CN106754729B - 利用Xist Tale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用Xist Tale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法，利用结合于Xist第一内含子区的基于类转录激活效应物样(Transcriptional‑activator‑like effectors,Tale)的抑制性转录因子R6联合Oct4、Sox2、Klf4和c‑Myc之间的协同作用提高小鼠成纤维细胞向诱导性多能干细胞的诱导效率。而且获得的iPSCs具有典型的多能性干细胞特性，包括参与嵌合体小鼠的发育。该方法不仅积极推进了iPSCs的临床应用和研究，而且为研究如何获得并提高人、猪和牛等其它哺乳动物iPSCs提供了新的技术和理论基础。

Description

利用Xist Tale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的 方法
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种利用Xist Tale抑制性转录因子联合Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc制备诱导性多能干细胞的方法。
背景技术
胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs)是一类高度未分化细胞，具有发育全能性。在适当条件下可以无限增殖，并可以分化出成体动物组织和器官的所有细胞，如造血细胞、神经细胞、心肌细胞等。在动物克隆、转基因动物生产、疾病治疗、组织工程、再生医学、疾病机理和治疗研究、药物发现和评价等诸多领域均具有应用价值。但是伦理法律以及免疫排斥等问题一直制约着ESCs技术的进一步发展和应用。
2006，日本科学家通过导入4种转录因子Oct4，Sox2，c-Myc，Klf4成功将鼠的体细胞重编程为ESCs状态，即诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，随后，人的iPSCs也用相似的基因改造方法获得。iPSCs具有与ESCs类似的生物学特征，包括具有分化出成体动物组织和器官的所有细胞的能力，如神经前体细胞、功能性的成熟神经细胞，造血前体细胞、造血细胞、血管内皮细胞，分泌胰岛素的β细胞，心肌细胞等。2009年，中国科学家周琪、曾凡一、高绍荣等利用iPSCs获得活体实验鼠，首次证明iPSCs与ESCs一样具有全能性。而且，由于iPSCs来源于自体细胞的重编程，较好地回避了长期以来围绕人类胚胎干细胞使用问题的伦理争论，同时也克服了异体移植存在的免疫排斥问题。这是科学史上的重大突破，在干细胞、发育生物学和医学研究领域中具有划时代意义。
但人们对iPSCs技术的研究尚在初级阶段，其效率低是iPSCs应用面临的主要障碍之一。在各种诱导方法中，逆转录病毒载体诱导细胞重编程效率最高，也仅为0.01％左右，慢病毒、腺病毒更低。如何获得高效的iPSCs技术成为目前国际上干细胞研究领域的热点。
iPSCs转化技术的核心是如何通过异源表达Oct4、Sox2等基因快速启动细胞内源性Oct4、Nanog等多能相关性基因的表达。在胚胎干细胞中，多能性调控因子OCT4、SOX2和NANOG等结合到Xist第一内含子区，以调控和维持Xist RNA的低水平状态。最近研究发现，在Xist第一内含子区结合的因子还包括多能性调控因子TCF3和PRDM14，以及早期胚胎发育调控因子CDX2等。而且有研究报道，Xist第一内含子在ESCs分化过程中具有增强子活性。作为多能性因子结合的关键区域，Xist第一内含子区的表观修饰状态可能与MEFs细胞的重编程息息相关，甚至可以提高iPSC的诱导效率。
类转录激活效应物(Transcriptional-activator-like effectors,TALEs)蛋白家族是来自于植物病原体-黄单胞杆菌的天然细菌效应蛋白。它与真核生物的转录因子相似，通过识别特异DNA序列来调节宿主基因转录，并促进细菌定植。人工体外合成的TALEs蛋白已经运用到基因工程的多个方面，包含具有基因组剪辑作用的类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和起基因转录修饰和调控作用的Tale-dTFs等，其中Tale-dTFs包含抑制性效应因子(TALE based designer transcription Repressors,Tale R-dTF)和激活性效应因子(TALE based designer transcription activators,Tale A-dTF)，它们的TALE蛋白分别与抑制结构域(如KRAB等)和激活结构域(如VP64)相连接，最终通过在结合位点募集各种不同的转录调控因子而达到改变结合位点的表观遗传修饰状态并调控靶基因开关的目的。而且，Tale-dTFs已成功地应用于MEF细胞的重编程及干细胞的分化、转分化实验中。
因此，利用结合于Xist第一内含子的Tale抑制性转录因子建立高效获得iPSCs的方法，不仅积极推进了iPSCs的临床应用和研究，而且为研究如何获得并提高人、猪和牛等其它哺乳动物iPSCs提供了新的技术和理论基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用Xist Tale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
1.细胞制备
获取胎鼠的成纤维细胞(mouse embryo fibroblast，MEF)，选择生长状态良好的MEF，丝裂霉素C处理，作为诱导和培养iPSCs的饲养层。
获取Oct4-GFP MEFs，选择生长状态良好的Oct4-GFP MEF，用于电转染并制备iPSCs。
2.建立高效获得诱导性多能干细胞的方法
在建立高效获得诱导性多能干细胞的方法中，利用含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的PiggyBac载体和Xist Tale抑制性转录因子转染。添加四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和结合于Xist第一内含子区的Tale抑制性转录因子R6为实验组，含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的单独处理或联合无特异性结合位点的ConR作为对照组，以确定不同组合转染Oct4-GFP MEFs获得iPSCs的效率，从而进一步确定高效获得iPSCs的方法。
电转染按照常规方法进行：利用电穿孔法将四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc及Xist Tale抑制性因子R6转染入生长良好的Oct4-GFP MEFs；。第二天将培养基更换为添加Dox的iPSC诱导用液体培养基(M15)，直到克隆形成，对克隆并进行碱性磷酸酶检测或挑选形态上类似胚胎干细胞的克隆进行扩大培养，进而进行诱导性多能干细胞生物学特征检测。对于符合诱导性多能干细胞生物学特征的克隆，被确定为诱导性多能干细胞。
显微镜下观察细胞形态变化。根据克隆形成情况，诱导25-30天后，确定各种方法获得iPSCs的效率；或对克隆进行机械传代以扩大培养，并进一步对获得的克隆进行生物学特征的鉴定。
3.iPSCs生物学特征鉴定
碱性磷酸酶AP活性检测，以确定获得的ESCs样克隆是否为AP染色阳性。
免疫荧光检测获得的ESC样克隆中ESCs相关蛋白的表达，抗体分别为anti-Oct4和anti-Nanog。对于核蛋白，需要进行PBT(PBS+0.1％Triton-100)处理，以使相应的抗体进入细胞核中与相应抗原结合。
通过体外和体内分化实验研究ESCs样克隆的分化潜能。体外分化利用拟胚体的形成以及拟胚体的自发分化形成各种细胞进行验证。体内分化潜能研究是将获得的ESC样克隆注射入NOD-SCID小鼠，观察畸胎瘤形成并分析畸胎瘤中三胚层分化情况。
RT-qPCR检测获得的ESC样克隆中ESCs多能基因表达，如Oct4、Sox2、Nanog等。
利用嵌合体制备技术研究ESC样细胞是否可以参与小鼠的正常发育，以确定ESC样细胞参与个体形成和发育的能力。
本发明的有益效果是：该方法提高了小鼠iPSCs的诱导效率，不仅积极推进了iPSCs的临床应用和研究，也为研究如何获得并提高人、猪和牛等其它哺乳动物iPSCs提供了新的技术和理论基础。。
附图说明
图1是本发明具体技术流程；
图2是本发明中Xist Tale抑制性效应因子R6的结构示意图；
图3是本发明中所使用载体在Xist基因上的结合位点；
图4是本发明中使用的Oct4-GFP MEFs(A、B比例尺分别为500μm和200μm)；
图5是本发明中诱导得到的Oct4-GFP阳性iPSC克隆形态图(A、B比例尺为200μm)；
图6是R6提高了iPSCs的诱导效率图(相对倍数，P<0.0)；
图7是本发明中获得的iPSCs的生长情况图(P15，比例尺为200μm)；
图8是本发明中获得的iPSCs具有典型的干细胞特性图(A:iPSCs的碱性磷酸酶(AP)染色呈阳性,比例尺为200μm；B:多能性因子OCT4和NANOG的免疫荧光染色呈阳性，比例尺为100μm；C:获得的iPSCs在体内具有向三胚层分化的能力(畸胎瘤实验),比例尺为100μm；D:获得的iPSCs在体外具有向三胚层分化的能力(拟胚体实验),比例尺为100μm；E:获得的iPSCs与ESCs的多能性相关基因的表达水平相近；F:获得的iPSCs参与了嵌合胚胎在体外的发育；G:获得的iPSCs参与了嵌合体小鼠的形成和发育)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明利用Xist Tale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法，包括以下步骤：
1)细胞制备
获取胎鼠的成纤维细胞MEF，经丝裂霉素C处理，作为诱导和培养iPSCs的饲养层；获取Oct4-GFP MEFs；
2)获得诱导性多能干细胞的方法
利用含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的PiggyBac载体和Xist Tale抑制性转录因子转染；添加四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和结合于Xist第一内含子区的Tale抑制性转录因子R6为实验组，含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的单独处理或联合无特异性结合位点的ConR作为对照组。
具体地说，所述步骤2)包括以下步骤：
A、Oct4-GFP MEF细胞的电转染：当Oct4-GFP MEF细胞达到80％汇合度时，用0.5g/L的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液于37℃消化5min，用等量的培养液中止消化，并对细胞计数，取1×106个细胞/电转体系，以1300rpm离心5min；弃上清后用100μL电转液重悬细胞；再将细胞移入电转杯Sigma Z706086-50EA中，选择电转仪Lonza，
Figure BDA0001200826720000051
程序A-023进行电激；向电转杯中加入500μL提前预热的培养液，最后将细胞悬液接种到事先准备好的铺有步骤1)中饲养层细胞的培养皿中进行培养；上述100μL电转液为包含1.0μgTRE-Oct4、2.0μg TRE-CKS、1.0μg转座酶HyBase、及1.0μg CAG-rtTA的Opti-MEM培养液；在此基础上，实验组另外添加2.0μg结合于Xist第一内含子的Tale抑制性转录因子R6，而对照组不添加其它载体，或者添加2.0μg无特异性结合位点的Tale抑制性转录因子ConR；TRE-CKS中的CKS是指c-Myc、Klf4和Sox2；
B、电转后iPSC的诱导及建系：电转染次日，培养液换为新鲜的添加2μg/mL Dox的M15培养液，并隔天换液；14天后，撤去Dox，换为2i培养液培养至第25-30天，至出现Oct4-GFP阳性克隆为止；第25天在荧光显微镜下镜检、计数，并拉制玻璃微针将表达Oct4-GFP阳性的细胞克隆挑出，用10μL移液枪将挑下的iPSC克隆转入提前加入30μL 0.5g/L的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液的圆底96孔板中，并于37℃消化8min，吹打数次后加入等量培养液终止消化，并接种于铺有步骤1)中饲养层细胞的平底96孔板中于37℃、5％CO2培养箱中培养，直到形成典型的iPSC克隆。
所述步骤B中利用结合于Xist第一内含子区的Tale抑制性转录因子R6联合四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc协同电转染MEF成为iPSC细胞，R6具体的结合位点如下：TTAAGTGTTATGGACAAGGA SEQ ID NO.1，GeneBank中参考基因序列号：NC_000086.7。
本发明中使用了3种培养基，具体配制方法如下：
1、小鼠胎儿成纤维细胞用液体培养基(M10)的配制：
含有10％胎牛血清、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青链霉素的KnockoutDMEM。
2、iPSCs诱导用液体培养基(M15)的配制：
含有15％胎牛血清、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青链霉素、0.1mMβ-巯基乙醇和106U/ml LIF的Knockout DMEM。
3、2i/LIF培养液：
含有N2、B27、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青链霉素、0.1mMβ-巯基乙醇和LIF(106U/ml)、PD(1.0μM)、CH(3.0μΜ)的DMEM/F12。
实施例1：载体的制备
利用小鼠Oct4Tale R-dTF载体(Reprogramming to pluripotency usingdesigner TALE transcription factors targeting enhancers(Gao et al.,2013))改造为特异性识别和结合Xist第一内含子区的Tale R-dTF(R6)，最终形成的R6为PB载体携带的由Doxycycline(Dox)依赖型启动子TRE驱动的表达载体(Xist Tale抑制性效应因子R6的结构及其结合位点，见图2和图3)。具体识别的DNA序列为TTAAGTGTTATGGACAAGGA(GeneBank中参考基因序列号：NC_000086.7)
实施例2：饲养层细胞的制备
取3-5代内长至80％汇合的MEFs，吸弃原培养液，加入终浓度为10mg/L的丝裂霉素C的MEF培养液6mL于100mm细胞培养皿处理细胞2.5h；弃去培养液，加5mL的D-PBS洗涤细胞，重复3次，完全去除丝裂霉素C，加入2mL0.5g/L的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液37℃孵育消化1min后，倒置相差显微镜下观察细胞收缩变圆后，用手轻拍培养皿侧壁，细胞层层随之从皿底脱下，此时加入等量的M10培养液终止消化；用电动移液器对皿壁和细胞悬液进行吹打混匀，收集细胞悬液至15mL离心管进行细胞计数，然后1000r/min离心3min后弃掉上清，用冻存液(10％FBS+10％DMSO+80％M10培养液)以2×106每管的浓度其冻存，待使用时对其进行解冻，每管解冻后可铺两个6孔板。
实施例3：Oct4-GFP MEFs的建系
性成熟的C57BL/6J母鼠与携带Oct4-GFP的MF1，129/sv公鼠按1(♂):2(♀)比例合笼，将见栓13.5d的孕鼠剖腹获取胎鼠，洗净后除去头部、四肢和尾部，洗净剪碎后用0.5g/L的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液于37℃水浴中消化20min，期间混匀几次；继续加入0.5g/L的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液，于37℃水浴中消化20min。吹打混匀后加入培养液终止消化，1000rpm离心10min。弃掉上清，加适量培养液，反复吹打约10次，置于T25培养瓶中于37℃、5％CO2培养箱中培养(Oct4-GFP MEFs生长状态见图4)，达到80％汇合度后，进行1：3-1：5传代和培养，其它细胞进行原代冻存。
实施例4：高效获得iPSCs方法的建立
1、Oct4-GFP MEFs的电转染：当细胞达到80％汇合度时，用0.5g/L的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液于37℃消化5min，用等量的培养液中止消化，并对细胞计数，取1×106个细胞/电转体系，以1300rpm离心5min。弃上清后用100μL电转液(内含1.0μg TRE-Oct4、2.0μg TRE-CKS、2.0μg R6和1.0μg转座酶HyBase、及1.0μg CAG-rtTA的Opti-MEM培养液)重悬细胞。再将细胞移入电转杯(Sigma)中，选择电转仪(Lonza，
Figure BDA0001200826720000083
)程序A-023进行电激；向电转杯中加入500μL提前预热的培养液，最后将细胞悬液接种到事先准备好的培养皿中进行培养。在此基础上，实验组另外添加2.0μg结合于Xist第一内含子的Tale抑制性转录因子R6，而对照组不添加其它载体，或者添加2.0μg无特异性结合位点的Tale抑制性转录因子ConR；TRE-CKS中的CKS是指c-Myc、Klf4和Sox2，通过对比，添加R6的实验组诱导形成iPS克隆的效率明显高于对照组，其中，在雌性中实验组的诱导效率为对照组的3.5倍，在雄性中实验组的诱导效率为对照组的2.5倍。(见图6和诱导形成iPS克隆数目统计表)
诱导形成iPS克隆数目统计表
Figure BDA0001200826720000081
Figure BDA0001200826720000082
Figure BDA0001200826720000091
2、对转入载体的Oct4-GFP MEFs进行诱导和培养：电转后次日，培养液换为新鲜的添加2μg/mL doxcycline(Dox)的M15培养液，并隔天换液。14天后，撤去Dox，换为2i培养液培养至第25-30天(至出现Oct4-GFP阳性克隆为止，见图5)。
3、对Oct4-GFP阳性的iPSC克隆进行计数并挑取单克隆建系：第25天在荧光显微镜下镜检、计数并统计诱导效率(见图6)，拉制玻璃微针将表达Oct4-GFP阳性的细胞克隆挑出，用10μL移液枪将挑下的iPSC克隆转入提前加入30μL 0.5g/L的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液的圆底96孔板中，并于37℃消化8min，吹打数次后加入等量培养液终止消化，并接种于铺有滋养层细胞的平底96孔板中于37℃、5％CO2培养箱中培养。
4、iPSCs的传代和培养：利用DPBS将96孔板中重新形成的iPSC克隆清洗一遍，加入0.5g/L的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液于37℃消化5min，吹匀后终止消化，1300rpm离心3min。弃上清并用培养液重悬接种于12孔板中进行培养(iPSCs的生长状态见图7)。
实施例5：获得的iPSCs的多能性鉴定
1、碱性磷酸酶染色(AP染色)
AP染液配制方法：①染液Sodium nitrite solution(1:50)与染液FRV-alkalinesolution(1:50)按1:1混匀，室温避光2min；②染液naphthol-AS-BI alkaline solution(1:50)，加入到Embryo water中。将配好的染液②加入到染液①中充分混匀。避光放置备用，现用现配。
利用12孔板培养iPSCs至第5天时，弃培养液，加入DPBS洗一遍，弃DPBS后每孔加入300μL的4％PFA室温固定15min。弃PFA后用Embryo water洗2遍，弃Embryo water并加入提前配制好的AP染液300μL，室温避光放置30-60min。显微镜下观察拍照(iPSCs的AP染色成强阳性，见图8A)。
2、iPSCs的免疫荧光染色
消化iPS细胞并计数，接种1×104个细胞于八孔板中，于培养箱中培养4天后进行免疫荧光染色。弃掉旧培养液，利用PBS洗2遍，加入4％PFA室温固定15min；PBS洗3遍，每次5min；加入IF buffer(含1％BSA和0.1％Triton的DPBS)，室温放置30min；加入I抗(Anti-Rat OCT4、Anti-Mouse NANOG)4℃冰箱避光过夜。IF buffer洗3遍，每次5min；加II抗(Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)、Goat Anti-Rat IgG)，室温避光放置1h。IF buffer洗3遍，每次5min；PBS洗1遍；33342染剂避光染色3min；PBS洗1遍；拆开八孔板，滴加封片液，加盖玻片，指甲油涂抹四周边缘完成封片。于激光共聚焦显微镜下观察并进行拍照(iPSCs的免疫荧光染色呈阳性，见图8B)。
3、分化能力的检测
①体内分化实验：将建系成功的iPSCs进行传代培养，直至饲养层细胞去除干净后，消化细胞并计数；收集1×106-2×106个细胞至1.5mL离心管，1300rpm离心3min，弃上清，向离心管中加入500μL的DPBS重悬iPSCs，将细胞悬液装入1mL注射器。抓取一只免疫缺陷型小鼠，用酒精擦拭注射部位(后腿根部)后进行皮下注射(左右两侧后腿各注射250μL)。8周后形成明显的肿块组织，并将分离的肿块组织置于4％多聚甲醛中固定，制备组织切片后进行苏木精、伊红染色。最后，显微镜下观察、拍照记录并分析结果(iPSCs体内可分化为三胚层组织，见图8C)。
②体外分化实验：事先向100mm培养皿中加入10mL PBS。消化iPSCs并计数，调整细胞浓度为1×105个/mL，并利用细胞悬液在皿盖上制备30μL的微滴。将皿盖小心翻过盖好并置于37℃、5％CO2培养箱中悬空培养。第5-7天即可观察到细胞聚合形成小球状，即拟胚体。将形成的拟胚体转移到八孔板中，每孔添加500μL M10培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。期间进行观察并换液，待到第10天左右，可观察到拟胚体已向四周扩散分化，荧光显微镜下观察已无绿色荧光时进行免疫荧光染色：弃掉八孔板中的培养液，PBS洗2遍，弃去PBS后加入4％PFA室温放置15min进行固定；弃去4％PFA后用洗液I(PBS+0.3％Triton)清洗3遍，每次5min；弃掉洗液I，加入洗液II(PBS+1％BSA+0.3％Triton)室温放置30min，加入一抗(AFP、T及NCAM1)于4℃冰箱孵育过夜。弃去一抗后用洗液I清洗3遍，每遍5min，并添加二抗(CY3荧光标记的山羊抗兔IgG)，避光放置1h；洗液I清洗3遍，每遍5min；DPBS清洗1遍，利用DAPI染色15min。DPBS清洗1遍后，弃掉DPBS后，拆分八孔板，滴加封片液，加盖玻片，指甲油涂抹四周边缘完成封片。最后于激光共聚焦显微镜下观察并进行拍照(iPSCs体外具有分化为三胚层组织细胞的能力，见图8D)。
4、利用RT-qPCR对iPSCs进行多能性基因表达的检测
①iPSCs总RNA提取：利用RNA提取试剂盒(Cat.No.74104，QIAGEN)完成iPSCs的总RNA提取。将收集到的RNA混匀后进行浓度与纯度的测定。
②iPSCs cDNA的制备：提前制冰，将试剂盒中的试剂在冰上融化。反转录反应体系为20μL，分为5μL和15μL两部分，5μL体系包括5μg的RNA，1μL的引物，然后用无核酸的水配制成5μL体系。70℃加热5min，然后迅速冰浴至少5min，微型离心机中离心10s，冰上放置直至15μL体系加入。15μL体系包括GoScriptTM5×缓冲液4.0μL，MgCl2(最终浓度1.5-5.0mM)2.5μL，dNTP 1.0μL，核糖核苷酸酶抑制剂0.5μL，GoScriptTM反转录酶1.0μL，无核酸水6μL。将5μL体系与15μL体系混匀，于25℃孵育5min后，42℃孵育1h。
③实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)反应：将试剂盒中的试剂于冰上融化，样品使用前混匀后离心富集。qPCR所用到的引物见表1.1；qPCR的反应体系为20μL(15μL Mix I+5μL Mix II，见表1.2)，反应条件见表1.3。将样品加入到96孔板中并记录加样信息，封好透明膜后离心，离心完成后将电脑连接RT-qPCR仪(Thermo，TCR0096)，更改电脑IP地址，打开软件PikoReal software，选择程序设定参数(参数设置见表1.3)，RT-qPCR反应完成后保存数据并进行分析(见图8E)。
表1.1 RT-qPCR所需引物信息(SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.15)
Figure BDA0001200826720000121
表1.2 RT-qPCR反应体系
Mix I：
Component 1× 26×
SYBR(2×) 10μL 260μL
cDNA 1μL 26μL
Nuclear-Free water 4μL 104μL
15μL
Mix II：
Component 1× 7×
Primer F+R(10μM) 0.8μL 5.6μL
Nuclear-Free water 4.2μL 29.4μL
5μL
表1.3 RT-qPCR反应条件
Figure BDA0001200826720000131
5、嵌合体小鼠的制备
①显微注射针的制备：利用水平微电极拉针仪(P-97)制作显微操作用针，选择程序为：P＝500，HEAT＝365，PULL＝55，VEL＝120，TIME＝100。拉制持卵针所使用的毛细玻璃管规格为：1.00mm O.D.×0.58mm I.D，拉制注射针所使用的毛细玻璃管规格为：1.00mmO.D.×0.78mm I.D。拉制完成后的持卵针口径为：90-120μm O.D.×18-21μm I.D，注射针口径为：15-18μm O.D.×1215μm I.D。
②供体囊胚的获得：对ICR母鼠进行超排处理并合笼，第二天检栓，见栓当日视为0.5天；选取3.5天的小鼠囊胚用于嵌合体制备的供体胚胎：在无菌室将怀孕3.5天小鼠断颈处死，使其腹部朝上，酒精消毒，使用眼科剪和尖头镊子解剖小鼠，将小鼠子宫和输卵管剪下并去除脂肪和子宫系膜。将子宫和输卵管放在盛有M2操作液的60mm平皿中，然后使用尖头镊子和1mL注射器(针头经断尖打磨处理)分别对子宫和输卵管进行冲洗。使用毛细玻璃管酒精灯下徒手拉针，用口吸管将胚胎拣出，M2清洗两遍后，利用KSOM培养液继续清洗两遍，然后置于提前平衡好的KSOM培养液中培养、备用。
③嵌合体小鼠的制备：选取核型正常的较低代次的小鼠iPSCs接种在铺有0.1％明胶的6孔板中培养，待细胞的汇合度达到70-80％时，用于嵌合体小鼠的制备。使用前弃培养液，DPBS洗一遍，0.5g/L的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化5min，1300rpm离心3min弃上清，M2操作液重悬iPSCs，剩余的iPSCs置于4℃冰箱备用。取一100mm培养皿的皿盖，制作15μL的M2操作滴，上面覆盖矿物油。将消化好的细胞以及准备好的胚胎用口吸管移到操作滴中进行嵌合体制备。利用压电式破膜仪(PiezoXpert)将胚胎透明带打孔，注射针吸取约15个iPSCs，然后注入胚胎内。注射完成后的胚胎转移至KSOM培养液中，部分胚胎体外培养，观察体外发育情况(见图8F)，部分胚胎2小时后用于胚胎移植。将2.5dpc的假孕母鼠腹腔注射麻醉，利用75％的酒精对背部皮毛进行消毒处理，利用眼科剪在其背部两侧分别剪开1cm开口，剪开体腔膜，用尖头镊子将其卵巢，输卵管和子宫拉出，将胚胎吸入口吸管，利用1mL注射器针头对其子宫进行穿孔，将吸入口吸管的胚胎吹入子宫中，每侧移植10枚胚胎，移植完成后利用手术缝合器将伤口夹好，放到加热板上待其苏醒后标记并放回鼠房，16-17天后小鼠出生，待小鼠长大后可观察到是否具有皮毛嵌合(见图8G)。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 利用Xist Tale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法
<120> 内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院有限公司
<130>
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<223> Xist Tale抑制性转录因子R6的结合位点
<400> 1
ttaagtgtta tggacaagga 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<223> 转录因子Oct4 基因的DNA 序列的上游引物
<400> 2
ctgagggcca ggcaggagca cgag 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<223> 转录因子Oct4 基因的DNA 序列的下游引物
<400> 3
ctgtagggag ggcttcgggc actt 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<223> 转录因子Sox2 基因的DNA 序列的上游引物
<400> 4
ggcagctaca gcatgatgca ggagc 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<223> 转录因子Sox2 基因的DNA 序列的下游引物
<400> 5
ctggtcatgg agttgtactg cagg 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<223> 转录因子Nanog 基因的DNA 序列的上游引物
<400> 6
caggagtttg agggtagctc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<223> 转录因子Nanog 基因的DNA 序列的下游引物
<400> 7
cggttcatca tggtacagtc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<223> 转录因子Esrrb 基因的DNA 序列的上游引物
<400> 8
cacttgggga ccagatgagc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<223> 转录因子Esrrb 基因的DNA 序列的下游引物
<400> 9
cggtacacga tgcccaagat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<223> 转录因子Prdm4 基因的DNA 序列的上游引物
<400> 10
gcatcctggt tcccacagag 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<223> 转录因子Prdm4 基因的DNA 序列的下游引物
<400> 11
ctgcagaaca cgccaaagtg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<223> 转录因子Stella 基因的DNA 序列的上游引物
<400> 12
agcgcctttc ccaagagaag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<223> 转录因子Stella 基因的DNA 序列的下游引物
<400> 13
agggtctttc agcaccgaca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<223> 转录因子Gapdh 基因的DNA 序列的上游引物
<400> 14
accacagtcc atgccatcac 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<223> 转录因子Stella 基因的DNA 序列的下游引物
<400> 15
tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims (2)

1.一种利用Xist Tale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)细胞制备
获取胎鼠的成纤维细胞MEF，经丝裂霉素C处理，作为诱导和培养iPSCs的饲养层；获取Oct4-GFP MEFs；
2)获得诱导性多能干细胞
A、Oct4-GFP MEF细胞的电转染：当Oct4-GFP MEF细胞达到80％汇合度时，用0.5g/L的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液于37℃消化5min，用等量的培养液中止消化，并对细胞计数，取1×106个细胞/电转体系，以1300rpm离心5min；弃上清后用100μL电转液重悬细胞；再将细胞移入电转杯中，用电转仪进行电激；向电转杯中加入500μL提前预热的培养液，最后将细胞悬液接种到事先准备好的铺有步骤1)中饲养层细胞的培养皿中进行培养；上述100μL电转液为包含1.0μg TRE-Oct4、2.0μg TRE-CKS、1.0μg转座酶HyBase、及1.0μg CAG-rtTA的Opti-MEM培养液；在此基础上，实验组另外添加2.0μg结合于Xist第一内含子的Tale抑制性转录因子R6，R6具体的结合位点如下：TTAAGTGTTATGGACAAGGA SEQ ID NO.1，GeneBank中参考基因序列号：NC_000086.7，而对照组不添加其它载体，或者添加2.0μg无特异性结合位点的Tale抑制性转录因子ConR；TRE-CKS中的CKS是指c-Myc、Klf4和Sox2；
B、电转后iPSC的诱导及建系：电转染次日，培养液换为新鲜的添加2μg/mL Dox的M15培养液，并隔天换液；14天后，撤去Dox，换为2i培养液培养至第25-30天，至出现Oct4-GFP阳性克隆为止；第25天在荧光显微镜下镜检、计数，并拉制玻璃微针将表达Oct4-GFP阳性的细胞克隆挑出，用10μL移液枪将挑下的iPSC克隆转入提前加入30μL 0.5g/L的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液的圆底96孔板中，并于37℃消化8min，吹打数次后加入等量培养液终止消化，并接种于铺有步骤1)中饲养层细胞的平底96孔板中于37℃、5％CO2培养箱中培养，直到形成典型的iPSC克隆。
2.根据权利要求1所述的利用Xist Tale抑制性转录因子制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述电转杯为Sigma Z706086-50EA，电转仪采用Lonza，
Figure FDA0002272041410000021
程序A-023进行电激。
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