JP7247101B2 - Ｓｔｅａｐ－１に結合する抗体 - Google Patents

Ｓｔｅａｐ－１に結合する抗体 Download PDF

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Description

本発明は、概して、例えばＴ細胞を活性化させるための二重特異性抗原結合分子を含むＳＴＥＡＰ－１に結合する抗体に関する。加えて、本発明は、このような抗体をコードするポリヌクレオチドと、このようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞とに関する。本発明はさらに、この抗体を生成するための方法、及び疾患の治療にそれらを使用する方法に関する。
ＳＴＥＡＰ－１（ｐｒｏｓｔａｔｅ－１の六つの膜貫通上皮抗原）は、正常組織において前立腺細胞に優勢に発現される３３９のアミノ酸の細胞表面タンパク質である。ＳＴＥＡＰ－１タンパク質の発現は、前立腺がんの様々な状態にわたって高レベルに維持され、ＳＴＥＡＰ－１も、肺及び結腸といった他のヒトがんにおいて高度に過剰発現される。正常組織及びがん組織におけるＳＴＥＡＰ－１の発現プロファイルは、例えば免疫療法のための、治療標的としての使用の可能性を示すものであった。国際公開第２００８／０５２１８７号には、抗ＳＴＥＡＰ－１抗体及びそのイムノコンジュゲートが報告されている。ＳＴＥＡＰ－１／ＣＤ３（ｓｃＦｖ）２二重特異性抗体は、国際公開第２０１４／１６５８１８号に記載されている。
前立腺、肺及び結腸における様々ながん及びがんの転移を治療するためのさらなる薬物に対する需要が存在している。この目的のために特に有用な薬物には、ＳＴＥＡＰ－１に結合する抗体、特に標的細胞上のＳＴＥＡＰ－１と、ＣＤ３といったＴ細胞上のＴ細胞活性化抗原とに結合する二重特異性抗体が含まれる。このような抗体がその標的の両方に同時結合することにより、標的細胞とＴ細胞の間に一時的な相互作用が生じ、いずれかの傷害性Ｔ細胞を活性化させ、続いて標的細胞を溶解させる。
治療目的のために、抗体が満たさなければならない重要な要件は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（薬物の貯蔵のため）及びｉｎ ｖｉｖｏ（患者への投与後）両方での十分な安定性である。
アスパラギン脱アミド、アスパルテート異性化、スクシンイミド形成、及びトリプトファン酸化のような修飾は、組み換え抗体に関する典型的な分解であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性及びｉｎ ｖｉｖｏでの生体機能の両方に影響しうる。
本発明は、二重特異性抗体を含む、ＳＴＥＡＰ－１に結合し、例えばスクシンイミド形成による分解に抵抗性であるが故に良好な安定性を示す新規のｌ抗体を提供する。提供される（二重特異性）抗体はさらに、良好な有効性及び生産性を、低い毒性及び好ましい薬物動態特性と組み合わせている。
本発明者らは、予期しなかった改善された特性を有する、ＳＴＥＡＰ－１に結合する新規の抗体を開発した。特に、この抗体は、例えばスクシンイミド形成による分解に抵抗性であり、したがって治療目的に必要とされるように特に安定である。さらに、本発明者らは、新規のＳＴＥＡＰ－１抗体を組み込んだ、ＳＴＥＡＰ－１とＴ細胞活性化抗原とに結合する二重特異性抗原結合分子を開発した。
したがって、第１の態様では、本発明はＳＴＥＡＰ－１に結合する抗体であって、質量分析により決定した場合に、ｐＨ７．４、３７℃で４週間後に約５％未満のスクシンイミド分解を示す、及び／又はｐＨ６．０、４０℃で４週間後に約１０％未満のスクシンイミド分解を示す抗体を提供する。
さらなる態様において、本発明により提供されるＳＴＥＡＰ－１に結合する抗体は、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。一実施態様において、ＶＨは、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様において、抗体は、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１抗体である。一実施態様において、抗体は完全長抗体である。別の実施態様では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子の群より選択される抗体断片である。一実施態様において、抗体は多重特異性抗体である。
本発明はまた、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＳＴＥＡＰ－１であり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部部分、並びに（ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部分を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。一実施態様において、第１の抗原結合部分のＶＨは、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様において、第２の抗原は、ＣＤ３、特にＣＤ３εである。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１５のＨＣＤＲ１、配列番号１６のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１８のＬＣＤＲ１、配列番号１９のＬＣＤＲ２及び配列番号２０のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分のＶＨは、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合部分のＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様において、第１及び／又は第２の抗原結合部分はＦａｂ分子である。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが、又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。一実施態様において、第１の抗原結合部分は、定常ドメインにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）によって置換されており、定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立してグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立してグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）Ｆａｂ分子である。一実施態様では、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している。一実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。一実施態様において、二重特異性抗原結合分子は第３の抗原結合部分を含む。一実施態様において、第３の抗原部分は第１の抗原結合部分と同一である。一実施態様において、二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。一実施態様において、第１の、第２の、及び存在する場合は第３の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり；（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、且つ第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、且つ第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に結合しており；第３の抗原結合部分は、存在する場合は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。一実施態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１のＦｃドメインである。一実施態様において、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。一実施態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な***が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の***を収容可能な空洞が生成される。一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含む。
本発明の別の態様によれば、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードする、一又は複数の単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明はさらに、本発明の単離されたポリヌクレオチド（複数可）を含む一又は複数の発現ベクター、及び本発明の単離されたポリヌクレオチド（複数可）又は発現ベクター（複数可）を含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物の細胞である。
別の態様では、ＳＴＥＡＰ－１に結合する抗体の生成方法が提供され、この方法は、ａ）本発明の宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養する工程、及びｂ）抗体を回収する工程を含む。本発明は、本発明の方法により生成されるＳＴＥＡＰ－１に結合する抗体も包含する。
本発明はさらに、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
本発明には、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子及び薬学的組成物の使用方法も包含される。一態様において、本発明は、医薬としての使用のための、本発明による抗体、二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物を提供する。一態様においては、疾患の治療においける使用のための、本発明による抗体、二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物が提供される。特定の一実施態様において、疾患はがんである。
さらに、疾患の治療のための医薬の製造における本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子の使用；並びに薬学的に許容される形態の本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む治療的有効量の組成物を個体に投与することを含む、前記個体における疾患の治療方法が提供される。特定の一実施態様において、疾患はがんである。上記実施態様のいずれにおいても、個体は好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的構成を示している。（Ａ、Ｄ）は、「１＋１のＣｒｏｓｓＭａｂ」分子を示しており、（Ｂ、Ｅ）は、別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分を有する（「反転型」）「２＋１のＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示しており、（Ｃ、Ｆ）は、「２＋１のＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示している。黒い点：ヘテロダイマー化を促すＦｃドメイン内の任意選択的修飾。＋＋、－－：任意選択的にＣＨ１及びＣＬドメインに導入された反対の電荷のアミノ酸。図示のＣｒｏｓｓＦａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含んでいるが、－ＣＨ１及びＣＬドメインに荷電修飾が導入されていない実施態様では－代替的にＣＨ１とＣＬドメインの交換を含んでいる場合がある。 本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的構造である。（Ｇ、Ｋ）は、別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分を有する（「反転型」）「１＋１のＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示しており、（Ｈ、Ｌ）は、「１＋１のＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示しており、（Ｉ、Ｍ）は、二つのＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１のＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示しており、（Ｊ、Ｎ）は、二つのＣｒｏｓｓＦａｂを有し、且つ別の順序でＣｒｏｓｓｆａｂ及びＦａｂ成分を有する（「反転型」）「２＋１のＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示している。黒い点：ヘテロダイマー化を促すＦｃドメイン内の任意選択的修飾。＋＋、－－：任意選択的にＣＨ１及びＣＬドメインに導入された反対の電荷のアミノ酸。図示のＣｒｏｓｓＦａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含んでいるが、－ＣＨ１及びＣＬドメインに荷電修飾が導入されていない実施態様では－代替的にＣＨ１とＣＬドメインの交換を含んでいる場合がある。 本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的構造である。（Ｏ、Ｓ）は、「Ｆａｂ－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示しており、（Ｐ、Ｔ）は、「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－Ｆａｂ」分子を示しており、（Ｑ、Ｕ）は、「（Ｆａｂ）２－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子を示しており、（Ｒ、Ｖ）は、「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－（Ｆａｂ）２」分子を示している。黒い点：ヘテロダイマー化を促すＦｃドメイン内の任意選択的修飾。＋＋、－－：任意選択的にＣＨ１及びＣＬドメインに導入された反対の電荷のアミノ酸。図示のＣｒｏｓｓＦａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含んでいるが、－ＣＨ１及びＣＬドメインに荷電修飾が導入されていない実施態様では－代替的にＣＨ１とＣＬドメインの交換を含んでいる場合がある。 本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子（ＴＣＢ）の例示的構造である。（Ｗ、Ｙ）は、「Ｆａｂ－（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子を示しており、（Ｘ、Ｚ）は、「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２－Ｆａｂ」分子を示している。黒い点：ヘテロダイマー化を促すＦｃドメイン内の任意選択的修飾。＋＋、－－：任意選択的にＣＨ１及びＣＬドメインに導入された反対の電荷のアミノ酸。図示のＣｒｏｓｓＦａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含んでいるが、－ＣＨ１及びＣＬドメインに荷電修飾が導入されていない実施態様では－代替的にＣＨ１とＣＬドメインの交換を含んでいる場合がある。 実施例において調製されるＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体分子の例示である。試験されるＴＣＢ抗体分子はすべて、電荷修飾を有する「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」として生成された（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、ＳＴＥＡＰ１バインダーにおける電荷修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ、２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）。 バンドルツズマブの可変ドメインの配列分析を示している。（Ａ）配列中のホットスポット位置の予測である。（Ｂ）ＣＤＲ領域及びバンドルツズマブの可変ドメイン配列中に予測されるホットスポットのアノテーションである。 異なるＳＴＥＡＰ－１ ＴＣＢ抗体分子により誘導された、２４時間（Ａ）又は４８時間（Ｂ）後のＳＴＥＡＰ－１発現ＬｎＣＡＰ細胞のＴ細胞媒介性の溶解である（Ｅ：Ｔ＝１０：１、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞）。ＳＤと共に３回分が示されている。 Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞上のヒトＣＤ３及びＬｎＣＡＰ（Ａ）又は２２Ｒｖ１細胞（Ｂ）上のヒトＳＴＥＡＰ－１に対する異なるＳＴＥＡＰ－１ ＴＣＢ抗体分子の同時結合時の、発光により決定されたＪｕｒｋａｔ活性化を示している。ＳＴＥＡＰ－１－陰性ＣＨＯ－Ｋ１細胞株がコントロールとして使用された（Ｃ）。ＳＤと共に３回分が示されている。 ヒトＳＴＥＡＰ－１発現ＣＨＯ－ｈＳＴＥＡＰ１細胞（Ａ）及びＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞（Ｂ）に対するＳＴＥＡＰ－１ ＴＣＢ抗体分子の結合を示している。
定義
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当技術分野で一般に使用されるように使用される。
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及び誘導体、例えば、その断片である。
用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が少なくとも二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。一般的に、二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的な二つの抗原結合部位を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、二つの抗原決定基、特に二つの別個の細胞上に発現した二つの抗原決定基に同時に結合することができる。
本明細書において使用される用語「価」は、抗原結合分子内における特定数の抗原結合部位の存在を意味する。したがって、「抗原に対する一価の結合」という表現は、抗原結合分子内において、抗原に特異的な一つの（且つ一つを超えない）抗原結合部位の存在を意味する。
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、即ち、一又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含む。天然免疫グロブリン分子は、一般に二つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は一般に単一の抗原結合部位を有する。
本明細書で使用される「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、それが結合するエンティティ（例えば、第２の抗原結合部分）を標的部位へ、例えば抗原決定基を有する特定の型の腫瘍細胞へと方向付けることができる。別の実施態様では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合抗原を通してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分には、抗体及びその断片が含まれる。これについては後述する。特定の抗原結合部分には、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメインが含まれる。特定の実施態様では、抗原結合部分は、本明細書でさらに定義し、且つ当技術分野において既知であるように、抗体定常領域を含むことができる。有用な重鎖定常領域は、五つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ、又はμのいずれかを含む。有用な軽鎖定常領域は、二つのアイソタイプ：κ及びλのいずれかを含む。
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分－抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外基質（ＥＣＭ）に見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原と呼ばれるタンパク質（例えばＳＴＥＡＰ－１、ＣＤ３）は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型を指す。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内でのプロセシングにより得られる任意の形態のタンパク質とを包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。抗原として有用な例示的ヒトタンパク質は、ＣＤ３、特にＣＤ３のエプシロンサブユニット（ヒト配列についてＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ． Ｐ０７７６６（バージョン１８５）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｎｏ． ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号２４；又はカニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ． Ｑ９５ＬＩ５（バージョン６９）、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ． ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号２５参照）、又はＳＴＥＡＰ－１（ｐｒｏｓｔａｔｅ １の六つの膜貫通上皮抗原：ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ． Ｑ９ＵＨＥ８（バージョン１３７）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｎｏ． ＮＰ＿０３６５８１．１、配列番号２３参照）である。特定の実施態様では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、様々な種由来のＣＤ３又はＳＴＥＡＰ－１抗原の中でも保存されたＣＤ３又はＳＴＥＡＰ－１のエピトープに結合する。特定の実施態様では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子はヒトＳＴＥＡＰ－１に結合する。
「特異的結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合部分の、特定の抗原決定基への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ計器上での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 （2000））、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 （2002））により測定することができる。一実施態様では、抗原結合部分の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合部分の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する抗原結合部分、又は抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
「親和性」は、分子（例えば、受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有相互作用の総和の強度を指す。本明細書では、特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（ＫＤ）によって表され、この解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含みうる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で既知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
例えばＦｃ受容体への結合減少といった「結合減少」は、例えばＳＰＲによって測定される、各相互作用に対する親和性の減少を指す。明確に示すために、用語はゼロ（又は分析方法の検出限界を下回る値）への親和性の減少、即ち相互作用の完全な消失も含む。逆に、「結合増大」は、各相互作用に対する親和性の増大を指す。
本明細書において使用される「Ｔ細胞活性化抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面上に発現される抗原決定基を指し、抗原結合分子との相互作用時にＴ細胞の活性化を誘導することができる。具体的には、抗原結合分子とＴ細胞活性化抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを引き起こすことによりＴ細胞活性化を誘導することができる。特定の一実施態様では、Ｔ細胞活性化抗原は、ＣＤ３、特にＣＤ３のエプシロンサブユニット（ヒト配列についてＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ． Ｐ０７７６６（バージョン１４４）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｎｏ． ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号２４を；カニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ． Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ． ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号２５を参照）。
本明細書において使用される「Ｔ細胞活性化」は、活性化マーカーの増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、及び発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の一又は複数の細胞応答を指す。Ｔ細胞活性化を測定するために適切なアッセイは、技術分野で既知であり、本明細書に記載される。
本明細書において使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質の細胞といった腫瘍内細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特定の一実施態様では、標的細胞抗原は、ＳＴＥＡＰ－１、特にヒトＳＴＥＡＰ－１である。
本明細書において、Ｆａｂ分子などに関して使用される用語「第１」、「第２」又は「第３」は、各種の部分が複数存在するときに区別を簡便にするために使用される。このような用語の使用は、明瞭に述べているのでない限り、二重特異性抗原結合分子の特定の順序又は方向を付与することを意図しているのではない。
「融合した」とは、複数の成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインのサブユニット）が、直接又は一又は複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合により結合していることを意味する。
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの、重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬ及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも呼ばれる）は、Ｆａｂ重鎖とＦａｂ軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている（即ち互いによって置き換えられている）Ｆａｂ分子を意味し、即ちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（ＮからＣ末端の方向に、ＶＬ－ＣＨ１）からなるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＮからＣ末端の方向に、ＶＨ－ＣＬ）からなるペプチド鎖とを含む。明瞭には、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１を含むペプチド鎖を、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。逆に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子では、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖を、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。
これに対して、「従来の」Ｆａｂ分子とは、その天然フォーマットにおけるＦａｂ分子、即ち重鎖の可変ドメイン及び定常ドメイン（ＮからＣ末端の方向に、ＶＨ－ＣＨ１）からなる重鎖と、軽鎖の可変ドメイン及び定常領域（ＮからＣ末端の方向に、ＶＬ－ＣＬ）からなる軽鎖を含むＦａｂ分子を意味する。
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している二つの軽鎖と二つの重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常ドメインとも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる定常ドメイン（ＣＬ）ドメインが続いている。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる五種類のうちの一つに割当てることができ、それらのいくつかはさらにサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。免疫グロブリンは、基本的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合された二つのＦａｂ分子とＦｃドメインからなる。
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、 即ち例えば、天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのこれらの方法及びその他の例示的な方法は本明細書に記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものであり、即ちその自然環境には存在しないものである。特定のレベルの精製は必要でない。例えば、単離された抗体は、その天然又は自然の環境から除去することができる。宿主細胞に発現される、組み換えにより生成された抗体を、任意の適切な技術により分離、画分化、又は部分的若しくは実質的に精製された天然又は組み換え抗体のように、本発明のために単離することが考慮される。したがって、本発明の抗体及び二重特異性抗原結合分子は、単離される。いくつかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）法により決定されるように、９５％又は９９％を上回る純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 （2007）を参照のこと。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 （2003）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., （Springer-Verlag, New York）, pp. 269-315 （1994）を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び 第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 （2003）；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 （1993）を参照。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 （2003）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて又は一部、或いは軽鎖可変ドメインのすべて又は一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６号参照）。抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により提供されうる。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は一般に、各々が四つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似構造を有する。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 （2007）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分でありうる。可変領域配列に関連して本明細書において使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）によって規定された番号付けシステムを指す。
本明細書において使用される場合、重鎖及び軽鎖のすべての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、本明細書において「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ番号付け」と呼ばれる、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）に記載されたＫａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる。具体的には、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）の頁６４７～６６０参照）が、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１～７２３頁参照）が、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用され、この場合本明細書でこれはさらに「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け」と呼ぶことにより分類される。
本明細書で用いられる「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変である抗体可変ドメインの領域（「相補性決定領域」即ち「ＣＤＲ」）及び／又は構造的に規定されるループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域及び／又は抗原接触残基（「抗原コンタクト（ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｎｔａｃｔ）」を含有する抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般的に、抗体は、ＶＨに三つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに三つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の計六つのＨＶＲを含む。本明細書において、例示的なＨＶＲは：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 （1987））；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３－１０１（Ｈ３）に生じる抗原コンタクト（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 （1996））；及び
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）、及び９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ
を含む。
特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では、上掲のKabat et al.に従って番号付けされる。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に四つのＦＲのドメイン、即ちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）に以下の順序で現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが、 非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてが、ヒト抗体のものに対応する。このような可変ドメインを、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ぶ。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでよい。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明による特性を産むように定常領域が追加的に修飾されているもの又は元の抗体から変更されているものである。
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。特定の実施態様では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物、例えばマウス、ラット、又はウサギから誘導される。特定の実施態様では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞株から誘導される。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片も、本明細書においてヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の五つの主要なクラス、即ちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異型Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに変化しうるが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びると定義される。しかしながら、宿主細胞によって生成される抗体には、重鎖のＣ末端から、一又は複数の、特に一つ又は二つのアミノ酸の翻訳後切断が生じうる。したがって、完全長重鎖をコードする特異的な核酸分子の発現により、宿主細胞によって生成される抗体は、完全長重鎖を含みうるか、又は完全長重鎖の切断された変異体（本明細書では「切断された変異型重鎖」とも呼ぶ）を含みうる。これは、重鎖の最後の二のＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）とリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）とリジン（Ｋ４４７）は、存在してもしなくてもよい。Ｆｃドメイン（又は本明細書において定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、本明細書では、特に断らない限りＣ末端グリシン－リジンジペプチドを有さないものとして示される。本発明の一実施態様では、本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子に含まれる、本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本発明の一実施態様では、本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子に含まれる、本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書に記載される薬学的組成物といった本発明の組成物は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の集団を含む。抗体又は二重特異性抗原結合分子の集団は、完全長重鎖を有する分子と、切断された変異型重鎖とを含みうる。抗体又は二重特異性抗原結合分子の集団は、完全長重鎖を有する分子と切断された変異型重鎖を有する分子との混合物からなることができ、この場合抗体又は二重特異性抗原結合分子の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％が切断された変異型重鎖を有する。本発明の一実施態様では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の集団を含む組成物は、追加的なＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施態様では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の集団を含む組成物は、追加的なＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施態様では、このような組成物は、本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子から構成される抗体又は二重特異性抗原結合分子の集団；追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する、本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子；及び追加のＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子を含む。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD、1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD、1991（上記も参照）．本明細書において使用されるＦｃドメインの「サブユニット」は、二量体Ｆｃドメインを形成する二つのポリペプチドの一方、即ち、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定な自己会合能を有するポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促す修飾」とは、Ｆｃドメインのサブユニットを含むポリペプチドの、同一のポリペプチドとの会合によるホモダイマーの形成を低減又は抑制する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書において使用される会合を促す修飾には、特に、会合することが望ましい二つのＦｃドメインサブユニット（即ち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別々の修飾が含まれ、これらの修飾は、二つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために互いに相補的である。例えば、会合を促す修飾は、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させることにより、それらの会合を、それぞれ立体的に又は静電的に好ましいものにすることができる。このように、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、これらのポリペプチドは、サブユニットの各々に融合したさらなる成分（例えば、抗原結合部分）が同じでないという意味で非同一でありうる。いくつかの実施態様では、会合を促す修飾は、Ｆｃドメイン内におけるアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促す修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因しうる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）；サイトカイン分泌；抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞の活性化が含まれる。
本明細書において使用される「改変する、改変された、改変」などの用語は、ペプチド骨格のいずれかの操作、又は天然に存在するポリペプチド若しくは組み換えポリペプチド若しくはその断片の翻訳後修飾を含むと考慮される。改変には、アミノ酸配列、グリコシル化パターン、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾と、このような手法の組合せが含まれる。
本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意図している。置換、欠失、挿入、及び修飾のあらゆる組み合わせは、最終的なコンストラクトが所望の特性、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減、又は別のペプチドとの会合の増大を保持することを前提に、最終的なコンストラクトに到達するために行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失、並びにアミノ酸の挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸の置換である。Ｆｃ領域の結合特性などを変更する目的で、非保存的アミノ酸置換、即ち、一のアミノ酸を、異なる構造及び／又は化学特性を有する別のアミノ酸で置換することは、特に好ましい。アミノ酸置換には、２０の標準のアミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）の天然に存在するアミノ酸誘導体又は天然に存在しないアミノ酸による置き換えが含まれる。アミノ酸変異体は、当技術分野で周知の遺伝学的方法又は化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的変異原性、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。遺伝学的改変以外の方法、例えば化学的修飾によるアミノ酸の側鎖基の変更方法も有用でありうると考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために、種々の表記が使用される。例えば、Ｆｃドメインの３２９位におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙとして示される。
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のために、％アミノ酸配列同一性の値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用して又はより最近のＢＬＯＳＵＭ５０比較行列を用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、W. R. Pearson and D. J. Lipman （1988）, “Improved Tools for Biological sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson （1996） “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227- 258; 及び Pearson et. al. （1997） Genomics 46:24-36によって作製され、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌから公的に利用可能である。代替的に、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉにおいてアクセス可能な公的サーバを使用して、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を用いて配列を比較し、確実にローカルアラインメントではなくグローバルアラインメントを実施することができる。パーセントアミノ酸同一性は、出力されるアラインメントヘッダに与えられる。
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含みうる。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組み換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色***置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにポジティブ及びネガティブな鎖形式、及び二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、さらに、合成により生成されたそのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった制御要素を含んでも含まなくてもよい。
「［例えば本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子］をコードする単離されたポリヌクレオチド（又は核酸）」は、抗体重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一又は複数のポリヌクレオチド分子を指し、これには、単一のベクター又は別々のベクター中のこのようなポリヌクレオチド分子（複数可）、及び宿主細胞中の一又は複数の位置に存在するこのような核酸分子（複数可）が含まれる。
用語「発現カセット」は、組み換えにより又は合成により、標的細胞内の特定の核酸の転写を許可する一連の特定の核酸要素を用いて生成されたポリヌクレオチドを指す。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、発現カセットは、本発明の抗体若しくは二重特異性抗原結合分子、又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び方向付けするために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機械により生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでいてもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができるいずれかの種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、さらには、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞を含む。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインの結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞により抗体でコートされた標的細胞の溶解を招く免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が通常Ｆｃ領域に対するＮ末端であるタンパク質部分を介して特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される用語「ＡＤＣＣの低下」は、標的細胞を囲む媒質中の所定の抗体濃度において、上記に定義したＡＤＣＣの機構により所定の時間内に溶解する標的細胞の数、及び／又は、ＡＤＣＣの機構により所定の時間内に所定の数の標的細胞を溶解させるために必要な、標的細胞を囲む媒質中の抗体濃度の上昇のいずれかと定義される。ＡＤＣＣの低下は、同じ標準的な生成、精製、製剤化、及び貯蔵方法（当業者に既知の）を用いて、但し改変されていない、同じ型の宿主細胞により生成される同じ抗体により媒介されるＡＤＣＣと相対的なものである。例えば、そのＦｃドメインにＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換を含む抗体により媒介されるＡＤＣＣの低下は、このアミノ酸置換をＦｃドメインに含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号参照）。
「有効量の」薬剤は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、低下させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
「個体」又は「被験者」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、組成物が投与される対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、バッファー、賦形剤、安定剤又は保存剤が含まれる。
本明細書で用いられる場合、「治療」（及びその文法上の変形）は、治療されている個体の疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程において実行できる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
用語「パッケージ挿入物」は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに使用され、このような治療製品の使用に関する指示、使用法、用量、投与、併用療法、禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
実施態様の詳細な説明
本発明は、ＳＴＥＡＰ－１、特にヒトＳＴＥＡＰ－１に結合し、例えばスクシンイミド形成による分解に抵抗性であり、したがって治療目的に必要であるように特に安定な抗体及び二重特異性抗原結合分子を提供する。加えて、この分子は、治療的用途にとって好ましい、例えば有効性及び／又は安全性、並びに生産性に関する他の特性も有する。
ＳＴＥＡＰ－１抗体
したがって、第１の態様では、本発明はＳＴＥＡＰ－１に結合する抗体を提供し、この抗体は、質量分析により決定して、ｐＨ７．４、３７℃で４週間後に約５％未満のスクシンイミド分解を示す、及び／又はｐＨ６．０、４０℃で４週間後に約１０％未満のスクシンイミド分解を示す。一実施態様において、抗体は、質量分析により決定して、ｐＨ７．４、３７℃で４週間後に約３％未満のスクシンイミド分解、特に約１％未満のスクシンイミド分解を示す。一実施態様において、抗体は、質量分析により決定して、ｐＨ６．０、４０℃で４週間後に約７．５％未満のスクシンイミド分解、特に約５％未満のスクシンイミド分解を示す。
さらなる態様において、本発明により提供されるＳＴＥＡＰ－１に結合する抗体は、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
特定の実施態様では、抗体は、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号７のＬＣＤＲ１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。
いくつかの実施態様において、抗体はヒト化抗体である。一実施態様において、ＶＨは、ヒト化ＶＨである及び／又はＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様において、抗体は、上記実施態様のいずれかにおけるＣＤＲを含み、さらにはアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一実施態様において、ＶＨは、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施態様において、抗体は、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列と、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ又はＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗体は、ＳＴＥＡＰ－１に対する結合能を保持する。特定の実施態様では、配列番号１１、１２又は１３において合計で１から１０のアミノ酸が置換、挿入及び／又は削除されている、及び／又は配列番号１４において合計で１から１０のアミノ酸が置換、挿入及び／又は削除されている。特定の実施態様では、置換、挿入、又は削除は、ＨＶＲ外の（即ちＦＲ内の）領域で生じる。任意選択的に、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号１１、１２又は１３にＶＨ配列を、及び／又は配列番号１４にＶＬ配列含む。
一実施態様において、抗体は、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３の群より選択されるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
一実施態様において、抗体は、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３の群より選択されるＶＨ配列と、配列番号１４のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
特定の実施態様では、抗体は、配列番号１３のＶＨ配列と配列番号１４のＶＬ配列とを含む。
一実施態様において、抗体は、ヒト定常領域を含む。一実施態様において、抗体は、ヒト定常領域を含む免疫グロブリン分子、特にヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含むＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号３９及び４０（それぞれヒトカッパ及びラムダのＣＬドメイン）、並びに配列番号４１（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に与えられる。いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号３９又は配列番号４０、特に配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域は、本明細書に記載されるようにＦｃドメインにおけるアミノ酸変異を含みうる。
一実施態様において、抗体はモノクローナル抗体である。
一実施態様において、抗体は、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１抗体である。一実施態様において、抗体は完全長抗体である。
一実施態様において、抗体は、Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ Ｆｃドメイン、さらに詳細にはＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。一実施態様において、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。抗体のＦｃドメインは、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに関して本明細書に記載される特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて含むことができる。
別の実施態様では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子の群より選択される抗体断片、特にＦａｂ分子である。別の実施態様では、抗体断片は、ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディである。
さらなる態様では、上記実施態様のいずれかによる抗体は、以下のセクションに記載される特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて含むことができる。
グリコシル化変異体
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を上昇又は低下させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一又は複数 グリコシル化部位が作成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に達成される。
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合するオリゴ糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合により一般に付着した分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32(1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含む。いくつかの実施態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は一定の改善された特性を有する抗体変異型を生成するために行われる。
一実施態様において、抗体変異体は、非フコシル化オリゴ糖、即ちＦｃ領域に（直接又は間接的に）付着したフコースを欠くオリゴ糖構造を有して提供される。このような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化された」オリゴ糖とも呼ばれる）は特に、二分岐オリゴ糖構造の幹の第１のＧｌｃＮＡｃに結合したフコース残基を欠くＮ－結合型オリゴ糖である。一実施態様においては、天然抗体又は親抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している抗体変異体が提供される。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は場合によっては約１００％（即ちフコシル化オリゴ糖は存在しない）である。非フコシル化オリゴ糖のパーセンテージは、例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって測定された、Ａｓｎ２９７に付着しているすべてのオリゴ糖の合計（例えば複合構造、ハイブリッド構造及び高マンノース構造）に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７とはＦｃ領域内のおよそ２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、抗体のわずかな配列変異に起因して、２９７位のおよそ±３アミノ酸上流又は下流に、即ち２９４位から３００位に位置する場合もある。Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加したこのような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合及び／又は改善されたエフェクター機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号；同第２００４／００９３６２１号を参照のこと。
低減したフコシル化を有する抗体を生成することのできる細胞株の例には、タンパク質フコシル化を欠くＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 （1986）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614-622 （2004）; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94（4）:680-688 （2006）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）、又はＧＤＰ－フコース合成又は輸送タンパク質が低減又は消失した細胞（例えば、米国特許出願公開第２００４２５９１５０号、同第２００５０３１６１３号、同第２００４１３２１４０号、同第２００４１１０２８２号を参照）が含まれる。
さらなる実施態様では、二分されたオリゴ糖を有する抗体変異体、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている抗体変異体が提供される。このような抗体変異体は、上述のように、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。このような抗体変異体の例は、例えば、Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 （1999）; Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 （2006）；国際公開第９９／５４３４号２；同第２００４／０６５５４０、同第２００３／０１１８７８号に記載されている。
Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号；同第１９９８／５８９６４号；及び同第１９９９／２２７６４号に記載されている。
システイン操作抗体変異体
特定の実施態様では、システイン操作抗体、例えば、抗体の一又は複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭａｂ」を作製することが望ましい。特定の実施態様では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位に生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー－薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用される。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号、同第８３０９３０号、同第７８５５２７５号、同第９０００１３０号、又は同第２０１６０４０８５６号に記載のように生成されうる。
抗体誘導体
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むようにさらに改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定しないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール並びにこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性のために製造上の利点を有しうる。ポリマーはいずれかの分子量のものであってよく、分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に付着するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが付着する場合、それらは同じ分子でも異なる分子でもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、その抗体誘導体が限定条件の下での治療に使用されるかどうかを含めた（但し、これらに限定されない）考慮事項に基づいて決定することができる。
別の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい非タンパク質部分と抗体とのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 （2005））。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体－非タンパク質部分の近位細胞が死滅させる温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
イムノコンジュゲート
本発明はまた、細胞傷害性剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素的に活性の毒素、若しくはその断片）、又は放射性同位体といった一又は複数の治療剤にコンジュゲート（化学的に結合）した、本明細書に記載される抗ＳＴＥＡＰ－１抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体が上述の治療剤の一又は複数にコンジュゲートしている抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。抗体は、典型的には、リンカーを用いて治療剤の一又は複数に接続される。治療剤及び治療薬並びにリンカーの例を含むＡＤＣ技術の概要は、Pharmacol Review 68:3-19 （2016）に明記されている。
別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン、及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）を含むがこれらに限定されない、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートしている、本明細書に記載の抗体を含む。
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートして放射性コンジュゲートを形成する、本明細書に記載の抗体を含む。種々の放射性同位体が、放射性コンジュゲートの製造のために入手可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が含まれる。検出のために用いられるとき、放射性コンジュゲートは、シンチグラフ検査用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られる）のためのスピン標識、例えばここでもヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含む。
抗体と細胞傷害性剤とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダート ＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えばビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン ２，６－ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta et al., Science 238:1098 （1987）に記載されているようにして調製することができる。炭素－１４－標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示的キレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞内で細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res.52:127-131 （1992）；米国特許第５２０８０２０号）が使用されうる。
本明細書のイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定しないが、（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されている、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋試薬を用いて調製されたコンジュゲートを明確に意図している。
多重特異性抗体
特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位、即ち異なる抗原上の異なるエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、多重特異性抗体は、三つ以上の結合特異性を有する。特定の実施態様では、結合特異性の一つはＳＴＥＡＰ－１に対するものであり、他の（二つ以上の）特異性は、他のいずれかの抗原に対するものである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＳＴＥＡＰ－１の二つ（以上）の異なるエピトープに結合することができる。多重特異性（例えば二重特異性）抗体はまた、ＳＴＥＡＰ－１を発現する細胞に対して細胞傷害性剤又は細胞を局在化させるために用いてもよい。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されないが、異なる特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組み換え共発現が含まれる（Milstein and Cuello, Nature305: 537 （1983））及び「ノブ・イン・ホール」エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号、及びAtwell et al., J. Mol. Biol. 270..26 （1997）参照）。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ－ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号参照）；二つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 （1985）を参照）；二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Ｋostelny et al., J. Immunol., 148（5）:1547-1553 （1992）及び国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照）；軽鎖の誤対合の問題を回避するための共通軽鎖技術を使用すること（例えば国際公開第９８／５０４３１号を参照）；二重特異性抗体断片を作製するため、「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 （1993）を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 （1994）を参照）；及び、例えば、Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 （1991）に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作製することができる。
例えば「オクトパス抗体」を含む三つ以上の抗原結合部位を有する操作抗体、又はＤＶＤ－Ｉｇも、本明細書に含まれる（例えば国際公開第２００１／７７３４２号及び同第２００８／０２４７１５号参照）。三つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、同第２０１０／１１２１９３号、同第２０１０／１３６１７２号、同第２０１０／１４５７９２号、同第２０１３／０２６８３１号に見ることができる。二重特異性抗体又はその抗原結合断片には、ＳＴＥＡＰ－１と、別の異なる抗原、又はＳＴＥＡＰ－１の二つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用性ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含まれる（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号及び国際公開第２０１５／０９５５３９号参照）。
同じ抗原特異性の一又は複数の結合アーム内のドメイン交差、即ち、ＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号及び同第２０１５／１５０４４７号参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５３号参照）又は完全Ｆａｂアーム（例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、同第２０１６／０１６２９９号、及びSchaefer et al, PNAS, 108 （2011） 1187-1191, 及びKlein at al., MAbs 8 （2016） 1010-20参照）を交換することによるドメイン交差を有する非対称形態の多重特異性抗体も提供されうる。非対称のＦａｂアームは、荷電又は非荷電アミノ酸変異をドメイン接触面に導入して正確なＦａｂペアリングを導くことにより操作することもできる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５を参照のこと。
多重特異性抗体の種々のさらなる分子フォーマットが、当技術分野で既知であり、本明細書に含まれる（例えば、Spiess et al., Mol Immunol 67 （2015） 95-106参照）。
やはり本明細書に含まれる特定の種類の多重特異性抗体は、標的細胞を殺すためにＴ細胞を再標的化するための、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のインバリアントな活性化成分、例えばＣＤ３と、標的細胞（例えば標的細胞）上の表面抗原とに同時結合するように設計された二重特異性抗体 である。したがって、特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、特に結合特異性の一方がＳＴＥＡＰ－１に対するものであり、他方がＣＤ３に対するものである二重特異性抗体である。
この目的のために有用でありうる二重特異性抗体フォーマットの例には、限定されないが、二つのｓｃＦｖ分子が可動性リンカーにより融合しているいわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）分子（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、同第２００５／０６１５４７号、同第２００７／０４２２６１号、及び同第２００８／１１９５６７号、Nagorsen and Baeuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 （2011））；ダイアボディ（Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 （1996））及びその誘導体、例えばタンデムダイアボディ（「ＴａｎｄＡｂ」；Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-56 （1999））；ダイアボディフォーマットに基づくがさらなる安定化のためにＣ末端ジスルフィド架橋を特徴として有する「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 （2010））、及び全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子であるいわゆるトリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）（Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 （2010）に概説）が含まれる。本明細書に含まれる特定のＴ細胞二重特異性抗体フォーマットは、国際公開第２０１３／０２６８３３号、同第２０１３／０２６８３９号、国際公開第２０１６／０２０３０９号；Bacac et al., Oncoimmunology 5（8） （2016） e1203498に記載されている。
ＳＴＥＡＰ－１と第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合分子
本発明は、二重特異性抗原結合分子、即ち二つの異なる抗原決定基（第１及び第２の抗原）に特異的に結合することのできる少なくとも二つの抗原結合部分を含む抗原結合分子も提供する。
本発明の特定の実施態様によれば、二重特異性抗原結合分子に含まれる抗原結合部分はＦａｂ分子（即ちそれぞれ可変及び定常ドメインを含む重鎖及び軽鎖から構成される抗原結合ドメイン）である。一実施態様において、第１及び／又は第２の抗原結合部分はＦａｂ分子である。一実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト分子である。特定の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト化分子である。また別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。
好ましくは、抗原結合部分の少なくとも一つはクロスオーバーＦａｂ分子である。このような修飾は、異なるＦａｂ分子由来の重鎖と軽鎖との誤対合を減少させ、それにより組み換え生成において本発明の二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を向上させる。本発明の二重特異性抗原結合分に有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメイン（それぞれＶＬ及びＶＨ）が交換されている。しかしながら、このようなドメイン交換によっても、二重特異性抗原結合分子の調製は、誤対合した重鎖と軽鎖間のいわゆるＢｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ型相互作用に起因する特定の副生成物を含みうる（Schaefer et al, PNAS, 108 （2011） 11187-11191参照）。異なるＦａｂ分子由来の重鎖と軽鎖の誤対合をさらに減少させ、したがって所望の二重特異性抗原結合分子の純度及び収率を向上させるために、反対の電荷を有する荷電アミノ酸を、第１の抗原（ＳＴＥＡＰ－１）に結合するＦａｂ分子（複数可）、又は第２の抗原（例えばＣＤ３といったＴ細胞活性化抗原）に結合するＦａｂ分子の、ＣＨ１及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置に導入することができる。これについては後述する。荷電修飾は、二重特異性抗原結合分子に含まれる従来のＦａｂ分子（複数可）（例えば図１Ａ－Ｃ、Ｇ－Ｊに示すような）、又は二重特異性抗原結合分子に含まれるＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子（複数可）（例えば図１Ｄ－Ｆ、Ｋ－Ｎに示すような）において行われる（但し両方で行われることはない）。特定の実施態様では、荷電修飾は、二重特異性抗原結合分子に含まれる従来のＦａｂ分子（複数可）（特定の実施態様において第１の抗原、即ちＳＴＥＡＰ－１に結合するもの）において行われる。
本発明による特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原（即ちＳＴＥＡＰ－１）と、第２の抗原（例えばＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３）とに同時結合することができる。一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＳＴＥＡＰ－１とＴ細胞活性化抗原に同時結合することにより、Ｔ細胞と標的細胞を架橋することができる。さらに詳細な実施態様では、このような同時結合は、標的細胞、特にＳＴＥＡＰ－１発現腫瘍細胞の溶解を引き起こす。一実施態様では、このような同時結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こす。他の実施態様では、このような同時結合は、活性化マーカーの増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、及び発現の群から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答を引き起こす。一実施態様では、ＳＴＥＡＰ－１への同時結合を含まない、Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３に対する二重特異性抗原結合分子の結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こさない。
一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を標的細胞へ再方向付けすることができる。特定の一実施態様では、前記再方向付けは、標的細胞によるＭＨＣ媒介性ペプチド抗原の提示及び／又はＴ細胞の特異性と無関係である。
特に、本発明の実施態様のいずれかによるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞はＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞、特にＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
第１の抗原結合部分
本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＳＴＥＡＰ－１（第１の抗原）に結合する少なくとも一の抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＳＴＥＡＰ－１に結合する二の抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。このような特定の一実施態様では、これら抗原結合部分の各々は、同じ抗原決定基に結合する。さらに詳細な実施態様では、これら抗原結合部分のすべては同一であり、即ちそれらは、本明細書に記載されるようにＣＨ１及びＣＬドメイン内に同じアミノ酸置換を含む（もしあれば）同じアミノ酸配列を含む。一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＳＴＥＡＰ－１に結合する二を超えない抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。
特定の実施態様では、ＳＴＥＡＰ－１に結合する抗原結合部分（複数可）は、従来のＦａｂ分子である。このような実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分（複数可）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬが、又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。
代替的実施態様では、ＳＴＥＡＰ－１に結合する抗原結合部分（複数可）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬが、又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。このような実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分（複数可）は、従来のＦａｂ分子である。
ＳＴＥＡＰ－１結合部分は、二重特異性抗原結合分子を標的部位へと、例えばＳＴＥＡＰ－１を発現する特殊な腫瘍細胞へと方向付けることができる。
科学的に明らかに不合理又は不可能でない限り、二重特異性抗原結合分子の第１の抗原結合部分は、ＳＴＥＡＰ－１に結合する抗体に関して本明細書に記載される特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
したがって、一態様において、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＳＴＥＡＰ－１であり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部部分、並びに（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分とを含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号７のＬＣＤＲ１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。
いくつかの実施態様では、第１の抗原結合部分はヒト化抗体（に由来するもの）である。一実施態様において、ＶＨは、ヒト化ＶＨである及び／又はＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様において、第１の抗原結合部分は、上記実施態様のいずれかにおけるＣＤＲを含み、さらにはアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一実施態様において、第１の抗原結合部分のＶＨは、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施態様において、第１の抗原結合部分は、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列と、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列とを含む。
一実施態様において、第１の抗原結合部分は、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３の群より選択されるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
一実施態様において、第１の抗原結合部分は、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３の群より選択されるＶＨ配列と、配列番号１４のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３のＶＨ配列と配列番号１４のＶＬ配列とを含む。
一実施態様において、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施態様において、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号３９及び４０（それぞれヒトカッパ及びラムダのＣＬドメイン）、並びに配列番号４１（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に与えられる。いくつかの実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号３９又は配列番号４０、特に配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、本明細書の「電荷修飾」の項に記載されるアミノ酸変異を含みうる、及び／又はクロスオーバーＦａｂ分子においては、一又は複数の（特に二つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含みうる。いくつかの実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号４１のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（特にＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」の項に記載されるアミノ酸変異を含みうる。
第２の抗原結合部分
本発明の二重特異性抗原結合分子は、第２の抗原（ＳＴＥＡＰ－１とは異なる）に結合する少なくとも一つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。
特定の実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬが、又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。このような実施態様では、第１の抗原（即ちＳＴＥＡＰ－１）に結合する抗原結合部分（複数可）は、好ましくは従来のＦａｂ分子である。二重特異性抗原結合分子に含まれるＳＴＥＡＰ－１に結合する複数の抗原結合部分、特にＦａｂ分子が存在する実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分は、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＳＴＥＡＰ－１に結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
代替的な実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。このような実施態様では、第１の抗原（即ちＳＴＥＡＰ－１）に結合する抗原結合部分（複数可）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ちＦａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬが、又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。二重特異性抗原結合分子に含まれる第２の抗原に結合する複数の抗原結合部分、特にＦａｂ分子が存在する実施態様では、ＳＴＥＡＰ－１に結合する抗原結合部分は、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原に結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
いくつかの実施態様では、第２の抗原はＴ細胞活性化抗原（「Ｔ細胞活性化抗原結合部分」又は「Ｔ細胞活性化抗原結合Ｆａｂ分子」とも呼ばれる）。特定の一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗原に対する特異的結合能を有する一を超えない抗原結合部分を含む。一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗原に対する一価の結合を提供する。
特定の実施態様では、第２の抗原はＣＤ３、特にヒトＣＤ３（配列番号２４）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号２５）、最も詳細にはヒトＣＤ３である。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、ヒト及びカニクイザルのＣＤ３に交差反応性（即ち、特異的に結合する）である。いくつかの実施態様では、第２の抗原は、ＣＤ３のエプシロンサブユニット（ＣＤ３エプシロン）である。
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１５のＨＣＤＲ１、配列番号１６のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７のＨＣＤＲ３と、配列番号１８のＬＣＤＲ１、配列番号１９のＬＣＤＲ２及び配列番号２０のＬＣＤＲ３とを含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１５のＨＣＤＲ１、配列番号１６のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１８のＬＣＤＲ１、配列番号１９のＬＣＤＲ２及び配列番号２０のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。
いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分はヒト化抗体（に由来するもの）である。一実施態様において、ＶＨは、ヒト化ＶＨである及び／又はＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、上記実施態様のいずれかにおけるＣＤＲを含み、さらにはアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列を含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列と、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列とを含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分のＶＨは、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合部分のＶＬは、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号２２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号２１のＶＨ配列と配列番号２２のＶＬ配列とを含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号３９及び４０（それぞれヒトカッパ及びラムダのＣＬドメイン）、並びに配列番号４１（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に与えられる。いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号３９又は配列番号４０、特に配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、本明細書の「電荷修飾」の項に記載されるアミノ酸変異を含みうる、及び／又はクロスオーバーＦａｂ分子においては、一又は複数の（特に二つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含みうる。いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号４１のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（特にＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」の項に記載されるアミノ酸変異を含みうる。
いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが、又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が、特に可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である（即ち、このような実施態様によれば、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変又は定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である）。このような一実施態様では、第１の（及び存在する場合は第３の）抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
一実施態様では、第２の抗原（例えばＣＤ３のようなＴ細胞活性化抗原）に結合する一を超えない抗原結合部分が、二重特異性抗原結合分子中に存在する（即ち、二重特異性抗原結合分子は第２の抗原に対する一価の結合を提供する）。
荷電修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、その中に含まれるＦａｂ分子に、特にそれらの結合アームの一つ（又は三つ以上の抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合、二つ以上）にＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベースの二重／多重特異性抗原結合分子の生成において生じうる、マッチしない重鎖との軽鎖の誤対合（Ｂｅｎｃｅ－Ｊｏｎｅｓ型副生成物）を減少させるうえで有効なアミノ酸置換を含むことができる（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／１５０４４７、特にその実施例も参照されたい。この特許文献を、参照によりその全体を本明細書に包含する）。望ましくない副産物、特にそれらの結合アームの一つにＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する二重特異性抗原結合分子に起こるＢｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ型副生成物と比較した場合の所望の二重特異性抗原結合分子の比率は、ＣＨ１及びＣＬドメイン中の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することに（本明細書では時に「荷電修飾」という）より改善することができる。
したがって、二重特異性抗原結合分子の第１及び第２の抗原結合部分の両方がＦａｂ分子であり、抗原結合部分の一方（特に第２の抗原結合部分）において、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているいくつかの実施態様では、
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、正の電荷を有するアミノ酸によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、負の電荷を有するアミノ酸によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）か；又は
ｉｉ）ｂ）による第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、正の電荷を有するアミノ酸によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つｂ）による第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、負の電荷を有するアミノ酸によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
二重特異性抗原結合分子は、ｉ）及びｉｉ）に記載の修飾の両方を含むことはない。ＶＨ／ＶＬ交換を有する抗原結合部分の定常ドメインＣＬとＣＨ１は、互いによって置き換えられない（即ち交換されないまま残る）。
具体的な一実施態様では，
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；又は
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
このような一実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらなる一実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらに詳細な一実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらに詳細な実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
特定の実施態様では、上記実施態様によるアミノ酸置換が、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１で行われる場合、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプのものである。
代替的に、上記実施態様によるアミノ酸置換は、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１の代わりに、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１で行われてもよい。このような特定の実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
したがって、一実施態様において、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらなる一実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
また別の実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
別の実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
特定の一実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＳＴＥＡＰ－１であり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、並びに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられている第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の一実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、１２３位のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の一実施態様では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
二重特異性抗原結合分子のフォーマット
本発明による二重特異性抗原結合分子の成分は、様々な構成で互いに融合することができる。例示的構成を図１に示す。
特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子に含まれる抗原結合部分はＦａｂ分子である。このような実施態様では、第１、第２、第３（など）の抗原結合部分は、本明細書において、それぞれ第１、第２、第３（など）のＦａｂ分子と呼ばれことがある。
一実施態様において、二重特異性抗原結合分子の第１及び第２の抗原結合部分は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している。特定の実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子である。このような一実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。別のこのような実施態様では、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している実施態様では、これに加えて、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とが、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合していてよい。
ＳＴＥＡＰ－１のような標的細胞抗原に特異的に結合することができる単一の抗原結合部分（例えばＦａｂ分子）を有する二重特異性抗原結合分子（例えば、図１Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌに示すような）は、特に高親和性抗原結合部分の結合に続いて標的細胞抗原の内部移行が予想される場合に有用である。このような場合、標的細胞抗原に特異的な一を超える抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内部移行を亢進し、それによりその利用可能性を低下させる。
しかしながら、他の場合には、標的細胞抗原に特異的な二以上の抗原結合部分（例えばＦａｂ分子）を含む二重特異性抗原結合分子（図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｍ又は１Ｎに示される実施例参照）を有することは、例えば標的部位へのターゲティングを最適化するため、又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために有利であろう。
したがって、特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３の抗原結合部分を含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、第１の抗原、即ちＳＴＥＡＰ－１に結合する。一実施態様では、第３の抗原結合部分はＦａｂ分子である。
一実施態様において、第３の抗原部分は第１の抗原結合部分と同一である。
科学的に明らかに不合理又は不可能でない限り、二重特異性抗原結合分子の第３の抗原結合部分は、第１の抗原結合部分及び／又はＳＴＥＡＰ－１に結合する抗体に関して本明細書に記載される特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
特定の一実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号６のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号７のＬＣＤＲ１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。
いくつかの実施態様では、第３の抗原結合部分はヒト化抗体（に由来するもの）である。一実施態様において、ＶＨは、ヒト化ＶＨである及び／又はＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様において、第３の抗原結合部分は、上記実施態様のいずれかにおけるＣＤＲを含み、さらにはアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分のＶＨは、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第３の抗原結合部分のＶＬは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３の群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列と、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列とを含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３の群より選択されるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３の群より選択されるＶＨ配列と、配列番号１４のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号１３のＶＨ配列と配列番号１４のＶＬ配列とを含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施態様において、第３の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号３９及び４０（それぞれヒトカッパ及びラムダのＣＬドメイン）、並びに配列番号４１（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に与えられる。いくつかの実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号３９又は配列番号４０、特に配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、本明細書の「電荷修飾」の項に記載されるアミノ酸変異を含みうる、及び／又はクロスオーバーＦａｂ分子においては、一又は複数の（特に二つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含みうる。いくつかの実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号４１のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（特にＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」の項に記載されるアミノ酸変異を含みうる。
特定の実施態様では、第３及び第１の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第３の抗原結合部分は第１の抗原結合部分と同一である。したがって、このような実施態様では、第１及び第３の抗原結合部分は、同じ重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、同じドメイン構成を有する（即ち、従来の又はクロスオーバー））。さらに、このような実施態様では、第３の抗原結合部分は、存在する場合、第１の抗原結合部分と同じアミノ酸置換を含む。例えば、本明細書に「電荷修飾」として記載されるアミノ酸置換は、第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分の各々の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われる。代替的に、前記アミノ酸置換は、（特定の実施態様ではＦａｂ分子でもある）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われてもよいが、第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１では行われない。
第１の抗原結合部分と同様に、第３の抗原結合部分は特に従来のＦａｂ分子である。しかしながら、第１及び第３の抗原結合部分がクロスオーバーＦａｂ分子である（且つ第２の抗原結合部分が従来のＦａｂ分子である）実施態様も考慮される。したがって、特定の実施態様では、第１及び第３の抗原結合部分はそれぞれ従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬが、又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。一実施態様において、第１及び第３の抗原結合部分はそれぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
第３の抗原結合部分が存在する場合、特定の実施態様では、第１及び第３の抗原部分はＳＴＥＡＰ－１に結合し、第２の抗原結合部分は第２の抗原、特にＴ細胞活性化抗原、さらに詳細にはＣＤ３、最も詳細にはＣＤ３エプシロンに結合する。
特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットは、安定した会合をすることができる。
本発明による二重特異性抗原結合分子は、異なる構成を有することができる、即ち第１、第２の（及び任意選択的に第３の）抗原結合部分は、互いに、及びＦｃドメインに、異なる方法で融合していてよい。これらは互いに直接、又は、好ましくは一又は複数の適切なペプチドリンカーを介して、融合することができる。Ｆａｂ分子の融合先がＦｃドメインのサブユニットのＦａｂ分子のＮ末端である場合、典型的には免疫グロブリンのヒンジ領域を介している。
いくつかの実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端又はＦｃドメインのサブユニットの他方のＮ末端に融合している。特定のこのような実施態様では、前記第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は本明細書に記載れるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬが、又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のこのような実施態様では、前記第１のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。
一実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｇ及び１Ｋに模式的に示されている（これら実施例における第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖とは、さらに互いに融合していてよい。
別の実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合している。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第１及び第２のＦａｂ分子はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットのうちの一つのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ａ及び１Ｄに模式的に示されている（これら実施例では第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。第１及び第２のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の一実施態様では、第１及び第２のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の一実施態様では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１のＦｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
いくつかの実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端又は（上述のように）Ｆｃドメインのサブユニットの他方のＮ末端に融合している。特定のこのような実施態様では、前記第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は本明細書に記載れるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬが、又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のこのような実施態様では、前記第１のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。
一実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、並びに任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｈ及び１Ｌに模式的に示されている（これら実施例では第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖とは、さらに互いに融合していてよい。
いくつかの実施態様では、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子、が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。特定のこのような実施態様では、前記第１及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ従来のＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は本明細書に記載れるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬが、又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のこのような実施態様では、前記第１及び第３のＦａｂ分子はそれぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。
特定のこのような実施態様では、第２及び第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｂ及び１Ｅ（これら実施例では第２の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）と、図１Ｊ及び１Ｎ（これら実施例では第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に模式的に示されている。第２及び第３のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の一実施態様では、第２及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の一実施態様では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１のＦｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖とは、さらに互いに融合していてよい。
別のこのような実施態様では、第１及び第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｃ及び１Ｆ（これら実施例では第２の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）、図１Ｉ及び１Ｍ（これら実施例では第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に模式的に示されている。第１及び第３のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合することができる。特定の一実施態様では、第１及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の一実施態様では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１のＦｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖とは、さらに互いに融合していてよい。
Ｆａｂ分子がＦａｂ重鎖のＣ末端において免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインのサブユニットの各々のＮ末端に融合している二重特異性抗原結合分子の構成においては、二つのＦａｂ分子、ヒンジ領域及びＦｃドメインは、本質的に免疫グロブリン分子を形成する。特定の実施態様では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。さらに特定の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。さらに詳細な実施態様では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。他の実施態様では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一実施態様において、免疫グロブリンはヒト定常領域、特にヒトＦｃ領域を含む。
本発明の二重特異性抗原結合分子のいくつかでは、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合している。第１及び第２のＦａｂ分子の構成に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合しうるか、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合しうる。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合はさらに、マッチしないＦａｂ重鎖とＦａｂ軽鎖の誤対合を低減し、また本発明の二重特異性抗原結合分子のいくつかの発現に必要なプラスミドの数を低減する。
抗原結合部分は、Ｆｃドメインに対して、又は互いに、直接又はペプチドリンカーを介して融合していてよく、一又は複数のアミノ酸、典型的には約２～２０のアミノ酸を含む。ペプチドリンカーは当分野において既知であり、本願明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又は４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は通常１から１０、典型的には２から４の整数である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５のアミノ酸長を、一実施態様では５から１００、さらなる実施態様では１０から５０のアミノ酸長を有する。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ［式中、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）］であり、一実施態様では、ｘ＝４、ｎ＝２又は３であり、さらなる実施態様ではｘ＝４、ｎ＝２である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合させるための特定の適切なペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖を接続するために適切な例示的ペプチドリンカーは、配列（Ｄ）－（Ｇ４Ｓ）２（配列番号３７及び３８）を含む。別の適切なこのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。加えて、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含むことができる。特にＦａｂ分子は、ＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に融合している場合には、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、追加のペプチドリンカーを用いて又は用いずに、融合することができる。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含んでいる）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、第１のＦａｂ部分のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））とを含んでいる。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））とを含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、Ｆｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。
これら実施態様のいくつかでは、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。これら実施態様のその他では、二重特異性抗原結合分子は、必要に応じて、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＬ（１）－ＣＬ（１））、又は第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。
これらの実施態様による二重特異性抗原結合分子はさらに、（ｉ）Ｆｃドメインのサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインのサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））とを含みうる。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ端末ペプチド結合を共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、Ｆｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。
これら実施態様のいくつかでは、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。これら実施態様のその他では、二重特異性抗原結合分子は、必要に応じて、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＬ（１））、又は第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が 第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。
これらの実施態様による二重特異性抗原結合分子はさらに、（ｉ）Ｆｃドメインのサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインのサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））とを含みうる。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子はＦｃドメインを含まない。特定のこのような実施態様では、前記第１のＦａｂ分子と、存在する場合第３のＦａｂ分子は、各々が従来のＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は本明細書に記載れるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬが、又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のこのような実施態様では、前記第１のＦａｂ分子と、存在する場合第３のＦａｂ分子は、各々がクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。
このような一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、本質的に第１及び第２の抗原結合部分からなり、任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーを含み、ここで第１及び第２の抗原結合部分は共にＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｏ及び１Ｓに模式的に示されている（これら実施例では第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。
別のこのような実施態様では、二重特異性抗原結合分子は本質的に第１及び第２の抗原結合部分からなり、任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーを含み、ここで第１及び第２の抗原結合部分は共にＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｐ及び１Ｔに模式的に示されている（これら実施例では第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。
いくつかの実施態様では、第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、二重特異性抗原結合分子は、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合する。特定のこのような実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２、及び第３のＦａｂ分子から、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｑ及び１Ｕ（これら実施例では、第２の抗原結合ドメインがＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び抗原結合部分の各々が従来のＦａｂ分子である）、又は図１Ｘ及び１Ｚ（これら実施例では、第２の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分の各々がＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）。
いくつかの実施態様では、第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、二重特異性抗原結合分子は、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＮ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合する。特定のこのような実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２、及び第３のＦａｂ分子から、及び任意選択的に一又は複数のペプチドリンカーからなり、第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＮ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。このような構成は、図１Ｒ及び１Ｖ（これら実施例では、第２の抗原結合ドメインがＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び抗原結合部分の各々が従来のＦａｂ分子である）、又は図１Ｗ及び１Ｙ（これら実施例では、第２の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分の各々がＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２）ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（３）－ＣＨ１（３））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第２のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（３）－ＣＨ１（３））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第１のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（即ち第３のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第１のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（即ち第３のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（３）－ＣＬ（３））ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））ポリペプチドをさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第３のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第１のＦａｂ分子が、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第３のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（即ち第１のＦａｂ分子が、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＨ（３）－ＣＬ（３）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２））ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））ポリペプチドをさらに含む。
一実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＳＴＥＡＰ－１であり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、
ｂ）Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する、第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが、又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン；
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）による第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）による第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）による第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）による第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合している。
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＳＴＥＡＰ－１であり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、
ｂ）Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する、第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが、又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１の抗原に結合する、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；並びに
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）による第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２の抗原結合部分及びｃ）による第３の抗原結合部分の各々が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）による第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）による第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）による第１の抗原結合部分及びｃ）による第３の抗原結合部分の各々が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合している。
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＳＴＥＡＰ－１であり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、
ｂ）Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する、第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが、又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン；
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
（ｉ）ａ）による第１の抗原結合部分及びｂ）による第２の抗原結合部分の各々が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合している。
本発明による二重特異性抗原結合分子の様々な構成のすべてにおいて、本明細書に記載されるアミノ酸置換は、存在する場合、第１及び（存在する場合）第３の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメイン、又は第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインに存在しうる。好ましくは、そのような置換は、第１及び（存在する場合）第３の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインに存在する。本発明の概念によれば、本発明に記載されるアミノ酸置換が第１（及び存在する場合第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる場合、そのようなアミノ酸置換はいずれも第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子では行われない。逆に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子で行われる場合、そのようなアミノ酸置換はいずれも第１（及び存在する場合第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子では行われない。アミノ酸置換は、特に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子を含む二重特異性抗原結合分子において行われる。
特に本明細書に記載されるアミノ酸置換が第１（及び存在する場合第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる、本発明による二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様では、第１（及び存在する場合第３）のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプである。特に本明細書に記載されるアミノ酸置換が第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子で行われる、本発明による二重特異性抗原結合分子の他の実施態様では、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプである。いくつかの実施態様では、第１（及び存在する場合第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプである。
一実施態様において、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＳＴＥＡＰ－１であり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、
ｂ）Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する、第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン；
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ａ）による第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も詳細にはアルギニン（Ｒ）によって）、且つａ）による第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
ここで、
（ｉ）ａ）による第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）による第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）による第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）による第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合している。
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＳＴＥＡＰ－１であり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、
ｂ）Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する、第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１の抗原に結合する、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；並びに
ｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン；
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ａ）による第１の抗原結合部分及びｃ）による第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も詳細にはアルギニン（Ｒ）によって）、且つａ）による第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
ここで、
（ｉ）ａ）による第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２の抗原結合部分及びｃ）による第３の抗原結合部分の各々が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）ｂ）による第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）による第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）による第１の抗原結合部分及びｃ）による第３の抗原結合部分の各々が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合している。
別の実施態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＳＴＥＡＰ－１であり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、
ｂ）Ｔ細胞活性化抗原、特にＣＤ３、さらに詳細にはＣＤ３エプシロンである第２の抗原に結合する、第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン；
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ａ）による第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も詳細にはアルギニン（Ｒ）によって）、且つａ）による第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
（ｉ）ａ）による第１の抗原結合部分及びｂ）による第２の抗原結合部分の各々が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合している。
上記実施態様のいずれによっても、二重特異性抗原結合分子の成分（例えば、Ｆａｂ分子、Ｆｃドメイン）は、直接融合するか、又は、本明細書に記載されるか若しくは当技術分野で既知である様々なリンカー、特に一又は複数のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合されうる。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれ、ここでｎは通常１から１０、典型的には２から４の整数である。
特定の実施態様では、本発明は、
ａ）ＳＴＥＡＰ－１である第１の抗原に結合する、第１及び第３の抗原結合部分であって；第１及び第２の抗原結合部分の各々が配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む（従来の）Ｆａｂ分子である、第１及び第３の抗原結合部分；
ｂ）ＣＤ３である第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である第２の抗原結合部分；
ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン；
を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、
ここで、
ａ）による第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（最も詳細にはアルギニン（Ｒ）によって）、且つａ）による第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
さらに、
ａ）による第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）による第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）による第２の抗原結合部分及びａ）による第３の抗原結合部分の各々が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）によるＦｃドメインのサブユニットの一つのＮ末端に融合している。
本発明のこの態様による一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられ（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的に３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本発明のこの態様によるさらなる実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｓ３５４Ｃ）か、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｅ３５６Ｃ）（特に３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基によって置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本発明のこの態様によるまた別の実施態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの各々において、２３４位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられ（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられ（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基がグリシン残基によって置き換えられる（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本発明のこの態様によるまた別の実施態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
特定の具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号３２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号３５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特に具体的な別の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
別の具体的な実施様態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号２８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号３５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。別の具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
また別の具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号３０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号３５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。別の具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号３４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
Ｆｃドメイン
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。二重特異性抗原結合分子に関連して本明細書に記載されるＦｃドメインの特徴は、本発明の抗体に含まれるＦｃドメインに等しく当てはまる。
二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインはダイマーであり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの二つのサブユニットは、互いに安定に会合することができる。一実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、一を超えないＦｃドメインを含む。
一実施態様において、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインはＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインである。別の実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。さらに詳細な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、ＩｇＧ４のＦｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のｉｎ ｖｉｖｏでのＦａｂアーム交換を低減する（Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91(2010)参照）。さらなる特定の一実施態様では、ＦｃドメインはヒトＦｃドメインである。さらに詳細な実施態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的配列は、配列番号３６に提示されている。
ヘテロ二量体化を促すＦｃドメインの修飾
本発明による二重特異性抗原結合分子は複数の異なる抗原結合部分を含み、これらはＦｃドメインの二つのサブユニットの一方又は他方に融合することができ、したがってＦｃドメインの二つのサブユニットは通常、二つの非同一なポリペプチド鎖に含まれている。これらポリペプチドの組み換え同時発現とそれに続く二量体化は、二つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。したがって、組み換え生成における二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善するために、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに所望のポリペプチドの会合を促す修飾を導入することが有利であろう。
即ち、特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促す修飾を含んでいる。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの二つのサブユニット間においてタンパク質－タンパク質相互作用が最大である部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインである。したがって、一実施態様では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内で行われる。
ヘテロダイマー化を実施するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおける修飾のための複数の手法が存在し、それらについては例えば国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に詳細な記載がある。典型的には、そのような手法のすべてにおいて、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは共に、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）がそれ自体ともはやホモダイマー化することがなく、相補的に改変された他のＣＨ３ドメインとヘテロダイマー化するように、（よって第１と第２のＣＨ３ドメインがヘテロダイマー化し、二つの第１のＣＨ３ドメイン又は二つの第２のＣＨ３ドメインの間にホモダイマーが形成されないように）共に相補的に改変される。重鎖ヘテロダイマー化の改善のためのこれら異なる手法は、重鎖／軽鎖誤対合及びＢｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ型副生成物を低減する二重特異性抗原結合分子における重鎖－軽鎖修飾（例えば、一の結合アームにおけるＶＨとＶＬの交換／置き換え、及びＣＨ１／ＣＬ接触面における、反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）と組み合わせた異なる代替法として考慮される。
特定の一実施態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する前記修飾は、いわゆる「ノブイントゥホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」修飾であり、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を、それぞれ含んでいる。
ノブイントゥホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 （1996） and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 （2001）に記載されている。通常、方法は、***がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に***（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロ二量体形成を促進し、且つホモ二量体形成を妨害することを含む。***は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖をそれよりも大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。***と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
このように、特定の一実施態様では、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な***が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の***を配置可能な空洞が生成される。
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群より選択される。
***と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。
特定の一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）のＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられる（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
またさらなる実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｓ３５４Ｃ）か、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｅ３５６Ｃ）（特に３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基によって置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。これら二つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの二つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、さらにダイマーを安定させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 （2001））。
特定の一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
特定の実施態様では、第２の抗原（例えばＴ細胞活性化抗原）に結合する抗原結合部分は、（任意選択的に、ＳＴＥＡＰ－１に結合する第１の抗原結合部分及び／又はペプチドリンカーを介して）Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含む）に融合する。理論に縛られることを望まないが、Ｔ細胞活性化抗原といった第２の抗原に結合する抗原結合部分の、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットへの融合は、Ｔ細胞活性化抗原に結合する二つの抗原結合部分を含む抗原結合分子の生成を（さらに）最小化するであろう（ノブ含有ポリペプチドの立体的衝突）。
ヘテロダイマー化を実施するためのＣＨ３修飾の他の技術が、本発明による代替法として考慮されており、例えば国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されている。
一実施態様では、ＥＰ１８７０４５９に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。この手法は、Ｆｃドメインの二つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン接触面内の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づいている。本発明の二重特異性抗原結合分子の一の好ましい実施態様は、（Ｆｃドメインの）二つのＣＨ３ドメインの一方におけるアミノ酸変異体Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他方におけるアミノ酸変異体Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
別の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、さらにはＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅを、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
別の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むか、又は前記二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖと、さらにＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（すべてＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一実施態様では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはさらなるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅより選択されるアミノ酸変異（好ましくはＬ３６８Ｅ）をさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一実施態様では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる一実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０、又はＫ３９２の位置に、例えばａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ、又はＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅから選択される、さらなるアミノ酸変異を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる一実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒをさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一実施態様では、例えば３６８及び４０９からなる群より選択される位置にアミノ酸修飾を用いる、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されたヘテロダイマー化の手法が代替的に使用される（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一実施態様では、上述のノブイントゥホール技術をやはり使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されるヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ｔを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一実施態様では、二重特異性抗原結合分子又はそのＦｃドメインはＩｇＧ２サブクラスであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。
代替的な一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促す修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。通常、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に望ましくなくなり、ヘテロ二量体化が静電的に望ましくなるような、荷電アミノ酸残基による二つのＦｃドメインサブユニットの接触面における一又は複数のアミノ酸残基の置き換えを伴う。このような一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負の電荷を有するアミノ酸（例えばグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）でのＫ３９２又はＮ３９２のアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメインは、正の電荷を有するアミノ酸（例えばリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ、又はＥ３５７Ｋ、さらに好ましくはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）でのＤ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６、又はＥ３５７アミノ酸の置換を含む。さらなる一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負の電荷を有するアミノ酸（例えばグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）でのＫ４０９又はＲ４０９のアミノ酸置換をさらに含む。さらなる一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負の電荷を有するアミノ酸（例えばグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ））でのＫ４３９及び／又はＫ３７０のアミノ酸置換を、さらに又は代替的に含む（すべてＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
またさらなる一実施態様では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されたヘテロダイマー化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、及びＫ２９２Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらに別の実施態様では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されたヘテロダイマー化手法を代替的に使用することができる。
一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低減するＦｃドメインの修飾
Ｆｃドメインは、二重特異性抗原結合分子（又は抗体）に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような特性には、標的組織中への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び望ましい組織－血液分布比が含まれる。しかしながら、同時に、Ｆｃドメインは、好ましい抗原保有細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞への二重特異性抗原結合分子（又は抗体）の望ましくないターゲティングの原因となることがある。さらには、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出の原因となりえ、サイトカイン放出は、Ｔ細胞活性化特性（例えば、第２の抗原結合部分がＴ細胞活性化抗原に結合する二重特異性抗原結合分子の実施態様において）、及び二重特異性抗原結合分子の長い半減期と組み合わさって、サイトカイン受容体の過剰な活性化を招き、全身投与されると重い副作用性を引き起こす。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体保有）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の破壊の可能性により、二重特異性抗原結合分子（特に第２の抗原結合部分がＴ細胞活性化抗原に結合する二重特異性抗原結合分子）の有効性をさらに低下させることすらある。
したがって、特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、天然のＩｇＧ１のＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する。このような一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）は、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、さらに好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を呈する、及び／又は、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、さらに好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満の、エフェクター機能を呈する。一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない、及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌の群から選択される一又は複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して実質的に同様の、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を呈する。実質的に同様のＦｃＲｎに対する結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）が、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）の約７０％、特に約８０％、さらには特に約９０％を上回る、ＦｃＲｎに対する結合親和性を呈するとき、達成される。
特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、非改変型Ｆｃドメインと比較して小さな、Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を有するように改変される。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ一又は複数のアミノ酸変異がＦｃドメインの二つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様では、アミノ酸変異はＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる。一実施態様では、アミノ酸変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低下させる。ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる複数のアミノ酸変異が存在する実施態様では、これらアミノ酸変異の組合せにより、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性が、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、又は少なくとも５０分の１まで低下する。一実施態様では、改変されたＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子は、非改変型Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子と比較して、２０％未満、特に１０％未満、さらには５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を呈する。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これら受容体の各々への結合は低減する。いくつかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も低減する。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、即ち、前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）が、Ｆｃドメインの非改変型形態（又はＦｃドメインの前記非改変型形態を含む二重特異性抗原結合分子）のＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％を上回る親和性を呈するとき、達成される。Ｆｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％、及び場合によっては約９０％を上回る親和性を呈しうる。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、非改変型Ｆｃドメインと比較してエフェクター機能が低下するように改変される。エフェクター機能の低下は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、標的結合抗体の架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの一又は複数を含むことができる。一実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低減、ＡＤＣＣの低減、ＡＤＣＰの低減、及びサイトカイン分泌の低減からなる群より選択される一又は複数である。特定の一実施態様では、エフェクター機能の低下はＡＤＣＣの低減である。一実施態様では、低減したＡＤＣＣは、非改変型Ｆｃドメイン（又は非改変型Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）によって誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
一実施態様では、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸の変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。一実施態様では、ＦｃドメインはＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。具体的な実施態様では、アミノ酸置換はＰ３２９Ａ又は Ｐ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９の位置にアミノ酸置換を、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。具体的な実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５の位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらに詳細な実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。具体的には、特定の実施態様において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み、即ちＦｃドメインの第１及び第２のサブユニットの各々において、２３４位のロイシン残基はアラニン残基で置き換えられ（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基はアラニン残基で置き換えられ（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基はグリシン残基により置き換えられる（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
このような一実施態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（並びに補体）結合をほぼ完全に無効にする。国際公開第２０１２／１３０８３１号には、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能といったその特性を決定する方法も記載されている。
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を呈する。よって、いくつかの実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４のＦｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。Ｆｃ受容体に対するその結合親和性及び／又はそのエフェクター機能をさらに低下させるために、一実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｌ２３５位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。特定の実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＩｇＧ４ Ｆｃドメインの変異及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
特定の実施態様では、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈するＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインであるか、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
特定の実施態様ではＦｃドメインのＮグリコシル化は排除されている。このような一実施態様では、ＦｃドメインはＮ２９７位におけるアミノ酸置換、特にアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）酸によりアスパラギンを置き換えるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本明細書及び国際公開第２０１２／１３０８３１号において記載されるＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の低下を有するＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の一又は複数の置換を有するものも含む（米国特許第６７３７０５６号）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含め、アミノ酸位２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの二以上に置換を有するＦｃ変異を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
変異Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の削除、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ器具（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準の器具類を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、このようなＦｃ受容体は組み換え発現により得ることができる。代替的に、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を用いて評価してもよい。
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当技術分野で既知の方法により測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 （1986）及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 （1985）；米国特許第５８２１３３７号；Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 （1987）に記載されている。或いは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。或いは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 （1998）に開示されるように、例えば動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。
いくつかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。したがって、エフェクター機能が低下するようにＦｃドメインが改変されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイが、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子がＣ１ｑに結合できるかどうか、それによりＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために実行されうる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 （1996）; Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 （2003）；及びCragg and Glennie, Blood 103:2738-2743 （2004）を参照）。
ＦｃＲｎ結合、及びｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス／半減期の決定も、当分野で既知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al.、Int’l. Immunol. 18（12）:1759-1769 （2006）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照）。
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を提供する。いくつかの実施態様において、前記断片は抗原結合断片である。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドは、抗体又は二重特異性抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は同時発現される複数（例えば、二以上）のポリヌクレオチドとして発現されうる。同時発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能性の抗体又は二重特異性抗原結合分子を形成することができる。例えば、抗体又は二重特異性抗原結合分子の軽鎖部分は、抗体又は二重特異性抗原結合分子の重鎖を含む抗体又は二重特異性抗原結合分子の部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされうる。同時発現されるとき、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して抗体又は二重特異性抗原結合分子を形成することができる。別の例では、二つのＦｃドメインサブユニットの一方び任意選択的に一又は複数のＦａｂ分子（の一部）を含む抗体又は二重特異性抗原結合分子の部分は、二つのＦｃドメインサブユニットの他方及び任意選択的にＦａｂ分子（の一部）を含む抗体又は二重特異性抗原結合分子の部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされうる。同時発現されるとき、Ｆｃドメインサブユニットは会合してＦｃドメインを形成する。
いくつかの実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される、本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子全体をコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される、本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態の、ＲＮＡである。本発明のＲＮＡは単鎖又は二本鎖である。
組み換え法
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固体相合成）又は組み換え生成によって得ることができる。組み換え生成のために、例えば上述したように、抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組み換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏでの組み換え／遺伝子組み換えを含む。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. （1989）;及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y （1989）に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチド（即ち、コード化領域）が、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合するようにクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード化領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード化領域の一部ではない。二以上のコード化領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード化領域を含んでいてもよいし、二以上のコード化領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合した又は融合していない異種コード化領域をコードしうる。異種コード化領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード化領域が、一又は複数の調節配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、同調節配列と結合するときである。（ポリペプチドコード化領域及びそれに結合するプロモーターのような）二つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び二つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現調節配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるといえる。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン－Ａと連動した即初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ－βグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来の要素（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットは、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端反転型配列（ＩＴＲ）などの染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード化領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード化領域と結合させることができる。例えば、抗体又は二重特異性抗原結合分子の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする核酸の上流に配置されうる。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又はそれに作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体が使用されうる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
後の精製を容易にするために使用されうる（例えば、ヒスチジンタグ）又は抗体又は二重特異性抗原結合分子の標識化における補助のために使用されうる短タンパク質配列をコードするＤＮＡは、抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチドの中又は末端に含まれうる。
さらなる実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。そのような一実施態様において、宿主細胞は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードする一又は複数のポリヌクレオチドを含む一又は複数のベクターを含む（例えばそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、本発明の抗体若しくは二重特異性抗原結合分子又はその断片を生成するように改変できるいずれかの種類の細胞系を指す。抗体又は二重特異性抗原結合分子の複製及び発現補助に適切な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量の抗体又は二重特異性抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌細胞のペーストから単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 （2004）,及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 （2006）を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生成に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 （1977）に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 （1980）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 （1982）に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 （1980））；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 （B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ）, pp. 255-268 （2003）を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞を含み、さらにはトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内部に含まれる細胞を含む。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖の他方も発現するように改変することができる。
一実施態様において、本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子を生成する方法が提供され、この方法は、抗体又は二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で、本明細書に与えられるように、抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、任意選択的に宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体又は二重特異性抗原結合分子を回収することとを含む。
本発明の二重特異性抗原結合分子（又は抗体）の成分は、遺伝的に互いに対して融合することができる。二重特異性抗原結合分子は、その成分が互いに直接的に、又はリンカー配列を介して間接的に融合するように、設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。二重特異性抗原結合分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書に提供される。必要に応じて、融合の個々の成分を分離するための切断部位を取り込むために、追加的配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列も含めることができる。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は通常、少なくとも、抗原決定基に結合することのできる抗体可変領域を含む。可変領域は、天然に又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、且つそのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988参照）。非天然に存在する抗体は、固体相－ペプチド合成を使用して構築されるか、組み換え的に生成されるか（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）によって得ることができる。
あらゆる動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域を、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子に用いることができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものでありうる。抗体又は二重特異性抗原結合分子がヒトでの使用を意図する場合、抗体の定常領域がヒトに由来する抗体のキメラ形態を使用することができる。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体も、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それら方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴う又は伴わないヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片で「覆い隠す（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」ことが含まれる。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えばAlmagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 （2008）にて総説されており、さらにRiechmann et al., Nature332:323-329 （1988）; Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 （1989）、米国特許第５８２１３３７号、第７５２７７９１号、第６９８２３２１号、及び第７０８７４０９号、Kashmiri et al., Methods 36:25-34 （2005）（特異性決定領域（ＳＤＲ）のグラフティングを記述）、Padlan, Mol. Immunol.28:489-498 （1991）（「リサーフェシング」を記述）、Dall’Acqua et al., Methods36:43-60 （2005）（「ＦＲシャッフリング」を記述）、並びにOsbourn et al., Methods 36:61-68 （2005）及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 （2000）（ＦＲシャッフリングに対する「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。ヒト化に用いることのできるヒトフレームワーク領域には、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al., J. Immunol. 151:2296 （1993）を参照）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 （1992）;及びPresta et al., J. Immunol., 151:2623 （1993）を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒトの生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 （2008）を参照）；及びＦＲライブラリースクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 （1997）及び Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 （1996）を参照）が含まれる。
ヒト抗体は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて生成することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 （2001） 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 （2008）に記載されている。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生成するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによって調製することができる。このような動物は、典型的には内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するか若しくは動物の染色体にランダムに組み込まれているヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべて又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Lonberg, Nat. Biotech.23:1117-1125 （2005）を参照。例えばＸＥＮＯマウスＴＭ技術を記載している米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号、ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号、Ｋ－Ｍ マウス（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号、及びＶｅｌｏｃｉマウス（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。このような動物により生成されるインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに改変されうる。
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の生成のためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記述されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 （1984）; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 （Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）; and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 （1991）を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体は、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 （2006）にも記載されている。さらなる方法は、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26（4）:265-268 （2006）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載）に記載されるものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20（3）:927-937 （2005） 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27（3）:185-91 （2005）にも記載されている。
ヒト抗体は、本明細書に記載されるように、ヒト抗体ライブラリーからの単離によって生成されてもよい。
本発明に有用な抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法は、例えば、Lerner et al. in Nature Reviews 16:498-508 （2016）に概説がある。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作成して所望の結合特性を有する抗体のそのようなライブラリーをスクリーニングするための種々の方法が、当技術分野で既知である。このような方法は、例えば、Frenzel et al. in mAbs8:1177-1194 （2016）; Bazan et al. in Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 （2012） 及びZhao et al. in Critical Reviews in Biotechnology36:276-289 （2016） 並びにHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology178:1-37 （O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001） 及びMarks and Bradbury in Methods in Molecular Biology 248:161-175 （Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003）に概説がある。
特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングし、ファージライブラリーにランダムに再結合させ、その後、Winter et al. in Annual Review of Immunology 12: 433-455 （1994）に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片として表示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代替的に、Griffiths et al. in EMBO Journal 12: 725-734 （1993）に記載されるように、ナイーブなレパートリーを、いかなる免疫感作も無く、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対し、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローニングすることができる。最後に、Hoogenboom and Winter in Journal of Molecular Biology 227: 381-388 （1992）によって記載されているように、幹細胞由来の再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて可変性に富むＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの再配列を達成することにより、ナイーブライブラリーを合成的に作成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載している特許公開には、例えば：米国特許第５７５０３７３号；同第７９８５８４０号；同第７７８５９０３号及び同第８６７９４９０号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０２３７７６４号及び同第２００７／０２９２９３６号が含まれる。コンビナトリアルライブラリーを一又は複数の所望の活性を有する抗体についてスクリーニングするための当技術分野で既知の方法のさらなる例には、リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ、並びに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞での抗体のディスプレイ及び選択のための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイのための方法は、例えば、Scholler et al. in Methods in Molecular Biology 503:135-56 （2012） 及びCherf et al. in Methods in Molecular biology1319:155-175 （2015） 、並びにZhao et al. in Methods in Molecular Biology889:73-84 （2012）に概説がある。リボソームディスプレイのための方法は、例えば、He et al. in Research25:5132-5134 （1997） 及びHanes et al. in PNAS 94:4937-4942 （1997）に記載されている。
本明細書で記載のように調製される抗体又は二重特異性抗原結合分子は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、抗体又は二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用されうる。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、基本的に実施例に記載されるように抗体又は二重特異性抗原結合分子を単離するために使用されうる。抗体又は二重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定されうる。
アッセイ
本明細書で提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子が、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、その物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特徴づけされる。
アフィニティーアッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対する抗体又は二重特異性抗原結合分子の親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準器具と、組み換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対する抗体又は二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、評価することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明的且つ例示的な一実施態様は、以下で説明される。
一実施態様によれば、ＫＤは、２５ ℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００マシン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
Ｆｃ部分とＦｃ受容体との相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグを付した組み換えＦｃ受容体を、ＣＭ５チップ上に固定化された抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）により捕捉し、二重特異性コンストラクトを被分析物として使用する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、供給業者の指示書に従ってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ抗体を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で４０μｇ／ｍｌに希釈した後、結合したタンパク質のおよそ６５００反応単位（ＲＵ）を達成するために５μｌ／分の流速で注入する。リガンドの注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。その後、Ｆｃ受容体を４又は１０ｎＭで６０秒間捕捉する。反応速度測定のため、抗体又は二重特異性抗原結合分子の４倍の連続希釈物（５００ｎＭ～４０００ｎＭの）を、２５℃のＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ｐＨ７．４）に流速３０μｌ／分で１２０秒間注入する。
標的抗原に対する親和性を決定するため、抗体又は二重特異性抗原結合分子を、抗Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ抗体について記載したように、活性化されたＣＭ５－センサーチップ表面上に固定化された抗ヒトＦａｂ特異性抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により捕捉する。結合したタンパク質の最終的な量は、約１２０００ＲＵである。抗体又は二重特異性抗原結合分子は、３００ｎＭで９０秒間捕捉される。標的抗原は、流速３０μｌ／分且つ濃度範囲２５０～１０００ｎＭでフローセルに１８０秒間通過させる。解離を１８０秒間モニタする。
バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正される。定常応答を使用して、ラングミュア結合等温線の非線形曲線適合により解離定数ＫＤを得た。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによる単純な一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．１．１）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照のこと。
活性のアッセイ
本発明の二重特異性抗原結合分子（又は抗体）の生物活性は、実施例に記載される様々なアッセイにより測定することができる。生物活性には、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞中のシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞中の活性マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍後退の誘導及び／又は生存率の改善が含まれる。
投与の組成、製剤、及び経路
さらなる態様において、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の他の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれかと、少なくとも一の追加的治療剤を、例えば後述するように含む。
さらには、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に適した形態の、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を生成する方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子を得ること、及び（ｂ）少なくとも一つの薬学的に許容される担体を用いて抗体又は二重特異性抗原結合分子を製剤化することであって、抗体又は二重特異性抗原結合分子の調製物が、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与のために製剤化される、製剤化することを含む。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解又は分散された抗体又は複数の抗体又は二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という表現は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、即ち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実態及び組成物を指す。抗体又は二重特異性抗原結合分子と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990（参照により本明細書に包含される）によって例示されているように、本開示内容の見地から当業者には既知であろう。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与のために、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ又は他の国の対応する官庁によって必要とされる無菌状態、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たさねばならない。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」には、当技術者に既知のように、あらゆる溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存料（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、分解剤、潤滑剤、甘味料、香料、染料、それらの類似物質及び組合せが含まれる（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照（参照により本明細書に包含される）。いずれの一般的な担体も、活性成分と不適合でない限り、治療的又は薬学的組成物におけるその使用が考慮される。
本発明の抗体又は二重特性抗原結合分子（及び追加的な治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療のために望ましい場合は、病巣内投与を含む任意の適切な手段により投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内 筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に考案されたものが含まれる。注射の場合、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーといった生理的に適合性のバッファー中において製剤化されうる。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤といった製剤関連薬剤を含有することができる。代替的には、抗体又は二重特異性抗原結合分子は、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌ピロゲンを含まない水を用いた組成に適した粉末形態であってもよい。無菌の注射可能な溶液は、必要量の本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を、必要に応じて以下に列挙する他の様々な成分を含む適切な溶媒中に取り込むことにより調製される。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。通常、分散液は、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌された様々な活性成分を取り込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、その直前の滅菌濾過された液体媒質から活性成分の粉末と任意の所望の追加的成分とを生む真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒質は、必要であれば適切にバッファーリングされなければならず、十分な食塩水又はグルコースを注射される前に、液体はまず希釈されて等張性にされる。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全レベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれなければならない。薬学的に許容される適切な担体には、限定されないが；リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ごま油のような脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)に開示されている。持続放出性調製物が調製されてもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の吸収を、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はそれらの組合せといった吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することにより持続させることができる。
上記の組成物に加えて、抗体又は二重特異性抗原結合分子は、デポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、植込（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（例えば、皮下又は筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、抗体又は二重特異性抗原結合分子は、適切なポリマー性又は疎水性物質（例えば、許容可能なオイル中の乳濁液としての）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、一又は複数の生理的に許容される担体、希釈材、賦形剤、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる一般的な方法で製剤化することができる。適当な製剤は、選択される投与経路によって決定する。
抗体又は二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は遊離塩基の、天然又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より、水性及び他のプロトン性溶媒に溶け易い。
治療的方法及び組成物
本明細書において提供されるいずれの抗体又は二重特異性抗原結合分子も、治療法に使用することができる。本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、例えばがんの治療において、免疫療法薬剤として使用されてもよい。
治療法において使用される場合、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、医学行動の規範に則って製剤化、投薬、及び投与される。この観点において考慮すべき要因は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。
一態様では、医薬としての使用のための本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子が提供される。さらなる態様では、疾患の治療において使用される本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の実施態様では、治療法において使用される本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子が提供される。一実施態様では、本発明は、それを必要とする個体の疾患の治療に使用される、本明細書に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、治療的有効量の抗体又は二重特異性抗原結合分子を、疾患を有する個体に投与することを含む、個体の治療法において使用される抗体又は二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患はがんである。特定の実施態様では、方法はさらに、個体に対して少なくとも一つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。さらなる実施態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解の誘導に使用される、本明細書に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するために抗体又は二重特異性抗原結合分子の有効量を投与することを含む、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法に使用される抗体又は二重特異性抗原結合分子を提供する。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、それを必要とする個体の疾患の治療を目的とするものである。さらなる実施態様において、本医薬は、疾患を有する個体に対し、治療的有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療する方法における使用を目的としている。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患はがんである。一実施態様では、方法はさらに、個体に対し、少なくとも一つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。さらなる実施態様では、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。またさらなる実施態様では、医薬は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するために医薬の有効量を投与することを含む、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用を目的とする。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
さらなる態様において、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、そのような疾患を有する個体に対し、治療的有効量の本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を投与することを含む。一実施態様では、薬学的に許容される形態の本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む組成物が、前記個体に対して投与される。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一実施態様では、疾患はがんである。特定の実施態様では、方法はさらに、個体に対して少なくとも一つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法を提供する。一実施態様では、方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞を、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子と接触させることを含む。さらなる態様において、個体の標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法が提供される。このような一実施態様では、方法は、標的細胞の溶解を誘導するために、個体に対し、有効量の抗体又は二重特異性抗原結合分子を投与することを含む。一実施態様において、「個体」はヒトである。
特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患、特にがんである。がんの非限定的な例には、前立腺がん、脳のがん、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、及び腎臓がんが含まれる。本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を用いて治療されうる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、***、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部及び頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎臓がん、膀胱がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳のがん、頭部及び頸部のがん、並びに前立腺がんからなる群より選択される。一実施態様において、がんは前立腺がんである。当業者は、多くの場合抗体又は二重特異性抗原結合分子は治癒をもたらさず、部分的恩恵を提供するだけであることを認識する。いくつかの実施態様では、いくつかの恩恵を有する生理的変化も治療的に有益と考えられる。したがって、いくつかの実施態様では、生理的変化をもたらす抗体又は二重特異性抗原結合分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。治療を必要とする被検体、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
いくつかの実施態様では、有効量の本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子が細胞に投与される。他の実施態様では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の治療的有効量が、疾患の治療のために個体に投与される。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の適切な投与量は（単独で使用されるか、或いは一又は複数の他の追加的治療剤との組み合わせで使用されるときの）、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、抗体又は二重特異性抗原結合分子の種類、疾患の重症度及び経過、抗体又は二重特異性抗原結合分子が予防又は治療いずれの目的で投与されるか、直前又は同時に行われる治療的介入、患者の病歴及び抗体又は二重特異性抗原結合分子に対する応答、並びに主治医の裁量によって決定されるであろう。投与の責任を負う施術者は、いずれにしろ、組成物中の活性成分（複数可）の濃度及び個別の対象に適切な用量（複数可）を決定する。限定されないが、様々な時点にわたる、単一回又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考慮される。
抗体又は二重特異性抗原結合分子は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数回の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体又は二重特異性抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となりうる。一つの典型的な一日あたり用量は、上記要因に応じて約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続されるであろう。抗体又は二重特異性抗原結合分子の一つの例示的用量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇであろう。他の非限定的実施例では、用量は、一回の投与につき、体重１ｋｇあたり約１マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約２００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約３５０マイクログラム、体重１ｋｇあたり約５００マイクログラム、体重１ｋｇあたり約１ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約２００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約３５０ミリグラム、体重１ｋｇあたり約５００ミリグラム、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇ以上及びそこで導かれるあらゆる範囲を含む。本明細書に列挙される数字から導かれる範囲の非限定的な例では、上記の数字に基づいて、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ～体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５マイクログラム～体重１ｋｇあたり約５００ミリグラムなどが投与されうる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらのいずれかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２～約２０投与量、又は例えば約６投与量の抗体又は二重特異性抗原結合分子を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、一又は複数の低用量を投与してよい。しかしながら、他の用量レジメンも有用でありうる。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、通常、意図された目的を達成するために有効な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子、又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示内容を踏まえると十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、まずは細胞培養アッセイのようなｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに基づいて推定することができる。次いで用量を、細胞培養物において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて製剤化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定するために使用することができる。
初期投与量は、ｉｎ ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから、当技術分野で周知の技術を用いて推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
投与の量及び間隔は、治療効果を維持するために十分な抗体又は二重特異性抗原結合分子の血漿レベルを提供するために個別に調整される。注射による投与のための通常の患者への投与量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数の用量を投与することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
局所投与又は選択的取り込みの場合、抗体又は二重特異性抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
本明細書に記載される抗体又は二重特異性抗原結合分子の治療的に有効な用量は、通常、実質的な毒性なしで治療的恩恵を提供する。抗体又は二重特異性抗原結合分子の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物の研究は、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らしめる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために使用することができる。毒性と治療効果との用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０と表現することができる。大きな治療指数を呈する抗体又は二重特異性抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子は高い治療指数を呈する。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した一定範囲の投与量の製剤化に使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性を殆ど又は全く有さないＥＤ５０を含む、一定範囲の循環濃度内にある。投与量は、種々の要因、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動しうる。正確な製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択されうる（例えば、Fingl et al., 1975, in:ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1参照。この文献は参照により本明細書に包含される）。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、いつ及びどのようにして投与を終了、中断、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には（毒性なしで）、治療レベルを上げるように調整することも分かっているであろう。対象となる障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動するであろう。例えば、状態の重症度は、部分的には標準の予後評価方法により評価される。さらに、用量及び恐らくは投薬回数も、個々の患者の年齢、体重、及び応答により変動するであろう。
その他の薬剤及び治療
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、療法において、一又は複数の他の薬剤との組み合わせで投与されうる。例えば、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、少なくとも一の追加的治療剤と共投与される。用語「治療剤」は、そのような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与されるあらゆる薬剤を包含する。このような追加的な治療剤は、治療される特定の兆候に適したあらゆる活性成分、好ましくは、互いに打ち消し合うことのない相補的活性を有する活性成分を含む。特定の実施態様では、追加的治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。特定の実施態様では、追加的治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊因子、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。
このような他の薬剤は、意図した目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される抗体又は二重特異性抗原結合分子の量、障害又は治療の種類、及び上述した他の要因によって決まる。抗体又は二重特異性抗原結合分子は、一般的に、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路において、又は本明細書に記載された投与量の１％～９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量で任意の経路により使用される。
上記のこうした併用療法は、併用投与（二以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起こりうる分離投与を包含する。本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、放射線療法と組み合わせて使用してもよい。
製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、状態の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性な薬剤は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の治療のために使用されることを示している。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む組成物を中に含む第一の容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害性又はその他の治療剤を含む組成物を中に含む第２の容器を含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書をさらに含んでいてもよい。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的に及びユーザーの立場から望まれる他の材料をさらに含んでもよい。
診断及び検出のための方法と組成物
特定の実施態様では、本明細書において提供される抗ＳＴＥＡＰ－１抗体のいずれもが、生物学的試料中のＳＴＥＡＰ－１の存在を検出するために有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。特定の実施態様では、生物学的サンプルは細胞又は組織、例えば前立腺組織を含む。
一実施態様では、診断又は検出方法に使用される抗ＳＴＥＡＰ－１抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的試料中におけるＳＴＥＡＰ－１の存在を検出する方法が提供される。特定の実施態様では、方法は、生物学的試料を、抗ＳＴＥＡＰ－１抗体のＳＴＥＡＰ－１への結合を許容する条件下において本明細書に記載される抗ＳＴＥＡＰ－１抗体と接触させること、及び抗ＳＴＥＡＰ－１抗体とＳＴＥＡＰ－１の間に複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。そのような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法又はｉｎ ｖｉｖｏ法である。一実施態様では、抗ＳＴＥＡＰ－１抗体は、抗ＳＴＥＡＰ－１抗体を用いた療法に適した対象を選択するために使用され、例えばＳＴＥＡＰ－１は患者の選択のためのバイオマーカーである。
本発明の抗体を用いて診断されうる例示的な障害には、がん、特に前立腺がんが含まれる。
特定の実施態様では、標識された抗ＳＴＥＡＰ－１抗体が提供される。標識は、限定されないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識などの）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。このような標識の例には、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３－ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼを、色素前駆体、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどを酸化するために過酸化水素を利用する酵素とカップリングさせたもの、などが含まれる。
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以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上記に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施されうる。
実施例１
コンストラクト及びツールの生成
組み換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Sambrook, J. et al, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、必要に応じて、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。すべてのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
抗ＳＴＥＡＰ１／抗ＣＤ３Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体のクローニング
種々のＳＴＥＡＰ１特異性Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体変異体の生成のために、バンドルツズマブの可変ドメインを使用した。それぞれの発現プラスミドの生成のために、バンドルツズマブの可変領域配列（配列番号１０及び１４）又はその変異体を使用し、各レシピエント哺乳動物の発現ベクターに事前挿入されるそれぞれの定常領域を用いてインフレームでサブクローニングした。その結果得られる分子の模式図が図２に示される。
抗ＳＴＥＡＰ１／抗ＣＤ３Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の調製
以下の分子が調製された。これらの模式図を図２に示す：
Ａ．分子Ａ：２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ「反転型」（ＣＤ３バインダーＣ末端からＳＴＥＡＰ１バインダーへ）、電荷修飾あり（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、ＳＴＥＡＰ１バインダーにおける電化修飾）（配列番号２６、２７、３４及び３５）
Ｂ．分子Ｂ：２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ「反転型」（ＣＤ３バインダーＣ末端からＳＴＥＡＰ１バインダーへ）、電荷修飾あり（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、ＳＴＥＡＰ１バインダーにおける電荷修飾；両方のＳＴＥＡＰ１結合部分におけるＤ１００ａＥ変異）（配列番号２８、２９、３４及び３５）
Ｃ．分子Ｃ：２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ「反転型」（ＣＤ３バインダーＣ末端からＳＴＥＡＰ１バインダーへ）、電荷修飾あり（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、ＳＴＥＡＰ１バインダーにおける電荷修飾；両方のＳＴＥＡＰ１結合部分におけるＤ１００ｂＥ変異）（配列番号３０、３１、３４及び３５）
Ｄ．分子Ｄ：２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ「反転型」（ＣＤ３バインダーＣ末端からＳＴＥＡＰ１バインダーへ）、電荷修飾あり（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、ＳＴＥＡＰ１バインダーにおける電荷修飾；両方のＳＴＥＡＰ１結合部分におけるＤ１００ａＥ／Ｄ１００ｂＥ変異）（配列番号３２、３３、３４及び３５）
上述の分子の発現は、キメラＭＰＳＶプロモーター又はＣＭＶプロモーターによって駆動された。ポリアデニル化は、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列により駆動された。加えて、各ベクターは、常染色体複製のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含んでいた。
すべてのコンストラクトの生成のために、懸濁液中において増殖するＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミンを用いて、それぞれの発現ベクターと共に共トランスフェクトした。したがって、すべての「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ」コンストラクトの生成のために、対応する発現ベクターを、１：２：１：１の比（「ベクター重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ－ＣＬ）」で共トランスフェクトした。
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ－グルタミン及び２５０ｍｇ／ｌのＧ４１８を含む無血清Ｅｘｃｅｌｌ培地において懸濁培養した。６００ｍｌのチューブスピンフラスコ（最大作業体積４００ｍＬ）内での生成のために、６億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションの前に、細胞を２１０×ｇにより５分間遠心分離し、予め温めた２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地により上清を置き換えた。発現ベクターを、ＤＮＡの量が最終的に４００μｇになるまで２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で混合した。１０８０μｌのＰＥＩ溶液（２．７μｇ／ｍｌ）を加えた後、培地を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、６００ｍｌのチューブスピンフラスコに移し、加湿した５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。このインキュベーション工程の後、６ｍＭのＬ－グルタミン、５ｇ／ＬのＰｅｐｓｏｙ、及び１．０ｍＭのＶＰＡを含む３６０ｍｌのＥｘｃｅｌｌ培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、７％のＦｅｅｄ ７を加える。７日間の培養後、上清を収集して２０～３０分間３６００×ｇで遠心分離（Ｓｉｇｍａ ８Ｋ遠心分離）することによって精製し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、アジ化ナトリウムを最終濃度０．０１％ ｗ／ｖになるまで加え、４℃に保持した。
すべての分子を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、続いてサイズ排除クロマトグラフィー工程により、細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、２５ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）により平衡化したＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム容積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。標的タンパク質を、６カラム容積の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）に溶出した。タンパク質溶液を、１／１０容積の０．５ Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を加えることにより中和させた。ＰｒｏｔｅｉｎＡクロマトグラフィー後のインプロセス分析のために、単一の画分中の分子の純度及び分子量を、還元剤の非存在下においてＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅＴＭ、Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ、，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を、製造者の指示に従って使用した。標的タンパク質の選択された画分を、濃縮し、濾過した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
精製されタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いる２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）により決定した。加えて、すべての分子の同一性を確認するために、それら分子の質量分析を実施した。
ＳＴＥＡＰ１発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞株の生成
完全長ヒトＳＴＥＡＰ１をコードする遺伝子を、哺乳動物の発現ベクター中にクローニングした。製造者のプロトコールに従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１５３３８１００）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、プラスミドをＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９６１８）細胞中にトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされたＳＴＥＡＰ１陽性ＣＨＯ細胞を、１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、＃１６１４００６３）及び１％のＧｌｕｔａＭＡＸ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ；＃３１３３１－０２８）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ｇｉｂｃｏ、＃１１３２００３３）中に維持した。トランスフェクションの二日後、ピューロマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ；＃ａｎｔ－ｐｒ－１）を６μｇ／ｍＬに加え、細胞を複数継代にわたって培養した。最初の選択後、最も高いＳＴＥＡＰ１の細胞表面発現を有する細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりソートし、培養して安定な細胞クローンを確立した。発現レベル及び安定性は、４週間の期間にわたって二次抗体としてバンドルツズマブ及びＰｅｒＣＰコンジュゲートＦｃガンマ特異性ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９－１２６－０９７）を用いたＦＡＣＳ解析により確認された。
実施例２
バンドルツズマブベースの配列変異体の生成及び特徴づけ
バンドルツズマブの配列分析
アスパラギン脱アミド、アスパルテート異性化、スクシンイミド形成、及びトリプトファン酸化のような修飾は、組み換え抗体に関する典型的な分解であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの安定性及びｉｎ ｖｉｖｏでの生体機能の両方に影響しうる。アスパルテート異性化、アスパラギン脱アミド又はスクシンイミド形成を生じやすい潜在的なアミノ酸配列パターンの存在をスクリーニングするために、バンドルツズマブＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔによる配列番号１、２、３、７、８及び９）の計算解析を実施した。さらに、ＣＤＲ領域を、酸化する可能性を有するトリプトファンの存在について分析した。図３に示すように、バンドルツズマブ配列の解析により、重鎖及び軽鎖両方の可変ドメインのＣＤＲ領域内の潜在的ホットスポットが明らかになった。
バンドルツズマブ配列（分子Ｂ－Ｄ）の変異体の生成
最小のイソ－アスパルテート及びスクシンイミド形成と、最適な安定性とを有する抗ＳＴＥＡＰ１抗体を調製するために、修飾されたＨＣＤＲ３配列を有するバンドルツズマブ配列の複数の変異体を生成した。特に、１００ａ位及び１００ｂ位（Ｋａｂａｔ番号付け）におけるアスパルテート残基を、個別に又は組み合わせてグルタメートにより置き換え（配列番号４、５及び６）、その結果得られたプラスミド（配列番号２８、２９、３４及び３５（変異Ｄ１００ａＥ、分子Ｂ）；配列番号３０、３１、３４及び３５（変異Ｄ１００ｂＥ、分子Ｃ）；配列番号３２－３５（変異Ｄ１００ａＥ／Ｄ１００ｂＥ、分子Ｄ））は、それぞれのＴＣＢ抗体分子の発現のために生成された。
化学分解試験
導入された変異により、ＨＣＤＲ３に予測されるホットスポットが消滅し、安定性が上昇し、抗ＳＴＥＡＰ１抗体の結合力価の欠失が防止されることを確認するために、すべてのコンストラクト（分子Ａ－Ｄ）を二つのアリコートに分割し、それぞれ２０ｍＭのＨｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）又はＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再バファリングし、４０℃（Ｈｉｓ／ＮａＣｌ）又は３７℃（ＰＢＳ）でインキュベートした。加えて、コントロール試料を－８０℃で貯蔵した。ｐＨ７．４でのインキュベーションは、血漿中の状況への分子の曝露を反映したものであり、ｉｎ ｖｉｖｏでの分子の安定性についての結論を導くことができる。対照的に、低減したｐＨ（ここではｐＨ６）を有するバッファー製剤は、抗体ベースのコンストラクトの長期貯蔵により適しており、このような条件下でのストレス試験は、分子の貯蔵寿命を予測する。
２８日間のインキュベーション期間の後、ＳＴＥＡＰ１結合部分の結合力価（相対活性濃度）について試料を分析及び比較した。この分析は、質量分析及び細胞ベースのＥＬＩＳＡにより間接的に実施された。
質量分析によるストレス分子Ａ－Ｄの特徴づけ
バンドルツズマブ及びその変異体のＣＤＲ内部における予測位置でのストレス誘導性のタンパク質分解を同定するために、分子Ａ－Ｄの質量分析を実施した。８０μｇの参照試料及びストレスタンパク質試料を、１２４．５μｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５．６Ｍ塩酸グアニジニウム、１０ｍＭ ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（ｐＨ６．０）中で、３７℃で１時間にわたり変性させ、還元した。バッファーを、０．５ｍＬのＺｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ中に、２０ｍＭ ヒスチジン クロリド、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ６．０）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に交換した。タンパク質試料は、最終容積１４０μＬにおいてタンパク質１μｇにつき０．０５μｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた後、一晩３７℃で消化させた。７μＬの１０％ギ酸（ＦＡ）溶液を加えることにより消化を止めた。
消化させた試料は使用まで－８０℃で貯蔵した。ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）及びＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＵＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析を実施した。約２．４μｇの消化した融合タンパク質を５μＬで注入した。クロマトグラフ分離法を、流速６０μＬ／分を用いるＡｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ３００Ｃ１８カラム（１×１５０ｍｍ、１．７μｍ、３００Å（Ｗａｔｅｒｓ））において逆相により実施した。移動相Ａ及びＢは、ＵＰＬＣグレードの水及びアセトニトリル中にそれぞれ０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸を含んでいた。５０℃のカラム温度を使用し、９０分間に１％から４０％の移動相Ｂの勾配を適用した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎを、データ依存モードで使用した。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＭＳの設定は：イオン化（スプレー電圧：３．６ｋＶ、イオン輸送管：２５０℃、ベーパライザー：１００℃）、フルＭＳ（ＡＧＣ：２×１０５、分解能：１２×１０４、ｍ／ｚレンジ：３００－２０００、最大注入時間：１００ｍｓ）；ＭＳ／ＭＳ（ＡＧＣ：１×１０４、最大注入時間：１００ｍｓ、単離幅：２Ｄａ）．正規化された衝突エネルギーは３５％に設定された。
分子Ａ－Ｄの予測されるホットスポット（Ｎ５３（ＨＣＤＲ２）、Ｎ９７（ＨＣＤＲ３）、Ｄ１００ａ（ＨＣＤＲ３）及びＷ５０（ＬＣＤＲ２）（Ｋａｂａｔ番号付け））の脱アミド化、異性化及び酸化のレベルを定量化するためにペプチドマッピングを適用した。
ＨＣＤＲ３領域を担持するペプチドにおいて、いずれの条件においても、分子Ａ－Ｄのいずれにおいても、Ｎ９７位における脱アミドもスクシンイミド形成も検出されなかった（データは示さない）。しかしながら、ｐＨ６でのストレス曝露により、やはり予測されるホットスポットアスパルテート１００ａを担持する同じＨＣＤＲ３ペプチドに異なるレベルのアスパルテート分解がもたらされた。四つの試験された分子それぞれのトリプシンペプチドには、４０℃のＨｉｓ／ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中で４週間後に、異なるレベルのスクシンイミド及びイソアスパルテート形成が検出された（表１）。ｐＨ６．０でのストレス曝露の後、最も高い合計レベルは分子Ａに検出された。分子ＢにおけるＤ１００ａ→Ｅ１００ａの変異導入と、分子ＣにおけるＤ１００ｂ→Ｅ１００ｂの変異導入は、スクシンイミドレベルを有意に低下させる。しかしながら、両変異の組み合わせ（Ｄ１００ａＥ／Ｄ１００ｂＥ）（分子Ｄ）は、スクシンイミドレベルを３％へと強力に低下させ、これはこのような長期間のストレス曝露については無視できる量である。さらに、分子Ｄにイソアスパルテートは検出されなかった。この結果は、分子Ａ中の両方のアスパルテート（Ｄ１００ａ及びＤ１００ｂ）と分子Ｃ又はＢ中のアスパルテート（Ｄ１００ａ又はＤ１００ｂ）のいずれか一つとが、ストレス後に見られるスクシンイミドとイソアスパルテートの合計レベルに寄与していることを示している。加えて、ｐＨ７．４でのストレス曝露後に、分子ＤのＨＣＤＲ３にタンパク質分解はまったく検出されず、この新規に設計された配列変異体の一体性が確認された。
Figure 0007247101000008
ＳＴＥＡＰ１バインダーの重鎖（ＨＣＤＲ２）においてペプチドを担持するＮ５３位の分析により、３７℃のＰＢＳ（ｐＨ７．４）中では４週間後にすべてのコンストラクトにおいてＮ５３脱アミドが少し増大するがことが明らかになったが、ｐＨ６では有意な増加が検出されなかった（表２）。Ｗ５０（ＬＣＤＲ２）の酸化はすべての試料について２％未満であった（表３）。結果として、これら推定上のホットスポットに関して分子最適化は実施されなかった。
Figure 0007247101000009
Figure 0007247101000010
細胞ベースのＥＬＩＳＡを用いたストレス後の結合力価の特徴づけ
ｐＨ７．４又は６．０で１－４週間のストレスによって生じる結合力価の低下を定量化するために、ヒトＳＴＥＡＰ１を安定に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いる細胞ベースのＥＬＩＳＡを採用した。この細胞ベースのＥＬＩＳＡのために、９６ウェルプレートの各ウェルに１００００個の細胞を播種し、１８時間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。上清を、自動洗浄器（ＢＩＯＴＥＫ）を用いて除去し、増殖培地中の抗体コンストラクトの１００μｌの希釈系列（１０ｐＭ－３０ｎＭ）を各ウェルに加えた。４℃でのインキュベーションの１時間後、ウェルを空にし、ＰＢＳ中０．０５％のグルタルアルデヒド１００μｌを１０分間ＲＴで加えた。ＰＢＳ／０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）での４回の洗浄後、ブロッキングバッファー（Ｒｏｃｈｅ）中において１：２００００に希釈した１００μｌの抗ヒト－ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を加え、プレートを１時間室温（ＲＴ）でインキュベートした。ウェルを、ＰＢＳＴで６回洗浄し、１ウェルあたり１００μｌのＴＭＢを用いてシグナルを生成し、５０μｌの１Ｍ ＨＣｌを用いて１０分後に反応を止め、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。データ（表４）は、ストレス試料の結合ＥＣ５０を未処理の試料の同値で除したものに１００を乗じた「％結合」で表している。
試験したすべてのＴＣＢ抗体が、分子あたり二つのＳＴＥＡＰ１結合部分を含むとして、ＳＴＥＡＰ１に対する一価の結合の親和性が４０－６０ｎＭの範囲であるとことを考慮すると、二つの機能的ＳＴＥＡＰ１結合部分を有する分子のみがこのＥＬＩＳＡにおいて検出されうると考えられる。対照的に、一つの機能的ＳＴＥＡＰ１結合部分のみを有する分子は、このプロトコールに記載される洗浄工程の間に洗い流されるはずである。したがって、スクシンイミドレベルが上昇した分子に関する結合損失の累積率は、ＨＣＤＲ３において検出されたタンパク質分解より高い（分子Ａ－Ｃ）。
Figure 0007247101000011
バンドルツズマブベースのＴＣＢ抗体変異体の生化学的特徴づけ（分子Ａ－Ｄ）
生化学的及び生物物理学的特性を特徴づけて比較するために、新規の抗ＳＴＥＡＰ－１抗体配列変異体を有するすべてのＴＣＢ（分子Ｂ－Ｄ）を分析し、バンドルツズマブ配列を担持するＴＣＢ抗体（分子Ａ）と比較した。この結果を表５にまとめる。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
見掛け上の疎水性を、２５ｍＭのＮａ－ホスフェート、１．５Ｍの硫酸アンモニウム（ｐＨ７．０）で平衡化したＨＩＣ－Ｅｔｈｅｒ－５ＰＷ（Ｔｏｓｏｈ）カラムに２０μｇの試料を注入することにより決定した。０から１００％の直線勾配のバッファーＢ（２５ｍＭのＮａ－ホスフェート、ｐＨ７．０）を用いて６０分以内に溶出を実施した。保持時間を、既知の疎水性を有するタンパク質標準と比較した。
熱安定性
２０ｍＭのヒスチジン／ヒスチジンクロリド、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中、１ｍｇ／ｍＬの濃度で試料を調製し、０．４μｍフィルターを通じた遠心分離により、光学３８４ウェルプレートに移し、パラフィン油でカバーした。試料を０．０５℃／分の速度で２５℃から８０℃に加熱する間に、流体力学半径を、ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｗｙａｔｔ）で動的光散乱により繰り返し測定する。
ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー
ＦｃＲｎが発現し、精製され、記載されるようにビオチン化された（Schlothauer et al., MAbs （2013） 5（4）, 576-86）。カップリングのために、調製された受容体をストレプトアビジン－セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に加えた。その結果得られたＦｃＲｎ－セファロースマトリックスを、カラムのハウジングに詰めた。カラムを２０ｍＭの２－（Ｎ－モルホリン）－エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．５）（溶出剤Ａ）で０．５ｍｌ／分の流速で平衡化した。３０μｇの抗体試料を、溶出剤Ａと１：１の容積比で希釈し、ＦｃＲｎカラムに適用した。カラムを５カラム容積の溶出剤Ａで洗浄し、続いて３５カラム容積中２０から１００％の直線勾配の２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．８）（溶出剤Ｂ）で溶出した。分析を、２５℃のカラムオーブンで実施した。溶出プロファイルを、２８０ｎｍでの吸光度を連続測定することにより監視した。保持時間を、既知の親和性を有するタンパク質標準と比較した。
ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー
ヘパリン親和性を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｈｅｐａｒｉｎ－５ＰＷ（Ｔｏｓｏｈ）カラムに３０－５０μｇの試料を注入することにより決定した。０から１００％の直線勾配のバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４ｍＭ）を用いて３７分以内に溶出を実施した。保持時間を、既知の親和性を有するタンパク質標準と比較した。
新規の抗ＳＴＥＡＰ－１抗体配列変異体を有する試験されたＴＣＢ（分子Ｂ－Ｄ）のいずれにおいても、試験されたすべての生物物理学的及び生化学的特性に関して、バンドルツズマブ配列（分子Ａ）を有する分子との間に有意な差は見られなかった（表５）。すべての試料は、ストレス時にわずかな凝集及び断片化を示すのみであり、このことは、ｐＨ６におけるストレスへの曝露後に観察された活性化の欠失（分子Ａ－Ｃ）が、ＨＣＤＲ３領域内の同定された位置における化学的タンパク質分解に起因していることを示唆している。
Figure 0007247101000012
実施例３
ＳＴＥＡＰ－１ ＴＣＢ抗体変異体の機能的特徴づけ
ＳＴＥＡＰ－１ ＴＣＢ抗体変異体によって誘導されるＴ細胞媒介性の腫瘍溶解
異なるＳＴＥＡＰ－１ ＴＣＢ抗体変異体（分子Ａ－Ｄ）によって媒介されるＴ細胞殺傷を、ＳＴＥＡＰ－１発現ＬｎＣＡＰ細胞において評価した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として使用し、前記殺傷を、二重特異性抗体と共に行ったインキュベーションの２４時間目及び４８時間目において検出した。付着した標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて収集し、洗浄し、平底９６ウェルプレートを用いて３００００細胞／ウェルの密度で播いた。細胞を一晩放置して付着させた。ＰＢＭＣを、健常なヒトドナーから得られたヘパリン添加血液の濃縮リンパ球調製物のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。新鮮血を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント上に重ねた（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分、室温）後、ＰＢＭＣを含有する界面相上の血漿を棄て、ＰＢＭＣを新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、その後５０ｍｌのＰＢＳを満たした。混合物を遠心分離（４００×ｇ、１０分間、室温）し、上清を棄て、滅菌ＰＢＳを用いてＰＢＭＣペレットを二度洗浄した（遠心分離工程：３５０×ｇ、１０分間）。その結果得られたＰＢＭＣの集団を自動カウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、細胞インキュベーター内において、３７℃、５％ ＣＯ２で１０％のＦＣＳ及び１％のＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、さらなる使用まで（２４時間以内）保管した。
殺傷アッセイのために、抗体を、示された濃度（０．０１ｐＭ～１ｎＭの範囲で３通り）で加えた。ＰＢＭＣを標的細胞に、最終的なＥ：Ｔ比が１０：１となるように加えた。標的細胞の死滅を、３７℃、５％ ＣＯ２での２４時間及び４８時間のインキュベーションの後に、アポトーシス／壊死細胞による細胞上清中に放出されたＬＤＨの定量化（ＬＤＨ検出キット、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１ ６４４ ７９３ ００１）により評価した。標的細胞の最大溶解（＝１００％）が、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００と共になされた標的細胞のインキュベーションにより達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性コンストラクトなしでエフェクター細胞と共にコインキュベートした標的細胞を指す。２４時間後（図４Ａ）及び４８時間後（図４Ｂ）の結果は、細胞媒介性の腫瘍溶解が、試験された分子によりＴ同様に誘導されること、及び分子Ｂ－ＤにおけるＳＴＥＡＰ－１バインダーの修飾が、分子の殺傷力価に悪影響を与えないことを示している。
ＳＴＥＡＰ－１ ＴＣＢ抗体変異体により誘導されるＴ細胞活性化（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ活性化アッセイ）
細胞上のＣＤ３及びヒトＳＴＥＡＰ－１に同時結合すると、ＣＤ３媒介性のエフェクター細胞活性化を誘導するＳＴＥＡＰ－１ ＴＣＢ抗体変異体の能力を、腫瘍抗原陽性標的細胞（ＬｎＣＡＰ、２２ＲＶ１）とＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞（ＣＤ３発現ヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株とＮＦＡＴプロモーター；ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）の共培養を用いて評価した。ＳＴＥＡＰ－１抗原（標的細胞に発現）及びＣＤ３抗原（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞に発現）にＴＣＢ分子が同時結合すると、ＮＦＡＴプロモーターが活性化し、活性ホタルルシフェラーゼの発現を導く。発光シグナルの強度（ルシフェラーゼ基質の付加時に得られる）は、ＣＤ３活性化及びシグナル伝達の強度に比例している。
アッセイのために、ヒト腫瘍細胞を回収し、ＶｉＣｅｌｌを用いて生存率を決定した。２００００個の細胞／ウェルを、平底白壁９６ウェルプレート（＃６５５０９８、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に蒔き、希釈した抗体又は培地（コントロール用）を加えた（２．６ｐＭ－２００ｎＭの範囲）。
その後、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を回収し、ＶｉＣｅｌｌを用いて生存率を評価した。細胞を細胞培地に再懸濁し、腫瘍細胞に加え、最終的なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比を５：１とし、最終容積をウェルあたり１００μｌとした。細胞を、加湿したインキュベーター内で６時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション時間の最後に、１００μｌ／ウェルのＯＮＥ－Ｇｌｏ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ；各ウェルのＯＮＥ－Ｇｌｏとアッセイ培地の比１：１）をウェルに加え、１０分間室温で暗所でインキュベートした。ＷＡＬＬＡＣ Ｖｉｃｔｏｒ３ ＥＬＩＳＡリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２０３０）を用いて、発光を、検出時間５秒／ウェルで検出した。
図５に示すように、評価されたすべてのＳＴＥＡＰ－１ ＴＣＢ抗体分子はＣＤ３を介してＴ細胞架橋を誘導し、その後ＳＴＥＡＰ１発現ＬｎＣＡＰ（図５Ａ）及び２２Ｒｖ１（図５Ｂ）細胞にＴ細胞活性化を誘導している。ＳＴＥＡＰ１陰性ＣＨＯ－Ｋ１細胞（図５Ｃ）にＴ細胞活性化は観察できない。
ＳＴＥＡＰ－１－及びＣＤ３発現細胞に対するＳＴＥＡＰ－１ ＴＣＢ抗体変異体の結合
ＳＴＥＡＰ－１ ＴＣＢ抗体変異体（分子Ａ－Ｄ）の結合を、ＳＴＥＡＰ－１発現ＣＨＯ－ｈＳＴＥＡＰ１細胞（ヒトＳＴＥＡＰ－１を安定に発現するようにトランスフェクトされたハムスター卵巣由来の上皮細胞株）及びＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ レポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）を用いて試験した。
簡潔には、Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｉｂｃｏ、＃１３１５１０１４）を用いて付着したＣＨＯ－ｈＳＴＥＡＰ１細胞を回収し、数え、生存率をチェックし、ＦＡＣＳバッファー（１００μｌ ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡ）中、２ｘ１０６個の細胞／ｍｌで再懸濁した。Ｊｕｒｋａｔ懸濁細胞も回収し、数え、生存率をチェックした。１００μｌの細胞懸濁液（０．２ｘ１０６個の細胞を含有）を、丸底９６ウェルプレートにおいて３０分間４℃で、漸増濃度のＳＴＥＡＰ－１ ＴＣＢ抗体（３１ｐＭ－１０００ｎＭ）と共にインキュベートし、０．１％のＢＳＡを含有する冷ＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）で二回洗浄し、４℃でさらに３０分間、１：５０に事前希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ－ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異性二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ＃１０９－６０６－００８、ＦＡＣＳバッファー中で希釈）と共に再インキュベートし、冷ＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡで二回洗浄した。
染色した細胞を、１００μＬの２％パラホルムアルデヒド含有ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートして染色を固定した。最後に、細胞を４分間３５０×ｇ及び４℃で遠心分離し、上清を棄て、細胞ペレットを２００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。染色を、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いてＦＡＣＳにより分析した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて結合曲線を得た（図６Ａ、ＣＨＯ－ｈＳＴＥＡＰ１細胞に対する結合；図６Ｂ、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する結合）。
図６に示すように、評価されたすべてのＳＴＥＡＰ－１ ＴＣＢ抗体分子は、ヒトＳＴＥＡＰ－１を発現するヒトＣＨＯ細胞（図６Ａ）と、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に発現されたヒトＣＤ３（図６Ｂ）に対する濃度依存性の結合を示し、このことは、分子Ｂ－ＤにおけるＳＴＥＡＰ－１バインダーの修飾が、細胞上のＳＴＥＡＰ－１に対するそれらの結合に悪影響を与えないことを示唆するものである。
前述の発明は、理解を明確にする例示及び実施例によってある程度詳細に説明されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての特許及び科学文献の開示内容は、参照によりその全体が本明細書に包含される。

Claims (46)

  1. 配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、並びに配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、ＳＴＥＡＰ－１に結合する抗体。
  2. ＶＨが、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. ＶＨが、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. ＩｇＧ抗体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
  5. 前記ＩｇＧ抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項４に記載の抗体。
  6. 完全長抗体である、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子からなる群より選択される抗体断片である、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
  8. 多重特異性抗体である、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体。
  9. （ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＳＴＥＡＰ－１であり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ２、並びに配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択されるＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８のＬＣＤＲ２及び配列番号９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分、並びに
    （ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２の抗原結合部分
    を含む二重特異性抗原結合分子。
  10. 第１の抗原結合部分のＶＨが、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の二重特異性抗原結合分子。
  11. 第１の抗原結合部分のＶＨが、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の二重特異性抗原結合分子。
  12. 第２の抗原がＣＤ３である、請求項９から１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  13. 第２の抗原がＣＤ３εである、請求項９から１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  14. 第２の抗原結合部分が、配列番号１５のＨＣＤＲ１、配列番号１６のＨＣＤＲ２、及び配列番号１７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１８のＬＣＤＲ１、配列番号１９のＬＣＤＲ２及び配列番号２０のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む、請求項９から１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  15. 第２の抗原結合部分のＶＨが、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合部分のＶＬが、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の二重特異性抗原結合分子。
  16. 第２の抗原結合部分のＶＨが、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合部分のＶＬが、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の二重特異性抗原結合分子。
  17. 第１及び／又は第２の抗原結合部分がＦａｂ分子である、請求項９から１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  18. 第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが、又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が、互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、請求項９から１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  19. Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられている、請求項１８に記載の二重特異性抗原結合分子。
  20. 第１の抗原結合部分が、定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立してグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立してグルタミン酸（Ｅ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）Ｆａｂ分子である、請求項９から１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  21. 第１及び第２の抗原結合部分が、互いに融合している、請求項９から２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  22. 第１及び第２の抗原結合部分が、ペプチドリンカーを介して互いに融合している、請求項２１に記載の二重特異性抗原結合分子。
  23. 第１及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している、請求項９から２２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  24. 第１の抗原に特異的に結合する第３の抗原結合部分を含む、請求項９から２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  25. 第３の抗原結合部分が第１の抗原結合部分と同一である、請求項２４に記載の二重特異性抗原結合分子。
  26. 第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、請求項９から２５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  27. 第１の、第２の、及び存在する場合は第３の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり；
    （ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、且つ第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、且つ第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており；
    第３の抗原結合部分は、存在する場合は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、
    請求項２６に記載の二重特異性抗原結合分子。
  28. ＦｃドメインがＩｇＧのＦｃドメインである、請求項２６又は２７に記載の二重特異性抗原結合分子。
  29. ＦｃドメインがＩｇＧ１のＦｃドメインである、請求項２８に記載の二重特異性抗原結合分子。
  30. ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  31. Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、それよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な***が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、それよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それにより第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の***を収容可能な空洞が生成される、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  32. Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合を低減する及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸置換を含んでいる、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
  33. 請求項１から３２のいずれか一項に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド。
  34. 請求項３３に記載のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  35. ベクターが発現ベクターである、請求項３４に記載のベクター。
  36. 請求項３３に記載のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド又は請求項３４又は３５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  37. ＳＴＥＡＰ－１に結合する抗体又は二重特異性抗原結合分子の生成方法であって、請求項３６に記載の宿主細胞を、抗体又は二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程を含む、方法。
  38. 抗体又は二重特異性抗原結合分子を回収する工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 請求項３７又は３８に記載の方法によって生成される、ＳＴＥＡＰ－１に結合する抗体又は二重特異性抗原結合分子。
  40. 請求項１から３２のいずれか一項又は請求項３９に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
  41. 医薬としての使用のための、請求項１から３２のいずれか一項又は請求項３９に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子、又は請求項４０に記載の薬学的組成物。
  42. 疾患の治療における使用のための、請求項１から３２のいずれか一項又は請求項３９に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子、又は請求項４０に記載の薬学的組成物。
  43. 疾患ががんである、請求項４２に記載の、抗体、二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物。
  44. 疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１から３２のいずれか一項又は請求項３９に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子の使用。
  45. 前記疾患ががんである、請求項４４に記載の使用。
  46. がんを治療するための医薬であって、請求項１から３２のいずれか一項又は請求項３９に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子、又は請求項４０に記載の薬学的組成物を含む、医薬。
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