CN117715933A - 抗vista的构建体及其用途 - Google Patents

抗vista的构建体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN117715933A
CN117715933A CN202280032211.6A CN202280032211A CN117715933A CN 117715933 A CN117715933 A CN 117715933A CN 202280032211 A CN202280032211 A CN 202280032211A CN 117715933 A CN117715933 A CN 117715933A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
sequence seq
cdr2
cdr3
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280032211.6A
Other languages
English (en)
Inventor
陈梓榕
J·李
A·诺顿
S·王
L·吴
Z·夏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dangkang Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Dangkang Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dangkang Biotechnology Co ltd filed Critical Dangkang Biotechnology Co ltd
Publication of CN117715933A publication Critical patent/CN117715933A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

本申请提供了与VISTA结合的抗VISTA构建体(例如，抗VISTA抗体)、编码抗VISTA氨基酸序列的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、包含所述载体的宿主细胞、制备所述抗VISTA构建体的方法、包含所述抗VISTA构建体的药物组合物、以及使用所述抗VISTA构建体或组合物的方法。

Description

抗VISTA的构建体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年3月5日提交的美国临时申请63/157,182的优先权，出于所有目的通过引用将其全部内容并入本文。
技术领域
本申请涉及抗VISTA构建体(例如抗VISTA抗体)及其用途。
提交ASCII文本文件上的序列表
以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：193852000440SEQLIST.TXT，记录日期：2022年3月2日，大小：24,739字节)。
背景技术
VISTA(也称为程序性死亡-1同源物、PD-1H、VSIR、Dies1、DD1α、Gi24)是T细胞和骨髓细胞上表达的B7/CD28基因家族的细胞表面抑制分子。VISTA可以作为抗原呈递细胞(APC)的抑制性配体发挥作用，并通过未知受体调节T细胞反应。此外，VISTA还可以作为T细胞上的抑制性受体。例如，激动剂VISTA单克隆抗体(mAh)可显著调节抗原特异性CD4+T细胞反应，并保护小鼠免受移植物抗宿主病(GVHD)和实验性肝炎。C57BL/6背景上VISTA缺乏的小鼠(B6 PD-1H KO)在与狼疮倾向株回交时更容易受到自身免疫诱导，例如实验性自身免疫脑脊髓炎和***性狼疮。VISTA已被证明参与外周免疫耐受并负调节T细胞激活。参见例如Sci Transl Med.，2019年12月11日；11(522)。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容均通过引用整体并入本文。
发明内容
本申请一方面提供了一种抗VISTA构建体，其包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述抗体部分与抗体或抗体片段竞争VISTA的结合抗原表位，所述抗体或抗体片段包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，其中：
a)所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQID NO:2的HC-CDR2、以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3，并且VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2、以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3；
b)所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQID NO:10的HC-CDR2、以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的的HC-CDR3，并且VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的LC-CDR3；
c)所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQID NO:18的HC-CDR2、以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的HC-CDR3，并且VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的LC-CDRl、包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的LC-CDR2、以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的LC-CDR3；
d)所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQID NO:26的HC-CDR2、以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HC-CDR3，所述VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的LC-CDRl、包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的LC-CDR2、以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的LC-CDR3；
e)所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQID NO:34的HC-CDR2、以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:35的HC-CDR3，所述VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的LC-CDR2、以及包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3，或在所述HC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；并且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQID NO:4的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3，或在所述LC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQID NO:10的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3，或在所述HC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；并且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的LC-CDR3，或在所述LC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，该VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的HC-CDR3，或在所述HC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的LC-CDR3，或在所述LC-CDRs中包含5、4、3、2、或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，该VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HC-CDR3，或在所述HC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且该VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的LC-CDR3，或在所述LC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:35的HC-CDR3，或所述HC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的LC-CDR3，或在所述LC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:42或51的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3；并且该VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ IDNO:46的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQID NO:47的LC-CDR3。在一些实施方案中，所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:44或52的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:45的HC-CDR3；并且该VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56或57的LC-CDR3。在一些实施方案中，该VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:41或43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58中任一个的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11或45的HC-CDR3；并且该VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQID NO:49的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:50或53的LC-CDR3。
在另一方面，本申请提供了一种抗VISTA构建体，其包含特异性结合VISTA的抗体部分，该抗VISTA构建体包含：
HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:7所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2及CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQID NO:8所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
b)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:15所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:16所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
c)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:23所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:24所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
d)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:31所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:32所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或
e)HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:39所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:40所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在根据上述任何抗VISTA构建体的一些实施方案中，所述VH包含SEQ ID NO:7、15、23、31和39中任一个的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；和/或其中所述VL包含SEQ ID NO:8、16、24、32和40中任一个的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；并且该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:15，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；并且该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:16，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:23，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；并且该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:24，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:31，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；并且该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，该VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:39，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；并且该VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:40，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
在根据上述任何抗VISTA构建体的一些实施方案中，抗体部分是选自下组的抗体或抗原结合片段：全长抗体、双特异性抗体、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、Fv-Fc融合体、scFv-Fc融合体、scFv-Fv融合体、双价抗体、三价抗体和四价抗体。在一些实施方案中，所述抗体部分是全长抗体。
在根据上述任何抗VISTA构建体的一些实施方案中，抗体部分具有Fc片段，所述Fc片段选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其组合和杂合体的Fc片段。在一些实施方案中。Fc片段选自来自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4及其组合和杂合体的Fc片段。在一些实施方案中，与相应的野生型Fc片段相比，Fc片段具有降低的效应子功能。在一些实施方案中，与相应的野生型Fc片段相比，Fc片段具有延长的半衰期。
在根据上述任何抗VISTA构建体的一些实施方案中，该抗VISTA构建体的抗体部分激活VISTA的下游信号传导途径。
在根据上述任何抗VISTA构建体的一些实施方案中，该抗VISTA构建体是VISTA的激动剂抗体。在一些实施方案中，该抗VISTA构建体的抗体部分激活或增强VISTA的下游信号传导途径至少约20％。
在根据上述任何抗VISTA构建体的一些实施方案中，该VISTA是人VISTA。
在另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含上述抗VISTA构建体和药学上可接受的载体。
在另一方面，本申请提供了一种分离的核酸，其编码上述抗VISTA构建体。
在另一方面，本申请提供了一种载体，其包含上述分离的核酸序列。
在另一方面，本申请提供了一种分离的宿主细胞，其包含上述分离的核酸序列或载体。
在另一方面，本申请提供了一种免疫缀合物，其包含与治疗剂或标记连接的上述抗VISTA构建体。
在另一方面，本申请提供了一种产生抗VISTA构建体的方法，包括：a)在有效表达抗VISTA构建体的条件下培养上述分离的宿主细胞；b)从宿主细胞获得表达的抗VISTA构建体。
在另一方面，本申请提供了治疗个体的疾病或病症的方法，包括向个体施用有效量的上述抗VISTA构建体或药物组合物。在一些实施方案中，所述疾病或病症与失调的免疫***相关。在一些实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植相关的病症。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣、自身免疫性肠道病症、***性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。在一些实施方案中，将抗VISTA构建体静脉内或皮下施用于个体。在一些实施方案中，抗VISTA构建体以约0.001mg/kg至约100mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，所述个体是人。
在另一方面，本申请提供了包含上述抗VISTA构建体的试剂盒。
附图说明
图1显示了通过ELISA测定的三只免疫的VISTA敲除小鼠血清中的抗人VISTA抗体滴度。
图2显示了通过ELISA测定的三只免疫的VISTA敲除小鼠血清中的抗小鼠VISTA抗体滴度。
图3显示了各种抗VISTA抗体针对人、小鼠和食蟹猴VISTA胞外结构域的结合活性。
图4A-4B使用荧光激活细胞分选(FACS)显示各种抗VISTA抗体针对表达Jurkat-hVISTA和Jurkat-mVISTA的细胞的结合活性。
图5A-5B显示了不同浓度的9F9在表达Jurkat-NFKb-GFP/hVISTA-hCD3z的细胞中对VISTA下游途径的激活。
图6A-6B显示了不同浓度的20E4在表达Jurkat-NFKb-GFP/hVISTA-hCD3z的细胞中对VISTA下游途径的激活。
图7比较了不同浓度的各种抗VISTA抗体在表达Jurkat-NFKb-GFP/hVISTA-hCD3z的细胞中激活VISTA下游途径的能力。
图8A-8B显示了不同浓度的9F9在抗CD3抗体(OKT3)存在的情况下、在表达Jurkat-NFKb-GFP/hVISTA-hCD3z的细胞中对VISTA下游途径的激活。
图9A-9B显示了不同浓度的20E4在OKT3存在的情况下、在表达Jurkat-NFKb-GFP/hVISTA-hCD3z的细胞中对VISTA下游途径的激活。
图10比较了不同浓度的各种抗VISTA抗体在OKT3存在下、在表达Jurkat-NFKb-GFP/hVISTA-hCD3z的细胞中激活VISTA下游途径的能力。
图11A-11B使用荧光激活细胞分选(FACS)显示与表达Jurkat-hVISTA和Jurkat-mVISTA的细胞系特异性结合的各种重组mIgG1抗VISTA抗体(9F9、16A1、17E7、20E4、V4)。
图12使用荧光激活细胞分选(FACS)显示在表达Jurkat-NFKb-GFP/hVISTA-hCD3z的细胞系中重组mIgG1抗VISTA(9F9)具有活化作用。
图13使用荧光激活细胞分选(FACS)显示在表达Jurkat-NFKb-GFP/hVISTA-hCD3z的细胞系中重组mIgG1抗VISTA(17E9)具有活化作用。
图14使用荧光激活细胞分选(FACS)显示在表达Jurkat-NFKb-GFP/hVISTA-hCD3z的细胞系中重组mIgG1抗VISTA(16A1)具有活化作用。
图15使用荧光激活细胞分选(FACS)显示在表达Jurkat-NFKb-GFP/hVISTA-hCD3z的细胞系中重组mIgG1抗VISTA(20E4)具有活化作用。
图16显示了通过Octet竞争进行的抗VISTA抗体的抗原表位分组(epitopebinning)分析。
图17A-17C通过生物膜干涉技术(BLI)测定显示抗VISTA mAb的人、食蟹猴和小鼠VISTA抗原交叉结合活性。
图18A-18E显示各种抗VISTA mAb针对人或食蟹猴VISTA的结合活性。
图19显示抗VISTA mAb对T细胞增殖的抑制作用。
图20显示小鼠狼疮治疗模型的实验方案的总结。
图21A显示分别在12、14、15周龄用mIgG、MH5A、9F9和20E4处理的小鼠中的***肿大。图21B显示在19周时从20E4组中的一只小鼠的颈部区域移除的***。
图22显示在用mIgG、MH5A、9F9和20E4处理后的小鼠中抗核免疫球蛋白的血清水平。
图23显示在用mIgG、MH5A、9F9和20E4处理后的小鼠中抗dsDNA免疫球蛋白的血清水平。
图24显示在用mIgG、MH5A、9F9和20E4处理后的小鼠中IFNa的血清水平。
图25显示用mIgG、MH5A、9F9和20E4处理后的12周龄小鼠的尿蛋白水平。
图26显示用mIgG、MH5A、9F9和20E4处理后的15周龄小鼠的尿蛋白水平。
图27显示用mIgG、MH5A、9F9和20E4处理后的17周龄小鼠在皮肤狼疮病变的变化。
图28显示注射同种型对照的小鼠与用抗VISTA抗体9F9或20E4处理的小鼠相比的体重变化。
图29显示注射同种型对照的小鼠与用抗VISTA抗体9F9或20E4处理的小鼠相比的血液中人CD45+细胞的水平。
图30显示注射同种型对照的小鼠与用抗VISTA抗体9F9或20E4处理的小鼠相比的皮肤剥脱。
发明详述
本申请提供了特异性结合VISTA的新型抗VISTA构建体、制备所述抗VISTA构建体的方法、使用该构建体的方法(例如，治疗疾病或病症的方法)。示例性抗VISTA构建体包括能够结合并激活VISTA的激动剂抗体。
I、定义
术语“抗体”以其最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、全长抗体及其抗原结合片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。术语“抗体部分”是指全长抗体或其抗原结合片段。
全长抗体包含两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原结合。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“VH”和“VL”。两条链中的可变区通常包含三个高度可变的环，称为互补决定区(CDR)(轻链(LC)CDR包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，重链(HC)CDR包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3)。本文公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可以通过Kabat、Chothia或Al-Lazikani的惯例(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat 1991)来定义或鉴定。重链或轻链的三个CDR***称为框架区(FR)的侧翼延伸之间，框架区比CDR更高度保守，并形成支撑所述高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出各种效应功能。抗体根据其重链恒定区的氨基酸序列进行分类。抗体的五个主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征是分别存在α、δ、ε、γ和μ重链。几个主要抗体类别被分为亚类，例如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。本文还考虑了嵌合Fc区(例如IgG2/4混合物)。
本文使用的术语“抗原结合片段”是指抗体片段，包括例如双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双特异抗体(ds双特异抗体)、单链Fv(scFv)、scFv二聚体(二价双特异抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或与抗原结合但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够结合于与亲本抗体或亲本抗体片段(例如亲本scFv)所结合抗原相同的抗原。在一些实施方案中，抗原结合片段可包含来自特定人抗体的一个或多个CDR，该CDR接枝至来自一种或多种不同人抗体的框架区。
“Fv”是最小的抗体片段，包含完整的抗原识别和结合位点。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。这两个结构域的折叠产生六个高变环(来自重链和轻链的各3个环)，它们为抗原结合提供氨基酸残基，并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或仅包含对抗原具有特异性的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力通常低于整个结合位点。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施方案中，scFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。有关scFv的综述，请参阅Plückthun，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”意指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区域已由Kabat et al.,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences ofproteins of immunological interest”(1991)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.et al.,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum etal.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan and Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.et al.,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；以及Honeggerand Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)描述，其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体或移植抗体或其变体的CDR旨在落入本文所定义和使用的术语的范围内。包含上述各参考文献所定义的CDR的氨基酸残基列于下表1中作为比较。CDR预测算法和界面是本领域已知的，包括例如Abhinandan and Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Ehrenmann F.et al.,Nucleic Acids Res.,38:D301-D307(2010)；和Adolf-Bryfogle J.et al.,Nucleic Acids Res.,43:D432-D438(2015)。本段中引用的参考文献的内容通过引用整体并入本文，以用于本申请并可能包含在本文的一项或多项权利要求中。在一些实施方案中，本文提供的CDR序列基于IMGT定义。例如，CDR序列可以通过VBASE2工具(http://www.vbase2.org/vbase2.php，也参见RetterI、Althaus HH、Münch R、Müller W:VBASE2,an integrative V gene database.NucleicAcids Res.2005年1月1日；33(数据库发布)：D671-4，其全部内容通过引用并入本文)测定。
表1：CDR定义
Kabat1 Chothia2 MacCallum3 IMGT4 AHo5
VH CDR1 31-35 26-32 30-35 27-38 25-40
VH CDR2 50-65 53-55 47-58 56-65 58-77
VH CDR3 95-102 96-101 93-101 105-117 109-137
VL CDR1 24-34 26-32 30-36 27-38 25-40
VL CDR2 50-56 50-52 46-55 56-65 58-77
VL CDR3 89-97 91-96 89-96 105-117 109-137
1残基编号遵循Kabat等人(见上文)的命名法、
2残基编号遵循Chothia等人(见上文)的命名法、
3残基编号遵循MacCallum等人(见上文)的命名法、
4残基编号遵循Lefranc等人(见上文)的命名法、
5残基编号遵循Honegger和Plückthun(见上文)的命名法。
“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变体，是指Kabat等人(见上文)的用于抗体的汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号***。使用该编号***，实际的线性氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FR或高变区(HVR)的缩短或***的更少或额外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包括H2的残基52之后的单个氨基酸***(根据Kabat的残基52a)和重链FR残基82后的***残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定抗体的残基Kabat编号可根据在抗体序列的同源区与“标准”Kabat编号序列比对来确定。
除非本文另有说明，免疫球蛋白重链中残基的编号是如上文Kabat等人的EU索引的编号。“如在Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”残基是除本文定义的CDR残基之外的那些可变结构域残基。
非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式是含有源自非人抗体的最小序列的嵌合抗体。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区(HVR)的残基被来自诸如具有所需抗体特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的非人物种(供体抗体)的高变区残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修改是为了进一步完善抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的基本上所有可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。更多细节参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)。
“人抗体”是具有对应于由人产生和/或已经使用本文公开的用于制备人抗体的任何技术制备的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术来产生，包括噬菌体呈现文库。Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner et al.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)中描述的方法也可用于制备人单克隆抗体。另请参见van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。人抗体可以通过向转基因动物施用抗原来制备，所述转基因动物已被修饰以响应抗原攻击而产生此类抗体，但其内源基因座已失能，例如免疫的异种小鼠(xenomouse)(参见例如关于XENOMOUSETM技术的美国专利第6,075,181号和6,150,584号)。另请参见，例如关于通过人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体的Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。
关于本文鉴定的多肽和抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比”或“同源性”定义为在序列比对后，在将任何保守取代考虑为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中与所比较多肽中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式来实现，例如使用公开可用的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或MUSCLE软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，就本文的目的而言，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序MUSCLE产生的(Edgar,R.C.,Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797,2004；Edgar,R.C.,BMCBioinformatics 5(1):113,2004)。
“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较的序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一个中的一个位置被腺嘌呤占据，则这些分子在该位置处是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共享的匹配或同源位置的数量除以所比较位置的数量乘以100的函数。例如，如果两个序列中的10个位置中有6个匹配或同源，则这两个序列有60％同源性。举例来说，氨基酸序列TKLEIK和TALGIE具有50％的同源性。通常，当两个序列比对以给出最大同源性时进行比较。
术语“恒定区”是指具有比含有抗原结合位点的免疫球蛋白的部分(也即可变区)更保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子的另一部分。恒定区包含重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称为CH)和轻链的CHL(或CL)结构域。
来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”都可以根据其恒定区的氨基酸序列分为两种称为kappa(“K”)和lambda(“l”)的明显不同的类型之一。
“CH1结构域”(也称为“H1”结构域的“C1”)通常从约氨基酸118延伸至约氨基酸215(EU编号***)。
“铰链区”一般定义为IgG中对应于人IgGl的Glu216至Pro230的区域(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放置在相同位置，可以将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列比对。
人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“C2”结构域)通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340。CH2结构域的独特之处在于它不与另一个结构域紧密配对。相反，两个N连接的分支碳水化合物链***完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测，碳水化合物可能为结构域-结构域配对提供替代品，并有助于稳定CH2结构域。Burton,Molec Immunol.22:161-206(1985).
“CH3结构域”(也称为“C2”结构域)包含Fc区中CH2结构域C端的残基延长段(即从抗体序列的约氨基酸残基341到C端末端，通常位于IgG的氨基酸残基446或447处)。
术语“Fc区”或“片段可结晶区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能有所不同，但人IgG重链Fc区通常定义为从Cys226位的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基端。Fc区的C端赖氨酸(根据EU编号***的残基447)可以例如在抗体的生产或纯化过程中去除，或者通过重组工程化编码抗体重链的核酸来去除。在某些情况下，Fc区后续的C端甘氨酸(根据EU编号***的残基446)也可能被去除。因此，完整抗体的组合物可包含已去除所有K447残基的抗体群、没去除K447残基的抗体群、以及含有具有和不具有K447残基的抗体的混合物的抗体群。适用于本文所述抗体的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和交替剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞浆区。活化受体FcγRIIA在其胞浆区中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞浆区中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见M.Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997).FcRs are reviewed in Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel et al.,Immunomethods 4:25-34(1994)；andde Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995))。本文涵盖新生儿Fc受体(FcRN)。本文中的术语“FcR”也涵盖包括将来待鉴定的FcR的其他FcR。
本文使用的术语“抗原表位”是指抗体或抗体部分结合的抗原上的特定原子或氨基酸基团。如果两个抗体或抗体部分表现出对抗原的竞争性结合，则它们可以结合抗原内的相同抗原表位。
如本文所用，当在等摩尔浓度的第一抗体或其片段存在下，第一抗体或其片段将第二抗体或其片段靶抗原结合抑制至少约50％(诸如至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％中的任一个)时，第一抗体或其片段与第二抗体或其片段“竞争”结合于靶抗原，或反之亦然。PCT公开号WO03/48731中描述了基于抗体的交叉竞争而将其“分组”的高通量方法。
如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”和“对……具有特异性”是指可测量且可再现的相互作用，例如靶标与抗体或抗体部分之间的结合，其在存在异质分子群(包括生物分子)的情况下决定了靶标的存在。例如，特异性识别靶标(其可以是抗原表位)的抗体或抗体部分是以比其与其他靶标的结合更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合该靶标的抗体或抗体部分。在一些实施方案中，抗体与无关靶标的结合程度小于抗体与靶标结合的约10％，例如通过放射免疫分析(RIA)所测量的。在一些实施方案中，特异性结合靶标的抗体的解离常数(KD)为≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10- 10M、≤10-11M或≤10-12M。在一些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上的抗原表位，该抗原表位在来自不同物种的蛋白质中是保守的。在一些实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他性结合。抗体或抗原结合结构域的结合特异性可以通过本领域已知的方法通过实验确定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、EIA、BIACORETM测试和肽扫描。
“分离的”抗体(或构建体)是已经从其生产环境(例如天然的或重组的)的成分中鉴定、分离和/或回收的抗体(或构建体)。优选地，分离的多肽不与其生产环境中的所有其他组分结合。
编码本文所述的构建体、抗体或其抗原结合片段的“分离的”核酸分子是从至少一种污染物核酸分子中鉴定和分离的核酸分子，该污染物核酸分子在其被生产的环境中通常与其相关。优选地，分离的核酸与所有与生产环境相关的组分无关联。编码本文所述的多肽和抗体的分离的核酸分子的形式不同于其在自然界中发现的形式或设定。因此，分离的核酸分子与本文所述的天然存在于细胞中的编码多肽和抗体的核酸不同。分离的核酸分子包括通常含有核酸分子的细胞中所含的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色***置不同的染色***置处。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中时，核酸被“可操作地连接”。例如，如果前序列(presequence)或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它与该多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子与该编码序列可操作地连接；或者，如果核糖体结合位点的位置便于翻译，则该位点与编码序列可操作地连接。一般而言，“可操作地连接”是指所连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的并且在阅读框中。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在方便的限制性位点处连接来完成的。如果这样的位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸转接器或接头。
如本文所用，术语“载体”是指能够增殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入其所引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移至或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代个体细胞及其后代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“被转化的细胞”，其包括初级转化细胞和由其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，并且可能含有突变。本文包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代。
术语“免疫缀合物”包括治疗剂或可检测标记物与抗体(如本文所述的抗体部分)的共价连接。该连接可以是直接的或通过接头(例如肽接头)间接的。
如本文所用，“治疗(treatment/treating)”是用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。出于本申请的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下一种或多种：减轻由疾病引起的一种或多种症状、减轻疾病的程度、稳定疾病病情(例如，预防或延缓疾病恶化)、预防或延缓疾病的扩散(例如，转移)、预防或延缓疾病的复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延缓疾病进展、提高或改善生活质量、增加体重增加、和/或延长生存期。本申请的方法考虑了治疗的这些方面中的任何一个或多个。
术语“抑制(inhibition/inhibit)”是指任何表型特征的减少或停止，或者指该特征的发生率、程度或可能性的减少或停止。“减少”或“抑制”是指使活性、功能和/或量与参考相比减少、降低或抑制。在某些实施方案中，“减少”或“抑制”是指引起总体减少20％或更多的能力。在另一个实施方案中，“减少”或“抑制”是指引起总体减少50％或更多的能力。在又一个实施方案中，“减少”或“抑制”是指引起总体减少75％、85％、90％、95％或更多的能力。
如本文所用，“参考”是指用于比较目的的任何样品、标准或水平。参考可以从健康和/或未患病的样品获得。在一些实施方案中，参考可以从未经处理的样品获得。在一些实施方案中，参考是从个体的未患病或未治疗的样本获得的。在一些实施方案中，参考是从不是个体或患者的一个或多个健康个体获得的。
如本文所用，“延迟疾病的发展”是指推迟、阻碍、减缓、阻滞、稳定、抑制和/或延迟疾病的发展。这种延迟的时间长度可能不同，具体取决于疾病史和/或接受治疗的个体。如本领域技术人员显而易见的，充分或显著的延迟实际上可以涵盖预防，使得该个体不发展该疾病。
本文所用的“预防”包括对可能易患该疾病但尚未诊断出患有该疾病的个体中疾病的发生或复发提供预防。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施方案中，个体是人类。
药剂的“有效量”是指在必需的剂量和时间段内有效实现期望的治疗或预防结果的量。具体的剂量可以根据以下一项或多项而变化：所选择的特定药剂、要遵循的给药方案、是否与其他化合物联合施用、施用时间、要成像的组织以及携带其的物理递送***。
术语“药物制剂”和“药物组合物”是指这样的制剂，其形式使得活性成分的生物活性有效，并且不含有对将施用该制剂个体具有不可接受的毒性的附加成分。此类制剂可以是无菌的。
“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一起使用的本领域常规的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料、配制助剂或载体，它们一起构成用于施用于个体的“药物组合物”。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的并且与制剂的其他成分相容。药学上可接受的载体适合于所采用的制剂。
“无菌”制剂是无菌的或基本上不含活微生物及其孢子。
与一种或多种另外的治疗剂“组合”施用包括同时(并行)和以任何顺序连续或顺序施用。
如本文所用，术语“并行”是指施用两种或更多种治疗剂，其中所述施用的至少一部分在时间上重叠，或者其中一种治疗剂的施用相对于另一种治疗剂的施用落在短时间内。例如，两种或更多种治疗剂以不超过约60分钟的时间间隔施用，例如不超过约30、15、10、5或1分钟中的任一个。
如本文所用，术语“依次”是指施用两种或更多种治疗剂，其中在停止施用一种或多种其他药剂后继续施用一种或多种药剂。例如，两种或更多种治疗剂以超过约15分钟的时间间隔施用，例如约20、30、40、50或60分钟、1天、2天、3天、1周、2周、1个月或更长时间中的任一种。
如本文所用，“结合”是指除了一种治疗方式之外还施用另一种治疗方式。因此，“结合”是指在向个体施用一种治疗方式之前、期间或之后施用另一种治疗方式。
术语“药品说明书”用于指通常包含在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于与使用此类治疗产品有关的适应症、用法、剂量、给药、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
“制品”是包含至少一种试剂的任何制品(例如，包装或容器)或试剂盒，例如用于治疗疾病或病症的药物，或用于特异性检测本文所述的生物标志物的探针。在某些实施方案中，制品或试剂盒作为用于执行本文描述的方法的单元进行推广、分销或销售。
应当理解，本文描述的本申请的实施方案包括“由......组成”和/或“基本上由......组成”的实施方案。
本文提及的“约”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所使用的，提及“不是”某值或参数通常意味着并描述“不同于”某值或参数。例如，该方法不用于治疗X型疾病意味着该方法用于治疗X型以外的类型的疾病。
本文使用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a/an)”、“或”和“该”包括复数(个)指示物，除非上下文另外明确指示。
II.抗VISTA构建体
本申请提供了抗VISTA构建体，其包含如本文所述特异性结合VISTA的抗VISTA抗体部分。
VISTA
T细胞活化的V区Ig抑制因子(VISTA)(也称为PD-1H、Gi24、Dies-1或DD1a)是最近鉴定的CD28/B7基因家族的细胞表面共抑制分子。据报道，VISTA可以作为抗原呈递细胞的抑制性配体发挥作用并调节T细胞反应，通过基因敲除或拮抗性抗体消除VISTA可以增强小鼠模型中针对肿瘤的T细胞免疫反应。VISTA还可能在炎症和自身免疫性疾病的调控中发挥关键作用，如移植物抗宿主病(GVHD)、急性肝炎、脑炎、狼疮、哮喘和牛皮癣的小鼠模型中显示的。VISTA还可以作为T细胞的共抑制受体。VISTA激动性mAh可显著调节抗原特异性CD4 T细胞反应，并保护小鼠免受GVHD、急性肝炎和哮喘的侵害。参见Files et al.,J.Immunol.187,1537–1541(2011)；Files et al.,J.Clin.Invest.124,1966–1975(2014)；和Liu et al.,Cell.Mol.Immunol.15,838–845(2018).***癌患者的VISTA上调也被证明与伊匹单抗(CTLA-4mAh)耐药相关。此外，已显示靶向VISTA可以与其他非冗余途径(例如PD-1阻断)协同作用，以在实验小鼠模型中实现最佳的肿瘤清除功效。参见Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.112,6682–6687(2015)。因此，VISTA可能是调节免疫反应的重要分子和免疫治疗的潜在靶点。
VISTA基因位于10q22.1。它在黑猩猩、牛、小鼠、大鼠、鸡、斑马鱼和青蛙中保守。人类VISTA序列可以通过NCBI参考号NM_022153找到。人VISTA蛋白具有311个氨基酸(NCBI参考号：NP_071436.1，SEQ ID NO:59)。
抗VISTA抗体部分
在一些实施方案中，抗VISTA构建体包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争VISTA的结合抗原表位，其中所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQID NO:3的HC-CDR3，并且VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3，或其在所述HC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；并且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3，或其在所述LC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方案中，氨基酸取代限于本申请表2中所示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是衍生自抗VISTA抗体的人源化抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3，且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3。
在一些实施方案中，抗体部分包含：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有如SEQ ID NO:7所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有如SEQ ID NO:8所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；且VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，抗VISTA构建体包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争VISTA的结合抗原表位，其中所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQID NO:11的HC-CDR3，且VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3，或其在所述HC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；并且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的LC-CDR3，或其在所述LC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请表2中所示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是衍生自抗VISTA抗体的人源化抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQID NO:13的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的LC-CDR3。
在一些实施方案中，抗体部分包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有如SEQ ID NO:15所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有如SEQ ID NO:16所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:15，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；且VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:16，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，抗VISTA构建体包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争VISTA的结合抗原表位，其中所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQID NO:19的HC-CDR3，且VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的HC-CDR3，或其在所述HC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的LC-CDR3，或其在所述LC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请表2中所示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是衍生自抗VISTA抗体的人源化抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)包含案基酸序列SEQ ID NO:17的HC-CDR1、ii)包含案基酸序列SEQ ID NO:18的HC-CDR2、和iii)包含案基酸序列SEQ ID NO:19的HC-CDR3，且VL包含：i)包含案基酸序列SEQ ID NO:20的LC-CDR1、ii)包含案基酸序列SEQID NO:21的LC-CDR2、和iii)包含案基酸序列SEQ ID NO:22的LC-CDR3。
在一些实施方案中，抗体部分包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:23所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:24所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH包含案基酸序列SEQ ID NO:23，或含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的案基酸序列的变体；且VL包含案基酸序列SEQ ID NO:24，或含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的案基酸序列的变体。
在一些实施方案中，抗VISTA构建体包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争VISTA的结合抗原表位，其中VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ IDNO:25的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HC-CDR3，且VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQID NO:29的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HC-CDR3，或其在所述HC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的LC-CDR3，或其在所述LC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，前述氨基酸取代限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方案中，氨基酸取代限于本申请表2中所示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是衍生自抗VISTA抗体的人源化抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQID NO:29的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的LC-CDR3。
在一些实施方案中，抗体部分包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:31所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，分别包含具有SEQ ID NO:32所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:31，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，或包含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，抗VISTA构建体包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中该抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争VISTA的结合抗原表位，其中所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQID NO:35的HC-CDR3，且VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:35的HC-CDR3，或其在所述HC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的LC-CDR3，或其在所述LC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，前述氨基酸取代限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方案中，所述氨基酸取代限于本申请表2中所示的“优选取代”。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是衍生自抗VISTA抗体的人源化抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:35的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQID NO:37的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的LC-CDR3。
在一些实施方案中，抗体部分包含HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:39所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:40所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:39，或含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；且VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:40，或含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。
在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的LC-CDR3。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是衍生自抗VISTA抗体的人源化抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQID NO:13的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56的LC-CDR3。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是源自抗VISTA抗体的人源化抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQID NO:55的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56的LC-CDR3。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是衍生自抗VISTA抗体的人源化抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQID NO:55的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的LC-CDR3。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是衍生自抗VISTA抗体的人源化抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQID NO:55的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HC-CDR3；且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的LC-CDR3。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是衍生自抗VISTA抗体的人源化抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQID NO:55的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的LC-CDR3。
在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:49的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:53的LC-CDR3。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是衍生自抗VISTA抗体的人源化抗体，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQID NO:49的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:53的LC-CDR3。
在一些实施方案中，构建体包含或者是选自以下的抗体或其抗原结合片段：全长抗体、双特异性抗体、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab’片段、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合体、scFv-Fc融合体、scFv-Fv融合体、双价抗体、三价抗体和四价抗体。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是全长抗体。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是scFv。
在一些实施方案中，上述抗VISTA抗体部分包含选自下组的免疫球蛋白的Fc片段：IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其组合和杂合体。在一些实施方案中，上述抗VISTA抗体部分或全长抗体包含选自下组的免疫球蛋白的Fc片段：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其组合和杂合体。在一些实施方案中，与相应的野生型Fc片段相比，所述Fc片段具有减弱的效应子功能。在一些实施方案中，与相应的野生型Fc片段相比，所述Fc片段具有增强的效应子功能。
在一些实施方案中，抗体部分包含本文所述的任何抗体部分的人源化抗体。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分结合人VISTA和食蟹猴VISTA两者。在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分结合人VISTA和小鼠VISTA两者。在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分结合人VISTA、食蟹猴VISTA和小鼠VISTA。在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分不结合食蟹猴VISTA和/或小鼠VISTA。
在一些实施方案中，抗VISTA构建体的抗体部分激活VISTA的下游信号传导途径。在一些实施方案中，抗VISTA构建体是VISTA的激动剂抗体。
在一些实施方案中，与参考构建体(例如不激活VISTA的相应构建体，例如包含诸如1E8的参考激动剂抗VISTA抗体的相应构建体)相比，抗VISTA构建体的抗体部分将VISTA的下游信号传导途径活化或增强至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。
在一些实施方案中，抗VISTA构建体包含或者是抗VISTA融合蛋白。在一些实施方案中，抗VISTA构建体包含抗VISTA抗体部分(例如抗VISTA scFv)和第二部分。在一些实施方案中，第二部分包含半衰期延长部分。在一些实施方案中，半衰期延长部分是白蛋白结合部分(例如，白蛋白结合抗体部分)。在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分和半衰期延长部分通过接头(例如肽接头，例如GS接头)连接。
在一些实施方案中，抗VISTA构建体包含或是抗VISTA免疫缀合物，其包含抗VISTA抗体部分(例如本文所述的任何VISTA抗体部分)和第二试剂。在一些实施方案中，第二试剂是治疗剂。在一些实施方案中，第二试剂是标记物。
在一些实施方案中，VISTA是人VISTA。
a)抗体亲和力
抗体部分的结合特异性可以通过本领域已知的方法通过实验确定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、EIA、BIACORETM测试和肽扫描。
在一些实施方案中，抗体部分与VISTA之间结合的KD为约10-7M至约10-12M、约10-7M至约10-8M、约10-8M至约10-9M、约10-9M至约10-10M、约10-10M至约10-11M、约10-11M至约10-12M、约10-7M至约10-12M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M、约10-7M至约10-11M、约10-8M至约10-11M、约10-9M至约10-11M、约10-7M至约10-10M、约10-8M至约10-10M、或约10- 7M至约10-9M。在一些实施方案中，抗体部分与VISTA之间结合的KD高于约10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M中的任一个。在一些实施方案中，VISTA是人VISTA。
在一些实施方案中，抗体部分和VISTA之间结合的Kon为约103M-1s-1至约108M-1s-1、约103M-1s-1至约104M-1s-1、约104M-1s-1至约105M-1s-1、约105M-1s-1至约106M-1s-1、约106M-1s-1至约107M-1s-1、或约107M-1s-1至约108M-1s-1。在一些实施方案中，抗体部分与VISTA之间结合的Kon为约103M-1s-1至约105M-1s-1、约104M-1s-1至约106M-1s-1、约105M-1s-1至约107M-1s-1、约106M- 1s-1至约108M-1s-1、约104M-1s-1至约107M-1s-1、或约105M-1s-1至约108M-1s-1。在一些实施方案中，抗体部分与VISTA之间结合的Kon不超过约103M-1s-1、104M-1s-1、105M-1s-1、106M-1s-1、107M- 1s-1或108M-1s-1中的任一个。在一些实施方案中，VISTA是人VISTA。
在一些实施方案中，抗体部分和VISTA之间结合的Koff为约1s-1至约10-6s-1、约1s-1至约10-2s-1、约10-2s-1至约10-3s-1、约10-3s-1至约10-4s-1、约10-4s-1至约10-5s-1、约10-5s-1至约10-6s-1、约1s-1至约10-5s-1、约10-2s-1至约10-6s-1、约10-3s-1至约10-6s-1、约10-4s-1至约10-6s-1、约10-2s-1至约10-5s-1、或约10-3s-1至约10-5s-1。在一些实施方案中，抗体部分与VISTA之间结合的Koff为至少约1s-1、10-2s-1、10-3s-1、10-4s-1、10-5s-1或10-6s-1中的任一个。在一些实施方案中，VISTA是人VISTA。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分或抗VISTA构建体的结合亲和力比现有抗VISTA抗体(例如抗人VISTA抗体，例如1E8)更高(例如具有更小的KD值)。
b)嵌合或人源化抗体
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是嵌合抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠的可变区)和人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已从亲本抗体的类别或亚类发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体是人源化抗体。通常，非人抗体被人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR例如CDR(或其部分)衍生自非人抗体，且FR(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体任选地还包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所源自的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法综述于例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并被进一步描述于例如Riechmann et al.,Nature332:323-329(1988)；Queen et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号、和第7,087,409号；Kashmiri et al.,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑(resurfacing”)；Dall’Acqua et al.,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR混排”)；以及Osbourn et al.,Methods 36:61-68(2005)and Klimka et al.,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR混排的“引导选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims et al.J.Immunol.151:2296(1993))；源自具有轻链或重链可变区特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta et al.J.Immunol.,151:2623(1993))；人类成熟(体细胞突变)框架区或人类种系框架区(参见，例如，Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和源自筛选FR文库的框架区(参见例如Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok et al.,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
应当理解，小鼠来源的抗体的人源化是常见且常规使用的技术。因此应当理解，序列表中公开的任何和所有抗VISTA抗体的人源化形式可以用于临床前或临床环境。在任何所提及的抗VISTA抗体或其抗原结合区的人源化形式用于这样的临床前或临床环境的情况下，则预期人源化形式具有与原始非人源化形式相同或相似的生物活性和概况。
c)人类抗体
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分是人抗体(称为人域抗体或人DAb)。人抗体可以使用本领域已知的各种技术来产生。人类抗体大体上描述于van Dijk and van deWinkel,Curr Opin Pharmacol.5:368-74(2001)、Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)和Chen,Mol.Immunol.47(4):912-21(2010)中。能够产生完全人单域抗体(或DAb)的转基因小鼠或大鼠是本领域已知的。参见，例如，US20090307787A1、美国专利第8,754,287号、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。
人抗体(例如，人DAb)可以通过向已被修饰以响应抗原挑战而产生完整人抗体、或具有人类可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备。此类动物通常含有全部或部分人类免疫球蛋白基因座，其取代内源性免疫球蛋白基因座，或者存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已失活。有关从转基因动物获得人类抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。也参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利第6,075,181号和第6,150,584号；描述技术的美国专利第5,770,429号；和描述K-M />技术的美国专利第7,041,870号；和描述/>技术的美国专利申请公开案第US2007/0061900号。来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区可以被进一步修饰，例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体(例如人DAb)也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其他方法包括例如美国专利第7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue 26(4):265-268(描述了人-人抗体杂交瘤)中描述的那些方法。人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)也描述于Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。
人抗体(例如人DAb)还可以通过分离选自人源噬菌体呈现文库的Fv克隆可变域序列来产生。然后可以将此类可变域序列与所需的人恒定区组合。下文描述了从抗体库中选择人抗体的技术。
d)源自文库的抗体
本文所述的抗VISTA抗体部分可以通过筛选组合文库中具有一种或多种所需活性的抗体来分离。例如，本领域已知用于产生噬菌体呈现文库和筛选此类文库中具有所需结合特性的抗体的多种方法。此类方法综述于例如Hoogenboom et al.in Methods inMolecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)，并进一步描述于例如McCafferty et al.,Nature 348:552-554；Clackson et al.,Nature352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks andBradbury,in Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。已描述了用于构建单域抗体文库的方法，例如参见美国专利第7371849号。
在某些噬菌体呈现方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因库，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以筛选其中的抗原结合噬菌体，如Winter et al.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常以scFv片段或Fab片段形式呈现抗体片段。来自免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以克隆初始库(例如从人类)，以提供针对多种非自身抗原和自身抗原的单一来源的抗体，而无需任何免疫，如Griffiths et al.,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，还可以通过克隆来自干细胞的未重排的V基因片段，并使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区域并在体外完成重排来合成原始文库，如Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)中所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括例如：美国专利第5,750,373号和美国专利公开第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号和第2009/0002360号。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
e)取代、***、缺失和变体
在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。取代诱变感兴趣的位点包括HVR(或CDR)和FR。保守取代显示在表2的“优选取代”标题下。表2的“示例性取代”标题下提供了更实质性的变化，并且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述。可以将氨基酸取代引入感兴趣的抗体中，并筛选产物的所需活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表2.氨基酸取代
/>
氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些类别之一的成员换为另一个类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化抗体或人类抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体将在某些生物学特性方面具有修饰(例如改进)(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。一种示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体呈现的亲和力成熟技术(例如本文描述的那些技术)方便地产生。简而言之，一个或多个HVR残基被突变，并且变体抗体呈现在噬菌体上并筛选特定的生物活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中进行改变(例如取代)，例如以提高抗体亲和力。可在HVR“热点”(即在体细胞成熟过程中高频突变的密码子编码的残基)(参见，例如Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行此类改变，测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建和从二级文库中重新选择来实现亲和力成熟描述于例如Hoogenboomet al.in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级库。然后筛选所述文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及将几个HVR残基(例如一次4-6个残基)随机分组的HVR定向的方法。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定参与抗原结合的HVR残基。尤其通常以CDR-H3和CDR-L3为目标。
在一些实施方案中，取代、***或缺失可以发生在一个或多个HVR内，只要此类改变实质上不降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在HVR中进行不实质降低结合亲和力的保守改变(例如，本文提供的保守取代)。此类更改可能位于HVR“热点”或CDR之外。
用于鉴定可作为诱变目标的抗体残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085中所述。在此方法中，鉴别一个残基或一组目标残基(例如，带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在氨基酸位置引入进一步的取代，从而证明对初始取代的功能敏感性。或者或另外，抗原-抗体复合物的晶体结构可鉴定抗体与抗原之间的接触点。这种接触残基和邻近的残基可以作为取代候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否包含所需的特性。
氨基酸序列***包括长度从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他***变体包括抗体的N或C末端与酶(例如，ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽的融合体。
f)糖基化变体
在一些实施方案中，改变抗VISTA抗体部分以提高或降低构建体糖基化的程度。在抗体上添加或删除糖基化位点可通过改变氨基酸序列从而产生或除去一个或多个糖基化位点来方便地实现。
当抗体部分包含Fc区时，可以改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖，其通常通过N-键连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如Wright et al.TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接至双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对抗体部分中的寡糖进行修饰以产生具有某些改进特性的抗体变体。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分具有缺少(直接或间接)连接至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中岩藻糖的量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％、或20％至40％。岩藻糖的量是通过相对于通过MAFDI-TOF质谱法测量的连接到Asn297的所有糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，计算糖链内Asn297处的岩藻糖的平均量来确定的，例如，如WO2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297(对Fc区残基的EU编号)处的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可能位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即位置294和300之间。这种岩藻糖基化变体可能具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开号US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”抗体变体相关的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al.J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lee 13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请第US2003/0157108 A1号，Presta,L；及WO 2004/056312A1,Adams等人,尤其实例11)以及基因敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8基因敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki etal.Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分具有二等分寡糖，例如，其中连接至抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类抗体变体可能具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO2003/011878(Jean-Mairet等人)中；美国专利第6,602,684号(Umana等人)；和US2005/0123546(Umana等人)。还提供了在连接至Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可能具有改进的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO1997/30087(Patel等人)；WO1998/58964(Raju,S.)；和WO1999/22764(Raju,S.)。
g)Fc区变异
在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分包含Fc片段。
术语“Fc区”、“Fc结构域”、“Fc片段”或“Fc”是指含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C端非抗原结合区。该术语包括天然Fc区和变异Fc区。在一些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在也可以不存在，而不影响Fc区的结构或稳定性。除非本文另有说明，IgG或Fc区中的氨基酸残基的编号是根据抗体的EU编号***，也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991中所描述。
在一些实施方案中，Fc片段是来自选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其组合和杂合体的免疫球蛋白。在一些实施方案中，Fc片段是来自选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其组合和杂合体的免疫球蛋白。
在一些实施方案中，Fc片段与相应的野生型Fc片段相比具有降低的效应子功能(例如根据抗体依赖性细胞毒性(ADCC)水平测量，效应器功能降低至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、或95％)。
在一些实施方案中，Fc片段是IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，IgG1 Fc片段包含L234A突变和/或L235A突变。在一些实施方案中，IgG1 Fc片段包含L235A突变和/或G237A突变。在一些实施方案中，Fc片段是IgG2或IgG4 Fc片段。在一些实施方案中，Fc片段是包含S228P、F234A和/或L235A突变的IgG4 Fc片段。在一些实施方案中，Fc片段包含N297A突变。在一些实施方案中，Fc片段包含N297G突变。
在一些实施方案中，可以将一种或多种氨基酸修饰引入抗体部分的Fc区中，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其包含在一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如取代)。
在一些实施方案中，Fc片段具有一些但不是全部的效应子功能，这使其成为对于抗体部分体内半衰期很重要，但某些效应子功能(例如补体和ADCC)是不必要的或有害的应用的理想候选者。可以进行体外和/或体内细胞毒性分析以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合分析以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的初级细胞NK细胞仅表达FcyRIII，而单核细胞表达FcyR I、FcyR11和FcyRIII。Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页表2总结了造血细胞上的FcR表达。用于评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利第5,500,362号(参见，例如Hellstrom,I.etal.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I et al.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987)).或者，可以采用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。用于此类分析的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，例如在Clynes et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA95:652-656(1998)中公开的动物模型中。还可以进行C1q结合分析以确认抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC分析(参见，例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.et al.,Blood 101:1045-1052(2003)；and Cragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法进行(参见，例如Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)).
效应子功能降低的抗体包括那些具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个被取代的抗体(美国专利第6,737,056号)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括将残基265和297取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。在一些实施方案中，Fc片段包含N297A突变。在一些实施方案中，Fc片段包含N297G突变。
描述了与FcR结合改善或减弱的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利第6,737,056号；WO 2004/056312及Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在一些实施方案中，Fc片段是IgG1 Fc片段。在一些实施方案中，IgG1 Fc片段包含L234A突变和/或L235A突变。在一些实施方案中，IgG1 Fc片段包含L235A突变和/或G237A突变。在一些实施方案中，Fc片段是IgG2或IgG4 Fc片段。在一些实施方案中，Fc片段是包含S228P、F234A和/或L235A突变的IgG4Fc片段。
在一些实施方案中，抗体部分包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸取代的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334处的取代(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，导致改变的(即，改善的或减弱的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利第6,194,551号、WO 99/51642及Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所描述。
在一些实施方案中，Fc片段在Thr250、Met252、Ser254、The256、Thr307、Glu380、Met428、His433和/或Asn434处具有一个或多个突变。
在一些实施方案中，抗体部分变体包含变体Fc区，所述变体Fc区包含改变半衰期和/或改变与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的一个或多个氨基酸取代。半衰期延长且与负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿Fc受体(FcRn)(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))的结合得到改善的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中。这些抗体包含其中具有一个或多个改变Fc区与FcRn的结合的取代的Fc区。此类Fc变体包括在Fc区残基中的一个或多个位置处具有取代的那些，例如Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
关于Fc区变体的其他实例还参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；以及WO 94/29351。
h)半胱氨酸工程改造的抗体变体
在一些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体部分，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在具体实施方案中，取代的残基出现在抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸取代这些残基，反应性硫醇基团由此定位在抗体的可接近位点处，并且可以用于将抗体缀合至其他部分，例如药物部分或接头-药物部分，以产生如本文进一步描述的免疫缀合物。在一些实施方案中，任何一个或多个以下残基可以被半胱氨酸取代：重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。经半胱氨酸工程改造的抗体部分可以如例如美国专利第7,521,541号中所述产生。
i)抗体衍生物
在一些实施方案中，本文所述的抗体部分可被进一步修饰以包含本领域已知的且容易获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-L,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制造中具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分枝的或非分枝的。连接到抗体的聚合物的数量可以变化，并且如果连接超过一种聚合物，则聚合物可以是相同或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于考虑因素来确定，包括但不限于待改进的抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的诊断等。
在一些实施方案中，抗体部分可以被进一步修饰以包含一种或多种生物活性蛋白质、多肽或其片段。“生物活性(Bioactive)”或“生物学上具有活性(biologicallyactive)”在本文中可互换使用，是指在体内表现出生物活性以执行特定功能。例如，它可以指与特定的生物分子如蛋白质、DNA等结合，然后促进或抑制该生物分子的活性。在一些实施方案中，生物活性蛋白或其片段包括作为活性药物物质施用于患者以预防或治疗疾病或病症的蛋白质和多肽，以及用于诊断目的的蛋白质和多肽，例如用于诊断分析或体外测定的酶，以及给予患者以预防疾病的蛋白质和多肽，例如疫苗。
III.制备方法
在一些实施方案中，提供了制备特异性结合VISTA的抗VISTA构建体或抗体部分的方法，以及在制备抗VISTA构建体或抗体部分的过程中所产生的组合物，例如多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞或培养基。本文描述的抗VISTA构建体或抗体部分或组合物可以通过如下文一般性描述且更具体地在实施方案(实施例)中描述的多种方法来制备。
抗体表达和生产
本文描述的抗体可以使用本领域任何已知的方法来制备，包括下文和实施例中描述的那些方法。
单克隆抗体
单克隆抗体是从基本上同质的抗体群体(即，除了可少量存在的可能天然发生的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之外，构成该群体的各个抗体是相同的)中获得的。因此，修饰语“单克隆”表明抗体不是离散抗体的混合物的特征。例如，单克隆抗体可以使用首先由Kohler et al.,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)来制备。在杂交瘤方法中，如上文所述免疫小鼠或其他合适的宿主动物(例如仓鼠或美洲驼)，以引发产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外对淋巴细胞进行免疫。然后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。另请参见实施例1了解骆驼的免疫接种。
免疫剂通常包括抗原蛋白或其融合变体。一般来说，如果需要人类来源的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者如果需要非人类哺乳动物来源的细胞，则使用脾细胞或***细胞。然后使用合适的融合剂例如聚乙二醇将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞。Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,AcademicPress(1986),pp.59-103。
永生化细胞系通常是被转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人类来源的骨髓瘤细胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。将由此制备的杂交瘤细胞接种并在合适的培养基中生长，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质可防止缺乏HGPRT的细胞生长。
优选的永生化骨髓瘤细胞是那些有效融合、支持由所选抗体产生细胞稳定高水平产生抗体、并且对培养基例如HAT培养基敏感的细胞。其中，优选的是鼠骨髓瘤系，例如可自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USA获得的来源于MOPC-21及MPC-11小鼠肿瘤的鼠类骨髓瘤株，和可自American Type Culture Collection,Manassas,Va.USA获得的SP-2细胞(及其衍生物，例如X63-Ag8-653)。人骨髓瘤和小鼠-人类异基因骨髓瘤细胞系也被描述用于生产人类单克隆抗体(Kozbor,J.,Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
分析杂交瘤细胞生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合分析法(例如放射免疫分析法(RIA)或酶联免疫吸附分析法(ELISA))来测定。
可以分析培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对所需抗原的单克隆抗体。优选地，单克隆抗体的结合亲和力和特异性可以通过免疫沉淀或通过体外结合分析法(例如放射免疫分析法(RIA)或酶联分析法(ELISA))来测定。此类技术和分析是本领域已知的。例如，结合亲和力可以通过Munson et al.,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来确定。
在鉴定产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，克隆可通过有限稀释程序被亚克隆并通过标准方法生长(Goding，同上)。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。也可以使用细胞分选仪。此外，杂交瘤细胞可以在哺乳动物体内作为肿瘤生长。
通过常规免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，适当地将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清分离。
单克隆抗体也可以通过重组DNA方法来制备，例如美国专利第4,816,567号中描述及如上文所述的那些方法。编码单克隆抗体的DNA很容易使用常规程序分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是此类DNA的优选来源。分离后，可将DNA放入表达载体中，然后将其转染至不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞中，例如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、HEK细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以便在此类重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于具有编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文章包括Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)和Plückthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可以从使用McCafferty等人，Nature 348:552-554(1990)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离抗体。Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)描述了使用噬菌体文库分别分离鼠和人抗体。后续的出版物描述了通过链改组生产高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等人,Bio/Technology,10:779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建超大噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。
DNA还可以被修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定区的编码序列取代同源鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison,et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列。通常，此类非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定区，或它们取代抗体的一个抗原结合位点的可变区，以产生嵌合二价抗体，其包含对抗原具有特异性的一个抗原结合位点和另一个对不同抗原具有特异性的抗原结合位点。
本文所述的单克隆抗体可以是单价的，其制备是本领域众所周知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和修饰的重链的重组表达。通常在Fc区的任何点处截短重链以防止重链交联。或者，相关的半胱氨酸残基可以被另一个氨基酸残基取代或被缺失以防止交联。体外方法也适用于制备单价抗体。可以使用本领域已知的常规技术来完成抗体的消化以产生其片段，特别是Fab片段。
嵌合或杂合抗体也可以使用合成蛋白质化学中的已知方法在体外制备，包括涉及交联剂的那些方法。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇酯和4-巯基丁酰亚胺。
编码抗体部分的核酸分子
在一些实施方案中，提供了编码本文所述的任何一种抗VISTA构建体或抗体部分的多核苷酸。在一些实施方案中，提供了使用本文所述的任何一种方法制备的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗体部分(例如抗VISTA抗体部分)的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗体部分(例如，抗VISTA抗体部分)的重链的多核苷酸和编码轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码重链的第一多核苷酸并且第二核酸分子包含编码轻链的第二多核苷酸。
在一些这样的实施方案中，重链和轻链由一个核酸分子表达，或由两个单独的核酸分子表达为两个单独的多肽。在一些实施方案中，例如当抗体是scFv时，单个多核苷酸编码包含连接在一起的重链和轻链的单个多肽。
在一些实施方案中，编码抗体部分(例如抗VISTA抗体部分)的重链或轻链的多核苷酸包含编码前导序列的核苷酸序列，该前导序列在翻译时位于重链或轻链的N末端。如上所述，前导序列可以是天然重链或轻链前导序列，或者可以是另一种异源前导序列。
在一些实施方案中，多核苷酸是DNA。在一些实施方案中，多核苷酸是RNA。在一些实施方案中，RNA是mRNA。
可以使用本领域常规的重组DNA技术构建核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子是适合在选定的宿主细胞中表达的表达载体。
核酸构建体
在一些实施方案中，提供了包含本文所述的任意一种多核苷酸的核酸构建体。在一些实施方案中，提供了使用本文描述的任何方法制备的核酸构建体。
在一些实施方案中，核酸构建体还包含可操作地连接至多核苷酸的启动子。在一些实施方案中，多核苷酸对应于基因，其中启动子是该基因的野生型启动子。
载体
在一些实施方案中，提供了一种载体，其包含编码本文所述的任何一个抗体部分(例如，抗VISTA抗体部分)或本文所述的核酸构建体的重链和/或轻链的任何多核苷酸。在一些实施方案中，提供了使用本文描述的任何方法制备的载体。还提供了如下载体，其包含编码本文所述的任一抗VISTA构建体(例如抗体、scFv、融合蛋白或本文所述的其他形式的构建体(例如抗VISTA scFv))的多核苷酸。此类载体包括但不限于DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施方案中，载体包含编码重链的第一多核苷酸序列和编码轻链的第二多核苷酸序列。在一些实施方案中，重链和轻链作为两个单独的多肽从载体表达。在一些实施方案中，重链和轻链表达为单个多肽的一部分，例如当抗体是scFv时。
在一些实施方案中，第一载体包含编码重链的多核苷酸并且第二载体包含编码轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，第一载体和第二载体以相似的量(例如相似的摩尔量或相似的质量)转染至宿主细胞中。在一些实施方案中，将第一载体和第二载体以5:1至1:5之间的摩尔比或质量比转染至宿主细胞中。在一些实施方案中，使用编码重链的载体和编码轻链的载体的质量比为1:1至1:5。在一些实施方案中，使用编码重链的载体和编码轻链的载体的质量比为1:2。
在一些实施方案中，选择针对在CHO或CHO衍生细胞、或在NSO细胞中表达多肽进行优化的载体。示例性的此类载体描述于例如Running Deer et al.,Biotechnol.Prog.20:880-889(2004).
宿主细胞
在一些实施方案中，提供了包含本文所述的任何多肽、核酸构建体和/或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了使用本文描述的任何方法制备的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞能够在发酵条件下产生本文所述的任何抗体部分。
在一些实施方案中，本文所述的抗体部分(例如，抗VISTA抗体部分)可以在原核细胞(例如细菌细胞)中表达；或在真核细胞中，例如真菌细胞(例如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达。这种表达可以例如根据本领域已知的方法进行。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、CHO-GS、DG44、Lecl3 CHO细胞和FUT8 CHO细胞；细胞(Crucell)；HEK细胞和NSO细胞。在一些实施方案中，本文描述的抗体部分(例如抗VISTA抗体部分)可以在酵母中表达。参见例如美国公开号US2006/0270045Al。在一些实施方案中，基于其对抗体部分的重链和/或轻链进行所需翻译后修饰的能力来选择特定的真核宿主细胞。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生的多肽具有比293细胞中产生的相同多肽更高水平的唾液酸化。
将一种或多种核酸引入所需宿主细胞可以通过任何方法完成，包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性的示例性方法描述于例如Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)。根据任何合适的方法，核酸可以瞬时或稳定转染到所需宿主细胞中。
本申请还提供了包含本文所述的任何多核苷酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，本申请提供了包含抗VISTA抗体的宿主细胞。任何能够过表达异源DNA的宿主细胞都可以用于分离编码感兴趣的抗体、多肽、或蛋白质的基因。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。还参见PCT公开号WO87/04462。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)和酵母(例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母或乳酸克鲁维酵母)。
在一些实施方案中，抗体部分在无细胞***中产生。非限制性示例性无细胞***描述于例如Sitaraman et al.,Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,TrendsBiotechnol.22:538-45(2004)；Endo et al.,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003).
培养基
在一些实施方案中，提供了一种培养基，其包含本文所述的任何抗体部分、多核苷酸、核酸构建体、载体和/或宿主细胞。在一些实施方案中，提供了使用本文描述的任何方法制备的培养基。
在一些实施方案中，培养基包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和/或胸苷(例如，HAT培养基)。在一些实施方案中，培养基不包含血清。在一些实施方案中，培养基包含血清。在一些实施方案中，培养基是D-MEM或RPMI-1640培养基。
在一些实施方案中，培养基是化学成分确定的。在一些实施方案中，培养基是针对特定细胞系(例如，CHO GS细胞)而获得的。
抗体部分的纯化
抗VISTA构建体可以通过任何合适的方法纯化。此类方法包括但不限于使用亲和基质或疏水相互作用层析。合适的亲和配体包括ROR1 ECD和结合抗体恒定区的配体。例如，蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G或抗体亲和柱可用于结合恒定区并纯化包含Fc片段的抗VISTA构建体。疏水相互作用层析(例如丁基或苯基柱)也可能适合于纯化一些多肽，例如抗体。离子交换层析(例如阴离子交换层析和/或阳离子交换层析)也可以适合于纯化一些多肽，例如抗体。混合模式层析(例如反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)也可以适合纯化一些多肽，例如抗体。许多纯化多肽的方法是本领域已知的。
V、治疗方法
本文还提供了治疗个体中的疾病或病症或调节个体中的免疫应答(例如，抑制T细胞的增殖)、或调节个体中的免疫应答(例如，抑制T细胞的增殖)的方法。该方法包括将本文所述的抗VISTA构建体给予个体(例如，哺乳动物，例如人)。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的疾病或病症或调节免疫应答(例如，抑制T细胞增殖)的方法，包括向个体施用有效量的本文所述的抗VISTA构建体。在一些实施方案中，疾病或病症与免疫***失调相关。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植相关的病症。在一些实施方案中，自身免疫疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣、自身免疫性肠道病症、***性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。
【1】在一些实施方案中，提供了治疗个体中的疾病或病症或调节免疫应答(例如，抑制T细胞增殖)的方法，包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争VISTA的结合抗原表位，并且其中VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDRl、包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HC-CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3，且VL-2包含：包含氨基酸序列SEQID NO:4的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3，或其在所述HC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3，或其在所述LC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分为来源于包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗VISTA抗体的人源化抗体，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，或含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；且VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:8，或含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，该疾病或病况与免疫***失调相关。在一些实施方案中，该疾病或病况为自体免疫疾病、发炎、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植相关的病况。在一些实施方案中，该自体免疫疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣、自身免疫性肠道疾病、***性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。
【1】在一些实施方案中，提供了治疗个体中的疾病或病症或调节免疫应答(例如，抑制T细胞增殖)的方法，包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争VISTA的结合抗原表位，其中VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3，且VL-2包含：包含氨基酸序列SEQID NO:12的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ IDNO:14的LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3，或其在所述HC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的LC-CDR3，或其在所述LC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分为来源于包含重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)的抗VISTA抗体的人类化抗体，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:15，或含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；且VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:16，或含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，该疾病或病况与免疫***失调相关。在一些实施方案中，该疾病或病况为自身免疫疾病、发炎、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植相关的病况。在一些实施方案中，该自身免疫疾病是选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣、自身免疫性肠道疾病、***性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的疾病或病症或调节免疫应答(例如，抑制T细胞增殖)的方法，包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗体部分：该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争VISTA的结合抗原表位，其中所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的HC-CDR3，且VL-2包含：包含氨基酸序列SEQID NO:20的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ IDNO:22的LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的HC-CDR3，或其在所述HC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的LC-CDR3，或其在所述LC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分为来源于包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗VISTA抗体的人类化抗体，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:23，或含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；且VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:24，或含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，该疾病或病况与免疫***失调相关。在一些实施方案中，该疾病或病况是自体免疫疾病、发炎、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植相关的病况。在一些实施方案中，该自体免疫疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣、自体免疫性肠道疾病、***性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的疾病或病症或调节免疫应答(例如抑制T细胞增殖)的方法，包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争VISTA的结合抗原决定基，其中VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HC-CDR3，且VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HC-CDR3，或其在所述HC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的LC-CDR3，或其在所述LC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分为来源于包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗VISTA抗体的人类化抗体，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQID NO:29的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:31，或含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；且VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，或含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，该疾病或病况与免疫***失调相关。在一些实施方案中，该疾病或病况是自体免疫疾病、发炎、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植相关的病况。在一些实施方案中，该自体免疫疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣、自体免疫性肠道疾病、***性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的疾病或病症或调节免疫应答(例如抑制T细胞增殖)的方法，包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中抗体部分与包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)的抗体或抗体片段竞争VISTA的结合抗原决定基，其中VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:35的HC-CDR3，且VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:36LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:35的HC-CDR3，或其在所述HC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的LC-CDR3，或其在所述LC-CDR中包含最多5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，抗VISTA抗体部分为来源于包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗VISTA抗体的人类化抗体，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:35的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQID NO:37的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的LC-CDR3。在一些实施方案中，VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:39，或含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体；且VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:40，或含具有至少约80％(例如至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中的任一个)序列同一性的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，该疾病或病况与免疫***失调相关。在一些实施方案中，该疾病或病况是自体免疫疾病、发炎、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植相关的病况。在一些实施方案中，该自体免疫疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣、自体免疫性肠道疾病、***性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。
在一些实施方案中，上述氨基酸取代限于本申请表2中所示的“示例性取代”。在一些实施方案中，氨基酸取代限于本申请表2中所示的“优选取代”。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的疾病或病症或调节免疫应答(例如抑制T细胞增殖)的方法，包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:42或51的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的LC-CDR3。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的疾病或病症或调节免疫应答(例如抑制T细胞增殖)的方法，包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:44或52的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56或57的LC-CDR3。在一些实施方案中，该疾病或病况与免疫***失调相关。在一些实施方案中，该疾病或病况是自体免疫疾病、发炎、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植相关的病况。在一些实施方案中，该自体免疫疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣、自体免疫性肠道病症、***性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。
在一些实施方案中，提供了治疗个体中的疾病或病症或调节免疫应答(例如抑制T细胞增殖)的方法，包括向个体施用有效量的抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体包含抗体部分，该抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:41或43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11或45的HC-CDR3，且VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:49的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:50或53的LC-CDR3。在一些实施方案中，该疾病或病况与免疫***失调相关。在一些实施方案中，该疾病或病况是自体免疫疾病、发炎、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植相关的病况。在一些实施方案中，该自体免疫疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣、自体免疫性肠道病症、***性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。
在一些实施方案中，与不激活VISTA的相应构建体(例如同种型对照)相比，用于调节个体的免疫应答或调节免疫细胞(例如T细胞)的抗VISTA构建体阻止T细胞的增殖至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，与包含参考激动剂抗VISTA抗体(例如1E8)的相应构建体相比，用于调节个体的免疫应答或调节免疫细胞(例如T细胞)的抗VISTA构建体阻止T细胞的增殖至少约5％、10％、15％、20％或25％。
在一些实施方案中，提供了调节细胞(例如免疫细胞)的方法，包括使免疫细胞与抗VISTA构建体(例如本文所述的任何抗VISTA构建体)接触。在一些实施方案中，细胞是T细胞(例如CD4和/或CD8 T细胞)。在一些实施方案中，细胞是嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，细胞是树突细胞(例如，浆细胞样树突细胞)。在一些实施方案中，细胞是巨噬细胞。在一些实施方案中，接触在体外发生。
在一些实施方案中，提供了对细胞(例如免疫细胞)进行基因组编辑的方法，包括引入细胞：a)包含编码本文所述的任何抗VISTA构建体的核酸序列的供体模板，和b)DNA核酸酶(例如CRISPR相关蛋白(Cas))或编码DNA核酸酶的核苷酸序列。在一些实施方案中，该方法还包括将基因组被编辑的细胞给予患有本文所述的疾病或病症的个体。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物(例如人类)。
在一些实施方案中，个体的抗核抗体血清水平升高(例如比健康个体的抗核抗体血清水平高至少约20％、40％、60％、80％、100％、150％、200％、300％、400％、或500％)。在一些实施方案中，个体的抗dsDNA抗体血清水平升高(例如比健康个体的抗dsDNA抗体血清水平高至少约20％、40％、60％、80％、100％、150％、200％、300％、400％或500％)。在一些实施方案中，个体具有升高的IFNa血清水平(例如比健康个体的IFNa的血清水平高至少约20％、40％、60％、80％、100％、150％、200％、300％、400％或500％)。在一些实施方案中，个体的尿液中蛋白质水平升高(例如比健康人的尿蛋白水平高至少约20％、40％、60％、80％、100％、150％、200％、300％、400％或500％)。
施用抗VISTA构建体的剂量和方法
用于治疗本文所述的疾病或病症的给予个体的抗VISTA构建体的给药方案(例如具体剂量和频率)可以根据具体的抗VISTA构建体、给予模式和所治疗的疾病或病况类型而变化。在一些实施方案中，抗VISTA构建体的有效量是有效减轻疾病或病况的至少一种症状的量。在一些实施方案中，抗VISTA构建体的有效量是足以延长个体总存活期的量。在一些实施方案中，抗VISTA构建体的有效量是足以在用抗VISTA构建体治疗的个体群体中产生大于约50％、60％、70％、80％或90％中任一项的临床益处的量。
在一些实施方案中，抗VISTA构建体的有效量是与未接受治疗的个体相比减缓或抑制(例如，至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％)疾病或病症进展的量。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，疾病或病症是感染。
在一些实施方案中，有效量的抗VISTA构建体使抗核抗体的血清水平与参考个体(例如患有相同疾病或病症但未用抗VISTA构建体治疗的个体)相比降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，有效量的抗VISTA构建体使抗dsDNA抗体的血清水平与参考个体(例如患有相同疾病或病症但未用抗VISTA构建体治疗的个体)相比降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，有效量的抗VISTA构建体使IFNa的血清水平与参考个体(例如患有相同疾病或病症但未用抗VISTA构建体治疗的个体)相比降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，有效量的抗VISTA构建体使尿蛋白水平与参考个体(例如患有相同疾病或病症但未用抗VISTA构建体治疗的个体)相比降低至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％或90％。
在一些实施方案中，抗VISTA构建体的有效量是使病症(例如移植)的副作用(自身免疫应答)与未接受治疗的个体降低(例如至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％或50％)的量。
在上述任一方面的一些实施方案中，抗VISTA构建体的有效量在以总体重计约0.001μg/kg至约100mg/kg范围内，例如约0.005μg/kg至约50mg/kg、约0.01μg/kg至约10mg/kg、或约0.01μg/kg至约1mg/kg
在上述任何方面的一些实施方案中，用于人类的抗VISTA构建体的有效量是等效于用于小鼠的0.5mg的剂量。
在上述任一方面的一些实施方案中，每周施用抗VISTA构建体。在上述任一方面的一些实施方案中，抗VISTA构建体每两周施用一次。在一些实施方案中，持续至少约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约18或约20周每周施用抗VISTA构建体。
抗VISTA构建体可以通过多种途径施用于个体(例如人)，包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、口服、吸入、囊泡内、肌肉内、气管内、皮下、眼内、鞘内、经粘膜和经皮。在一些实施方案中，当给予个体时，抗VISTA构建体包含在药物组合物中。在一些实施方案中，可以使用组合物的缓释连续释放制剂。在一些实施方案中，静脉内施用组合物。在一些实施方案中，腹膜内施用组合物。在一些实施方案中，静脉内施用组合物。在一些实施方案中，腹膜内施用组合物。在一些实施方案中，肌内施用组合物。在一些实施方案中，皮下施用组合物。在一些实施方案中，静脉内施用组合物。在一些实施方案中，口服施用组合物。
联合治疗
本申请还提供了将抗VISTA构建体施用到个体中以治疗疾病或病症的方法，其中该方法进一步包括施用第二药剂或疗法。在一些实施方案中，第二药剂或疗法是用于治疗疾病或病症的标准或常用药剂或疗法。
在一些实施方案中，抗VISTA构建体与第二药剂或疗法同时施用。在一些实施方案中，抗VISTA构建体与第二药剂或疗法并行施用。在一些实施方案中，抗VISTA构建体与第二药剂或疗法顺序施用。在一些实施方案中，抗VISTA构建体在第二药剂或疗法之前施用。在一些实施方案中，抗VISTA构建体在第二药剂或疗法之后施用。在一些实施方案中，抗VISTA构建体与第二药剂或疗法以相同的单位剂型施用。在一些实施方案中，抗VISTA构建体与第二药剂或疗法以不同的单位剂型施用。在一些实施方案中，抗VISTA构建体与第二药剂或疗法以相同的单位剂型施用。在一些实施方案中，抗VISTA构建体与第二药剂或疗法以不同的单位剂型施用。
六.组合物、试剂盒和制品
本文还提供了组合物(例如制剂)，其包含本文所述的抗VISTA构建体或抗VISTA抗体部分中的任一种、编码抗体部分的核酸、包含编码抗体部分的核酸的载体、或包含核酸或载体的宿主细胞。
本文所述的抗VISTA构建体的合适制剂可以通过将具有所需纯度的抗VISTA构建体或抗VISTA抗体部分与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))混合成冻干制剂或水溶液的形式而获得。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。适合于皮下施用的冻干制剂描述于WO97/04801中。此类冻干制剂可以用合适的稀释剂复原至高蛋白质浓度，并且可以将复原的制剂皮下施用于本文待成像、诊断或治疗的个体。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以通过例如经由无菌过滤膜过滤来容易地实现。
还提供了包含本文所述的抗VISTA构建体或抗VISTA抗体部分中的任一种的试剂盒。该试剂盒可用于本文描述的调节细胞组成或治疗的任何方法。
在一些实施方案中，提供了包含特异性结合VISTA的抗VISTA构建体的试剂盒。
在一些实施方案中，试剂盒进一步包含能够将抗VISTA构建体递送至个体中的装置。用于诸如肠胃外递送等应用的一种类型的装置是用于将组合物注射到受试者体内的注射器。吸入装置也可用于某些应用。
在一些实施方案中，试剂盒还包含用于治疗疾病或病症例如传染病、自身免疫性疾病或移植的治疗剂。
本申请的试剂盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子、软包装(例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。试剂盒任选可以提供其他组分例如缓冲液和说明性信息。
因此，本申请还提供了制品。制品可包括容器和位于容器上或与容器相关联的标签或药品说明书。合适的容器包括小瓶(例如密封小瓶)、瓶子、罐子、软包装等。通常，容器容纳组合物，并且可以具有无菌进入口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。标签或药品说明书指示该组合物用于对个体进行成像、诊断或治疗的特定病症。标签或药品说明书将进一步包含用于向个体施用组合物和对个体进行成像的说明。标签可以指示关于复原和/或使用的说明。容纳组合物的容器可以是多次使用的小瓶，其允许重复施用(例如2-6次施用)复原制剂。药品说明书是指市售诊断产品包装中通常含有的说明书，其中含有关于适应症、用法、剂量、给药、与此类诊断产品的使用有关的禁忌和/或警告的信息。另外，制品还可包含第二容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它还可以包括从商业和用户角度来看所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
试剂盒或制品可包括多单位剂量的组合物和使用说明书，其包装量足以在药房(例如医院药房和配药房)中储存和使用。
本领域技术人员将认识到，在本申请的范围和精神内，若干实施方式是可能的。现在将参考以下非限制性实施方式更详细地描述本申请。以下实施方式进一步说明本申请，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。
示例性实施方式
实施方式1.一种抗VISTA构筑体，其包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述抗体部分与抗体或抗体片段竞争VISTA的结合抗原表位，所述抗体或抗体片段包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，其中：
a)所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQID NO:2的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3，并且所述VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3；
b)所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQID NO:10的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3，并且所述VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的LC-CDR3；
c)所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQID NO:18的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的HC-CDR3，并且所述VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的LC-CDRl、包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的LC-CDR3；
d)所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQID NO:26的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HC-CDR3，并且所述VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的LC-CDRl、包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的LC-CDR3；
e)所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQID NO:34的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:35的HC-CDR3，并且所述VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的LC-CDR3。
实施方式2.如实施方式1的抗VISTA构建体，其中：
a)所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3，或在所述HC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:6的LC-CDR3，或在所述LC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；
b)所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3，或在所述HC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ IDNO:12的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQID NO:14的LC-CDR3，或在所述LC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；
c)所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的HC-CDR3，或在所述HC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ IDNO:20的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQID NO:22的LC-CDR3，或在所述LC-CDRs中包含5、4、3、2、或1个氨基酸取代的变体；
d)所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HC-CDR3，或在所述HC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ IDNO:28的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQID NO:30的LC-CDR3，或在所述LC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；
e)所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:35的HC-CDR3，或在所述HC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ IDNO:36的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQID NO:38的LC-CDR3，或在所述LC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；
f)所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:42或51的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的LC-CDR3；
h)所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:44或52的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HC-CDR3；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56或57的LC-CDR3；
i)所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:41或43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11或45的HC-CDR3；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:49的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:50或53的LC-CDR3。
实施方式3.如实施方式2的抗VISTA构建体，其中所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3。
实施方式4.如实施方式2的抗VISTA构建体，其中所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的LC-CDR3。
实施方式5.如实施方式3的抗VISTA构建体，其中所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的HC-CDR3；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的LC-CDR3。
实施方式6.如实施方式3的抗VISTA构建体，其中所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HC-CDR3；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的LC-CDR3。
实施方式7.一种抗VISTA构建体，其包含特异性结合VISTA的抗体部分，所述抗VISTA构建体包含：
a)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:7所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:8所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
b)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:15所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:16所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
c)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:23所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:24所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
d)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:31所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:32所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或
e)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:39所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:40所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
实施方式8.如实施方式1-7中任一项的抗VISTA构建体，其中所述VH包含SEQ IDNO:7、15、23、31和39中任一个的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；和/或其中所述VL包含SEQ ID NO:8、16、24、32和40中任一个的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
实施方式9.如实施方式8的抗VISTA构建体，其中：
a)所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；并且所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，
b)所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:15，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；并且所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:16，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，
c)所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:23，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；并且所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:24，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，
d)所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:31，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；并且所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，或
e)所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:39，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；并且所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:40，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
实施方式10.如实施方式1-9中任一项的抗VISTA构建体，其中所述抗体部分是选自下组的抗体或其抗原结合片段：全长抗体、双特异性抗体、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、Fv-Fc融合体、scFv-Fc融合体、scFv-Fv融合体、双价抗体、三价抗体和四价抗体。
实施方式11.如实施方式10的抗VISTA构建体，其中所述抗体部分是全长抗体。
实施方式12.如实施方式1-11中任一项的抗VISTA构建体，其中所述抗体部分具有Fc片段，所述Fc片段选自来自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其组合和杂合体的Fc片段。
实施方式13.如实施方式12的抗VISTA构建体，其中所述Fc片段选自来自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4及其组合和杂合体的Fc片段。
实施方式14.如实施方式12或实施方式13的抗VISTA构建体，其中与相应的野生型Fc片段相比，所述Fc片段具有降低的效应子功能
实施方式15.如实施方式12-14中任一项的抗VISTA构建体，其中与相应的野生型Fc片段相比，所述Fc片段具有延长的半衰期。
实施方式16.如实施方式1-15中任一项的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体的所述抗体部分激活VISTA的下游信号传导途径。
实施方式17.如实施方式1-16中任一项的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体是VISTA的激动剂抗体。
实施方式18.如实施方式16的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体的所述抗体部分激活或增强VISTA的下游信号传导途径至少约20％。
实施方式19.如实施方式1-18中任一项的抗VISTA构建体，其中所述VISTA是人VISTA。
实施方式20.一种药物组合物，其包含如实施方式1-19中任一项的抗VISTA构建体和药学可接受的载体。
实施方式21.一种分离的核酸，其编码如实施方式1-20中任一项的抗VISTA构建体。
实施方式22.一种载体，其包含如实施方式21的分离的核酸。
实施方式23.一种分离的宿主细胞，其包含如实施方式21的分离的核酸或如实施方式22的载体。
实施方式24.一种免疫缀合物，其包含如实施方式1-19中任一项的抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体连接至治疗剂或标记。
实施方式25.一种产生抗VISTA构建体的方法，其包括：
a)在有效表达抗VISTA构建体的条件下培养实施方式23的分离的宿主细胞；
b)从所述宿主细胞获得表达的抗VISTA构建体。
实施方式26.一种治疗个体的疾病或病症的方法，其包括向个体施用有效量的如实施方式1-19中任一项的抗VISTA构建体或如实施方式20的药物组合物。
实施方式27.如实施方式26的方法，其中所述疾病或病症与免疫***失调相关。
实施方式28.如实施方式26或实施方式27的方法，其中所述疾病或病症是自身免疫性疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植相关的病症。
实施方式29.如实施方式28的方法，其中所述自身免疫性疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣、自身免疫性肠道疾病、***性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。
实施方式30.如实施方式26-29中任一项的方法，其中将所述抗VISTA构建体静脉内或皮下施用于该个体。
实施方式31.如任一项实施方式中的方法，其中所述抗VISTA构建体以约0.001mg/kg至约100mg/kg的剂量施用。
实施方式32.如实施方式22-31中任一项的方法，其中所述个体是人类。
实施方式33.一种试剂盒，其包含如实施方式1-19的抗VISTA构建体中的任一种。
实施例
下面的实施例仅旨在示例性地说明本申请，因此不应被视为以任何方式限制本申请。以下实施例和详细描述是通过说明而非限制的方式提供的。
实施例1.材料
His标记的人类、小鼠和食蟹猴VISTA胞外域蛋白是使用标准方案在内部生产的。hVISTA-mFc购自Adipogen(货号：#CHI-HF-211B7H5-C100)。使用Alexa Fluor 647标记的抗人VISTA抗体(BD Biosciences，目录号#566670)和APC抗小鼠VISTA抗体(Biolegend，目录号#150205)来检测表达人和小鼠VISTA的Jurkat细胞。
用pLenti7.3/TOPO-小鼠VISTA或人VISTA全长序列转导Jurkat A6亲本细胞，通过流式细胞术进行结合分析。Jurkat-nfkb-GFP报告细胞由慢病毒携带CMV-人VISTA细胞外跨膜与CD3ζCAR-EF1-puro一起转导，用于通过流式细胞术进行报告激活分析。对于每个构建体，Jurkat细胞的VISTA阳性群体被分选两次。每个构建体的细胞都是多克隆的。
实施例2.免疫接种
三只VISTA敲除的BALB/c小鼠(雌性)根据表1中概述的方案接受4次免疫接种。用hVISTA(人VISTA-mFc)和mVISTA(小鼠VISTA-his)对小鼠进行免疫。前3次免疫包括皮下和腹膜内注射。最后的加强只是腹膜内注射。通过ELISA分析免疫反应：将第0天、第42天和第74天收集的血清样品与吸附到96孔板的人VISTAECD(2μg/ml)或阴性对照抗体一起孵育。通过抗小鼠IgG辣根过氧化物酶(Jackson ImmunoResearch,目录号#615035214)检测结合的小鼠IgG。结果如图1和图2所示。
表5.免疫接种时间表
如图1和图2所示，使用hVISTA或mVISTA产生了与每种抗原结合的抗体。
实施例3.杂交瘤上清液的产生
收集小鼠的脾脏。按照众所周知的程序制备杂交瘤细胞。在37℃、Hybridoma-SFM培养基(Gibco)中培养杂交瘤细胞7-10天。通过离心沉淀细胞并如下文实施例中所述分析上清液。
实施例4.初步筛选(通过ELISA，与人VISTA、小鼠VISTA和食蟹猴VISTA的结合)
将50μl杂交瘤上清液与包被在96孔ELISA板上的人VISTAECD(2pg/ml)、小鼠VISTAECD(2μg/ml)、食蟹猴VISTA(2μg/ml)或阴性小鼠IgG1对照一起温育。小鼠抗VISTA抗体通过抗小鼠IgG-HRP((Jackson ImmunoResearch，目录号#615035214)检测。结果如图3所示。
如图3所示，9E9、15D11、16A1、17E9和20E4杂交瘤上清液均有效结合人、食蟹猴和/或小鼠VISTA胞外结构域，并显示出跨物种反应性(特别是在人和食蟹猴VISTA蛋白之间)。
实施例5.通过FACS分析对与VISTA结合的杂交瘤来源的抗体进行第二次筛选
在含有10％FBS的RPMI1640中培养表达人类和小鼠VISTA的Jurkat细胞。将细胞以1x105个细胞/孔接种到96孔板中。然后将细胞与抗VISTA杂交瘤上清液在4℃下孵育30分钟。将1E8(Immunext，参见WO2017/181139A2)用作参考抗体。用FACS缓冲液洗涤后，将细胞与Alexa Fluor 647缀合的抗小鼠IgG(H+L)(1μg/ml)(Jackson ImmunoResearch，目录号#61505214)在4℃下孵育30分钟。用FACS缓冲液洗涤两次后，在NovoCyte流式细胞仪(Agilent)中运行样品。使用NovoExpress软件分析数据。
图4A-图4B显示所有测试的抗VISTA杂交瘤(9F9、16A1、17E9和20E4)表现出与表达Jurkat-hVISTA的细胞系的有效结合，以及与表达Jurkat-mVISTA的细胞系的一些结合亲和力。
实施例6.杂交瘤衍生抗体的报告激活分析
在96孔板中，以1X105个细胞/孔在含10％FBS的200μl RPMI1640培养基中接种Jurkat-nfkb-GFP/人VISTA-hCD3z细胞。将杂交瘤上清液以递增的抗VISTA浓度添加到培养基中(基于ELISA，0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、10和30μg/ml)。孵育24小时后通过流式细胞术测量GFP。结果显示在图5至图7中。为了测试OKT3对细胞活化的影响，在抗VISTA浓度渐增的杂交瘤衍生抗体存在下，将OKT3(3ng/ml)添加到细胞中孵育24小时。结果显示在图8A至图10中。
图5A-5B和图6A-6B显示，与不同浓度的9F9或20E4杂交瘤上清液一起温育后，VISTA下游途径在表达Jurkat-NFKb-GFP/hVISTA-hCD3z的细胞中被激活，如阳性GFP染色所示。激活程度呈浓度依赖性方式。16A1、17E9和1E8还表现出在一定浓度下激活Jurkat-NFKb-GFP/hVISTA-hCD3z细胞的能力。见图7。因此，9F9、20E4、1E8、16A1和17E9都对人VISTA表现出激动作用，其中9F9和20E4在这些抗体中表现出最高的激动作用。
图8A-8B、图9A-9B和图10显示OKT3显著增加活化的Jurkat-NFKb-GFP/hVISTA-hCD3z细胞的百分比。除15D11外，所有测试的抗体的活化细胞百分比均达到60％以上。对于与20E4和17E9或16A1一起孵育的细胞，超过80％的细胞在一定浓度下被激活。这些结果表明这些抗体具有很强的激动作用。
实施例7.序列分析
从杂交瘤细胞系培养物中分离总RNA。RNA经过处理以去除异常转录物，并使用oligo(dT)引物进行逆转录。使用框架1和对重链或轻链具有特异性的恒定区引物对，在单独的PCR中扩增所得的cDNA样品。在琼脂糖凝胶上分离反应产物，评估大小并回收。扩增子被克隆到pUC19载体(Clontech)中。选择10个菌落并对质粒DNA和PCR产物都进行Sanger测序。
分析了所有构建体的DNA序列数据并确定了重链和轻链的共有序列。
表3.VH CDR序列和共有序列
/>
表4.VL CDR序列和共有序列
/>
实施例8.抗VISTA抗体的表达和杂交瘤细胞的纯化
在37℃、Hybridoma-SFM培养基(Gibco)中把杂交瘤细胞培养7-10天。通过离心沉淀细胞并收集上清液以使用Protein G Sepharose(GE)纯化抗体。通过离心渗滤将柱的洗脱液缓冲液更换为1XPBS(pH7.4)。通过SDS-PAGE凝胶电泳分析纯化的抗体以确认纯度和大小。通过分光光度计上的A280测定抗体的浓度。纯化的抗体在储存前进行0.2μm过滤。
实施例9.Expi293细胞中抗VISTA抗体的重组表达和纯化
将抗VISTA可变区与mIgG1恒定区一起克隆并在Expi293细胞中表达。简言之，小鼠IgG1可变区是使用来自IDT的人优选密码子进行基因合成的。然后将基因片段亚克隆到含有鼠抗体信号序列和mIgG1 Fc片段的pcDNA3.4载体中。使用ExpiFectamine 293转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific)瞬时转染Expi293细胞来产生抗体。转染五天后，收集转染细胞的上清液并使用Protein G Sepharose(GE)进行纯化。使用0.1M甘氨酸缓冲液(pH2.7)洗脱结合的抗体，并使用1XPBS(pH7.4)透析过夜。在还原和非还原性SDS-PAGE上分析纯化的抗体以确认纯度和大小。于分光光度计上以A280测定重组蛋白浓度。
实施例10.通过荧光激活细胞分选(FACS)分析确定重组抗VISTA抗体与细胞表面表达人和小鼠VISTA的Jurkat细胞的结合
在含有10％FBS的RPMI1640中培养人和小鼠表达Jurkat细胞。将细胞以1x105个细胞/孔接种到96孔板中。然后将细胞与重组抗VISTA抗体9F9、16A1、17E9、20E4或V4(Hummingbird)(10μg/ml)在4℃下共孵育30分钟。用FACS缓冲液洗涤后，将细胞与AlexaFluor 647缀合的抗小鼠IgG(H+L)(1μg/ml)(Jackson ImmunoResearch，目录号#615605214)在4℃下共孵育30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并在NovoCyte流式细胞仪(Agilent)中运行样品。使用NovoExpress软件分析数据。结果显示在图11A-11B中。
图11A-11B证实重组mIgG1抗VISTA抗体(9F9、16A1、17E9和20E4)均显示出与Jurkat-hVISTA表达细胞系的有效结合。此外，9F9还显示出与Jurkat-mVISTA的有效结合，表明具有跨物种反应性。
实施例11.重组抗VISTA抗体的报告子活化分析
在96孔板中，将Jurkat-nfkb-GFP/人VISTA-hCD3z细胞以1x105个细胞/孔接种于含有10％FBS的200μl RPMI1640培养基中。以渐增VISTA浓度将重组抗VISTA抗体添加到培养基(0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、10和30μg/ml)或(0.05、0.5、5和50μg/ml)。培育24小时后通过流式细胞术测量GFP。为了测试OKT3对细胞激活的影响，在渐增抗VISTA浓度的情况下将OKT3(3ng/ml)添加到细胞中，并在孵育24小时后测量GFP。
图12-图15显示重组mIgG1抗VISTA抗体(9F9、16A1、17E9和20E4)在表达Jurkat-NFKb-GFP/hVISTA-hCD3z的细胞系中诱导有效激活，其中15％-50％的细胞在5μg/mL浓度时被激活。
实施例12.通过Octet竞争进行抗VISTA抗体的表位分组分析
使用Octet QKe(ForteBio)测定抗VISTA抗体表位组。使用EZ-LINK NHS-PEG4生物素(Thermo Fisher Scientific)使人VISTA重组蛋白(Sino Biological Inc.,目录号#13485-H08H)生物素化。使用链霉亲和素生物传感器端部(ForteBio)捕获生物素化的VISTA蛋白(5μg/ml下300秒)。基线测量在1X动力学缓冲液(Fortebio)中稳定60秒，然后使抗VISTA一抗(10μg/ml)与捕获的蛋白质结合300秒。然后使一组抗VISTA二抗(10μg/ml)与抗原和一抗复合物再结合300秒。记录每个结合事件的信号，并在ForteBio数据分析HT 11.1软件上进行数据分析。
主要抗VISTA抗体的表位分组分析在此Octet分析中显示了三组结合表位。图16显示16A1、17E9和20E4在VISTA上竞争相同的抗原表位，而1E8、9F9和15D11结合不同的抗原表位。所有这些抗体结合的结合表位与基准对照抗体奥瓦利单抗(Onvatilimab)和IE8(Immunext)的结合表位不同。
实施例13.通过生物膜干涉技术(BLI)测定抗VISTAmAb的人、食蟹猴和小鼠VISTA抗原交叉结合活性
使用Octet QKe(ForteBio)通过生物膜干涉技术测定抗VISTA抗体的人、食蟹猴和小鼠VISTA抗原交叉结合活性。使用EZ-LINK NHS-PEG4生物素(Thermo FisherScientific)使人VISTA重组蛋白(Sino Biological Inc.,目录号#13482-H08H)、小鼠VISTA(Sino Biological Inc.,目录号#51550-M08H)、或食蟹猴VISTA蛋白(内部制造)生物素化。使用链霉亲和素生物传感器(ForteBio)加载生物素化的VISTA蛋白(5μg/ml下300秒)。基线测量在1X动力学缓冲液(ForteBio)中稳定60秒，然后使5μg/ml的抗VISTA抗体与捕获的蛋白质结合300秒。然后使传感器在1X动力学缓冲液中解离600秒。并在ForteBio数据分析HT 11.1软件上进行数据分析。
图17A-图17C显示所有测试的抗体均表现出与人、食蟹猴和小鼠VISTA的有效结合。相比之下，基准对照抗体奥瓦利单抗不与小鼠VISTA发生交叉反应。
实施例14.通过生物膜干涉技术(BLI)测定抗VISTA抗体对人和食蟹猴VISTA的结合亲和力
使用Octet QKe(ForteBio)通过生物膜干涉技术测定抗VISTA抗体对人和食蟹猴的结合亲和力。使用EZ-LINK NHS-PEG4生物素(Thermo Fisher Scientific)使人VISTA重组蛋白(Sino Biological Inc.,目录号#13482-H08H)或食蟹猴VISTA蛋白(内部制造)生物素化。使用链霉亲和素生物传感器(ForteBio)加载生物素化VISTA蛋白(在5μg/ml下300秒)。使基线测量在1X动力学缓冲液(ForteBio)中稳定60秒，然后使系列稀释液(50、25、12.5、6.25和3.125μg/ml)的抗VISTA抗体与捕获的蛋白质结合300秒。然后使传感器在1X动力学缓冲液中解离600秒。在ForteBio数据分析HT 11.1软件上进行数据分析。
图18A-图18E显示所有抗VISTA抗体与人和食蟹猴VISTA的结合亲和力。
实施例15.抗VISTA抗体抑制T细胞增殖能力分析
在体外测定中分析了抗VISTA抗体抑制T细胞增殖的能力。在37℃下将浓度比为1:1(2.5μg/ml抗CD3:2.5μg/ml)的抗CD3(OKT3)和VISTA-Ig包被到96孔过夜。从新鲜收集的血块黄层中纯化人PBMC，并用CFSE(Invitrogen，目录号#C34554)标记。然后用1XPBS缓冲液洗涤96孔板孔3次，并在抗VISTA抗体(50μg/ml)或小鼠IgG对照(50μg/ml)的存在下用CTSOpTmizer T细胞扩增SFM(Invitrogen，目录号#A1048501)将200000个经CFSE标记的PBMC细胞添加到每个孔中。处理5天后，收获细胞，用APC缀合的抗人CD3抗体(Biolegend目录号#300311)标记，并在NovoCyte流式细胞仪(Agilent)中运行。使用NovoExpress软件分析数据。结果如图19所示。
基准对照抗体1E8(Immunext)用作阳性对照，小鼠IgG同种型用作阴性对照。如所示，与仅OKT3、OKT3+VISTA-Ig、或OKT3+VISTA-Ig+mIgG一起孵育的约50％-70％的细胞增殖，如CFSE染色所示。相反，抗VISTA抗体(1E8、9F9、15D11、16A1、17E9和20E4)的存在显著抑制T细胞增殖。其中9F9、15D11、16A1和20E4表现出比1E8更好的抑制效果。
实施例16.动物研究
在狼疮治疗模型中使用4周龄雌性MRL-lpr小鼠。在第5-12周期间，每周对不同组的小鼠给予200μg mIgG1(对照)或抗VISTA构建体(MH5A、9F9或20E4)处理。在第12周或之后进行大部分测量，其中在第12周之前进行几次血清抗体含量测量。用于狼疮治疗模型的方案的图形总结显示于图20中。下面的实验A-F是使用狼疮的主要临床指标设计的，以检查本文测试的抗VISTA构建体的功效。
A.抗VISTA构建体在治疗***肿大中的作用
MRL-lpr小鼠表现出与自发突变Faslpr引起的异常T细胞增殖相关的大量***病。这种自身免疫小鼠模型会出现皮肤损伤，通常用作红斑狼疮模型。从10周大时开始，轻轻按压颈部周围即可感觉到***肿大。***肿大可能是反映狼疮情况的早期征兆，随着动物年龄的增长，皮肤病变也会形成。
分别在12、14和15周龄时检查分别用mIgG、MH5A、9F9或20E4治疗的四组小鼠的***大小。结果示于图21A中，从左至右每周的数据条柱为mIgG处理组、MH5A处理组、9F9处理组和20E4处理组。将***的大小分类为5个数值：0(摸不到)、1(绿豆大小)、2(豌豆大小)、3(花生大小)和4(核桃大小)。如图21A显示，与对照组(mIgG1处理)相比，MH5A和9F9显著减小了小鼠中的***尺寸，并且20E4稍微减小了***尺寸。如图21B显示了从实验中使用的小鼠颈部区域取出的***的示例性尺寸。
B.抗VISTA构建体降低抗核免疫球蛋白的血清水平
MRL-lpr小鼠会出现***性自身免疫症状，包括自发产生针对细胞核的自身抗体(抗核抗体，ANA)。已将ANA测试用于人类以诊断狼疮；ANA测试呈阳性表明免疫***发起了对人体自身组织的错误攻击。
分别在第5、6、9、12和15周测定用mIgG1、MH5A、9F9或20E4处理的小鼠的血清ANA水平。结果如图22所示。图22中从左到右每周的数据条柱分别是mIgG处理组、MH5A处理组、9F9处理组和20E4处理组。在第15周时，与mIgGl相比，MH5A和9F9显著降低了小鼠血清中的ANA水平，并且20E4稍微降低了小鼠血清中的ANA水平。
C.抗VISTA构建体降低抗dsDNA免疫球蛋白的血清水平
在临床上，血液中高水平的抗dsDNA抗体与狼疮密切相关，并且通常在发作期间或发作前显著增加。将与狼疮相关的其他临床体征和症状相关的阳性抗dsDNA抗体测试用于诊断狼疮。
分别在第9、12和15周测定用mIgG1、MH5A、9F9或20E4处理的小鼠中抗dsDNA抗体的血清水平。结果如图23所示。所有测试的抗VISTA构建体(MH5A、9F9和20E4)在第12周时均能够减少小鼠血清中的抗dsDNA抗体，并且在处理后3周(即第15周)水平仍保持较低水平。
D.抗VISTA构建体降低IFNa的血清水平
参与狼疮病因和发病机制的重要细胞因子的一个例子是干扰素α(IFNa)。IFNa是免疫调节中的重要蛋白质。IFNa是一种多效性细胞因子，可以影响与狼疮相关的多种细胞类型。血清IFNa水平升高和干扰素途径中几个基因表达的变化与狼疮风险相关，表明该途径在病因学中发挥作用。
在第12周和第15周测定用mIgG1、MH5A、9F9或20E4处理的小鼠中IFNa的血清水平。如图24明显地展示，与mIgG1(对照)相比，所有3种抗VISTA构建体在第12周均显著降低了IFNa的血清水平，并且在第15周仍保持显著较低。
E.抗VISTA构建体降低尿液中的蛋白质水平
本文使用的MRL-lpr小鼠自发地出现狼疮性肾炎。尿液中的蛋白质水平可以反映肾脏疾病的发病机制。在临床上，除了血液检查外，还使用包括尿蛋白水平在内的尿液检查来诊断和监测狼疮对肾脏的影响。
在第12周和第15周测量用mIgG1、MH5A、9F9或20E4处理的小鼠的尿蛋白水平。每组有6只小鼠。图25和图26中的饼图展示了每个处理组中不同尿蛋白水平归类下的小鼠分布。图表下的百分比值显示每个处理组中蛋白质水平≥100mg/dL或>300mg/dL的小鼠百分比。在第12周时，与mIgG组相比，所有抗VISTA构建体处理组中归于2+组(100-300mg/dL蛋白质)和3+组(300-1000mg/dL蛋白质)的小鼠数量更少。MH5A和9F9在第15周时表现出对维持尿蛋白水平降低的长期作用。
F.抗VISTA构建体减少皮肤狼疮病变
在第17周时研究了抗VISTA构建体对小鼠皮肤狼疮病变的保护作用。如图27所示，与用mIgG1处理的小鼠相比，用MH5A和9F9处理的小鼠皮肤损伤有所减少。
G.结论
在MRL-lpr小鼠中测试了MH5A、9F9和20E4对狼疮(包括***性红斑狼疮(SLE))的治疗效果。通过***肿大、血清中自身抗体和细胞因子水平、尿蛋白水平和皮肤外观来评价处理后各组中疾病的严重程度。9F9和MH5A在MRL-lpr小鼠模型中表现出有前景的临床前效应，并显著减少MRL-lpr小鼠的***肿大，降低血清抗核和抗dsDNA自身抗体水平、血清IFNa水平和尿蛋白水平。与mIgG1(对照)相比，20E4还显示出降低血清抗dsDNA和IFNa水平的保护作用。
实施例17.抗VISTA抗体在移植物抗宿主(GvHD)小鼠模型中的功效研究
本研究的目的是评估抗VISTA抗体9F9和20E4在移植物抗宿主病(GvHD)小鼠模型中的功效。
通过测量体重和目视评估小鼠皮肤的剥脱情况来评估研究的效果。在整个研究过程中，对小鼠的整体活动进行了评估。还测量了人CD45+细胞植入的水平，其指示血液中GvHD的发展程度。参见例如Ali et al.,PLoS One.2012；7(8):e44219。
本研究使用NOD-scid IL2rg裸(NSG)小鼠。第0天，通过静脉注射(IV)对所有小鼠注射1000万个人PBMC，并分为三组。第1组在第0天接受小鼠IgG同型对照(0.5mg/小鼠)处理。第2组和第3组通过腹膜内(i.p.)注射分别用9F9(0.5mg/小鼠)或20E4(0.5mg/小鼠)处理。每周收集体重。在两周时给予第二剂测试品。在第2周和第5周采集血样进行流式细胞术分析。第37天处死小鼠。
使用GraphPad软件Prism对作为原始数据收集的测量结果进行分析。P<0.05被认为有统计学意义。
移植物抗宿主病会导致体重减轻，随着疾病的进展，动物变得昏昏欲睡、活动减少。图28显示用抗VISTA抗体9F9和20E4处理小鼠可在研究期间防止体重减轻。与同种型对照组相比，9F9和20E4处理组的体重变化有统计学差异。在同种型对照处理的小鼠中的四分之三中观察到活动减少。对于用9F9或20E4抗体处理的任一组均未观察到活动变化。
患有GvHD的小鼠随时间推移而随着疾病的进展出现皮肤剥脱。在第33天，给小鼠拍照以捕捉不同组中观察到的皮肤剥脱的程度。图30显示注射同种型对照的小鼠与用抗VISTA抗体9F9或20E4处理的小鼠相比的皮肤剥脱。
PBMC转移后第14天和第37天收集血清。收集细胞并针对人和小鼠CD45染色以进行流式细胞术分析。图29显示不同组中人CD45+细胞的百分比。每个符号代表组中的个别小鼠。与对照组相比，用9F9或20E4抗体处理的小鼠中人CD45+细胞在统计学上显著减少。
序列表
/>
/>
/>
/>
/>
/>
序列表
<110> 当康生物技术有限责任公司
<120> 抗VISTA的构建体及其用途
<130> PG03340A
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> US 63/157,182
<151> 2021-03-05
<160> 59
<170> 适用于Windows 4.0版的FastSEQ
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 1
Gly Tyr Trp Met Gln
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 2
Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 3
Arg Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 4
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 5
Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 6
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 7
Gln Val Gln Phe Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 8
Asp Ile Lys Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 9
Ser Ser Trp Val Glu
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 10
Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Ser Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 11
Arg Pro Pro Gly Trp Phe Phe Asp Val
1 5
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 12
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Asp Val Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 13
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 14
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 15
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Trp Val Glu Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Ser Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Pro Pro Gly Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 17
Ser Ser Trp Ile Glu
1 5
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 18
Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Ser Leu Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 19
Arg Pro Pro Gly Trp Phe Phe Asp Val
1 5
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 20
Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Asp Val Ala
1 5 10
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 21
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 22
Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 23
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Ser Leu Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Pro Pro Gly Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Thr Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ser Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 25
Ser Cys Trp Ile Glu
1 5
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 26
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 27
Arg Pro Pro Gly Trp Tyr Phe Asp Val
1 5
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 28
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Asp Ile Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 29
Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Thr
1 5
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 30
Gln His Gln Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 31
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Thr Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Cys
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Pro Pro Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr
100 105 110
Ala Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 32
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Asp
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Gln Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 33
Asp Thr Phe Ile His
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 34
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 35
Trp Pro Ser Asn Trp Glu Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 36
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 37
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 38
Gln Gln Trp Ile Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 39
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 39
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Ala Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Lys Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Pro Ser Asn Trp Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<400> 40
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Phe Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa = V or I
<400> 41
Ser Ser Trp Xaa Glu
1 5
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> Xaa = T or L
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = H or N
<220>
<221> 变体
<222> 11
<223> Xaa = Y or F
<400> 42
Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Ser Xaa Xaa Xaa Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> 2
<223> Xaa = S or C
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> Xaa = V or I
<400> 43
Ser Xaa Trp Xaa Glu
1 5
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa = F or L
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> Xaa = G or D
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> Xaa = Y or S
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = H or N
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> Xaa = G or D
<400> 44
Glu Ile Xaa Pro Gly Ser Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Xaa
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa = F or Y
<400> 45
Arg Pro Pro Gly Trp Xaa Phe Asp Val
1 5
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> Xaa = S or T
<400> 46
Lys Ala Ser Gln Asp Val Xaa Thr Asp Val Ala
1 5 10
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa = S or T
<400> 47
Gln Gln His Tyr Ser Xaa Pro Trp Thr
1 5
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> Xaa = S or T
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = V or I
<400> 48
Lys Ala Ser Gln Asp Val Xaa Thr Asp Xaa Ala
1 5 10
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa = Y or F
<400> 49
Ser Ala Ser Tyr Arg Xaa Thr
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> 2, 3
<223> Xaa = Q or H
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa = S or T
<400> 50
Gln Xaa Xaa Tyr Ser Xaa Pro Trp Thr
1 5
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> (9)..(11)
<223> Xaa = THY or LNF
<400> 51
Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Ser Xaa Xaa Xaa Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa = F or L
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(8)
<223> Xaa = DY or GS
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = H or N
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> Xaa = G or D
<400> 52
Glu Ile Xaa Pro Gly Ser Xaa Xaa Thr Xaa Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Xaa
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(3)
<223> Xaa = QH or HQ
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa = S or T
<400> 53
Gln Xaa Xaa Tyr Ser Xaa Pro Trp Thr
1 5
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> Xaa = V or I
<400> 54
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Asp Xaa Ala
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> Xaa = Y or F
<400> 55
Ser Ala Ser Tyr Arg Xaa Thr
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> 2, 3
<223> Xaa = Q or H
<400> 56
Gln Xaa Xaa Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(3)
<223> Xaa = QH or HQ
<400> 57
Gln Xaa Xaa Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的结构
<220>
<221> 变体
<222> 3
<223> Xaa = F or L
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(11)
<223> Xaa = GSTHY, GSLNF, or DYTNY
<220>
<221> 变体
<222> 17
<223> Xaa = F or L
<400> 58
Glu Ile Xaa Pro Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Xaa
<210> 59
<211> 311
<212> PRT
<213> 人类
<400> 59
Met Gly Val Pro Thr Ala Leu Glu Ala Gly Ser Trp Arg Trp Gly Ser
1 5 10 15
Leu Leu Phe Ala Leu Phe Leu Ala Ala Ser Leu Gly Pro Val Ala Ala
20 25 30
Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln
35 40 45
Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His
50 55 60
Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val
65 70 75 80
Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp
85 90 95
Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp
100 105 110
Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn
115 120 125
Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr
130 135 140
Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val
145 150 155 160
His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser
165 170 175
Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Asp Ser Glu Asn Ile Thr
180 185 190
Ala Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu
195 200 205
Pro Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr Lys Gln Arg Gln Ala Ala Ser Asn
210 215 220
Arg Arg Ala Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Asn Ile Gln Gly Ile
225 230 235 240
Glu Asn Pro Gly Phe Glu Ala Ser Pro Pro Ala Gln Gly Ile Pro Glu
245 250 255
Ala Lys Val Arg His Pro Leu Ser Tyr Val Ala Gln Arg Gln Pro Ser
260 265 270
Glu Ser Gly Arg His Leu Leu Ser Glu Pro Ser Thr Pro Leu Ser Pro
275 280 285
Pro Gly Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp
290 295 300
Ser Pro Asn Phe Glu Val Ile
305 310

Claims (33)

1.一种抗VISTA构建体，其包含抗体部分，所述抗体部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述抗体部分与抗体或抗体片段竞争VISTA的结合抗原表位，所述抗体或抗体片段包含第二重链可变区(VH-2)和第二轻链可变区(VL-2)，其中：
a)所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3，并且所述VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQID NO:6的LC-CDR3；
b)所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3，并且所述VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的LC-CDR3；
c)所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:18的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的HC-CDR3，并且所述VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的LC-CDRl、包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的LC-CDR3；
d)所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:26的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HC-CDR3，并且所述VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的LC-CDRl、包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的LC-CDR3；
e)所述VH-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ IDNO:34的HC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:35的HC-CDR3，并且所述VL-2包含：包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的LC-CDR1、包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的LC-CDR2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的LC-CDR3。
2.如权利要求1所述的抗VISTA构建体，其中：
a)所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:2的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的HC-CDR3，或在所述HC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3，或在所述LC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；
b)所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:10的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3，或在所述HC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的LC-CDR3，或在所述LC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；
c)所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:18的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的HC-CDR3，或在所述HC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的LC-CDR3，或在所述LC-CDRs中包含5、4、3、2、或1个氨基酸取代的变体；
d)所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:26的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的HC-CDR3，或在所述HC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的LC-CDR3，或在所述LC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；
e)所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:34的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:35的HC-CDR3，或在所述HC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的LC-CDR3，或在所述LC-CDRs中包含5、4、3、2或1个氨基酸取代的变体；
f)所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:42或51的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的HC-CDR3；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的LC-CDR3；
h)所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:44或52的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的HC-CDR3；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56或57的LC-CDR3；
i)所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:41或43的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11或45的HC-CDR3；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:49的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:50或53的LC-CDR3。
3.如权利要求2所述的抗VISTA构建体，其中所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:3的HC-CDR3；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的LC-CDR3。
4.如权利要求2所述的抗VISTA构建体，其中所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:11的HC-CDR3；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的LC-CDR3。
5.如权利要求3所述的抗VISTA构建体，其中所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:19的HC-CDR3；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的LC-CDR3。
6.如权利要求3所述的抗VISTA构建体，其中所述VH包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的HC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的HC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:27的HC-CDR3；并且所述VL包含：i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的LC-CDR1、ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的LC-CDR2、和iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的LC-CDR3。
7.一种抗VISTA构建体，其包含特异性结合VISTA的抗体部分，所述抗VISTA构建体包含：
a)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:7所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ IDNO:8所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
b)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:15所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ IDNO:16所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
c)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:23所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ IDNO:24所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；
d)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:31所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ IDNO:32所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或
e)HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其分别包含具有SEQ ID NO:39所示序列的VH链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；以及LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其分别包含具有SEQ IDNO:40所示序列的VL链区内的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。
8.如权利要求1-7中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述VH包含SEQ ID NO:7、15、23、31和39中任一个的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；和/或其中所述VL包含SEQ ID NO:8、16、24、32和40中任一个的氨基酸序列，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
9.如权利要求8所述的抗VISTA构建体，其中：
a)所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；并且所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，
b)所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:15，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；并且所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:16，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，
c)所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:23，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；并且所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:24，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，
d)所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:31，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；并且所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体，或
e)所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:39，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体；并且所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:40，或包含具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的变体。
10.如权利要求1-9中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗体部分是选自下组的抗体或其抗原结合片段：全长抗体、双特异性抗体、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、Fv-Fc融合体、scFv-Fc融合体、scFv-Fv融合体、双价抗体、三价抗体和四价抗体。
11.如权利要求10所述的抗VISTA构建体，其中所述抗体部分是全长抗体。
12.如权利要求1-11中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗体部分具有Fc片段，所述Fc片段选自来自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其组合和杂合体的Fc片段。
13.如权利要求12所述的抗VISTA构建体，其中所述Fc片段选自来自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4及其组合和杂合体的Fc片段。
14.如权利要求12或13所述的抗VISTA构建体，其中与相应的野生型Fc片段相比，所述Fc片段具有降低的效应子功能。
15.如权利要求12-14中任一项所述的抗VISTA构建体，其中与相应的野生型Fc片段相比，所述Fc片段具有延长的半衰期。
16.如权利要求1-15中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体的所述抗体部分激活VISTA的下游信号传导途径。
17.如权利要求1-16中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体是VISTA的激动剂抗体。
18.如权利要求16所述的抗VISTA构建体，其中所述抗VISTA构建体的所述抗体部分激活或增强VISTA的下游信号传导途径至少约20％。
19.如权利要求1-18中任一项所述的抗VISTA构建体，其中所述VISTA是人VISTA。
20.一种药物组合物，其包含如权利要求1-19中任一项所述的抗VISTA构建体和药学可接受的载体。
21.一种分离的核酸，其编码如权利要求1-20中任一项所述的抗VISTA构建体。
22.一种载体，其包含如权利要求21所述的分离的核酸。
23.一种分离的宿主细胞，其包含如权利要求21所述的分离的核酸或如权利要求22所述的载体。
24.一种免疫缀合物，其包含如权利要求1-19中任一项所述的抗VISTA构建体，所述抗VISTA构建体连接至治疗剂或标记。
25.一种产生抗VISTA构建体的方法，其包括：
a)在有效表达抗VISTA构建体的条件下培养如权利要求23所述的分离的宿主细胞；
b)从所述宿主细胞获得表达的抗VISTA构建体。
26.一种治疗个体的疾病或病症的方法，其包括向个体施用有效量的如权利要求1-19中任一项所述的抗VISTA构建体或如权利要求20所述的药物组合物。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述疾病或病症与免疫***失调相关。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中所述疾病或病症是自身免疫性疾病、炎症、感染、移植物抗宿主病(GvHD)或与移植相关的病症。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自皮肤狼疮、类风湿性关节炎、牛皮癣、自身免疫性肠道疾病、***性红斑狼疮(SLE)、盘状红斑狼疮(DLE)。
30.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其中将所述抗VISTA构建体通过静脉内或皮下施用于该个体。
31.如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述抗VISTA构建体以约0.001mg/kg至约100mg/kg的剂量施用。
32.如权利要求22-31中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
33.一种试剂盒，其包含如权利要求1-19中任一项所述的抗VISTA构建体。
CN202280032211.6A 2021-03-05 2022-03-04 抗vista的构建体及其用途 Pending CN117715933A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163157182P 2021-03-05 2021-03-05
US63/157,182 2021-03-05
PCT/US2022/070988 WO2022187863A1 (en) 2021-03-05 2022-03-04 Anti-vista constructs and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117715933A true CN117715933A (zh) 2024-03-15

Family

ID=80952232

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280032211.6A Pending CN117715933A (zh) 2021-03-05 2022-03-04 抗vista的构建体及其用途

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20240141048A1 (zh)
EP (1) EP4301472A1 (zh)
JP (1) JP2024509191A (zh)
CN (1) CN117715933A (zh)
AR (1) AR125040A1 (zh)
TW (1) TW202302646A (zh)
WO (1) WO2022187863A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024054929A1 (en) * 2022-09-07 2024-03-14 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-vista constructs and uses thereof

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
CA2226575C (en) 1995-07-27 2011-10-18 Genentech, Inc. Stabile isotonic lyophilized protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
CA2293829C (en) 1997-06-24 2011-06-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
BR9813365A (pt) 1997-12-05 2004-06-15 Scripps Research Inst Método para produção e humanização de um anticorpo monoclonal de rato
DK1068241T3 (da) 1998-04-02 2008-02-04 Genentech Inc Antistofvarianter og fragmenter deraf
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PT1914244E (pt) 1999-04-09 2013-07-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
CA2393869A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genetech,Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CA2785941C (en) 2000-10-06 2017-01-10 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ATE378403T1 (de) 2000-11-30 2007-11-15 Medarex Inc Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humänen antikörpern
CN1555411A (zh) 2001-08-03 2004-12-15 ���迨�����＼���ɷݹ�˾ 抗体-依赖性细胞毒性增大的抗体糖基化变体
EP1433793A4 (en) 2001-09-13 2006-01-25 Inst Antibodies Co Ltd METHOD FOR CREATING A CAMEL ANTIBODY LIBRARY
EP1443961B1 (en) 2001-10-25 2009-05-06 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
ATE395413T1 (de) 2001-12-03 2008-05-15 Amgen Fremont Inc Antikörperkategorisierung auf der grundlage von bindungseigenschaften
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
JP4628679B2 (ja) 2002-04-09 2011-02-09 協和発酵キリン株式会社 Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞
JPWO2003085107A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 ゲノムが改変された細胞
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
JP4753578B2 (ja) 2002-06-03 2011-08-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 合成抗体ファージライブラリー
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
EP1572744B1 (en) 2002-12-16 2010-06-09 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
WO2004065416A2 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
WO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 融合蛋白質組成物
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
WO2005040395A1 (en) 2003-10-22 2005-05-06 Keck Graduate Institute Methods of synthesizing heteromultimeric polypeptides in yeast using a haploid mating strategy
RS55723B1 (sr) 2003-11-05 2017-07-31 Roche Glycart Ag Molekuli koji se vezuju za antigen sa povećanim afinitetom vezivanja za fc receptor i efektornom funkcijom
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
WO2007056441A2 (en) 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2007096779A2 (en) 2006-01-25 2007-08-30 Erasmus University Medical Center Rotterdam Generation of heavy-chain only antibodies in transgenic animals
AU2007249408A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
US20100122358A1 (en) 2008-06-06 2010-05-13 Crescendo Biologics Limited H-Chain-only antibodies
LT2954779T (lt) 2009-12-10 2019-05-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pelės, gaminančios sunkiosios grandinės antikūnus
KR20210088756A (ko) 2014-03-21 2021-07-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물
CA3020848A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Anti-human vista antibodies and use thereof
WO2017181109A1 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 Michael Molloy Anti-human vista antibodies and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AR125040A1 (es) 2023-05-31
EP4301472A1 (en) 2024-01-10
WO2022187863A1 (en) 2022-09-09
TW202302646A (zh) 2023-01-16
JP2024509191A (ja) 2024-02-29
US20240141048A1 (en) 2024-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI825431B (zh) FcRH5之人源化及親和力成熟抗體及使用方法
CN115052893A (zh) 抗tigit抗体和使用方法
WO2019129211A1 (en) Antibodies and variants thereof against pd-l1
US20230112085A1 (en) Anti-b7-h4 constructs and uses thereof
CA3138550A1 (en) Cancer associated antibody compositions and methods of use
TW201946653A (zh) 雙特異性抗原結合分子及使用方法
JP2023516004A (ja) 抗ｃｄ１３７コンストラクト、多重特異性抗体及びその使用
US20240141048A1 (en) Anti-vista constructs and uses thereof
CN114746119A (zh) 抗-ceacam抗体及其用途
EP3178848A1 (en) Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
WO2021164701A1 (en) Fusion proteins and uses thereof
WO2021170067A1 (zh) 抗cd137构建体及其用途
JP2023543031A (ja) 抗ｃｄ９３構築物およびその使用
US20210137982A1 (en) Calreticulin binding constructs and engineered t cells for the treatment of diseases
US20230125301A1 (en) Multispecific anti-claudin-18.2 constructs and uses thereof
WO2024054929A1 (en) Anti-vista constructs and uses thereof
WO2023131329A1 (en) Multispecific constructs and uses thereof
AU2019203917B2 (en) Modified CK and CH1 domains
RU2800779C2 (ru) Биспецифичные антигенсвязывающие молекулы и способы их применения
CN117715934A (zh) 抗cd3构建体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination