩增和/或调节。对于经基因工程改造以表达重组TCR或CAR的衍生化造血谱系细胞，可以使用例如美国专利6,352,694中描述的方法激活和扩增细胞。
在某些实施方案中，可以通过不同的方案提供衍生化造血谱系细胞的主要刺激信号和共刺激信号。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或偶联至表面。当偶联至表面时，药剂可以偶联至相同表面(即，以“顺式”形式)或偶联至单独表面(即，以“反式”形式)。可替代地，可以将一种药剂偶联至表面，而将另一种药剂偶联至溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的药剂可以结合至细胞表面，并且提供主要激活信号的药剂处于溶液中或偶联至表面。在某些实施方案中，两种药剂都可以处于溶液中。在另一个实施方案中，所述药剂可以为可溶形式，然后交联至表面，例如表达Fc受体或抗体或将会与所述药剂结合的其他结合剂的细胞，如美国专利申请公开号20040101519和20060034810中针对人工抗原呈递细胞(aAPC)所公开的，在本发明的实施方案中预期用于激活和扩增T淋巴细胞。
适于向患者施用的治疗性组合物可以包含一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂(例如药学上可接受的培养基，例如细胞培养基)或其他药学上可接受的组分。药学上可接受的载体和/或稀释剂部分地由所施用的特定组合物以及用于施用治疗性组合物的特定方法来决定。因此，本发明的治疗组合物存在多种合适的制剂(参见例如《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences),第17版，1985年，其公开内容特此通过引用整体并入)。
在特定的实施方案中，具有iPSC衍生化造血谱系细胞的分离群体的治疗性细胞组合物还具有药学上可接受的细胞培养基或药学上可接受的载体和/或稀释剂。可以通过静脉内、腹膜内、肠内或气管施用方法单独地或与其他合适的化合物组合施用包含本文公开的iPSC衍生化造血谱系细胞群的治疗组合物，以实现预期治疗目的。
这些药学上可接受的载体和/或稀释剂可以足以将治疗组合物的PH维持在约3至约10之间的量存在。因而，缓冲剂可以占总组合物重量的约5％。电解质例如但不限于氯化钠和氯化钾也可以包括在治疗组合物中。一方面，治疗组合物的PH在约4至约10的范围内。可替代地，治疗组合物的PH在约5至约9、约6至约9或约6.5至约8的范围内。在另一个实施方案中，治疗组合物包含PH在所述PH范围之一中的缓冲剂。在另一个实施方案中，治疗组合物的PH为约7。可替代地，治疗组合物的PH在约6.8至约7.4的范围内。在另一个实施方案中，治疗组合物的PH为约7.4。
本发明还部分地提供了药学上可接受的细胞培养基在本发明的特定组合物和/或培养物中的用途。此类组合物适合于施用于人类受试者。一般而言，根据本发明的实施方案支持iPSC衍生化免疫细胞的维持、生长和/或健康的任何培养基都适合用作药物细胞培养基。在特定实施方案中，药学上可接受的细胞培养基是无血清和/或无饲养层的培养基。在各种实施方案中，无血清培养基是无动物的，并且可以任选地是无蛋白质的。任选地，培养基可以包含生物药学上可接受的重组蛋白。无动物的培养基是指其中组分衍生自非动物来源的培养基。重组蛋白取代了无动物培养基中的天然动物蛋白，营养成分获自合成、植物或微生物来源。相比之下，无蛋白质的培养基被定义为基本上不含蛋白质。本领域的普通技术人员将理解，上述培养基的实例是说明性的，绝不限制适用于本发明的培养基的配方。
序列表
SEQ ID NO:1
长度：641
类型：PRT
生物体：人类疱疹病毒4
MSDEGPGTGPGNGLGEKGDTSGPEGSGGSGPQRRGGDNHGRGRGRGRGRGGGRPGAPGGSGSGPRHRDGVRRPQKRPSCIGCKGTHGGTGAGAGAGGAGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGGAGGAGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGAGGGGRGRGGSGGRGRGGSGGRGRGGSGGRRGRGRERARGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSQSSSSGSPPRRPPPGRRPFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE
SEQ ID NO:2
长度：422
类型：PRT
生物体：人类疱疹病毒4
MSDEGPGTGPGNGLGEKGDTSGPEGSGGSGPQRRGGDNHGRGRGRGRGRGGGRPGAPGGSGSGPRHRDGVRRPQKRPSCIGCKGTHGGTGAGAGAGGAGAGGAGAGGGGRGRGGSGGRGRGGSGGRGRGGSGGRRGRGRERARGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSQSSSSGSPPRRPPPGRRPFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE
实施例
以下实施例是以举例说明的方式而非限制的方式提供的。
实施例1–材料和方法
单细胞解离转染后第14天，所有重编程培养物均转换到FMM。一旦进入FMM，就使用Accutase维持和解离所有重编程培养物。然后使单细胞在基质胶或玻连蛋白涂层表面上传代。然后将单细胞解离的细胞在FMM中扩增并维持直至进行流式细胞术分选。
流式细胞术分析和分选将单细胞解离的重编程库重悬于冷却的染色缓冲液中。将包括SSEA4-FITC、TRA181-Alexa Fluor-647和CD30-PE(BD Biosciences)在内的偶联一抗添加到细胞溶液中，并在冰上孵育15分钟。所有抗体均以每百万细胞7-10μL于100μL染色缓冲液中使用。将重悬在染色缓冲液中的解离单细胞离心并重悬在现在含有ROCK抑制剂的染色缓冲液中，并保持在冰上以进行流式细胞术分选。使用结果部分中描述的门控策略在FACS Aria II(BD Biosciences)上进行流式细胞术分选。将分选的细胞以每孔3和9个事件的浓度直接喷射到96孔板中。每个孔都预装有FMM。完成分选后，孵育96孔板以进行集落形成和扩增。分选后七至十天，将细胞进行传代。在FMM中的后续传代通常在75-90％融合时进行。在Guava EasyCyte 8HT(Millipore)上进行流式细胞术分析，并使用FCS Express 4(DeNovo软件)进行分析。
测试转基因的存在使用
Figure BDA0002443312760000481
DNA微型试剂盒和蛋白酶K消化(Qiagen)分离基因组DNA。使用Taq PCR主混合试剂盒(Qiagen)，使用对转基因(包括重编程因子和EBNA1)具有特异性的引物组扩增100ng基因组DNA。PCR反应进行35个循环，如下所述：94℃持续30秒(变性)，60-64℃持续30秒(退火)和72℃持续1分钟(延伸)。使用慢病毒方法产生的成纤维细胞和hiPSC的基因组DNA用作阴性对照。附加型构建体的DNA用作阳性对照。
碱性磷酸酶染色将细胞在4％v/v多聚甲醛(Alfa Aesar)中固定，用PBS洗涤3次并用碱性磷酸酶染色试剂盒(Millipore)染色。简言之，将两份耐晒红紫，一份Naphtol AS-BI磷酸盐和一份水混合混合，添加到固定的细胞中，并在25℃孵育15分钟，然后用PBS洗涤。
核型分析由WiCell研究所(Madison,WI)对G带中期细胞进行细胞遗传学分析。每个核型分析都包括至少20个扩散，当在前20个中鉴定出非克隆异常时，分析扩展到40个扩散计数。
畸胎瘤形成将单细胞解离的hiPSC皮下注射到NOD/SCID/γ裸鼠中，其浓度为每200μL溶液50万至300万个细胞(100μL FMM和100μL基质胶)。在5-6周(注射300万个细胞)和7-8周(注射50万个细胞)后，收获畸胎瘤，固定并维持以进行处理。将样品提交给UCSD组织学核心机构进行切片、染色和检查。
统计分析至少进行三次独立实验。值报道为平均值±SEM。使用ANOVA进行统计分析，p<0.05视为显著。
培养基传统的hESC培养物含有DMEM/F12培养基，补充有20％敲除血清替代品、0.1mM(或1％v/v)非必需氨基酸、1-2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇和10-100ng/mlbFGF)。相比之下，多阶段培养基另外包含ROCK抑制剂以及GSK3抑制剂、MEK抑制剂和TGFβ抑制剂中的一种或多种。这种阶段特异性培养平台还支持无饲养层的重编程和维持。
在某些应用中，除了用于常规培养的成分外，重编程培养基(FRM)还含有SMC4：ROCK抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂和TGFβ抑制剂的组合；维持培养基(FMM)含有SMC3：ROCK抑制剂、GSK3抑制剂和MEK抑制剂的组合。
实施例2–使用瞬时和时序性重编程***进行重编程
质粒和附加型载体都是非整合型染色体外DNA。标准质粒仅含启动子和待表达的多核苷酸，不能自主复制或随宿主细胞染色体复制。因此，质粒介导的转基因表达不连续也不稳定，而是瞬时的(细胞质的)和时序性的(短期的)，并且由存活的输入载体DNA指示，该载体DNA可受到转染效率、拷贝数和质粒丢失率的影响。已经显示仅通过每天重复转染质粒载体即实现重编程，但是效率低得令人无法接受(Okita等人，Science(2008)；322:949-953)。
与质粒载体相比，附加型载体可以存在并在细胞质中自主复制或作为染色体的一部分复制。因此，由于载体的复制，由附加型载体介导的转基因表达是连续且稳定的。例如，除了目标转基因外，基于EBV的附加型载体还编码爱泼斯坦-巴尔核抗原1(EBNA1)蛋白和源自EBV的复制起点(oriP)，它们共同作用于将附加型载体复制并保留在***细胞的细胞核中。附加型载体中表达的EBNA结合oriP并募集细胞DNA复制复合物组分，以允许oriP起始载体DNA的复制以及宿主细胞的染色体复制。然后EBNA-1通过oriP将S期产生的子代附加体拴系到宿主子代染色体，从而维持附加体的核保留，从而保持连续的转基因和EBNA表达(Gil等人，Gene Ther 2010 17(10):1288-1293)。EBNA介导的附加体拴系在有丝***过程向每个子细胞赋予附加体分离，确保每个细胞具有恒定数量的附加体(Gil等人，2010)。同时含有oriP和EBNA-1表达盒的附加体质粒可持续复制培养的人细胞，每个细胞周期～95％的附加体保持，无需选择(Gil等人，2010)。基于EBV的附加型载体提供外源重编程因子的连续表达至少12天(建立自我维持的多能状态所需的时间周期，参见Okita等人,Science(2008)；322：949-953；或美国专利第8,5546,140号中陈述的至少8天至至少30天)。
为了使用本申请的瞬时和时序性重编程***进行重编程，构建了几种载体，如表1和图1所示。载体1(V1)是含有启动子的质粒载体，所述启动子驱动选择的重编程因子(RF)和oriP的表达。载体1没有EBNA编码序列，因此缩短了在宿主细胞中的保留时间。载体1也称为oriP/RF质粒。在载体1编码一个以上重编程因子的情况下，可以通过自裂解2A肽或IRES分离这些因子。在需要多种重编程因子的不同组合的情况下，可以将多个V1用于共转染，并且可以通过控制V1组合中每种重编程因子的相对拷贝数来预定重编程因子的化学计量。载体2(V2)是含有启动子和EBNA编码序列的质粒，该表达受启动子驱动。更重要的是，V2缺乏oriP，这导致转染的宿主细胞群体中V2的保留时间大大缩短。载体2也称为EBNA质粒。V2也可以用EBNA mRNA或蛋白质/肽代替。用于mRNA介导的重编程的方法和材料在例如Warren等人(Cell Stem Cell(2010):7,618-630)中进行了描述，而对于重组蛋白介导的重编程，其在例如Zhou等人(Cell Stem Cell(2009):4,381-384)中进行了描述，两者均通过引用并入本文。载体3(V3)是表达oriP和EBNA的载体，但没有任何重编程因子编码序列。为了检查这些载体是否支持重编程，将V1、V2和V3单独或以不同组合转导至人成纤维细胞(参见表2)。
表1—载体构造
Figure BDA0002443312760000511
首先测试的是V1、V2和V3(EmTTR，EBNA介导的瞬时和时序性重编程***)的组合，以诱导EBNA的长期表达，持久的转基因保留和有效的重编程。该组合中使用的重编程因子包括OCT4、NANOG和SOX2(V1A和V1B)。转染后十五天(D15)，通过流式细胞术分选重编程库中表达SSEA4和TRA181(指示多能性状态)的细胞。在这些多能性标志物中，显著的21.4％的细胞为双阳性(图2)。转染后三十天(D30)，对重编程库中的iPSC多能性标志物TRA181、SSEA4和CD30(NANOG的替代标志物)进行染色(图3)。OCT4和NANOG的免疫荧光染色证实出现了表达iPSC多能性标志物的集落，表明重编程成功。
为消除V3在EmTTR***中反式产生超生理量的转基因表达，从而产生过分依赖转基因表达而不是在驱动重编程时及时过渡为内源多能性因子的细胞的可能性，我们从组合中去除了V3并且仅用V1(V1A+V1B)和V2转染成纤维细胞，这是称为STTR(短暂的瞬时和时序性重编程)的一种***。令人惊讶的是，V1和V2的组合不仅引起重编程，而且效率适中，无需重复转染V1和V2。转染后第15天有2.35％的SSEA/TRA181双阳性细胞(图4)。转染后第二十七天，对重编程库中的iPSC多能性标志物TRA181、SSEA4和CD30进行染色。免疫荧光染色证实出现了表达iPSC多能性标志物的集落，表明使用STTR***(仅V1和V2)重编程成功(图5)。
这是完全出乎意料的结果。预计STTR***不支持重编程，因为假定短暂的转基因表达在持续时间或时间上都不足。
表2-用于重编程的载体组合
Figure BDA0002443312760000521
1：Yu等人，Science(2009)；324(5928):797-801(3种附加型载体共转染以转移7种重编程因子，并使用饲养层条件的常规hESC培养基进行重编程以获得3-6个集落/106个输入细胞)。
2：在估计重编程效率方面，AP染色不如双阳性严格
另外，尽管与基于双阳性细胞百分比的STTR重编程相比，通过EmTTR***进行的初始重编程似乎效率更高，但是STTR更好地支持了细胞重编程，以生成具有自我维持多能性并且能够长期维持的iPSC。使用EmTTR和STTR***诱导重编程的成纤维细胞分别维持25天，并评估多能标志物SSEA4、TRA181和CD30的表达。如图6所示，虽然第25天衍生自STTR的大多数群体都维持了所有三种多能性标志物的表达，正如CD30表达的大幅下降表明的，第25天EmTTR诱导的群体似乎正在丧失多能性，表明与非持续性或不稳定的多能状态相关的逆转。然后使两个群体传代，随后观察培养物中iPSC集落和分化集群的形态，并在第28天进行比较(图7A)。如最初指出的那样，在保持SSEA4、TRA181和CD30共表达的情况下，STTR群体主要保持为自发分化程度最小的iPSC集落，而EmTTR群体显示出高水平的自发分化(图7B)。
为了分析STTR***的瞬时和时序性特性，我们使用定量RT-PCR分析转染后细胞群体中的EBNA表达。还监测了指示细胞群中出现多能状态的内源性OCT4表达。如图8所示，EBNA表达在转染后出现，在第2天达到最高点，然后开始急剧下降，到第4天不足1％，反映每次细胞***V2质粒的丢失率超过90％(与基于EBV的附加型载体的丢失率约5％相比)。常规测定法消除了在实验开始时对质粒的选择，并针对长期群体生长中无质粒细胞出现进行了筛选。到第6天，群体中的EBNA表达基本上是不可检测的，表征了暂时表达***。如此迅速的EBNA表达丧失决定了它极端短暂和时序性的特性，表明V2质粒最有可能在细胞质中瞬时保留，而没有细胞核吸收和染色体拴系或基因组整合的益处。更重要的是，在培养物中出现任何iPSC形态之前并且肯定是在形成自我维持的多能状态之前，EBNA丢失。本文提供的方法减少了EBNA介导的质粒保留时间，并且与游离型介导的重编程中EBNA稳定表达的需求形成鲜明对比(参见US 8,546,140，需要EBNA稳定表达至少8天到至少30天，或在宿主细胞中组成型表达(Mazda等人，1997))。
Howden等人，2006(Human Gene Therapy；17:833-844)证实，将EBNA mRNA与基于EBV的附加型载体共转染可增加核吸收，从而增加基于EBV的附加型载体的染色体拴系，从而使转染效率增加10倍。在本申请中，通过STTR***中的V2质粒转染进行的EBNA表达的瞬时尖峰在形式上可以与EBNA mRNA的形式相似，但是，本文的仅含oriP并且不表达EBNA的V1质粒缺乏基于EBV的附加型的拴系机制，该机制依赖于连续的EBNA表达以长期保留和复制载体DNA，从而有意义地影响转染率。即使在两个质粒共转染的情况时，瞬时表达的EBNA质粒V2增强了含oriP的质粒(例如V1)从细胞质到细胞核的转运，V1仍然不支持长期表达重编程因子转基因，正如V1和V2之间丢失率相似所表明的那样。
因此，使用V1和V2进行STTR重编程是通过一种质粒机制进行的，该质粒特征在于真正的瞬时性(染色体外和细胞质)和时序性(持续时间极短)，相比之下与核定位的且长期的附加型重编程不同。不需要多次转染，V1和V2介导的质粒重编程惊人地有效。而且，质粒重编程到第6天似乎丢失了所有EBNA质粒，此时尚未形成iPSC或多能状态。通过EBNA检测，STTR***证明转基因丢失迅速并且在建立多能状态(通常在第21天-第32天左右)之前显著，并且内源OCT4表达水平升高是标志物之一。
有趣的是，尽管使用STTR***的重编程效率低于EmTTR***(大约为2％与21％)，但与EmTTR***不同，我们在STTR***中没有检测到iPSC的多能性逆转和/或自发分化，因为STTR***中生成的大多数iPSC维持其iPSC状态，并能够分化为所有三个胚层：内胚层、中胚层和外胚层(图9)。这部分可归因于转基因暴露于细胞群体的持续时间短，使得重编程更倾向于利用诱导的内源性发育***和动力学，而不是很大程度上受外源重编程因子驱动，外源重编程因子的存在可通过正如EmTTR中可以看到EBNA的长期表达而长期维持。
为了提供新形成的iPSC中不存在V1 DNA的进一步证据，我们在多个iPSC系(第25天-第30天)中针对潮霉素存在下的存活率进行了功能测试。测试的所有hiPSC系均证明不含STTR的任何遗传组分，并且显示对潮霉素具有抗性，这是STTR***中V1 DNA完全丧失的进一步证据。选定的克隆物在无饲养层的环境中作为单细胞连续传代，并且经证明会维持未分化细胞的均质群体，同时显示出有效分化为三个体细胞谱系的能力。核型和拷贝数变异分析揭示，在FMM中长期培养期间，基因组稳定的hiPSC系得以维持。另外，选择的克隆物展示出产生三个胚层的细胞的能力，并且当定向时，以同质方式分化为造血细胞，包括CD34+细胞、NK细胞和T细胞。
还证实STTR***可有效地起始重编程，而与不同V1载体携带的各种重编程因子组合无关(图10和表3)。
表3-适用于STTR***介导的重编程的新型重编程因子组合
Figure BDA0002443312760000541
使用本发明的STTR***进行重编程，以及使用基于EBV的附加型载体进行重编程，就外源DNA含量而言会产生不同的iPSC。基于EBV的游离重编程被赞誉为可产生无足迹的iPSC，但很大程度上取决于游离DNA缓慢丢失的速率，每次细胞***为约3-5％(Leight等人，MolCellBiol(2001)；21:4149-4161)。因此，当将附加型载体用于重编程时，只有经过多轮iPS细胞传代后，无足迹的iPSC群体才有可能。已经证实，最初获得的iPSC至少需要经过12-15次传代(每次培养每4-7天***一次为一次传代)才能获得基本上无足迹的多能干细胞群体(Cheng等人，CellStemCell(2012)；10:337-344)，无需选择。在此之前，这样产生的iPSC群体就异源DNA含量而言高度异质。一项研究显示，在转染后约20天，该群体中约有三分之二的iPSC含有oriP/EBNA附加型载体(Leight等人，MolCellBiol(2001)；21:4149-4161；Yu等人,Science(2009)；324(5928):797-801)。对于具有显著或高自发分化率的重编程细胞，通过延长的自然传代过程获得无足迹的iPSC甚至是不够的。
总体而言，数据显示，使用本文提供的短暂质粒载体组合，可以通过瞬时和时序性表达重编程基因而容易地生成无足迹的hiPSC，并且该平台支持高效且快速生成基本上同质的无足迹iPSC群体。在一些实施方案中，产生无足迹的iPSC群体而无需大量传代，并且任选地，在完全无饲养层的环境中产生。
实施例3-用于产生单细胞衍生的iPSC库作为治疗用途的衍生细胞来源的瞬时和时序性重编程***
STTR重编程组合物和方法已经用于产生克隆的主iPSC系，用作现成免疫疗法的可再生和可靠的细胞来源。用公开的质粒组合转染捐赠者同意的成纤维细胞。将重编程细胞以克隆密度分选到96孔板中，并扩增单细胞衍生的iPSC克隆物并筛选所需属性，包括多能性、重编程质粒的丢失、基因组稳定性和分化潜力。在严格的生产和过程质量控制下，生产和冷冻保存选定的iPSC克隆系，并且对该系进一步进行广泛的表征和测试，以使其取得作为相关法规要求的“主细胞库”的资格。按照当前的良好生产规范，使生产的iPSC库分化为具有临床相关规模的自然杀伤(NK)细胞。进一步对衍生细胞进行广泛的表征和测试，以使其符合相关法规要求的“药物和药品”的资格。将iPSC衍生的NK细胞冷冻保存，以每剂量约1x108个细胞的量产生多个剂量，用于血液和实体癌的过继细胞疗法，作为单一治疗或与免疫检查点抑制剂联合使用。通常，对于60kg的患者，1x108个细胞/剂可转换为1.67x106个细胞/kg。每种指征的剂型、施用途径和给药方案是根据来自GLP(良好实验室规范)及体外和体内的非GLP研究的临床前数据设计并确定的。
除支持iPSC衍生的免疫细胞治疗癌症和免疫疾病外，通过STTR重编程平台产生的无足迹和无饲养层细胞的iPSC主细胞系具有实现现成细胞疗法的潜力，所述现成细胞疗法可用于退行性病症，范围从黄斑变性、糖尿病、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、血液病症到心血管疾病。
本领域技术人员将容易理解，本文描述的方法、组合物和产品代表示例性实施方案，并非旨在限制本发明的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的本公开做出各种取代和修改。
说明书中提到的所有专利和出版物都指示了本公开所属领域的技术人员的水平。所有专利和出版物都以相同的程度通过引用并入本文，就好像明确地和单独地指出每个单独的出版物都通过引用并入一样。
本文说明性地描述的本公开可以在不存在本文未明确公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实践。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任何一个都可以用另外两个术语中的任一个代替。已经采用的术语和表达用作描述而不是限制的术语，并且在使用此类术语和表达时，不意图排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是应当认识到，在所要求保护的本公开的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管本公开已经通过优选实施方案和任选特征明确公开，但是本领域技术人员可以对本文公开的概念进行修改和改变，并且可以将此类修改和改变视为对在由所附权利要求书限定的本发明的范围内。
序列表
<110> 菲特治疗公司
<120> 使用时序性和瞬时质粒载体表达***进行细胞重编程
<130> 13601-187-228
<140> 待转让
<141> 随函
<150> 62/571,105
<151> 2017-10-11
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 641
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人疱疹病毒4
<400> 1
Met Ser Asp Glu Gly Pro Gly Thr Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu
1 5 10 15
Lys Gly Asp Thr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Gln
20 25 30
Arg Arg Gly Gly Asp Asn His Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly
35 40 45
Arg Gly Gly Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro
50 55 60
Arg His Arg Asp Gly Val Arg Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser Cys Ile
65 70 75 80
Gly Cys Lys Gly Thr His Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly
85 90 95
Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly
100 105 110
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly
115 120 125
Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala
130 135 140
Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly
165 170 175
Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly
180 185 190
Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly
195 200 205
Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala
210 215 220
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala
225 230 235 240
Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly
245 250 255
Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly
260 265 270
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly
275 280 285
Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly
290 295 300
Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly
305 310 315 320
Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly
325 330 335
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Arg Arg Gly Arg Gly Arg Glu Arg Ala Arg Gly Gly Ser Arg Glu Arg
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385 390 395 400
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Gly Glu Glu Gly Gln Glu
420

Claims (65)

1.一种重编程非多能细胞以产生多能细胞、细胞系或其群体的方法，其包括：
(a)将以下物质引入第一细胞中，其中所述第一细胞是非多能细胞：
一个或多个第一质粒，其中所述第一质粒包含复制起点和编码一个或多个重编程因子而不是编码EBNA或其衍生物的多核苷酸；其中所述一个或多个第一质粒中的至少一个包含编码OCT4的多核苷酸；其中所述一个或多个第一质粒的引入诱导重编程过程；以及任选地
以下的一种：(1)包含编码EBNA的核苷酸序列的第二质粒，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸；(2)EBNAmRNA；和(3)EBNA蛋白；
(b)培养来自步骤(a)的细胞以产生第二细胞，其中所述第二细胞是重编程细胞，其中所述重编程细胞包含相比于所述第一细胞的形态变化并且基本上不含EBNA；其中所述重编程细胞不包含：
(1)多能细胞形态；和
(2)内源性OCT4表达；
并且，
(c)将步骤(b)中获得的所述第二细胞进一步培养足够的时间以产生多能细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括向所述第一细胞中引入包含编码EBNA的核苷酸序列的第二质粒，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸；
3.根据权利要求1所述的方法，其还包括：
解离所述多能细胞以获得单细胞解离的多能细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其还包括：
使所述单细胞解离的多能细胞悬浮。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其还包括：
通过选择并分离表达一种或多种多能性标志物的细胞来分选所述单细胞解离的多能细胞以富集表达标志物的多能细胞。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其还包括：
在GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂的存在下培养所述多能细胞以维持多能性，其中所述多能细胞维持多能性至少5、10、15或20代。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)的培养包括在TGFβ抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂中的至少一种的存在下培养。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一细胞是体细胞、祖细胞或多潜能细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一细胞是成纤维细胞，并且其中所述第二细胞的形态变化包括MET(间质-上皮转化)。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二细胞基本上不含步骤(a)的质粒。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二细胞包括在步骤(a)中引入一个或多个第一质粒后约4至10、12、14、21、25天或至其间的任何天数的重编程细胞。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能细胞具有降低的多能性逆转或自发分化。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能细胞基本上不含步骤(a)的所述质粒的多核苷酸，而无需选择所述多能细胞或使所述多能细胞广泛传代。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能细胞具有以下的至少一种特性：
(1)高克隆性；
(2)遗传稳定性；和
(3)基态多能性。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能细胞包含与胚外细胞相关的再活化基因。
16.根据权利要求2所述的方法，其中所述第二质粒具有高丢失率；和/或其中所述EBNA的表达是瞬时和时序性的。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述复制起点和/或EBNA是基于EBV的。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述细胞处于无饲养层的条件下。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是噻唑菌素。
20.一种重编程细胞或其群体，其是在向非多能细胞中引入一个或多个第一质粒后获得的，其中所述第一质粒包含复制起点，以及编码一种或多种重编程因子但不编码EBNA或其衍生物的多核苷酸；其中所述一个或多个第一质粒中的至少一个包含编码OCT4的多核苷酸；并任选地引入以下的一种：
(1)包含编码EBNA的核苷酸序列的第二质粒，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸；
(2)EBNA mRNA；和
(3)EBNA蛋白；
其中所述重编程细胞包含相比于引入所述质粒组合之前的所述非多能细胞的形态变化，并且基本上不含EBNA或其衍生物；
其中所述重编程细胞不包括：
(1)多能细胞形态；和
(2)内源性OCT4表达；并且
其中所述重编程细胞在给定足够的时间时建立稳定或自我维持的多能性以产生多能细胞。
21.根据权利要求20所述的重编程细胞或其群体，其中所述重编程细胞是在引入一个或多个第一质粒后约4至10、12、14、21、25天或其间的任何天数。
22.根据权利要求20或21所述的重编程细胞或其群体，其中所述重编程细胞是在TGFβ抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂和ROCK抑制剂中的至少一种的存在下培养的。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的重编程细胞或其群体，其中所述非多能细胞是成纤维细胞，并且其中所述重编程细胞的形态变化包括MET(间质-上皮转化)。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的重编程细胞或其群体，其中所述重编程细胞基本上不含第一和/或第二质粒。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的重编程细胞或其群体，其中所述多能细胞基本上不含所述质粒的多核苷酸，而无需选择所述多能细胞或使所述多能细胞广泛传代。
26.根据权利要求20至25中任一项所述的重编程细胞或其群体，其中所述多能细胞具有降低的多能性逆转或自发分化。
27.根据权利要求20至26中任一项所述的重编程细胞或其群体，其中所述多能细胞具有以下的至少一种特性：
(1)高克隆性；
(2)遗传稳定性；和
(3)基态多能性。
28.根据权利要求20至27中任一项所述的重编程细胞或其群体，其中所述多能细胞包含与胚外细胞相关的再活化基因。
29.一种组合物，其包含根据权利要求20至28中任一项所述的重编程细胞或其群体。
30.根据权利要求29所述的组合物，其还包含含有TGFβ抑制剂、GSK3抑制剂，MEK抑制剂和ROCK抑制剂的培养基。
31.根据权利要求29所述的组合物，其中所述ROCK抑制剂是噻唑菌素。
32.根据权利要求30或31所述的组合物，其中所述培养基无饲养层。
33.一种通过根据权利要求1-19中任一项所述的方法产生的分离的多能细胞或多能细胞系。
34.一种基因组工程改造的多能细胞或其细胞系，其使用通过根据权利要求1-19中任一项所述的方法产生的所述分离的多能细胞或细胞系。
35.一种衍生化非天然细胞，其是由根据权利要求33所述的分离的多能细胞或由根据权利要求34所述的基因组工程改造的多能细胞或细胞系再分化而来的。
36.根据权利要求35所述的衍生化非天然细胞，其中所述细胞是类免疫细胞，其中所述细胞包括CD34细胞、生血内皮细胞、造血干细胞或祖细胞、造血多潜能祖细胞、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞、B细胞或免疫调节细胞。
37.根据权利要求35或36所述的衍生化非天然细胞，其中所述细胞是包含以下至少一种特性的复原细胞：与其天然的细胞对应物相比，异染色质总体增加；线粒体功能改善；DNA损伤反应增强；端粒伸长和短端粒百分比降低；衰老细胞的比例减少；并且增殖、存活、持久性或记忆类功能的潜力更高。
38.一种用于治疗用途的组合物，其包含通过根据权利要求1至19中任一项所述的方法获得的多能细胞，和任选地一种或多种附加治疗剂。
39.一种用于治疗用途的组合物，其包含根据权利要求34所述的基因组工程改造的多能细胞或根据权利要求35至37所述的衍生化非天然细胞，以及任选地一种或多种附加治疗剂。
40.根据权利要求38或39所述的组合物，其用于治疗有需要的受试者。
41.一种用于制造应用于基于细胞的疗法的多能细胞的组合物，其中所述组合物包含根据权利要求1-19中任一项所述的方法产生的多能细胞。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述多能细胞是同种异体的或自体的。
43.一种用于药物用途的试剂盒，其包含根据权利要求1-19中任一项所述的方法获得的多能细胞。
44.一种用于药物用途的试剂盒，其包含根据权利要求34所述的基因组工程改造的多能细胞或根据权利要求35至37中任一项所述的衍生化非天然细胞。
45.一种用于在非多能细胞中引发重编程的体外***，其中所述***包括：
一个或多个第一质粒，其中所述第一质粒包含复制起点和编码一个或多个重编程因子而不是编码EBNA或其衍生物的多核苷酸；其中所述一个或多个第一质粒中的至少一个包含编码OCT4的多核苷酸；以及任选地以下的一种：
(1)包含编码EBNA的核苷酸序列的第二质粒，其中所述第二质粒不包含复制起点或编码重编程因子的多核苷酸；
(2)EBNA mRNA；和
(3)EBNA蛋白。
46.根据权利要求44所述的***，其中所述第二质粒具有高丢失率；和/或其中所述EBNA的表达是瞬时和时序性的。
47.根据权利要求45或46所述的***，其中所述***在细胞核不提供EBNA复制和/或连续表达。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的***，其中所述***能够在短时间内且在出现多能细胞形态和诱导内源多能性基因表达之前实现EBNA的瞬时/细胞质表达。
49.根据权利要求45至48中任一项所述的***，其中所述***能够在短时间内且在出现多能细胞形态和诱导内源多能性基因表达之前实现一种或多种重编程因子的瞬时/细胞质表达。
50.根据权利要求45至49中任一项所述的***，其中所述复制起点选自由多瘤病毒科病毒、***瘤病毒科病毒和γ疱疹病毒亚科病毒组成的组。
51.根据权利要求45至50中任一项所述的***，其中所述复制起点是选自由SV40、BK病毒(BKV)、牛***瘤病毒(BPV)或爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)组成的组的复制起点。
52.根据权利要求45至51中任一项所述的***，其中所述复制起点对应于，或源自野生型EBV复制起点。
53.根据权利要求45至52中任一项所述的***，其中所述EBNA是基于EBV的。
54.根据权利要求45至53中任一项所述的***，其中所述一个或多个第一质粒共同包含编码重编程因子的多核苷酸，所述重编程因子包括OCT4、SOX2、NANOG、KLF、LIN28、c-MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、HESRG、CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3和L1TD1中的一种或多种。
55.根据权利要求45至54中任一项所述的***，其中编码重编程因子的所述多核苷酸包含在多顺反子构建体或非多顺反子构建体中。
56.根据权利要求45至55中任一项所述的***，其中所述多顺反子构建体包含单个开放阅读框或多个开放阅读框。
57.根据权利要求45至56中任一项所述的***，其中所述***包含两个或更多个第一质粒，每个第一质粒均包含由多核苷酸的至少一个拷贝编码的相同或不同的重编程因子。
58.根据权利要求56所述的***，包含两个或更多第一质粒的所述***提供对重编程因子化学计量的控制。
59.根据权利要求45至58中任一项所述的***，其中所述第一质粒包含多于一个编码重编程因子的多核苷酸，其中所述相邻的多核苷酸操作性地通过编码自我裂解肽或IRES的接头序列连接。
60.根据权利要求45至59中任一项所述的***，其中所述自我裂解肽是选自包括F2A、E2A、P2A和T2A的组的2A肽。
61.根据权利要求45至60中任一项所述的***，其中包含在第一质粒构建体中的所述2A肽可以相同或不同。
62.根据权利要求45至61中任一项所述的***，其中在相邻位置上的两个2A肽不同。
63.根据权利要求45至62中任一项所述的***，其中所述第一质粒和所述第二质粒各自包含一个或多个用于表达重编程因子和EBNA的启动子，并且其中所述一个或多个启动子包含CMV、EF1α、PGK、CAG、UBC，以及其他合适的组成型、诱导型、内源调控型或时间、组织或细胞类型特异性的启动子中的至少一种。
64.根据权利要求45至63中任一项所述的***，其中所述第一质粒和所述第二质粒各自均包含CAG启动子。
65.一种试剂盒，其包含根据权利要求45至64中任一项所述的***。
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