JP2021129561A - Hla−a2/wt1に結合する抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、および配列番号3のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号4の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号5のLCDR2、および配列番号6のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号9のHCDR1、配列番号10のHCDR2、および配列番号11のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号12のLCDR1、配列番号13のLCDR2、および配列番号14のLCDR3を含むVL;
(iii)配列番号17のHCDR1、配列番号18のHCDR2、および配列番号19のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号20のLCDR1、配列番号21のLCDR2、および配列番号22のLCDR3を含むVL;
(iiii)配列番号25のHCDR1、配列番号26のHCDR2、および配列番号27のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号28のLCDR1、配列番号29のLCDR2、および配列番号30のLCDR3を含むVL;
(v)配列番号33のHCDR1、配列番号34のHCDR2、および配列番号35のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号36のLCDR1、配列番号37のLCDR2、および配列番号38のLCDR3を含むVL;
(vi)配列番号41のHCDR1、配列番号42のHCDR2、および配列番号43のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号44のLCDR1、配列番号45のLCDR2、および配列番号46のLCDR3を含むVL;
(vii)配列番号49のHCDR1、配列番号50のHCDR2、および配列番号51のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号52のLCDR1、配列番号53のLCDR2、および配列番号54のLCDR3を含むVL;
(viii)配列番号57のHCDR1、配列番号58のHCDR2、および配列番号59のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号60のLCDR1、配列番号61のLCDR2、および配列番号62のLCDR3を含むVL;または
(ix)配列番号65のHCDR1、配列番号66のHCDR2、および配列番号67のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号68のLCDR1、配列番号69のLCDR2、および配列番号70のLCDR3を含むVL
を含む抗体を提供する。
(i)配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(ii)配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号39のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号48のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;または
(ix)配列番号71のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号72のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL
を含む。
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原はHLA−A2/WT1であり、第1の抗原結合性部分は、
(i)配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、および配列番号3のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号4の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号5のLCDR2、および配列番号6のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号9のHCDR1、配列番号10のHCDR2、および配列番号11のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号12のLCDR1、配列番号13のLCDR2、および配列番号14のLCDR3を含むVL;
(iii)配列番号17のHCDR1、配列番号18のHCDR2、および配列番号19のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号20のLCDR1、配列番号21のLCDR2、および配列番号22のLCDR3を含むVL;
(iv)配列番号25のHCDR1、配列番号26のHCDR2、および配列番号27のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号28のLCDR1、配列番号29のLCDR2、および配列番号30のLCDR3を含むVL;
(v)配列番号33のHCDR1、配列番号34のHCDR2、および配列番号35のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号36のLCDR1、配列番号37のLCDR2、および配列番号38のLCDR3を含むVL;
(vi)配列番号41のHCDR1、配列番号42のHCDR2、および配列番号43のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号44のLCDR1、配列番号45のLCDR2、および配列番号46のLCDR3を含むVL;
(vii)配列番号49のHCDR1、配列番号50のHCDR2、および配列番号51のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号52のLCDR1、配列番号53のLCDR2、および配列番号54のLCDR3を含むVL;
(viii)配列番号57のHCDR1、配列番号58のHCDR2、および配列番号59のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号60のLCDR1、配列番号61のLCDR2、および配列番号62のLCDR3を含むVL;または
(ix)配列番号65のHCDR1、配列番号66のHCDR2、および配列番号67のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号68のLCDR1、配列番号69のLCDR2、および配列番号70のLCDR3を含むVLを含む第1の抗原結合性部分;ならびに
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合性部分
を含む二重特異性抗原結合性分子を提供する。
(i)配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(ii)配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号39のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号48のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;または
(ix)配列番号71のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号72のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL
を含む。
用語は、本明細書では、下記で別様に定義されていない限り当該技術分野で一般に用いられている通りに使用される。
(a)アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、および96〜101(H3)に生じる超可変ループ(ChothiaおよびLesk、J.Mol.Biol.、196巻:901〜917頁(1987年));
(b)アミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)、89〜97(L3)、31〜35b(H1)、50〜65(H2)、および95〜102(H3)に生じるCDR(Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、ベセスダ、メリーランド州(1991年));
(c)アミノ酸残基27c〜36(L1)、46〜55(L2)、89〜96(L3)、30〜35b(H1)、47〜58(H2)、および93〜101(H3)に生じる抗原接触(MacCallumら、J.Mol.Biol.、262巻:732〜745(1996年));ならびに
(d)HVRアミノ酸残基46〜56(L2)、47〜56(L2)、48〜56(L2)、49〜56(L2)、26〜35(H1)、26〜35b(H1)、49〜65(H2)、93〜102(H3)、および94〜102(H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
本発明は、HLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1RMFまたはHLA−A2/WT1VLD、最も特にHLA−A2/WT1RMFに結合し、治療目的に必要とされる良好な親和性および特異性を有する抗体および二重特異性抗原結合性分子を提供する。加えて、上記分子は、治療応用のための他の有利な特性、例えば有効性および/または安全性ならびに生産可能性も有する。
本発明者らは、特に良好な親和性および特異性を有する、HLA−A2/WT1に結合する新規抗体を開発した。例えば、実施例に示されるように、本発明者らは、HLA−A2と他の構造的に類似するペプチドとの複合体よりも、HLA−A2/WT1(具体的には、HLA−A2/WT1RMF)に対して顕著に選択的である抗体を開発した。
PBSTをランニングバッファー(10mM PBS、pH7.4および0.005%(v/v)Tween20))として使用して、25℃で実験を実施する。BioRad Inc.(ハーキュリーズ、カリフォルニア州)のGLCおよびGLMセンサチップを備えたProteOn XPR36バイオセンサーおよびカップリング試薬(10mM酢酸ナトリウム pH4.5、スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミド[スルホ−NHS]、1−エチル−3−(3−ジメチルアミンプロピル)−カルボジイミド塩酸塩[EDC]、およびエタノールアミン)を使用する。固定化をGLMチップ上にて30μl/分で実施する。pAb(ヤギ)抗ヒトIgG、F(ab)2特異的抗体(Jackson ImmunoResearch)を、標準的アミンカップリング手順を使用して垂直方向にカップリングする:6つのリガンドチャネルをすべて、EDC(200mM)およびスルホ−NHS(50mM)の混合物で5分間活性化する。表面を活性化した直後に、pAb(ヤギ)抗ヒトIgG、F(ab)2特異的抗体(50μg/ml、10mM酢酸ナトリウム、pH5)を、6つすべてのチャネルにわたって5分間注入する。最後に、1Mエタノールアミン−HCl(pH8.5)を5分間注入することによりチャネルをブロックする。別々の水平チャネルの5つに沿って同時に5分間注入する(30μl/分)ことにより大腸菌上清からFab変異体を捕捉する。順化培地を6番目のチャネルに沿って注入して、二重参照目的の「インライン」ブランクを提供する。ワンショット動力学測定(one−shot kinetic measurement)を、HLA−WT1(例えば、HLA−A2/WT1RMFまたはHLA−A2/WT1VLD)の希釈系列物(100、50、25、12.5、6.25、0nM、50μl/分)を垂直チャネルに沿って2分間注入することにより実施する。解離を3分間モニターする。動力学データは、ProteOnマネージャー v.2.1で分析する。反応スポットデータの処理は、インラインバッファーブランクを使用したスポット間参照工程および二重参照工程を適用すること含む(Myszka、J mol Recognit(1999年)12巻、279〜284頁)。反復ワンショット注入の処理データを、物質移行のない単純な1:1ラングミュア結合モデルにフィッティングする(O’Shannessyら、Anal Biochem(1993年)212巻、457〜468頁)。
T2細胞を、10%FBS(Gibco、カタログ番号16140−071)+1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco、カタログ番号15070−063)で補完されたIMDM培地(Gibco by Life Technologies、カタログ番号31980−048)(完全培地)中106細胞/mlの細胞懸濁物として調製する。総容積が10mlの細胞をチューブで維持し、10μlの10−2M(ペプチドの最終濃度:10−5M)ペプチド(例えば、WT1 VLDペプチド(配列番号77)またはRMFペプチド(配列番号78))と共に、5%CO2で2時間37℃にてインキュベートする。洗浄した後、細胞を冷却PBSに懸濁し、滴定された濃度のIgG形式の抗体(例えば、10μg/ml〜0.00064μg/ml)と共に4℃で1時間インキュベートし、続いて二次抗ヒトIgG−Fcフィコエリトリン(PE)−コンジュゲート抗体(Jackson Laboratories、カタログ番号109−116−098)と共に30分間インキュベートする。FACS LSR II(BD)で細胞を取得する。データは、Graphpad PrismにおいてPEの平均蛍光強度(MFI)として示される。
T2細胞(ATCC、カタログ番号CRL−1992)を、10%FBS(Gibco、カタログ番号16140−071)+1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco、カタログ番号15070−063)で補完されたIMDM培地(Gibco by Life Technologies、カタログ番号31980−048)(完全培地)中106細胞/mlの細胞懸濁物として調製する。総容積が10mlの細胞をチューブで維持し、10μlの10−2M(ペプチドの最終濃度:10−5M)ペプチド(例えば、WT1 VLDペプチド(配列番号77)またはRMFペプチド(配列番号78))と共に、5%CO2で2時間37℃にてインキュベートする。洗浄した後、細胞を冷却PBSに懸濁し、滴定された濃度のIgG形式の抗体(例えば、10μg/ml〜0.00064μg/ml)と共に4℃で1時間インキュベートし、続いて二次抗ヒトIgG−Fcフィコエリトリン(PE)−コンジュゲート抗体(Jackson Laboratories、カタログ番号109−116−098)と共に30分間インキュベートする。FACS LSR II(BD)で細胞を取得する。データは、Graphpad PrismにおいてPEの平均蛍光発光強度(MFI)として示される。EC50値は、XLfit(登録商標)アドオン(ID Business Solutions、ギルフォード、英国)を使用してMicrosoft(登録商標)Excelで算出される。
(i)配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、および配列番号3のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号4の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号5のLCDR2、および配列番号6のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号9のHCDR1、配列番号10のHCDR2、および配列番号11のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号12のLCDR1、配列番号13のLCDR2、および配列番号14のLCDR3を含むVL;
(iii)配列番号17のHCDR1、配列番号18のHCDR2、および配列番号19のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号20のLCDR1、配列番号21のLCDR2、および配列番号22のLCDR3を含むVL;
(iv)配列番号25のHCDR1、配列番号26のHCDR2、および配列番号27のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号28のLCDR1、配列番号29のLCDR2、および配列番号30のLCDR3を含むVL;
(v)配列番号33のHCDR1、配列番号34のHCDR2、および配列番号35のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号36のLCDR1、配列番号37のLCDR2、および配列番号38のLCDR3を含むVL;
(vi)配列番号41のHCDR1、配列番号42のHCDR2、および配列番号43のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号44のLCDR1、配列番号45のLCDR2、および配列番号46のLCDR3を含むVL;
(vii)配列番号49のHCDR1、配列番号50のHCDR2、および配列番号51のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号52のLCDR1、配列番号53のLCDR2、および配列番号54のLCDR3を含むVL;
(viii)配列番号57のHCDR1、配列番号58のHCDR2、および配列番号59のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号60のLCDR1、配列番号61のLCDR2、および配列番号62のLCDR3を含むVL;または
(ix)配列番号65のHCDR1、配列番号66のHCDR2、および配列番号67のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号68のLCDR1、配列番号69のLCDR2、および配列番号70のLCDR3を含むVL
を含む抗体を提供する。
(i)配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(ii)配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号39のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号48のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;または
(ix)配列番号71のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号72のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL
を含む。
(i)配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(ii)配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(iii)配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(iv)配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(v)配列番号39のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(vi)配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号48のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(vii)配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(viii)配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;または
(ix)配列番号71のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号72のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列
を含む。
(i)配列番号7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号8のアミノ酸配列を含むVL;
(ii)配列番号15のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号16のアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号24のアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号31のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号32のアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号39のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号40のアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号47のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号48のアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号55のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号56のアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号63のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号64のアミノ酸配列を含むVL;または
(ix)配列番号71のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号72のアミノ酸配列を含むVL
を含む。
(i)配列番号7のVH配列および配列番号8のVL配列;
(ii)配列番号15のVH配列および配列番号16のVL配列;
(iii)配列番号23のVH配列および配列番号24のVL配列;
(iv)配列番号31のVH配列および配列番号32のVL配列;
(v)配列番号39のVH配列および配列番号40のVL配列;
(vi)配列番号47のVH配列および配列番号48のVL配列;
(vii)配列番号55のVH配列および配列番号56のVL配列;
(viii)配列番号63のVH配列および配列番号64のVL配列;または
(ix)配列番号71のVH配列および配列番号72のVL配列
を含む。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変更されている。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つまたは複数のグリコシル化部位が創出または除去されるようにアミノ酸配列を変更することにより簡便に達成することができる。
ある特定の実施態様では、システイン操作抗体、例えば、抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオMab」を創出することが望ましい場合がある。特定の実施態様では、置換された残基は、抗体の接近可能な部位に生じる。そうした残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基がそれにより抗体の接近可能な部位に配置され、薬物部分またはリンカー−薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートして、本明細書でさらに記載されていようなイムノコンジュゲートを創出するために使用することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号明細書、第8、30,930号明細書、第7,855,275号明細書、第9,000,130号明細書、または国際公開第2016040856号パンフレットに記載されているように生成することができる。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野で公知であり容易に利用可能である追加の非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾されていてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分としては、これに限定されないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる:ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダム共重合体のいずれか)、およびデキストランまたはポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレン(propropylene)グリコールホモポリマー、プロリプロピレン(prolypropylene)オキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定であるため、製造に有利であり得る。ポリマーは、分子量が任意であってもよく、分岐していてもよく、または非分岐であってもよい。抗体に付着されるポリマーの数は様々であってもよく、1つよりも多くのポリマーが付着されている場合、それらは同じ分子であってもよくまたは異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および/またはタイプは、これらに限定されないが、向上させようとする抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が画定された条件下での治療に使用されることになるか否かなどを含む考察に基づいて決定することができる。
また、本発明は、細胞傷害性剤、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌由来、真菌由来、植物由来、もしくは動物由来の酵素的活性毒素、またはそれらの断片)または放射性同位体などの1つまたは複数の治療剤にコンジュゲートされた(化学的結合された)本明細書に記載されているような抗HLA−A2/WT1抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対して、つまり異なる抗原の異なるエピトープまたは同じ抗原の異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施態様では、多重特異性抗体は、3つまたはそれよりも多くの結合特異性を有する。ある特定の実施態様では、結合特異性の1つはHLA−A2/WT1に対するものであり、他の(2つまたはそれよりも多い)特異性は任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施態様では、二重特異性抗体は、HLA−A2/WT1の2つの(またはそれよりも多くの)異なるエピトープに結合することができる。また、多重特異性(例えば、二重特異性)抗体を使用すると、細胞傷害性剤または細胞傷害性細胞を、またはHLA−A2/WT1を発現する細胞に局在化することができる。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
また、本発明は、二重特異性抗原結合性分子、つまり2つの異なる抗原決定基(第1および第2の抗原)に対して特異的に結合することが可能な少なくとも2の抗原結合性部分を含む抗原結合性分子を提供する。
T2細胞(ATCC、Cat.No.CRL−1992)を、10%FBS(Gibco、カタログ番号16140−071)+1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco、カタログ番号15070−063)で補完されたIMDM培地(Gibco by Life Technologies、カタログ番号31980−048)(完全培地)中106細胞/mlの細胞懸濁物として調製する。総容積が10mlの細胞をチューブで維持し、10μlの10−2M(ペプチドの最終濃度:10−5M)ペプチド(例えば、WT1 VLDペプチド(配列番号77)またはRMFペプチド(配列番号78))と共に、5%CO2で2時間37℃にてインキュベートする。フィコール(GE Healthcare、Cat.No.17−1440−03)勾配遠心分離によりバフィーコートから単離したPBMCから汎CD3+細胞を精製する。ヒト汎T細胞抗原細胞単離キット(Miltenyi Biotec、Cat.No.130−096−535)を使用して、MACS(Miltenyi Biotec)により、全CD3+ T細胞を精製する。細胞傷害性アッセイを以下の通りに実施する:ペプチドでパルスした細胞(100μl)を96ウェルマイクロタイター丸底プレートに播種し(3×105細胞/ml)、完全培地中で、50μlのT細胞(6×106細胞/ml)および50μlの滴定された二重特異性抗原結合性分子(moelcule)(例えば、40μg/ml〜0.00004μg/ml)と共に、5%CO2で18時間37℃にて共培養する。その後、50μlの上清を新しい白色プレートに移し、1ウェル当たり25μlのCytoTox−Gloルシフェラーゼアッセイ(Promega、Cat.No.G9291)を添加して、15分間室温(RT)にてインキュベートする。発光シグナル(細胞死を示すものとしてのLDH放出を測定するため)を、EnVision(パーキンエルマー)で読み取る。データは相対発光ユニット(RLU)として示されている。
T2細胞(ATCC、Cat.No.CRL−1992)を、10%FBS(Gibco、カタログ番号16140−071)+1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco、カタログ番号15070−063)で補完されたIMDM培地(Gibco by Life Technologies、カタログ番号31980−048)(完全培地)中106細胞/mlの細胞懸濁物として調製する。総容積が10mlの細胞をチューブで維持し、10μlの10−2M(ペプチドの最終濃度:10−5M)ペプチド(例えば、WT1 VLDペプチド(配列番号77)またはRMFペプチド(配列番号78))と共に、5%CO2で2時間37℃にてインキュベートする。フィコール(GE Healthcare、Cat.No.17−1440−03)勾配遠心分離によりバフィーコートから単離したPBMCから汎CD3+細胞を精製する。ヒト汎T細胞抗原細胞単離キット(Miltenyi Biotec、Cat.No.130−096−535)を使用して、MACS(Miltenyi Biotec)により、全CD3+ T細胞を精製する。細胞傷害性アッセイを以下の通りに実施する:ペプチドでパルスした細胞(100μl)を96ウェルマイクロタイター丸底プレートに播種し(3×105細胞/ml)、完全培地中で、50μlのT細胞(6×106細胞/ml)および50μlの滴定された二重特異性抗原結合性分子(moelcule)(例えば、40μg/ml〜0.00004μg/mlの)と共に、5%CO2で18時間37℃にて共培養する。18時間の共インキュベーション後に細胞を回収し、CD3(Biolegend Cat.No.300321)、CD25(Biolegend Cat.No.302606)、およびCD69(Biolegend Cat.No.310914)に対する抗体で染色して、フローサイトメトリーによりT細胞活性化を測定する。
T2細胞(ATCC、Cat.No.CRL−1992)を、10%FBS(Gibco、カタログ番号16140−071)+1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco、カタログ番号15070−063)で補完されたIMDM培地(Gibco by Life Technologies、カタログ番号31980−048)(完全培地)中106細胞/mlの細胞懸濁物として調製する。総容積が10mlの細胞をチューブで維持し、10μlの10−2M(ペプチドの最終濃度:10−5M)ペプチド(例えば、WT1 VLDペプチド(配列番号77)またはRMFペプチド(配列番号78))と共に、5%CO2で2時間37℃にてインキュベートする。洗浄した後、2.2×105細胞/mlの細胞懸濁物中のペプチドでパルスされた細胞の90μlを、96ウェルマイクロタイター丸底プレート(20,000細胞/ウェル、TPP、Cat.No.92097)に播種し、NFATのプロモーター下でルシフェラーゼを発現する50μlのジャーカット細胞(ジャーカット−NFAT;Promega、Cat.No.CS176501)(2×106細胞/mlの細胞懸濁物)および10μlの滴定された二重特異性抗原結合性分子(例えば、PBS中100μg/ml〜0.0064μg/ml)と共に、5%CO2で16時間37℃にて共培養する。その後、50μlの上清を除去し、1ウェル当たり100μlのBright−Gloルシフェラーゼアッセイ(Promega、Cat.No.E2620)と取り替え、室温(RT)でインキュベートする。5分後、180μlの上清を新しい白色プレートに移して、発光シグナルをEnVision(パーキンエルマー)で測定する。データは相対発光ユニット(RLU)として示されている。
本発明の二重特異性抗原結合性分子は、HLA−A2/WT1(第1の抗原)に結合する少なくとも1つの抗原結合性部分、特にFab分子を含む。ある特定の実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、HLA−A2/WT1に結合する2つの抗原結合性部分、特にFab分子を含む。特定のそのような実施態様では、こうした抗原結合性部分の各々は、同じ抗原決定基に結合する。さらにより特定の実施態様では、こうした抗原結合性部分はすべて同一であり、つまり、本明細書に記載されているように、CH1ドメインおよびCLドメインに同じアミノ酸置換(もしあれば)を含む同じアミノ酸配列を含む。一実施態様では、二重特異性抗原結合性分子は、HLA−A2/WT1に結合する2つ以下の抗原結合性部分、特にFab分子を含む。
(i)配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、および配列番号3のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号4の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号5のLCDR2、および配列番号6のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号9のHCDR1、配列番号10のHCDR2、および配列番号11のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号12のLCDR1、配列番号13のLCDR2、および配列番号14のLCDR3を含むVL;
(iii)配列番号17のHCDR1、配列番号18のHCDR2、および配列番号19のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号20のLCDR1、配列番号21のLCDR2、および配列番号22のLCDR3を含むVL;
(iv)配列番号25のHCDR1、配列番号26のHCDR2、および配列番号27のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号28のLCDR1、配列番号29のLCDR2、および配列番号30のLCDR3を含むVL;
(v)配列番号33のHCDR1、配列番号34のHCDR2、および配列番号35のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号36のLCDR1、配列番号37のLCDR2、および配列番号38のLCDR3を含むVL;
(vi)配列番号41のHCDR1、配列番号42のHCDR2、および配列番号43のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号44のLCDR1、配列番号45のLCDR2、および配列番号46のLCDR3を含むVL;
(vii)配列番号49のHCDR1、配列番号50のHCDR2、および配列番号51のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号52のLCDR1、配列番号53のLCDR2、および配列番号54のLCDR3を含むVL;
(viii)配列番号57のHCDR1、配列番号58のHCDR2、および配列番号59のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号60のLCDR1、配列番号61のLCDR2、および配列番号62のLCDR3を含むVL;または
(ix)配列番号65のHCDR1、配列番号66のHCDR2、および配列番号67のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号68のLCDR1、配列番号69のLCDR2、および配列番号70のLCDR3を含むVL
を含む第1の抗原結合性部分;ならびに
(b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分
を含む二重特異性抗原結合性分子を提供する。
(i)配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(ii)配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号39のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号48のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;または
(ix)配列番号71のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号72のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL
を含む。
(i)配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(ii)配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(iii)配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(iv)配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(v)配列番号39のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(vi)配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号48のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(vii)配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(viii)配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;または
(ix)配列番号71のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号72のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列
を含む。
(i)配列番号7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号8のアミノ酸配列を含むVL;
(ii)配列番号15のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号16のアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号24のアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号31のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号32のアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号39のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号40のアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号47のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号48のアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号55のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号56のアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号63のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号64のアミノ酸配列を含むVL;または
(ix)配列番号71のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号72のアミノ酸配列を含むVL
を含む。
(i)配列番号7のVH配列および配列番号8のVL配列;
(ii)配列番号15のVH配列および配列番号16のVL配列;
(iii)配列番号23のVH配列および配列番号24のVL配列;
(iv)配列番号31のVH配列および配列番号32のVL配列;
(v)配列番号39のVH配列および配列番号40のVL配列;
(vi)配列番号47のVH配列および配列番号48のVL配列;
(vii)配列番号55のVH配列および配列番号56のVL配列;
(viii)配列番号63のVH配列および配列番号64のVL配列;または
(ix)配列番号71のVH配列および配列番号72配列のVL
を含む。
本発明の二重特異性抗原結合性分子は、第2の抗原(HLA−A2/WT1とは異なる)と結合する少なくとも1つの抗原結合性部分、特にFab分子を含む。
本発明の二重特異性抗原結合性分子は、それらの結合性アームの1つ(または複数、2つよりも多くの抗原結合性Fab分子を含む分子の場合)にVH/VL交換を有するFabに基づく二重特異性/多重特異性抗原結合性分子を産生する際に生じる場合がある、軽鎖と不一致重鎖とのミスペアリング(ベンスジョーンス型副産物)の低減に特に効果的であるアミノ酸置換を、それらに含まれているFab分子に含んでいてもよい(また、国際公開第2015/150447号パンフレット、特にその中の例を参照。この文献は、その全内容が本明細書に参照により援用される)。望ましくない副産物、特にそれらの結合性アームの1つにVH/VLドメイン交換を有する二重特異性抗原結合性分子に生じるベンスジョーンズ型副産物と比較した、所望の二重特異性抗原結合性分子の比率は、CH1ドメインおよびCLドメインの特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することにより向上させることができる(本明細書では「電荷修飾」と呼ばれることもある)。
i)第1の抗原結合性部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、正荷電アミノ酸により置換されており(カバットによる番号付け)、その場合、第1の抗原結合性部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸または213位のアミノ酸が、負荷電アミノ酸により置換されているか(カバットEUインデックスによる番号付け);または
ii)第2の抗原結合性部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、正荷電アミノ酸により置換されており(カバットによる番号付け)、その場合、第2の抗原結合性部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸または213位のアミノ酸が、負荷電アミノ酸により置換されている(カバットEUインデックスによる番号付け)。
i)第1の抗原結合性部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により置換されており(カバットによる番号付け)、第1の抗原結合性部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸または213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)により置換されているか(カバットEUインデックスによる番号付け);または
ii)第2の抗原結合性部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により置換されており(カバットによる番号付け)、第2の抗原結合性部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸または213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)により置換されている(カバットEUインデックスによる番号付け)。
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原は、HLA−A2/WT1、具体的にはHLA−A2/WT1RMFであり、第1の抗原結合性部分は、配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、および配列番号3のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号4の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号5のLCDR2、および配列番号6のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むFab分子である第1の抗原結合性部分;ならびに
(b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分であって、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いに置き換えられているFab分子である第2の抗原結合性部分を含み、
第1の抗原結合性部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により(特定の実施態様では、独立してリジン(K)またはアルギニン(R)により)置換されており(カバットによる番号付け)、123位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により(特定の実施態様では、独立してリジン(K)またはアルギニン(R)により)置換されており(カバットによる番号付け)、第1の抗原結合性部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)により置換されている(カバットEUインデックスによる番号付け)。
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原は、HLA−A2/WT1、具体的にはHLA−A2/WT1RMFであり、第1の抗原結合性部分は、配列番号9の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号10のHCDR2、および配列番号11のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号12の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号13のLCDR2、および配列番号14のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むFab分子である第1の抗原結合性部分;ならびに
(b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分であって、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いに置き換えられているFab分子である第2の抗原結合性部分を含み、
第1の抗原結合性部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により(特定の実施態様では、独立してリジン(K)またはアルギニン(R)により)置換されており(カバットによる番号付け)、123位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により(特定の実施態様では、独立してリジン(K)またはアルギニン(R)により)置換されており(カバットによる番号付け)、第1の抗原結合性部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)に置換されている(カバットEUインデックスによる番号付け)。
本発明による二重特異性抗原結合性分子の成分は、様々な構成で互いに融合させることができる。例示的な構成は図1に示されている。
(i)配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、および配列番号3のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号4の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号5のLCDR2、および配列番号6のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号9のHCDR1、配列番号10のHCDR2、および配列番号11のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号12のLCDR1、配列番号13のLCDR2、および配列番号14のLCDR3を含むVL;
(iii)配列番号17のHCDR1、配列番号18のHCDR2、および配列番号19のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号20のLCDR1、配列番号21のLCDR2、および配列番号22のLCDR3を含むVL;
(iv)配列番号25のHCDR1、配列番号26のHCDR2、および配列番号27のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号28のLCDR1、配列番号29のLCDR2、および配列番号30のLCDR3を含むVL;
(v)配列番号33のHCDR1、配列番号34のHCDR2、および配列番号35のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号36のLCDR1、配列番号37のLCDR2、および配列番号38のLCDR3を含むVL;
(vi)配列番号41のHCDR1、配列番号42のHCDR2、および配列番号43のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号44のLCDR1、配列番号45のLCDR2、および配列番号46のLCDR3を含むVL;
(vii)配列番号49のHCDR1、配列番号50のHCDR2、および配列番号51のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号52のLCDR1、配列番号53のLCDR2、および配列番号54のLCDR3を含むVL;
(viii)配列番号57のHCDR1、配列番号58のHCDR2、および配列番号59のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号60のLCDR1、配列番号61のLCDR2、および配列番号62のLCDR3を含むVL;または
(ix)配列番号65のHCDR1、配列番号66のHCDR2、および配列番号67のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号68のLCDR1、配列番号69のLCDR2、および配列番号70のLCDR3を含むVL
を含む。
(ii)配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号39のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号48のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;または
(ix)配列番号71のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号72のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL
を含む。
(i)配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(ii)配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(iii)配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(iv)配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(v)配列番号39のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(vi)配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号48のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(vii)配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;
(viii)配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列;または
(ix)配列番号71のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVH配列、および配列番号72のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるVL配列
を含む。
(i)配列番号7のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号8のアミノ酸配列を含むVL;
(ii)配列番号15のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号16のアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号23のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号24のアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号31のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号32のアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号39のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号40のアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号47のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号48のアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号55のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号56のアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号63のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号64のアミノ酸配列を含むVL;または
(ix)配列番号71のアミノ酸配列を含むVHおよび配列番号72のアミノ酸配列を含むVL
を含む。
(i)配列番号7のVH配列および配列番号8のVL配列;
(ii)配列番号15のVH配列および配列番号16のVL配列;
(iii)配列番号23のVH配列および配列番号24のVL配列;
(iv)配列番号31のVH配列および配列番号32のVL配列;
(v)配列番号39のVH配列および配列番号40のVL配列;
(vi)配列番号47のVH配列および配列番号48のVL配列;
(vii)配列番号55のVH配列および配列番号56のVL配列;
(viii)配列番号63のVH配列および配列番号64のVL配列;または
(ix)配列番号71のVH配列および配列番号72配列のVL
を含む。
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原は、HLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1RMFであり、第1の抗原結合性部分は、配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、および配列番号3のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号4の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号5のLCDR2、および配列番号6のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むFab分子である第1の抗原結合性部分;
(b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分であって、第2の抗原は、活性化T細胞抗原、特にCD3、より特にCD3エプシロンであり、第2の抗原結合性部分は、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1が互いに置き換えられているFab分子である第2の抗原結合性部分;
c)第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含み、
(i)a)の第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、b)の第2の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、b)の第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、c)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されているか、または
(ii)b)の第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、a)の第1の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、a)の第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、c)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原は、HLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1RMFであり、第1の抗原結合性部分は、配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、および配列番号3のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号4の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号5のLCDR2、および配列番号6のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むFab分子である第1の抗原結合性部分;
(b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分であって、第2の抗原は、活性化T細胞抗原、特にCD3、より特にCD3エプシロンであり、第2の抗原結合性部分は、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1が互いに置き換えられているFab分子である第2の抗原結合性部分;
c)第1の抗原に結合し、第1の抗原結合性部分と同一である第3の抗原結合性部分;ならびに
d)第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含み、
(i)a)の第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、b)の第2の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、b)の第2の抗原結合性部分およびc)の第3の抗原結合性部分は各々、Fab重鎖のC末端が、d)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されているか、または
(ii)b)の第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、a)の第1の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、a)の第1の抗原結合性部分およびc)の第3の抗原結合性部分は各々、Fab重鎖のC末端が、d)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原は、HLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1RMFであり、第1の抗原結合性部分は、配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、および配列番号3のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号4の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号5のLCDR2、および配列番号6のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むFab分子である第1の抗原結合性部分;
(b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分であって、第2の抗原は、活性化T細胞抗原、特にCD3、より特にCD3エプシロンであり、第2の抗原結合性部分は、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1が互いに置き換えられているFab分子である第2の抗原結合性部分;
c)第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含み、
(i)a)の第1の抗原結合性部分およびb)の第2の抗原結合性部分は各々、Fab重鎖のC末端が、c)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端の融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原は、HLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1RMFであり、第1の抗原結合性部分は、配列番号9の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号10のHCDR2、および配列番号11のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号12の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号13のLCDR2、および配列番号14のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むFab分子である第1の抗原結合性部分;
(b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分であって、第2の抗原は、活性化T細胞抗原、特にCD3、より特にCD3エプシロンであり、第2の抗原結合性部分は、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1が互いに置き換えられているFab分子である第2の抗原結合性部分;
c)第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含み、
(i)a)の第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、b)の第2の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、b)の第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、c)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されているか、または
(ii)b)の第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、a)の第1の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、a)の第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、c)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原は、HLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1RMFであり、第1の抗原結合性部分は、配列番号9の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号10のHCDR2、および配列番号11のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号12の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号13のLCDR2、および配列番号14のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むFab分子である第1の抗原結合性部分;
(b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分であって、第2の抗原は、活性化T細胞抗原、特にCD3、より特にCD3エプシロンであり、第2の抗原結合性部分は、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1が互いに置き換えられているFab分子である第2の抗原結合性部分;
c)第1の抗原に結合し、第1の抗原結合性部分と同一である第3の抗原結合性部分;ならびに
d)第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含み、
(i)a)の第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、b)の第2の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、b)の第2の抗原結合性部分およびc)の第3の抗原結合性部分は各々、Fab重鎖のC末端が、d)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されているか、または
(ii)b)の第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、a)の第1の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、a)の第1の抗原結合性部分およびc)の第3の抗原結合性部分は各々、Fab重鎖のC末端が、d)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原は、HLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1RMFであり、第1の抗原結合性部分は、配列番号9の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号10のHCDR2、および配列番号11のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号12の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号13のLCDR2、および配列番号14のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むFab分子である第1の抗原結合性部分;
(b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分であって、第2の抗原は、活性化T細胞抗原、特にCD3、より特にCD3エプシロンであり、第2の抗原結合性部分は、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1が互いに置き換えられているFab分子である第2の抗原結合性部分;
c)第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含み、
(i)a)の第1の抗原結合性部分およびb)の第2の抗原結合性部分は各々、Fab重鎖のC末端が、c)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端の融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原は、HLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1RMFであり、第1の抗原結合性部分は、配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、および配列番号3のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号4の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号5のLCDR2、および配列番号6のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むFab分子である第1の抗原結合性部分;
(b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分であって、第2の抗原は、活性化T細胞抗原、特にCD3、より特にCD3エプシロンであり、第2の抗原結合性部分は、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いに置き換えられているFab分子である第2の抗原結合性部分;
c)第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含み、
a)の第1の抗原結合性部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)により置換されており(カバットによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)またはアルギニン(R)により(最も特にはアルギニン(R)により)置換されており(カバットによる番号付け)、a)の第1の抗原結合性部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け);ならびに
(i)a)の第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、b)の第2の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、b)の第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、c)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されているか、または
(ii)b)の第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、a)の第1の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、a)の第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、c)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原は、HLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1RMFであり、第1の抗原結合性部分は、配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、および配列番号3のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号4の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号5のLCDR2、および配列番号6のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むFab分子である第1の抗原結合性部分;
(b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分であって、第2の抗原は、活性化T細胞抗原、特にCD3、より特にCD3エプシロンであり、第2の抗原結合性部分は、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いに置き換えられているFab分子である第2の抗原結合性部分;
c)第1の抗原に結合し、第1の抗原結合性部分と同一である第3の抗原結合性部分;ならびに
d)第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含み、
a)の第1の抗原結合性部分およびc)の第3の抗原結合性部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)により置換されており(カバットによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)またはアルギニン(R)により(最も特にはアルギニン(R)により)置換されており(カバットによる番号付け)、a)の第1の抗原結合性部分およびc)の第3の抗原結合性部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け);ならびに
(i)a)の第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、b)の第2の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、b)の第2の抗原結合性部分およびc)の第3の抗原結合性部分は各々、Fab重鎖のC末端が、d)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されているか、または
(ii)b)の第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、a)の第1の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、a)の第1の抗原結合性部分およびc)の第3の抗原結合性部分は各々、Fab重鎖のC末端が、d)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原は、HLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1RMFであり、第1の抗原結合性部分は、配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、および配列番号3のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号4の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号5のLCDR2、および配列番号6のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むFab分子である第1の抗原結合性部分;
(b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分であって、第2の抗原は、活性化T細胞抗原、特にCD3、より特にCD3エプシロンであり、第2の抗原結合性部分は、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いに置き換えられているFab分子である第2の抗原結合性部分;
c)第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含み、
a)の第1の抗原結合性部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)により置換されており(カバットによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)またはアルギニン(R)により(最も特にはアルギニン(R)により)置換されており(カバットによる番号付け)、a)の第1の抗原結合性部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け);ならびに
a)の第1の抗原結合性部分およびb)の第2の抗原結合性部分は各々、Fab重鎖のC末端が、c)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端の融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原は、HLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1RMFであり、第1の抗原結合性部分は、配列番号9の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号10のHCDR2、および配列番号11のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号12の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号13のLCDR2、および配列番号14のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むFab分子である第1の抗原結合性部分;
(b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分であって、第2の抗原は、活性化T細胞抗原、特にCD3、より特にCD3エプシロンであり、第2の抗原結合性部分は、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いに置き換えられているFab分子である第2の抗原結合性部分;
c)第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含み;
a)の第1の抗原結合性部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)により置換されており(カバットによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)またはアルギニン(R)により(最も特にはアルギニン(R)により)置換されており(カバットによる番号付け)、a)の第1の抗原結合性部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け);ならびに
(i)a)の第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、b)の第2の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、b)の第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、c)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されているか、または
(ii)b)の第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、a)の第1の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、a)の第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、c)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原は、HLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1RMFであり、第1の抗原結合性部分は、配列番号9の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号10のHCDR2、および配列番号11のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号12の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号13のLCDR2、および配列番号14のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むFab分子である第1の抗原結合性部分;
(b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分であって、第2の抗原は、活性化T細胞抗原、特にCD3、より特にCD3エプシロンであり、第2の抗原結合性部分は、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いに置き換えられているFab分子である第2の抗原結合性部分;
c)第1の抗原に結合し、第1の抗原結合性部分と同一である第3の抗原結合性部分;ならびに
d)第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含み;
a)の第1の抗原結合性部分およびc)の第3の抗原結合性部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)により置換されており(カバットによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)またはアルギニン(R)により(最も特にはアルギニン(R)により)置換されており(カバットによる番号付け)、a)の第1の抗原結合性部分およびc)の第3の抗原結合性部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け);ならびに
(i)a)の第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、b)の第2の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、b)の第2の抗原結合性部分およびc)の第3の抗原結合性部分は各々、Fab重鎖のC末端が、d)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されているか、または
(ii)b)の第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、a)の第1の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、a)の第1の抗原結合性部分およびc)の第3の抗原結合性部分は各々、Fab重鎖のC末端が、d)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原は、HLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1RMFであり、第1の抗原結合性部分は、配列番号9の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号10のHCDR2、および配列番号11のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号12の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号13のLCDR2、および配列番号14のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むFab分子である第1の抗原結合性部分;
(b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分であって、第2の抗原は、活性化T細胞抗原、特にCD3、より特にCD3エプシロンであり、第2の抗原結合性部分は、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いに置き換えられているFab分子である第2の抗原結合性部分;
c)第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含み;
a)の第1の抗原結合性部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)により置換されており(カバットによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)またはアルギニン(R)により(最も特にはアルギニン(R)により)置換されており(カバットによる番号付け)、a)の第1の抗原結合性部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け);ならびに
a)の第1の抗原結合性部分およびb)の第2の抗原結合性部分は各々、Fab重鎖のC末端が、c)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端の融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
a)第1の抗原に結合する第1および第3の抗原結合性部分であって、第1の抗原はHLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1RMFであり、第1および第2の抗原結合性部分は各々、配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む(従来型)Fab分子である第1および第3の抗原結合性部分;
b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分であって、第2の抗原はCD3であり、第2の抗原結合性部分は、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いに置き換えられており、(i)配列番号121のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号122のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または(ii)配列番号136のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号137のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(特に、配列番号136のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号137のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域)を含むFab分子である第2の抗原結合性部分;
c)第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含み;
a)の第1および第3の抗原結合性部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)により置換されており(カバットによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)またはアルギニン(R)により(最も特にはアルギニン(R)により)置換されており(カバットによる番号付け)、a)の第1および第3の抗原結合性部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け);ならびに
さらに
a)の第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、b)の第2の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、b)の第2の抗原結合性部分およびa)の第3の抗原結合性部分は各々、Fab重鎖のC末端が、c)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
a)第1の抗原に結合する第1および第3の抗原結合性部分であって、第1の抗原はHLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1RMFであり、第1および第2の抗原結合性部分は各々、配列番号15のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号16のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む(従来型)Fab分子である第1および第3の抗原結合性部分;
b)第2の抗原に結合する第2の抗原結合性部分であって、第2の抗原はCD3であり、第2の抗原結合性部分は、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHが互いに置き換えられており、(i)配列番号121のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号122のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または(ii)配列番号136のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号137のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(特に、配列番号136のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号137のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域)を含むFab分子である第2の抗原結合性部分;
c)第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含み;
a)の第1および第3の抗原結合性部分の定常ドメインCLでは、124位のアミノ酸が、リジン(K)により置換されており(カバットによる番号付け)、123位のアミノ酸が、リジン(K)またはアルギニン(R)により(最も特にはアルギニン(R)により)置換されており(カバットによる番号付け)、a)の第1および第3の抗原結合性部分の定常ドメインCH1では、147位のアミノ酸が、グルタミン酸(E)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸がグルタミン酸(E)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け);ならびに
さらに
a)の第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、b)の第2の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、b)の第2の抗原結合性部分およびa)の第3の抗原結合性部分は各々、Fab重鎖のC末端が、c)のFcドメインのサブユニットの一方のN末端に融合されている
二重特異性抗原結合性分子を提供する。
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合性分子は、第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含む。二重特異性抗原結合性分子に関して本明細書に記載されているFcドメインの特徴は、本発明の抗体に含まれるFcドメインに等しく適用することができることが理解される。
本発明による二重特異性抗原結合性分子は、Fcドメインの2つのサブユニットの一方または他方に融合されていてもよい異なる抗原結合性部分を含み、したがって、Fcドメインの2つのサブユニットは、典型的には2つの非同一ポリペプチド鎖で構成される。こうしたポリペプチドの組換え共発現およびその後の二量体化は、2つのポリペプチドの幾つかの考え得る組合せに結び付く。したがって、組換え産生における二重特異性抗原結合性分子の収率および純度を向上させるために、二重特異性抗原結合性分子のFcドメインに、所望のポリペプチドの付随を促進する修飾を導入することが有利だろう。
Fcドメインは、二重特異性抗原結合性分子(または抗体)に、標的組織における良好な蓄積および有利な組織−血液分布比に寄与する長期血清半減期を含む有利な薬物動態特性を付与する。しかしながら、Fcドメインは、同時に、好ましい抗原担持細胞に対してではなく、Fc受容体を発現する細胞に対しての二重特異性抗原結合性分子(または抗体)の望ましくない標的化に結び付く場合がある。さらに、Fc受容体シグナル伝達経路の同時活性化は、二重特異性抗原結合性分子のT細胞活性化特性(例えば、第2の抗原結合性部分が活性化T細胞抗原に結合する二重特異性抗原結合性分子の実施態様において)および長期半減期と組み合わさると、全身投与時にサイトカイン受容体の過剰活性化および重度の副作用をもたらすサイトカイン放出に結び付く場合がある。T細胞以外の(Fc受容体担持)免疫細胞の活性化は、例えばNK細胞によりT細胞が破壊される可能性があるため、二重特異性抗原結合性分子(特に、第2の抗原結合性部分が活性化T細胞抗原に結合する二重特異性抗原結合性分子)の有効性を低減する場合さえある。
本発明は、本明細書に記載されているような抗体または二重特異性抗原結合性分子またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。一部の実施態様では、断片は、抗原結合性断片である。
本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子は、例えば、固体状態ペプチド合成(solid−state peptide synthesis)(例えば、メリフィールド固相合成)または組換え産生により得ることができる。組換え産生の場合、例えば上記に記載されているような抗体または二重特異性抗原結合性分子(断片)をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドが単離され、さらなるクローニングおよび/または宿主細胞での発現のために1つまたは複数のベクターに挿入される。そのようなポリヌクレオチドは、従来手順を使用して容易に単離および配列決定することができる。一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドの1つまたは複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写/翻訳制御シグナルと共に抗体または二重特異性抗原結合性分子(断片)のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。そうした方法としては、インビトロ組換えDNA技法、合成技法、およびインビボ組換え/遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Maniatisら、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク(1989年);およびAusubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、ニューヨーク(1989年)に記載の技法を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部分であってもよく、または核酸断片であってもよい。発現ベクターは、抗体または二重特異性抗原結合性分子(断片)をコードするポリヌクレオチド(つまり、コード化領域)が、プロモーターおよび/または他の転写もしくは翻訳制御エレメントと作動可能に付随してクローニングされている発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の部分である。「終止コドン」(TAG、TGA、またはTAA)は、アミノ酸に翻訳されないが、コード化領域の一部分とみなされる場合がある。しかしながら、任意のフランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、ならびに5’および3’非翻訳領域などは、存在する場合でもコード化領域の一部分ではない。2つまたはそれよりも多くのコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクトに、例えば単一のベクターに存在してもよく、または別々のポリヌクレオチドコンストラクトに、例えば別々の(異なる)ベクターに存在してもよい。さらに、任意のベクターは、単一のコード化領域を含んでいてもよく、または2つもしくはそれよりも多くのコード化領域を含んでいてもよく、例えば、本発明のベクターは、タンパク質分解性切断により翻訳後にまたは翻訳と同時に最終タンパク質へと分離される1つまたは複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発明の抗体もしくは二重特異性抗原結合性分子(断片)またはその変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合されているかまたは融合されていないかのいずれでもよい異種コード化領域をコードしてもよい。異種コード化領域としては、限定ではないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメインなどの特殊なエレメントまたはモチーフが挙げられる。作動可能な付随は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード化領域が、遺伝子産物の発現が調節配列の影響下または制御下に配置されるように、1つまたは複数の調節配列に付随されている場合である。2つのDNA断片(それらに付随するポリペプチドコード化領域およびプロモーターなど)は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、および2つのDNA断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指図する発現調節配列の能力に干渉しないか、または転写しようとするDNA鋳型の能力に干渉しない場合、「作動可能に付随されている」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写を達成することが可能だった場合、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に付随されていることになる。プロモーターは、所定の細胞でのみDNAの実質的な転写を指図する細胞特異的プロモーターであってもよい。細胞特異的転写を指図するために、プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルが、ポリヌクレオチドに作動可能に付随されていてもよい。好適なプロモーターおよび他の転写制御領域は、本明細書に開示されている。様々な転写制御領域が当業者に公知である。そうした転写制御領域としては、限定ではないが、以下のものが挙げられる:これらに限定されないが、サイトメガロウイルス(例えば、イントロン−Aを伴う最初期プロモーター)、シミアンウイルス40(例えば、初期プロモーター)、およびレトロウイルス(例えば、ラウス肉腫ウイルスなど)に由来するプロモーターおよびエンハンサーセグメントなどの、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域。他の転写制御領域としては、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβ−グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核細胞において遺伝子発現を制御可能な他の配列が挙げられる。追加の好適な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに誘導可能なプロモーター(例えば、プロモーター誘導可能なテトラサイクリン)が挙げられる。同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。翻訳制御エレメントとしては、これらに限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、ならびにウイルス系に由来するエレメントが挙げられる(特に、内部リボソーム侵入部位すなわちIRESは、CITE配列とも呼ばれる)。また、発現カセットは、複製開始点などの他の特徴、および/またはレトロウイルス長末端反復(LTR)もしくはアデノ随伴ウイルス(AAV)末端逆位反復(ITR)などの染色体組込みエレメントを含んでいてもよい。
ヒト胚性腎臓株(例えば、Grahamら、J Gen Virol 36巻、59頁(1977年)に記載されているような293細胞または293T細胞)、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)、マウスセルトリ細胞(例えば、Mather、Biol Reprod 23巻、243〜251頁(1980年)に記載されているようなTM4細胞)、サル腎臓細胞(CV1)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO−76)、ヒト子宮頸癌細胞(HELA)、イヌ腎臓細胞(MDCK)、バッファローラット肝臓細胞(BRL 3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝臓細胞(Hep G2)、マウス***腫瘍細胞(MMT060562)、TRI細胞(例えば、Matherら、Annals N.Y.Acad Sci 383巻、44〜68頁(1982年)に記載されているような)、MRC5細胞、およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、dhfr− CHO細胞(Urlaubら、Proc Natl Acad Sci USA、77巻、4216頁(1980年))を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞;ならびにYO、NS0、P3X63、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株が挙げられる。タンパク質産生に好適なある哺乳動物宿主細胞株の総説は、例えば、YazakiおよびWu、Methods in Molecular Biology、248巻(B.K.C.Lo編、Humana Press、トトワ、ニュージャージー州)、255〜268頁(2003年)を参照されたい。宿主細胞としては、培養細胞、ほんの少数を挙げれば、例えば、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞、および植物細胞だけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック/遺伝子組換え植物、または培養植物または動物組織内に含まれる細胞も挙げられる。一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞、またはリンパ球細胞(例えば、Y0細胞、NS0細胞、Sp20細胞)などの哺乳動物細胞である。
VelociMouse(登録商標)技術が記載されている米国特許出願公開第2007/0061900号明細書)。そのような動物により生成されるインタクトな抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに修飾することができる。
さらなる態様では、本発明は、本明細書で提供される抗体または二重特異性抗原結合性分子のいずれかを含む、例えば下記の治療方法のいずれかで使用するための薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体または二重特異性抗原結合性分子のいずれか、および薬学的に許容される担体を含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体または二重特異性抗原結合性分子のいずれか、および例えば下記に記載されているような少なくとも1つの追加の治療剤を含む。
本明細書に提供される抗体または二重特異性抗原結合性分子のいずれかを、治療方法に使用することができる。本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子は、例えば、がんの治療における免疫療法剤として使用することができる。
本発明の抗体および二重特異性抗原結合性分子は、治療において1つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子は、少なくとも1つの追加の治療剤と共に共投与することができる。用語「治療剤」は、そのような治療を必要とする個体の症候または疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。そのような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に好適な任意の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含む。ある特定の実施態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性化因子、またはアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増加させる薬剤である。特定の実施態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば微小管撹乱物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、DNAインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法剤、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、または抗血管新生剤である。
本発明に別の態様では、上記に記載されている障害の治療、予防、および/または診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器および容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、IV溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、様々な材料で形成されてもよい。容器は、組成物それ自体であるか、または状態を治療、予防、および/もしくは診断するのに有効な別の組成物と組み合わされている組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有していてもよい(例えば、容器は、皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有する静注溶液バッグまたはバイアルであってもよい)。組成物中の少なくとも1つの活性薬剤は、本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択された状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、(a)本発明の抗体または二重特異性抗原結合性分子を含む組成物がそこに含まれている第1の容器;および(b)さらなる細胞傷害性治療剤または別様の治療剤を含む組成物がそこに含まれている第2の容器を含んでいてもよい。本発明のこの実施態様の製造品は、組成物が、特定の状態を治療するために使用することができることを示す添付文書をさらに含んでいてもよい。その代わりにまたはそれに加えて、製造品は、静菌性注射用水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、およびデキストローズ溶液などの、薬学的に許容されるバッファーを含む第2の(または第3の)容器をさらに含んでいてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、および注射器を含む、商業的な視点およびユーザの視点で望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
ある特定の実施態様では、本明細書中で提供される抗HLA−A2/WT1抗体のいずれかは、生物学的試料中のHLA−A2/WT1の存在の検出に有用である。用語「検出する」は、本明細書で使用される場合、定量的検出または定性的検出を包含する。ある特定の実施態様では、生物学的試料は、前立腺組織などの細胞または組織を含む。
HLA−A2/WT1のFab結合体の生成
抗HLA−A2/WT1 Fabの選択およびスクリーニング
VLドメイン(3つの異なる長さ)およびVHドメイン(6つの異なる長さ)のCDR3に配列多様性を有する完全ヒトフレームワークに基づく合成Fabライブラリーからファージディスプレイにより、抗HLA−A2/WT1 Fabを選択した。
個々のクローンを、96ウェル形式の1ml培養物として細菌で発現させ、上清をELISAによるスクリーニングに供した。特異的結合体は、HLA−A2/WT1RMFに対しては5×バックグラウンドよりも高いシグナルを有し、HLA−A2/WT1VLDに対しては3×バックグラウンド未満のシグナルを有すると定義した。より正確には、ニュートラアビジン96ウェルストリッププレート(Thermo Fisher)を、10nM HLA−A2/WT1RMFまたは50nM HLA−A2/WT1VLDで30分間37℃にてコーティングし、続いて2%(w/v)ミルク−リン酸緩衝生理食塩水(MPBS)(200μl/ウェル)で1時間室温にてプレートをブロックした。プレートをPBSで3回洗浄し、その後Fab含有細菌上清を添加し、プレートを1時間室温にてインキュベートした。PBSでさらに3回洗浄した後、抗FLAG−HRP二次抗体(Sigma、Cat.No.A8592((1:4000)を添加し、プレートを室温で1時間振盪器でインキュベートした。プレートをPBSで3回洗浄し、100μl/ウェルのBM Blue POD(Roche)を添加することにより発色させた。50μl/ウェルの1M H2SO4を添加することにより酵素反応を停止させた。OD450−650の最終読み取りには、450nmのODを読み取った(参照は650nm)。ELISA陽性クローンを、下記に記載されている動力学スクリーニング実験に供した。
ProteOn XPR36バイオセンサー(BioRad)を使用して、Fab含有細菌培養上清を表面プラズモン共鳴法でスクリーニングすることにより、特異的結合体を特定した。手短に述べると、溶出したファージ粒子を対数増殖期の大腸菌TG1細胞に感染させた後、単一コロニー形成単位(cfu)をプレーティングし、96ディープウェルプレートの1ml発現培養に接種するため採取した。
表1.選択されたHLA-A2/WT1結合体のアミノ酸配列。
HLA−A2/WT1 IgGおよびHLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体の調製
クローニング
タンパク質をコードするcDNAを、従来の(非PCRに基づく)クローニング技法を使用して、ベクター系(Evitria)にクローニングした。ベクタープラスミドは、合成された遺伝子だった。陰イオン交換クロマトグラフィーに基づき低エンドトキシン条件下でプラスミドDNAを調製した。260nmの波長の吸光度を測定することによりDNA濃度を決定した。サンガー配列決定法で配列の正確性を検証した(cDNAのサイズに応じて、1プラスミド当たり最大2つの配列決定反応を用いた)。
IgG抗体および二重特異性抗体を、HEK293 EBNA細胞(無血清のExcell培地で懸濁培養した)の一過性のトランスフェクションにより生成した。細胞を遠心分離し、培地を予め温めておいたCD CHO培地に取り替えた。発現ベクターをCD CHO培地で混合した、ポリエチレンイミン(PEI)を添加し、溶液をボルテックスし、室温で10分間インキュベートした。その後、細胞をDNA/PEI溶液と混合し、振盪フラスコに移し、5%CO2雰囲気のインキュベーター中で3時間37℃にてインキュベートした。インキュベーション後、補完剤を有するExcell培地を添加した。1日後に、トランスフェクション補完剤を添加した。細胞上清を7日後に回収し、標準的な方法により精製した。
標準的プロトコールを参照して、濾過した細胞培養上清からタンパク質を精製した。手短に述べると、プロテインA(HiTrap ProteinA HPカラム、GE Healthcare)を使用してアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞培養上清からFc含有タンパク質を精製した。pH3.0で溶出を達成し、続いて試料を直ちに中和した。タンパク質を濃縮し、20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム、pH6.0でのサイズ排除クロマトグラフィー(HiLoad Superdex 200カラム、GE Healthcare)により、凝集したタンパク質をモノマータンパク質から分離した。
精製タンパク質の濃度を、ペースら(Protein Science、1995年、4巻、2411〜1423頁)に従ってアミノ酸配列に基づき計算されたモル吸光係数を使用して、280nmの光学濃度(OD)を測定することにより決定した。タンパク質の純度および分子量を、LabChipGXII装置(Caliper Lifescience)を使用して、還元剤の存在下および非存在下でCE−SDSを行うことにより分析した。凝集体含有量の決定は、25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L−アルギニンモノヒドロクロリド(monohydrocloride)pH6.7ランニングバッファーで25℃にて平衡化された分析用サイズ排除カラム(TSKgel G3000 SW XL、Tosoh)を使用してHPLCクロマトグラフィーにより実施した。
HLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体の親和性およびアビディティーの生化学的分析
HLA−A2/WT1RMFに対するHLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体の親和性を決定するために、HBS−EP(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、0.005%界面活性剤P20(GE Healthcare))をランニングバッファーとして用いて、Biacore T200で25℃にて、表面プラズモン共鳴(SPR)実験を実施した。抗ヒトFc特異的抗体(GE Healthcare、Cat.No.BR−1008−39)を、アミンカップリングによりCM5チップ(GE Healthcare)に直接固定化した。二重特異性コンストラクトを、5nMにて30秒間捕捉した。HBS−EPによるHLA−A2/WT1RMF複合体の3倍希釈系列物(1.03〜250nM)を、30μl/分で120秒間リガンドに流して結合段階を記録した。解離段階を120秒間モニターした。解離段階は、試料溶液からHBS−EPに切り替えることにより誘発させた。各サイクル後に3M MgCl2を10μl/分で30秒間注入して、チップ表面を再生した。抗ヒトFc抗体を含むが、それに二重特異性コンストラクトが捕捉されていない参照フローセルで得られた応答を減算することにより、バルク屈折率差を補正した。BIAevalソフトウェア(GE Healthcare)を使用して1:1ラングミュア結合にフィッティングすることによる動力学的速度定数から、親和性定数を導き出した。
表2. HLA-A2/WT1RMFに対する選択されたHLA-A2/WT1 IgGおよびHLA-A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)のSPRにより決定された親和性およびアビディティーデータの要約。
表3. CD3に対する選択されたHLA-A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)のSPRにより決定された親和性データの要約。
HLA−A2/WT1ペプチドRMFまたはVLDに対する特異性によるIgG結合体の選択。
本発明者らは、まず、ファージディスプレイから生成されたIgG結合体による、ペプチドでパルスされたT2細胞に対する結合特異性をフローサイトメトリーにより測定した。手短に言えば、T2細胞を、10%FBS(Gibco、カタログ番号16140−071)+1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco、カタログ番号15070−063)で補完されたIMDM培地(Gibco by Life Technologies、カタログ番号31980−048)(完全培地)中106細胞/mlの細胞懸濁物として調製した。総容積が10mlの細胞をチューブで維持し、10μlの10−2M(ペプチドの最終濃度:10−5M)ペプチド(WT1 p37−45 VLDペプチド(配列番号77)またはp126−134 RMFペプチド(配列番号78))と共に、5%CO2で2時間37℃にてインキュベートした。洗浄した後、細胞を冷却PBSに懸濁し、滴定濃度のIgG結合体(10μg/ml〜0.00064μg/ml)と共に1時間4℃にてインキュベートし、続いて二次抗ヒトIgG−Fcフィコエリトリン(PE)−コンジュゲート抗体(Jackson Laboratories、カタログ番号109−116−098)と共に30分間インキュベートした。FACS LSR II(BD)で細胞を取得した。データは、Graphpad PrismにおいてPEの平均蛍光発光強度(MFI)として示される。
NFAT−ジャーカットレポーターアッセイでは、HLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)が、ペプチドでパルスされたT2細胞に結合するとT細胞が活性化される
HLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)の特異性を調べるため、NFATのプロモーター下でルシフェラーゼを発現するジャーカット細胞(ジャーカット−NFAT;Promega、Cat.No.CS176501)であるレポーター細胞株を使用して、TCBが、ペプチドでパルスされたT2細胞(ATCC、Cat.No.CRL−1992)に結合する際のT細胞活性化を測定した。手短に言えば、T2細胞を、10%FBS(Gibco、カタログ番号16140−071)+1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco、カタログ番号15070−063)で補完されたIMDM培地(Gibco by Life Technologies、カタログ番号31980−048)(完全培地)中106細胞/mlの細胞懸濁物として調製した。総容積が10mlの細胞をチューブで維持し、10μlの10−2M(ペプチドの最終濃度:10−5M)ペプチド(WT1 p37−45VLDペプチドまたはp126−134RMFペプチド)と共に、5%CO2で2時間37℃にてインキュベートした。洗浄した後、2.2×105細胞/mlの細胞懸濁物中90μlのペプチドでパルスされた細胞を、96ウェルマイクロタイター丸底プレート(20,000細胞/ウェル、TPP、Cat.No.92097)に播種し、50μlのジャーカット−NFAT(2×106細胞/mlの細胞懸濁物)および10μlの滴定されたTCB(PBS中100μg/ml〜0.0064μg/mlの)と共に、5%CO2で16時間37℃にて共培養した。その後、50μlの上清を除去し、1ウェル当たり100μlのBright−Gloルシフェラーゼアッセイ(Promega、Cat.No.E2620)と取り替え、室温(RT)でインキュベートした。5分後、180μlの上清を新しい白色プレートに移して、発光シグナルをEnVision(パーキンエルマー)で測定した。データは相対発光ユニット(RLU)として示されている。
ペプチドでパルスされたT2細胞との結合時にHLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)により媒介されるT細胞細胞傷害性
次に、本発明者らは、TCBの細胞傷害性を測定した。標的細胞は、実施例5に記載されているようなペプチドでパルスされたT2細胞だった。エフェクター細胞は、フィコール(GE Healthcare、Cat.No.17−1440−03)勾配遠心分離によりバフィーコートから単離されたPBMCから精製された汎CD3+細胞だった。ヒト汎T細胞単離キット(Miltenyi Biotec、Cat.No.130−096−535)を使用して、MACS(Miltenyi Biotec)により、全CD3+ T細胞を精製した。細胞傷害性アッセイを以下の通りに実施した:ペプチドでパルスした細胞(100μl)を96ウェルマイクロタイター丸底プレートに播種し(3×105細胞/ml)、50μlのT細胞(6×106細胞/ml)および50μlの滴定されたTCB(40μg/ml〜0.00004μg/mlの)と共に、5%CO2で18時間37℃にて完全培地中で共培養した。その後、50μlの上清を新しい白色プレートに移し、1ウェル当たり25μlのCytoTox−Gloルシフェラーゼアッセイ(Promega、Cat.No.G9291)を添加して、15分間室温(RT)でインキュベートした。発光シグナル(細胞死を示すものとしてのLDH放出を測定するため)を、EnVision(パーキンエルマー)で読み取った。データは相対発光ユニット(RLU)として示されている。
WT1+細胞株との結合時にHLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)により媒介されるT細胞細胞傷害性
TCBによる特異的な死滅を確認するために、本発明者らは、WT1+腫瘍細胞株で細胞傷害性アッセイを実施した。HLA−A2+WT1+細胞株は、SKM−1細胞(DZMZ No.ACC547)およびHLA−A2/WT1RMF複合体でトランスフェクトされたCHO細胞(CHO−WT1)(自家製)だった。陰性コントロールは、HLA−A2+WT1−細胞:BJAB(DZMZ No.ACC757)、ARH−77(DZMZ No.ACC512)、およびHLA−A2/MAGE−A4複合体でトランスフェクトされたCHO細胞(CHO−MAGEA4)(自家製)、ならびにHLA−A2−WT1+細胞株:K562(ATCC No.CLL−243)だった(図6A)。細胞傷害性アッセイを、実施例6に記載されているように実施した。11D06−TCBおよび33H09−TCBは両方とも、SKM−1細胞およびCHO−WT1細胞に対して強力な死滅を示したが、いかなるHLA−A2+WT1−細胞およびHLA−A2−WT1+細胞に対しては死滅を示さず、これら2つのTCBが、WT1ペプチドRMFに対して特異性を有することが示された(図6B、6C)。それとは対照的に、VLDペプチド特異的なTCBはいずれも、HLA−A2+WT1+細胞株に対する死滅を示さなかった。それらが高濃度(10μg/ml)においてWT1+細胞株に対して低力価の死滅を示した場合、WT1−細胞株に対しても同様に同じ程度の死滅が見られた(図6D、6E)。こうした機能性データに基づき、本発明者らは、さらなる評価のために11D06−TCBおよび33H09−TCBを選択した。
表4.選択されたTCBによるWT1+細胞株の死滅。
WT1+細胞株との結合時にHLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)により媒介されるT細胞活性化
WT1+標的細胞に対するTCB媒介細胞傷害性の要件は、T細胞が活性化されてエフェクター機能を獲得することである。本発明者らは、実施例7に記載されているようなインビトロ死滅アッセイ中に、2つの選択されたTCB、33H09−TCBおよび11D06−TCBの存在下でのT細胞およびHLA−A2+WT1−細胞SKM−1またはHLA−A2+WT1−細胞BJABの共培養のフローサイトメトリーによりT細胞の活性化状態を測定した。18時間の共インキュベーション後に細胞を回収し、CD3(Biolegend Cat.No.300321)、CD25(Biolegend Cat.No.302606)、およびCD69(Biolegend Cat.No.310914)に対する抗体で染色して、フローサイトメトリーによりT細胞活性化を測定した。
選択されたHLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)は、報告されているオフターゲットペプチドに結合しない
T細胞受容体(TCR)様抗体の開発における主要な潜在的リスクは、正常組織により発現されるタンパク質に由来する提示されたペプチドホモログと抗体との交差反応性である。ESK1抗体はタンパク質MED13LおよびPIGQに由来する配列類似ペプチドに結合することが、Ataieら(J Mol Biol.(2016年)428巻:194〜205頁)により報告されているため、本発明者らは、これら2つのペプチドに対する交差反応性に関して本発明者らのTCBを試験した。これらのペプチドの配列は、図8Fおよび配列番号79および80に示されている。実施例4に記載されているようなフローサイトメトリーに基づく結合アッセイでは、本発明者らは、11D06−TCBおよび33H09−TCBが両方ともPIGQペプチドに結合しないことを見出した。両TCBによるMED13Lペプチドとの結合は、天然WT1 RMFペプチドと比較して、ほぼ100倍だけより低い(図8A、8B)。ESK1−TCBは、RMFペプチドと低親和性で結合するが、PIGQペプチドとは同様の様式で結合し、MED13Lとはさらにより強力に結合する(図8C)。これは、ESK1 IgGの報告されている結合活性と一致する(Ataieら、J Mol Biol.(2016年)428巻:194〜205頁)。
選択されたHLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)は、未同定のオフターゲットペプチドに結合しない
正常組織に由来する相同ペプチド(重要な認識残基を共有する)に対する交差反応性は、TCR様抗体またはTCRに基づくT細胞療法による、重度の容易に予測可能でない毒性を引き起こす場合がある(例えば、Linetteら、Blood(2013年)122巻:863〜71を参照;心臓組織により発現されるタンパク質に対するオフターゲット反応性による、MAGE A3−TCR療法の致死毒性が報告されている)。したがって、こうした薬剤の特異性は重要である。11D06(実施例15を参照)の結合に関与するRMFペプチドの位置を確認する結晶構造データに基づいて本発明者らの抗体の特異性を詳しく画定するために、本発明者らは、ペプチドームデータベース(SwissprotおよびTrEMBL)において、RxxPNxxYxをマスキングすることにより、WT1 RMFペプチド(配列番号78)と類似したアミノ酸配列を有する潜在的オフターゲットペプチドの探索を拡張した。本発明者らは、すべてがHLA−A2に対する高い予測親和性を有する様々なタンパク質に由来する追加の25個のペプチドを見出した(表5)。その後、本発明者らは、上記に記載されているように、NFATレポーターアッセイ(ペプチド1〜6)またはT細胞細胞傷害性アッセイ(ペプチド7〜25)を使用して、ペプチドでパルスされたT2細胞に対する本発明者らの選択されたTCBの交差反応性を試験した。
表5.追加の新しく特定されたオフターゲットペプチド。
選択されたHLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)は、CD34+幹細胞に対する細胞傷害性を媒介しない
CD34+造血幹細胞はWT1陽性であることが報告されており(RamaniおよびCowell、J.Path(1996年)179巻:162〜8頁)、したがって、TCBがそれらに結合した場合、潜在的に有害であり得る。CD34+細胞がRMFペプチドを内因的に提示するか否かを研究するため、本発明者らは、3人のドナーに由来するHLA−A2+骨髄由来CD34+細胞をLonzaから得、本発明者らの選択されたTCBを、上記の実施例7に記載されているような死滅アッセイで試験した。11D06−TCBおよび33H09−TCBは、SKM−1細胞に対して強力な死滅を媒介するが、CD34+幹細胞に対しては死滅活性を示さなかった。これは、これらの幹細胞がHLA−A2の状況ではRMFペプチドを提示しない可能性があることを示す(図10)。
アラニン走査アッセイによる、選択されたHLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)の結合残基の画定
本発明者らのTCBは、ESK1−TCBと比較して、RMFペプチドに対する結合および機能活性が異なることは明らかである。TCBによるRMFペプチドの潜在的結合モチーフの特徴を明らかにするため、本発明者らは、天然配列に由来するペプチドアレイを使用して各アミノ酸をアラニンに個々に置き換えることによるアラニン走査アッセイを設定し、そうしたペプチドでパルスされたT2細胞によるNFATレポーターシグナルを測定した(図11A〜11L)。データは、漸増濃度のTCBにわたってRLUとして示されている。本発明者らは、天然ペプチドのEC50に対するEC50の倍率変化をプロットし、10≧の倍率変化を有意であるとみなした。これは、RMFペプチドの対応するアミノ酸残基が、11D06−TCBおよび33H09−TCBによる認識に重要であり得ることを意味する(図11M)。本発明者らは、11D06−TCBおよび33H09−TCBは両方とも、残基R1、F3、N5、およびA6と重要な接触を有するが(図11N)、ESK1は、RMFペプチドR1、P4、およびN5と緊密な接触を有することが示された(Ataieら、J Mol Biol.(2016年)428巻:194〜205頁)と結論付けた。
NSGマウスへの単回注射後のHLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)の薬物動態プロファイル
0.5mg/kgの33H09−TCBまたは11D06−TCBの単一用量を、NSGマウスに注射した。マウスにはすべて、200μlの適切な溶液をi.v.注射した。適正量の200μl当たりの化合物を得るために、ストック溶液をヒスチジンバッファーで希釈した。1時点当たり3匹のマウスを、10分、1時間、3時間、6時間、24時間、48時間、72時間、96時間、6日、8日、10日、および12日目に出血させた。血清試料中の注射した化合物をELISAにより分析した。ビオチン化抗huCD3−CDR抗体(Roche Diagnostics、ペンツベルク、ドイツ)、試験試料、ジゴキシゲニン標識抗huFc抗体、および抗ジゴキシゲニン検出抗体(ペルオキシダーゼ(POD))を、96ウェルストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに段階的に添加し、各段階後に室温で1時間インキュベートした。各段階後にプレートを3回洗浄して、未結合物質を除去した。最後に、ペルオキシダーゼ結合複合体を、ABTS(2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)基質溶液を添加して、有色反応生成物を形成することにより視覚化する。405nm(参照波長は490nm)で光度測定的に決定した反応生成物強度は、血清中の被分析物濃度に比例する。結果(図12)は、試験した両クローンのPK挙動は安定であることを示した。これは、その後の有効性研究では週1回のスケジュールでよいことを示唆した。
ヒト化マウスのSKM−1異種移植片におけるHLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)の有効性研究
HLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体の最初の有効性研究は、完全ヒト化NSGマウスにおけるヒト急性骨髄性白血病(AML)異種移植片(SKM−1;HLA−A2+、WT−1+)での有効性の点で、2つの異なるWT1結合体(11D06および33H09)を比較することが目的だった。
Tv:(W2/2)×L (W:幅、L:長さ)
HLA−A2/WT1抗体/pMHC複合体の結晶構造
Fab断片を、1mg当たり1.05Uのプラスミン(Roche、Cat.No.602361)を有する50mM Tris pH8.0、150mM NaCl中で抗体を72時間25℃にてインキュベートすることにより調製した。50mM Tris、100mMグリシン、150mM NaCl、pH8.0で平衡化された4.5mLのCaptureSelect CH1−アフィニティーカラム(BAC BV、Cat.No.191.3120)を使用して、切断されたFcをFab断片から分離した。Fab断片を、50mM Tris、100mMグリシン、150mM NaCl、pH2.0でカラムから溶出し、0.5Mリン酸ナトリウムpH8.0で中和してから、20mM Tris、150mM NaCl、pH7.4で平衡化されたサイズ排除カラムS75(GE Healthcare)に負荷した。品質管理は、非還元条件および還元条件下で分析用サイズ排除(カラムはTosoh、TSK−Gel G3000SWXLで、Agilent HPLC1200装置を使用)およびCE−SDS(Caliper LabChip GXII、Perkin Elmer)を行うことにより実施した。精製Fab断片を、液体窒素で凍結し、−80℃で保管した。
結晶化。5C01結合体に基づく1.2倍過剰モルのHLA−A2/WT1 Fab断片(Fab 5C01)を、HLA−A2/WT1VLDペプチド複合体(HLA−A02/WT1VLD pMHC)と混合することにより、抗体/pMHC複合体(Fab 5C01 HLA−A02/WT1VLD pMHC)を調製した。4℃で1時間インキュベートした後、混合物を10mg/mlに濃縮した。初期結晶化試行は、シッティングドロップ蒸気拡散設定で21℃にて実施した。結晶品質を向上させるために10%2−メチル−2,4−ペンタンジオール(MPD)が結晶化液滴に添加された0.2M酒石酸ナトリウム、20%ポリエチレングリコール(PEG)3350から1日以内に結晶が出現した。結晶を、一切のさらなる最適化工程を行わずにスクリーニングプレートから直接回収した。
表6. Fab 5C01 HLA-A02/WT1VLD pMHCのデータ収集および精密化統計学
*括弧中の値は、最も高い分解能シェルのものである。
VLDペプチドとFab 5C01との相互作用の詳細、5C01とHLA−A02との結合エピトープおよびパラトープの特徴を明らかにするために、本発明者らは、5C01とHLA−A02/WT1VLD pMHCとの複合体の結晶構造を、1.98Åの分解能で決定した(図14A)。この構造は、Fab 5C01が、軽鎖のCDR1およびCDR3の主な寄与により、および重鎖のすべてのCDRにより、pMHCに結合することを明らかにする。VLDペプチド(配列番号77)からは、残基Val1、Phe4、およびPro7の側鎖がFabと直接接触する。ペプチドの他のすべての側鎖は、HLA−A02分子の方を向いている。接触表面積に対するペプチドの寄与は約68Å2であるが、総Fab−pMHC接触面積は約476Å2であることが観察される。Fab 5C01−pMHC接触面の拡大図は図15に示されている。
結晶化。11D06結合体(Fab 11D06)に基づく1:1モル量のHLA−A2/WT1 Fab断片を、HLA−A2/WT1RMFペプチド複合体(HLA−A02/WT1RMF pMHC)と混合することにより、抗体/pMHC複合体(Fab 11D06 HLA−A02/WT1RMF pMHC)を調製した。21℃で4時間インキュベートした後、混合物を20mg/mlに濃縮した。初期結晶化試行は、シッティングドロップ蒸気拡散設定で21℃にて実施した。結晶は、0.1M Tris pH8.0、20%PEG 4000から4日以内に出現した。結晶を、一切のさらなる最適化工程を行わずにスクリーニングプレートから直接回収した。
本発明者らは、Fab 11D06とHLA−A02/RMF pMHCとの複合体の結晶構造を、2.64Åの分解能で決定した(図14B)。構造は、Fab 11D06が、CDRすべての寄与によりpMHCと結合することを示す。残基Arg1、Met2、Pro4、Asn5、Ala6、およびTyr8のRMFペプチド(配列番号78)側鎖は、Fabの軽鎖および重鎖と直接接触している。ペプチドの残りの側鎖は、HLA−A02分子の方を向いている。接触表面積に対するペプチドの寄与は約107Å2である。総Fab−pMHC接触面積は約397Å2に相当する。Fab 11D06−pMHC接触面の拡大図は図17に示されている。
比較のために、HLA−A02/RMF pMHCに結合する抗体(Fab)ESK1の公的に入手可能な結晶構造(PDB ID 4WUU;http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=4WUU)を、そのFab−pMHC接触に関して同様に分析した。図14Cは、HLA−A02/VLD pMHCとのFab 5C01およびHLA−A02/RMF pMHCとのFab 11D06の結晶構造(図14Aおよび14B)と同じ角度(HLA−A02部分に対してアラインされている)からのHLA−A02/RMF pMHCとのFab ESK1結晶構造を示す。Fab ESK1−pMHC接触面の拡大図は図19に示されており、接触が要約されている概要的Fab ESK1−pMHC相互作用マトリックスは、図20に示されている。
結合体5C01、11D06、およびESK1のエピトープおよびパラトープの要約は、下記に示されている。エピトープおよびパラトープ(5Å近隣半径に基づき画定した)残基は、太字斜体文字で強調されている。CDR残基は灰色背景で強調されている。
結合体5C01、11D06、およびESK1の化学的相互作用に関与する残基の要約は、下記に示されている。特異的な化学的相互作用に関与する残基(図16、18、および20を比較)は、太字斜体文字で強調されている。CDR残基は灰色背景で強調されている。
HLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)と様々なCD3結合体との比較
本発明者らは、上記に記載されているようなアッセイ(実施例7)にてSKM−1細胞を使用して、11D06−TCBの死滅活性の力価を様々なCD3結合体と比較した。CH2527は、以前の実験で使用したTCBのCD3結合体である(VH配列およびVL配列は、配列番号121および122を参照)。V9は、Rodriguesら、Int J Cancer Suppl(1992年)7巻、45〜50頁および国際公開第1992/22653号パンフレットに記載されているCD3結合剤であり(VH配列およびVL配列は、配列番号136および137を参照)、40G5Cは、国際公開第2015/095392号パンフレットに記載されている(VH配列およびVL配列は、国際公開第2015/095392号パンフレットの配列番号184および185(「hu40G5c」)を参照)。
表8.この実験で比較されたCD3結合体の親和性。
RMFペプチドでパルスされたT2細胞との結合時にHLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)により媒介されるT細胞細胞傷害性
11D06−TCB(V9)(完全な配列は、配列番号123、125、139、140を参照)の死滅活性を、異なるHLA/WT1結合体を有する類似TCBと比較した(「Aali」および「Daniel」、国際公開第2017/060201号パンフレット、それぞれ配列番号5(VH)および6(VL)ならびに配列番号35(VH)および36(VL)を参照)。また、ESK1−TCBおよび非標的DP47−TCBが、コントロールとして含まれていた。実験は、実施例6に記載されているように実施した。RMFペプチドでパルスされた細胞(100μl、2×105細胞/ml)を、50μlのT細胞(2×106細胞/ml)と共におよびTCB(50μl)の段階希釈物と共に、5%CO2で24時間37℃にて共培養した。
選択されたHLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)はオフターゲットペプチドに結合しない
また、本発明者らは、実施例9および10に記載されているオフターゲットペプチドとの、11D06−TCB(V9)、Aali−TCB、Daniel−TCB、およびESK1−TCBの交差反応性を比較した。
NSGマウスへの単回注射後のHLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(11D06−TCB(V9))の薬物動態プロファイル
1mg/kgの11D06−TCB(V9)の単一用量を、ヒト化および腫瘍保有NSGマウスに注射した。マウスに、ヒスチジンバッファーで希釈した200μlのTCBをi.v.注射した。1時点当たり3匹のマウスを、10分、6時間、24時間、72時間、7日目に出血させた。血清試料中の注射した化合物を、実施例13に記載されているようにELISAにより分析した。
ヒト化マウスのSKM−1異種移植片におけるHLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(11D06−TCB(V9))の有効性研究
この有効性研究は、完全ヒト化NSGマウスのヒトAML異種移植片(SKM−1)における11D06−TCB(V9)の有効性を評価することが目的だった。実験は、実施例14に記載されているように実施した。
様々な分子形式を有するHLA−A2/WT1×CD3二重特異性抗体(「TCB」)の比較
本発明者らは、11D06−TCB(V9)の活性を、「1+1 CrossMab」形式の類似分子(図1Aに図示されているような)と比較した。活性を、標的細胞の存在下にて用量依存的な様式でレポーター細胞株(ジャーカットNFAT)のTCB媒介性活性化を検出する、細胞に基づく機能アッセイを使用してモニターした。アッセイは、HLA−A02/WT1RMF pMHC複合体を発現するCHO−K1細胞を標的細胞として使用して、本質的に上記の実施例5に記載されているように実施した。TCBが、標的細胞のHLA−A02/WT1RMF pMHC複合体およびレポーター細胞のT細胞受容体(TCR)のCD3εユニットに同時に結合すると、レポーター細胞活性化が生じ、それによりCD3のハイパークラスタリングがもたらされ、それによりTCR活性化がもたらされる。対応する細胞内シグナル伝達経路のその後の開始は、転写因子NFATの活性化をもたらし、それによりNFAT駆動性ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現が誘導される。ルシフェラーゼレポーターの活性を、基質の添加時に発光を読み取ることにより測定する。
* * *
本発明のさらなる態様を、以下に記載する。
[態様1]
HLA−A2/WT1に結合する抗体であって、抗体は、HLA−A2/WT1のWT1ペプチド、特にWT1 RMF ペプチドの少なくとも3つのアミノ酸残基を含む、HLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1 RMF のエピトープに結合する抗体。
[態様2]
少なくとも3つのアミノ酸残基が、WT1 RMF ペプチドのアミノ酸残基R1、M2、P4、N5、A6、およびY8に対応するアミノ酸残基から選択される、態様1に記載の抗体。
[態様3]
HLA−A2/WT1に結合する抗体であって、抗体は、
(i)配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、および配列番号3のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号4の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号5のLCDR2、および配列番号6のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号9のHCDR1、配列番号10のHCDR2、および配列番号11のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号12のLCDR1、配列番号13のLCDR2、および配列番号14のLCDR3を含むVL;
(iii)配列番号17のHCDR1、配列番号18のHCDR2、および配列番号19のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号20のLCDR1、配列番号21のLCDR2、および配列番号22のLCDR3を含むVL;
(iv)配列番号25のHCDR1、配列番号26のHCDR2、および配列番号27のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号28のLCDR1、配列番号29のLCDR2、および配列番号30のLCDR3を含むVL;
(v)配列番号33のHCDR1、配列番号34のHCDR2、および配列番号35のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号36のLCDR1、配列番号37のLCDR2、および配列番号38のLCDR3を含むVL;
(vi)配列番号41のHCDR1、配列番号42のHCDR2、および配列番号43のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号44のLCDR1、配列番号45のLCDR2、および配列番号46のLCDR3を含むVL;
(vii)配列番号49のHCDR1、配列番号50のHCDR2、および配列番号51のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号52のLCDR1、配列番号53のLCDR2、および配列番号54のLCDR3を含むVL;
(viii)配列番号57のHCDR1、配列番号58のHCDR2、および配列番号59のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号60のLCDR1、配列番号61のLCDR2、および配列番号62のLCDR3を含むVL;または
(ix)配列番号65のHCDR1、配列番号66のHCDR2、および配列番号67のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号68のLCDR1、配列番号69のLCDR2、および配列番号70のLCDR3を含むVL
を含む抗体。
[態様4]
抗体が、
(i)配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(ii)配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号39のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号48のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;または
(ix)配列番号71のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号72のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL
を含む、態様3に記載の抗体。
[態様5]
抗体が、IgG抗体、特にIgG 1 抗体である、態様1から4のいずれか一項に記載の抗体。
[態様6]
抗体が、完全長抗体である、態様1から5のいずれか一項に記載の抗体。
[態様7]
抗体が、Fv分子、scFv分子、Fab分子、およびF(ab’) 2 分子の群から選択される抗体断片である、態様1から5のいずれか一項に記載の抗体。
[態様8]
抗体が、多重特異性抗体である、態様1から7のいずれか一項に記載の抗体。
[態様9]
(a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原はHLA−A2/WT1であり、第1の抗原結合性部分は、
(i)配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、および配列番号3のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号4の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号5のLCDR2、および配列番号6のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号9のHCDR1、配列番号10のHCDR2、および配列番号11のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号12のLCDR1、配列番号13のLCDR2、および配列番号14のLCDR3を含むVL;
(iii)配列番号17のHCDR1、配列番号18のHCDR2、および配列番号19のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号20のLCDR1、配列番号21のLCDR2、および配列番号22のLCDR3を含むVL;
(iv)配列番号25のHCDR1、配列番号26のHCDR2、および配列番号27のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号28のLCDR1、配列番号29のLCDR2、および配列番号30のLCDR3を含むVL;
(v)配列番号33のHCDR1、配列番号34のHCDR2、および配列番号35のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号36のLCDR1、配列番号37のLCDR2、および配列番号38のLCDR3を含むVL;
(vi)配列番号41のHCDR1、配列番号42のHCDR2、および配列番号43のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号44のLCDR1、配列番号45のLCDR2、および配列番号46のLCDR3を含むVL;
(vii)配列番号49のHCDR1、配列番号50のHCDR2、および配列番号51のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号52のLCDR1、配列番号53のLCDR2、および配列番号54のLCDR3を含むVL;
(viii)配列番号57のHCDR1、配列番号58のHCDR2、および配列番号59のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号60のLCDR1、配列番号61のLCDR2、および配列番号62のLCDR3を含むVL;または
(ix)配列番号65のHCDR1、配列番号66のHCDR2、および配列番号67のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号68のLCDR1、配列番号69のLCDR2、および配列番号70のLCDR3を含むVL
を含む第1の抗原結合性部分、ならびに
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合性部分
を含む、二重特異性抗原結合性分子。
[態様10]
第1の抗原結合性部分が、
(i)配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(ii)配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号39のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号48のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;または
(ix)配列番号71のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号72のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL
を含む、態様9に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様11]
第2の抗原が、CD3、特にCD3εである、態様9または10に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様12]
第2の抗原結合性部分が、
(i)配列番号115のHCDR1、配列番号116のHCDR2、および配列番号117のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号118のLCDR1、配列番号119のLCDR2、および配列番号120のLCDR3を含むVL;または
(ii)配列番号130のHCDR1、配列番号131のHCDR2、および配列番号132のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号133のLCDR1、配列番号134のLCDR2、および配列番号135のLCDR3を含むVL
を含む、態様11に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様13]
第2の抗原結合性部分が、
(i)配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;または
(ii)配列番号136のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号137のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL
を含む、態様12に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様14]
第1および/または第2の抗原結合性部分が、Fab分子である、態様9から13のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様15]
第2の抗原結合性部分が、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1、特に可変ドメインVLおよびVHが互いに置き換えられているFab分子である、態様9から14のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様16]
第1の抗原結合性部分が、定常ドメインにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により置換されており(カバットによる番号付け)、123位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により置換されており(カバットによる番号付け)、定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)により置換されている(カバットEUインデックスによる番号付け)Fab分子である、態様9から15のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様17]
第1および第2の抗原結合性部分が、互いに、任意選択でペプチドリンカーを介して融合されている、態様9から16のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様18]
第1および第2の抗原結合性部分が、各々がFab分子であり、(i)第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、第1の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されているか、または(ii)第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、第2の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されているかのいずれかである、態様9から17のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様19]
第3の抗原結合性部分を含む、態様9から18のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様20]
第3の抗原部分が、第1の抗原結合性部分と同一である、態様19に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様21]
第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含む、態様9から20のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様22]
第1、第2、および存在する場合は第3の抗原結合性部分が、各々Fab分子であり、(i)第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、第1の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、Fcドメインの第1のサブユニットのN末端に融合されているか、または(ii)第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、第2の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、Fcドメインの第1のサブユニットのN末端に融合されているかのいずれかであり;ならびに第3の抗原結合性部分は、存在する場合、Fab重鎖のC末端が、Fcドメインの第2のサブユニットのN末端に融合されている、態様21に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様23]
Fcドメインが、IgG Fcドメイン、特にIgG 1 Fcドメインである、態様21または22に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様24]
Fcドメインが、ヒトFcドメインである、態様21から23のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様25]
Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインのアミノ酸残基が、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換えられており、それにより第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空洞に位置決め可能である第1のサブユニットのCH3ドメイン内の突起が生成され、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインのアミノ酸残基が、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換えられており、それにより第1のサブユニットのCH3ドメイン内の突起を位置決め可能である第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空洞が生成される、態様21から24のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様26]
Fcドメインが、Fc受容体との結合および/またはエフェクター機能を低減させる1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、態様21から25のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
[態様27]
態様1から26のいずれか一項に記載の抗体または二重特異性抗原結合性分子をコードする1つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド。
[態様28]
態様27に記載のポリヌクレオチドを含む、1つまたは複数のベクター、特に発現ベクター。
[態様29]
態様27に記載のポリヌクレオチドまたは態様28に記載のベクターを含む宿主細胞。
[態様30]
HLA−A2/WT1に結合する抗体を産生するための方法であって、a)抗体の発現に好適な条件下で態様29に記載の宿主細胞を培養する工程、およびb)任意選択で抗体を回収する工程を含む方法。
[態様31]
態様30に記載の方法により産生される、HLA−A2/WT1に結合する抗体。
[態様32]
態様1から26または31のいずれか一項に記載の抗体または二重特異性抗原結合性分子および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
[態様33]
医薬として使用するための、態様1から26もしくは31のいずれか一項に記載の抗体もしくは二重特異性抗原結合性分子、または態様30に記載の薬学的組成物。
[態様34]
疾患の治療に使用するための、態様1から26もしくは31のいずれか一項に記載の抗体もしくは二重特異性抗原結合性分子、または態様30に記載の薬学的組成物。
[態様35]
疾患が、がんである、態様34に記載の抗体、二重特異性抗原結合性分子、または薬学的組成物。
[態様36]
疾患の治療に使用するための医薬の製造における、態様1から26または31のいずれか一項に記載の抗体または二重特異性抗原結合性分子の使用。
[態様37]
個体の疾患を治療するための方法であって、態様1から26または31のいずれか一項に記載の抗体または二重特異性抗原結合性分子を含む、薬学的に許容される形態の治療的有効量の組成物を、個体に投与することを含む方法。
[態様38]
疾患が、がんである、態様36に記載の使用または態様37に記載の方法。
[態様39]
態様1から38のいずれか一項に記載の発明。
Claims (39)
- HLA−A2/WT1に結合する抗体であって、抗体は、HLA−A2/WT1のWT1ペプチド、特にWT1RMFペプチドの少なくとも3つのアミノ酸残基を含む、HLA−A2/WT1、特にHLA−A2/WT1RMFのエピトープに結合する抗体。
- 少なくとも3つのアミノ酸残基が、WT1RMFペプチドのアミノ酸残基R1、M2、P4、N5、A6、およびY8に対応するアミノ酸残基から選択される、請求項1に記載の抗体。
- HLA−A2/WT1に結合する抗体であって、抗体は、
(i)配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、および配列番号3のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号4の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号5のLCDR2、および配列番号6のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号9のHCDR1、配列番号10のHCDR2、および配列番号11のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号12のLCDR1、配列番号13のLCDR2、および配列番号14のLCDR3を含むVL;
(iii)配列番号17のHCDR1、配列番号18のHCDR2、および配列番号19のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号20のLCDR1、配列番号21のLCDR2、および配列番号22のLCDR3を含むVL;
(iv)配列番号25のHCDR1、配列番号26のHCDR2、および配列番号27のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号28のLCDR1、配列番号29のLCDR2、および配列番号30のLCDR3を含むVL;
(v)配列番号33のHCDR1、配列番号34のHCDR2、および配列番号35のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号36のLCDR1、配列番号37のLCDR2、および配列番号38のLCDR3を含むVL;
(vi)配列番号41のHCDR1、配列番号42のHCDR2、および配列番号43のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号44のLCDR1、配列番号45のLCDR2、および配列番号46のLCDR3を含むVL;
(vii)配列番号49のHCDR1、配列番号50のHCDR2、および配列番号51のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号52のLCDR1、配列番号53のLCDR2、および配列番号54のLCDR3を含むVL;
(viii)配列番号57のHCDR1、配列番号58のHCDR2、および配列番号59のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号60のLCDR1、配列番号61のLCDR2、および配列番号62のLCDR3を含むVL;または
(ix)配列番号65のHCDR1、配列番号66のHCDR2、および配列番号67のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号68のLCDR1、配列番号69のLCDR2、および配列番号70のLCDR3を含むVL
を含む抗体。 - 抗体が、
(i)配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(ii)配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号39のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号48のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;または
(ix)配列番号71のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号72のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL
を含む、請求項3に記載の抗体。 - 抗体が、IgG抗体、特にIgG1抗体である、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体。
- 抗体が、完全長抗体である、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体。
- 抗体が、Fv分子、scFv分子、Fab分子、およびF(ab’)2分子の群から選択される抗体断片である、請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体。
- 抗体が、多重特異性抗体である、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体。
- (a)第1の抗原に結合する第1の抗原結合性部分であって、第1の抗原はHLA−A2/WT1であり、第1の抗原結合性部分は、
(i)配列番号1の重鎖相補性決定領域(HCDR)1、配列番号2のHCDR2、および配列番号3のHCDR3を含む重鎖可変領域(VH)、ならびに配列番号4の軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、配列番号5のLCDR2、および配列番号6のLCDR3を含む軽鎖可変領域(VL);
(ii)配列番号9のHCDR1、配列番号10のHCDR2、および配列番号11のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号12のLCDR1、配列番号13のLCDR2、および配列番号14のLCDR3を含むVL;
(iii)配列番号17のHCDR1、配列番号18のHCDR2、および配列番号19のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号20のLCDR1、配列番号21のLCDR2、および配列番号22のLCDR3を含むVL;
(iv)配列番号25のHCDR1、配列番号26のHCDR2、および配列番号27のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号28のLCDR1、配列番号29のLCDR2、および配列番号30のLCDR3を含むVL;
(v)配列番号33のHCDR1、配列番号34のHCDR2、および配列番号35のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号36のLCDR1、配列番号37のLCDR2、および配列番号38のLCDR3を含むVL;
(vi)配列番号41のHCDR1、配列番号42のHCDR2、および配列番号43のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号44のLCDR1、配列番号45のLCDR2、および配列番号46のLCDR3を含むVL;
(vii)配列番号49のHCDR1、配列番号50のHCDR2、および配列番号51のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号52のLCDR1、配列番号53のLCDR2、および配列番号54のLCDR3を含むVL;
(viii)配列番号57のHCDR1、配列番号58のHCDR2、および配列番号59のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号60のLCDR1、配列番号61のLCDR2、および配列番号62のLCDR3を含むVL;または
(ix)配列番号65のHCDR1、配列番号66のHCDR2、および配列番号67のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号68のLCDR1、配列番号69のLCDR2、および配列番号70のLCDR3を含むVL
を含む第1の抗原結合性部分、ならびに
(b)第2の抗原に特異的に結合する第2の抗原結合性部分
を含む、二重特異性抗原結合性分子。 - 第1の抗原結合性部分が、
(i)配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(ii)配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iii)配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号24のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(iv)配列番号31のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号32のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(v)配列番号39のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vi)配列番号47のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号48のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(vii)配列番号55のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号56のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;
(viii)配列番号63のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;または
(ix)配列番号71のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号72のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL
を含む、請求項9に記載の二重特異性抗原結合性分子。 - 第2の抗原が、CD3、特にCD3εである、請求項9または10に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- 第2の抗原結合性部分が、
(i)配列番号115のHCDR1、配列番号116のHCDR2、および配列番号117のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号118のLCDR1、配列番号119のLCDR2、および配列番号120のLCDR3を含むVL;または
(ii)配列番号130のHCDR1、配列番号131のHCDR2、および配列番号132のHCDR3を含むVH、ならびに配列番号133のLCDR1、配列番号134のLCDR2、および配列番号135のLCDR3を含むVL
を含む、請求項11に記載の二重特異性抗原結合性分子。 - 第2の抗原結合性部分が、
(i)配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL;または
(ii)配列番号136のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVH、および配列番号137のアミノ酸配列と少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むVL
を含む、請求項12に記載の二重特異性抗原結合性分子。 - 第1および/または第2の抗原結合性部分が、Fab分子である、請求項9から13のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- 第2の抗原結合性部分が、Fab軽鎖およびFab重鎖の可変ドメインVLおよびVHまたは定常ドメインCLおよびCH1、特に可変ドメインVLおよびVHが互いに置き換えられているFab分子である、請求項9から14のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- 第1の抗原結合性部分が、定常ドメインにおいて、124位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により置換されており(カバットによる番号付け)、123位のアミノ酸が、独立して、リジン(K)、アルギニン(R)、またはヒスチジン(H)により置換されており(カバットによる番号付け)、定常ドメインCH1において、147位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)により置換されており(カバットEUインデックスによる番号付け)、213位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸(E)またはアスパラギン酸(D)により置換されている(カバットEUインデックスによる番号付け)Fab分子である、請求項9から15のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- 第1および第2の抗原結合性部分が、互いに、任意選択でペプチドリンカーを介して融合されている、請求項9から16のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- 第1および第2の抗原結合性部分が、各々がFab分子であり、(i)第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、第1の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されているか、または(ii)第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、第2の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されているかのいずれかである、請求項9から17のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- 第3の抗原結合性部分を含む、請求項9から18のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- 第3の抗原部分が、第1の抗原結合性部分と同一である、請求項19に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- 第1および第2のサブユニットで構成されるFcドメインを含む、請求項9から20のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- 第1、第2、および存在する場合は第3の抗原結合性部分が、各々Fab分子であり、(i)第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、第1の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、Fcドメインの第1のサブユニットのN末端に融合されているか、または(ii)第1の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、第2の抗原結合性部分のFab重鎖のN末端に融合されており、第2の抗原結合性部分は、Fab重鎖のC末端が、Fcドメインの第1のサブユニットのN末端に融合されているかのいずれかであり;ならびに第3の抗原結合性部分は、存在する場合、Fab重鎖のC末端が、Fcドメインの第2のサブユニットのN末端に融合されている、請求項21に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- Fcドメインが、IgG Fcドメイン、特にIgG1 Fcドメインである、請求項21または22に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- Fcドメインが、ヒトFcドメインである、請求項21から23のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- Fcドメインの第1のサブユニットのCH3ドメインのアミノ酸残基が、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換えられており、それにより第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空洞に位置決め可能である第1のサブユニットのCH3ドメイン内の突起が生成され、Fcドメインの第2のサブユニットのCH3ドメインのアミノ酸残基が、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換えられており、それにより第1のサブユニットのCH3ドメイン内の突起を位置決め可能である第2のサブユニットのCH3ドメイン内の空洞が生成される、請求項21から24のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- Fcドメインが、Fc受容体との結合および/またはエフェクター機能を低減させる1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項21から25のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合性分子。
- 請求項1から26のいずれか一項に記載の抗体または二重特異性抗原結合性分子をコードする1つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項27に記載のポリヌクレオチドを含む、1つまたは複数のベクター、特に発現ベクター。
- 請求項27に記載のポリヌクレオチドまたは請求項28に記載のベクターを含む宿主細胞。
- HLA−A2/WT1に結合する抗体を産生するための方法であって、a)抗体の発現に好適な条件下で請求項29に記載の宿主細胞を培養する工程、およびb)任意選択で抗体を回収する工程を含む方法。
- 請求項30に記載の方法により産生される、HLA−A2/WT1に結合する抗体。
- 請求項1から26または31のいずれか一項に記載の抗体または二重特異性抗原結合性分子および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- 医薬として使用するための、請求項1から26もしくは31のいずれか一項に記載の抗体もしくは二重特異性抗原結合性分子、または請求項30に記載の薬学的組成物。
- 疾患の治療に使用するための、請求項1から26もしくは31のいずれか一項に記載の抗体もしくは二重特異性抗原結合性分子、または請求項30に記載の薬学的組成物。
- 疾患が、がんである、請求項34に記載の抗体、二重特異性抗原結合性分子、または薬学的組成物。
- 疾患の治療に使用するための医薬の製造における、請求項1から26または31のいずれか一項に記載の抗体または二重特異性抗原結合性分子の使用。
- 個体の疾患を治療するための方法であって、請求項1から26または31のいずれか一項に記載の抗体または二重特異性抗原結合性分子を含む、薬学的に許容される形態の治療的有効量の組成物を、個体に投与することを含む方法。
- 疾患が、がんである、請求項36に記載の使用または請求項37に記載の方法。
- 請求項1から38のいずれか一項に記載の発明。
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