JP2017509355A - 単一ドメイン結合タンパク質を作る非ヒト動物 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、米国特許法第119条(e)の下で、2014年3月21日出願の米国仮出願シリアル番号第61/968,986号及び2014年3月21日出願の米国仮出願シリアル番号第61/968,905号の利益を主張し、当該出願の双方は、参照によりその全体が本明細書に共に援用される。
免疫グロブリン重鎖遺伝子座の高い多様性を示し、且つ好適には免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の低い多様性を示し、VH単一ドメイン結合タンパク質及びVL単一ドメイン結合タンパク質を含む抗原と結合する単一ドメイン抗原結合タンパク質の選択を可能にする非ヒト動物を提供する。
本発明は記載する特定の方法及び実験条件に限定されるものではなく、したがって、方法及び条件は変化し得る。本明細書で用いる専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のために過ぎず、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定を意図するものでない。
本明細書では、(a)インタクトなIgM CH1定常領域を保持しながら機能的CH1ドメインが不活性化及び/または除去された1つ以上の非IgM免疫グロブリン定常領域を含む改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の重鎖可変領域または軽鎖可変領域遺伝子配列によってそれぞれコードされてもよい、単一ドメイン抗原結合タンパク質(例えば、VHまたはVL単一ドメイン結合タンパク質)、及び/または(b)軽鎖遺伝子座の単一の再構成された可変遺伝子配列(例えば、免疫グロブリンカッパ遺伝子座に挿入された単一の再構成されたVκ:Jκ遺伝子配列)によってコードされてもよい、遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖を含む遺伝子改変された非ヒト動物を提供する。
本明細書では、2種類の単一ドメイン抗原結合タンパク質すなわち(1)再構成された重鎖可変領域遺伝子配列によってコードされるVH単一ドメイン結合タンパク質及び(2)再構成された軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされるVL単一ドメイン結合タンパク質を含む遺伝子改変された非ヒト動物を提供し、単一ドメイン抗原結合タンパク質の各々は、インタクトなIgM CH1定常領域を保持しながら機能的CH1ドメインが不活性化及び/または除去された1つ以上の非IgM免疫グロブリン定常領域を含む改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によってもコードされている。
更なる実施形態では、本明細書では、(a)内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の少なくとも1つの内在性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子のCH1ドメインをコードするヌクレオチド配列における欠失または不活性化変異であり、ここで、該少なくとも1つの内在性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子は、IgG、IgA、IgE、IgD、またはそれらの組み合わせであるものと、(b)VL及びJL遺伝子セグメント配列を含んでいる単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域VL/JL遺伝子配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座であり、ここで、該単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列は免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、例えば、単一軽鎖をコードするものと、場合によっては、更に(c)内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の内在性VH、DH、JH遺伝子セグメントの、少なくとも1つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)遺伝子セグメント及び少なくとも1つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結(JL)遺伝子セグメントを含む核酸配列による置き換えであり、該再構成されていないVL及びJL遺伝子セグメントの各々は、CH1ドメインをコードするヌクレオチド配列における欠失または不活性化変異を含む免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL/JL)ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能であるものと、を含む非ヒト動物を提供する。
本明細書に開示する非ヒト動物の作製方法も提供する。係る方法は、(a)該非ヒト動物の重鎖免疫グロブリン遺伝子座(IgG1重鎖遺伝子座など)の、CH1ドメイン、及び場合によってはヒンジ領域(複数可)を不活性化または欠失させること、遺伝子操作された再構成された軽鎖遺伝子座をコードする核酸を導入すること、及び該動物に、不活性化されたCH1ドメインを有する重鎖免疫グロブリン遺伝子座と遺伝子的に再構成された軽鎖遺伝子座(ULC)とを発現させることを含む。
一旦、単一ドメイン抗原結合タンパク質及び/または遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖を産生することができる遺伝子操作された動物が得られると、ある抗原に対する免疫グロブリンと結合タンパク質調製物は、該動物にその抗原によって免疫することによって容易に得られる。本明細書で用いられる場合「ポリクローナル抗血清組成物」には、親和性精製されたポリクローナル結合タンパク質調製物を含む。
実施例1.1:動物の作製
参照により本明細書に援用されるMacdonaldらのUS2011/0145937に記載の方法に従って、完全で機能的なIgM遺伝子配列、及び機能的CH1遺伝子配列を欠き、場合によっては機能的ヒンジ領域を欠いているIgG1遺伝子配列を含む重鎖遺伝子座を含むように遺伝子改変されたマウス(図1A)を作製した。種々の組み合わせの重鎖定常遺伝子配列を欠き、CH1ドメイン(複数可)の欠失を含むが、完全で機能的なIgMを含んだマウスのいくつかのバージョンを作製した(図3)。例えば、マウス重鎖可変遺伝子セグメント、及び完全で機能的なIgM遺伝子配列、及び、機能的CH1遺伝子配列及びヒンジ領域を欠いているIgG1遺伝子配列を含んだ重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウス(mVHIgG1ΔCH1&ヒンジ;1576HO、図3及び4Bの「II」)を作製した。更に、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント、及び完全で機能的なIgM遺伝子配列、機能的なCH1遺伝子配列及びヒンジ領域を欠いているIgG1遺伝子配列を含み、且つIgG2b及びIgG2a遺伝子配列を欠いている重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウス(hVHIgG1ΔCH1&ヒンジΔIgG2b/2a;1859HO、例えば、図3の「IV」を参照)を作製した。更に、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント及び完全で機能的なIgM遺伝子配列、機能的なCH1遺伝子配列を欠いたIgG1遺伝子配列を含み、且つIgG2b及びIgG2a遺伝子配列を欠いている重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウス(hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2a;1673HO、例えば、図3及び4Aの「III」を参照)を作製した。更に、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント及び完全で機能的なIgM遺伝子配列、機能的CH1を欠いたIgG1遺伝子配列を含み、且つIgD、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE、及びIgA遺伝子配列を欠いている重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウス(hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2aΔIgG3ΔIgD/A/E;6180HO、図3及び4C〜Dの「V」を参照)を作製した。重鎖定常領域の改変の追加の例示のバージョンを図3に示す。CH1欠失/不活性化及び/または免疫グロブリン定常遺伝子欠失/不活性化の組み合わせの他の変形例を作成する。例えば、IgG1及びIgG2aの両方がCH1ドメイン欠失を含んでいるマウスを作製し、該マウスはまた、IgD、IgE、IgG3、及びIgG2bの欠失も含む。図4に示すように、重鎖遺伝子座は、ヒト可変領域(ヒト重鎖可変領域またはヒト軽鎖可変領域でもよい)を含むように改変することもできる(図16、以下の実施例2及び3を参照)。重鎖遺伝子座はAdam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方、あるいは該遺伝子の断片を含むように改変することもでき、ここで、該遺伝子またはその断片は雄マウスにおいて機能的である(例えば、参照により本明細書に援用されるU.S.2012/0322108を参照)。
異なる抗原を用いて改変についてホモ接合性のマウスに免疫し、種々のアジュバントを用い、様々な経路により追加免疫した。IgG1特異的応答の力価をELISAまたはウエスタンブロットにより評価した。
本明細書に示す種々の細胞表面マーカーのフローサイトメトリーを用いて、B細胞発生及びB細胞成熟の進行について、改変されたCH1ドメイン及び単一の再構成された軽鎖(ULC)(図2を参照)についてホモ接合性のマウスからの脾臓、血液及び骨髄コンパートメントのB細胞含有物を分析した。
実施例2.1:動物の生成
軽鎖遺伝子セグメントを重鎖遺伝子座に導入したマウスは米国特許出願公開第2012/0096572号に記載のように生成した。具体的には、VELOCIGENE(登録商標)遺伝子工学技術を用いてマウスゲノムのバクテリア人工染色体(BAC)ライブラリーを改変して、種々のターゲティングコンストラクトを作製した(例えば、米国特許第6,586,251号及びValenzuela,D.M.,Murphy,A.J.,Frendewey,D.,Gale,N.W.,Economides,A.N.,Auerbach,W.,Poueymirou,W.T.,Adams,N.C.,Rojas,J.,Yasenchak,J.,Chernomorsky,R.,Boucher,M.,Elsasser,A.L.,Esau,L.,Zheng,J.,Griffiths,J.A.,Wang,X.,Su,H.,Xue,Y.,Dominguez,M.G.,Noguera,I.,Torres,R.,Macdonald,L.E.,Stewart,A.F.,DeChiara,T.M.,Yancopoulos,G.D.(2003)“High−throughput engineering of the mouse genome coupled with high−resolution expression analysis”,Nat Biotechnol 21,652−659を参照)。相同組換えによりマウスBAC DNAを改変してVH、DH及びJH遺伝子セグメントのターゲティングされた欠失を通して内在性マウス重鎖遺伝子座を不活性化し、続いて再構成されていないヒト生殖系列κ軽鎖遺伝子配列を挿入した(図15の上)。
(a)軽鎖可変領域と、IgG1遺伝子において機能的CH1ドメインを欠き、且つ更にIgG2b遺伝子及びIgG2a遺伝子を欠いている重鎖定常遺伝子配列とを含んでいる重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウス、(b)対照野生型、及び(c)ヒト重鎖V、D及びJセグメントを発現し、IgG1遺伝子における機能的CH1ドメインを欠き、且つ機能的IgG2b及びIgG2a遺伝子も欠き、且つ共通またはユニバーサル軽鎖とも呼ばれる単一の再構成された軽鎖遺伝子座(例えば、米国特許出願公開第2011/0195454号参照)を含む改変されたマウス重鎖遺伝子座について双方ホモ接合性の対照CH1 del x ULCマウスの脾臓及び骨髄からB細胞のmRNAを単離した。TAQMANアッセイにおいて以下のプローブ及びプライマーを用いて、単離したmRNAの生産的な再構成を分析した:
hJk/mIgG1ヒンジ−セット71(Biosearch Technologiesに注文)
(センス)5’−GGACCAAGCTGGAGATCAAAC−3’(配列番号1)、
(アンチセンス)5’−CTTCTGGGACTGTACATATGCAA−3’(配列番号2)、
(プローブ)5’−FAM−CCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCC−BHQ1−3’(配列番号3);
hJH/mIgG1ヒンジ−セット72(Applied Biosystemsに注文)
(センス)5’−TGGTCACCGTCTCCTCAGTG−3’(配列番号4)、
(アンチセンス)5’−CACACGTGACCTTAGGAGTCAGAG−3’(配列番号5)、
(プローブ)5’−FAM−TGGTTGTAAGCCTTGC−MGB−3’(配列番号6);
mHPRT1−セット51(Biosearch Technologiesに注文)
(センス)5’−CGAGTCTGAAGCTCTCGATTTCCT−3’(配列番号7)、
(アンチセンス)5’−CAGCCAACACTGCTGAAACATG−3’(配列番号8)、
(プローブ)5’−FAM−CAGCATCTAAGAGGTTTTGCTCAGTGGA−BHQ−3(配列番号9)’;
単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域を含んでいるVELOCIMMUNE(登録商標)ヒト化マウス(ULC Vκ3−20Jκ1;1635、あるいは、ULC Vκ1−39Jκ5;1633も使用する)を、IgG1 CH1ドメイン、IgG2a遺伝子及びIgG2b遺伝子が欠失または不活性化されたネズミ定常領域に作動可能に連結されるヒト軽鎖カッパ可変領域を含んでいる改変された重鎖遺伝子座を担持するマウス(hVκIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2b;6082)と交配して以下の後代マウスを得た:hVκIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2b x Vκ3−20Jκ1 ULCホモ接合マウス(6082HO 1635HO)。これらのマウスはVL単一ドメイン結合タンパク質を発現した(図18)。
Claims (100)
- 生殖系列に以下を含む、遺伝子改変された非ヒト動物:
(a)内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における少なくとも1つの内在性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子のCH1ドメインをコードするヌクレオチド配列における欠失または不活性化変異であって、前記少なくとも1つの内在性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子が、IgG、IgA、IgE、IgD、またはそれらの組み合わせである前記欠失または不活性化変異、及び
(b)以下の(i)または(ii)のいずれか、または両方:
(i)少なくとも1つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)遺伝子セグメント及び少なくとも1つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結(JL)遺伝子セグメントを含む核酸配列であって、前記再構成されていないVL及びJL遺伝子セグメントが、前記CH1ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列において前記欠失または不活性化変異を含む前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL/JL)ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能である、前記核酸配列、
(ii)VL及びJL遺伝子セグメント配列を含んでいる単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域VL/JL遺伝子配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座であって、前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座。 - 前記少なくとも1つの再構成されていないVL遺伝子セグメント、前記少なくとも1つの再構成されていないJL遺伝子セグメント、及び/または前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域VL/JL遺伝子配列が、ヒト型である、請求項1に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記免疫グロブリン軽鎖定常領域及び/または前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、非ヒト型である、請求項2に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記少なくとも1つの再構成されていないVL遺伝子セグメント及び前記少なくとも1つの再構成されていないJL遺伝子セグメントが、ヒトカッパセグメントである、請求項2に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記少なくとも1つの再構成されていないVL遺伝子セグメント及び前記少なくとも1つの再構成されていないJL遺伝子セグメントが、前記内在性免疫グロブリン重鎖における1つ以上の内在性VH、DH、JH遺伝子セグメントを置き換える、請求項1に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記少なくとも1つの再構成されていないVL遺伝子セグメント及び前記少なくとも1つの再構成されていないJL遺伝子セグメントが、前記内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座における全てのまたは実質的に全ての内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを置き換える、請求項5に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 全てのまたは実質的に全ての内在性重鎖可変領域遺伝子セグメント及び/または全てのまたは実質的に全ての内在性軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、欠失されているか、または機能的に不活性化されている、請求項1に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域VL/JL遺伝子配列が、ヒトVκ1−39/J遺伝子配列、またはヒトVκ3−20/J遺伝子配列である、請求項2に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記ヒトVκ1−39/J遺伝子配列が、ヒトJκ5遺伝子セグメントとともに再構成されたヒトVκ1−39遺伝子セグメントを含む、請求項8に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- ヒトVκ3−20/J遺伝子配列が、ヒトJκ1遺伝子セグメントとともに再構成されたヒトVκ3−20遺伝子セグメントを含む、請求項8に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記動物が、(i)少なくとも1つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)遺伝子セグメント及び少なくとも1つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結(JL)遺伝子セグメントを含む核酸配列を含まず、前記再構成されていないVL及びJL遺伝子セグメントが、前記CH1ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異を含む前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL/JL)ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能であり、前記重鎖遺伝子座が、非ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントを含む、請求項1に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記動物が、(i)少なくとも1つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)遺伝子セグメント及び少なくとも1つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結(JL)遺伝子セグメントを含む核酸配列を含まず、前記再構成されていないVL及びJL遺伝子セグメントが、前記CH1ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異を含む前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL/JL)ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能であり、前記重鎖遺伝子座が、ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントを含む、請求項1に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントが、全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを置き換える、請求項12に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である、請求項1に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である、請求項1に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記単一の再構成された軽鎖VL/JL遺伝子配列が、前記非ヒト動物の全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを置き換える、請求項1に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域VL/JL遺伝子配列が、ヒト生殖系列VL及びヒト生殖系列JL遺伝子セグメント配列を含む、請求項2に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、不活性化されたヒンジ領域を更に含む、請求項1に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- CH1ドメインをコードするヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異が、IgG1配列におけるものであり、前記内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、IgD、IgG3、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgE、IgA、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される免疫グロブリン遺伝子の欠失または不活性化変異を更に含む、請求項1に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、前記IgG2a及びIgG2b免疫グロブリン遺伝子において欠失または不活性化変異を更に含む、請求項19に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、前記IgG2b及びIgG2c免疫グロブリン遺伝子において欠失または不活性化変異を更に含む、請求項19に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、前記IgG3、IgD、IgA、及びIgE免疫グロブリン遺伝子において欠失または不活性化変異を更に含む、請求項19に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記非ヒト動物が、雄非ヒト動物において機能的なAdam6遺伝子またはその一部を更に含み、前記Adam6遺伝子が、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方である、請求項1に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記動物が、その血清中に、機能的CH1ドメインを欠いている抗原特異的単一ドメイン抗原結合タンパク質を更に含む、請求項1に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記動物が、機能的CH1ドメインを含んでいるIgM重鎖を更に含む、請求項24に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、前記CH1ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異を含む前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される前記再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL/JL)ヌクレオチド配列によってコードされるVL単一ドメイン結合タンパク質である、請求項24に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されるVL及びJL遺伝子セグメント配列を含む前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされる遺伝子操作されたユニバーサル軽鎖を更に含む、請求項25に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、前記CH1ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異を含んでいる前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される前記再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL/JL)ヌクレオチド配列によってコードされるVL単一ドメイン抗原結合タンパク質であり、且つ、前記非ヒト動物が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されるVL及びJL遺伝子セグメント配列を含んでいる前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされる遺伝子操作されたユニバーサル軽鎖を更に含む、請求項25に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記単一ドメイン抗原結合タンパク質の少なくとも1つの重鎖が、機能的ヒンジ領域を更に欠いている、請求項24に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、及びIgG3からなる群より選択されるIgGアイソタイプを有する、請求項24に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、ヒト可変ドメイン及び非ヒト定常ドメインを含む、請求項24に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、単量体である、請求項24に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- IgM重鎖が同族軽鎖と会合する、請求項25に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記同族軽鎖は、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されるVL及び/またはJL遺伝子セグメント配列を含んでいる前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされるユニバーサル軽鎖である、請求項33に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 高力価の前記単一ドメイン抗原結合タンパク質を更に含む、請求項24に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記抗原特異的単一ドメイン抗原結合タンパク質の前記力価が、少なくとも1×102μg/mL、少なくとも1×103μg/mL、少なくとも1×104μg/mL、または少なくとも1×105μg/mLである、請求項35に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記単一ドメイン抗原結合タンパク質の前記力価が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されるVL及びJL遺伝子セグメント配列を含んでいる前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされる遺伝子操作されたユニバーサル軽鎖を発現しない対応する対照動物の、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍である、請求項35に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記力価が、酵素結合免疫測定法によって決定される、請求項35に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 前記動物が、げっ歯類である、請求項1に記載の遺伝子改変された動物。
- 前記げっ歯類が、ラットまたはマウスである、請求項39に記載の遺伝子改変された動物。
- 前記動物が、マウスである、請求項40に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 遺伝子改変されたマウスであって、
(a)マウス重鎖遺伝子座における、全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン重鎖V、D、及びJ遺伝子セグメントの、
(i)1つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖VH遺伝子セグメント、1つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖DH遺伝子セグメント、及び1つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖JH遺伝子セグメントであって、前記1つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖VH、DH、及びJH遺伝子セグメントがマウス重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、前記遺伝子セグメント、または、
(ii)1つ以上の再構成されていないヒト軽鎖VL遺伝子セグメント及び1つ以上の再構成されていないヒト軽鎖JL遺伝子セグメントであって、前記1つ以上の再構成されていないヒト軽鎖VL、及びJL遺伝子セグメントがマウス重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、
前記マウス重鎖定常領域遺伝子配列が、完全長IgM遺伝子、及びIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるIgG遺伝子においてCH1ドメインをコードするヌクレオチド配列における欠失または不活性化変異を含む、前記遺伝子セグメント、
のいずれかによる置き換え、
(b)全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメントの、単一の再構成されたヒト可変Vκ/Jκ遺伝子配列による置き換えを含み、前記マウスが、同族軽鎖と会合するIgM重鎖を含むB細胞受容体を発現する、前記遺伝子改変されたマウス。 - 以下を含む請求項1に記載の遺伝子改変された非ヒト動物の作製方法:
(a)前記非ヒト動物の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において少なくとも1つの非ヒト重鎖定常領域を改変して、前記重鎖定常領域がIgG、IgA、IgE、IgD、またはそれらの組み合わせのCH1ドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失または不活性化変異を含むようにすること、及び、
(b)以下の(i)または(ii)のいずれか、または両方:
(i)前記内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に核酸配列を挿入することであって、前記核酸配列が、少なくとも1つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)遺伝子セグメント及び少なくとも1つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結(JL)遺伝子セグメントを含み、前記再構成されていないVL及びJL遺伝子セグメントが、前記CH1ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異を含んでいる前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL/JL)ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能である、挿入すること、及び/または
(ii)VL及びJL遺伝子セグメント配列を含んでいる単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域VL/JL遺伝子配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を導入することであって、前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、導入すること。 - ステップ(a)が、前記改変されたCH1ドメインを含んでいる、前記IgG、IgA、IgE、IgD、またはその組み合わせのヒンジ領域を欠失または不活性化させることを更に含む、請求項43に記載の方法。
- ステップ(a)が、前記重鎖免疫グロブリン遺伝子座の1つ以上の内在性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントをヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントによって置き換え、前記重鎖免疫グロブリン遺伝子座の発現がヒトイディオタイプを含む重鎖可変ドメインを生じさせるようにすることを更に含み、前記方法が、(b)(i)前記内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に核酸配列を挿入することを含まず、前記核酸配列が、少なくとも1つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)遺伝子セグメント及び少なくとも1つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結(JL)遺伝子セグメントを含み、ここで、前記再構成されていないVL及びJL遺伝子セグメントが、前記CH1ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異を含んでいる前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL/JL)ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能である、請求項43に記載の方法。
- 前記挿入ステップが、前記重鎖免疫グロブリン遺伝子座の1つ以上の内在性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを前記再構成されていない軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントにより置き換えて、前記重鎖免疫グロブリン遺伝子座の発現が、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、CH1ドメインを欠いている免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含んでいるVL単一ドメイン結合タンパク質を生じるようにすることを含む、請求項43に記載の方法。
- 前記免疫グロブリン定常領域遺伝子が、非ヒトである、請求項46に記載の方法。
- 前記再構成されていない軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントが、ヒトセグメントである、請求項47に記載の方法。
- 前記再構成されていない軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントが、ヒトカッパセグメントである、請求項48に記載の方法。
- 前記再構成されていない軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントが、ヒトラムダセグメントである、請求項48に記載の方法。
- 前記再構成されていない軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントが、前記内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、全てのまたは実質的に全ての内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを置き換える、請求項46に記載の方法。
- CH1ドメインをコードするヌクレオチド配列の前記欠失または不活性化変異が、IgG遺伝子においてである、請求項43に記載の方法。
- CH1ドメインをコードするヌクレオチド配列の前記欠失または不活性化変異が、IgG1遺伝子においてである、請求項52に記載の方法。
- 前記重鎖免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト可変ドメインをコードする可変領域遺伝子セグメント及び非ヒト定常ドメインをコードする定常領域遺伝子を含む、請求項43に記載の方法。
- 免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、ユニバーサル軽鎖をコードする、請求項43に記載の方法。
- 前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域VL/JL遺伝子配列が、ヒトVL/JL遺伝子配列である、請求項55に記載の方法。
- 前記ヒトVL/JL遺伝子配列が、ヒトVκ1−39/J遺伝子配列、またはヒトVκ3−20/J遺伝子配列である、請求項56に記載の方法。
- 前記ヒトVκ1−39/J遺伝子配列が、ヒトJκ5遺伝子セグメントとともに再構成されたヒトVκ1−39遺伝子セグメントを含む、請求項57に記載の方法。
- 前記ヒトVκ3−20/J遺伝子配列が、ヒトJκ1遺伝子セグメントとともに再構成されたヒトVκ3−20遺伝子セグメントを含む、請求項57に記載の方法。
- 前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、請求項43に記載の方法。
- 前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、請求項43に記載の方法。
- 前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域が、前記非ヒト動物の全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントを置き換える、請求項43に記載の方法。
- 前記核酸配列及び/または単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、前記非ヒト動物の生殖系列にある、請求項43に記載の方法。
- 前記CH1の欠失または不活性化変異が、IgG1におけるものであり、前記方法が、(c)IgD、IgG3、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgE、IgA、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される免疫グロブリン遺伝子を欠失または不活性化させることを更に含む、請求項43に記載の方法。
- 前記IgG2a及びIgG2b免疫グロブリン遺伝子が、欠失または不活性化される、請求項64に記載の方法。
- 前記IgG2b及びIgG2c免疫グロブリン遺伝子が、欠失または不活性化される、請求項64に記載の方法。
- IgG3、IgD、IgA、及びIgE免疫グロブリン遺伝子が、欠失または不活性化される、請求項64に記載の方法。
- 前記非ヒト動物が、げっ歯類である、請求項43に記載の方法。
- 前記げっ歯類が、ラットまたはマウスである、請求項68に記載の方法。
- 前記げっ歯類が、マウスである、請求項69に記載の方法。
- CH1ドメインを欠いている抗原特異的IgG単一ドメイン結合タンパク質の生成方法であって、全部または一部において、前記方法が、以下のステップを含む方法:
(a)遺伝子改変された非ヒト動物に前記抗原で免疫することであって、前記遺伝子改変された非ヒト動物が、
(i)内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における少なくとも1つの内在性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子のCH1ドメインをコードするヌクレオチド配列における欠失または不活性化変異であって、前記少なくとも1つの内在性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子が、IgG、IgA、IgE、IgD、またはそれらの組み合わせである前記欠失または不活性化変異、及び
(ii)以下の1または2のいずれか、または両方:
1.少なくとも1つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)遺伝子セグメント及び少なくとも1つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結(JL)遺伝子セグメントを含んでいる核酸配列であって、前記再構成されていないVL及びJL遺伝子セグメントが、前記CH1ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異を含んでいる前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL/JL)ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能である、前記核酸配列、及び/または
2.VL及びJL遺伝子セグメント配列を含んでいる単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域VL/JL遺伝子配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座であって、前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座、
を含む、前記免疫することと、
(b)前記マウスが:
(i)2つの同族軽鎖と会合された2つのIgM重鎖を含んでいるIgM抗体;及び
(ii)機能的CH1ドメインを欠いている少なくとも1つの重鎖を含んでいる単一ドメイン抗原結合タンパク質を発現するように、前記マウスを維持すること。 - 前記少なくとも1つの重鎖定常領域遺伝子が、IgG1、IgG2b、IgG2a、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項71に記載の方法。
- 前記重鎖定常領域遺伝子が、IgG1定常領域遺伝子である、請求項72に記載の方法。
- 前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、前記CH1ドメインを全て欠いている、請求項71に記載の方法。
- 前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、ヒト重鎖可変領域を含む、請求項71に記載の方法。
- 前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、ヒト軽鎖可変領域を含む、請求項71に記載の方法。
- 前記同族軽鎖が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列によってコードされたユニバーサル軽鎖である、請求項71に記載の方法。
- 前記非ヒト動物が、内在性軽鎖を発現しない、請求項77に記載の方法。
- 前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、ヒトVκ1−39/J遺伝子配列またはヒトVκ3−20/J遺伝子である、請求項77に記載の方法。
- 前記ヒトVκ1−39/J遺伝子配列が、ヒトJκ5遺伝子セグメントとともに再構成されたヒトVκ1−39遺伝子セグメントを含む、請求項79に記載の方法。
- 前記ヒトVκ3−20/J遺伝子配列が、ヒトJκ1遺伝子セグメントとともに再構成されたヒトVκ3−20遺伝子セグメントを含む、請求項79に記載の方法。
- (c)前記ヒト動物から前記抗原と特異的に結合する細胞またはタンパク質を単離することを更に含み、前記細胞またはタンパク質が、体細胞変異された単一ドメイン抗原結合タンパク質を含む、請求項71に記載の方法。
- (d)(c)で単離された前記細胞から、前記単一ドメイン抗原結合タンパク質の前記可変ドメインをコードする第1の核酸を単離することを更に含む、請求項82に記載の方法。
- 最終ステップとして、(e)ベクターを発現させるのに十分な条件で、前記ベクターをトランスフェクトした細胞を培養することを更に含み、前記ベクターが、ヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される第2の核酸を含み、前記第2の核酸が、ステップ(d)で単離した前記第1の核酸と同一または実質的に同一である、請求項83に記載の方法。
- 前記重鎖定常領域遺伝子が、IgG1、IgG2a、IgG2b、及びIgG3からなる群より選択されるヒトIgG定常領域遺伝子である、請求項84に記載の方法。
- (d)ハイブリドーマ培養物から上清を採取するステップを更に含み、前記ハイブリドーマが、(c)で単離された前記細胞から生成される、請求項82に記載の方法。
- (e)(d)で生成された前記ハイブリドーマから、前記単一ドメイン抗原結合タンパク質の前記可変ドメインをコードする第1の核酸を単離することを更に含む、請求項86に記載の方法。
- (f)ベクターでトランスフェクトした細胞を、前記ベクターを発現させるのに十分な条件で培養することを更に含み、前記ベクターが、ヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される第2の核酸を含み、前記第2の核酸が、ステップ(e)で単離した前記第1の核酸と同一または実質的に同一である、請求項87に記載の方法。
- 前記重鎖定常領域遺伝子が、IgG1、IgG2a、IgG2b、及びIgG3からなる群より選択されるヒトIgG定常領域遺伝子である、請求項88に記載の方法。
- 請求項82に記載の方法に従って単離された前記細胞から生成されるハイブリドーマ。
- 請求項83に記載の方法に従って単離された核酸。
- 請求項87に記載の方法に従って単離された核酸。
- 請求項83に記載の核酸と同一または実質的に類似する核酸を含む細胞。
- 請求項87に記載の核酸と同一または実質的に類似する核酸を含む細胞。
- 請求項1に記載の非ヒト動物の単離された細胞。
- 前記細胞が、胚性幹(ES)細胞またはB細胞である、請求項95に記載の単離された細胞。
- 機能的CH1ドメインを欠いている重鎖定常領域に作動可能に連結される軽鎖可変ドメインを含む、単一ドメイン抗原結合タンパク質。
- 請求項1に記載の非ヒト動物から単離される、単一ドメイン抗原結合タンパク質。
- 請求項42に記載のマウスから単離される、単一ドメイン抗原結合タンパク質。
- 請求項71に記載の方法に従って生成される、単一ドメイン抗原結合タンパク質。
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