CN109679918A - 一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法 - Google Patents

一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109679918A
CN109679918A CN201811586070.4A CN201811586070A CN109679918A CN 109679918 A CN109679918 A CN 109679918A CN 201811586070 A CN201811586070 A CN 201811586070A CN 109679918 A CN109679918 A CN 109679918A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cells
pluripotent stem
preparation
inductive pluripotent
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811586070.4A
Other languages
English (en)
Inventor
薛燕婷
廖宝剑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hefei Zhongke Stem Cell Regenerative Medicine Co Ltd
Original Assignee
Hefei Zhongke Stem Cell Regenerative Medicine Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hefei Zhongke Stem Cell Regenerative Medicine Co Ltd filed Critical Hefei Zhongke Stem Cell Regenerative Medicine Co Ltd
Priority to CN201811586070.4A priority Critical patent/CN109679918A/zh
Publication of CN109679918A publication Critical patent/CN109679918A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

本发明公开了一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法，将重编程载体通过脂质体转染的方法导入人类体细胞中，得到转染后的人类体细胞，将转染后的人类体细胞在人胚胎干细胞培养基中进行诱导培养，至人胚胎干细胞样克隆产生，挑取人胚胎干细胞样克隆进行扩增培养，鉴定细胞的多能性后得到人诱导性多能干细胞。通过本发明提供的制备方法能够获得无外源基因整合的人诱导性多能干细胞，而且与现有技术相比，本发明中的制备方法实验成本低且对实验设备的要求低，简便易操作。

Description

一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法。
背景技术
多能干细胞(pluripotent stem cell)是一类具有自我更新能力以及向三胚层分化的干细胞，在再生医学领域具有广阔的应用前景。人诱导性多能干细胞(iPSC)的制备方法可以实现将体细胞转变为诱导性多能干细胞的设想，从而能够获得充足的、病人自体来源的iPSC。iPSC不仅可以应用于疾病的再生医学治疗，还能够有效地避免免疫排斥问题。目前最常用的iPSC制备方法包括逆转录病毒或慢病毒诱导、外随体电转诱导、仙台病毒诱导。
然而，目前常用的iPSC的制备方法仍有待改进。其中通过逆转录或慢病毒诱导得到的iPSC，由于有外源基因的整合，iPSC的使用安全性会降低。通过外随体电转及仙台病毒诱导得到的iPSC，虽然无外源基因整合，具有较高的使用安全性，但是外随体电转诱导对实验设备要求高，而仙台病毒诱导实验成本高，且普通实验室无法制备，必须购买，均限制了iPSC的研究与应用。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法，使用此方法，只需要具备基本的细胞培养条件，即可便捷的获得无外源基因整合的人诱导性多能干细胞。
本发明提出的一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：
a、将重编程载体通过脂质体转染的方法导入人类体细胞中，得到转染后的人类体细胞；
b、将转染后的人类体细胞在人胚胎干细胞培养基中进行诱导培养，至人胚胎干细胞样克隆产生，挑取人胚胎干细胞样克隆进行扩增培养，经过鉴定后得到人诱导性多能干细胞。
优选地，所述人类体细胞为尿液细胞。
优选地，所述重编程载体包括：
第一重编程载体，所述第一重编程载体包括OriP复制位点，EF1α启动子，EBNA1表达序列，miR-302-367簇；
第二重编程载体，所述第二重编程载体包括OriP复制位点，EF1α启动子，转录因子。
优选地，所述第一重编程载体的数量为1个，单个第二重编程载体包含1个或2个转录因子。
优选地，所述重编程载体的大小不超过10000bp。
优选地，所述转录因子为OCT4、SOX2、SOX1、KLF4、KLF5、l-MYC、n-MYC、c-MYC、ESRRB、LRH、NANOG、LIN28、SV40LT中的一种或多种。
优选地，所述转录因子为OCT4、SOX2、KLF4、SV40LT。
优选地，所述转录因子OCT4与SOX2通过IRES序列或2A序列进行串联。
本发明提出的一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法，OriP复制位点在EBNA1表达序列存在的情况下，可以使重编程载体独立于细胞基因组进行复制，并随着细胞传代而逐渐丢失，保证利用本发明提供的制备方法得到的人诱导性多能干细胞无外源基因整合，提高了人诱导性多能干细胞的使用安全性。在本发明使用的重编程载体中，每个重编程载体仅包含1-2个转录因子，使重编程载体大小均控制在10000bp以内，显著提高了脂质体转染的效率。另外，重编程载体中的EF1α启动子、miR-302-367簇能够提高对尿液细胞的诱导效果，使得本发明与现有技术相比，获得人诱导性多能干细胞的实验成本低且对实验设备的要求低，简便易操作。
附图说明
图1为实施例1中尿液细胞进行脂质体转染前的显微镜照片；
图2为实施例1中尿液细胞进行脂质体转染后第6h的显微镜照片；
图3为实施例1中尿液细胞转染载体后诱导培养第4天的显微镜照片；
图4为实施例1中尿液细胞转染载体后诱导培养第14天的显微镜照片；
图5为实施例1中尿液细胞转染载体后诱导培养第25天的显微镜照片；
图6为实施例1中尿液细胞经过诱导培养形成的人胚胎干细胞样克隆；
图7为实施例1中检测人诱导性多能干细胞标记物OCT4的表达；
图8为实施例1中检测人诱导性多能干细胞表面标记物SSEA4的表达；
图9为实施例1中检测人诱导性多能干细胞表面标记物TRA-1-81的表达；
图10为实施例1中获得的人诱导性多能干细胞具有分化为内胚层的能力；
图11为实施例1中获得的人诱导性多能干细胞具有分化为中胚层的能力；
图12为实施例1中获得的人诱导性多能干细胞具有分化为外胚层的能力。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
本发明提出的一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法：
(1)重编程载体的构建
用核酸内切酶RruI和KpnI切除pCEP4(Invitrogen)质粒中包括潮霉素和CMV启动子在内的核酸序列：
在1.5mLEP管中加入5μl10×FastDigest buffer(Thermo Scientific)，1μgpCEP4质粒，1μlFastDigest RruI(Thermo Scientific)，1μl FastDigest KpnI(ThermoScientific)，加入ddH2O补足至50μl，在37℃条件下酶切2h，经过琼脂糖凝胶电泳回收7500bp左右的片段，得到pCEP4质粒的酶切后片段。
通过PCR获得含有核酸内切酶KpnI酶切位点的EF1α启动子序列：
表1 PCR所用特异性引物
引物序列
上游引物1 GGCTCCGGTGCCCGTCAGT
下游引物1 AACGGTACCTCACGACACCTGAAATGGAAGAAA
表2 PCR体系
10×KOD Plus buffer(TOYOBO) 5μl
2.5mM dNTP 5μl
上游引物(5μM) 2.5μl
下游引物(5μM) 2.5μl
KOD Plus(TOYOBO) 1μl
MgSO4(25mM) 2μl
pCEP4质粒 100ng
ddH<sub>2</sub>O 补足至50μl
按照以下PCR程序进行扩增：
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并回收1200bp左右的目的产物，用核酸酶内切酶KpnI对目的产物进行单酶切：
在1.5mLEP管中加入5μl10×FastDigest buffer(Thermo Scientific)，20μl目的产物，1μlFastDigest KpnI(Thermo Scientific)，加入ddH2O补足至50μl，在37℃的条件下酶切2h，直接进行回收得到连接片段。
将pCEP4质粒的酶切后片段与连接片段通过连接酶连接：
在PCR管加入5μlSolution I，0.5μlpCEP4质粒的酶切后片段，4.5μl连接片段，在16℃的条件下连接30min得到连接产物，将连接产物转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆扩大培养、抽提质粒，经测序鉴定正确后得到含有OriP复制位点、EF1α启动子、EBNA1表达序列的pEP4M质粒。
用核酸内切酶NsiI及ClaI切除pEP4M质粒中EBNA1表达序列：
在1.5mLEP管中加入5μl10×FastDigest buffer(Thermo Scientific)，1μgpEP4M质粒，1μlFastdigest Bsu15I(即ClaI)(Thermo Scientific)，1μlFastDigestMph1103I(即NsiI)(Thermo Scientific)，加入ddH2O补足至50μl，在37℃的条件下酶切2h，经过琼脂糖凝胶电泳回收5000bp左右的片段，得到pEP4M质粒的酶切后片段。
通过PCR扩增出pEP4M质粒中被核酸内切酶NsiI及ClaI部分切除的OriP复制位点序列：
表3 PCR所用特异性引物
引物序列
上游引物2 GCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCA
下游引物2 AATTCCATCGATTAAATTCACCTAAGAATGGGAGCAACC
表4 PCR体系
10×KOD Plus buffer(TOYOBO) 5μl
2.5mM dNTP 5μl
上游引物(5μM) 2.5μl
下游引物(5μM) 2.5μl
KOD Plus(TOYOBO) 1μl
MgSO4(25mM) 2μl
pEP4M质粒 100ng
ddH<sub>2</sub>O 补足至50μl
按照如下PCR程序进行扩征：
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并回收500bp左右的目的产物，将目的产物用核酸内切酶NsiI、ClaI进行双酶切：
在1.5mLEP管中加入5μl10×FastDigest buffer(Thermo Scientific)，20μl目的产物，1μlFastdigest Bsu15I(即ClaI)(Thermo Scientific)，1μlFastDigest Mph1103I(即NsiI)(Thermo Scientific)，加入ddH2O补足至50μl，在37℃的条件下酶切2h，直接回收得到连接片段。
将pEP4M质粒的酶切后片段与连接片段进行连接：
在PCR管中加入5μl Solution I，0.5μlpEP4M质粒的酶切后片段，4.5μl连接片段，在16℃的条件下连接30min，转化进大肠杆菌DH5α感受态，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆扩大培养、抽提质粒，经测序鉴定正确后得到包含OriP复制位点，EF1α启动子且不携带EBNA1表达序列的pEP4MM质粒。
将miR-302-367簇克隆入pEP4M质粒中EF1α启动子后的多克隆位点，得到第一重编程载体；将转录因子OCT4与SOX2通过2A序列连接后克隆入pEP4MM质粒中EF1α启动子后的多克隆位点，得到第二重编程载体1；将转录因子Klf4、SV40LT克隆入另一个pEP4MM质粒中EF1α启动子后的多克隆位点，得到第二重编程载体2。将三种重编程载体分别经无内毒素提取试剂盒纯化，混合后按转染试剂说明书要求，使用脂质体(lipofectamine 3000)将重编程载体转染入尿液细胞内。
(2)尿液细胞的诱导培养
诱导培养基的配制：
在人胚胎干细胞培养基mTeSR1(Stem Cell Technologies)中加入四种促进细胞重编程的小分子化合物PD0325901(Selleck)、CHIR99021(Selleck)、A-83-01(sigma-aldrich)及Thiazovivin(Selleck)，使四种小分子化合物的工作浓度分别为0.5μM/L、3μM/L、0.5μM/L、0.5μM/L。
用无菌收尿杯收集中后段尿液，将收集到的尿液转入离心管中，400g离心10min，吸去上清至每管留下约1-5ml液体，加入含有双抗(青霉素500U/ml，链霉素500μg/ml)(GIBCO)的PBS(Genom)，400g离心10min。吸掉上清至剩余0.5-1ml液体，将剩余的液体重悬后加入包被0.1％明胶(Millipore)的6孔培养板中，并加入3ml含有0.2％(v/v)Primocin(InvivoGen)的REGM培养基(LONZA)。
将6孔培养板置于37℃二氧化碳培养箱内静置培养3天，于第3天在显微镜下观察细胞是否污染，如果污染，则重新收集；若无污染，则继续静置培养大约2周时间，期间每3天更换一次培养基，得到第一代尿液细胞。
吸去培养基，将得到的第一代尿液细胞用PBS清洗两遍后，加入500μl0.25％胰酶-EDTA(GIBCO)，室温消化至轻敲培养板细胞飘起，加入FBS(GIBCO)终止消化。
吹打分散尿液细胞并收集入离心管中，200g离心5min，吸去上清，加入REGM培养基(LONZA)，细胞吹散后传入包被了Matrigel(BD)的6孔板内，在37℃二氧化碳培养箱内培养，待细胞生长至70％融合度时，使用lipofectamine3000(ThermoFisher)按说明书操作，将重编程载体进行转染进尿液细胞中。转染6h后换液为诱导培养基，诱导培养10天左右，然后更换为人胚胎干细胞培养基mTeSR1(Stem Cell Technologies)再继续培养15天左右，期间每天更换一次培养基。挑取人胚胎干细胞样克隆进行扩增培养，扩增培养到第10代左右进行人诱导性多能干细胞鉴定实验。
(3)人诱导性多能干细胞鉴定实验
人诱导性多能干细胞多能性标记物检测实验：
一抗：Mouse anti-OCT4 antibody(Santa Cruz Biotechnology sc-5279)
Mouse anti-SSEA4 antibody(Abcam ab16287)
TRA-1-81antibody(Millipore MAB4381)
二抗：Goat anti-Mouse IgG(H+L)Highly Cross-Adsorbed SecondaryAntibody,Alexa Fluor Plus 488(Invitrogen)
将细胞用PBS清洗一遍，加入0.25％胰酶-EDTA(GIBCO)室温消化至轻敲培养板细胞飘起，加入FBS(GIBCO)终止消化，轻轻吹打将细胞分散，收集入离心管内200g离心5min。吸去上清，用PBS洗一次后，200g离心5min弃上清。加入200μl Cytofix Fixation Buffer(BD)室温固定20min，用PBS清洗2次。将SSEA4及TRA-1-81抗体用PBS按照1:50的比例进行稀释后加入细胞中，在37℃的条件下孵育30min；加入OCT4抗体之前，向细胞中加入200μl用去离子水按1：10的比例稀释的Perm/Wash Buffer I(BD)，在4℃条件下通透15min，离心弃上清后用PBS清洗2次，将OCT4抗体用PBS按照1:50的比例进行稀释后加入细胞中，在37℃的条件下孵育30min。将SSEA4、TRA-1-81、OCT4抗体弃去后用PBS清洗2遍。将二抗用PBS按1：100比例稀释后加入细胞中，在37℃条件下避光孵育30min，PBS洗2次后用流式细胞仪检测人诱导性多能干细胞标记物OCT4、人诱导性多能干细胞表面标记物SSEA4、TRA-1-81的表达。
(2)检测人诱导性多能干细胞的分化能力
将大约500万个经过诱导培养得到的细胞注射入免疫缺陷小鼠腹股沟部位，经过1-2个月，取出小鼠体内的畸胎瘤制作成组织切片并进行苏木精-伊红染色，显微镜下观察经过诱导培养得到的细胞的分化能力。
实施例1中尿液细胞在转染前后的细胞状态如图1、图2所示，从图1、图2的对比中可以看出，本发明中通过脂质体转染重编程载体的方法对细胞损伤较小。图3、图4、图5、显示了实施例1中尿液细胞在诱导培养过程中细胞形态的变化，图6为尿液细胞经过诱导培养形成的单克隆，表明本发明提供的制备方法可以诱导体细胞形成人胚胎干细胞样克隆。通过流式细胞仪检测人诱导性多能干细胞标记物OCT4、人诱导性多能干细胞表面标记物SSEA4、TRA-1-81在实施例1中经过诱导培养的细胞中表达，结果分别如图7、图8、图9所示，显示人诱导性多能干细胞多能性标记物为阳性。显微镜下可观察到畸胎瘤中存在由内胚层发育而来的腺体，如图10所示；由中胚层发育而来的软骨，如图11所示；以及由外胚层发育的神经组织，如图12所示，表明通过本发明中的制备方法诱导培养得到的细胞具有分化成内、中、外胚层的能力，具有多能性，证明本发明中的方法可以便捷的得到人诱导性多能干细胞。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 合肥中科干细胞再生医学有限公司
<120> 一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法
<130> 2018.12.21
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ggctccggtg cccgtcagt 19
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
aacggtacct cacgacacct gaaatggaag aaa 33
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gctatcctaa tctgtatccg ggtagca 27
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
aattccatcg attaaattca cctaagaatg ggagcaacc 39

Claims (8)

1.一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将重编程载体通过脂质体转染的方法导入人类体细胞中，得到转染后的人类体细胞；
b、将转染后的人类体细胞在人胚胎干细胞培养基中进行诱导培养，至人胚胎干细胞样克隆产生，挑取人胚胎干细胞样克隆进行扩增培养，经过鉴定后得到人诱导性多能干细胞。
2.根据权利要求1所述便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述人类体细胞为尿液细胞。
3.根据权利要求1或2所述便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述重编程载体包括：
第一重编程载体，所述第一重编程载体包括OriP复制位点，EF1α启动子，EBNA1表达序列，miR-302-367簇；
第二重编程载体，所述第二重编程载体包括OriP复制位点，EF1α启动子，转录因子。
4.根据权利要求3所述便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述第一重编程载体的数量为1个，单个第二重编程载体包含1个或2个转录因子。
5.根据权利要求1-4任一项所述便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述重编程载体的大小不超过10000bp。
6.根据权利要求3或4所述便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述转录因子为OCT4、SOX2、SOX1、KLF4、KLF5、l-MYC、n-MYC、c-MYC、ESRRB、LRH、NANOG、LIN28、SV40LT中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述转录因子为OCT4、SOX2、KLF4、SV40LT。
8.根据权利要求7所述便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述转录因子OCT4与SOX2通过IRES序列或2A序列进行串联。
CN201811586070.4A 2018-12-25 2018-12-25 一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法 Pending CN109679918A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811586070.4A CN109679918A (zh) 2018-12-25 2018-12-25 一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811586070.4A CN109679918A (zh) 2018-12-25 2018-12-25 一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109679918A true CN109679918A (zh) 2019-04-26

Family

ID=66189074

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811586070.4A Pending CN109679918A (zh) 2018-12-25 2018-12-25 一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109679918A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113122505A (zh) * 2021-04-13 2021-07-16 四川大学华西医院 一种通过逆病毒获取尿源诱导多能干细胞的方法
WO2023273882A1 (zh) * 2021-06-30 2023-01-05 呈诺再生医学科技(珠海横琴新区)有限公司 一种高效无遗传修饰的iPSC诱导、产业化单克隆挑取平台及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102625837A (zh) * 2009-08-07 2012-08-01 国立大学法人京都大学 有效建立诱导的多能干细胞的方法
CN102628029A (zh) * 2012-03-29 2012-08-08 中国科学院广州生物医药与健康研究院 地贫诱导多能干细胞及其制备方法和用途
CN105624102A (zh) * 2016-02-02 2016-06-01 中国科学院广州生物医药与健康研究院 利用人的尿液细胞构建软骨组织的方法
CN106414721A (zh) * 2014-03-04 2017-02-15 菲特治疗公司 改良的重编程方法和细胞培养平台

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102625837A (zh) * 2009-08-07 2012-08-01 国立大学法人京都大学 有效建立诱导的多能干细胞的方法
US20150140662A1 (en) * 2009-08-07 2015-05-21 Kyoto University Method of producing induced pluripotent stem cells using a dominant negative mutant of p53
CN102628029A (zh) * 2012-03-29 2012-08-08 中国科学院广州生物医药与健康研究院 地贫诱导多能干细胞及其制备方法和用途
CN106414721A (zh) * 2014-03-04 2017-02-15 菲特治疗公司 改良的重编程方法和细胞培养平台
CN105624102A (zh) * 2016-02-02 2016-06-01 中国科学院广州生物医药与健康研究院 利用人的尿液细胞构建软骨组织的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENXIA HU ET AL.: ""Current reprogramming systems in regenerative medicine: from somatic cells to induced pluripotent stem cells"", 《REGEN. MED.》 *
DONGSHENG GUO ET AL.: ""Generation of non-integrated induced pluripotent stem cells from a 23-year-old male with multiple endocrine neoplasia type 1 syndrome"", 《STEM CELL RESEARCH》 *
DONGSHENG GUO ET AL.: ""Generation of non-integrated induced pluripotent stem cells from a 59-year-old female with multiple endocrine neoplasia type 1 syndrome"", 《STEM CELL RESEARCH》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113122505A (zh) * 2021-04-13 2021-07-16 四川大学华西医院 一种通过逆病毒获取尿源诱导多能干细胞的方法
WO2023273882A1 (zh) * 2021-06-30 2023-01-05 呈诺再生医学科技(珠海横琴新区)有限公司 一种高效无遗传修饰的iPSC诱导、产业化单克隆挑取平台及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102093981B (zh) 一种高效诱导人类体细胞重编程为多潜能干细胞的方法
Ghasemi‐Dehkordi et al. Comparison between the cultures of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) on feeder‐and serum‐free system (Matrigel matrix), MEF and HDF feeder cell lines
CN102144027B (zh) 生产多能干细胞的方法
Slamecka et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions
Lu et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system
CN104136604A (zh) 来自人类脐带组织衍生的细胞的诱导性多能干细胞
CN109679918A (zh) 一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法
WO2017097007A1 (zh) 分化培养基及其在制备神经干细胞中的用途
CN105002143B (zh) 一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为血管内皮样细胞的方法
Wei et al. Derivation of endothelial cells from porcine induced pluripotent stem cells by optimized single layer culture system
CN102286535A (zh) 一种成纤维细胞转分化为肝干细胞的方法
CN103589686A (zh) 一种运用人脐带间充质干细胞作为饲养层培养人诱导多能干细胞的方法
CN102586171A (zh) 一种绵羊可诱导多能干细胞及其制备方法
US20170304430A1 (en) Virus vector, cell, and construct
CN102586176B (zh) 一种新型的无动物源、无饲养层的人多能干细胞培养***
CN101613717B (zh) 用猪成纤维细胞生成诱导的多能性干细胞的方法
CN102653774B (zh) 山羊可诱导多能干细胞的制备方法
Mohamed et al. Umbilical cord tissue as a source of young cells for the derivation of induced pluripotent stem cells using non-integrating episomal vectors and feeder-free conditions
CN101705247A (zh) 利用转录因子转染牛体细胞成为诱导性多能干细胞的方法
CN103739718A (zh) 用于诱导多能干细胞的融合蛋白及其使用方法
El-Sayed et al. Pluripotent state induction in mouse embryonic fibroblast using mRNAs of reprogramming factors
KR101768451B1 (ko) 비-바이러스성 벡터를 이용하여 체세포를 간세포로 직접 교차분화시키는 방법
CN110499331A (zh) 外源性人端粒酶反转录酶基因重组慢病毒颗粒的获得方法
CN103756969B (zh) 建立iPS的方法
Sivapatham et al. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190426