JP2019500910A - ベクターを含まない人工多能性幹細胞を作製するための方法およびベクター - Google Patents

Abstract

本発明は、リプログラミングベクターを含まない人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法に一般的に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、リプログラミング因子および／または合成転写因子ならびに自殺遺伝子を含む少なくとも１つの発現カセットを含むエピソーマルベクターを導入することによって、体細胞に多能性を誘導することに関する。いくつかの実施態様において、本発明は、リプログラミング因子および／または合成転写因子ならびに転写制御されたＥＢＮＡ−１遺伝子を含む発現カセットを含むエピソーマルベクターを導入することによって、体細胞に多能性を誘導することに関する。いくつかの実施態様において、本発明は、リプログラミング因子および／または合成転写因子ならびに自殺遺伝子および転写制御されたＥＢＮＡ−１遺伝子の両方を含む発現カセットを含むエピソーマルベクターを導入することによって、体細胞に多能性を誘導することに関する。

Description

本発明は、リプログラミングベクターを含まない人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法に一般的に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、リプログラミング因子および／または合成転写因子ならびに自殺遺伝子を含む少なくとも１つの発現カセットを含むエピソーマルベクターを導入することによって、体細胞に多能性を誘導することに関する。

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する、現在の細胞リプログラミング法は大抵、レトロウイルスを用いてリプログラミング因子を送達する。(Schlaeger et al., "A comparison of non-integrating reprogramming methods," Nat Biotechnol 33(1): 58-63 (2015) ("Schlaeger"))。これらのウイルス由来のＲＮＡはＤＮＡに逆転写され、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。しかしながら、そのような細胞は治療応用のための規制ガイドライン下では容認されない。したがって、ｉＰＳＣがいかなる外来性ＤＮＡ配列も含まないことを保証する、他のリプログラミング法が必要とされる。

Schlaegerによって要約されるように、主要な手法は、マイクロＲＮＡを含む、および含まないメッセンジャーＲＮＡの遺伝子導入の使用、およびＥＢＮＡ−１に基づくエピソームの発現ベクターの使用を含む。ＲＮＡに基づく方法である前者は効率的にｉＰＳＣを作製できるが、必要な労働量および成功率（方法の頑強性）ならびに細胞種およびドナー特異性に関する重要な問題を示し得る。

エピソーマルベクターのリプログラミングは、該方法に必要な全ての特徴を考慮したリプログラミングのための魅力的で「オールラウンド」なシステムである。しかしながら、長期のベクターの保持または宿主細胞ゲノムへの組み込みのいずれかのために、広範な植え継ぎが外来性ＤＮＡを含まない株を樹立する前に必要であるという主要な問題が残っている。

エピソーマルベクターを用いた現在の細胞リプログラミングのプロトコルでは、作製したｉＰＳＣ株がベクターを含まないことを保証するために定量的な測定を行う必要がある。新規に作製されたｉＰＳＣは通常、遺伝子導入の２０〜３０日後にＰ０プレートから採取される。ほとんどのコロニーは採取時にベクターを保持しており、ベクター損失の速度論は種々のｉＰＳＣクローンにおいて様々であり、いくつかのクローンは低い継代数（５〜１０）においてベクターを含まないクローンとして同定され、他のクローンは高い継代数（１５〜３０）で同定される。このため、Ｐ０プレートから多くのｉＰＳＣクローンを採取し、それらをベクターの排除が達成されるまで長期間培養し続ける必要がある。この実践は時間および費用が重要な要因である細胞療法の応用への障害である。

いくつかの実施態様において、本発明は、リプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する効率的な方法を提供し、これは以下を含む：（ａ）リプログラミングベクターをヒト体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでリプログラミングベクターはウイルスの複製起点、少なくとも１つのｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット、ならびに自殺遺伝子を含む；（ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子および／または合成転写因子の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること；および（ｃ）第２の細胞集団を自殺遺伝子基質と接触させ、リプログラミングベクターを本質的に含まない細胞集団を作製すること。

いくつかの実施態様において、本発明は、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法に関し、これは以下を含む：（ａ）エピソーマルリプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでエピソーマルリプログラミングベクターは、（ｉ）ＯｒｉＰ複製起点、（ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット、（ｉｉｉ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド、および（ｉｖ）チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子を含む；（ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子および／または合成転写因子の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること；（ｃ）第２の細胞集団を自殺遺伝子基質と接触させ、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。

さらなる実施態様において、本発明は、リプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法を提供し、これは以下を含む：（ａ）リプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでリプログラミングベクターは、ｉ）ウイルスの複製起点、ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット、ｉｉｉ）リプログラミングベクターの染色体外での複製および分配を制御する遺伝子、およびｉｖ）制御されたプロモーターシステムを含む；（ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子および／または合成転写因子の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること、ここで第１の細胞集団の培養中にリプログラミングベクターは複製される；および（ｃ）第２の細胞集団を培養すること、ここでリプログラミングベクターの染色体外での複製および分配を制御する遺伝子は、リプログラミングベクターが細胞***中に消失するように制御され、リプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製する。

さらなる実施態様において、本発明は、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法を提供し、これは以下を含む：（ａ）エピソーマルリプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでエピソーマルリプログラミングベクターは、（ｉ）ＯｒｉＰ複製起点、（ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット、ｉｉｉ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド、および（ｉｖ）テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体に制御されたプロモーターシステム（ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆ）を含む；（ｂ）第１の細胞集団を培養し、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること、ここで培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製される；（ｃ）第２の細胞集団を培養し、第３の細胞集団を作製すること、ここで培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製されない；（ｄ）コロニーを第３の細胞集団から選択し、第４の細胞集団を作製すること；および（ｅ）第４の細胞集団を培養し、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。

さらなる実施態様において、本発明は、リプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法を提供し、これは以下を含む：（ａ）リプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでリプログラミングベクターは、ｉ）ウイルスの複製起点、ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット、ｉｉｉ）リプログラミングベクターの染色体外での複製および分配を制御する遺伝子、ｉｖ）制御されたプロモーターシステム、およびｖ）自殺遺伝子を含む；（ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子および／または合成転写因子の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること、ここで培養中にリプログラミングベクターは複製される；（ｃ）第２の細胞集団を培養すること、ここで染色体外での複製および分配を制御する遺伝子はリプログラミングベクターが細胞***中に消失するように制御され、リプログラミング因子を実質的に含まないｉＰＳＣを含む第３の細胞集団を作製する；および（ｄ）第３の細胞集団を自殺遺伝子基質と接触させ、リプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。

さらなる実施態様において、本発明は、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法を提供し、これは以下を含む：（ａ）エピソーマルリプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでエピソーマルリプログラミングベクターは、（ｉ）ＯｒｉＰ複製起点、（ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット、（ｉｉｉ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド、（ｉｖ）テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体に制御されたプロモーターシステム（ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆ）、および（ｖ）チミジンキナーゼおよびシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子を含む；（ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること、ここで培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製される；（ｃ）第２の細胞集団を培養し、エピソーマルリプログラミングベクターを実質的に含まないｉＰＳＣを含む第３の細胞集団を作製すること、ここで第２の細胞集団の培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製されない；および（ｄ）第３の細胞集団を自殺遺伝子基質に接触させ、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。

いくつかの実施態様において、本発明は、（ａ）ＯｒｉＰ複製起点；（ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット；（ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；および（ｄ）自殺遺伝子を含む、エピソーマルリプログラミングベクターを提供する。

さらなる実施態様において、本発明は、（ａ）ＯｒｉＰ複製起点；（ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット；（ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；および（ｄ）チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子を含む、エピソーマルリプログラミングベクターを提供する。

いくつかの実施態様において、本発明はさらに、（ａ）ＯｒｉＰ複製起点；（ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット；（ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；および（ｄ）制御されたプロモーターシステムを含む、エピソーマルリプログラミングベクターを提供する。

いくつかの実施態様において、本発明はさらに、（ａ）ＯｒｉＰ複製起点；（ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット；（ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；および（ｄ）ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆシステムを含む、エピソーマルリプログラミングベクターを提供する。

いくつかの実施態様において、本発明はさらに、（ａ）ＯｒｉＰ複製起点；（ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット；（ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；（ｄ）ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆシステム；および（ｅ）自殺遺伝子を含む、エピソーマルリプログラミングベクターを提供する。

いくつかの実施態様において、本発明はさらに、（ａ）ＯｒｉＰ複製起点；（ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット；（ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；（ｄ）ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆシステム；および（ｅ）チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子を含む、エピソーマルリプログラミングベクターを提供する。

本発明を説明する目的のために、本発明の特定の実施態様を図中に示す。しかしながら、本発明は図中に示された実施態様の詳細な配置および手段に限定されない。

図１は、ｉＰＳＣコロニーの増殖および分析の手順を示す。

定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本発明に関連する分野において通常の知識を有する者によって理解される意味と共通する意味を持つ。

本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の組成物または方法の工程に限定されず、それ自体が様々であり得ることが理解されるはずである。本明細書および添付された特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかな他の指示がない限り、複数の指示対象を含む。用語「ａ」（または「ａｎ」）ならびに「１以上」および「少なくとも１つ」は本明細書において互換的に使用され得る。

さらに、本明細書における「および／または」は、他方を含む、または含まない２つのそれぞれの特定の特徴または要素の具体的な開示として解釈される。したがって、本明細書における語句「Ａおよび／またはＢ」などにおいて使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、語句「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などにおいて使用される用語「および／または」は、以下の各実施態様を包含することが意図される：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。

本開示のあらゆる箇所において、割合および比などの全ての表現は他の指示がない限り、「重量による」。本明細書において、「重量による」は用語「質量による」と同義であり、本明細書で規定される比または割合が体積、厚さまたは他の何らかの寸法ではなく、重量によってなされることを示す。

本明細書で使用される用語「約」は、およそ、ほとんど、大体、またはおおよそを意味する。用語「約」が数値範囲と組み合わせて使用される場合、この用語は規定されている数値の上限および下限を拡張することによって、その範囲を改変する。一般に、本明細書で使用される用語「約」は、１０％の変動によって規定された値よりも高い数値、および低い数値に改変する。

単位、接頭辞および記号は国際単位系（ＳＩ）に認められた形式で示される。数値範囲は、範囲を規定する数を含む。他の指示がない限り、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの配向で左から右に記載される。本明細書において提供される表題は、本発明の様々な態様または実施態様を限定せず、これは本明細書を全体として参照することによって有され得る。したがって、以下に規定されている用語は、本明細書全体の参照によってより完全に規定される。

実施態様が言語「含む」と共に本明細書において記述される場合は常に、「からなる」および／または「から本質的になる」に関して記述される他の類似の実施態様もまた提供されることが理解される。

アミノ酸は、周知の３文字の記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会に推奨されている１文字の記号のいずれかによって本明細書で言及される。同様にヌクレオチドは、一般的に認められた１文字のコードによって言及される。

「リプログラミング」は、ある特定の細胞種を別の細胞種に変換することである。例えば、リプログラミングは体細胞種（線維芽細胞など）を多能性細胞種に変換することである。リプログラミングを受けた測定可能な割合の細胞（子孫）が、十分な増殖後にリプログラミング前とは異なる新たな細胞種の表現型の特徴を有する場合、細胞はリプログラミングされている。特定の条件下において新たな細胞種の特徴を有する子孫の割合は、少なくとも約０．０５％、０．１％、０．２％、０．５％、１％、５％、２５％またはそれ以上であり得る。

「ベクター」または「コンストラクト」（遺伝子送達「媒体」または遺伝子導入「媒体」と呼ばれることもある）は、インビトロ(in vitro)またはインビボ(in vivo)のいずれかにおいて宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子または分子の複合体を指す。ベクターは直鎖分子または環状分子であり得る。

「エピソーマルベクター」は、ベクターが存在する細胞中の染色体ＤＮＡとは独立して複製する（上記で定義された）ベクターを指す。

ベクターの一般的な種類である「プラスミド」は、適合した細胞中の染色体ＤＮＡと独立して複製できる染色体ＤＮＡとは別個の染色体外ＤＮＡ分子である。例えば、特定のプラスミド（ｐＵＣなど）は細菌中で独立して複製するが、哺乳類細胞中では独立して複製しない。ある場合において、プラスミドは環状および二本鎖である。

「複製の起点」（「ｏｒｉ」）または「複製起点」はＤＮＡ複製に関与するＤＮＡ配列である。一般に、これらは細菌またはウイルスに由来し、それぞれは別個の特徴を含む。細菌の「ｏｒｉ」は細菌細胞のＤＮＡ複製に必要である。全ての一般的なプラスミド／ベクターはこのような領域を含み（大抵ｐＵＣベクターに由来する）、効率的な増殖を可能にする。ウイルスの「ｏｒｉ」（例えばリンパ増殖性ヘルペスウイルス由来）は、哺乳類細胞中での複製を可能にするように機能する。適切な係留タンパク質（例えばＥＢＮＡ−１）と共に存在する場合、細胞はＤＮＡ合成を開始する部位またはその付近の部位にベクターを維持でき、細胞***中にＤＮＡの複製および分配をもたらす。ＥＢＶのためのｏｒｉはＦＲ配列（３０ｂｐの反復配列の不完全な２０コピー）、および好ましくはＤＳ配列を含む。しかしながら、ＥＢＶの他の部位はＥＢＮＡ−１を結合する（例えば、Ｒｅｐ＊配列は複製起点としてＤＳの代わりとなり得る）。したがって、ＥＢＶの複製起点はＦＲ、ＤＳもしくはＲｅｐ＊配列、またはそれに由来する核酸修飾もしくは合成の組合せを介した機能的に等価なあらゆる配列を含む。例えば、本発明はまた、個々の要素の挿入または変異などによって遺伝子操作されたＥＢＶの複製起点を使用し得る。

用語「ＯｒｉＰ」は、ヒト細胞におけるプラスミドの複製および安定な維持を支持するエプスタインバーウイルス染色体の領域を指す。

「リンパ増殖性の」ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（例えばヒトＢリンパ芽球）または他の細胞種において複製し、天然の生活環の少なくとも一部において染色体外で複製するヘルペスウイルスである。宿主に感染した後、これらのウイルスは、ウイルスゲノムをプラスミドとして維持することによって宿主に潜在的に感染する。例示的なリンパ増殖性ヘルペスウイルスは、限定されないが、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）およびマレック病ウイルス（ＭＤＶ）を含む。

本明細書における「鋳型」は、リンパ増殖性ヘルペスウイルスの野生型タンパク質（この野生型タンパク質はＥＢＮＡ−１に対応する）により特異的に結合されるＤＮＡ分子であり、その結合は、野生型タンパク質によるＥＢＶのＯｒｉＰに対応するＤＮＡ配列への結合の親和性の少なくとも１０％の親和性で野生型タンパク質により結合されるＤＮＡ配列であって、そこからそのタンパク質の結合後に鋳型の転写が場合により開始および／または増強され、かつ／または、細胞における鋳型の維持が増強されるＤＮＡ配列が、その鋳型に存在する結果として起こるものである。「組み込まれた鋳型」は、細胞のゲノム中で安定に維持されている（例えば、細胞の染色体内に組み込まれた）鋳型である。「染色体外の鋳型」は、細胞内で安定に維持されているが、染色体内に組み込まれていない鋳型である。

用語「調節エレメント」は、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーおよびスプライス部位などをまとめて指し、これらはレシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写、転写後プロセシングおよび翻訳を共同で与える。選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写および翻訳され得る限り、これらの調節エレメントの全てが常に存在する必要はない。

用語「プロモーター」は本明細書において通常の意味で使用され、ＤＮＡの制御配列を含むヌクレオチド領域を指し、ここで制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼを結合でき、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始できる遺伝子に由来する。

本明細書において、用語「体細胞」は、生殖細胞（卵細胞または精細胞など）以外のあらゆる細胞を指し、これらはそのＤＮＡを次世代に直接移行しない。典型的に、体細胞は制限された多能性を有し、または多能性を有さない。本明細書で使用される体細胞は、天然に存在してもよく、または遺伝子組換えされていてもよい。体細胞の例は、単核細胞（末梢血単核細胞など）、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、胃細胞およびβ細胞を含む。

本明細書において、細胞が１０％未満のエピソーマルリプログラミングベクターおよび外来性遺伝要素を有する場合、細胞はそれらの要素を「実質的に含まない」（例えばリプログラミングベクターの遺伝要素を実質的に含まない）。細胞が１％未満のエピソーマルリプログラミングベクターおよび外来性遺伝要素を有する場合、細胞はそれらの要素を「本質的に含まない」（例えばリプログラミングベクターの遺伝要素を本質的に含まない）。しかしながら、全体の細胞集団の０．５％未満または０．１％未満が外来性遺伝要素を含んでいる細胞集団がさらにより望ましい。したがって、ｉＰＳ細胞集団の０．１％未満〜１０％（全ての中間の割合を含む）の細胞は、望ましくない外来性遺伝要素を含む。

「エンハンサー」は、プロモーターに近接して配置された場合に、エンハンサードメインが存在しないプロモーターに起因する転写活性に対して向上した転写活性を与える核酸配列を意味する。

「発現コンストラクト」または「発現カセット」は、転写を導くことができる核酸分子を意味する。発現コンストラクトは、少なくともプロモーターまたはプロモーターと機能的に同等の構造物を含む。エンハンサーおよび／または転写終結シグナルなどの追加の要素を含んでもよい。

細胞または生物内のタンパク質、遺伝子、核酸またはポリヌクレオチドに関して使用される場合、用語「外来性」は人工的な手段または天然の手段で細胞または生物内に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸またはポリヌクレオチドを指す。細胞に関して、用語「外来性」は、単離され、次いで人工的な手段または天然の手段で他の細胞または生物に導入された細胞を指す。外来性核酸は異なる生物または細胞由来であり得、または生物または細胞内で天然に生じる核酸の１以上のさらなるコピーであり得る。外来性細胞は異なる生物由来であり得、または同一の生物由来であり得る。限定されない例として、外来性核酸は染色***置が天然の細胞と異なっており、または天然に見出される核酸配列と異なる核酸配列に隣接している。

用語「植え継ぎ」は、いくつかまたは全ての細胞を前の培養液から新鮮な増殖培地を含む新たな基板（例えば新たな容器）に移行することによって、細胞を継代培養する方法を指す。

用語「自殺遺伝子」は、非毒性化合物を毒性型に変換するタンパク質をコードするヌクレオチドである。自殺遺伝子の例は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ／ガンシクロビルシステム、シトシンデアミナーゼ／５−ＦＵシステム、およびカルボキシルエステラーゼ／イリノテカンシステムを含む。自殺遺伝子は大抵、適切な基質を与えた場合に細胞毒性を生じるように構成的に発現している。「自殺遺伝子基質」は、自殺遺伝子が毒性型に変換する非毒性化合物である。

用語「対応する」は、ポリヌクレオチド配列が基準のポリヌクレオチド配列の全部または一部と相同（すなわち、同一であるが、厳密に進化的に関連しない）であること、またはポリヌクレオチド配列が基準のポリヌクレオチド配列と同一であることを意味する。本明細書において、用語「相補的である」は、相補的な配列が基準のポリヌクレオチド配列の全部または一部と相同であることを意味する。説明のために、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は基準配列「ＴＡＴＡＣ」に対応しており、基準配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。

特定のタンパク質を「コード」する「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「フラグメント」または「導入遺伝子」は、インビトロまたはインビボにおいて適切な制御配列の制御下におかれた場合に、転写され、場合により遺伝子産物（例えばポリペプチド）に翻訳される核酸分子である。コード領域はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの形式のいずれかで存在し得る。ＤＮＡの形式で存在する場合、核酸分子は一本鎖（すなわちセンス鎖）または二本鎖であり得る。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子は、限定されないが、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を含み得る。転写終結配列は通常、遺伝子配列の３’に位置する。

本明細書において、用語「細胞」は当分野における最も広い意味で用いられ、多細胞生物の組織の構造単位であり、外部からそれを隔離する膜構造に囲まれ、自己複製の能力を有し、ならびに遺伝子情報およびそれを発現する機構を有する生体を指す。本明細書における細胞は天然に存在する細胞または人工的に改変された細胞（例えば融合細胞、遺伝子組換え細胞など）であり得る。

本明細書において、用語「細胞集団」はクローン細胞の一群を包含する。

本明細書において、用語「幹細胞」は、自己複製でき、多能性を有する細胞を指す。典型的に、幹細胞は損傷組織を再生できる。本明細書において、幹細胞は、限定されないが、胚性幹（ＥＳ）細胞、または組織幹細胞（組織特異的幹細胞または体性幹細胞とも呼ばれる）であり得る。上述の能力を有し得る人工的に作製されたあらゆる細胞（例えば、融合細胞、リプログラミングされた細胞、または本明細書で使用される細胞など）が幹細胞であり得る。

「胚性幹（ＥＳ）細胞」は初期胚由来の多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は１９８１年に最初に確立され、１９８９年からノックアウトマウスの作製にも適用されている。１９９８年にヒトＥＳ細胞が確立され、現在では再生医療に利用可能となっている。

ＥＳ細胞とは異なり、組織幹細胞は制限された分化能を有する。組織幹細胞は組織内の特定の位置に存在し、未分化細胞内構造を有する。したがって、組織幹細胞の多能性は典型的に低い。組織幹細胞はより高い核／細胞質比を有し、細胞内小器官をほとんど持たない。ほとんどの組織幹細胞は低い多能性、長い細胞周期、および個体の寿命を超えた増殖能を有する。組織幹細胞は、細胞が由来する部位（例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系など）に基づいてカテゴリー分類される。皮膚系の組織幹細胞は、表皮幹細胞、毛包幹細胞などを含む。消化器系の組織幹細胞は、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などを含む。骨髄系の組織幹細胞は、造血幹細胞、間葉系幹細胞などを含む。神経系の組織幹細胞は、神経幹細胞、網膜幹細胞などを含む。

一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される「人工多能性幹細胞」は、胚性幹細胞を特徴付ける性質を維持する遺伝子および因子を発現させることによって、胚性幹細胞様の状態に人工的に遺伝的にリプログラミングされた細胞である。ｉＰＳＣは、特定の因子（リプログラミング因子と呼ばれる）を導入することによって非多能性細胞（典型的に成体の体細胞）または最終分化した細胞（線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、神経細胞、表皮細胞など）から誘導される。合成転写因子は、体細胞に導入され、細胞を胚性幹細胞様状態にリプログラミングし得る天然に存在しないリプログラミング因子である。

「多能性」は、三胚葉（内胚葉（内側の胃の内壁、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）または外胚葉（表皮組織および神経系））のいずれに由来する細胞にも分化する細胞の能力を指す。本明細書において、「多能性幹細胞」は三胚葉のいずれに由来する細胞にも分化できる細胞を指す。

核酸分子に関して「動作可能に結合する」ことは、２以上の核酸分子（例えば、転写される核酸分子、プロモーターおよびエンハンサー配列）を核酸分子の転写を可能とする方法で連結することを意味する。ペプチドおよび／またはポリペプチド分子に関して「動作可能に結合する」ことは、２以上のペプチドおよび／またはポリペプチド分子を単一のポリペプチド鎖（すなわち、融合の各ペプチドおよび／またはポリペプチド成分の少なくとも１つの性質を有する融合ポリペプチド）を産生する方法で連結することを意味する。融合ポリペプチドは、好ましくはキメラである（すなわち、異種分子から構成される）。

「相同性」は、２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド間の同一性の割合を指す。ある配列と別の配列との一致は当分野で公知の技術によって決定され得る。例えば相同性は、配列情報を整列し、容易に利用可能なコンピュータプログラムを用いることによって、２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接比較することで決定され得る。あるいは、相同性は、相同領域間の安定な二本鎖を形成する条件下におけるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、ならびにそれに続く一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化および消化されたフラグメントのサイズ決定によって決定され得る。２つのＤＮＡ配列または２つのポリペプチド配列は、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸が、上記の方法を用いて決定されるように、分子の規定された長さにわたってそれぞれ適合する場合、互いに「実質的に相同」である。

概観
組み込まれないエピソーマルベクターによる細胞リプログラミングの方法において、ｉＰＳＣ株がベクターを含まないことを保証するための定量的な尺度が通常必要とされる。ベクターを含まないｉＰＳＣを作製するための現在の方法は、ＤＮＡを介したリプログラミングの使用を含み、複数のｉＰＳＣコロニーをＰ０プレートから採取し、定量的なベクター検出に適用するのに十分な細胞となるまでそれらを増殖させ、その後にベクターが除去されるまでさらに培養することに関する。ベクターを含まないコロニーは３継代において潜在的に同定され得るが、ほとんどのｉＰＳＣクローンは１０継代以上においてもベクターを保持している。この期間の培養は、工業的過程の一部として実行される場合、必要とされる労力、スケジュールおよび費用に対して深刻な影響を与える。いくつかの実施態様において、本発明はより迅速なベクターの排除を促進する２つの異なる手法を提供する：ｉ）リプログラミング後のベクター保持の時間的制御、およびｉｉ）ベクターを含まないコロニーの増殖を選択するための、リプログラミングベクター上の自殺遺伝子の取り込み。

いくつかの実施態様において、本発明は、ベクターを修飾することによって細胞療法のための外来性ＤＮＡを含まないｉＰＳＣを作製する方法を提供し、これは（１）自殺遺伝子をエピソーマルベクターに追加すること、または（２）ベクター上に存在する構成的なＥＢＮＡ−１発現カセットを１以上のベクター上の制御された発現カセットに交換する（ここでＥＢＮＡ−１発現は制御されたプロモーターシステムを介して調節される）ことによって、リプログラミング因子および／または合成転写因子を送達するために使用されるエピソーマルベクターを含む。これらの手法は、個々にまたは組み合わせて使用され得る。

いくつかの実施態様において、本発明は多数の利点を与え、これは（１）ベクターを含まないｉＰＳＣを同定する前に必要とされる継代培養の数を減少させること、（２）ベクターを含まないｉＰＳＣを同定する前に採取および維持するのに必要なコロニーの数を減少させること、（３）個々のコロニーを手動で採取する代わりに、「プール」としてｉＰＳＣコロニーを回収する能力、および（４）全体の労力、時間および費用の節約を含む。

自殺遺伝子
自殺遺伝子は、非毒性化合物の毒性型への変換の原因となる。したがって、自殺遺伝子は発現ベクター上に配置され得、適切な時点で非毒性自殺遺伝子基質を添加することによって、ベクター保持の負の選択として役立ち得る。エピソーマルベクターに追加され得る潜在的な自殺遺伝子は、チミジンキナーゼおよびシトシンデアミナーゼを含む。これらの遺伝子の発現は、構成的なプロモーターによって調節される。細胞死は、それらの各基質（ガンシクロビル（ＧＮＣ）または５−フルオロシトシン（５−ＦＵ））が培地に直接添加された後にのみ誘導される。

リプログラミング後（コロニー採取前または直後）の自殺遺伝子基質の供給は、ベクターを保持しているｉＰＳＣコロニーの細胞死を導く。生存しているコロニーは、ベクターを失っているコロニーであり、したがってさらに採取および増殖され得る。スクリーニングアッセイは、ベクターを含むｉＰＳＣの増殖に対する資源を投資することなく、ｉＰＳＣコロニーが今後の増殖、貯蔵(banking)および分化に有望であるか否かについての指標を与える。同様に、この戦略をベクターを含まないｉＰＳＣコロニーを選択するために適用することは、単一のコロニーを手動で採取する必要なく、「プール」としてｉＰＳＣを収集でき、頑強な細胞株を確立する前の培養の遅滞期を減少させる。ｉＰＳＣのプールを収集することは、完全な特徴付けおよび貯蔵を達成するための時間を短縮し、下流の細胞療法への適用のための効率的な細胞分化の可能性を増加させる多様なｉＰＳＣプールをさらに提供する。

ベクター排除の速度論は、Ｐ０プレートに現れたｉＰＳＣが自殺遺伝子基質を添加した時点で未だベクターを保持している場合に、自殺遺伝子の手法と共にでさえ、コロニーの採取を命じ得る。それにもかかわらず、自殺遺伝子基質は、（例えばＰ１において）採取の後に「レプリカ」プレートに供給され得、資源集約的なｑＰＣＲスクリーニングを実行する必要なしに、ベクターを含まないｉＰＳＣクローンを同定し得る。

したがって、本発明は、リプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法を提供し、この方法は以下を含む：（ａ）リプログラミングベクターをヒト体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでリプログラミングベクターはウイルスの複製起点、少なくとも１つのｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセットならびに自殺遺伝子を含む；（ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子および／または合成転写因子の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること；および（ｃ）第２の細胞集団を自殺遺伝子基質と接触させ、リプログラミングベクターを本質的に含まない細胞集団を作製すること。いくつかの実施態様において、自殺遺伝子は、チミジンキナーゼおよびシトシンデアミナーゼからなる群から選択される。

自殺遺伝子を使用し、ｉＰＳＣ作製の効率を向上させる方法の実施態様において、エピソーマルリプログラミングベクターを細胞に導入した後、細胞を、体細胞をｉＰＳＣに変換することを可能にするのに十分長い時間培養する（すなわち、リプログラミング因子の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する細胞集団を作製するために培養する）。いくつかの実施態様において、胚細胞と一致した形質を有する細胞を継代培養する。いくつかの実施態様において、継代培養後、細胞は、自殺遺伝子基質（例えば、ＧＮＣまたは５−ＦＣ）を供給する前にさらに植え継がれる。さらなる実施態様において、継代培養後、細胞は自殺遺伝子基質を供給する前に植え継がれない。

いくつかの実施態様において、自殺遺伝子を使用し、ｉＰＳＣ作製の効率を向上させる本発明の方法において使用される複製起点はＯｒｉＰである。さらなる実施態様において、複製起点はＯｒｉＰであり、発現カセットはＥＢＶのＥＢＮＡ−１、またはＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基もしくはその両方が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施態様において、自殺遺伝子を使用し、ｉＰＳＣ作製の効率を向上させる本発明の方法は、エピソーマルリプログラミングベクターの存在に対して、細胞集団をスクリーニングすることをさらに含む。このようなスクリーニングは、エピソーマルリプログラミングベクターを体細胞に導入した後の本方法におけるあらゆる工程において生じ得る。いくつかの実施態様において、細胞は自殺遺伝子基質の供給後にスクリーニングされる。スクリーニング方法は当業者に公知であり、限定されないが、ｑＰＣＲベクター検出アッセイを含む。いくつかの実施態様において、未だエピソーマルリプログラミングベクターを含む、自殺遺伝子基質供給後の細胞集団における細胞は、さらに培養されない。

本発明の方法は、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まない、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製することをさらに含み、これは以下を含む：（ａ）エピソーマルリプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでエピソーマルリプログラミングベクターは、（ｉ）ＯｒｉＰ複製起点、（ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット、（ｉｉｉ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド、および（ｉｖ）チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子を含む；（ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子および／または合成転写因子の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること；（ｃ）第２の細胞集団を自殺遺伝子基質と接触させ、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。ＥＢＮＡ−１および誘導体の記述は、Levitskaya et al., Nature 375:685 (1995)、Levitskaya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12616-12621 (1997)およびYin, Science 301:1371-1374 (2003)に見出され、これらのそれぞれは参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。

いくつかの実施態様において、自殺遺伝子を使用し、ｉＰＳＣ作製の効率を向上させる本発明の方法において使用される体細胞は、単核細胞（ヒト末梢血単核細胞を含む）、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、胃細胞および／またはβ細胞を含む。いくつかの実施態様において、自殺遺伝子を使用し、ｉＰＳＣ作製の効率を向上させる本発明の方法において使用される体細胞はヒト末梢血単核細胞である。

いくつかの実施態様において、自殺遺伝子を使用し、ｉＰＳＣ作製の効率を向上させる本発明の方法において使用されるリプログラミング因子は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８および／またはｐ５３ＤＤを含む。さらなる実施態様において、ｉＰＳＣリプログラミング因子は、Ｓｏｘ−２およびＯｃｔ−４を含む。いくつかの実施態様において、ｉＰＳＣリプログラミング因子は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４およびＮａｎｏｇである。いくつかの実施態様において、ｉＰＳＣリプログラミング因子は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、ならびにＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上である。いくつかの実施態様において、ｉＰＳＣリプログラミング因子は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤである。

いくつかの実施態様において、自殺遺伝子の手法を単独で使用し、ベクターの排除を促進する場合、適切な基質はコロニーを採取する４〜５日前にＰ０プレートに添加される。これはベクターを含まないコロニーの生存を選択する。ｑＰＣＲベクター検出スクリーニングアッセイは、生存したｉＰＳＣコロニーが今後の増殖、貯蔵および分化に有望であるか否かについてのさらなる検証を与える。上述のように、ベクター排除の速度論に依存して、自殺遺伝子基質の添加を後の継代に移行する必要があり得る。

ＥＢＮＡ−１の制御された発現
ＥＢＮＡ−１は、エピソーマルリプログラミングベクター内に見出されるＯｒｉＰと呼ばれる領域への結合、および細胞***中における染色体ＤＮＡへの係留の促進に関与するウイルスタンパク質である。これは遺伝子導入後のプラスミドの維持の向上をもたらす。これは最初にリプログラミング因子および／または合成転写因子の高レベルの発現を達成するために有益であるが、リプログラミングが生じた場合に遅いプラスミドの減少をもたらす。

いくつかの実施態様において、本明細書において提供される本発明は、リプログラミング後のＥＢＮＡ−１の転写を（例えば、テトラサイクリン抑制性（ＴｅｔＯｆｆ）を用いることによって）抑制すること、またはリプログラミングが生じた場合にのみ活性化される誘導性システム（例えば、テトラサイクリン誘導性（ＴｅｔＯｎ））を用いることのいずれかによって、ＥＢＮＡ−１を制御する。代替の手法はまた、ＥＢＮＡ−１発現を制御するために存在する（例えば、ＥＢＮＡ−１に対する誘導性アンチセンスまたは干渉ＲＮＡが、リプログラミングが生じた場合に発現し得る）。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ；Ｔｅｔシステム用）などの誘発剤が利用可能であり、現在のｉＰＳＣ作製法に適合する。これらの手法は細胞***中のプラスミドの分配を減少させ、したがってベクターを含まない細胞株を作製するのに必要な継代数を減少させる。

いくつかの実施態様において、本発明は、リプログラミングベクターを本質的に含まない、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法を提供し、これは以下を含む：（ａ）リプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでリプログラミングベクターは、ｉ）ウイルスの複製起点、ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット、ｉｉｉ）リプログラミングベクターの染色体外での複製および分配を制御する遺伝子、およびｉｖ）制御されたプロモーターシステムを含む；（ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子および／または合成転写因子の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること、ここで第１の細胞集団の培養中に、リプログラミングベクターは複製される；および（ｃ）第２の細胞集団を培養すること、ここでリプログラミングベクターの染色体外での複製および分配を制御する遺伝子は、リプログラミングベクターが細胞***中に消失するように制御され、リプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製する。

いくつかの実施態様において、染色体外での複製および分配を制御するための本発明の方法は、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体活性化システム（例えば、ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆシステム）を利用する。いくつかの実施態様において、ＴｅｔＯｎシステムを使用する場合、遺伝子導入された細胞集団を培養している間、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体（ドキシサイクリンなど）が存在し、ＥＢＮＡ−１発現を上方制御する。次に、細胞集団をテトラサイクリンまたは誘導体の非存在下で培養し、ＥＢＮＡ−１の発現を減少させ、したがって、エピソーマルベクターの複製および分配を実質的に減少させる。

いくつかの実施態様において、染色体外での複製および分配を制御する本発明の方法は、ＴｅｔＯｆｆシステムを利用する。ＴｅｔＯｆｆシステムでは、遺伝子導入された細胞集団を培養している間、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体（ドキシサイクリンなど）は存在せず、ＥＢＮＡ−１発現が上方制御される。次に、細胞集団はテトラサイクリンまたは誘導体の存在下で培養され、ＥＢＮＡ−１の発現が下方制御され、したがってエピソーマルベクターの複製および分配が実質的に減少する。

いくつかの実施態様において、染色体外での複製および分配を制御する本発明の方法は、ＯｒｉＰ複製起点を利用する。さらなる実施態様において、複製起点はＯｒｉＰであり、発現カセットは、ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基またはその両方が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施態様において、染色体外での複製および分配を制御する本発明の方法は、エピソーマルリプログラミングベクターの存在に対して、細胞集団をスクリーニングすることをさらに含む。このようなスクリーニングは、エピソーマルリプログラミングベクターが体細胞に導入された後の本方法におけるあらゆる工程で生じ得る。いくつかの実施態様において、細胞は自殺遺伝子の活性化後にスクリーニングされる。スクリーニング方法は当業者に公知であり、限定されないが、ｑＰＣＲベクター検出アッセイを含む。

染色体外での複製および分配を制御する方法の実施態様において、エピソーマルリプログラミングベクターを細胞に導入した後、細胞を、体細胞をｉＰＳＣに変換することを可能にするのに十分長い時間培養する（すなわち、リプログラミング因子および／または合成転写因子の発現をもたらし、胚細胞と一致した形質を有する細胞集団を作製するために培養する）。胚細胞と一致した形質を有する細胞は継代培養される。いくつかの実施態様において、継代培養後、細胞は、細胞集団を培養し、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製する前に、さらに植え継がれる。さらなる実施態様において、継代培養後、細胞は培養前に植え継がれない、ここでエピソーマルリプログラミングベクターは培養中に複製されない。

本発明は、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まない、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法をさらに提供し、これは以下を含む：（ａ）エピソーマルリプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでエピソーマルリプログラミングベクターは、（ｉ）ＯｒｉＰ複製起点、（ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット、（ｉｉｉ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド、および（ｉｖ）テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体に制御されたプロモーターシステム（ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆ）を含む；（ｂ）第１の細胞集団を培養し、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること、ここで培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製される；（ｃ）第２の細胞集団を培養し、第３の細胞集団を作製すること、ここで培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製されない；（ｄ）コロニーを第３の細胞集団から選択し、第４の細胞集団を作製すること；および（ｅ）第４の細胞集団を培養し、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。

いくつかの実施態様において、染色体外での複製および分配を制御する本発明の方法は体細胞を利用し、体細胞はヒト末梢血単核細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、胃細胞およびβ細胞であり得る。

いくつかの実施態様において、染色体外での複製および分配を制御する本発明の方法において使用されるリプログラミング因子は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８および／またはｐ５３ＤＤを含む。さらなる実施態様において、ｉＰＳＣリプログラミング因子は、Ｓｏｘ−２およびＯｃｔ−４を含む。いくつかの実施態様において、ｉＰＳＣリプログラミング因子は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４およびＮａｎｏｇである。いくつかの実施態様において、ｉＰＳＣリプログラミング因子は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、ならびにＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上である。いくつかの実施態様において、ｉＰＳＣリプログラミング因子は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤである。

いくつかの実施態様において、ＥＢＮＡ−１発現を単独で制御し、ベクターの排除を促進する場合、ｉＰＳＣコロニーを採取する前に、ＥＢＮＡ−１の発現をＰ０プレートに対応する時点で減少させる。現在のｉＰＳＣ作製法と同様にコロニーの採取を実行するが、ベクターを含まないコロニーの数の増加がより早い継代数で同定される。

自殺遺伝子ならびに制御された染色体外での複製および分配の組合せ
いくつかの実施態様において、方法の組合せはさらなる利点を与え、実験手法の有益な修飾を可能にする。ＥＢＮＡ−１に基づくエピソーマルベクターの特性のために、自殺遺伝子基質を遺伝子導入後の期間（すなわち２０〜３０日）に供給することは、Ｐ０プレートに存在するｉＰＳＣコロニーの広範な細胞死をもたらす。この望ましくない効果は、自殺遺伝子の基質を添加する前にベクターの排除を促進するためにＥＢＮＡ−１の発現を減少させることによって、減少する。

本発明を組み合わせるさらなる利点は、高いリプログラミング効率および高いベクターの排除率を達成した場合に、ｉＰＳＣコロニーが増殖、貯蔵および特徴付けを促進するプールとして採取され得ることである。

したがって、本発明は、リプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法をさらに提供し、これは以下を含む：（ａ）リプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでリプログラミングベクターは、ｉ）ウイルスの複製起点、ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット、ｉｉｉ）リプログラミングベクターの染色体外での複製および分配を制御する遺伝子、ｉｖ）制御されたプロモーターシステム、およびｖ）自殺遺伝子を含む；（ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子および／または合成転写因子の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること、ここで培養中にリプログラミングベクターは複製される；（ｃ）第２の細胞集団を培養すること、ここで染色体外での複製および分配を制御する遺伝子は、リプログラミングベクターが細胞***中に消失するように制御され、リプログラミング因子を実質的に含まないｉＰＳＣを含む第３の細胞集団を作製する；および（ｄ）第３の細胞集団を自殺遺伝子基質と接触させ、リプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。

いくつかの実施態様において、本発明の方法の組合せでは、自殺遺伝子はチミジンキナーゼおよびシトシンデアミナーゼからなる群から選択される。

本発明の組合せの方法において、複製起点はＯｒｉＰである。さらなる実施態様において、複製起点はＯｒｉＰであり、発現カセットは、ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、またはＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基またはその両方が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。

本発明の組合せの方法において、ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセットの転写を制御する遺伝子は、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体（例えばドキシサイクリン）活性化システムを含む。いくつかの実施態様において、ドキシサイクリンは第１の細胞集団の培養中に存在し、リプログラミング因子の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する細胞集団を作製し、ドキシサイクリンは培養中に存在せず、エピソーマルリプログラミングベクターを実質的に含まないｉＰＳＣを作製する、ここで培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製されない。いくつかの実施態様において、ドキシサイクリンは第１の培養の工程中には存在せず、ドキシサイクリンは第２の工程において存在しない。

本発明の組合せの方法において、さらなる実施態様は、エピソーマルリプログラミングベクターの存在に対して、細胞集団をスクリーニングすることをさらに含む。このようなスクリーニングは、エピソーマルリプログラミングベクターが体細胞に導入された後の本方法におけるあらゆる工程で生じ得る。いくつかの実施態様において、細胞は、第２の細胞集団を培養し、エピソーマルリプログラミングベクターを実質的に含まないｉＰＳＣを含む第３の細胞集団を作製した後にスクリーニングされる、ここで第２の細胞集団の培養中に、エピソーマルリプログラミングベクターは複製されない。さらなる実施態様において、細胞は自殺遺伝子の活性化後にスクリーニングされる。スクリーニング方法は当業者に公知であり、限定されないが、ｑＰＣＲベクター検出アッセイを含む。いくつかの実施態様において、第２の細胞集団が培養され、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣが作製された後、細胞集団はエピソーマルリプログラミングベクターの存在のためである。

本発明の組合せの方法の実施態様において、エピソーマルリプログラミングベクターを細胞に導入した後、細胞を、体細胞をｉＰＳＣに変換することを可能にするのに十分長い時間培養する（すなわち、リプログラミング因子および／または合成転写因子の発現をもたらし、胚細胞と一致した形質を有する細胞集団を作製するために培養する）。胚細胞と一致した形質を有する細胞は継代培養される。いくつかの実施態様において、継代培養後、細胞は、細胞集団を培養し、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製する前に、さらに植え継がれる。さらなる実施態様において、継代培養後、細胞は培養前に植え継がれない、ここでエピソーマルリプログラミングベクターは培養中に複製されない。本発明の組合せの方法のさらなる実施態様において、エピソーマルリプログラミングベクターを細胞に導入した後、細胞を、体細胞をｉＰＳＣに変換することを可能にするのに十分長い時間培養する（すなわち、リプログラミング因子および／または合成転写因子の発現をもたらし、胚細胞と一致した形質を有する細胞集団を作製するために培養する）。いくつかの実施態様において、胚細胞と一致した形質を有する細胞は継代培養される。いくつかの実施態様において、継代培養後、細胞は、例えば自殺遺伝子基質を供給する（ＧＮＣまたは５−ＦＣを添加する）前に、さらに植え継がれる。さらなる実施態様において、継代培養後、細胞は自殺遺伝子基質を供給する前に植え継がれない。

本発明は、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まない、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法をさらに提供し、これは以下を含む：（ａ）エピソーマルリプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでエピソーマルリプログラミングベクターは、（ｉ）ＯｒｉＰ複製起点、（ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット、（ｉｉｉ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド、（ｉｖ）テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体に制御されたプロモーターシステム（ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆ）、および（ｖ）チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子を含む；（ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子および／または合成転写因子の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること、ここで培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製される；（ｃ）第２の細胞集団を培養し、エピソーマルリプログラミングベクターを実質的に含まないｉＰＳＣを含む第３の細胞集団を作製すること、ここで第２の細胞集団の培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製されない；および（ｄ）第３の細胞集団を自殺遺伝子基質に接触させ、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。

いくつかの実施態様において、本発明の組合せの方法は体細胞を利用し、体細胞は、ヒト末梢血単核細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、胃細胞およびβ細胞であり得る。

いくつかの実施態様において、本発明の組合せの方法において使用されるリプログラミング因子は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８および／またはｐ５３ＤＤを含む。さらなる実施態様において、ｉＰＳＣリプログラミング因子は、Ｓｏｘ−２およびＯｃｔ−４を含む。いくつかの実施態様において、ｉＰＳＣリプログラミング因子は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４およびＮａｎｏｇである。いくつかの実施態様において、ｉＰＳＣリプログラミング因子は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、ならびにＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上である。いくつかの実施態様において、ｉＰＳＣリプログラミング因子は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤである。

エピソーマルリプログラミングベクター
いくつかの実施態様において、本発明はエピソーマルリプログラミングベクターを提供し、これは以下を含む：（ａ）ＯｒｉＰ複製起点；（ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット；（ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；および（ｄ）自殺遺伝子。

さらなる実施態様において、本発明はエピソーマルリプログラミングベクターを提供し、これは以下を含む：（ａ）ＯｒｉＰ複製起点；（ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット；（ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；および（ｄ）チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子。

いくつかの実施態様において、本発明はエピソーマルリプログラミングベクターをさらに提供し、これは以下を含む：（ａ）ＯｒｉＰ複製起点；（ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット；（ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；および（ｄ）制御されたプロモーターシステム。

いくつかの実施態様において、本発明はエピソーマルリプログラミングベクターをさらに提供し、これは以下を含む：（ａ）ＯｒｉＰ複製起点；（ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット；（ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；および（ｄ）ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆシステム。

いくつかの実施態様において、本発明はエピソーマルリプログラミングベクターをさらに提供し、これは以下を含む：（ａ）ＯｒｉＰ複製起点；（ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット；（ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；（ｄ）ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆシステム；および（ｅ）自殺遺伝子。

いくつかの実施態様において、本発明はエピソーマルリプログラミングベクターをさらに提供し、これは以下を含む：（ａ）ＯｒｉＰ複製起点；（ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセット；（ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；（ｄ）ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆシステム；および（ｅ）チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子。

いくつかの実施態様において、本発明の方法は、単一のベクターまたは複数のベクターを利用し、リプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製する。いくつかの実施態様において、例えば、上述のように制御されたＥＢＶのＥＢＮＡ−１またはＥＢＮＡ−１の誘導体は、リプログラミング因子および／または合成転写因子の発現カセットと同一のベクター上にはない。同様に、いくつかの実施態様において、自殺遺伝子および／または制御されたプロモーターシステムは別々のベクター上にある。

リプログラミング因子
リプログラミング因子はｉＰＳＣを作製するために必要である。以下の因子または因子の組合せが本発明の方法において使用され得る。ある態様において、ＳｏｘおよびＯｃｔ（特にＯｃｔ３／４）をコードする核酸がリプログラミングベクター中に含まれる。例えば、１以上のリプログラミングベクターが、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇおよび場合によりＬｉｎ２８をコードする発現カセット、またはＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４および場合によりｃ−Ｍｙｃをコードする発現カセット、またはＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、および場合によりＥｓｒｒｂをコードする発現カセット、またはＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃおよび場合によりＳＶ４０大型Ｔ抗原をコードする発現カセットを含み得る。これらのリプログラミング因子をコードする核酸は、同一の発現カセット、異なる発現カセット、同一のリプログラミングベクター、または異なるリプログラミングベクター中に含まれ得る。

Ｏｃｔ４およびＳｏｘ遺伝子ファミリーの特定のメンバー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３およびＳｏｘ１５）は、存在しないことで誘導が不可能になる、誘導方法に関与する重要な転写制御因子として同定されている。しかしながら、Ｋｌｆファミリーの特定のメンバー（Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−ＭｙｃおよびＮ−Ｍｙｃ）、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を含むさらなる遺伝子が誘導効率を増加させる遺伝子として同定されている。

Ｏｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１）は８量体（「Ｏｃｔ」）転写因子のファミリーの１つであり、多能性を維持するのに非常に重要な役割を果たす。細胞内（卵割球および胚性幹細胞など）にＯｃｔ４が存在しないことは、自発的なトロホブラスト分化を導き、したがってＯｃｔ４の存在は胚性幹細胞の多能性および分化能を生じさせる。「Ｏｃｔ」ファミリーにおける様々な他の遺伝子（Ｏｃｔ１およびＯｃｔ６を含む）は誘導を引き起こすことができない。

Ｓｏｘファミリー遺伝子はＯｃｔ４と同様に多能性の維持に関連するが、多能性幹細胞において排他的に発現するＯｃｔ４とは異なり、多能性および単能性幹細胞に関連する。Ｓｏｘ２はリプログラミング誘導に使用された最初の遺伝子だが、Ｓｏｘファミリーの他の遺伝子が誘導法において同様に作用することが分かっている。Ｓｏｘ１はＳｏｘ２と同様の効率でｉＰＳ細胞を生じ、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８遺伝子もｉＰＳ細胞を生じるが、効率は低下する。

Ｌｉｎ２８は、分化および増殖に関連する、胚性幹細胞および胚性がん細胞において発現するｍＲＮＡ結合タンパク質である。

本発明の方法およびベクターに使用されるリプログラミング因子は天然に存在してもよく、または天然に存在しなくてもよい。本明細書において、天然に存在しないリプログラミング因子は合成転写因子と呼ばれる。合成転写因子はまた、体細胞に導入され得、細胞を胚性幹細胞様状態にリプログラミングし得る。合成転写因子はリプログラミングの効率を増強し得、速度論を加速し得る。さらなる合成転写因子が当業者に公知である。

本発明に使用されるリプログラミングタンパク質は、ほぼ同一のリプログラミング機能を有するタンパク質ホモログによって置換され得る。また、これらのホモログをコードする核酸がリプログラミングに使用され得る。保存的アミノ酸置換が好ましい、すなわち、例えば、極性酸性アミノ酸としてのアスパラギン酸−グルタミン酸；極性塩基性アミノ酸としてのリジン／アルギニン／ヒスチジン；非極性または疎水性アミノ酸としてのロイシン／イソロイシン／メチオニン／バリン／アラニン／グリシン／プロリン；極性または非電荷親水性アミノ酸としてのセリン／スレオニンである。保存的アミノ酸置換はまた、側鎖に基づく分類も含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンへの置換、アスパラギン酸のグルタミン酸への置換、スレオニンのセリンへの置換、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸への同様な置換が、得られるポリペプチドの性質に大きな影響を与えないと予想することは合理的である。アミノ酸交換が機能的なポリペプチドをもたらすか否かは、ポリペプチドの特異的活性をアッセイすることによって容易に決定され得る。

自殺遺伝子
自殺遺伝子はがん治療においてテストされている。現在のがんの処置に使用される従来の化学療法の主要な制限は、低い治療指数および正常な組織に対する薬物作用に起因する副作用である。腫瘍選択性を向上した治療法を開発するための最も革新的な手法の一つは遺伝子治療である。

自殺遺伝子治療の基盤となる基本概念は以下の通りである：全身的に利用可能なプロドラッグを活性な抗腫瘍薬に局所的に代謝する酵素をコードする遺伝子を、腫瘍環境に選択的に導入する。がん治療のための自殺遺伝子の手法の第１の例は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の、腫瘍ＢＡＬＢ／ｃマウスＫ３Ｔ３肉腫細胞株への導入であった。ガンシクロビル（これは細胞性キナーゼによる３リン酸化の後に、チミジンキナーゼによって有毒となる化合物に変換される）での処置は、インビトロにおける腫瘍細胞の破壊をもたらした。ガンシクロビルの、細胞株によって作製されたＫ３Ｔ３肉腫腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスへの投与は、インビボにおける腫瘍の破壊をもたらした。自殺遺伝子治療の中心的な原理は、宿主組織とがん細胞との間の利用可能な生化学的差異を人工的に作り出すことである。

上記発明において、自殺遺伝子はエピソーマルリプログラミングベクターを未だ含有するｉＰＳＣを除去するために利用される。自殺遺伝子システムが活性化されている場合、エピソーマルベクターを含有するこれらの細胞のみが死滅する。

ベクターを含まない人工多能性幹細胞を作製するための染色体外ベクター
上述のように、ヒト体細胞からの多能性幹細胞の作製は、リプログラミング遺伝子の異所性発現のためのレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを用いて達成されている。モロニーマウス白血病ウイルスなどの組み換えレトロウイルスは、宿主ゲノムに安定な様式で組み込む能力を有する。これらは宿主ゲノムへの組み込みを可能にする逆転写酵素を含有する。レンチウイルスはレトロウイルスのサブクラスである。これらは、非***細胞ならびに***細胞のゲノムに組み込む能力を有するため、ベクターとして広く適用されている。これらのウイルスベクターはまた、より広い文脈（リプログラミング、分化および分化転換を含む細胞の分化リプログラミング）で広く使用されている。ＲＮＡ型のウイルスゲノムは、ウイルスが細胞に侵入した場合に逆転写され、ＤＮＡを作製し、次いでこのＤＮＡがウイルスインテグラーゼ酵素によってゲノムのランダムな位置に挿入される。上述のように、ウイルスヌクレオチドの宿主ゲノムへの組み込みは、細胞療法に基づく治療応用に好ましくない。

したがって、ある実施態様において、本発明は、外来性の遺伝要素（従前の方法で使用されるレトロウイルスまたはレンチウイルスベクター由来など）を本質的に含まない人工多能性幹細胞および他の所望の細胞種を作製する方法を提供する。これらの方法は、染色体外で複製するベクターまたはエピソームとして複製できるベクターを利用する。

エプスタインバーウイルス
ヒトヘルペスウイルス４（ＨＨＶ−４）とも呼ばれるエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）は、（単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスを含む）ヘルペスファミリーのウイルスである。ＥＢＶは、細胞***中の細胞内でのその複製および保持のための２つの必須の特徴にのみ依存し、そのゲノムを染色体外に維持し、効率的な複製および維持のために宿主細胞の機構と共に作用する。一方の要素であるＯｒｉＰは、シスに存在し、複製起点として働く。他方の因子であるＥＢＮＡ１は、ＯｒｉＰ内の配列に結合することによってトランスで機能し、プラスミドＤＮＡの複製および維持を促進する。

ＯｒｉＰ
ＯｒｉＰは、ヒト細胞においてプラスミドの複製および安定な維持を支持するエプスタインバーウイルス染色体の領域である。ＯｒｉＰは、ＤＮＡ複製が開始される部位またはその付近の部位であり、リピートファミリー（ＦＲ）および二重対称（dyad symmetry；ＤＳ）として知られる約１キロ塩基対離れた２つのシス作用性配列から構成される。

ＦＲは、３０ｂｐの反復配列の２１個の不完全コピーから構成され、２０個の高親和性のＥＢＮＡ１結合部位を含む。ＦＲにＥＢＮＡ１が結合した場合、これは、プロモーターの転写エンハンサーとして最大で１０ｋｂ離れてシスで作用し、ＦＲ含有プラスミドの核内保持および正確な維持に寄与する。ＯｒｉＰプラスミドの効率的な分配はまた、ＦＲに起因する可能性がある。このウイルスはＦＲにおいて２０個のＥＢＮＡ１結合部位を維持するように進化しているが、効率的なプラスミド維持はこれらの部位のうち７個のみを必要とし、全部で１２個のＥＢＮＡ１結合部位を有する、３コピーのＤＳのポリマーによって再構成され得る。

二重対称の要素（ＤＳ）は、ＥＢＮＡ１の存在下でＤＮＡ合成の開始に十分であり、ＤＳまたはその付近のいずれかにおいて開始される。２Ｄゲル電気泳動によって観察されるように、ＦＲにＥＢＮＡ１が結合した場合、ＦＲは複製フォークの障壁として機能するため、ウイルスＤＮＡ合成の終結はＦＲで起こると考えられる。ＤＳからのＤＮＡ合成の開始は、細胞周期毎に１回可能であり、細胞複製システムの構成成分によって制御される。ＤＳは、ＦＲにおいて見出される部位よりも親和性は低いが、４個のＥＢＮＡ１結合部位を含む。ＤＳのトポロジーは、４個の結合部位が２対の部位として配置され、各対の間の中心間の間隔が２１ｂｐであり、対でない２つの内部結合部位の間の中心間の間隔が３３ｂｐである。

ＤＳ内の要素の機能的役割は、ＤＳを非効率的に置換し得るエレメントとして同定された、Ｒｅｐ^＊と呼ばれるＥＢＶのゲノムの別の領域の研究によって確認されている。Ｒｅｐ＊を８回重合させることは、その複製の支持においてＤＳと同程度に効率的な要素を生じた。Ｒｅｐ^＊の生化学的な精査は、その複製機能に非常に重要な２１ｂｐの中心間の間隔を有するＥＢＮＡ−１結合部位の対を同定した（同書）。ポリマーの全ての隣接配列をラムダファージ由来の配列で置換した後でさえ複製機能が維持されたため、Ｒｅｐ^＊の最小のレプリケーターがＥＢＮＡ−１結合部位の対であることが分かった。ＤＳおよびＲｅｐ^＊の比較は、共通の機構を明らかにしている：これらのレプリケーターは、ＥＢＮＡ１によって曲げられ、結合される、適切な間隔が空いた部位の対を介した細胞複製機構を採用することにより、ＤＮＡ合成の開始を支持する。

哺乳類細胞において複製する、さらなる染色体外プラスミドは、ＥＢＶと関連せずに存在し、ＥＢＶのＲａｊｉ株における開始の区域と同様であると考えられる。例えば、「核骨格／マトリクス結合領域」（Ｓ／ＭＡＲ）およびロバストな転写単位を含有するプラスミドは当分野に属する。それらのＳ／ＭＡＲは、ヒトインターフェロン−β遺伝子に由来し、Ａ／Ｔリッチであり、核マトリクスとの結合および、低イオン強度での、またはスーパーコイルＤＮＡに組み込まれた際の優先的な巻き戻しによって、操作的に定義される。これらのプラスミドは、半保存的に複製し、ＯＲＣタンパク質を結合し、それらのＤＮＡの至る所での無作為で効率的なＤＮＡ合成の開始を支持する。これらは、薬物選択せずに、ハムスター細胞およびヒト細胞の増殖において効率的に維持され、ブタ胚に導入された場合、胎仔動物のほとんどの組織においてＧＦＰの発現を支持し得る。

ＥＢＮＡ１
エプスタインバー核抗原１（ＥＢＮＡ１）は、ＯｒｉＰのＦＲおよびＤＳまたはＲｅｐ^＊に結合し、各細胞***中に細胞の染色体に依存しないが、細胞の染色体と協調した、ＥＢＶプラスミドの複製および娘細胞への正確な分配を促進するＤＮＡ結合タンパク質である。

ＥＢＮＡ１の６４１アミノ酸（ＡＡ）は、変異分析および欠失分析によってその様々な機能と関連付けられたドメインに分類されている。ＡＡ４０〜８９間およびＡＡ３２９〜３７８間の２つの領域は、ＥＢＮＡ１が結合すると、シスまたはトランスにおいて２つのＤＮＡ要素に連結でき、したがって連結領域１および２（ＬＲ１、ＬＲ２）と呼ばれている。ＥＢＮＡ−１のこれらのドメインをＧＦＰと融合させると、ＧＦＰは有糸***染色体に誘導される。ＬＲ１およびＬＲ２は複製について機能的に重複しており、いずれか１つの欠失は、ＤＮＡ複製を支持できるＥＢＮＡ−１誘導体を生じる。ＬＲ１およびＬＲ２はアルギニンおよびグリシン残基に富み、Ａ／ＴリッチＤＮＡに結合するＡＴ−フックモチーフに似ている。ＥＢＮＡ１のＬＲ１およびＬＲ２のインビトロ分析は、それらがＡ／ＴリッチＤＮＡに結合する能力を明らかにした。このようなＡＴ−フックを１つ含むＬＲ１をＥＢＮＡ１のＤＮＡ結合ドメインおよび二量体化ドメインと融合させた場合、野生型ＥＢＮＡ１よりも効率は低いが、ＯｒｉＰプラスミドのＤＮＡ複製に十分であることが分かった。

ＬＲ２は、ＯｒｉＰ複製におけるＥＢＮＡ１の支持に必要ではない。さらに、ＥＢＮＡ１のＮ−末端側半分はＡＴ−フックモチーフを含有する細胞性タンパク質（ＨＭＧＡ１ａなど）で置換され得、これは依然として複製機能を保持する。これらの知見は、ＬＲ１およびＬＲ２のＡＴ−フックの活性がヒト細胞におけるＯｒｉＰの維持に必要である可能性があることを示唆する。

ＥＢＮＡ１の残基の３分の１（ＡＡ９１〜３２８）はグリシン−グリシン−アラニン（ＧＧＡ）反復配列からなり、これはＥＢＮＡ１がプロテアソーム分解および提示を阻害することによって宿主免疫応答を回避する能力に関連する。これらの反復配列は、インビトロおよびインビボでのＥＢＮＡ１の翻訳を阻害することも分かっている。しかしながら、このドメインの大部分の欠失は、細胞培養におけるＥＢＮＡ１の機能に明確な影響を与えない。

核移行シグナル（ＮＬＳ）はＡＡ３７９〜３８６によってコードされ、これは細胞核輸入機構にも関連する。

最後に、Ｃ−末端（ＡＡ４５８〜６０７）は、ＥＢＮＡ１の重複するＤＮＡ結合ドメインおよび二量体化ドメインをコードする。ＤＮＡに結合するこれらのドメインの構造は、Ｘ線結晶構造解析により解析されており、パピローマウイルスのＥ２タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに類似していることが分かった。

本発明の実施態様において、リプログラミングベクターは、ＯｒｉＰならびに、細胞***中のプラスミド複製およびその適切な維持を支持する能力を有するＥＢＮＡ１のバージョンをコードする短縮配列の両方を含有する。野生型ＥＢＮＡ１のアミノ末端側の３分の１における高度な反復配列および、様々な細胞で毒性を示す２５アミノ酸領域の除去は、ＯｒｉＰに関連するＥＢＮＡ１のトランス作用性の機能に必要ではない。したがって、例示的な誘導体であるデルタＵＲ１として知られるＥＢＮＡ１の短縮型は、このプラスミドに基づくシステムにおいてＯｒｉＰと共に使用され得る。染色体外の鋳型からの転写を活性化し得るＥＢＮＡ１誘導体のより多くの例が当分野で利用可能である（例えば、KirchmaierおよびSugden, J. Virol. 71(3):1776-1775 (1997)、ならびにKennedyおよびSugden, Mol. Cell. Biol. 23(19):6901-6908 (2003)、これら両方は参照によって本明細書に取り込まれる）。

本発明で使用されるＥＢＮＡ−１の誘導体は、対応する野生型ポリペプチドに対して修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである。この修飾は、ＥＢＮＡ−１におけるＬＲ１（残基約４０〜約８９）のユニーク領域（残基約６５〜約８９）に対応する領域の少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を含み、得られた誘導体が所望の性質（例えば、二量体化し、ＯｒｉＰに対応するｏｒｉを含有するＤＮＡに結合し、核に局在化し、細胞毒性がなく、染色体外から転写を活性化するが組み込まれた鋳型からの転写を実質的に活性化しない性質）を有する限り、ＥＢＮＡ−１の他の残基に対応する領域（例えば、残基約１〜残基約４０、残基約９０〜約３２８（「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ」反復配列領域）、残基約３２９〜約３７７（ＬＲ２）、残基約３７９〜約３８６（ＮＬＳ）、残基約４５１〜約６０８（ＤＮＡ結合および二量体化）または残基約６０９〜約６４１）の１以上のアミノ酸残基の欠失、挿入および／または置換を含み得る。置換は、Ｌ型ではなくＤ型を用いた置換、ならびに他の周知のアミノ酸類似体（例えば、アルファ−二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸など）を用いた置換を含む。これらの類似体は、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸；馬尿酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、アルファ−メチルアラニン、パラ−ベンゾイルフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシン、イプシロン−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、イプシロン−Ｎ−アセチルリジン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、オメガ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸、ならびにイミノ酸およびｔｅｒｔ−ブチルグリシンを含む。

保存的アミノ酸置換が好ましい、すなわち、例えば、極性酸性アミノ酸としてのアスパラギン酸−グルタミン酸；極性塩基性アミノ酸としてのリジン／アルギニン／ヒスチジン；非極性または疎水性アミノ酸としてのロイシン／イソロイシン／メチオニン／バリン／アラニン／グリシン／プロリン；極性または非電荷親水性アミノ酸としてのセリン／スレオニンである。保存的アミノ酸置換はまた、側鎖に基づく分類も含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンへの置換、アスパラギン酸のグルタミン酸への置換、スレオニンのセリンへの置換、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸への同様な置換が、得られるポリペプチドの性質に大きな影響を与えないと予想することは合理的である。アミノ酸交換が機能的なポリペプチドをもたらすか否かは、ポリペプチドの特異的活性をアッセイすることによって容易に決定され得る。

本発明の範囲内に入るアミノ酸置換は、一般に、（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクの維持に対するそれらの効果において著しく異ならない置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖の性質に基づく群に分けられる：

（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；

（２）中性で親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；

（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；

（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；

（５）鎖の配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および

（６）芳香族；ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。

本発明はまた、非保存的な置換を含むポリペプチドを想定する。非保存的な置換は、上述のある分類のメンバーを別の分類のメンバーに交換することを伴う。

ポリペプチドの酸付加塩またはポリペプチドのアミノ酸残基の酸付加塩は、ポリペプチドまたはアミンを、所望の無機酸または有機酸（例えば塩酸など）に相当する１つ以上のものに接触させることで調製され得る。ポリペプチドのカルボキシ基のエステルもまた、当分野で公知の通常の方法のいずれかで調製され得る。

ベクターの構築および送達
ある実施態様において、リプログラミングベクターまたは分化プログラミングベクターは、上述のリプログラミング因子、分化プログラミング因子および／または合成転写因子をコードする核酸配列に加えてさらなる要素を含み、これらのリプログラミング因子を細胞内で発現するように構築される。いくつかの実施態様において、これらのベクターの構成要素および送達方法は以下で開示される。

ベクター
プラスミドまたはリポソームに基づく染色体外ベクター（例えば、ＯｒｉＰに基づくベクター）および／またはＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするベクターの使用は、ＤＮＡの大型のフラグメントを細胞に導入し、染色体外で維持することを可能にする。

他の染色体外ベクターとして、他のリンパ向性ヘルペスウイルスに基づくベクターが挙げられる。リンパ向性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（例えばヒトＢリンパ芽球）において複製し、その天然の生活環の一部のためにプラスミドになるヘルペスウイルスである。例示的なリンパ向性ヘルペスウイルスは、限定されないが、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）；ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）およびマレック病ウイルス（ＭＤＶ）を含む。また、エピソームに基づくベクターの他の供給原（酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０またはＢＰＶなど）が提供されている。

ベクターはまた、遺伝子送達および／または遺伝子発現をさらに調整し、あるいは他の方法で標的とする細胞に有利な性質を与える他の成分または機能性を含み得る。このような他の成分は、例えば、細胞への結合または標的化に影響を与える成分（細胞種または組織に特異的な結合を媒介する成分を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を与える成分；取り込み後に細胞内でのポリヌクレオチドの局在化に影響を与える成分（核移行を媒介する物質など）；およびポリヌクレオチドの発現に影響を与える成分を含む。

調節エレメント
ベクターに含まれる真核生物の発現カセットは、好ましくは、（５’から３’方向で）タンパク質コード配列に動作可能に連結する真核生物の転写プロモーター、介在配列を含むスプライスシグナル、および転写終結配列／ポリアデニル化配列を含む。

プロモーター／エンハンサー
「プロモーター」は、転写の開始および速度を調節する核酸配列の領域である調節配列である。プロモーターは、制御タンパク質および分子（ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子など）が結合し、核酸配列の特異的な転写を開始し得る遺伝要素を含み得る。語句「動作可能に配置される」、「動作可能に連結される」、「制御下」および「転写制御下」は、プロモーターが核酸配列に対して正しい機能的位置および／または配向にあり、転写開始および／またはその配列の発現を制御することを意味する。

本発明のＥＢＮＡ−１をコードするベクターにおける使用に適したプロモーターは、ＥＢＮＡ−１タンパク質をコードする発現カセットの発現を導き、ＥＢＶ ＯｒｉＰ含有ベクターを安定に維持するのに十分な定常状態のレベルのＥＢＮＡ−１タンパク質をもたらすプロモーターである。プロモーターはまた、リプログラミング因子および／または合成転写因子をコードする発現カセットの効率的な発現のために使用される。

プロモーターは一般に、ＲＮＡ合成の開始点を配置するために機能する配列を含む。この最もよく知られた例はＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを持たないいくつかのプロモーター（例えば、哺乳類末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなど）において、開始点自身を覆う別の要素が開始位置の固定に役立つ。さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を制御する。通常、これらは開始点の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多くのプロモーターは開始点の下流に機能的要素を含むことが示されている。コード配列をプロモーターの「制御下」に導くため、コード配列は選択したプロモーターの「下流」（すなわち３’側）の転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端に位置する。「上流」のプロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。

エレメントが互いに対して逆転または移動している場合にプロモーターの機能が保存されるように、プロモーターエレメント間の間隔は柔軟であることが多い。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始める前に５０ｂｐまで増加し得る。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、協同的にまたは独立して機能し、転写を活性化し得ると思われる。プロモーターは、「エンハンサー」と共に使用してもよく、または使用しなくてもよく、「エンハンサー」は核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性制御配列を指す。

プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られ得るような、核酸配列と天然に関連しているものであり得る。このようなプロモーターは「内在性」と呼ばれ得る。同様に、エンハンサーは、核酸配列と天然に関連しているものであり得、その配列の下流または上流のいずれかに位置し得る。あるいは、組換えプロモーターまたは異種プロモーター（その天然の環境で核酸配列と通常は関連していないプロモーターを指す）の調節下にコード核酸セグメントを配置することにより、一定の利点が得られる。組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーはまた、その天然の環境において核酸配列と通常は関連していないエンハンサーを指す。このようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、およびあらゆる他のウイルスもしくは原核細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在」しないプロモーターまたはエンハンサー（すなわち、種々の転写制御領域の種々のエレメントおよび／または発現を変化させる変異を含有するプロモーターまたはエンハンサー）を含み得る。例えば、組換えＤＮＡ構築において最もよく使用されているプロモーターとして、ベータ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステムが挙げられる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に作製することに加えて、配列は、本明細書において開示される組成物と組み合わせた組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術（ＰＣＲを含む）を用いて作製され得る。さらに、いくつかの実施態様において、非核小器官（ミトコンドリアおよび葉緑体など）における配列の転写および／または発現を導く調節配列も利用され得る。

発現のために選択される、細胞小器官、細胞種、組織、器官または生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効率的に導くプロモーターおよび／またはエンハンサーを利用することは重要である。利用されるプロモーターは、適切な条件下で構成的であり、組織特異的であり、誘導性であり、および／または有用であり得、組換えタンパク質および／またはペプチドの大規模な作製に有利であるように、導入されたＤＮＡセグメントの高レベルの発現を導く。プロモーターは異種性または内在性であり得る。

Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系の使用は、１つの実施態様である。真核細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが送達複合体の一部またはさらなる遺伝子発現コンストラクトのいずれかとして提供される場合、特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支持し得る。

プロモーターの限定されない例は、初期または後期ウイルスプロモーター（ＳＶ４０初期または後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーターなど）；真核細胞プロモーター（例えば、βアクチンプロモーター（Ng, S. Y., Nuc. Acid Res. 17: 601-615, 1989, Quitsche et al., J. Biol. Chem. 264: 9539-9545, 1989）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Alexander et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 5092-5096, 1988, Ercolani et al., J. Biol. Chem. 263: 15335-15341, 1988）、メタロチオネインプロモーター（Karin et al. Cell 36: 371-379, 1989; Richards et al., Cell 37: 263-272, 1984など）；および連鎖状(concatenated)応答エレメントプロモーター（サイクリックＡＭＰ応答エレメントプロモーター（ｃｒｅ）、血清応答エレメントプロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）および最小ＴＡＴＡボックス付近の応答エレメントプロモーター（ｔｒｅ）を含む。ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ、受入番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３〜３４１に記載のヒト成長ホルモン最小プロモーター）またはマウス***腫瘍プロモーター（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＡＴＣＣ４５００７より入手可能）を使用することも可能である。具体例はホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである。

開始シグナルおよび内部リボソーム結合部位
特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接の配列を含む。外来性翻訳調節シグナル（ＡＴＧ開始コドンを含む）を提供することが必要とされ得る。当業者は、これを容易に決定でき、必要とされるシグナルを容易に提供できる。開始コドンが、挿入全体の翻訳を保証するために所望のコード配列のリーディングフレームと共に「インフレーム」でなければならないことは周知である。外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然または合成のいずれかであり得る。発現効率は適切な転写エンハンサーエレメントの包含によって増強され得る。

マルチクローニングサイト
ベクターはマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含み得、これは複数の制限酵素部位を含む核酸領域であり、これらのいずれかは標準的な組換え技術と組み合わせて使用され、ベクターを消化し得る。「制限酵素消化」は、核酸分子の特異的な位置でのみ機能する酵素による核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くは市販されている。

スプライシング部位
いくつかの実施態様において、本発明の方法に使用されるベクターは、スプライシング部位を含む。転写された真核生物ＲＮＡ分子のほとんどはＲＮＡスプライシングを受け、一次転写物からイントロンを除去する。ゲノム真核細胞配列を含有するベクターは、タンパク質発現のための転写産物の適切なプロセシングを保証するために、ドナーおよび／またはアクセプタースプライシング部位を必要とし得る。

終結シグナル
いくつかの実施態様において、本発明のベクターまたはコンストラクトは少なくとも１つの終結シグナルを含む。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の特異的な終結に関与するＤＮＡ配列から構成される。したがって、ある実施態様において、ＲＮＡ転写物の生成を終了させる終結シグナルが与えられる。ターミネーターは、所望のメッセージレベルを達成するためにインビボにおいて必要とされ得る。

真核細胞系において、ターミネーター領域はまた、ポリアデニル化部位を露出させるように、新たな転写産物の部位特異的切断を可能にする特異的なＤＮＡ配列を含み得る。これは、特殊化した内在性ポリメラーゼにシグナルを送り、一続きの約２００個のＡ残基（ポリＡ）を転写産物の３’末端に付加する。このポリＡテールで修飾されたＲＮＡ分子は、より安定であると見受けられ、より効率的に翻訳される。したがって、真核生物を含む他の実施態様において、ターミネーターはＲＮＡの切断のためのシグナルを含むことが好ましく、ターミネーターシグナルがメッセージのポリアデニル化を促進することがより好ましい。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位エレメントは、メッセージレベルを増強し、カセットから他の配列への読み取りを最小限にするために働き得る。

本発明における使用のために提供されるターミネーターは、本明細書に記載され、または当業者に公知の転写のあらゆる公知のターミネーターを含み、これは限定されないが、例えば、遺伝子の終結配列（例えばウシ成長ホルモンターミネーターなど）、またはウイルス性終結配列（例えばＳＶ４０ターミネーターなど）を含む。ある実施態様において、終結シグナルは、配列短縮化などによる転写可能な配列または翻訳可能な配列の欠如であり得る。

ポリアデニル化シグナル
発現、特に真核生物での発現において、通常、転写産物の適切なポリアデニル化をもたらすポリアデニル化シグナルが含まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実践の成功に重要ではないと考えられ、あらゆるそのような配列が利用され得る。好ましい実施態様は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含み、これらは便利で、様々な標的細胞においてよく機能することが知られている。ポリアデニル化は、転写産物の安定性を向上し得、または細胞質輸送を促進し得る。

選択マーカーおよびスクリーニング可能なマーカー
本発明のある実施態様において、本発明の核酸コンストラクトを含有する細胞は、発現ベクター中にマーカーを含むことによって、インビトロまたはインビボで同定され得る。このようなマーカーは同定可能な変化を細胞に与え、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定を可能にする。一般に、選択マーカーは選択を可能にする性質を与えるマーカーである。正の選択マーカーは、マーカーの存在によってその選択を可能にするマーカーであり、負の選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を妨げるマーカーである。正の選択マーカーの例は薬剤耐性マーカーである。

通常、薬剤選択マーカーの含有は、形質転換体のクローニングおよび同定に役立ち、例えばネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ｚｅｏｃｉｎおよびヒスチジノールに対する耐性を与える遺伝子は有用な選択マーカーである。条件の実行に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を与えるマーカーに加えて、スクリーニング可能なマーカー（熱量分析に基づくＧＦＰなど）を含む他の種類のマーカーも与えられる。あるいは、負の選択マーカーとしてのスクリーニング可能な酵素（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）など）も利用され得る。ＦＡＣＳ分析と組み合わされる可能性のある、免疫学的マーカーの使用方法も当業者に公知である。遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現可能である限り、使用されるマーカーは重要ではないと考えられる。選択マーカーおよびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は当業者に周知である。本発明の一つの特徴は、分化プログラミング因子が細胞において望ましく変化した分化状態をもたらした後に、選択マーカーおよびスクリーニング可能なマーカーを使用し、ベクターを含まない細胞を選択することを含む。

ベクター送達
本発明での体細胞へのリプログラミングベクターまたは分化プログラミングベクターの導入は、本明細書に記載されるように、または当業者に公知のように、細胞の形質転換のための核酸送達のあらゆる適切な方法を使用し得る。そのような方法は、限定されないが、エクスビボにおける遺伝子導入（マイクロインジェクションを含む）；エレクトロポレーション；リン酸カルシウム沈殿法；ＤＥＡＥ−デキストランの使用に続くポリエチレングリコールの使用；直接の音波負荷(direct sonic loading)；リポソーム介在性遺伝子導入および受容体介在性遺伝子導入；微粒子銃；炭化ケイ素繊維との撹拌；アグロバクテリウム介在性形質転換；プロトプラストのＰＥＧ介在性形質転換；乾燥／阻害が介在するＤＮＡ取り込み、およびこのような方法のあらゆる組合せなどによる、ＤＮＡの直接送達を含む。本発明のベクターを送達するさらなる方法は「細胞圧縮(cell squeezing)」を含み、これは細胞の迅速な機械的変形を伴い、巨大分子およびナノマテリアルを細胞に送達する。例えば、Sharei, "Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform," J. Vis. Exp. 81:1-7 (2013)を参照、これは参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。

リポソーム介在性遺伝子導入
本発明のある実施態様において、核酸は脂質複合体（例えばリポソームなど）中に封入され得る。リポソームは、リン脂質二重膜および内部の水媒体によって特徴付けられる小胞構造体である。多重膜リポソームは、水媒体によって分離される複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質を過剰量の水溶液中で懸濁すると自発的に形成する。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再編成を起こし、脂質二重層間に水および溶解した溶質を封入する。リポフェクタミン(Gibco BRL)またはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ(Qiagen)と複合体形成した核酸も提供される。使用されるリポソームの量は、リポソームの性質ならびに使用される細胞によって様々であり得、例えば１００万〜１０００万個の細胞当たり約５〜約２０μｇのベクターＤＮＡが使用され得る。

エレクトロポレーション
本発明のある実施態様において、核酸はエレクトロポレーションを介して細胞小器官、細胞、組織または生物に導入される。エレクトロポレーションは、細胞およびＤＮＡの懸濁液の高電圧放電への曝露を含む。レシピエント細胞は、機械的損傷によってより形質転換しやすくなり得る。また使用されるベクターの量は、使用される細胞の性質によって様々であり得、例えば１００万〜１０００万個の細胞当たり約５〜約２０μｇのベクターＤＮＡが与えられ得る。

エレクトロポレーションを用いた真核細胞の遺伝子導入は極めて成功している。この方法で、マウスプレＢリンパ球にヒトカッパ−免疫グロブリン遺伝子が遺伝子導入され(Potter et al., 1984)、ラット肝細胞にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が遺伝子導入された(Tur-Kaspa et al., 1986)。

リン酸カルシウム
本発明の他の実施態様において、核酸はリン酸カルシウム沈殿法を用いて細胞に導入される。この技術を用いて、ヒトＫＢ細胞にアデノウイルス５ＤＮＡが遺伝子導入された。またこの方法で、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞にネオマイシンマーカー遺伝子が遺伝子導入され、ラット肝細胞に様々なマーカー遺伝子が遺伝子導入された。

ＤＥＡＥ−デキストラン
別の実施態様において、核酸はＤＥＡＥ−デキストラン、およびそれに続くポリエチレングリコールを用いて細胞に送達される。この方法において、レポータープラスミドがマウス骨髄腫および赤白血病細胞に導入された。

超音波負荷
本発明のさらなる実施態様は、直接の超音波負荷による核酸の導入を含む。超音波負荷によって、ＬＴＫ線維芽細胞にチミジンキナーゼ遺伝子が遺伝子導入された。

受容体介在性遺伝子導入
さらに、核酸は受容体介在性送達媒体を介して標的細胞に送達され得る。これらは、標的細胞において生じる受容体介在性エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的な取り込みを利用する。様々な受容体の細胞種特異的な分布を考慮して、この送達方法は別の程度の特異性を本発明に付加する。

特定の受容体介在性の遺伝子ターゲティング媒体は、細胞受容体特異的リガンドおよび核酸結合物質を含む。他の媒体は、送達される核酸が動作可能に結合している細胞受容体特異的リガンドを含む。本発明のある態様において、リガンドは標的細胞集団上に特異的に発現する受容体に対応するように選択される。

他の実施態様において、細胞特異的な核酸ターゲティング媒体の核酸送達媒体成分は、リポソームと組み合わせた特異的に結合するリガンドを含み得る。送達される核酸はリポソーム内に入れられ、特異的に結合するリガンドはリポソーム膜に機能的に取り込まれる。したがって、リポソームは標的細胞の受容体に特異的に結合し、内容物を細胞に送達する。このようなシステムは、機能的に使用するシステムであることが示されており、例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、核酸の、ＥＧＦ受容体の発現上昇を示す細胞への受容体介在性送達において使用される。

さらなる実施態様において、標的送達媒体の核酸送達媒体成分は、リポソーム自体であり得、これは好ましくは、細胞特異的な結合を導く１以上の脂質または糖タンパク質を含む。例えば、ラクトシルセラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシド(asialganglioside)はリポソームに組み込まれ、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加が観察された(Nicolau et al., 1987)。本発明の組織特異的な形質転換コンストラクトは、類似の様式で標的細胞に特異的に送達され得ることが想定される。

微粒子銃
微粒子銃技術は、少なくとも１つの細胞小器官、細胞、組織または生物に核酸を導入するために使用され得る。この方法は、ＤＮＡを被覆した微粒子(microprojectile)を高速まで加速させる能力に依存し、これはこの微粒子が細胞を死滅させることなく細胞膜を貫通し、細胞に侵入することを可能にする。当分野で公知の非常に多様な微粒子銃技術が存在し、これらの多くは本発明に適用できる。

この微粒子銃において、１以上の粒子が少なくとも１つの核酸で被覆され得、推進力によって細胞に送達され得る。小粒子を加速するための数種の装置が開発されている。そのような装置の一つは高電圧放電に依存して電流を発生させ、これは次に駆動力を与える。使用される微粒子は、生物学的に不活性な物質（タングステンまたは金粒子またはビーズなど）からなっている。例示的な粒子として、タングステン、白金および好ましくは金から構成される粒子が挙げられる。場合により、金属粒子上へのＤＮＡ沈殿は、微粒子銃を用いたレシピエント細胞へのＤＮＡ送達に必要ではないことが想定される。しかしながら、粒子はＤＮＡで被覆されるのではなく、ＤＮＡを含んでもよいことが想定される。ＤＮＡで被覆された粒子は粒子銃を介したＤＮＡ送達のレベルを増加させ得るが、それ自体は必要ではない。

照射のために、懸濁液中の細胞はフィルターまたは固形培養培地上に濃縮される。あるいは、未熟胚または他の標的細胞が固形培養培地上に配置され得る。照射される細胞は、マクロプロジェクタイル停止プレート(macroprojectile stopping plate)下の適切な距離に配置される。

ｉＰＳ細胞の選択
本発明のある態様において、リプログラミングベクターが体細胞に導入された後、細胞は増殖のために培養（場合により、正の選択マーカーまたはスクリーニング可能なマーカーのようなベクターエレメントの存在について選択し、遺伝子導入細胞を濃縮）され、リプログラミングベクターはこれらの細胞中にリプログラミング因子を発現し、細胞***と共に複製および分配する。これらの発現したリプログラミング因子は、体細胞ゲノムを自律的多能性状態を確立するようにリプログラミングし、その間に、またはベクターの存在についての正の選択の除去後に、外来性遺伝要素は徐々に失われる。これらの人工多能性幹細胞は、多能性胚性幹細胞と類似の特徴を共有すると想定されるため、胚性幹細胞の特徴に基づいてこれらの体細胞由来の子孫から選択され得る。また、さらなる負の選択の工程を利用し、リプログラミングベクターＤＮＡが存在しないことをテストすることによって、または選択マーカーを使用することによって、外来性遺伝要素を本質的に含まないｉＰＳＣ細胞の選択を加速または促進し得る。

胚性幹細胞の特徴に対する選択
ｉＰＳＣは、以下の点において天然に単離された多能性幹細胞（マウスおよびヒト胚性幹細胞、それぞれｍＥＳＣおよびｈＥＳＣなど）と類似しており、したがって、天然に単離された多能性幹細胞に対するｉＰＳＣの同一性、信頼性および多能性が確認されている。したがって、本発明において開示される方法から作製される人工多能性幹細胞は、以下の胚性幹細胞の特徴のうち１つ以上に基づいて選択され得る。

細胞生物学的性質
形態：ｉＰＳＣは、形態学的にＥＳＣと類似している。各細胞は円形であり得、大型の核小体およびわずかな細胞質を有し得る。また、ｉＰＳＣのコロニーはＥＳＣのコロニーと類似してい得る。ヒトｉＰＳＣは、ｈＥＳＣと類似した、縁が鋭く、平らで密なコロニーを形成し、マウスｉＰＳＣはｍＥＳＣと類似したコロニーを形成し、ｈＥＳＣのコロニーよりも起伏があり、凝集したコロニーを形成する。

増殖の性質：幹細胞はその定義の一部として自己複製しなければならないため、倍加時間および有糸***活性はＥＳＣにおいて肝要である。ｉＰＳＣは、ＥＳＣと同等の速度で、有糸***的に活性であり、活発に自己複製し、増殖し、かつ***し得る。

幹細胞の細胞外マーカー：ｉＰＳＣは、ＥＳＣ上で発現する細胞表面抗原性マーカーを発現し得る。ヒトｉＰＳＣはｈＥＳＣに特異的なマーカーを発現し、これは限定されないが、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅを含む。マウスｉＰＳＣはｍＥＳＣと同様に、ＳＳＥＡ−１を発現したが、ＳＳＥＡ−３もＳＳＥＡ−４も発現しなかった。

幹細胞遺伝子：ｉＰＳＣは未分化ＥＳＣにおいて発現する遺伝子を発現し得、これはＯｃｔ−３／４、Ｓｏｘ−２、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４およびｈＴＥＲＴを含む。

テロメラーゼ活性：テロメラーゼは、約５０回の細胞***というヘイフリック限界によって制限されない細胞***を維持するのに必要である。ｈＥＳＣは自己複製および増殖を維持するために高テロメラーゼ活性を発現し、ｉＰＳＣも高テロメラーゼ活性を示し、テロメラーゼタンパク質複合体に必要な構成要素であるｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）を発現する。

多能性：ｉＰＳＣは、ＥＳＣと同様の様式で三胚葉の細胞に分化できる。

神経分化：ｉＰＳＣはニューロンに分化し得、これはベータＩＩＩ−チューブリン、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＣｈＡＴ、ＬＭＸ１ＢおよびＭＡＰ２を発現する。カテコールアミン関連酵素が存在することは、ｈＥＳＣのように、ｉＰＳＣがドーパミン作動性ニューロンに分化可能であり得ることを示し得る。幹細胞関連遺伝子は分化後に下方制御される。

心臓分化：ｉＰＳＣは、鼓動を自発的に開始した心筋細胞に分化し得る。心筋細胞は、ＴｎＴｃ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＬ２Ａ、ＭＹＨＣベータおよびＮＫＸ２．５を発現した。幹細胞関連遺伝子は分化後に下方制御される。

奇形腫形成：免疫不全マウスに注入されたｉＰＳＣは、一定時間（９週間など）後に、奇形腫を自発的に形成し得る。奇形腫は、三胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）由来の組織を含有する複数系統の腫瘍であり、これは、典型的に１細胞種のみの腫瘍である他の腫瘍とは異なる。奇形腫形成は多能性の指標テストである。

胚様体：培養中のｈＥＳＣは、「胚様体」と呼ばれる球状胚様構造を自発的に形成し、これは有糸***的に活性であり、分化するｈＥＳＣのコア、および全三胚葉から完全に分化した細胞の末端からなる。ｉＰＳＣもまた胚様体を形成し得、末梢の分化した細胞を有し得る。

胚盤胞注入：ｈＥＳＣは、胚盤胞の内部細胞塊（胚結節）の内部に天然に存在し、胚結節中において胚に分化するが、胚盤胞の殻（トロホブラスト）は胚外組織に分化する。中空状のトロホブラストは、生きている胚を形成できず、したがって、胚結節内の胚性幹細胞が分化し、胚を形成する必要がある。雌のレシピエントに移行した胚盤胞を生成するためにマイクロピペットによってトロホブラストに注入されたｉＰＳＣは、生きているキメラ仔マウスをもたらし得る：それらの全身にわたり１０％〜９０で組み込まれたｉＰＳＣ誘導体およびキメラ化を伴うマウス。

エピジェネティックなリプログラミング
プロモーター脱メチル化：メチル化は、メチル基のＤＮＡ塩基への移行であり、典型的にメチル基のＣｐＧ部位（隣接するシトシン／グアニン配列）におけるシトシン分子への移行である。遺伝子の広範なメチル化は、発現タンパク質の活性を妨げ、または発現に干渉する酵素を補充することによって、発現に干渉する。したがって、遺伝子のメチル化は、転写を妨げることによって効果的に発現を抑制する。多能性関連遺伝子のプロモーター（Ｏｃｔ−３／４、Ｒｅｘ１およびＮａｎｏｇを含む）はｉＰＳＣにおいて脱メチル化され得、ｉＰＳＣにおいてそれらのプロモーター活性ならびに多能性関連遺伝子の有効な促進および発現を示す。

ヒストン脱メチル化：ヒストンは、様々なクロマチン関連修飾を介してそれらの活性をもたらし得るＤＮＡ配列に構造的に局在する小型のタンパク質である。Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ−２およびＮａｎｏｇに関連するＨ３ヒストンは脱メチル化され得、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ−２およびＮａｎｏｇの発現を活性化し得る。

残留物を含まない特徴の選択
本発明におけるＯｒｉＰに基づくプラスミドなどのリプログラミングベクターは染色体外で複製し、数世代後に宿主細胞においてその存在が失われる。しかしながら、外来性ベクターエレメントを本質的に含まない子孫細胞のためのさらなる選択の工程がこの方法を容易にし得る。例えば、当分野で公知の外来性ベクターエレメントの存在または損失をテストするために、子孫細胞の試料が抽出され得る。

代替または相補的な手法は、従来の方法（ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）、遺伝子アレイまたはハイブリダイゼーション（例えばサザンブロット）など）を用いて、外来性遺伝要素が子孫細胞において存在しないことをテストすることである。

ｉＰＳ細胞の培養
開示された方法を用いて体細胞にリプログラミングベクターを導入した後、これらの細胞は多能性を維持するために培地中で十分に培養され得る。本発明において作製される人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養には、霊長類多能性幹細胞、より具体的には胚性幹細胞を培養するために開発された様々な培地および技術を使用できる。

例えば、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞と同様に、ｉＰＳ細胞は、８０％ＤＭＥＭ(Gibco #10829-018または#11965-092)、熱失活していない２０％ｄｅｆｉｎｅｄウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール中で維持され得る。あるいは、ＥＳ細胞は、８０％Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ ＤＭＥＭ(Gibco #10829-018)、２０％血清代替物(Gibco #10828-028)、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールで作成された無血清培地中で維持され得る。使用の直前にヒトｂＦＧＦが約４ｎｇ／ｍＬの終濃度となるように添加される(WO99/20741)。

ＥＳ細胞と同様に、ｉＰＳ細胞は、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４(Developmental Studies Hybridoma Bank, National Institute of Child Health and Human Development, Bethesda Md.)、ならびにＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１(Andrews et al., in Robertson E, ed. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells. IRL Press, 207-246, 1987)に対する抗体を用いて免疫組織化学またはフローサイトメトリーによって同定され得る特徴的な抗原を有する。胚性幹細胞の多能性は、約０．５〜１０ １０ ６個の細胞を８〜１２週齢の雄性ＳＣＩＤマウスの後肢の筋肉に注入することによって確認され得る。各三胚葉の少なくとも１つの細胞種を示す奇形腫が発生する。

本発明は、以下の実施例に関連して記述されている。これらの実施例は単に説明的であり、本発明はいかなる方法においてもこれらの実施例に限定されるものとして解釈されるべきでなく、むしろ本明細書において与えられる教示の結果として明らかになるあらゆる変形を包含するように解釈されるべきである。

実施例１
材料と方法
プロトコル：4D Nucleofectorを用いた、エピソーマルプラスミドおよびリプログラミングエンハンサーＡでのヒトＰＢＭＣのフィーダー非依存的リプログラミング

材料：
１．ｈＰＢＭＣ(Lonza Cat. CC-2702、５０ｘ１０^６細胞／バイアル)
２．Lonza L7 hPSC Culture Medium^（商標）および添加キット
３．Lonza L13 hPSC Passaging Solution^（商標）
４．Lonza L7 hPSC Matrix^（商標）
５．Lonza 4D Nucleofector^（商標）
６．Lonza P3 Primary Cell 4D-Nucleofector^（商標）キット
７．Lonza Episomal Reprogramming Kit^（商標）
ａ．Episomal Reprogramming Plasmid Mix^（商標）
ｂ．Episomal Enhancer A^（商標）
８．６および１２ウェル組織培養処理プレート
９．ＰＢＭＣ基本培地： HPGM^（商標）：Poietics^（商標）抗生物質を含まない造血前駆増殖培地
１０．ＰＢＭＣ培地添加物（表参照）
１１．遠心管
１２．１Ｘ ＰＢＳ
１３．ドライアイス
１４．パラフィルム^（商標）
１５．低酸素加湿型細胞培養インキュベーター（３％Ｏ_２；５％ＣＯ_２）
１６．加湿型細胞培養インキュベーター（２０．９％Ｏ_２；５％ＣＯ_２）

プライミングの工程（０日目〜６日目）の間、細胞数の著しい減少が観測される。このプロトコルは、１０〜５０ｘ１０^６個の開始細胞数で最適化されている。プライミングが１０ｘ１０^６細胞未満である場合、さらに２日間細胞をプライミングし、８日目にヌクレオフェクトする(nucleofect)ことを考慮する。

添加されたＨＰＧＭは４℃に維持されている場合、１０日目まで有効である。全ての遠心分離は室温で実行されるべきである。

手順
それぞれの日に必要とされるＰＢＭＣ基本培地および添加物を含むＰＢＭＣ培地の量を計画し、見積もる。必要とされる量を適切な温度にする。

０日目：液体窒素タンクからｈＰＢＭＣのバイアルを取り出す。３７℃の水浴中でキャップを浸すことなく、バイアルの解凍を迅速に始める。極少量の目に見える氷がある場合、バイアルを水浴から取り出す。バイアルの外側を７０％エタノールで洗浄する。

バイアルの内容物を５０ｍｌ遠心管に移す。

４９ｍｌの室温のＰＢＭＣ基本培地を細胞にゆっくりと滴下して加える。大量の培地を一度に細胞に加えない。これは浸透圧ショックをもたらし得る。

細胞を１５分間の２００ ｘ ｇで回収する。

細胞のペレットを乱すことなく、遠心管から培地を取り除く。

細胞のペレットを、全ての添加物を含む１０ｍｌのＰＢＭＣ培地に穏やかに懸濁する。細胞を数える。

細胞を６ウェル組織培養処理プレートに２〜４ｘ１０^６細胞／ｍｌで播種する。

プレートを、加湿した３７℃のインキュベーター中に正常酸素条件下（２０．９％Ｏ_２；５％ＣＯ_２）で配置する。

３日目：細胞を１５ｍｌ遠心管に移す。１ｍｌのＰＢＭＣ基本培地でよくリンスする。細胞を５分間の２００ ｘ ｇで回収する。細胞のペレットを乱すことなく、遠心管から培地を取り除く。

細胞のペレットを、全ての添加物を含む１０ｍｌのＰＢＭＣ培地に穏やかに懸濁する。細胞を数える。

細胞を６ウェルプレートに０．５〜１ｘ１０^６細胞／ｍｌで播種する。

プレートを、加湿した３７℃のインキュベーター中に正常酸素条件下（２０．９％Ｏ_２；５％ＣＯ_２）で配置する。

５日目：添付の説明書に従って、６日目のために６ウェルプレートをL7 hPSC Matrix^（商標）で調製する。

６日目：マトリックス溶液を６ウェルプレートから取り除く。全ての添加物を含む２ｍｌのＰＢＭＣ培地をそれを必要とする各ウェルに加える。６μｌのEpisomal Enhancer A^（商標）を各ウェルに加える。

低酸素加湿インキュベーター（３％Ｏ_２；５％ＣＯ_２）中において、３７℃で１時間、前平衡化する。

インキュベーターから細胞を取り出す。１５ｍｌ遠心管に移す。１ｍｌのＰＢＭＣ基本培地でよくリンスする。細胞を数える。

１ｘ１０^６細胞を少なくとも２つの１５ｍｌ遠心管に移す。

１つの遠心管はヌクレオフェクトされず、ゲノムＤＮＡ対照として調製される。この対照は、ｉＰＳＣ株の同一性を確認する（ＳＴＲ分析）のために後に使用され得る。

細胞を遠心分離し、５分間の２００ ｘ ｇで回収するために遠心管に移す。ヌクレオフェクション(nucleofection)反応が終了するまで、対照の遠心管を取りのけておく。

各ヌクレオフェクション用：１００μｌのP3 Nucleofector^（商標）溶液を３μｇのEpisomal Reprogramming Plasmid Mix^（商標）を含む１つのチューブにピペッティングする。

遠心管中に回収された細胞から上清を取り除く。

各遠心管の細胞を調製されたヌクレオフェクション試薬（工程２０）中に懸濁する。

P3 Nucleofector^（商標）溶液への細胞の曝露は最小化されるべきである。4D Nucleofector^（商標）を介して、１つのチューブのみで一度に調製し、処理する。

細胞をNucleocuvette^（商標）に移し、4D Nucleofector^（商標）中に配置する。プログラムＥＯ−１１５を用いてヌクレオフェクト細胞に泡を作るのを回避する。

Nucleofection^（商標）キットに付属しているトランスファーピペットを用いて、約５００μｌの予め温めたＰＢＭＣ培地（全ての添加物を含む）をキュベットに加え、細胞を平衡化した６ウェルプレートの１つのウェルに直接移す。

細胞を低酸素加湿インキュベーター（３％Ｏ_２；５％ＣＯ_２）中において、３７℃で２日間配置する。

ゲノムＤＮＡ対照試料の処理の完了：工程１８で取りのけた細胞を含む遠心管から培地を取り除く。１ｍｌのセロロジカルピペットを用いて、細胞を１Ｘ ＰＢＳ中に懸濁し、１．５ｍｌ遠心管に移す。細胞を３００ ｘ ｇで５分間遠心分離する。上清を注意深く取り除く。細胞ペレットをドライアイス上で急速冷凍し、試料を−８０℃で保存する。

８日目：２ｍｌのL7 hPSC Culture Medium^（商標）（添加物を含む）をヌクレオフェクトされた細胞を含む各ウェルに添加する。

細胞を低酸素加湿インキュベーター（３％Ｏ_２；５％ＣＯ_２）中において、３７℃で２日間配置する。

１０日目：培地を２ｍｌのL7 hPSC Culture Medium^（商標）（添加物を含む）に交換する。

細胞を低酸素加湿インキュベーター（３％Ｏ_２；５％ＣＯ_２）中において、３７℃で２日間配置する。

１日おきの培地交換を１４日目から開始し、継続する：培地を２ｍｌのL7 hPSC Culture Medium^（商標）（添加物を含む）に交換する。コロニーが継代培養するのに十分大きくなるまで、１日おきの培地交換を繰り返す。

ｉＰＳＣコロニーの継代培養：１２ウェルプレートをL7 hPSC Matrix^（商標）で調製する。

L7 hPSC Culture Medium^（商標）（添加物を含む）を用いて、存在する最初のコロニーを、別々のウェルに手動で植え継ぎする（Ｐ１）。

プレートを、加湿した３７℃のインキュベーター中に正常酸素条件下（２０．９％Ｏ_２；５％ＣＯ_２）で配置する。

一度コロニーを新たなプレートに手動で植え継ぎした場合（工程３６）、ヒトｉＰＳＣ培養は正常酸素条件下（２０．９％Ｏ_２；５％ＣＯ_２）の加湿した３７℃のインキュベーター中において培養されるべきである。

Ｐ３および後の植え継ぎのために、L7 hPSC Passaging Solution^（商標）を用い、添付の説明書に従ってコロニーを増殖中に継代培養する。

工程１、実験目標１：ＥＢＮＡ−１の発現を制御することによるｉＰＳＣにおけるベクター排除の速度論の決定
本実験のために、ＥＢＮＡ−１配列を機能的ＴｅｔＯｎベクターからのＴＲＥプロモーターの下流にクローン化し、ＴｅｔＯｎ−ＥＢＮＡ−１ベクターを作製する。この系において、ＥＢＮＡ−１の発現はドキシサイクリン（Ｄｏｘ）存在下において活性化される（ＴｅｔＯｎシステム）。同じクローン化の戦略を用いてＴｅｔＯｎ−ｅＧＦＰベクターを作製し、Ｔｅｔ制御の対照ベクターとして用いる。構成的なＥＢＮＡ−１発現に対する制御されたＥＢＮＡ−１発現の効果をテストするため、ＥＢＮＡ−１発現を駆動するＣＡＧプロモーターを含むベクターを作製する。ＴｅｔＯｎ−ＥＢＮＡ−１ベクターおよびＣＡＧ−ＥＢＮＡ−１ベクターの両方を、ＯｒｉＰ領域を含み、および含まずにテストする。最終的に、「テスト」ベクターは構成的なｅＧＦＰ発現カセット（ＳＶ４０プロモーター）を含み、ＯｒｉＰ領域を含む。「テスト」ベクターは、リプログラミング因子を含む標準的なベクターの模倣物である。エピソーマルベクターの排除に対するＥＢＮＡ−１制御の効果を調べるのに使用されるベクターの一覧および説明について、表１を参照。

ベクターを様々な組合せでｉＰＳＣに同時導入し、遺伝子導入された細胞をＤｏｘを含み、または含まずに１５継代の間維持する（遺伝子導入条件および想定される効果の要約について、表２を参照）。ＧＦＰレポーターの発現を適用可能な場合にモニターする。細胞ペレットを細胞継代毎に回収する。ベクター排除の状態を、２〜３細胞継代毎にｑＰＣＲベクター検出スクリーニングアッセイを用いて調べる。

工程１、実験目標２：ｉＰＳＣにおけるベクター排除の速度論に対する自殺遺伝子取り込みの効果をテストする
自殺遺伝子チミジンキナーゼ（ＴＫ）の配列を、表１に記載されるＳＶ４０−ｅＧＦＰ（ＯｒｉＰ）ベクター、ＴｅｔＯｎ−ＥＢＮＡ−１ベクターおよびＣＡＧ−ＥＢＮＡ−１ベクター中にクローン化する（表３の一覧参照）。ＳＶ４０−ｅＧＦＰ（ＯｒｉＰ）ベクターは、遺伝子導入効率の対照を与えるため、および「テスト」ベクターとして使用される。遺伝子導入のためのベクターの組合せを表４に示す。テストされるＥＢＮＡ−１ベクターはＯｒｉＰ領域を最初に含むが、ＯｒｉＰを含まないバリアントもまた必要に応じてテストされ得る（表３にも含まれている）。

ＴＫベクターと共に使用するＧＮＣの最適な濃度を決定するため、死滅曲線を標準的な方法に従って作成する。ｉＰＳＣにＳＶ４０−ｅＧＦＰ−ＴＫ（ＯｒｉＰ）を遺伝子導入し、次いで遺伝子導入の４８時間後に、様々な濃度のＧＮＣで処理する（遺伝子導入条件および想定される効果の要約について、表４を参照）。ＧＮＣの最適な濃度が決定した場合、ＥＢＮＡ−１発現ベクターを用いて実験を繰り返し、最適な濃度のＧＮＣに対するその応答を検証する。生存細胞の数をCellTiter-Glo発光細胞生存率アッセイ(Promega)を用いて決定する。さらに、アポトーシス細胞の数をCellEvent^（商標）カスパーゼ−３／７緑色Readyプローブ試薬(Invitrogen)を用いて決定する。

工程２、実験目標１：ＥＢＮＡ−１発現の制御、およびそれに続くベクターを含まないコロニーのスクリーニングのための自殺遺伝子の活性化によって、ｉＰＳＣコロニーにおけるベクターの排除を促進する
本実験のために、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ２８およびｐ５３ＤＤを、工程１の実験で使用されるＳＶ４０−ｅＧＦＰの代わりに、ＯｒｉＰ ＴＫベクターにクローン化することによって、リプログラミングベクターを作製する。さらに、上述のＴｅｔＯｎ−ＥＢＮＡ−１ ＴＫベクターをＥＢＮＡ−１制御および自殺遺伝子の活性化のために使用する（細胞リプログラミングおよびベクター排除の誘導に使用されるベクターの一覧および説明について、表５を参照）。細胞リプログラミングを誘導するために、ＰＢＭＣに、Ｏｃｔ４−ＴＫ（ＯｒｉＰ）、Ｓｏｘ２／ＫＬＦ４ ＴＫ（ＯｒｉＰ）、ｃＭＹＣ／Ｌｉｎ２８ ＴＫ（ＯｒｉＰ）、ｍｐ５３ＤＤ ＴＫ（ＯｒｉＰ）およびＴｅｔＯｎ−ＥＢＮＡ−１ ＴＫベクターを同時にヌクレオフェクト(co-nucleofect)する。

ヌクレオフェクトした細胞をＰ０プレート上に播種し、リプログラミングプロトコルに記述されるように（リプログラミングプロトコルの付録Ａ参照）培養し、Ｄｏｘ存在下で培養し、ＥＢＮＡ−１の発現およびリプログラミングベクターの保持を可能とする。Ｐ０プレート上に現れるコロニーを別々のウェルに手動で移行し、Ｄｏｘを添加した培養培地を与える。また、各クローンのＰ１コロニーを１：１の比率で通し、Ｄｏｘを添加した培養培地を与える。各クローンのＰ２コロニーを１：２の比率で２つのウェルに通し、Ｄｏｘを添加した培養培地を与える。２つのウェルからの各クローンのＰ３コロニーを１：２の比率で通し、４つのレプリカウェルを作成する。各ｉＰＳＣクローンの２つのウェルをＤｏｘを添加した培養培地中で維持し、他の２つのウェルをＤｏｘを含まない培地中で培養する。Ｐ４において、ベクターを未だ保持するコロニーの細胞死を誘導するために、ＧＮＣを各ｉＰＳＣクローンの２つのウェルの培養培地に添加する（Ｄｏｘで処理された１つのウェルとＤｏｘで処理されていない１つのウェル）。細胞死は、Ｄｏｘを含んで培養した全てのコロニーにおいて観察されるはずである。Ｄｏｘで処理されていないウェルからの生存細胞をさらに増殖させる。Ｐ４のＧＮＣ処理でクローンが生存していなかった場合、残りのレプリカウェルをＰ５に通し、ベクターを含まないクローンが同定されるまで工程を繰り返す。増殖の工程の間、細胞ペレットを回収し、ｑＰＣＲベクター検出スクリーニングアッセイを用いて分析し、ベクターの排除を確かめる（ｉＰＳＣコロニーの増殖および分析の手順を示す図１参照）。リプログラミング処理および所定の体細胞がリプログラミングされる能力のための正の対照として、細胞をＯｋｉｔａリプログラミングセットでヌクレオフェクトする（Okita, K. et al. (2013). "An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells." Stem Cells 31(3): 458-66）。

工程２、実験目標２：ＥＢＮＡ−１発現の制御およびそれに続く自殺遺伝子の活性化による、Ｐ０プレートにおけるベクター排除の誘導の実現可能性の決定
細胞リプログラミングは、絶対的な発現レベルおよび時間的な発現レベルの両方に関して、体細胞中でリプログラミング因子の発現を制御する能力に依存する。現在の方法は両方の点において準最適であることが広く想定されている。

（培地からDoxを除去することによって）ＥＢＮＡ−１誘導を除去し、ベクター排除を誘導するタイミングは潜在的に、リプログラミング効率に負に影響し得る。ｉＰＳＣコロニーをＰ０プレートから採取可能とするために、個別のコロニーの代わりにプールとして、リプログラミング効率に影響しないＤｏｘを取り除く最適な時点を決定する必要がある。この実験のために、ＰＢＭＣに、Ｏｃｔ４ ＴＫ（ＯｒｉＰ）、Ｓｏｘ２／ＫＬＦ４ ＴＫ（ＯｒｉＰ）、ｃＭＹＣ／Ｌｉｎ２８ ＴＫ（ＯｒｉＰ）、ｍｐ５３ＤＤ ＴＫ（ＯｒｉＰ）およびＴｅｔＯｎ−ＥＢＮＡ１ ＴＫベクターを同時にヌクレオフェクトし、Ｄｏｘ存在下でリプログラミングプロトコルに記述されるように（リプログラミングプロトコルの付録Ａ参照）培養し、ＥＢＮＡ−１の発現およびリプログラミングベクターの保持を可能とする。

表６に示すヌクレオフェクション後の様々な時点において、Ｄｏｘを培養培地から取り除く。様々な実験条件下でのｉＰＳＣコロニーの出現を位相差顕微鏡を用いてモニターする。コロニーが継代培養するのに十分大きい場合、ＧＮＣを培養培地に添加し、ＴＫを活性化し、ベクターを含まないコロニーの生存を選択する。生存しているコロニーをさらに採取し、増殖させる。増殖の工程の間、細胞ペレットを回収し、ｑＰＣＲベクター検出スクリーニングアッセイを用いて分析し、ベクターの排除を確かめる。リプログラミング処理および所定の体細胞がリプログラミングされる能力のための正の対照として、細胞をＯｋｉｔａリプログラミングセットでヌクレオフェクトする（Okita, Yamakawa et al. 2013)。

補足のデータ：自殺遺伝子を発現しないｈＰＳＣに対する自殺遺伝子基質の細胞毒性
我々は細胞リプログラミング中または後の体細胞において自殺遺伝子を活性化することを提案しているため、それぞれの自殺遺伝子を発現しないｈｉＰＳＣに対するガンシクロビルおよび５−ＦＣの細胞毒性をテストした。ｈｉＰＳＣを終濃度０．２、２または２０μＭのガンシクロビル存在下で４８時間培養し、終濃度１、１０および１００μＭの５−ＦＣをｈｉＰＳＣに添加した。細胞を固定し、アルカリホスファターゼ活性について４８時間後に染色した。染色の結果は、ｈｉＰＳＣに対するガンシクロビルまたは５−ＦＣの細胞毒性がないことを示す。さらなる実験は、自殺遺伝子を発現するｈｉＰＳＣにおけるガンシクロビルおよび５−ＦＣの必要とされるレベルを決定し、必要とされる最低の濃度を決定する。

ドキシサイクリンのｈＰＳＣに対する正の効果
ＥＢＮＡ−１制御は、ドキシサイクリン誘導性プロモーターシステムを用いることによって潜在的に達成され得る。最近の論文は、ドキシサイクリンがｈＰＳＣの生存および自己複製に対して著しい効果を発揮することを報告している（Chang, M. Y. et al. "Doxycycline enhances survival and self-renewal of human pluripotent stem cells." Stem Cell Reports 3(2):353-64 (2014)）。ドキシサイクリンの効果は、その抗菌作用とは関連せず、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ細胞内シグナルの直接の活性化によって仲介される。これらの発見は、ドキシサイクリンを幹細胞の増殖および維持を促進する、幹細胞培養の有用な添加物として示し、したがってＥＢＮＡ−１発現を制御するためにドキシサイクリンを使用することの負の効果はないことが想定される。

Claims (64)

1. リプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、以下を含む方法：
   （ａ）リプログラミングベクターをヒト体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでリプログラミングベクターはウイルスの複製起点、ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセットおよび自殺遺伝子を含む；
   （ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子、合成転写因子またはその両方の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること；
   （ｃ）第２の細胞集団を自殺遺伝子基質と接触させ、リプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。
2. 自殺遺伝子がチミジンキナーゼおよびシトシンデアミナーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 複製起点がＯｒｉＰである、請求項１または２に記載の方法。
4. 発現カセットが、ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 体細胞が、ヒト末梢血単核細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、胃細胞およびβ細胞からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. ｉＰＳＣリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. ｉＰＳＣリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、またはＳｏｘ−２およびＯｃｔ−４の両方から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. リプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、ならびにＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. （ｄ）エピソーマルリプログラミングベクターの存在に対して、（ｃ）の細胞集団をスクリーニングすることをさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. （ｅ）エピソーマルリプログラミングベクターを含まない、（ｄ）のスクリーニングされた細胞を培養することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
11. スクリーニングがｑＰＣＲベクター検出アッセイを含む、請求項９または１０に記載の方法。
12. 工程（ｂ）後、工程（ｃ）の前に、第２の細胞集団の細胞を継代培養することをさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
13. 継代培養後に、さらなる植え継ぎをせずに工程（ｃ）を行う、請求項１２に記載の方法。
14. エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、以下を含む方法：
    （ａ）エピソーマルリプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでエピソーマルリプログラミングベクターは、
    （ｉ）ＯｒｉＰ複製起点、
    （ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット、
    （ｉｉｉ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、または６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド、および
    （ｉｖ）チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子を含む；
    （ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子、合成転写因子またはその両方の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること；
    （ｃ）第２の細胞集団を自殺遺伝子基質と接触させ、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。
15. 体細胞が、ヒト末梢血単核細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、胃細胞およびβ細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. ｉＰＳＣリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上からなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の方法。
17. ｉＰＳＣリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、またはＳｏｘ−２およびＯｃｔ−４の両方を含む、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
18. ｉＰＳＣリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、ならびにＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上を含む、請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
19. リプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、以下を含む方法：
    （ａ）リプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでリプログラミングベクターは、（ｉ）ウイルスの複製起点、（ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット、（ｉｉｉ）リプログラミングベクターの染色体外での複製および分配を制御する遺伝子、および（ｉｖ）制御されたプロモーターシステムを含む；
    （ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子、合成転写因子またはその両方の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること、ここで第１の細胞集団の培養中に、エピソーマルリプログラミングベクターは複製される；
    （ｃ）第２の細胞集団を培養すること、ここでリプログラミングベクターの染色体外での複製および分配を制御する遺伝子は、リプログラミングベクターが細胞***中に消失するように制御され、リプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製する。
20. エピソーマルリプログラミングベクターの転写を制御する遺伝子が、テトラサイクリン活性化システムまたはテトラサイクリン誘導体活性化システムを含む、請求項１９に記載の方法。
21. 工程（ｂ）の培養中にドキシサイクリンが存在し、工程（ｃ）においてドキシサイクリンが存在しない、請求項２０に記載の方法。
22. 工程（ｂ）の培養中にドキシサイクリンが存在せず、工程（ｃ）においてドキシサイクリンが存在する、請求項２０に記載の方法。
23. 複製起点がＯｒｉＰである、請求項１９〜２２のいずれかに記載の方法。
24. 発現カセットが、ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１９〜２３のいずれかに記載の方法。
25. 体細胞が、ヒト末梢血単核細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、胃細胞およびβ細胞からなる群から選択される、請求項１９〜２４のいずれかに記載の方法。
26. ｉＰＳリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上からなる群から選択される、請求項１９〜２５のいずれかに記載の方法。
27. ｉＰＳリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、またはＳｏｘ−２およびＯｃｔ−４を含む、請求項１９〜２６のいずれかに記載の方法。
28. リプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、ならびにＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上を含む、請求項１９〜２７のいずれかに記載の方法。
29. （ｄ）エピソーマルリプログラミングベクターの存在に対して、（ｃ）の細胞集団をスクリーニングすることをさらに含む、請求項１９〜２８のいずれかに記載の方法。
30. （ｅ）エピソーマルリプログラミングベクターを含まない、（ｄ）のスクリーニングされた細胞を培養することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
31. スクリーニングがｑＰＣＲベクター検出アッセイを含む、請求項２９または３０に記載の方法。
32. 第１の細胞集団を植え継ぎすることをさらに含む、請求項１９〜３１のいずれかに記載の方法。
33. 第１の細胞集団を植え継ぎせずに工程（ｃ）を行う、請求項１９〜３１のいずれかに記載の方法。
34. エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、以下を含む方法：
    （ａ）エピソーマルリプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでエピソーマルリプログラミングベクターは、
    （ｉ）ＯｒｉＰ複製起点、
    （ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット、
    （ｉｉｉ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド、および
    （ｉｖ）テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体に制御されたプロモーターシステム（ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆ）を含む；
    （ｂ）第１の細胞集団を培養し、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること、ここで培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製される；
    （ｃ）第２の細胞集団を培養し、第３の細胞集団を作製すること、ここで培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製されない；
    （ｄ）コロニーを第３の細胞集団から選択し、第４の細胞集団を作製すること；および
    （ｅ）第４の細胞集団を培養し、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。
35. 体細胞が、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、胃細胞およびβ細胞からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
36. ｉＰＳリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上からなる群から選択される、請求項３４または３５に記載の方法。
37. ｉＰＳリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、またはＳｏｘ−２およびＯｃｔ−４を含む、請求項３４〜３６のいずれかに記載の方法。
38. リプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、ならびにＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上を含む、請求項３４〜３７のいずれかに記載の方法。
39. リプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、以下を含む方法：
    （ａ）リプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでリプログラミングベクターは、（ｉ）ウイルスの複製起点、（ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット、（ｉｉｉ）リプログラミングベクターの染色体外での複製および分配を制御する遺伝子、（ｉｖ）制御されたプロモーターシステム、および（ｖ）自殺遺伝子を含む；
    （ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子、合成転写因子またはその両方の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること、ここで培養中にリプログラミングベクターは複製される；
    （ｃ）第２の細胞集団を培養すること、ここで染色体外での複製および分配を制御する遺伝子は、リプログラミングベクターが細胞***中に消失するように制御され、リプログラミングベクターを実質的に含まないｉＰＳＣを含む第３の細胞集団を作製する；
    （ｄ）第３の細胞集団を自殺遺伝子基質と接触させ、リプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。
40. 自殺遺伝子がチミジンキナーゼおよびシトシンデアミナーゼからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
41. 複製起点がＯｒｉＰである、請求項３９または４０に記載の方法。
42. 発現カセットが、ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３９〜４１のいずれかに記載の方法。
43. 体細胞が、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、胃細胞およびβ細胞からなる群から選択される、請求項３９〜４２のいずれかに記載の方法。
44. ｉＰＳＣリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上からなる群から選択される、請求項３９〜４３のいずれかに記載の方法。
45. ｉＰＳＣリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、またはＳｏｘ−２およびＯｃｔ−４を含む、請求項３９〜４４のいずれかに記載の方法。
46. リプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、ならびにＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上を含む、請求項３９〜４５のいずれかに記載の方法。
47. ｉＰＳＣリプログラミング因子をコードする発現カセットの転写を制御する遺伝子が、テトラサイクリン活性化システムまたはテトラサイクリン誘導体活性化システムを含む、請求項３９〜４６のいずれかに記載の方法。
48. 工程（ｂ）の前記培養中にドキシサイクリンが存在し、工程（ｃ）においてドキシサイクリンが存在しない、請求項３９〜４７のいずれかに記載の方法。
49. 工程（ｂ）の前記培養中にドキシサイクリンが存在せず、工程（ｃ）においてドキシサイクリンが存在する、請求項３９〜４７のいずれかに記載の方法。
50. （ｅ）エピソーマルリプログラミングベクターの存在に対して、（ｄ）の第３の細胞集団をスクリーニングすることをさらに含む、請求項３９〜４９のいずれかに記載の方法。
51. エピソーマルリプログラミングベクターを含む、（ｄ）の第３の細胞集団における細胞を培養しない、請求項３９〜５０のいずれかに記載の方法。
52. スクリーニングがｑＰＣＲベクター検出アッセイを含む、請求項９または１０に記載の方法。
    （請求項５０）
    第１の細胞集団を植え継ぎすることをさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
    （請求項５１）
    第１の細胞集団を植え継ぎせずに工程（ｃ）を行う、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
    （請求項５２）
    エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製する方法であって、以下を含む方法：
    （ａ）エピソーマルリプログラミングベクターを体細胞に導入し、第１の細胞集団を作製すること、ここでエピソーマルリプログラミングベクターは、
    （ｉ）ＯｒｉＰ複製起点、
    （ｉｉ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット、
    （ｉｉｉ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド、
    （ｉｖ）テトラサイクリンまたは誘導体に制御されたプロモーターシステム（ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆ）、および
    （ｖ）チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子を含む；
    （ｂ）第１の細胞集団を培養し、リプログラミング因子の発現をもたらし、胚性幹細胞と一致した形質を有する第２の細胞集団を作製すること、ここで培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製される；
    （ｃ）第２の細胞集団を培養し、エピソーマルリプログラミングベクターを実質的に含まないｉＰＳＣを含む第３の細胞集団を作製すること、ここで第２の細胞集団の培養中にエピソーマルリプログラミングベクターは複製されない；
    （ｄ）第３の細胞集団を自殺遺伝子基質と接触させ、エピソーマルリプログラミングベクターを本質的に含まないｉＰＳＣを作製すること。
53. ｉＰＳリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上からなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
54. ｉＰＳリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、またはＳｏｘ−２およびＯｃｔ−４を含む、請求項５２または５３に記載の方法。
55. リプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、ならびにＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上を含む、請求項５２〜５４のいずれかに記載の方法。
56. （ａ）ＯｒｉＰ複製起点；
    （ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット、および
    （ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；および
    （ｄ）自殺遺伝子を含む、エピソーマルリプログラミングベクター。
57. （ａ）ＯｒｉＰ複製起点；
    （ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット、
    （ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；および
    （ｄ）チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子を含む、エピソーマルリプログラミングベクター。
58. （ａ）ＯｒｉＰ複製起点；
    （ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット、
    （ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；および
    （ｄ）制御されたプロモーターシステムを含む、エピソーマルリプログラミングベクター。
59. （ａ）ＯｒｉＰ複製起点；
    （ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット、
    （ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；および
    （ｄ）ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆシステムを含む、エピソーマルリプログラミングベクター。
60. （ａ）ＯｒｉＰ複製起点；
    （ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット；
    （ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド分子；および
    （ｄ）ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆシステム；および
    （ｅ）自殺遺伝子を含む、エピソーマルリプログラミングベクター。
61. （ａ）ＯｒｉＰ複製起点、
    （ｂ）ｉＰＳＣリプログラミング因子、合成転写因子またはその両方をコードする発現カセット；
    （ｃ）ＥＢＶのＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ−１の６５〜８９残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、ＥＢＮＡ−１の９０〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体、またはＥＢＮＡ−１の６５〜３２８残基が欠失しているＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするポリヌクレオチド；
    （ｄ）ＴｅｔＯｎまたはＴｅｔＯｆｆシステム、および
    （ｅ）チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ自殺遺伝子を含む、エピソーマルリプログラミングベクター。
62. ｉＰＳＣリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上からなる群から選択される、請求項５６〜６１のいずれかに記載のベクター。
63. ｉＰＳＣリプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、またはＳｏｘ−２およびＯｃｔ−４を含む、請求項５６〜６２のいずれかに記載のベクター。
64. リプログラミング因子が、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、ならびにＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、Ｌｉｎ−２８およびｐ５３ＤＤのうち１つ以上を含む、請求項５６〜６３のいずれかに記載のベクター。

Images