ES2872475T3

ES2872475T3 - Animales no humanos que producen proteínas de unión de dominio único

Info

Publication number: ES2872475T3
Application number: ES15715048T
Authority: ES
Inventors: Lynn Macdonald; Andrew J Murphy; Cagan Gurer; John Mcwhirter
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2015-03-20
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2035-03-20
Also published as: KR20230158661A; CA3124228A1; SG10201808225TA; JP2017509355A; KR102601491B1; KR20210088756A; KR20160135791A; WO2015143414A2; RU2016141307A3; KR102276752B1; IL247524A0; EP3119194B1; RU2016141307A; SG11201607203XA; CN106255410A; AU2015230938C1; EP3119194A2; US20210084872A1; KR20220111726A; BR112016021572A2

Abstract

Un roedor genéticamente modificado que comprende en su línea germinal (a) una deleción de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio CH1 de al menos un gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, en donde el al menos un gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno es de IgG, IgA, IgE, IgD o una combinación de los mismos, y (b) un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina VL/JL reorganizada sencilla que comprende las secuencias de segmento génico VL y JL, en donde la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina VL/JL reorganizada sencilla está unida operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina y, opcionalmente, (c) una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos un segmento génico de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) no reorganizada y al menos un segmento génico de unión de cadena ligera de inmunoglobulina (JL) no reorganizada, en donde los segmentos génicos VL y JL no reorganizados son capaces de recombinarse para formar una secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL/JL) reorganizada unida operativamente al gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la deleción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio CH1, en donde el roedor además comprende en su suero una proteína de unión a antígeno de domino único específica a antígeno que carece de un dominio CH1 funcional, opcionalmente en donde la proteína de unión a antígeno de dominio único es una proteína de unión de dominio único VL codificada por la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL/JL) reorganizada unida operativamente al gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la deleción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio CH1, en donde el roedor además comprende una cadena pesada de IgM que comprende un dominio CH1 funcional, y en donde la cadena pesada de IgM está asociada a una cadena ligera universal cognada codificada por la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina VL/JL reorganizada sencilla que comprende las secuencias de segmento génico VL y JL unidas operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina.

Description

DESCRIPCIÓN

Animales no humanos que producen proteínas de unión de dominio único

Campo de la invención

En el presente documento se divulgan animales no humanos que presentan alta diversidad en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina, y preferentemente muy baja diversidad en el locus de cadena ligera de inmunoglobulina, lo que permite la selección de proteínas de unión a antígeno de dominio único, incluidas las proteínas de unión de dominio único V^hy las proteínas de unión de dominio único V^l, que se unen a antígeno.

Antecedentes

En la mayoría de los animales, las cadenas pesadas de la inmunoglobulina normal únicamente se expresan bien cuando se acoplan a sus cadenas ligeras cognadas. En los seres humanos, se encuentran cadenas pesadas solas en la enfermedad de la cadena pesada que se manifiesta por cadenas pesadas disfuncionales que carecen de secuencias del dominio variable pesado, el C^h1, o los dominios variable pesado y C^h1. Las cadenas pesadas desprovistas de cadenas ligeras se encuentran en determinadas especies de peces y en camellos. Dichas cadenas pesadas carecen de un dominio C^h1 funcional y tienen características no humanas en sus dominios variables de cadena pesada. Se han hecho intentos de producir anticuerpos tipo camello modificando ratones para expresar genes tipo camello que imitan los dominios V^hhencontrados en camellos o determinadas especies de pescado, en parte mediante la eliminación de dominios C^h1 de IgM e IgG y adaptando las regiones variables de la cadena pesada para parecerse a las de los camellos y/o determinadas especies de pescado. Desafortunadamente, se esperaría que los anticuerpos tipo camello indujeran respuestas inmunitarias en animales no camélidos. Otro reto con las anteriores versiones de animales no humanos genéticamente modificados para comprender un dominio C^h1 desactivado son los reducidos niveles de expresión de proteínas de unión a antígeno de dominio único específicas a antígeno, en comparación con los anticuerpos tradicionales. Dicha reducción puede ser debida a una falta de mecanismos disponibles para las regiones variables de cadena pesada de no camélidos que permita que las regiones variables de cadena pesada compensen la ausencia de un dominio V^l. Por ejemplo, los dominios V^hhcamélidos encontrados en las proteínas de unión de solo cadena pesada comprenden una CDRH3 que es, en promedio, mayor que la encontrada en los anticuerpos no camélidos, se considera que es una influencia importante sobre la afinidad y la especificidad a antígeno total, y se piensa que compensa la ausencia de un dominio V^len el anticuerpo de solo cadena pesada camélido.

Por tanto, existe una necesidad en la técnica de animales no humanos genéticamente modificados que produzcan diversas proteínas de unión de dominio único que tengan dominios V^hno camélidos.

Sumario

Como se divulga en el presente documento, cadenas polipeptídicas de la inmunoglobulina que comprenden una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena pesada pueden ser expresadas por animales no humanos y formar proteínas de unión a antígeno de dominio único V^l, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno de dominio único que comprenden dominios variables de cadena ligera unidos operativamente a dominios constantes de cadena ligera, en donde lo(s) dominio(s) constante(s) de cadena pesada carecen de un dominio C^h1 funcional, por ejemplo, preferiblemente una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionada de IgG, IgA, IgE, IgD o una combinación de las mismas. Las proteínas de unión a antígeno de dominio único V^lpueden presentar estabilidad aumentada en comparación con las proteínas de unión a antígeno de dominio único V^hque comprenden dominios variables de cadena pesada unidos operativamente a dominios constantes de cadena pesada que carecen de un dominio C^h1 funcional. Por consiguiente, en el presente documento se divulgan animales no humanos capaces de expresar una proteína de unión a antígeno de dominio único V^lque comprende un dominio variable de cadena ligera y una región constante de cadena pesada, en donde la región constante de cadena pesada carece de un dominio C^h1 funcional, y también puede carecer opcionalmente de una región bisagra funcional y métodos de obtención y uso de animales no humanos que expresen proteínas de unión a antígeno de dominio único V^l. También se divulgan células, proteínas y ácidos nucleicos derivados de animales no humanos que expresan proteínas de unión a antígeno de dominio único V^l, y el uso de las células, las proteínas y los ácidos nucleicos aislados.

La invención proporciona un roedor genéticamente modificado que comprende en su línea germinal

(a) una deleción de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio C^h1 de al menos un gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, en donde el al menos un gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno es de IgG, IgA, IgE, IgD o una combinación de los mismos; y (b) un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina V^l/J^lreorganizada sencilla que comprende las secuencias de segmento génico V^ly J^l, en donde la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina V^l/J^lreorganizada sencilla está unida operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina; y opcionalmente

(c) una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos un segmento génico de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl) no reorganizada y al menos un segmento génico de unión de cadena ligera de inmunoglobulina (Jl) no reorganizada, en donde los segmentos génicos Vl y Jl no reorganizados son capaces de recombinarse para formar una secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl/Jl) reorganizada unida operativamente al gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la deleción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio Ch1;

en donde el roedor además comprende en su suero una proteína de unión a antígeno de domino único específica a antígeno que carece de un dominio Ch1 funcional, opcionalmente en donde la proteína de unión a antígeno de dominio único es una proteína de unión de dominio único Vl codificada por la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl/Jl) reorganizada unida operativamente al gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la deleción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio Ch1, en donde el roedor además comprende una cadena pesada de IgM que comprende un dominio Ch1 funcional, y en donde la cadena pesada de IgM está asociada a una cadena ligera universal cognada codificada por la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina Vl/Jl reorganizada sencilla que comprende las secuencias de segmento génico Vl y Jl unidas operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina.

La invención además proporciona un roedor genéticamente modificado que es un ratón que comprende

(a) un reemplazo en un locus de cadena pesada de ratón de todos los segmentos génicos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina endógenos funcionales por (1) al menos un segmento génico Vh de cadena pesada de inmunoglobulina humano no reorganizado, al menos un segmento génico Dh de cadena pesada de inmunoglobulina humano no reorganizado, y al menos un segmento génico JH de cadena pesada de inmunoglobulina humano no reorganizado, en donde los segmentos génicos Vh, Dh, y Jh de cadena pesada de inmunoglobulina no reorganizados humanos están unidos operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena pesada de ratón, o (2) al menos un segmento génico Vl de cadena ligera humano no reorganizado y al menos un segmento génico Jl de cadena ligera no reorganizado humano, en donde los segmentos génicos Vl y Jl de cadena ligera humanos no reorganizados están unidos operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena pesada de ratón; y en donde los segmentos génicos Vl y Jl humanos no reorganizados son capaces de recombinarse para formar una secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl/Jl) reorganizada unida operativamente a la secuencia del gen de la región constante de cadena pesada de ratón, en donde la secuencia del gen de la región constante de cadena pesada de ratón comprende un gen de IgM de longitud completa y una deleción de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio Ch1 en un gen de IgG seleccionado entre el grupo que consiste en uno de IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3 y una combinación de los mismos, y

(b) un reemplazo de todos los segmentos génicos V y J de cadena ligera de inmunoglobulina endógenos funcionales por una secuencia del gen de Vk/Jk variable humana reorganizada sencilla, en donde la secuencia del gen de la región variable Vk/Jk humana reorganizada sencilla está unida operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina, en donde el ratón además comprende en su suero una proteína de unión a antígeno de domino único específica a antígeno que carece de un dominio Ch1 funcional, opcionalmente en donde la proteína de unión a antígeno de dominio único es una proteína de unión de dominio único Vl codificada por la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl/Jl) reorganizada unida operativamente a la secuencia del gen de la región constante de cadena pesada de ratón que comprende la deleción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio Ch1, y en donde el ratón expresa un receptor de linfocitos B que comprende una cadena pesada de IgM asociada a una cadena ligera universal cognada codificada por la secuencia del gen de la región variable Vk/Jk humana reorganizada sencilla que comprende las secuencias del segmento génico VK y JK unidas operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina.

La invención también proporciona un método para obtener un roedor genéticamente modificado de la invención que comprende las etapas

(a) modificar al menos una región constante de cadena pesada de roedor en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno del roedor de modo que la región constante de cadena pesada comprenda una deleción de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio Ch1 de IgG, IgA, IgE, IgD o una combinación de los mismos; y

(b) introducir un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina Vl/Jl reorganizada sencilla que comprende secuencias del segmento génico Vl y Jl, en donde la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina Vl/Jl reorganizada sencilla está unida operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina; y opcionalmente

(c) insertar una secuencia de ácido nucleico en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende al menos un segmento génico de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl) no reorganizado y al menos un segmento génico de unión de cadena ligera de inmunoglobulina (Jl) no reorganizado, en donde los segmentos génicos Vl y Jl no reorganizados son capaces de recombinarse para formar una secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl/Jl) reorganizada unida operativamente al gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la deleción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio Ch1.

Como se divulga en el presente documento, la expresión de una cadena ligera reorganizada sencilla por animales no humanos capaces de producir proteínas de unión a antígeno de dominio único, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno de dominio único Vl o Vh, aumenta el título de las proteínas de unión a antígeno de dominio único específicas a antígeno en respuesta a la exposición a antígeno en comparación con un animal no humano similar capaz de producir proteínas de unión a antígeno de dominio único que no expresan la cadena ligera reorganizada sencilla. FIG. 5. Estos datos sugieren que la presencia de la cadena ligera reorganizada sencilla por animales no humanos aumenta la probabilidad de generar una proteína de unión a antígeno de dominio único específica a antígeno. Por consiguiente, en el presente documento se divulgan animales no humanos capaces de expresar proteínas de unión a antígeno de dominio único (por ejemplo proteínas de unión a antígeno de dominio único Vh y/o Vl) y una cadena ligera reorganizada sencilla y métodos de obtención y uso de animales no humanos que expresan proteínas de unión a antígeno de dominio único Vl. También se divulgan células, proteínas y ácidos nucleicos derivados de animales no humanos que expresan proteínas de unión a antígeno de dominio único y una cadena ligera reorganizada sencilla, y el uso de las células, las proteínas y los ácidos nucleicos aislados.

En el presente documento también se describen animales no humanos que comprenden proteínas de unión a antígeno de dominio único Vl y una cadena ligera reorganizada sencilla, métodos de obtención de animales no humanos capaces de producir un alto título de proteínas de unión a antígeno de dominio único y/o que aumentan la producción de proteínas de unión de dominio único por animales no humanos capaces de producir dichas proteínas de unión, métodos de uso de los animales no humanos para producir proteínas de unión a antígeno de dominio único específicas a antígeno, y proteínas de unión a antígeno de dominio único así producidas.

Se describen células modificadas genéticamente, embriones no humanos, animales no humanos y métodos y composiciones para obtenerlos y usarlos, en donde los animales se modifican genéticamente para producir proteínas de unión a antígeno de dominio único, por ejemplo, proteínas de unión que comprenden una región constante de cadena pesada que carece de una secuencia de Ch1 funcional, y también opcionalmente carecen de una secuencia de la región bisagra funcional, y en donde los animales además se modifican genéticamente para expresar la proteína de unión a antígeno de dominio único como una proteína de unión a antígeno de dominio único Vl (por ejemplo, codificada a partir de una secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera reorganizada unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada modifica para desactivar o suprimir una secuencia codificante del dominio Ch1) y/o una cadena ligera reorganizada sencilla (por ejemplo, codificada a partir de una secuencia de Vl:Jl reorganizada sencilla unida operativamente a una región constante de cadena ligera en la línea germinal del animal).

Los animales como se divulga en el presente documento pueden producir proteínas de unión de dominio único, que, en un aspecto, comprenden un isotipo IgG, tal como, por ejemplo, el isotipo IgG1. En algunos aspectos, la proteína de unión a antígeno de dominio único es una proteína de unión a antígeno de dominio único Vh, por ejemplo, comprende una región variable de cadena pesada unida operativamente a una región constante de cadena pesada que carece de un Ch1 funcional. En otros aspectos, la proteína de unión a antígeno de dominio único es una proteína de unión a antígeno de dominio único Vl, por ejemplo, comprende un dominio variable de cadena ligera unido operativamente a una región constante de cadena pesada que carece de un Ch1 funcional, por ejemplo, una región constante de cadena pesada que comprende bisagra, CH2, CH3, CH4 o una combinación de los mismos.

Por consiguiente, en algunos aspectos, una proteína de unión a antígeno de dominio único como se describe en el presente documento es codificada por una secuencia de ácido nucleico derivada de uno o más segmentos V de cadena ligera de inmunoglobulina no reorganizados y uno o más segmentos J de cadena ligera de inmunoglobulina no reorganizados unidos operativamente a una región constante de cadena pesada (por ejemplo, un dominio de región constante de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en Ch1, bisagra, Ch2, Ch3, Ch4 y combinación de los mismos), en donde la región constante de cadena pesada comprende una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia de la región Ch1. En un aspecto, los segmentos V y J de cadena ligera no reorganizados reemplazan uno o más, básicamente todos, o todos los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no humanos endógenos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina no humano endógeno. En algunos aspectos, se puede encontrar un locus de cadena pesada modifico para comprender segmentos génicos de la región variable de cadena pesada unidos operativamente a una región constante de cadena pesada que comprende una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia de la región CH1 como se describe en el presente documento en la línea germinal del animal no humano. Dicho locus modificado puede estar en el locus de cadena pesada endógeno, o estar presente en un transgén en un locus distinto del locus de cadena pesada endógeno (por ejemplo, insertado en una posición aleatoria en el genoma).

En un aspecto, los animales divulgados en el presente documento que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a antígeno de dominio único Vl (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico derivada de uno o más segmentos V de cadena ligera de inmunoglobulina no reorganizados y uno o más segmentos J de cadena ligera de inmunoglobulina no reorganizados unidos operativamente a una región constante de cadena pesada que comprende una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia de la región Ch1) pueden también comprender una segunda cadena polipeptídica de inmunoglobulina que comprende una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera, que puede ser codificada por una segunda secuencia de ácido nucleico que comprende un segmento V de cadena ligera humano y un segmento J de cadena ligera humano unido operativamente a una región constante de cadena ligera. Dicha segunda secuencia de ácido nucleico también puede encontrarse en la línea germinal del animal no humano. Dicha secuencia de ácido nucleico puede estar presente en el locus de cadena ligera endógeno, o estar presente en un transgén en un locus distinto del locus de cadena ligera endógeno (por ejemplo, insertado en una posición aleatoria en el genoma).

En otro aspecto, los animales modificados para comprender una secuencia de ácido nucleico derivada de uno o más segmentos V de cadena ligera de inmunoglobulina no reorganizados y uno o más segmentos J de cadena ligera de inmunoglobulina no reorganizados unidos operativamente a una región constante de cadena pesada que comprende una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia de la región Ch1 pueden modificarse más para expresar una cadena ligera reorganizada sencilla, por ejemplo, una cadena ligera común (ULC).

En algunos aspectos, la proteína de unión a antígeno de dominio único tal como, aunque no de forma limitativa, una proteína de unión a antígeno de dominio único Vl, y/o la cadena ligera reorganizada sencilla comprende idiotipos humanos. Por ejemplo, una proteína de unión a antígeno de dominio único y/o una cadena ligera reorganizada sencilla modificada por ingeniería genética como se divulga en el presente documento comprende un dominio variable humano y, en un aspecto, un dominio constante no humano. En un aspecto, el dominio constante no humano es un dominio constante no humano endógeno. En un aspecto, el dominio constante no humano es un dominio constante de roedor, por ejemplo, un dominio constante murino, por ejemplo, un dominio constante de ratón. En otro aspecto, el dominio constante no humano es un dominio constante humano. En un aspecto, la proteína de unión a antígeno de dominio único es una proteína de unión a antígeno de dominio único Vl que comprende un dominio variable de cadena ligera humano y una región constante de cadena pesada no humana. En un aspecto, los segmentos V y/o J de cadena ligera no reorganizados que codifican una proteína de unión a antígeno de dominio único Vl como se describe en el presente documento son segmentos humanos.

Los animales genéticamente modificados para producir las proteínas de unión a antígeno de dominio único como se divulga en el presente documento pueden comprender un locus de cadena pesada que tiene un reemplazo de uno o más, o todos, los segmentos génicos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina endógenos por uno o más segmentos génicos de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humanos no reorganizados, o uno o más segmentos V de cadena ligera de inmunoglobulina humanos no reorganizados y uno o más segmentos J de cadena ligera de inmunoglobulina humanos no reorganizados. En algunos aspectos, todos los segmentos génicos VH, DH, y JH están reemplazados por uno o más segmentos génicos VH humanos no reorganizados, uno o más DH humanos no reorganizados y uno o más Jh humanos no reorganizados. En otros aspectos, todos los segmentos génicos Vh, Dh, y Jh están reemplazados por uno o más segmentos génicos Vl de cadena ligera de inmunoglobulina humanos no reorganizados y uno o más segmentos génicos Jl de cadena ligera de inmunoglobulina humanos no reorganizados, por ejemplo, segmentos génicos kappa (k) Vk y/y Jk humanos y/o segmentos génicos lambda (A) VA y/y JA humanos.

Los animales genéticamente modificados para producir la proteína de unión de dominio único que comprende una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera en el contexto de una región constante de cadena pesada que comprende una deleción de una región Ch1 y/o una región bisagra pueden portar la modificación (y/u otras modificaciones de un locus del gen constante descrito en el presente documento) en un locus de cadena pesada endógeno, o pueden portar la modificación en un transgén, en donde el transgén se coloca en cualquier lugar en el genoma, por ejemplo, introducido en el genoma por inserción aleatoria. En algunos aspectos, el locus de cadena pesada modificado como se describe en el presente documento puede encontrarse en la línea germinal del animal. En animales también modificados para expresar una cadena ligera reorganizada sencilla, la región variable de cadena ligera reorganizada sencilla puede estar unida operativamente a una región constante de cadena ligera en el locus de cadena ligera endógeno, o puede estar presente en un transgén que comprende la región variable de cadena ligera reorganizada sencilla unida operativamente a una región constante de cadena ligera singenética (por ejemplo autóloga; con respecto al animal no humano) o heteróloga y presente en un locus distinto del locus de cadena ligera endógeno, por ejemplo, insertado aleatoriamente en el genoma.

En aspectos adicionales, los loci de cadena pesada de los animales divulgados en el presente documento pueden comprender una deleción o una mutación de desactivación en la(s) región(es) bisagra.

Además, los animales divulgados en el presente documento pueden modificarse para comprender y/o expresar una secuencia del gen variable de cadena ligera reorganizada sencilla unida operativamente a una región constante de cadena ligera, también denominada cadena ligera común o universal (ULC), que puede ser codificada por un locus de cadena ligera que comprende una secuencia de gen Vl:Jl reorganizada sencilla. En algunos aspectos, el locus de cadena ligera comprende una secuencia de gen Vl:Jl reorganizada sencilla en la que la secuencia de Vl es una secuencia del gen VK. En algunos aspectos, la secuencia de Vk se selecciona de Vk1 -39 o Vk3-20. En algunos aspectos, la secuencia de Jl es una secuencia del gen JK, por ejemplo, una secuenciación de JK1, una secuenciación de JK2, una secuenciación de JK3, una secuenciación de JK4, o una secuenciación de JK5, etc. En algunos aspectos, el locus de cadena ligera comprende una secuencia Vk:Jk reorganizada sencilla seleccionada del grupo que consiste en Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1. En un aspecto, el locus de cadena ligera comprende una secuencia Vk:Jk reorganizada sencilla de Vk1-39Jk5. En otro aspecto, el locus de cadena ligera comprende una secuencia Vk:Jk reorganizada sencilla de Vk3-20Jk1. En algunos aspectos, la secuencia del gen variable reorganizada sencilla está unida operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera no humano, por ejemplo, el gen de la región constante de cadena ligera no humano endógeno. En otro aspecto, la secuencia del gen variable reorganizada sencilla está unida operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera humano. En algunos aspectos, la secuencia del gen variable reorganizada sencilla es una secuencia V:J humana insertada en el locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno de modo que el animal no humano resultante no comprende los segmentos génicos V y/o J no reorganizados funcionales en uno o más loci de cadena ligera.

Por consiguiente, en el presente documento se divulgan animales no humanos que portan una región constante de cadena pesada que comprende una deleción o una mutación de desactivación en una región codificante de C^h1 y una 0 ambas de (a) una región variable de cadena ligera en el contexto de la región constante de cadena pesada que comprende una deleción o una mutación de desactivación en una región de C^h1 y (b) la cadena ligera reorganizada sencilla. Por ejemplo, un animal no humano como se divulga en el presente documento puede comprender una secuencia de ácido nucleico derivada de uno o más segmentos V de cadena ligera de inmunoglobulina no reorganizados y uno o más segmentos J de cadena ligera de inmunoglobulina no reorganizados unidos operativamente a una región constante de cadena pesada que comprende una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia de la región de CH1 como se describe en el presente documento. En un aspecto, una animal no humano como se divulga en el presente documento comprende una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio C^h1 de inmunoglobulina y una secuencia del gen variable de cadena ligera reorganizada sencilla unida operativamente a una región constante de cadena ligera como se divulga en el presente documento. En otro aspecto, un animal no humano como se divulga en el presente documento comprende una secuencia de ácido nucleico derivada de uno o más segmentos V de cadena ligera de inmunoglobulina no reorganizados y uno o más segmentos J de cadena ligera de inmunoglobulina no reorganizados unidos operativamente a una región constante de cadena pesada que comprende una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia de la región de C^h1 y una secuencia del gen variable de cadena ligera reorganizada sencilla unida operativamente a una región constante de cadena ligera. En algunos aspectos, la región constante de cadena pesada es una región constante no humana, por ejemplo, una región constante no humana endógena. En otros aspectos, la región constante de cadena pesada es una región constante humana.

En algunos aspectos, un animal no humano comprende los loci de cadena pesada modificados y/o los loci de cadena ligera reorganizados modificados por ingeniería genética como se divulga en el presente documento en su línea germinal. El animal no humano también puede comprender una deleción o una mutación de desactivación en uno o más de los siguientes genes de inmunoglobulina: IgD, IgG3, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgE, IgA y una combinación de los mismos. En un aspecto, el animal no humano comprende una deleción o una mutación de desactivación en los genes de la inmunoglobulina IgG2a e IgG2b. En otro aspecto, el animal no humano comprende una deleción o una mutación de desactivación en los genes de la inmunoglobulina IgG3, IgD, IgA e IgE. En otro aspecto, el animal no humano comprende una deleción o una mutación de desactivación en los genes de la inmunoglobulina IgG3, IgD, IgG2a, IgG2b, IgA e IgE.

En algunos aspectos, un animal no humano como se divulga en el presente documento puede también comprender un gen de Adam6a (o un fragmento del mismo) y/o un gen de Adam6b (o fragmento del mismo) capaz de conservar la fertilidad de un animal no humano macho. El gen de Adam6a, el gen de Adam6b, o ambos pueden estar colocados de manera ectópica, puede estar en una posición que se aproxima a la posición del(de los) gen(es) de Adam6 en el animal no humano. El gen de Adam6a, el gen de Adam6b, o ambos son funcionales en un animal no humano macho. Por ejemplo, el animal no humano es un roedor (por ejemplo, un ratón o una rata) y el gen de Adam6a, el gen de Adam6b, o ambos son genes de ratón o rata, respectivamente. En diversos aspectos, el mantenimiento o la inserción del(de los) gen(es) de Adam6 mantiene o confiere fertilidad al animal no humano macho (por ejemplo, el ratón o rata macho).

En un aspecto, los animales no humanos divulgados en el presente documento comprenden una inmunoglobulina IgM codificada por una secuencia del gen de IgM que comprende una secuencia codificante del dominio C^h1 funcional, que puede asociarse a una cadena ligera cognada, por ejemplo, una cadena ligera reorganizada sencilla modificada por ingeniería genética. En otro aspecto, el animal no humano produce únicamente cadenas pesadas que tienen un isotipo IgM e IgG1, en donde las cadenas pesadas de IgM comprende un dominio C^h1 funcional mientras que las cadenas pesadas de IgG1 carecen de un dominio C^h1 funcional. En un aspecto, la cadena ligera cognada asociada a la cadena pesada de IgM es codificada por o se deriva de una secuencia del gen variable de cadena ligera reorganizada sencilla unida operativamente a una región constante de cadena ligera.

La expresión de la cadena ligera reorganizada sencilla modificada por ingeniería genética como se divulga en el presente documento da como resultado la producción de un título alto de proteínas de unión a antígeno de dominio único específicas a antígeno después de exponer los animales no humanos al antígeno. Un título, por ejemplo, una concentración de anticuerpo o proteína de unión, por ejemplo, medido por ELISA, de al menos 1 x 102 pg/ml, al menos 1 x 103 pg/ml, al menos 1 x 104 pg/ml o al menos 1 x l05 pg/ml puede considerarse un título alto. Como alternativa, un animal no humano produce un título alto de proteína de unión si la concentración de la proteína de unión es de al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, o al menos 100 veces la concentración de un correspondiente animal control que no comprende la cadena ligera reorganizada modificada por ingeniería genética.

En el presente documento también se divulgan métodos para obtener un animal no humano como se divulga en el presente documento. Dichos métodos comprenden modificar la región constante de cadena pesada no humana del animal no humano de modo que la región constante de cadena pesada comprende una deleción o una mutación de desactivación de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio C^h1, por ejemplo, un dominio C^h1 de IgG1.

Los métodos para obtener un animal no humano como se divulga en el presente documento pueden también comprender reemplazar en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, uno o más, todos, o básicamente todos los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada no humanos por uno o más segmentos génicos V de cadena ligera no reorganizados y/o uno o más J de cadena ligera no reorganizados de modo que los segmentos génicos V y J de cadena ligera están unidos operativamente a una región constante de cadena pesada que comprende una deleción o una mutación de desactivación de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio C^h1. En un aspecto, los segmentos génicos V y J de cadena ligera no reorganizados son capaces de experimentar reorganización productiva, por ejemplo, comprenden secuencias señal de recombinación (RSS) que permiten que los segmentos génicos V y J de cadena ligera no reorganizados se recombinen de modo que el animal no humano modificado comprende una secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (V^l/J^l) reorganizada unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada, en donde la secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada comprende una mutación de desactivación o una deleción en una secuencia que codifica un dominio C^h1. En un aspecto, los segmentos génicos V y J de cadena ligera no reorganizados se recombinan de modo que el animal no humano modificado comprende una secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (V^l/J^l) reorganizada que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 o más adicciones de N y está unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada, y en donde la secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada comprende una mutación de desactivación o una deleción en una secuencia que codifica un dominio C^h1. En un aspecto, los segmentos génicos V y J de cadena ligera no reorganizados son segmentos V y J humanos. El método también puede comprender provocar que el animal exprese una proteína de unión a domino único V^lderivada del segmento génico V de cadena ligera no reorganizado, el segmento génico J de cadena ligera no reorganizado y la región constante de cadena pesada que tiene un domino C^h1 desactivado o delecionado.

En otro aspecto, los métodos para obtener un animal no humano como se divulga en el presente documento pueden también comprender introducir un locus de cadena ligera reorganizada sencilla modificado por ingeniería genética que comprende un ácido nucleico que codifica una cadena ligera reorganizada sencilla, por ejemplo, una cadena ligera universal (ULC) y, opcionalmente, provocar que el animal exprese el locus de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene un dominio C^h1 desactivado y el locus de cadena ligera reorganizada sencilla.

En un aspecto, los métodos para obtener un animal no humano como se divulga en el presente documento comprenden (a) modificar la región constante de cadena pesada no humana del animal no humano de modo que la región constante de cadena pesada comprende una deleción o una mutación de desactivación de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio C^h1 y uno o ambos de (b) reemplazar en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, uno o más, todos, o básicamente todos los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada no humanos por uno o más segmentos génicos V de cadena ligera no reorganizados y/o uno o más J de cadena ligera no reorganizados de modo que los segmentos génicos V y J de cadena ligera están unidos operativamente a la región constante de cadena pesada no humana que comprende una deleción o una mutación de desactivación de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio C^h1 y/o (c) introducir un ácido nucleico que codifica un locus de cadena ligera reorganizada sencilla modificado por ingeniería genética. Las etapas de los métodos divulgados en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden, de forma secuencial o simultánea.

Por ejemplo, un método como se divulga en el presente documento puede comprender (a) modificar la región constante de cadena pesada no humana del animal no humano de modo que la región constante de cadena pesada comprende una deleción o una mutación de desactivación de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio C^h1 y (b) reemplazar en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, uno o más, todos, o básicamente todos los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada no humanos por uno o más segmentos génicos V de cadena ligera no reorganizados y/o uno o más J de cadena ligera no reorganizados de modo que los segmentos génicos V y J de cadena ligera están unidos operativamente a la región constante de cadena pesada no humana que comprende una deleción o una mutación de desactivación de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio C^h1. En un aspecto, un método como se divulga en el presente documento comprenden (a) modificar la región constante de cadena pesada no humana del animal no humano de modo que la región constante de cadena pesada comprende una deleción o una mutación de desactivación de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio CH1 y (b) introducir un ácido nucleico que codifica un locus de cadena ligera reorganizada sencilla modificado por ingeniería genética. En otro aspecto, el método para obtener un animal no humano como se divulga en el presente documento comprende (a) modificar la región constante de cadena pesada no humana del animal no humano de modo que la región constante de cadena pesada comprende una deleción o una mutación de desactivación de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio C^h1, (b) reemplazar en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, uno o más, todos, o básicamente todos los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada no humanos por uno o más segmentos génicos V de cadena ligera no reorganizados y/o uno o más J de cadena ligera no reorganizados de modo que los segmentos génicos V y J de cadena ligera están unidos operativamente a la región constante de cadena pesada no humana que comprende una deleción o una mutación de desactivación de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio C^h1 y (c) introducir un ácido nucleico que codifica un locus de cadena ligera reorganizada sencilla modificado por ingeniería genética. Los métodos de obtención de un animal no humano como se divulga en el presente documento pueden también comprender introducir un gen de Adam6a, un gen de Adam6a, o ambos dentro del genoma del animal no humano, por ejemplo, en la línea germinal del animal. En un aspecto, el método además comprende provocar que el animal exprese el locus de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene un dominio C^h1 desactivado y/o el locus de cadena ligera genéticamente reorganizada (locus de cadena ligera reorganizada sencilla), por ejemplo, inmunizando el animal.

En un aspecto, la etapa de desactivación del(de los) dominio(s) C^h1, y opcionalmente la(s) región(es) bisagra, de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina posibilita que el animal no humano produzca una proteína de unión a antígeno de dominio único como se divulga en el presente documento. En un aspecto, la desactivación del(de los) dominio(s) C^h1 y, opcionalmente, la(s) región(es) bisagra de un locus de cadena pesa de inmunoglobulina comprende mutagénesis dirigida de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina con un vector de mutagénesis dirigida que suprime o introduce una mutación de desactivación dentro del(de los) dominio(s) C^h1 y, opcionalmente, la región bisagra, de un locus de cadena pesada, por ejemplo, de un locus de cadena pesada de IgG. En un aspecto, la desactivación del(de los) dominios C^h1 y, opcionalmente, la(s) región(es) bisagra del locus de cadena pesada de inmunoglobulina comprende recombinación homóloga. En otro aspecto, la etapa de desactivación puede también comprender el remplazo de uno o más, básicamente todos, o todos los segmentos génicos de la región variable endógenos del locus del gen de cadena pesada con uno cualquiera o más de los siguientes: uno o más segmentos génicos de la región variable de cadena pesada, uno o más segmentos génicos de la región variable de cadena ligera, uno o más segmentos génicos de la región variable humanos y uno o más segmentos génicos de la región variable no reorganizados. La etapa de desactivación del(de los) dominios C^h1 y, opcionalmente, la(s) región(es) bisagra del locus del gen de cadena pesada puede darse en la línea germinal del animal no humano.

En un aspecto el método comprende introducir un locus de ácido nucleico que codifica una cadena ligera reorganizada modificada por ingeniería genética, por ejemplo, una cadena ligera universal modificada por ingeniería genética. En un aspecto, la etapa de introducción del locus de ácido nucleico que codifica una cadena ligera reorganizada modificada por ingeniería genética además comprende reemplazar todos o básicamente todos los loci de cadena ligera de inmunoglobulina endógenos. En un aspecto, la etapa de introducción del locus de ácido nucleico que codifica una cadena ligera reorganizada modificada por ingeniería genética además comprende desactivar funcionalmete todos o básicamente todos los loci de cadena ligera de inmunoglobulina endógenos. En otro aspecto el ácido nucleico que codifica una cadena ligera reorganizada modificada por ingeniería genética se introduce en la línea germinal del animal.

En un aspecto, el método para obtener un animal no humano como se divulga en el presente documento comprende (a) obtener un primer animal no humano que comprenda un locus de cadena pesada que tiene un dominio C^h1 delecionado o desactivado (y opcionalmente una secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera unida operativamente a la secuencia de la región constante de cadena pesada que tiene un dominio C^h1 delecionado o desactivado) y, opcionalmente, un región bisagra delecionada o desactivada de modo que el animal no humano produce proteínas de unión a antígeno de dominio único (tales como una proteína de unión de dominio único V^l) como se divulga en el presente documento, y (b) cruzar el primer animal no humano de (a) con un segundo animal no humano, el cual en un aspecto puede ser una cepa diferente que el primer animal no humano, en donde el segundo animal no humano expresa una cadena ligera universal, y en donde el cruce da como resultado progenie que produce, por ejemplo, comprende, una proteína de unión a antígeno de dominio único y una cadena ligera reorganizada modificada por ingeniería genética (cadena ligera reorganizada sencilla; ULC).

En algunos aspectos, los métodos para obtener un animal no humano como se divulga en el presente documento además comprende desactivación o deleción de uno o más genes de inmunoglobulina seleccionados entre el grupo que consiste en de IgD, IgG3, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgE e IgA. En un aspecto, los genes de inmunoglobulina IgG2b e IgG2a/IgG2c están delecionados. En otro aspecto, los genes de IgD, IgG3, IgG2b, IgG2a/IgG2c, IgE e IgA se someten a deleción de modo que el animal no humano produce cadenas pesadas de inmunoglobulina que tienen un isotipo IgM o IgG1, en donde el isotipo IgG1 tiene una deleción o una mutación de desactivación en el dominio C^h1 y opcionalmente en una región bisagra.

En un aspecto, un animal no humano ya es capaz de producir proteínas de unión a antígeno de dominio único y como se describe en el presente documento es un método de aumento de la producción de proteínas de unión a antígeno de dominio único por el animal no humano. Dicho método comprende provocar que los linfocitos B del animal no humano exprese un ácido nucleico que codifica una cadena ligera reorganizada sencilla modificada por ingeniería genética, por ejemplo, una cadena ligera universal modificada por ingeniería genética. La provocación de que los linfocitos B expresen dicho ácido nucleico también puede comprender la etapa de desactivación o prevención de la expresión de los genes de la cadena ligera endógenos por los linfocitos B.

En un aspecto un animal no humano como se divulga en el presente documento es una rata o un ratón. En otro aspecto, un animal no humano como se divulga en el presente documento es un ratón. Por consiguiente, en el presente documento se divulga un ratón genéticamente modificado, que comprende (a) un reemplazo en un locus de cadena pesada de ratón de todos o básicamente todos los segmentos génicos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina endógenos por uno o más de los segmentos génicos V, D y J de cadena pesada humanos, en donde el uno o más segmentos génicos V, D y J de cadena pesada humanos están unidos operativamente a una región constante de cadena pesada de ratón (por ejemplo, región constante de cadena pesada de ratón endógena), en donde la región constante de cadena pesada de ratón comprende el gen de IgM de longitud completa; y un gen de IgG que comprende una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia de nucleótidos que codifica una región C^h1 en un gen de IgG seleccionado entre el grupo que consiste en uno de IgG1, IgG2a, IgG2c, IgG2b y una combinación de los mismos, en donde el ratón expresa un receptor de los linfocitos B que comprende una IgM con una región C^h1, en donde la IgM comprende una cadena pesada asociada a una cadena ligera cognada; y (b) un reemplazo de todos o básicamente todos los segmentos génicos V y J de cadena ligera de inmunoglobulina endógenos por una secuencia de gen Vk:Jk variable reorganizada sencilla. En algunos aspectos, la cadena ligera cognada se deriva de la secuencia de gen variable Vk:Jk reorganizada sencilla. En algunos aspectos, la secuencia del gen variable Vk:Jk reorganizada sencilla está unida operativamente a una secuencia constante de cadena ligera de ratón, por ejemplo, la secuencia constante de cadena ligera de ratón endógena.

En otro aspecto, en el presente documento se divulga un animal no humano, por ejemplo, una rata o un ratón, que comprende (a) una deleción o una desactivación funcional en un locus de cadena pesada de ratón de todos o básicamente todos los segmentos génicos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina endógenos, y la introducción de uno o más segmentos génicos V, D y J de cadena pesada humanos, en donde el uno o más segmentos génicos V, D y J de cadena pesada humanos están unidos operativamente a una región constante de cadena pesada de ratón (por ejemplo, región constante de cadena pesada de ratón endógena), en donde la región constante de cadena pesada de ratón comprende el gen de IgM de longitud completa; y un gen de IgG que comprende una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia de nucleótidos que codifica una región C^h1 en un gen de IgG seleccionado entre el grupo que consiste en uno de IgG1, IgG2a, IgG2c, IgG2b y una combinación de los mismos, en donde el ratón expresa un receptor de los linfocitos B que comprende una IgM con una región C^h1, en donde la IgM comprende una cadena pesada asociada a una cadena ligera cognada; y/o (b) una deleción o una desactivación funcional de todos o básicamente todos los segmentos génicos V y J de cadena ligera de inmunoglobulina endógenos y la introducción de una secuencia del gen variable Vk:Jk reorganizada sencilla.

En el presente documento también se divulga un ratón genéticamente modificado, que comprende (a) un reemplazo en un locus de cadena pesada de ratón de todos o básicamente todos los segmentos génicos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina endógenos por uno o más de los segmentos génicos V y J de cadena ligera humanos, en donde los uno o más segmentos génicos V y J de cadena ligera humanos están unidos operativamente a una región constante de cadena pesada de ratón, en donde la región constante de cadena pesada de ratón comprende el gen de IgM de longitud completa; y un gen de IgG que comprende una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia de nucleótidos que codifica una región C^h1 en un gen de IgG seleccionado entre el grupo que consiste en uno de IgG1, IgG2a, IgG2c, IgG2b, IgG3 y una combinación de los mismos, en donde el ratón expresa un receptor de los linfocitos B que comprende una IgM con una región C^h1, en donde la IgM comprende una cadena pesada asociada a una cadena ligera cognada; y (b) un reemplazo de todos o básicamente todos los segmentos génicos V y J de cadena ligera de inmunoglobulina endógenos por una secuencia del gen variable Vk:Jk sencilla. En algunos aspectos, la cadena ligera cognada se deriva de la secuencia de gen variable Vk:Jk reorganizada sencilla.

En un aspecto, se describe un método para producir una proteína de unión que carezca de un dominio C^h1, que comprende: (a) aislar de un animal no humano como se describe en el presente documento la proteína de unión, una célula que produce la proteína de unión, o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de la proteína de unión. En un aspecto, la etapa de aislamiento puede comprender una o más de las siguientes etapas: (a) inmunizar un animal no humano como se describe en el presente documento con un antígeno; (b) mantener el animal no humano bajo condiciones suficientes para que el animal no humano produzca una proteína de unión y/o (c) identificar una proteína de unión producida por el animal no humano que carece de un dominio C^h1 funcional y/o que carece de una región bisagra funcional. En algunos aspectos la proteína de unión aislada así es una proteína de unión a antígeno de dominio único. En algunos aspectos una proteína de unión a antígeno de dominio único es monomérica.

En un aspecto, se describe un método para producir una proteína de unión a antígeno, que comprende (a) inmunizar un animal no humano como se describe en el presente documento con un antígeno; (b) mantener el animal no humano bajo condiciones suficientes para producir una proteína de unión; (c) identificar una proteína de unión producida por el animal no humano, en donde la proteína de unión carece de un dominio C^h1 funcional o carece de un dominio C^h1 funcional y carece de una región bisagra; (d) identificar una secuencia de región variable que codifica un dominio variable en un polipéptido de inmunoglobulina que carece de un dominio C^h1, o carece de una región bisagra y un domino C^h1, en donde el dominio variable se une específicamente al antígeno; (e) expresar una proteína codificada por una secuencia idéntica o básicamente idéntica a la secuencia de región variable de (d) en un sistema de expresión adecuado en donde la secuencia de región variable de (d) está unida a una secuencia de ácido nucleico de una secuencia variable de cadena pesada que carece una región C^h1 o carece una región C^h1 y una bisagra; y/o (f) aislar la proteína expresada de (e). En algunos aspectos, las etapas de expresión de una proteína codificada por la secuencia de región variable y/o (f) aislamiento de la proteína expresada comprenden cultivar una célula, por ejemplo, una célula sometida a transfección con la secuencia de región variable, un hibridoma formado de una célula aislada de un animal divulgado en el presente documento y/o recoger el sobrenadante de un cultivo celular.

En un aspecto, se describe un método para producir una proteína de unión a antígeno, que comprende inmunizar un animal no humano como se describe en el presente documento con un antígeno, identificar una secuencia de ácido nucleico de región variable que codifica un dominio variable que se une específicamente al antígeno, y emplear la secuencia de ácido nucleico de región variable en un sistema de expresión adecuado, en donde la secuencia de ácido nucleico de región variable está unida a un gen constante de cadena pesada que carece de un Ch1 o carece de un Ch1 y una bisagra; en donde el sistema de expresión expresa una proteína de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno.

Por consiguiente, en el presente documento también se divulga dichas proteínas de unión, células y secuencias de ácido nucleico aisladas.

Otras realizaciones se describen y serán evidentes para un experto en la materia a partir de una revisión de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

La FIG. 1A ilustra la mutagénesis dirigida de un gen de IgG1 de ratón, los genes de IgG2b e IgG2a (no a escala) para obtener un locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón genéticamente modificado que expresa una IgG1 que carece de un dominio Ch1; se insertan segmentos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina humanos, representados por los triángulos vacíos, a un locus constante de ratón en donde el exón de CH1 de IgG1* e IgG2a/ 2b** están delecionados, los óvalos representan potenciadores.

La FIG. 1B ilustra un locus de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón (no a escala) que comprende una secuencia del gen de Vl/Jl humana reorganizada***.

La FIG. 1C ilustra una IgM expresada por un ratón que tiene los loci de Ig de las FIGs. 1B y 1C, en donde la IgM comprende un dominio Ch1 intacto. La FIG. 1C también ilustra que tras el cambio de clase, la IgG1 expresada por el ratón que tiene los loci de Ig de las FIGs. 1A y 1C es una proteína de unión a antígeno de cadena pesada de dominio único que carece de un dominio Ch1.

La FIG. 2 ilustra la estructura genómica (no a escala) de dos cadenas ligeras universales, una de las cuales comprende una región variable humana reorganizada que comprende Vk1-39Jk5 y la otra comprende una región variable humana reorganizada sencilla que comprende Vk3-20Jk1.

La FIG. 3 ilustra un locus de IgG1 de tipo silvestre en un ratón (IgG1, parte superior), que muestra el segmento génico de la región Jh fusionado a un segmento génico Ch1, seguido de una región bisagra, un segmento génico Ch2 y un segmento génico Ch3; un locus de IgG1 modificado con una construcción que suprime un dominio Ch1 (IgGlACHl; I); un locus de IgG1 modificado con una construcción que suprime un dominio Ch1 y una región bisagra (igGIACHl-Abisagra; II); un locus de región constante modificado con una construcción que suprime un dominio Ch1 de IgG1, IgG2b e IgG2a (IgG1ACHlAIgG2b/2a; III); un locus de región constante modificado con una construcción que suprime un dominio Ch1 de IgG1, una región bisagra, IgG2b e IgG2a (IgGIACHl&Abisagra AIgG2b/2a; IV); o un locus de la región constante modificado con una construcción que suprime un dominio Ch1 de IgG1, IgG2b, IgG2a, IgG3, IgD, IgA e IgE, y, opcionalmente, una región bisagra (IgG1ACHlAIgG2b/2a AIgG3 AIgD/A/E (opcionalmente Abisagra); V). Las ilustraciones esquemáticas de los loci no están representadas a escala. IgG2a/c designa un locus de IgG2a o IgG2c, ya que un ratón puede tener un alelo de IgG2a o un alelo de IgG2c dependiendo de su cepa.

La FIG. 4A ilustra la mutagénesis dirigida de una secuencia de cadena pesada de ratón (no a escala) para obtener un locus genéticamente modificado que contiene segmentos génicos variables de cadena pesada humanos (triángulos vacíos) y carece de un dominio Ch1 de IgG1 funcional así como carece de los loci de IgG2a e IgG2b (en algunas realizaciones denominados 1673).

La FIG. 4B ilustra la mutagénesis dirigida de un gen de IgG1 de ratón (todos los segmentos génicos variables son de ratón y están indicados por los triángulos rellenos) para obtener un locus genéticamente modificado (no a escala) que expresa una IgG1 que carece de un dominio Ch1 y una bisagra (en algunas realizaciones denominado 1576).

La FIG. 4C ilustra la mutagénesis dirigida de una región constante de cadena pesada (no a escala) para obtener un locus genéticamente modificado que carece de los segmentos génicos de IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2b, IgG2a, IgE e IgA (primera parte de clonación IgG1ACHlAIgG2b/IgG2a, AIgG3, AlgD/A/E continuada en la FIG. 4D). Los segmentos génicos variables humanos están indicados por triángulos vacíos.

La FIG. 4D ilustra la mutagénesis dirigida de la región constante de ratón de la FIG. 4C para obtener un locus genéticamente modificado (no a escala) que comprende los segmentos génicos variables de cadena pesada, una región del gen de IgM murina completa y funcional, y una región del gen de IgG1 que carece de un dominio Ch1 funcional y, opcionalmente, que carece de una región bisagra funcional (el ratón también carece de IgG2b/IgG2a, IgG3 e IgD/A/E; en algunas realizaciones denominado 6180). Los segmentos génicos variables humanos están indicados por triángulos vacíos.

La FIG. 5A muestra los títulos de IgG1 en suero totales comparativos entre diferentes ratones con IgG1 de dominio único, antes y después de la inmunización con p-galactosidasa (pgal): ratones homocigotos para mVHlgGIACHl&bisagra con cadena kappa de ratón (1576); ratones homocigotos para mVHlgGIACHl&bisagra con una cadena kappa que es una cadena ligera reorganizada sencilla Vk3-20Jk1 ULC (1576/1635); o ratón tipo silvestre (WT) con el mismo transfondo genético. HO es homocigoto para la modificación genética.

La FIG. 5B ilustra los títulos en suero de IgG1 específica a antígeno en ratones WT inmunizados en comparación con ratones homocigotos mVHlgGIACHl&bisagra (1576HO) o ratones homocigotos mVHlgGIACHl-bisagra x Vk3-20Jk1 ULC1 (1576HO 1635HO). Los ratones se inmunizaron con p-galactosidasa (pgal) como antígeno modelo, los títulos de IgG1 específica a antígeno se midieron por ELISA.

La FIG. 6proporciona una imagen de una transferencia Western, preparada en condiciones no reductoras y visualizada con anti-IgG de ratón, de sueros de ratón de dos ratones homocigotos hVHlgG1ACHl&bisagraAIgG2b/2a x Vk1-39Jk5 ULC (1859HO 1633HO), tres ratones homocigotos hVHlgG1ACHlAIgG2b/2a x Vk3-20Jk1 ULC (1673HO 1635 HO) y tres ratones control VELOCIMMUNE® (VI3 IgG1) que tienen regiones variables humanas (Vh y Vk) con regiones constantes de ratón de proteínas de unión a antígeno de dominio único diméricas (37-37 homodímero) o proteínas de unión de dominio único ACh1 monoméricas (deleción bisagra CH1 cadena sencilla).

La FIG. 7 muestra los títulos de IgG1 (eje y) en el plasma de animales a diferentes momentos (eje x) después de la inmunización intraperitoneal con Antígeno X, una proteína de la superficie celular, de ratones homocigotos hVHlgG1ACH1AIgG2b/2a x V k1-39Jk5 (1673X1633) o ratones homocigotos hVHlgG1ACH1AlgG2b/2a x Vk3-20Jk1 (1673X1635).

La FIG. 8proporciona una imagen de una transferencia Western, preparada en condiciones no reductoras y visualizada con anti-IgG de ratón, de sueros de ratón de tres ratones homocigotos hVHlgG1ACH1AlgG2b/2a AIgG3 AlgD/A/E x Vk1-39Jk5 ULC (6180 HO 1634 HO), dos ratones homocigotos hVHlgG1ACH1AlgG2b/2a AIgG3 AlgD/A/E (6180 HO) y tres ratones control VI3 que tienen regiones variables humanas (Vh y Vk) con regiones constantes de ratón de proteínas de unión a antígeno de dominio único diméricas (37-37 homodímero) o proteínas de unión de dominio único ACH1 monoméricas (deleción CH1 cadena sencilla).

La FIG. 9 muestra la concentración de IgM e IgG en estado estacionario en el plasma de ratones hVHlgG1ACH1AIgG2a/2bAIgG3AIgD/A/E x Vk1-39Jk5 (6180 HO x1634 HO) y hVHlgG1ACH1AIgG2a/2bAIgG3AIgD/A/E (6180 HO) y animales control VI3.

La FIG. 10 muestra diagramas de contorno de esplenocitos separados ("gated")en singletes teñidos para CD19 y CD3 de un ratón VI3 control homocigoto representativo y hVHlgG1ACH1AIgG2a/2bAIgG3AIgD/A/E (6180 HO) x Vk1-39Jk5 (6180 HO 1634 HO) (A). También se muestran diagramas de contorno de esplenocitos separados en linfocitos B CD19+ teñidos para la inmunoglobulina D (IgD) y la inmunoglobulina M (IgM) de un ratón VI3 control representativo y un ratón homocigoto representativo hVHlgG1ACH1AIgG2a/2bAIgG3AIgD/A/E x Vk1-39Jk5 (6180 HO x1634 HO) (C). Notablemente, los linfocitos B son IgD- ya que se sometió a deleción el dominio constante de IgD. Por lo tanto, el término "maduro" en este diagrama es meramente una indicación de la ausencia de IgD y no otras inmunoglobulinas no IgM. También se proporciona una gráfica que muestra un número total de linfocitos B CD19+ (eje y; células/bazo X107) de tres ratones representativos de cada grupo (B). El animal para el que se incluyen los diagramas de contorno está rodeado por un círculo.

La FIG. 11 muestra diagramas de contorno de (A) linfocitos B separados en CD19+ aislados del bazo teñido para CD93 y B220, (B) linfocitos B separados en inmaduros o maduros teñidos para IgM y CD23 o (C) linfocitos B separados en inmaduros o maduros teñidos para CD21/35 e IgM de un ratón VI3 control representativo y un ratón homocigoto representativo hVHIgG1ACH1AIgG2a/2bAIgG3AIgD/A/E x Vk1-39Jk5 (6180 HO x1634 HO).

La FIG. 12 muestra diagramas de contorno de médula ósea aislada de los fémures de un ratón VI3 control representativo y un ratón homocigoto representativo hVHIgG1ACH1&IgG2a/2bAIgG3AIgD/A/E x Vk1-39Jk5 (6180 HO x1634 HO), teñida con CD19 y CD3. También se muestra en número total de células o linfocitos B CD19+ por fémur (eje y; Células/fémur x 107) de tres ratones representativos de cada grupo. El animal para el que se incluyen los diagramas de contorno está rodeado por un círculo.

La FIG. 13 muestra diagramas de contorno de médula ósea aislada de fémures de un ratón VI3 control representativo y un ratón homocigoto representativo hVHIgG1ACH1AIgG2a/2bAIgG3AIgD/A/E x Vk1-39Jk5 (6180 h O x1634 HO) teñida con IgM y B220. También se muestra el número total de linfocitos B maduros (IgM+ B220hi) e inmaduros (IgM+ B220int) por fémur (eje y; Células/fémur x 107) de tres ratones representativos de cada grupo. El animal para el que se incluyen los diagramas de contorno está rodeado por un círculo.

La FIG. 14A ilustra un esquema del locus de cadena pesada de ratón (no a escala). El locus de cadena pesada de ratón es de aproximadamente 3 Mb de longitud y contiene aproximadamente 200 segmentos génicos variables de cadena pesada (Vh), 13 segmentos génicos de diversidad de cadena pesada (Dh) y 4 segmentos génicos de unión de cadena pesada (Jh) así como potenciadores (Enh) y regiones constantes de cadena pesada (CH).

La FIG. 14Bilustra un esquema del locus de cadena ligera k humano (no a escala). El locus de cadena ligera k humano se duplica en cóntigos distales y proximales de polaridad opuesta que abarcan aproximadamente 440 kb y 600 kb, respectivamente. Entre los dos cóntigos hay aproximadamente 800 kb de ADN que se cree que está libre de segmentos génicos Vk. El locus de cadena ligera k humana contiene aproximadamente 76 segmentos génicos Vk, 5 segmentos génicos Jk, un potenciador intrónico (Enh) y una región constante sencilla (Ck).

La FIG. 15 muestra una estrategia de mutagénesis dirigida (no a escala) para la inserción progresiva de 40 segmentos génicos Vk humanos y 5 Jk humanos dentro de un locus de cadena pesada de ratón en el que se han sometido a deleción los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada endógenos. Se muestran los casetes de selección de higromicina (HYG) y neomicina (NEO) con sitios de reconocimiento de recombinasa (FRT). También se muestra una estrategia de mutagénesis dirigida (no a escala) para la inserción de los genes de Adam6a, Adam6b y IGCR1. Los segmentos génicos variables humanos están indicados por triángulos vacíos.

La FIG. 16 muestra el locus de cadena pesada de ratón modificado de la FIG. 15 (hJK, 40hVK, Adam6; parte superior); una estrategia de mutagénesis dirigida que da como resultado la deleción y/o desactivación del dominio Ch1 de la secuencia del gen de IgG1, la secuencia del gen de IgG2b, y la secuencia del gen de IgG2a del locus de cadena pesada de ratón modificado de la FIG. 15 (hJK, 40hVK, Adam6, A Ch1, AIgG2b, AIgG2a; en el medio), y una estrategia de mutagénesis dirigida que da como resultado la deleción del casete de selección de un locus de cadena pesada de ratón modificado que comprende segmentos génicos Jk humanos no reorganizados y 40 segmentos génicos Vk humanos, en donde el locus de cadena pesada de ratón modificado carece de un dominio Ch1 funcional en el gen de IgG1 y también carece de los genes de IgG2b e IgG2a funcionales (hJK, 40hVK, Adam6, ACh1, AIgG2b, AIgG2a casete de selección delecionado; también denominado 6082 en la parte inferior). Los segmentos génicos variables humanos están indicados por triángulos vacíos.

La FIG. 17A muestra la expresión relativa de ARNm (normalizada al ARNm de HPRT1; eje y) por linfocitos B aislados del bazo y la médula ósea de tres grupos diferentes de animales (eje x): ratones tipo silvestre (WT), ratones homocigotos para el locus de cadena pesada modificado de la FIG. 16 (hJK, 40hVK, Adam6, A Ch1 AIgG2b AIgG2a casete delecionado; KoH Ch1 del), y ratones homocigotos para un locus de cadena pesada de ratón modificado que expresa segmentos V, D y J de cadena pesada humanos, que carece de un dominio Ch1 funcional en los genes de IgG1, y también carece de genes de IgG2b e IgG2a funcionales y comprende un locus de cadena ligera reorganizada sencilla (Ch1 del x ULC). Las sondas se diseñaron para detectar reorganización productiva, y consistían en una sonda que detectaba la recombinación entre un segmento Jk humano y bisagra de IgG1 murina (sonda hJk/mIgG1 bisagra; paneles de la izquierda) o una sonda que detectaba la recombinación entre un segmento Jh humano y bisagra de IgG1 murina (sonda hJH/mIgG1 bisagra; paneles de la derecha). ND: no detectado (Ct > 35). n= 2 para WT, 2 para KoH Ch1 del, y 3 para Ch1 del x ULC.

La FIG. 17B muestra la expresión relativa de ARNm (normalizada al ARNm de mKappaC; eje y) por linfocitos B aislados del bazo y la médula ósea de tres grupos diferentes de animales (eje x): ratones tipo silvestre (WT), ratones homocigotos para el locus de cadena pesada modificado de la FIG. 16 (hJK, 40hVK, Adam6, A Ch1 AIgG2b AIgG2a casete delecionado; KoH Ch1 del), y ratones homocigotos para un locus de cadena pesada de ratón modificado que expresa segmentos V, D y J de cadena pesada humanos, que carece de un dominio Ch1 funcional en la secuencia del gen de IgG1, y también carece de secuencias de los genes de IgG2b e IgG2a funcionales y comprende un locus de cadena ligera reorganizada sencilla (Ch1 del x ULC). Las sondas se diseñaron para detectar reorganización productiva, y consistían en una sonda que detectaba la recombinación entre un segmento JK humano y bisagra de IgG1 murina (sonda (hJ)JmIgG1 bisagra; paneles de la izquierda) o una sonda que detectaba el segmento Jh humano y la bisagra de IgG1 murina (sonda hJH/mIgG1 bisagra; paneles de la derecha). ND: no detectado (Ct > 35). n= 2 para WT, 2 para KoH Ch1 del, y 3 para Ch1 del x ULC.

La FIG. 18proporciona una imagen de una transferencia Western, preparada en condiciones no reductoras y visualizada con anti-IgG de ratón, de sueros de ratón de tres ratones homocigotos hVKlgG1ACHlAIgG2a/2b x Vk3-20Jk1 ULC (6082HO 1635 HO), tres ratones VELOCIMMUNE® (VI3 IgG1) que tienen la región variable humana (Vh y Vk) con regiones constantes de ratón (WT), y dos ratones hVHlgG1ACHlAIgG2a/2bAIgG3AIgD/A/E (6180 HO) que demuestran la presencia o ausencia de proteínas de unión a antígeno de dominio único diméricas (37-37 homodímero) o proteínas de unión a dominio único ACH1 monoméricas (deleción CH1 cadena sencilla).

Descripción detallada

La invención no se limita a los métodos particulares, y las condiciones experimentales descritas, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. La terminología usada en el presente documento es con el fin de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitante, puesto que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones.

A menos que se definan lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales particulares.

La presente divulgación se refiere a animales no humanos genéticamente modificados (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, hámsteres, etc.) que comprenden en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, secuencia(s) de nucleótidos que codifica(n) proteínas de unión a antígeno de dominio único, incluidas las proteínas de unión a antígeno de dominio único Vh y las proteínas de unión a antígeno de dominio único Vl, y/o una cadena ligera reorganizada sencilla; métodos para producir los mismos; así como métodos para utilizar los mismos. A menos que se definan lo contrario, todos los términos y expresiones utilizados en el presente documento incluyen los significados que los términos y las expresiones tienen en la técnica, a menos que se indique claramente lo contrario o sea claramente evidente a partir del contexto en el que se utiliza un término o expresión.

El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina típicas que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. El término también incluye una inmunoglobulina que es reactiva a un antígeno o fragmento del mismo. Los anticuerpos adecuados incluyen, pero sin limitación, anticuerpos humanos, anticuerpos primatizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos policlonales, anticuerpos poliespecíficos, anticuerpos no específicos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanizados, anticuerpos sintéticos, anticuerpos recombinantes, anticuerpos híbridos, anticuerpos mutados, anticuerpos conjugados injertados (es decir, anticuerpos conjugados o fusionados a otras proteínas, radioetiquetas, citoxinas), y anticuerpos generados in vitro. Un experto en la materia reconocerá fácilmente isotipos comunes de anticuerpo, por ejemplo, anticuerpos que tienen una región constante de cadena pesada del grupo que consiste en IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, o cualquier subclase de los mismos (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4).

La expresión "cadena pesada", o "inmunoglobulina de cadena pesada" incluye una secuencia de cadena pesada de la inmunoglobulina, incluida la secuencia de región constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, procedente de cualquier organismo. Los dominios variables de cadena pesada incluyen tres CDR de cadena pesada y cuatro regiones FR, a menos que se especifique lo contrario. Los fragmentos de cadenas pesadas incluyen CDR, CDR y FR, y combinaciones de las mismas. Una cadena pesada típica tiene, después del dominio variable (desde el extremo N al extremo C), un dominio C^h1, una bisagra, un dominio C^h2, un dominio C^h3 y un dominio C^h4 (en el contexto de IgM o IgE). Un fragmento funcional de una cadena pesada incluye un fragmento que es capaz de reconocer específicamente un epítopo (por ejemplo, reconocer el epítopo con una K^den el intervalo micromolar, nanomolar o picomolar), que es capaz de expresarse y secretarse a partir de una célula, y que comprende al menos una CDR. Un dominio variable de cadena pesada está codificado por una secuencia del gen de la región variable, que comprende generalmente segmentos V^h, D^h, y J^hderivados de un repertorio de segmentos V^h, D^h, y J^hpresentes en la línea germinal. Las secuencias, las localizaciones y la nomenclatura para los segmentos V, D, y J de cadena pesada para diferentes organismos pueden verse en la página de Internet para el "International Immunogenetics Information System" (IMGT) en www.imgt.org.

La expresión "cadena ligera" incluye una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de cualquier organismo, y a menos que se especifique lo contrario incluye las cadenas ligeras kappa y lambda y VpreB, así como cadenas ligeras subrogadas. Los dominios variables de cadena ligera incluyen normalmente tres CDR de cadena ligera y cuatro regiones marco (FR), a menos que se especifique lo contrario. En general, una cadena ligera de longitud completa incluye, desde el extremo amino al extremo carboxilo, un dominio variable que incluye FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, y una región constante de cadena ligera. Un dominio variable de cadena ligera está codificado por una secuencia del gen de la región variable de cadena ligera, que comprende generalmente segmentos génicos V^ly J^l, derivados de un repertorio de segmentos génicos V^ly J^lpresentes en la línea germinal. Las secuencias, las localizaciones y la nomenclatura para los segmentos V y J de cadena ligera para diferentes organismos pueden verse en la página de Internet para el "International Immunogenetics Information System" (IMGT) en www.imgt.org. Las cadenas ligeras incluyen aquellas, por ejemplo, que no se unen selectivamente a un primer o un segundo epítopo unido selectivamente por la proteína de unión a epítopo en la que aparecen. Las cadenas ligeras incluyen también aquellas que se unen y reconocen, o ayudan a la cadena pesada con la unión y el reconocimiento, uno o más epítopos unidos selectivamente por la proteína de unión a epítopo en la que aparecen. La expresión cadena ligera incluye una "cadena ligera común", también denominada "cadena ligera universal" (ULC).

Las cadenas ligeras comunes o universales (ULC) incluyen aquellas derivadas de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizada sencilla unida operativamente a una región constante de cadena ligera, en donde la expresión del locus de cadena ligera de inmunoglobulina produce únicamente una cadena ligera derivada de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina unida operativamente a la región constante de cadena ligera independientemente de la inclusión de otras secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, otros segmentos génicos de cadena ligera, en el locus de cadena ligera de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras universales incluyen un gen Vk1-39Jk humano (por ejemplo, gen Vk1-39Jk5) o un gen Vk3-20Jk (por ejemplo, Vk3-20Jk1), e incluyen versiones somáticamente mutadas (por ejemplo, madurada para afinidad) de los mismos.

La expresión "segmento génico", o "segmento" incluye referencia a un segmento génico de inmunoglobulina V (ligera o pesada) o D o J (ligera o pesada), que incluye secuencias no reorganizadas en loci de inmunoglobulina (en, por ejemplo, seres humanos y ratones) que pueden participar en una reorganización (mediada por, por ejemplo, recombinasas endógenas) para formar una secuencia V/J (ligera) o V/D/J (pesada) reorganizada. A menos que se indique lo contrario, los segmentos V, D y J comprenden secuencias de señal de recombinación (RSS) que permiten la recombinación de V/J o la recombinación de V/D/J de acuerdo con la norma 12/23. A menos que se indique lo contrario, los segmentos además comprenden secuencias con las cuales se asocian en la naturaleza o sus equivalentes funcionales (por ejemplo, segmentos V, promotor(es) y líder(es)).

El término "no reorganizada", con referencia a una secuencia de ácido nucleico, incluye secuencias de ácido nucleico que existen en la línea germinal de una célula animal, preferentemente una célula derivada de un animal que no se ha modificado genéticamente, por ejemplo, comprende un genoma tipo silvestre. En general, en la configuración de la línea germinal nativa, la región variable de cadena pesada comprende segmentos génicos V^hno reorganizados, segmentos génicos D^hno reorganizados y segmentos génicos J^hno reorganizados mientras que la región variable de cadena ligera comprende segmentos génicos V^lno reorganizados y segmentos génicos J^lno reorganizados. Durante el proceso de maduración de los linfocitos B, estos segmentos génicos se reorganizan para producir un gen de la región variable reorganizado.

El término "línea germinal" en referencia a una secuencia de ácido nucleico de la inmunoglobulina incluye una secuencia de ácido nucleico que se puede pasar a la progenie.

La expresión "región determinante de complementariedad", o el término "CDR", incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de los genes de inmunoglobulina de un organismo que normalmente (es decir, en un animal de tipo silvestre) aparece entre dos regiones marco en una región variable de una cadena ligera o una cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo o un receptor de linfocitos T). Una CDR puede estar codificada por, por ejemplo, una secuencia de la línea germinal o una secuencia reorganizada o no reorganizada, y, por ejemplo, por un linfocito B o un linfocito T virgen o maduro. Una CDR puede estar mutada somáticamente (por ejemplo, variar a partir de una secuencia codificada en una línea germinal de mamífero), humanizada, y/ modificada con sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. En algunas circunstancias (por ejemplo, para una CDR3), las CDR pueden estar codificadas por dos o más secuencias (por ejemplo, secuencias de la línea germinal) que no son contiguas (por ejemplo, en una secuencia del ácido nucleico no reorganizada) pero son contiguas en una secuencia del ácido nucleico de un linfocito B, por ejemplo, como resultado del corte y empalme o de la conexión de las secuencias (por ejemplo, recombinación V-D-J para formar una CDR3 de cadena pesada).

La expresión "somáticamente mutada" incluye referencia a una secuencia de ácido nucleico de un linfocito B que ha experimentado cambio de clase, en donde la secuencia de ácido nucleico de una región variable de inmunoglobulina (por ejemplo, secuencia de nucleótidos que codifica un domino variable de cadena pesada o que incluye una secuencia de FR o CDR de cadena pesada) en el linfocito B cambiado de clase no es idéntica a la secuencia de ácido nucleico en el linfocito B antes del cambio de clase, tal como, por ejemplo, una diferencia en una secuencia de ácido nucleico de CDR o marco entre un linfocito B que no ha experimentado cambio de clase y un linfocito B que ha experimentado cambio de clase. "Somáticamente mutadas" incluye la referencia a secuencias de ácido nucleico de linfocitos B madurados para afinidad que no son idénticas a las correspondientes secuencias de la región variable de inmunoglobulina que no son maduras para afinidad (es decir, secuencias en el genoma de las células de la línea germinal). La expresión "somáticamente mutada" también incluye la referencia a una secuencia de ácido nucleico de la región variable de inmunoglobulina de un linfocito B después de la exposición del linfocito B a un epítopo de interés, en donde la secuencia de ácido nucleico difiere de la correspondiente secuencia de ácido nucleico antes de la exposición del linfocito B al epítopo de interés. La expresión "somáticamente mutadas" se refiere a secuencias de proteínas de unión que se han generado en un animal, por ejemplo, un ratón que tiene secuencias de ácido nucleico de la región variable de inmunoglobulina humana, en respuesta a una exposición a inmunógeno, y que resulta de los procesos de selección inherentemente operativos en dicho animal.

El término "cognado", cuando se usa en el sentido de "cognado con", por ejemplo, un primer dominio V^lque está "cognado con" un segundo domino V^l, se pretende incluir la referencia a la relación entre dos dominios V^lde una misma proteína de unión producida por un ratón de acuerdo con la invención. Por ejemplo, un ratón que está genéticamente modificado de acuerdo con un aspecto de la divulgación, por ejemplo, un ratón que tiene un locus de cadena pesada en el que las regiones V^h, D^hy J^hse reemplazan por regiones V^ly J^l, produce proteínas de unión tipo anticuerpo que tienen dos cadenas polipeptídicas idénticas hechas de la misma región C^hde ratón (por ejemplo, un isotipo IgM fusionado con un primer dominio V^lhumano, y dos cadenas polipeptídicas idénticas hechas de la misma región C^lde ratón fusionada a un segundo dominio V^lhumano). Durante la selección clonal en el ratón, se seleccionaron el primer y el segundo dominio V^lhumano mediante el proceso de selección clonal para aparecer juntos en el contexto de una única proteína de unión tipo anticuerpo. Por tanto, los dominio V^lprimero y segundo que aparecen juntos, como resultado del proceso de selección clonal, en una única molécula tipo anticuerpo se refiere que son "cognados". Por el contrario, un dominio V^lque aparece en una primera molécula tipo anticuerpo y un dominio V^lque aparece en una segunda molécula tipo anticuerpo no son cognados, a menos que la primera y la segunda molécula tipo anticuerpo tengan cadenas pesadas idénticas (es decir, a menos que el dominio V^lfusionado a la primera región de cadena pesada humana y el dominio V^lfusionado a la segunda región de cadena pesada humana sean idénticos).

Pronto en el desarrollo de anticuerpo, las cadenas pesadas del anticuerpo experimentan un proceso de selección en donde la naturaleza elige, a través de una diversidad de esquemas de selección, cadenas pesadas adecuadas para experimentar más selección para formar finalmente anticuerpos funcionales y madurados para afinidad. La diversidad que surge de la reorganización del gen variable de cadena pesada y ligera se da en la médula ósea y precede al cambio de clase. Las cadenas pesadas del anticuerpo expresadas a partir de los segmentos génicos de cadena pesada recombinados en linfocitos B progenitores (o, pro-linfocitos B) normalmente se emparejan con una cadena ligera subrogada para la presentación sobre la superficie de los pro-linfocitos B en un isotipo IgM para formar una estructura (que incluye otros correceptores) denominada pre-receptor de linfocito B o pre-BCR. Una vez que el pre-BCR está presente sobre la superficie celular, se cree que el pre-BCR señala su formación apropiada del complejo a la célula, enseñando eficazmente a la célula que la cadena pesada ha pasado esta etapa de selección temprana. Por tanto, la célula está informada de que la cadena pesada puede experimentar selección adicional. Si la cadena pesada contiene un defecto que es perjudicial para la formación de un pre-BCR cuando se presenta en el contexto de una IgM y una cadena ligera subrogada, la célula experimentará apoptosis. Si la célula experimenta apoptosis, se perderá la utilidad, o la contribución a la diversidad, de la región variable de cadena pesada de la cadena pesada. Por tanto, una etapa muy temprana en la selección de anticuerpo requiere presentación de la cadena pesada junto con una cadena ligera subrogada en el contexto de un isotipo IgM. El desarrollo normal de los linfocitos B productores de anticuerpo generalmente requiere la presencia de un dominio C^h1. Todos los isotipos de cadena pesada, incluido IgM, comprenden un dominio C^h1. Se cree que tanto la cadena ligera subrogada como una cadena ligera cognada interactúan con una cadena pesada dada por el dominio C^h1 de la cadena pesada en el contexto de una IgM.

Después de la salida de los linfocitos B de la médula ósea, el acoplamiento con el antígeno (que requiere una interacción de afinidad baja entre el anticuerpo reorganizado expresado como una IgM de superficie celular) estimula la inducción concertada de hipermutación somática y cambio de clase. Después del cambio de clase, el reconocimiento diferencial de antígeno por el receptor de linfocito B de superficie permite que los anticuerpos de afinidad aumentada se seleccionen de un grupo de derivados hipermutados de la IgM original.

El término "anticuerpo de solo cadena pesada", "proteína de unión a antígeno de solo cadena pesada", "proteína de unión a antígeno de dominio único", "proteína de unión de dominio único" o similares se refiere a una molécula de inmunoglobulina monomérica o homodimérica que comprende una cadena tipo inmunoglobulina que comprende un dominio variable unido operativamente a una región constante de cadena pesada, que es incapaz de asociarse a una cadena ligera debido a que la región constante de cadena pesada carece de un dominio C^h1 funcional. Por consiguiente, el término "anticuerpo de solo cadena pesada", "proteína de unión a antígeno de solo cadena pesada", "proteína de unión a antígeno de dominio único", "proteína de unión de dominio único" o similares abarca (i) una proteína de unión a antígeno de dominio único monomérica que comprende una de la cadenas tipo inmunoglobulina que comprende un dominio variable unido operativamente a una región constante de cadena pesada que carece de un dominio C^h1 funcional, o (ii) una proteína de unión a antígeno de dominio único homodimérica que comprende dos cadenas tipo inmunoglobulina, comprendiendo cada una de las cuales un dominio variable unido operativamente a una región constante de cadena pesada que carece de un dominio C^h1 funcional. En diversos aspectos, una proteína de unión a antígeno de dominio único homodimérica comprende dos cadenas tipo inmunoglobulina idénticas, comprendiendo cada una de las cuales un dominio variable idéntico unido operativamente a una región constante de cadena pesada idéntica que carece de un dominio C^h1 funcional. Adicionalmente, cada cadena tipo inmunoglobulina de una proteína de unión a antígeno de dominio único comprende un dominio variable, el cual puede ser derivado de segmentos génicos de la región variable de cadena pesada (por ejemplo, V^h, D^h, J^h), segmentos génicos de cadena ligera (por ejemplo, V^l, J^l), o una combinación de los mismos, unidos a una secuencia del gen de la región constante de cadena pesada (C^h) que comprende una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia codificante de C^h1 (y, opcionalmente, una región bisagra) de un gen de la región constante de cadena pesada de, por ejemplo, IgG, IgA, IgE, IgD o una combinación de los mismos. Una proteína de unión a antígeno de dominio único que comprende un dominio variable derivado de segmentos génicos de cadena pesada puede denominarse "anticuerpo de dominio único V^h" o "proteína de unión a antígeno de dominio único V^h". Una proteína de unión a antígeno de dominio único que comprende un dominio variable derivado de segmentos génicos de cadena ligera puede denominarse "proteína de unión a antígeno de dominio único V^l".

Como se ha divulgado anteriormente, la producción de proteínas de unión a antígeno de dominio único por animales no humanos modificados por ingeniería genética da como resultado la expresión relativamente baja de proteínas de unión a antígeno de dominio único específicas a antígeno en respuesta a antígeno en comparación con los anticuerpos tradicionales. La técnica sugiere que un título alto es posible únicamente cuando hay de poca a nada de expresión de una cadena ligera reorganizada. Específicamente, se ha afirmado que los animales que no expresan una cadena ligera reorganizada son capaces de producir mayores niveles de proteínas de unión a antígeno de dominio único que se unen específicamente al antígeno. Janssens et al. (2006) PNAS 103:15.130-15.135; Zou et al. (2004) J. Exp. Med.

204:3271-32. Al contrario que la técnica, los datos proporcionados en el presente documento muestran que animales que expresan una cadena ligera reorganizada sencilla modificada por ingeniería genética generarán títulos altos de proteínas de unión a antígeno de dominio único específicas a antígeno después de la exposición. En el presente documento también se describe la capacidad de los segmentos génicos de la región variable de cadena ligera para reorganizarse y recombinarse con una región constante de cadena pesada que comprende una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia de C^h1 para codificar una proteína de unión a antígeno de dominio único V^lcapaz de unirse específicamente al antígeno. Es posible que el dominio variable de cadena ligera de dicha proteína de unión a antígeno de dominio único V^lcompense la falta de una cadena ligera cognada mediante la adición de, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 o más adiciones de N en una secuencia del gen de la región variable de cadena ligera, que normalmente no se ve en las secuencias del gen de la región variable de cadena ligera reorganizadas a partir de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno o no modificado.

Por consiguiente, en un aspecto, se divulga un animal no humano, en donde el animal comprende una proteína de unión a antígeno de dominio único y una cadena ligera reorganizada sencilla modificada por ingeniería genética, por ejemplo, una cadena ligera común, en donde al menos una cadena pesada de la proteína de unión a antígeno de dominio único carece de un dominio C^h1 funcional. En otro aspecto, se divulga un animal no humano, en donde el animal comprende proteína de unión a antígeno de dominio único V^lque comprende una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena pesada que carece de un dominio C^h1 funcional. En otro aspecto, se divulga un animal no humano, en donde el animal comprende una proteína de unión a antígeno de dominio único V^lque comprende una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena pesada que carece de un dominio C^h1 funcional y una cadena ligera reorganizada sencilla modificada por ingeniería genética, por ejemplo, una cadena ligera común. También se describen métodos para obtener el animal no humano genéticamente modificado, proteínas (por ejemplo, proteínas de unión a antígeno de dominio único) células aisladas de los animales no humanos genéticamente modificados, y métodos para aislar las proteínas y las células de los animales genéticamente modificados.

La expresión anticuerpo de "alta afinidad" se refiere a un anticuerpo que tiene una K^dcon respecto a su epítopo diana aproximadamente de 10-9 M o inferior (por ejemplo, aproximadamente 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, o aproximadamente 1 x 10-12 M). En un aspecto, K^dse mide por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™; en otro aspecto, K^dse mide por ELISA.

El término "célula" incluye cualquier célula que sea adecuada para expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante. Las células incluyen las de procariotas y eucariotas (unicelulares o pluricelulares), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobacterias, células fúngicas, células de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetales, células de insectos (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insectos infectadas por baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), células animales no humanas, células humanas, o fusiones de células tal como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunos aspectos, la célula es una célula humana, de mono, de simio, de hámster, de rata o de ratón. En algunos aspectos, la célula es eucariota y se selecciona entre las siguientes células: CHO (por ejemplo, CHO K1, CHO DXB-11, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula de la retina, Vero, CV1, de riñón (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral y una línea celular derivada de una célula anteriormente mencionada. En algunos aspectos, la célula comprende uno o más genes víricos, por ejemplo, una célula de la retina que expresa un gen vírico (por ejemplo, una célula PER.C6™).

El término "conservativa", cuando se usa para describir una sustitución conservativa de aminoácidos, incluye la sustitución de un resto de aminoácido por otro resto de aminoácido que tiene un grupo R de la cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservativa de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad de una región variable de unirse específicamente a un epítopo diana con una afinidad deseada. Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen cadenas laterales alifáticas tales como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; cadenas laterales de hidroxilo alifáticas tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen amida tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromáticas tales como fenilalanina, tirosina y triptófano; cadenas laterales básicas tales como lisina, arginina e histidina; cadenas laterales ácidas tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y, cadenas laterales que contienen azufre tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/arginina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato, y asparagina/glutamina. En algunos aspectos, una sustitución de aminoácidos conservativa puede ser una sustitución de cualquier resto nativo en una proteína con alanina, como se usa en, por ejemplo, mutagénesis por barrido de alanina. En algunos aspectos, se realiza una sustitución conservativa que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica de PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) "Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database", Science 256:1443-45. En algunos aspectos, la sustitución es una sustitución moderadamente conservativa en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica de PAM250.

En algunos aspectos, las posiciones del resto en una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina difieren en una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunos aspectos, las posiciones del resto en una cadena ligera de inmunoglobulina o fragmento funcional de la misma (por ejemplo, un fragmento que permite la expresión y secreción de, por ejemplo, un linfocito B) no son idénticas a una cadena ligera cuya secuencia de aminoácidos se publica en el presente documento, pero difiere en una o más sustituciones de aminoácidos conservativas.

La expresión "proteína de unión a epítopo" o "proteína de unión a antígeno" incluye una proteína que tiene al menos una CDR y que es capaz de reconocer selectivamente un epítopo, por ejemplo, es capaz de unirse a un epítopo con una K^dque es de aproximadamente un micromolar o menos (por ejemplo, una K^dque es de aproximadamente 1 x 10 6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, o aproximadamente 1 x 10-12 M). Las proteínas de unión a epítopo terapéuticas (por ejemplo, proteínas de unión terapéuticas) frecuentemente requieren una K^dque está en el intervalo de nanomolar o picomolar.

La expresión " fragmento funcional" incluye fragmentos de proteínas de unión a epítopo que pueden expresarse, secretarse, y unirse específicamente a un epítopo con una K^den el intervalo micromolar, nanomolar, o picomolar. El reconocimiento específico incluye tener una K^dque está al menos en el intervalo micromolar, el intervalo nanomolar, o el intervalo picomolar.

El término "identidad" en relación con una comparación de secuencias incluye identidad determinada mediante cualquiera de numerosos algoritmos diferentes conocidos en la técnica que se pueden utilizar para medir la identidad de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos. En algunos aspectos, las identidades como se describen en el presente documento se determinan utilizando una alineación ClustalW v. 1.83 (lenta) empleando una penalización por hueco abierto de 10,0, una penalización por extensión de hueco de 0,1, y utilizando una matriz de similitud de Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). El término "identidad" incluye la relación total entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. En algunos aspectos, las moléculas poliméricas se consideran que son "básicamente idénticas" entre sí si sus secuencias son al menos 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 99 % idénticas. Tal como entenderán los expertos en la materia, hay disponibles una diversidad de algoritmos que permiten la comparación de secuencias con el fin de determinar su grado de homología, que incluyen permitir huecos de la longitud diseñada en una secuencia en relación a otra cuando se considera que los restos "corresponden" uno con otro en diferentes secuencias. El cálculo del porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, puede realizarse alineando las dos secuencias con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de las secuencias de ácido nucleico primera y segunda para una alineación óptima y pueden descartarse secuencias no correspondientes con fines de comparación). En determinados aspectos, la longitud de una secuencia alineada con fines de comparación es al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o básicamente el 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los nucleótidos en las posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. Algoritmos representativos y programas informáticos útiles en la determinación del porcentaje de identidad entre las dos secuencias de nucleótidos incluyen, por ejemplo, el algoritmo de Meyers y Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) utilizando una tabla de restos de peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse, como alternativa, por ejemplo, utilizando el programa GAP en el paquete informático GCG utilizando una matriz NWSgapdna.CMP.

La expresión "intervalo micromolar" se pretende que signifique 1-999 micromolar; la expresión "intervalo nanomolar" se pretende que signifique 1-999 nanomolar; la expresión "intervalo picomolar" se pretende que signifique 1-999 picomolar.

La expresión "unido operativamente" se refiere a una relación en la que los componentes unidos operativamente funcionan en su manera prevista. En un ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína puede estar unida operativamente a secuencias reguladoras (por ejemplo, un promotor, potenciador, secuencia silenciadora, etc.) para conservar la apropiada regulación de la transcripción. En un ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de una región variable de inmunoglobulina (o segmentos V(D)J) puede unirse operativamente a una secuencia de ácido nucleico de una región constante de inmunoglobulina para permitir la recombinación apropiada entre las secuencias dentro de una secuencia del gen de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina.

El término "reemplazo", en referencia al reemplazo de genes se refiere a colocar material genético exógeno en un locus genético endógeno, reemplazando así la totalidad o una porción del gen endógeno con una secuencia del ácido nucleico ortóloga u homóloga.

El término "animales no humanos" se pretende que incluya cualquier vertebrado tal como ciclostomos, pez óseo, pez cartilaginoso tal como tiburones o rayas, anfibios, reptiles, mamíferos y aves. Los animales no humanos adecuados incluyen mamíferos. Mamíferos adecuados incluyen primates no humanos, cabras, ovejas, cerdos, perros, vacas y roedores.

En algunos aspectos de la divulgación, el animal no humano incluye un pequeño mamífero, por ejemplo, de la superfamilia Dipodoidea o Muroidea. En un aspecto, el animal genéticamente modificado es un roedor. En un aspecto, el roedor se selecciona entre un ratón, una rata, una ardilla, un puercoespín o un hámster. En un aspecto, el roedor se selecciona de la superfamilia Muroidea. En un aspecto, el animal genéticamente modificado es de una familia seleccionada entre Calomyscidae (por ejemplo, hámsteres similares a ratones), Cricetidae (por ejemplo, de hámster, ratas y ratones del nuevo mundo, campañoles), Muridae (ratones y ratas auténticos, jerbos, ratones espinosos, ratas con cresta), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de abazón de las rocas, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirón espinoso), y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas del bambú, y zokores). En un aspecto específico, el roedor genéticamente modificado se selecciona entre un ratón o rata auténtico (familia Muridae), un jerbo, un ratón espinoso, y una rata con cresta. En un aspecto, el ratón genéticamente modificado es un miembro de la familia Muridae. En un aspecto, el animal es un roedor. En un aspecto específico, el roedor se selecciona entre un ratón y una rata. En un aspecto, el animal no humano es un ratón.

En un aspecto específico, el animal no humano es un roedor que es un ratón de una cepa C57BL seleccionada entre C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, y C57BL/Ola. En otro aspecto, el ratón es una cepa 129 seleccionada entre el grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (véase, por ejemplo, Festing et al. (1999) "Revised nomenclature for strain 129 mice", Mammalian Genome 10:836, véase también, Auerbach et al (2000) "Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines)". En un aspecto específico, el ratón genéticamente modificado es una mezcla de una cepa 129 anteriormente mencionada y una cepa C57BL/6 anteriormente mencionada. En otro aspecto específico, el ratón es una mezcla de las cepas 129 anteriormente mencionadas, o una mezcla de las cepas BL/6 anteriormente mencionadas. En un aspecto específico, la cepa 129 de la mezcla es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En otro aspecto, el ratón es una cepa BALB, por ejemplo, cepa BALB/c. En otro aspecto más, el ratón es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa anteriormente mencionada.

En un aspecto, el animal no humano es una rata. En un aspecto, la rata se selecciona entre una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, F344, F6 y Dark Agouti. En un aspecto, la cepa de la rata es una mezcla de dos o más cepas seleccionadas entre el grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 y Dark Agouti.

"Modificado por ingeniería genética", "genéticamente modificado", y similares, como se utiliza en el presente documento incluye la manipulación artificial, la modificación y/o la recombinación de una secuencia de ácido nucleico que da como resultado la producción de un polipéptido no nativo, por ejemplo, por un animal.

Animales modificados por ingeniería genética para la producción de proteínas de unión a antígeno de dom inio único

En el presente documento se divulgan animales no humanos genéticamente modificados que comprenden (a) proteínas de unión a antígeno de dominio único, por ejemplo, proteínas de unión de dominio único V^ho V^l, que pueden ser codificadas respectivamente por secuencias del gen de la región variable de cadena pesada o la región variable de cadena ligera en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificado que contiene una o más regiones constantes de inmunoglobulina no IgM en las que un dominio C^h1 funcional se ha desactivado y/o eliminado mientras se conserva una región constante C^h1 de IgM intacta, y/o (b) una cadena ligera reorganizada sencilla modificada por ingeniería genética, que puede ser codificada por una secuencia del gen variable reorganizada sencilla en un locus de cadena ligera, por ejemplo, una secuencia de gen Vk:Jk reorganizada sencilla insertada dentro del locus de kappa de inmunoglobulina.

Los anticuerpos son útiles como terapéutica humana. Las proteínas de unión de dominio único también son útiles como terapéutica humana. Debido a que las proteínas de unión de dominio único carecen de una cadena ligera, son menores y, por tanto, se espera que presenten mejor penetración de tejido que los anticuerpos que contienen cadenas ligeras, aún tienen un perfil farmacocinético similar o más favorable y aún conserva función efectora similar en comparación con un anticuerpo convencional. Debido a que son menores, proteínas de unión de dominio único son también capaces de administración a una dosis mayor en un volumen dado. Un método frecuente de administración de proteínas de unión es por inyección subcutánea, y una reducción en el volumen de administración para una dosis dada de anticuerpo puede producir beneficios a los pacientes y evitar complicaciones y dolor debido a las inyecciones subcutáneas de grandes volúmenes.

Otra ventaja de las proteínas de unión de dominio único es la capacidad de producir anticuerpos biespecíficos por heterodimerización de cadenas de inmunoglobulina con especificidad para dos epítopos diferentes en una terapéutica sencilla. Debido a que las proteínas de unión de dominio único carecen de una cadena ligera, son particularmente adecuadas para la producción de anticuerpos biespecíficos puesto que no hay reorganización de la cadena ligera que crearía una cadena ligera que interferiría con la afinidad o la especificidad de unión de la otra cadena.

La observaciones en camélidos, en determinados peces, y en afecciones patológicas revelan que bajo algunas circunstancias una proteína de unión que carece de un dominio C^h1 funcional en su región constante de cadena pesada puede expresarse en ausencia de una cadena ligera cognada. Por consiguiente, en un aspecto, una proteína de unión puede denominarse "proteína de unión de dominio único", que también es bien conocida en la técnica como anticuerpo desprovisto de las cadenas ligeras que comprenden una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera, es decir, "un anticuerpo solo de cadena pesada" que comprende únicamente una o dos cadenas polipeptídicas de inmunoglobulina que comprenden cada una región constante de cadena pesada, en donde al menos una de las cadenas polipeptídicas de inmunoglobulina del anticuerpo de solo cadena pesada carece de un dominio C^h1 funcional. En la técnica se encuentran descubrimientos sobre los anticuerpos de solo cadena pesada, por ejemplo, véase las publicaciones PCT WO02085944, WO02085945, WO2006008548 y WO2007096779. Véase también la Patente de Estados Unidos n.° 5.840.526; Patente de Estados Unidos n.° 5.874.541; Patente de Estados Unidos n.° 6.005.079; Patente de Estados Unidos n.° 6.765.087; Patente de Estados Unidos n.° 5.800.988; el documento EP 1589107; el documento WO 9734103; y la Patente de Estados Unidos n.° 6.015.695.

Los animales no humanos genéticamente modificados para producir proteínas de unión a antígeno de solo cadena pesada son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Janssens et al. (2006) PNAS 103:15.130-15.135; Zou et al. (2004) J. Exp. Med. 204:3271-32. Por ejemplo, los animales, y en particular, los roedores (por ejemplo, ratones) que se han modificado genéticamente para carecer de una secuencia de C^h1 funcional, por ejemplo, en un gen de inmunoglobulina G (IgG), expresaron posteriormente proteínas de unión a antígeno de dominio único.

Aunque las observaciones en camélidos, en determinados peces, y en afecciones patológicas revelan que bajo algunas circunstancias una proteína de unión que carece de un dominio C^h1 de su región constante de cadena pesada puede expresarse en ausencia de una cadena ligera cognada, el desarrollo normal de los linfocitos B productores de anticuerpo generalmente requiere la presencia de un dominio C^h1. Todos los isotipos de cadena pesada, incluido IgM, comprenden un dominio C^h1. Se cree que tanto la cadena ligera subrogada como una cadena ligera cognada interactúan con una cadena pesada dada por el dominio C^h1 de la cadena pesada en el contexto de una IgM. Hasta el punto de que el desarrollo de las proteínas de unión de dominio único depende de la integridad o funcionalidad estructural de una cadena pesada del isotipo IgM, la alteración de la integridad estructural de IgM o función sería no deseable.

El desarrollo normal de los anticuerpos requiere que los anticuerpos sobrevivan a lo largo de múltiples esquemas de selección de complejos que da como resultado la supervivencia y por último la expresión de anticuerpos funcionales y útiles. Las alteraciones en la estructura del anticuerpo pueden resultar ser perjudiciales para la supervivencia y la expresión final de un anticuerpo hasta el punto que la alteración estructural da como resultado la incapacidad del anticuerpo de competir eficazmente y desarrollarse hasta la satisfacción de uno o más de los esquemas de selección de anticuerpo naturales.

Pronto en el desarrollo de anticuerpo, las cadenas pesadas del anticuerpo experimentan un proceso de selección en donde la naturaleza elige, a través de una diversidad de esquemas de selección, cadenas pesadas adecuadas para experimentar más selección para formar finalmente anticuerpos funcionales y madurados para afinidad. Las cadenas pesadas del anticuerpo expresadas a partir de los segmentos génicos de cadena pesada recombinados en linfocitos B progenitores (o, pro-linfocitos B) normalmente se emparejan con una cadena ligera subrogada para la presentación sobre la superficie de los pro-linfocitos B en un isotipo IgM para formar una estructura (que incluye otros correceptores) denominada pre-receptor de linfocito B o pre-BCR. Una vez que el pre-BCR está presente sobre la superficie celular, se cree que el pre-BCR señala su formación apropiada del complejo a la célula, enseñando eficazmente a la célula que la cadena pesada ha pasado esta etapa de selección temprana. Por tanto, la célula está informada de que la cadena pesada puede experimentar selección adicional. Si la cadena pesada contiene un defecto que es perjudicial para la formación de un pre-BCR cuando se presenta en el contexto de una IgM y una cadena ligera subrogada, la célula experimentará apoptosis. Si la célula experimenta apoptosis, se perderá la utilidad, o la contribución a la diversidad, de la región variable de cadena pesada de la cadena pesada. Por tanto, una etapa muy temprana en la selección de anticuerpo requiere presentación de la cadena pesada junto con una cadena ligera subrogada en el contexto de un isotipo IgM. Se cree que la cadena ligera subrogada interactúa con IgM al menos en parte por el dominio CH1 de IgM. Un fallo o alteración en la estructura del anticuerpo en este momento crítico temprano (por ejemplo, un dominio CH1 no funcional) puede dar como resultado fallo en la selección, pérdida de pro-linfocito B que expresa la cadena pesada, y pérdida de la posibilidad de emplear el dominio variable de cadena pesada particular en un anticuerpo útil.

Una vez que la célula portadora del pre-BCR pasa esta etapa de selección, la próxima etapa de selección requiere que la cadena pesada se empareje con una cadena ligera cognada (por ejemplo, kappa o lambda en ratones y seres humanos). La estructura de cadena pesada/cadena ligera cognada emparejadas de nuevo se presenta sobre la superficie de la célula, ahora un pre-linfocito B virgen, en el contexto de un isotipo IgM por el dominio C^h1 de IgM. Este complejo sobre la superficie da como resultado un receptor de linfocito B (BCR) funcional, unido a membrana. Se cree que este BCR es una señal para la célula de que la cadena pesada es adecuada para más selección, y que la célula ahora puede cometer la expresión de esta cadena ligera particular y proceder a etapas de maduración de linfocito B adicionales, incluida la maduración de la afinidad y cambio de clase. Si la cadena pesada contiene un defecto que es perjudicial para la formación de un BCR cuando se presenta en el contexto de una IgM y su cadena ligera cognada, la célula experimentará apoptosis. Si la célula experimenta apoptosis, se perderá la utilidad, o la contribución a la diversidad, de la región variable de cadena pesada de la cadena pesada. Por tanto, una etapa muy temprana en la selección de anticuerpo requiere presentación de la cadena pesada junto con una cadena ligera cognada en el contexto de un isotipo IgM. De nuevo, un fallo o alteración en la estructura del anticuerpo (por ejemplo, un dominio C^h1 no funcional) en este momento crítico temprano puede dar como resultado fallo en la selección clonal y pérdida concomitante del pre-linfocito B que expresa la cadena pesada.

Al haber sobrevivido la selección hasta ahora, el pre-linfocito B que presenta la cadena pesada emparejada con su cadena ligera cognada en el contexto de IgM a continuación experimenta un proceso de maduración que por último da como resultado el cambio de clase y mecanismos de selección adicionales en los que la cadena pesada y la cadena ligera cognada se presentan sobre la superficie del linfocito B en el contexto de un isotipo IgG. Sería en esta etapa donde ocurriría cualquier selección de las cadenas pesadas de IgG que carecen de un dominio C^h1 o que carecen de un domino C^h1 y una región bisagra. En animales de acuerdo con la divulgación, se cree que un repertorio aumentado de regiones variables en un locus de cadena pesada estaría disponible para la selección basándose en si el dominio variable sobreviviría o no para ser expresado en una cadena pesada de IgG que carece de un dominio C^h1 o que carece de un dominio C^h1 y una región bisagra. Por el contrario, los ratones que tienen IgM alterada probablemente no presentarían un repertorio de regiones variables de cadena pesada, puesto que únicamente aquellas regiones variables capaces de sobrevivir la selección en el contexto de una IgM alterada estarían disponibles para el cambio de clase.

Por tanto, un animal que carece de una IgM funcional puede experimentar una reducción notable en la capacidad de producir una población de linfocitos B tras la reorganización de segmentos génicos variables de cadena pesada de otra manera adecuados. En tal caso, incluso cuando hay disponible un suministro abundante de regiones variables (es decir, el animal tiene un número adecuado de segmentos génicos de la región variable capaces de reorganizarse y unirse operativamente a una región constante de cadena pesada, por ejemplo, en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina), no puede formarse una población satisfactoria de linfocitos B que muestren un grado deseable de diversidad debido a un deterioro de IgM que mitiga la supervivencia de una cadena pesada durante el proceso de selección.

Es deseable que se mantenga un número adecuado de regiones variables reorganizadas en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que puede sobrevivir eficazmente la selección cuando se presentan durante el desarrollo de los linfocitos B en el contexto de una IgM con el fin de generar diversidad suficiente para producir anticuerpos mediante la inmunización de un animal no humano con un inmunógeno de interés. Por tanto, un animal no humano genéticamente modificado que comprende un dominio C^h1 no funcional o un dominio C^h1 no funcional y, opcionalmente, una región bisagra no funcional, en una cadena pesada de inmunoglobulina no debería comprender una deleción de C^h1 en uno o ambos alelos de IgM. Dichos animales, divulgados en el documento US 2011/0145937, presentan cambio de clase a una región de gen constante de IgG en donde el dominio C^h1 se ha sometido a deleción o se ha desactivado y expresa un dominio único, la IgG de superficie (receptor de linfocitos B) que tanto 1) se pliega y expresa en la superficie celular sin un patrón de cadena ligera, como 2) aún reconoce el antígeno en ausencia de cadena ligera, con el fin de ser estimulada por antígeno y seleccionada.

En diversos aspectos de la presente divulgación, se divulga que los animales no humanos genéticamente modificados que producen proteínas de unión que carecen de un domino C^h1, incluidas las proteínas de unión a antígeno de dominio único, tales como aunque no de forma limitativa proteínas de unión de dominio único V^hy V^l. Los animales no humanos genéticamente modificados pueden comprender una modificación genética que incluye una falta de un dominio de cadena pesada de inmunoglobulina funcional (un dominio C^h1), por ejemplo, un dominio C^h1 de IgG1, y en algunos aspectos una modificación adicional que comprende una deleción de una región bisagra en la cadena pesada de inmunoglobulina que carece del dominio C^h1 funcional, en donde el animal no humano expresa una IgM funcional. Otras modificaciones incluyen volver isotipos distintos de IgG1 e IgM en no funcionales, por ejemplo, produciendo deleciones en genes, o deleciones de genes, o mutaciones de desactivación en genes, para IgD, IgG3, IgG2a, IgG2c, IgG2b, IgA e IgE, tales como deleciones o mutaciones de desactivación de dominios CH1 o regiones bisagra de IgD, IgG3, IgG2a, IgG2c, IgG2b, IgA e IgE. También se describen embriones no humanos genéticamente modificados, células, y construcciones de mutagénesis dirigida para producir los animales no humanos, los embriones no humanos, y las células.

También se describen composiciones y métodos para producir un animal que produce una proteína de unión que carece de un dominio CH1 de inmunoglobulina (y opcionalmente una región bisagra), incluidas las proteínas de unión a antígeno de dominio único, que pueden comprender dominios V^h(por ejemplo, dominios V^hendógenos o humanos) o dominios V^l(por ejemplo, dominios V^lhumanos). Los métodos incluyen volver selectivamente no funcional una región C^h1 de no IgM endógena en (por ejemplo, por una deleción o desactivación de una secuencia de un dominio C^h1), y emplear segmentos génicos de la región variable de cadena pesada (HCVR) endógenos no reorganizados, segmentos génicos de la región variable humana (hHCVR) no reorganizados, o la región variable de cadena ligera humana (hLCVR) no reorganizada en el locus de región variable endógena para producir una proteína de unión humana quimérica en un no humano. La deleción del dominio C^h1 se realiza en uno o más genes de la región constante de inmunoglobulina (por ejemplo, genes de IgG1, IgD, IgG3, IgG2a, IgG2c, IgG2b, IgA o IgE), pero no en un gen de IgM. En una realización en donde la deleción está en una IgG, este planteamiento vuelve selectivamente no funcionales uno o más dominios CH1 de IgG mientras retiene una IgM funcional. Además de la deleción de uno o más dominios CH1 de IgG, un aspecto adicional se refiere a deleción o volver no funcional la(s) región(es) bisagra de la(s) IgG(s) que carece(n) de un dominio C^h1 funcional.

En este aspecto concreto, el planteamiento de deleción de C^h1 de IgG emplea una alteración relativamente conservativa en el desarrollo natural de los linfocitos B en el animal, debido a que no todos los isotipos de Ig del animal no humano genéticamente modificado presentará un C^h1 no funcional o una deleción del dominio C^h1 (y, opcionalmente, bisagra). Por tanto, la modificación de C^h1 no se da en moléculas de IgM y, por tanto, no afecta a estas etapas, como se ha descrito anteriormente, en el desarrollo temprano de los linfocitos B que depende de una IgM que tiene un C^h1 funcional. Debido a que la IgM no está modificada, los animales que portan una o más deleciones del dominio C^h1 de una IgG (y opcionalmente una región bisagra de la IgG), pero no el dominio C^h1 de una IgM, debería ser capaz de procesar un repertorio satisfactoriamente grande de regiones variables en las etapas de selección clonal antes de la presentación del dominio variable en el contexto de una IgG. Por tanto, en diversos aspectos, cualquier efecto perjudicial de la(s) modificación(es) genética(s) sobre la diversidad de regiones variables disponibles para su uso en una proteína de unión de dominio único no debería impactar negativamente en el conjunto de regiones variables disponibles para la selección en un contexto de IgG. Además, cuando la secuencia de C^h1 que se vuelve no funcional (por ejemplo, delecionada) en la línea germinal es una IgG1, el animal carecerá de la capacidad de producir cualquier ARN que codifique un dominio C^h1.

Modificar genéticamente un animal no humano para volver no funcional un dominio C^h1 o un dominio C^h1 y, opcionalmente, una región bisagra de uno o más isotipos de inmunoglobulina no IgM puede dar como resultado un animal que es capaz de seleccionar, a partir de un repertorio completo o básicamente completo de segmentos génicos de región V, por ejemplo, regiones V^ho V^l, una región V adecuada para expresarse en una proteína de unión de dominio único. Modificar selectivamente isotipos IgG (pero no IgM) evita una reducción potencial en el número de regiones variables que sobreviven a la selección debido a un falta de una dominio C^h1 o una falta de un dominio C^h1 en IgM. Por tanto, está disponible un repertorio más completo de regiones V para la selección en el contexto de una IgG (que carece de un dominio C^h1 o que carece de un dominio C^h1 y carece de una región bisagra). Por tanto, la selección de un dominio V en un animal genéticamente modificado de acuerdo con la divulgación no depende, por ejemplo, de que el dominio V pueda ayudar a superar los obstáculos al desarrollo temprano de linfocitos B dependiente de IgM que son debido a las estructuras modificadas de IgM. En cambio, las etapas dependientes de IgM tempranas deberían darse como normales, dando como resultado un gran repertorio de cadenas pesadas disponibles para la selección con respecto a su idoneidad para expresarse en el contexto de una IgG que carece de un dominio C^h1 o que carece de un dominio C^h1 y carece de una región bisagra.

Por tanto, en diversos aspectos, un animal genéticamente modificado de acuerdo con la divulgación debería mantener la expresión de IgM funcional, que debería proporcionar una oportunidad para un proceso de selección clonal más natural. Por ejemplo, con una IgM funcional (por ejemplo, una IgM que comprende un dominio C^h1 funcional), tanto cadena ligera subrogada como la cadena ligera cognada serán capaces de asociarse por el dominio CH1 de IgM y participar en los procesos de selección en el desarrollo temprano de los linfocitos B. En un animal genéticamente modificado de acuerdo con la divulgación, se cree que el cambio de clase a un isotipo IgG es la primera etapa de selección donde se encuentra cualquier selección de dominios variables de cadena pesada que pueden expresarse en el contexto de un dominio constante que carece de un dominio C^h1 funcional o que carece de un dominio C^h1 funcional y una bisagra funcional.

En diversos aspectos, la región constante de cadena pesada de no IgM en el animal no humano que comprende una deleción o una mutación de desactivación en el dominio C^h1 es una no humana, por ejemplo, región constante de cadena pesada no humana endógena. En otro aspecto, la región constante de cadena pesada de no IgM en el animal no humano que comprende una deleción o una mutación de desactivación en el dominio C^h1 es una región constante de cadena pesada humana. En otros aspectos más, en donde el animal adicionalmente comprende una secuencia del gen de cadena ligera reorganizada sencilla unida operativamente a una región constante de cadena ligera, la región constante de cadena ligera es una no humana, por ejemplo, región constante de cadena ligera no humana endógena; o la cadena ligera es una región constante de cadena ligera humana.

Proteínas de unión de dom inio único V^l, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno de dominio único que tienen un dominio variable de cadena ligera

En el presente documento se describen animales no humanos genéticamente modificados que comprenden dos tipos de proteínas de unión a antígeno de dominio único: (1) una proteína de unión de dominio único V^h, que es codificada por una secuencia del gen de la región variable de cadena pesada reorganizada y (2) una proteína de unión de dominio único V^l, que es codificada por una secuencia del gen de la región variable de cadena ligera reorganizada, cada una codificada también por un locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificado que contiene una o más regiones constantes de inmunoglobulina no IgM en las que un dominio C^h1 funcional se ha desactivado y/o eliminado mientras se conserva una región constante C^h1 de IgM intacta.

Por tanto, en un aspecto divulgado en el presente documento es un locus de cadena pesada modificado por ingeniería genética para comprender segmentos génicos de la región variable de cadena ligera, por ejemplo, los segmentos génicos Vk, Jk, VA, y/o JA, unidos operativamente a una región constante de cadena pesada. Se ha descrito la modificación por ingeniería genética de un locus de cadena pesada para comprender una región variable de cadena ligera. Por ejemplo, la generación de un animal no humano que comprende un locus de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende un reemplazo de uno o más, básicamente todos, o todos los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina V^h, D^h, y/o J^hpor uno o más segmentos génicos de la región variable de cadena ligera V^ly/o J^lse describe en, por ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 20120096572.

Un experto en la materia reconocerá fácilmente que el reemplazo de los segmentos génicos V^ly/o J^lpuede comprender segmentos génicos VL no reorganizados y/o JL no reorganizados, que sean capaces de experimentar reorganización productiva. Adicionalmente, los segmentos génicos V^ly/o J^lpueden ser uno o más segmentos seleccionados de los segmentos génicos VK, JK, VA, JA, y pueden ser una combinación de los mismos. En un aspecto, el uno o más segmentos de la región variable de cadena pesada se reemplaza por uno o más segmentos génicos variables de cadena ligera humanos, lo que permite la producción de un dominio variable que tiene idiotipos humanos.

Como se divulga en el presente documento, un locus de cadena pesada modificado por ingeniería genética para comprender segmentos génicos de la región variable de cadena ligera, por ejemplo, los segmentos génicos Vk, Jk, VA, y/o JA, unidos operativamente a una región constante de cadena pesada puede experimentar reorganización génica productiva para formar una cadena de inmunoglobulina, incluso cuando uno o más dominios o segmentos génicos de la región constante de cadena pesada están desactivados o delecionados. Como se muestra en el presente documento, el reemplazo de segmentos génicos de la región variable de cadena pesada por segmentos génicos de la región variable de cadena ligera con la deleción de un dominio Ch1, por ejemplo, en el gen de IgG1, da como resultado proteínas de unión a antígeno de dominio único que tienen regiones variables de cadena ligera. Específicamente, el reemplazo de segmentos génicos de la región variable de cadena pesada endógenos de un locus de cadena pesada con los segmentos génicos V y J kappa (Vk y Jk) da como resultado una región variable kappa unida operativamente a una región constante de cadena pesada (KoH). La modificación adicional al locus de cadena pesada para suprimir el(los) dominio(s) Ch1 (Ch1 del) da como resultado un locus de inmunoglobulina (KoH Ch1 del) que codifica una cadena polipeptídica de inmunoglobulina que comprende una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena pesada que carece de un dominio Ch1 funcional, en donde la cadena polipeptídica de inmunoglobulina puede formar una proteína de unión a antígeno de dominio único, por ejemplo, una proteína de unión a antígeno de dominio único Vl.

Por consiguiente, en algunos aspectos, se divulgan animales no humanos genéticamente modificados que comprenden una proteína de unión de dominio único Vl que comprende un dominio variable de cadena ligera unido operativamente a una región constante de cadena pesada que carece de un dominio Ch1 funcional, en donde la cadena polipeptídica de inmunoglobulina puede formar una proteína de unión a antígeno de dominio único, que puede ser codificada por secuencias del gen de la región variable de cadena ligera en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina modificado que contiene una o más regiones constantes de inmunoglobulina no IgM en las que un dominio Ch1 funcional se ha desactivado y/o eliminado mientras se conserva una región constante IgM intacta.

Aspectos descritos en el presente documento incluyen proteínas de unión Vl que comprenden una cadena híbrida codificada por un gen de inmunoglobulina híbrido que comprende o se deriva de un, segmento génico Vl, preferentemente no reorganizado y más preferentemente humano, (o parte del mismo) reorganizado con un, segmento génico Jl, preferentemente no reorganizado y más preferentemente humano, (o parte del mismo) unido operativamente a secuencias de nucleótidos que codifican uno o más genes de la región constante de cadena pesada, por ejemplo, IgM, IgD, IgG, IgA o IgE, en donde el gen de IgD, IgG, IgA o IgE comprende una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia codificante de Ch1. La proteína de unión Vl, la proteína de unión a antígeno Vl, o similares, incluye una proteína de unión a antígeno que comprende un sitio de unión a antígeno que comprende dos dominios variables de cadena ligera. En un aspecto, al menos dos dominios variables de cadena ligera de las proteínas de unión Vl son cognados. En algunos aspectos, cada uno de los dos dominios variables de cadena ligera son codificados por o derivados de un segmento del gen de la región variable de cadena ligera (Vl) y/o un segmento génico de la región de unión de cadena ligera (Jl). En aspectos preferidos, uno de los dos dominios variables de cadena ligera puede ser parte de una cadena de inmunoglobulina híbrida, y el otro de los dos dominios variables de cadena ligera puede ser parte de una cadena ligera de inmunoglobulina (L).

La expresión "cadena híbrida de inmunoglobulina", "cadena híbrida", "cadena de inmunoglobulina híbrida", o similares como se utiliza en el presente documento se refiere a una proteína de inmunoglobulina que incluye, desde el extremo amino al carboxilo, un dominio variable de cadena ligera (que puede ser o no somáticamente mutado) y una región constante de cadena pesada. En general, una cadena híbrida es codificada por una secuencia del gen de la región variable de cadena ligera reorganizada unida operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena pesada. Como se divulga en el presente documento, una proteína de unión de dominio único Vl comprende una cadena híbrida, en donde la cadena híbrida es codificada por una secuencia del gen de la región variable de cadena ligera reorganizada unida operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena pesada que tiene una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia que codifica Ch1.

La secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de una cadena de inmunoglobulina híbrida puede comprender generalmente secuencias del segmento del gen variable de cadena ligera (Vl) (o parte del mismo) y un segmento del gen de unión de cadena ligera (Jl) (o parte del mismo). En aspectos preferidos, las secuencia del gen de la región variable de cadena ligera, por ejemplo, la secuencia de gen Vl-Jl reorganizada, que codifica el domino variable de cadena híbrida se deriva de un repertorio de segmentos génicos Vl y Jl no reorganizados, preferentemente segmentos génicos Vl y Jl no reorganizados de la línea germinal, que son (a) capaces de experimentar reorganización del gen, por ejemplo, capaces de reorganización para formar una secuencia del gen de la región variable de cadena ligera dentro del marco de lectura y (b) están unidos operativamente a uno o más segmento génicos de la región constante de cadena pesada, por ejemplo, un grupo no reorganizado de segmentos génicos de la región constante o un segmento génico de la región constante.

Tras la reorganización de los segmentos génicos de cadena ligera, se obtiene una secuencia de nucleótidos reorganizada que comprende una secuencia que codifica una región variable de cadena ligera fusionada a una secuencia que codifica una región constante de cadena pesada. Esta secuencia codifica una cadena de inmunoglobulina que tiene un dominio variable de cadena ligera fusionado a un dominio constante de cadena pesada. Por tanto, en un aspecto, una inmunoglobulina híbrida como se divulga en el presente documento consiste prácticamente en, desde el extremo N al extremo C, un dominio Vl y un dominio CH. En un aspecto, el dominio CH comprende una región CH1 funcional (en el contexto de IgM), una bisagra, una región CH2, una región CH3 y opcionalmente una región CH4. En otro aspecto, el dominio CH carece de una región CH1 funcional, por ejemplo, carece de una región CH1 en todo o en parte, y puede adicionalmente carecer de una región bisagra, por ejemplo, en el contexto de IgG, IgA, IgE y/o IgD. En otro aspecto, el dominio Ch carece de una región Ch1 funcional, por ejemplo, carece de una región C^h1 en todo o en parte, y puede adicionalmente carecer de otras regiones constante de isotipo no IgM.

Los animales no humanos modificados descritos en el presente documento pueden generar proteínas de unión V^lque tienen un isotipo IgM que también comprende una cadena ligera cognada emparejada con una cadena híbrida para producir una proteína de unión V^lque es tipo anticuerpo, por ejemplo, puede ser tetramérica, pero en donde en lugar de una cadena pesada (o par de cadenas pesadas) la proteína de unión V^lcomprende una cadena híbrida (o par de cadenas híbridas) que comprende dominio V^l, no un dominio V^h, fusionado a un dominio C^hde IgM.

Puesto que los animales no humanos divulgados en el presente documento preferentemente comprenden un gen de región constante de IgM que tiene un dominio C^h1 funcional, los animales no humanos divulgados en el presente documento abarcan la humanización de los loci de inmunoglobulina en la expresión de proteínas de unión V^lque se parecen a la estructura tetramérica de algunos anticuerpos convencionales pero sin embargo difieren en las características de unión, y da como resultado la expresión de dichas proteínas de unión V^lsobre la superficie de la membrana de las células del animal no humano. En algunos aspectos, los animales no humanos de la presente divulgación son capaces de generar dominios V^lhumanos, o una o ambas de las cadenas híbridas y ligeras de la proteína de unión V^l, que se unen a antígeno; en algunos aspectos, dichos mamíferos no humanos desarrollan y/o tienen una población de linfocitos B que expresan proteínas de unión que comprenden dominios variables que no son codificados por o derivados de alguna secuencia de segmento génico V^h, D^hy/o J^h. En algunos aspectos, las proteínas de unión V^lexpresadas por dichos animales no humanos se caracterizan en que la parte de unión a antígeno está comprendida exclusivamente de dominios humanos V^l. En algunos aspectos, los animales no humanos de la presente divulgación comprenden en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno material genético del animal no humano y una especie heteróloga (por ejemplo, un ser humano) y comprenden en un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno material genético del animal no humano y una especie heteróloga (por ejemplo, ser humano).

En diversos aspectos, los animales no humanos modificados producen proteínas de unión de dominio único V^l, en donde el dominio V^lde una cadena híbrida presenta un grado aumentado de hipermutación somática sobre un dominio V^lde una cadena ligera. En algunos aspectos, una región V^lde una cadena híbrida presenta aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces o 5 veces o más de hipermutaciones somáticas que una región V^lfusionada a una región C^l. En algunos aspectos, el animal no humano modificado, por ejemplo, ratón, en respuesta a un antígeno presenta una población de proteínas de unión de dominio único V^lque comprenden un dominio V^lde una cadena híbrida, en donde la población de proteínas de unión de dominio único V^lpresenta un promedio de aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces o más de hipermutaciones somáticas en el dominio V^lde la cadena híbrida que el observado en una población de cadenas ligeras, por ejemplo, un dominio V^lde una cadena ligera, presentado por una ratón tipo silvestre en respuesta al mismo antígeno.

En un aspecto, las hipermutaciones somáticas en el domino V^lde la cadena híbrida comprende una o más o dos o más adiciones de N en una CDR3. En diversos aspectos, las proteínas de unión V^l, por ejemplo, las proteínas de unión de dominio único V^l, comprenden cadenas híbridas que comprenden dominios variables codificados por secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina que comprenden un mayor número de adiciones de N que el observado en la naturaleza para cadenas ligeras reorganizadas de un locus de cadena ligera endógeno, por ejemplo, los segmentos génicos V^ly J^lhumanos se reorganizan para formar un gen de la región variable reorganizado unido operativamente a un gen de la región constante de cadena pesada, en donde la región variable de cadena ligera reorganizada comprende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 o más adiciones de N.

En diversos aspectos, las proteínas de unión V^l, por ejemplo, las proteínas de unión de dominio único V^l, como se divulga en el presente documento, por ejemplo, aquellas producidas por los animales no humanos genéticamente modificados, por ejemplo, ratones, divulgadas en el presente documento, pueden estar en un promedio menor que los anticuerpos convencionales o los anticuerpos de solo cadena pesada, respectivamente y poseen ventajas asociadas al menor tamaño. El menor tamaño se consigue al menos en parte por la ausencia de una secuencia de aminoácidos codificada por una región D^h, normalmente presente en un dominio V^h. El menor tamaño también se puede conseguir por la formación de una CDR3 que es derivada, por ejemplo, de una región Vk y una región Jk.

En un aspecto, se divulga un animal no humano, por ejemplo, un ratón, que comprende un locus de cadena híbrida de inmunoglobulina. En un aspecto, el locus de cadena híbrida se crea dentro de un locus de cadena pesada endógeno, en donde uno o más segmentos génicos de la región variable de cadena pesada (V^h) de inmunoglobulina, segmentos génicos de diversidad de cadena pesada (D^h) y segmentos génicos de unión de cadena pesada (J^h) en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón endógeno se reemplazan por uno o más segmentos génicos de la región variable de cadena ligera (V^l) y uno o más segmentos génicos de la región de unión de cadena ligera (J^l) que se reorganizan para formar una secuencia del gen de la región variable V^l/J^lreorganizada que se recombina con un gen de C^hde ratón endógeno para formar un gen reorganizado que se deriva de un segmento génico V^l, un segmento génico J^ly un gen de C^hde ratón endógeno, en donde el gen de C^hes de IgM, IgD, IgG, IgA, IgE, y en donde IgD, IgG, IgA o IgE carecen de un dominio C^h1 funcional. En un aspecto, se divulga un animal no humano, que comprende un locus de cadena híbrida que reemplaza el locus de cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, todos o básicamente todos los segmentos génicos Vh, Dh, y Jh endógenos de uno o ambos loci de cadena pesada se reemplazan por uno o más segmentos génicos Vl y uno o más segmentos génicos Jl que forman una secuencia del gen de la región variable Vl/Jl reorganizada que se recombina con un gen de Ch de ratón endógeno para formar un gen reorganizado que se deriva de un segmento génico Vl, un segmento génico Jl y un gen de Ch de ratón endógeno, en donde el gen de Ch es de IgM, IgD, IgG, IgA, IgE, y en donde IgD, IgG, IgA o IgE carecen de un dominio Ch1 funcional.

En algunos aspectos, los animales no humanos de la presente divulgación comprenden un locus de cadena híbrida de inmunoglobulina que incluye segmentos génicos Vl humanos no reorganizados y/o segmentos génicos Jl humanos y un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que incluye segmentos génicos Vl humanos no reorganizados y/o segmentos génicos Jl humanos. En algunos aspectos, los animales no humanos de la presente divulgación comprenden un locus de cadena híbrida de inmunoglobulina que incluye segmentos génicos Vl humanos no reorganizados y/o segmentos génicos JL humanos y, preferentemente, un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que incluye una secuencia del gen de la región variable Vl/Jl humana reorganizada unida operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena ligera, por ejemplo, y que codifica una cadena ligera común.

Animales no humanos modificados por ingeniería genética que expresan proteínas de unión de dominio único y una cadena ligera reorganizada

En aspectos adicionales, en el presente documento se divulgan animales no humanos que comprenden (a) una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio Ch1 de al menos un gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, en donde el al menos un gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno es de IgG, IgA, IgE, IgD o una combinación de los mismos, (b) un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina Vl/Jl reorganizada sencilla que comprende las secuencias de segmento génico Vl y Jl, en donde la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizada sencilla está unida operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina, y, por ejemplo, codifica una cadena ligera sencilla, y opcionalmente también (c) un reemplazo de segmentos génicos Vh, Dh, Jh endógenos en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno con una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos un segmento génico de la región variable de cadena ligera (Vl) de inmunoglobulina no reorganizado y al menos un segmento génico de unión de cadena ligera (Jl) de inmunoglobulina no reorganizado, en donde cada uno de los segmentos génicos Vl y Jl no reorganizados son capaces de recombinarse para formar una secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl/Jl) reorganizada unida operativamente al gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la deleción o mutación de desactivación en la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio Ch1.

Se ha descrito la modificación por ingeniería genética de una cadena ligera reorganizada sencilla, por ejemplo, una cadena ligera que comprende una región variable de cadena ligera reorganizada. Por ejemplo, la generación de cadena ligera universal (ULC) de ratón que comprende una secuencia del gen variable reorganizada sencilla Vl:Jl y la generación de anticuerpos específicos a antígeno en aquellos ratones se describe en, por ejemplo, las Solicitudes de Patente de Estados Unidos n.° 13/022.759, 13/093.156, 13/412.936, 13/488.628, 13/798.310 y 13/948.818 (Publicaciones n.° 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300, 2013/0045492, US20130185821 y US20130302836, respectivamente). La expresión de una cadena ligera reorganizada sencilla modificada por ingeniería genética, por ejemplo, una cadena ligera universal, provoca la expansión de anticuerpos en la fase temprana de IgM, en donde la mayoría de la diversidad y, por tanto, el reconocimiento de antígeno se da en la cadena pesada. Sin limitación con respecto a la invención, se propone que la expansión en la fase temprana de IgM con una cadena ligera reorganizada sencilla modificada por ingeniería genética dará como resultado más células que porten las regiones variables de cadena pesada o ligera capaces de sobrevivir para experimentar el cambio de clase a un isotipo IgG y la selección en el contexto de una IgG que carece de un dominio Ch1 funcional o que carece de un dominio Ch1 funcional y carece de una región bisagra funcional.

Por consiguiente, se describe un animal no humano genéticamente modificado, junto con métodos y composiciones para obtener el animal, en donde la modificación genética da como resultado la falta de un dominio Ch1 funcional (en un aspecto adicional la falta de una región bisagra funcional) en un dominio de Ig que no es un dominio de IgM, y en donde el animal además expresa una cadena ligera reorganizada sencilla modificada por ingeniería genética, por ejemplo, una cadena ligera común (ULC) modificada por ingeniería genética, que puede asociarse a una IgM intacta.

El ratón con cadena ligera modificada por ingeniería genética descrito en las Publicaciones de Solicitud de Estados Unidos n.° 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300 y 2013/0045492 comprendía una secuencia de ácido nucleico que codificaba un repertorio limitado de opciones de cadena ligera, por ejemplo, cadena ligera común o universal "ULC" que comprendía no más de dos segmentos génicos Vl o una secuencia de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reorganizada sencilla. Para lograr dicho repertorio limitado, un ratón se modificó por ingeniería genética para volver no funcional o básicamente no funcional su capacidad de producir, o reorganizar, un dominio variable de cadena ligera de ratón nativo. En un aspecto, esto se logró, por ejemplo, por deleción de los segmentos génicos de la región variable de cadena ligera de ratón. Como se ha descrito anteriormente, a continuación, el locus de ratón endógeno puede modificarse por segmentos génicos de la región variable de cadena ligera adecuados exógenos de elección, preferentemente segmentos génicos de la región variable de cadena ligera humanos, unidos operativamente al dominio constante de cadena ligera de ratón, de una manera tal que los segmentos génicos de la región variable exógenos pueden combinarse con el gen de la región constante de cadena ligera de ratón endógeno y formar un gen de cadena ligera quimérico inverso reorganizado (variable humana, constante de ratón). En diversos aspectos, la región variable de cadena ligera es capaz de ser somáticamente mutada. En diversos aspectos, para maximizar la capacidad de la región variable de cadena ligera de adquirir mutaciones somáticas, el(los) potenciador(es) apropiado(s) se mantienen en el ratón. En un aspecto, en la modificación de un locus de cadena ligera k de ratón para reemplazar los segmentos génicos de cadena ligera k de ratón endógenos con segmentos génicos de cadena ligera k humanos, el potenciador intrónico k de ratón y el potenciador 3' k de ratón se mantienen funcionalmente, o están no alterados.

Por tanto, se divulga un ratón modificado por ingeniería genética que expresa un repertorio limitado de cadenas ligeras quiméricas inversas (variables humanas, constantes de ratón) asociadas a una diversidad de cadenas pesadas quiméricas inversas (variables humanas, constantes de ratón). En diversos aspectos, los segmentos génicos de cadena ligera k de ratón endógenos se someten a deleción y se reemplazan por una región de cadena ligera humana reorganizada sencilla (o dos), unida operativamente al gen de Ck de ratón endógeno. En aspectos para maximizar la hipermutación somática de la región de cadena ligera humana reorganizada, se mantienen el potenciador intrónico k de ratón y el potenciador 3' k de ratón. En diversos aspectos, el ratón también comprende un locus de cadena ligera A no funcional, o una deleción del mismo o una deleción que vuelve el locus incapaz de producir una cadena ligera A.

Por tanto, en un aspecto, en el presente documento se divulga un animal no humano (por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón o una rata) que comprende en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, un repertorio limitado de preferentemente regiones variables de cadena ligera humana o una región variable de cadena ligera humana reorganizada sencilla, de un repertorio limitado de preferentemente segmentos génicos variables de cadena ligera humanos, en donde el animal no humano también comprende en su genoma, por ejemplo, en su línea germinal, una deleción o una mutación de desactivación en una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio C^h1.

Se divulgan animales modificados por ingeniería genética que expresan un repertorio limitado de dominios variables de cadena ligera humanos, o un domino variable de cadena ligera humano único, de un repertorio limitado de secuencias del gen de la región variable de cadena ligera humanas. En un aspecto, la secuencia de cadena ligera humana V/J reorganizada sencilla se selecciona de Vk1-39Jk y Vk3-20Jk, por ejemplo, Vk1-39Jk5 y Vk3-20Jk1. En algunos aspectos, un animal no humano como se divulga en el presente documento comprende un locus de cadena ligera modificado que comprende un reemplazo de todos los segmentos génicos V^lendógenos y todos los J^lendógenos con la secuencia de cadena ligera V/J reorganizada sencilla, en donde la secuencia de cadena ligera V/J reorganizada sencilla está unida operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera endógeno. En algunos aspectos, el locus de cadena ligera modificado está en el genoma de la línea germinal del animal no humano. En un aspecto, el animal no humano comprende en su genoma de línea germinal una secuencia del gen variable de cadena ligera reorganizada sencilla unida operativamente a una secuencia del gen de región constante de cadena ligera, en donde la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera reorganizada sencilla comprende segmentos génicos V^lde la línea germinal humana y J^lde la línea germinal humana, por ejemplo, Vk1-39 de la línea germinal humana y Jk5 de la línea germinal humana o Vk3-20 y Jk1 de la línea germinal humana. En algunos aspectos, un animal no humano como se divulga en el presente documento comprende un linfocito B, por ejemplo, un linfocito B que no ha experimentado cambio de clase, que comprende en su genoma una secuencia de cadena ligera V/J reorganizada sencilla unida operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera endógeno, en donde la cadena ligera V/J reorganizada sencilla no comprende mutaciones somáticas en comparación con una secuencia de cadena ligera V/J reorganizada sencilla unida operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera endógeno encontrado en el genoma de la línea germinal del animal no humano. En otros aspectos, un animal no humano como se divulga en el presente documento comprende un linfocito B, por ejemplo, un linfocito B ha experimentado cambio de clase, que comprende en su genoma una secuencia de cadena ligera V/J reorganizada sencilla unida operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera endógeno, en donde la cadena ligera V/J reorganizada sencilla comprende mutaciones somáticas en comparación con una secuencia de cadena ligera V/J reorganizada sencilla unida operativamente a un gen de la región constante de cadena ligera endógeno encontrado en el genoma de la línea germinal del animal no humano.

Producción de animales genéticamente modificados

En el presente documento también se divulgan métodos para obtener un animal no humano como se divulga en el presente documento. Dichos métodos comprenden (a) desactivación o deleción del dominio C^h1, y opcionalmente la(s) región(es) bisagra, de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina del animal no humano, tal como el locus de cadena pesada de IgG, introduciendo un ácido nucleico que codifica un locus de cadena ligera reorganizado modificado por ingeniería genética, y provocando que el animal exprese el locus de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene un dominio C^h1 desactivado y/o el locus de cadena ligera genéticamente reorganizado (ULC).

Las modificaciones genéticas para obtener un animal que exprese una proteína de unión de dominio único se describen convenientemente en el presente documento utilizando el ratón como un ejemplo, aunque dichas modificaciones pueden adaptarse fácilmente y aplicarse a otros animales. Un animal genéticamente modificado de acuerdo con la invención puede obtenerse de una diversidad de maneras, cuyos aspectos particulares se discuten más adelante.

En la FIG. 1 se proporciona una ilustración esquemática ilustrativa (no a escala) de un locus de IgG1 (parte superior) para mostrar la disposición del dominio Ch en el locus de IgG1. Como se ilustra, los dominios Ch1, Ch2, y Ch3 y la regiones bisagra se presentan en tramos fácilmente identificables de nucleótidos en dirección 3' de una región de cambio.

Un animal no humano genéticamente modificado, por ejemplo, ratón, que carece de una secuencia de nucleótidos funcional que codifica un dominio Ch1 de una IgG1 pero que contiene una región bisagra puede obtenerse por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede producirse un vector de mutagénesis dirigida que reemplace el gen de IgG1 por una IgG1 truncada que carece de un dominio Ch1 pero que contiene la bisagra. En un ejemplo, el genoma de un ratón se modifica por una construcción de mutagénesis dirigida que tiene un brazo de homología 5' (con respecto a la dirección de transcripción del gen de IgG1 genómico) que contiene la secuencia en dirección 5' del dominio Ch1 endógeno, seguido de secuencias de nucleótidos que codifican una bisagra de IgG1, un dominio Ch2 de IgG1, un dominio Ch3 de IgG1, un casete de selección de fármaco (por ejemplo, un gen de resistencia con lox), y un dominio de transmembrana de IgG1, y un brazo de homología 3' que contiene secuencias en dirección 3' con respecto al dominio de transmembrana. Tras la recombinación homóloga en el locus y la eliminación del casete de selección de fármaco (por ejemplo, por tratamiento con Cre), el IgG1 endógeno se reemplaza por un IgG1 que carece de un domino Ch1 (FIG. 3) (IgGIACHl; I). En algunos aspectos, la estructura de los locus resultantes, que expresarán una IgG1 tiene una secuencia de la región J fusionada a la secuencia de bisagra.

Un animal no humano genéticamente modificado, por ejemplo, ratón, que carece de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio Ch1 de una IgG1 y que carece de una secuencia de nucleótidos que codifica una región bisagra puede obtenerse por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, puede producirse un vector de mutagénesis dirigida que reemplace el gen de IgG1 por una IgG1 truncada que carece de una secuencia que codifica un dominio Ch1 y que carece de una secuencia que codifica la región bisagra. En otro aspecto, el genoma de un ratón se modifica por una construcción de mutagénesis dirigida que tiene un brazo de homología 5' (con respecto a la dirección de transcripción del gen de IgG1 genómico) que contiene la secuencia en dirección 5' del dominio Ch1 endógeno, seguido de secuencias de nucleótidos que codifican un dominio Ch2 de IgG1, un dominio Ch3 de IgG1, un casete de selección de fármaco (por ejemplo, un gen de resistencia con lox), y un dominio de transmembrana de IgG1, y un brazo de homología 3' que contiene secuencias en dirección 3' con respecto al dominio de transmembrana. Tras la recombinación homóloga en el locus y la eliminación del casete de selección de fármaco (por ejemplo, por tratamiento con Cre), el gen de IgG1 endógeno se reemplaza por un gen de IgG1 que carece de una secuencia que codifica domino Ch1 (FIG.3) (IgGIACHl&bisagra; II). En algunos aspectos, la estructura del locus resultante expresará una IgG1 que tiene una secuencia de la región J fusionada al dominio CH2.

Un animal no humano genéticamente modificado, por ejemplo, ratón, que carece de una secuencia de Ch1 de IgG1 (IgGIACHl), o que carece de una secuencia Ch1 de IgG1 y que carece de una bisagra (IgGIACHl&bisagra), además puede modificarse para favorecer el uso del isotipo IgG1 modificado por deleción de uno u otros más isotipos IgG, por ejemplo, IgG2b e IgG2a/IgG2c y uno u otros más isotipos de Ig, por ejemplo, IgD, IgA y/o IgE, por deleción o inutilizando funcionalmente secuencias que codifican estos isotipos. Por ejemplo, se produce una construcción de mutagénesis dirigida que tiene un brazo de homología 5' que contiene secuencia en dirección 5' de la secuencia de la región bisagra endógena (o en dirección 5' de la secuencia de dominio Ch1 endógeno), secuencias que codifican los dominios Ch2 y Ch3 de IgG1, un casete de selección de fármaco seguido de una secuencia que codifica el dominio de transmembrana de IgG1, seguido de otro casete de selección de fármaco si se desea, y un brazo de homología 3' que contiene secuencias en dirección 3' con respecto al gen IgG2a/c. Tras la recombinación homóloga en el locus y la eliminación del(de los) casete(s) de selección de fármaco (por ejemplo, por tratamiento con Cre), el locus constante de cadena pesada endógeno contiene únicamente dos genes de IgG: uno de IgG3 endógeno y el IgGIACHl o IgGIACHl&bisagra. (FIG. 3) (IgG1ACHlAIgG2b/2a; III o IgGIACHl&bisagra AIgG2b/2a; IV).

Un animal modificado por ingeniería genética como se ha descrito anteriormente se puede modificar más para comprender una deleción o una mutación de desactivación en los segmentos génicos de IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3, IgD, IgA y/o IgE de un locus de cadena pesada. Por ejemplo, se puede producir un vector de mutagénesis dirigida que suprima la secuencia del gen de la región constante del locus de cadena pesada. En un ejemplo, el genoma de un ratón se modifica por una construcción de mutagénesis dirigida que tiene un brazo de homología 5' (con respecto a la dirección de transcripción de la secuencia del gen de la región constante genómica) que contiene la secuencia en dirección 5' del dominio de IgM endógeno, seguido de secuencias de nucleótidos que codifican un casete de selección de fármaco (por ejemplo, un gen de resistencia con lox) y un brazo de homología 3' que contiene secuencia en dirección 3' del segmento génico de IgA. Tras la recombinación homóloga en el locus y la eliminación del casete de selección de fármaco (por ejemplo, por tratamiento con Cre), la región constante endógena se somete a deleción y/o se reemplaza por un marcador seleccionable. (FIG. 4C). El animal puede modificarse más con un vector de mutagénesis dirigida producido para reintroducir un segmento génico de IgM y un gen de IgG1 que carece de una secuencia de dominio Ch1 funcional y opcionalmente carece de una región bisagra funcional. (FIG.4D). En un ejemplo, el genoma de un animal se modifica por una construcción de mutagénesis dirigida que tiene un brazo de homología 5' que contiene secuencia en dirección 5' del gen marcador seleccionable, seguido de secuencias de nucleótidos que codifican una región constante de IgM completa y una región constante de IgG1 que carece de un dominio Ch1 funcional, y opcionalmente que carece de una bisagra funcional, un casete de selección de fármaco (por ejemplo, un gen de resistencia con lox), y un brazo de homología 3' que contiene secuencia en dirección 3' con respecto al marcador seleccionable. Tras la recombinación homóloga en el locus y la eliminación del casete de selección de fármaco (por ejemplo, por tratamiento con Cre), se reintroduce un segmento génico de IgM y un gen de IgG1 que carece de una secuencia de dominio Ch1 funcional y opcionalmente carece de una región bisagra funcional. (FIG. 3) (IgG1 ACh1 AIgG2b/2aAIgG3AIgD/A/E (opcionalmente Abisagra); V). También se divulgan otras manipulaciones de loci de inmunoglobulina endógenos, por ejemplo, deleciones o mutaciones de desactivación de región(es) Ch1 de diferentes isotipos de inmunoglobulina no IgM.

Además de la manipulación genética que introduce una deleción o una desactivación dentro de un dominio Ch1 y, opcionalmente una bisagra, de una región constante de inmunoglobulina no IgM mediante el diseño de una construcción de región constante apropiada y la introducción de dicha construcción en el locus por recombinación homóloga como se ha descrito anteriormente, pueden realizarse una deleción o una desactivación en un CH1 de no IgM por otros métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, una deleción de Ch1 de no IgM condicional que se induce en un ratón únicamente tras la inmunización con antígeno, etc. En la técnica se conocen métodos para la desactivación condicional de loci.

La modificación genética del locus de cadena pesada como se ha descrito anteriormente puede también comprender reemplazo de uno o más, básicamente todos, o todos los segmentos génicos variables de cadena pesada endógenos, por ejemplo, segmentos génicos Vh, segmentos génicos Dh y/o segmentos génicos Jh con (a) segmentos génicos Vh, segmentos génicos Dh y/o segmentos génicos Jh humanos, que pueden reorganizarse o ser capaces de experimentar reorganización para codificar proteínas de unión que tienen idiotipos humanos, (b) segmentos génicos variables de cadena ligera, por ejemplo, segmentos génicos V de cadena ligera y/o segmentos génicos J de cadena ligera, que pueden reorganizarse o ser capaces de experimentar reorganización para codificar cadenas polipeptídicas de inmunoglobulina que tienen una región variable de cadena ligera unida a una región constante de cadena pesada que carece de un dominio Ch1 funcional, por ejemplo, las proteínas de unión de dominio único Vl, por ejemplo, una proteína de unión a antígeno de dominio único que comprende una región variable de cadena ligera, o (c) segmentos génicos variables de cadena ligera humanos, por ejemplo, segmentos génicos V de cadena ligera humanos y/o segmentos génicos J de cadena ligera humanos, que pueden reorganizarse o ser capaces de experimentar reorganización para codificar cadenas polipeptídicas de inmunoglobulina que tienen una región variable de cadena ligera humana unida a una región constante de cadena pesada que carece de un dominio Ch1 funcional, por ejemplo, las proteínas de unión de dominio único Vl, por ejemplo, una proteína de unión a antígeno de dominio único que comprende una región variable de cadena ligera humana que tiene idiotipos humanos.

En la FIG. 14 se divulga una ilustración esquemática (no a escala) de loci de una cadena pesada de ratón y una cadena ligera k humana para mostrar los aproximadamente 200 segmentos génicos variables de cadena pesada (Vh), 13 segmentos génicos de diversidad de cadena pesada (Dh) y 4 segmentos génicos de unión de cadena pesada (Jh) así como los potenciadores (Enh) y las regiones constantes de cadena pesada (Ch) del locus de ratón, y los aproximadamente 76 segmentos génicos Vk, 5 segmentos génicos Jk, un potenciador intrónico (Enh) y una región constante sencilla (Ck) de un locus k humano.

En la FIG. 15 se muestra una ilustración esquemática (no a escala) para insertar segmentos génicos k humanos en un locus de cadena pesada murino, que se modificó por recombinación homóloga para desactivar el locus de cadena pesada de ratón endógeno por deleción dirigida de segmentos génicos mVH, mDH y mJH. Como se muestra en la FIG.

15, pueden utilizarse cuatro vectores de mutagénesis dirigida separados para insertar progresivamente segmentos génicos Vk humanos y segmentos génicos Jk humanos dentro del locus de cadena pesada de ratón desactivado utilizando técnicas moleculares convencionales reconocidas en la técnica. Los segmentos génicos k humanos utilizados para la modificación por ingeniería genética de las cuatro construcciones de mutagénesis dirigida se pueden encontrar de manera natural en el cóntigo proximal del locus de cadena ligera k humano de la línea germinal.

Se puede obtener un ratón genéticamente modificado que comprenda una cadena ligera reorganizada modificada por ingeniería genética por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede producir un vector de mutagénesis dirigida que reemplace los segmentos génicos V y J variables de cadena ligera no reorganizados endógenos de un locus de cadena ligera endógeno con un gen V:J reorganizado sencillo, o el locus de cadena ligera no reorganizado entero por un locus de cadena ligera modificado por ingeniería genética que comprende un gen V:J reorganizado sencillo unido a una región constante de cadena ligera.

En otro aspecto, un animal no humano como se describe en el presente documento se modifica más por ingeniería genética para comprender una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica ADAM 6 (ADAM6a y/o ADAM6b), un fragmento funcional, homólogo u ortólogo de la misma. En algunos aspectos, un locus de cadena pesada de un animal no humano como se describe en el presente documento se modifica más por ingeniería genética para comprender una secuencia de nucleótidos ectópica que codifica ADAM6 de ratón (ADAM6a y/o ADAM6b), un fragmento funcional, homólogo u ortólogo de la misma. En diversos aspectos, la proteína ADAM6 es funcional en un animal macho no humano. Métodos y composiciones para la modificación por ingeniería genética de dichos animales no humanos se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos n.° 8.642.835.

En algunos aspectos, el animal genéticamente modificado como se ha descrito anteriormente, y otros, se obtienen introduciendo una construcción de mutagénesis dirigida en una célula CME adecuada (en uno o más mutagénesis dirigidas independientes), y se identifican y se cultivan clones positivos que comprenden un marcador o casete de selección de la construcción de mutagénesis dirigida. A continuación, los clones se emplean como células CME donantes en un embrión hospedador en condiciones adecuadas para obtener un animal quimérico o un animal derivado totalmente de la célula CME. El marcador o el casete de selección opcionalmente se puede eliminar, en la fase de célula madre embrionaria o en el ratón derivado de célula CME o quimérico, por ejemplo, empleando un casete con lox y cruzando con una cepa que contiene Cre, o por electroporación de la célula CME con un vector de expresión de Cre. Por consiguiente, en algunos aspectos, la modificación genética se da en la línea germinal del animal.

En algunos aspectos, el método para obtener un animal como se divulga en el presente documento comprende cruzar un primer animal capaz de producir una proteína de unión a antígeno de dominio único, por ejemplo, un primer animal que comprende en su línea germinal un locus de cadena pesada de IgG que carece de un dominio C^h1 funcional, con un segundo animal capaz de producir una cadena ligera reorganizada modificada por ingeniería genética, por ejemplo, un segundo animal que comprende en su línea germinal un locus de cadena ligera modificado por ingeniería genética que tiene una región variable V:J reorganizada unida operativamente a una región constante de cadena ligera, para producir un animal modificado por ingeniería genética F1, en donde el animal F1 comprende el locus de cadena pesada de IgG del primer animal y el locus de cadena ligera del segundo animal. El cruce puede hacerse por cría animal o de otro modo combinación de gametos, incluidas las manipulaciones in vitro.

Para los animales no humanos cuyas células CME genéticamente modificables adecuadas no estén fácilmente disponibles, se emplean métodos distintos de los descritos en el presente documento para obtener un animal no humano que comprenda la modificación genética. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, modificar el genoma de una célula no CME (por ejemplo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y emplear la transferencia nuclear para transferir el genoma modificado a una célula adecuada, por ejemplo, un oocito, y gestar la célula modificada (por ejemplo, el oocito modificado) en un animal no humano en las condiciones adecuadas para formar un embrión.

Producción de proteínas de unión a antígeno de dom inio único

Una vez que se obtiene el animal modificado por ingeniería genética capaz de producir proteínas de unión a antígeno de dominio único y una cadena ligera reorganizada sencilla modificada por ingeniería genética, se pueden obtener fácilmente inmunoglobulinas y preparaciones de proteína de unión frente a un antígeno inmunizando el animal con el antígeno. "Composición antisuero policlonal" como se utiliza en el presente documento incluye preparaciones de proteína de unión policlonales purificadas para la afinidad.

En un aspecto, se divulga un método para producir una proteína de unión que carece de un dominio C^h1, que comprende: (a) inmunizar un animal no humano como se describe en el presente documento con un antígeno; (b) mantener el animal no humano bajo condiciones suficientes para que el animal no humano produzca una proteína de unión; (c) identificar una proteína de unión producida por el ratón que carece de un dominio C^h1 funcional y/o carece de una región bisagra funcional; y, (d) aislar del animal no humano la proteína de unión, una célula que produce la proteína de unión, o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de la proteína de unión.

Se pueden utilizar una diversidad de antígenos para inmunizar un animal transgénico. Dichos antígenos incluyen, pero sin limitación, proteínas celulares, microorganismos, por ejemplo, virus y organismos unicelulares (tales como bacterias y hongos), vivos, atenuados o muertos, fragmentos de los microorganismos, o moléculas antigénicas aisladas de los microorganismos.

Los antígenos pueden administrarse a un animal transgénico de una manera conveniente, con o sin un adyuvante y pueden administrarse de acuerdo con una pauta predeterminada.

Para producir una proteína de unión monoclonal, se aislaron células del bazo del animal transgénico inmunizado y se utilizaron en fusión celular con líneas celulares transformadas para la producción de hibridomas, o se clonaron los ADN que codificaban anticuerpos por técnicas biológicas moleculares convencionales y se expresaron en células transfectadas. Los procedimientos para fabricar anticuerpos monoclonales son bien establecidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Europea 0 583 980 A1 ("Method For Generating Monoclonal Antibodies From Rabbits"), la Patente de Estados Unidos n.° 4.977.081 ("Stable Rabbit-Mouse Hybridomas And Secretion Products Thereof'), el documento WO 97/16537 ("Stable Chicken B-cell Line And Method of Use Thereof'), y el documento EP 0 491 057 B1 ("Hybridoma Which Produces Avian Specific Immunoglobulin G"). La producción in vitro de anticuerpos monoclonales de moléculas de ADNc clonadas se han descrito en Andris-Widhopf et al, "Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display", J. Immunol Methods 242:159 (2000), y en Burton, D.R., "Phage display", Immunotechnology 1:87 (1995).

Una vez que se han generado proteínas de unión a anticuerpo de dominio único monoclonales, tales proteínas de unión pueden convertirse fácilmente en proteínas de unión totalmente humanas utilizando técnicas biológicas moleculares convencionales, si se desea. Las proteínas de unión monoclonales totalmente humanas no son inmunogénicas y son apropiadas para su uso en el tratamiento terapéutico de sujetos humanos.

Por tanto, en un aspecto, en donde la proteína de unión a antígeno de dominio único comprende una región Vh humana o una Vl humana y una región constante de cadena pesada de ratón que comprende una deleción o una mutación de desactivación en un dominio Ch1 de no IgM, la secuencia del dominio Vh o Vl de la proteína de unión a antígeno de dominio único puede clonarse en dirección 5' de una región constante humana, que opcionalmente carece de un dominio Ch1 en un vector de expresión adecuado dando como resultado una construcción de expresión que codifica proteína de unión a antígeno de dominio único totalmente humana que puede expresarse en una célula adecuada, por ejemplo, la célula normalmente para la expresión de anticuerpo, por ejemplo, célula eucariota, por ejemplo, una célula c Ho .

Por consiguiente, en el presente documento también se describen células productoras de proteína de unión monoclonal derivadas de animales genéticamente modificados como se divulga en el presente documento, así como ácidos nucleicos derivados de las mismas. También se describen hibridomas derivados de las mismas. También se describen proteínas de unión de dominio único totalmente humanas, así como ácidos nucleicos codificantes, derivados de las mismas.

También se pueden utilizar las proteínas de unión a antígeno de dominio único descritas en el presente documento para producir anticuerpos biespecíficos. Una ventaja de las proteínas de unión a antígeno de dominio único descritas en el presente documento es la capacidad de producir anticuerpos biespecíficos por heterodimerización de cadenas pesadas con especificidad para dos epítopos diferentes en una terapéutica sencilla.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir a los expertos en la materia cómo preparar y usar los métodos y composiciones de la invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. Los Ejemplos no incluyen descripciones detalladas de métodos convencionales que serían bien conocidos por los expertos en la materia (técnicas de clonación molecular, etc.).

Ejemplo 1: Ratones que codifican una proteína de unión de dom inio único V^h: Ratones que comprenden cadena de inmunoglobulina que tiene una región variable de cadena pesada y una región constante de cadena pesada que carece de un dominio Ch1 funcional, y que comprende una cadena ligera reorganizada sencilla (ULC).

Ejemplo 1.1: Generación de animales

Se obtuvieron ratones genéticamente modificados para comprender un locus de cadena pesada que comprende una secuencia del gen de IgM completo y funcional y una secuencia del gen de IgG1 que carece de una secuencia del gen de Ch1 funcional, y opcionalmente carece de una región bisagra funcional (FIG. 1A), de acuerdo con los métodos descritos en el documento US2011/0145937, Macdonald et al. Se obtuvieron varias versiones de ratones que carecían de diferentes combinaciones de secuencias del gen constante de cadena pesada y contenían de deleción de dominio(s) Ch1 pero comprendían una IgM completa y funcional (FIG. 3). Por ejemplo, se obtuvieron ratones homocigotos para un locus de cadena pesada que comprende segmentos génicos variables de cadena pesada de ratón y una secuencia del gen de IgM completa y funcional y una secuencia del gen de IgG1 que carece de una secuencia del gen de Ch1 completa y funcional (mVHlgGIACHl&bisagra; 1576 HO, "II" en las FIGs. 3 y 4B). Adicionalmente, se obtuvieron ratones homocigotos para un locus de cadena pesada que comprende segmentos génicos variables de cadena pesada humanos y una secuencia del gen de IgM completa y funcional, una secuencia del gen de IgG1 que carece de una secuencia del gen de Ch1 funcional y región bisagra, y que carece de las secuencias del gen de IgG2b e IgG2a (hVHIgG1ACHl&bisagraAIgG2b/2a; 1859 HO, véase, por ejemplo, "IV" en la FIG. 3). Adicionalmente, se obtuvieron ratones homocigotos para un locus de cadena pesada que comprende segmentos génicos variables de cadena pesada humanos y una secuencia del gen de IgM completa y funcional, una secuencia del gen de IgG1 que carece de una secuencia del gen de Ch1 funcional, y que carece de las secuencias del gen de IgG2b e IgG2a (hVHIgG1ACH1AIgG2b/2a; 1673 HO, véase, por ejemplo, "III" en las FIGs. 3 y 4A). Adicionalmente, se obtuvieron ratones homocigotos para un locus de cadena pesada que comprende segmentos génicos variables de cadena pesada humanos y una secuencia del gen de IgM completa y funcional, una secuencia del gen de IgG1 que carece de un Ch1 funcional, y que carece de secuencias del gen de IgD, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgE e IgA (hVHIgG1ACH1AlgG2b/2aAIgG3AIgD/A/E; 6180 HO, véase "V" en las FIGs. 3 y 4C-D). Versiones ilustrativas adicionales de la modificación en la región constante de cadena pesada se presentan en la FIG. 3. Se realizan otras variaciones de combinaciones de deleciones/desactivaciones de Ch1 y/o deleciones/desactivaciones de gen constante de inmunoglobulina, por ejemplo, se obtiene un ratón en donde tanto IgG1 como IgG2a comprenden deleciones del dominio Ch1, y el ratón también comprende una deleción de IgD, IgE, IgG3 e IgG2b. Como se muestra en la FIG. 4, los loci de cadena pesada también pueden modificarse para comprender regiones variables humanas, que pueden ser regiones variables de cadena pesada humanas [o regiones variables de cadena ligera humanas (FIG. 16, véase los Ejemplos 2 y 3 de más adelante)]. Los loci de cadena pesada también pueden modificarse para comprender un gen de Adam 6a, un gen de Adam 6b, o ambos, o un fragmento del gen, en donde el gen o el fragmento del mismo es funcional en un ratón macho (véase, por ejemplo, el documento U.S. 2012/0322108).

La generación de un ratón con cadena ligera común (también denominados ratones con cadena ligera universal o ULC) que comprende una secuencia del gen variable reorganizada sencilla V:J (por ejemplo, ratón con cadena ligera común Vk1-39Jk5 o Vk3-20Jk1) y la generación de anticuerpos específicos a antígeno en aquellos ratones se describe en, por ejemplo, las Solicitudes de Patente de Estados Unidos n.° 13/022.759, 13/093.156, 13/412.936, 13/488.628, 13/798.310 y 13/948.818 (Publicaciones n.° 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300, 2013/0045492, US20130185821 y US20130302836, respectivamente). Específicamente, se obtuvieron ratones que expresaban la cadena ligera kappa Vk1-39Jk5 modificada por ingeniería genética (1633 HO o 1634 HO) o la cadena ligera kappa Vk3-20Jk1 modificada por ingeniería genética (1635 HO o 1636 HO) en su línea germinal.

Ratones VELOCIMMUNE® que contienen una región de cadena ligera de la línea germinal humana reorganizada sencilla (ULC Vk1-39Jk5; 1633 o 1634) o (ULC Vk3-20Jk1; 1635 o 1636) se cruzan con ratones que portan una región constante de IgG modificada. Específicamente, dichos ratones ULC se cruzaron con ratones que tenían una región variable de cadena pesada unida operativamente a una región constante de cadena pesada murina en donde las regiones Ch1 de IgG1 y bisagra de IgG1 estaban delecionadas o desactivadas (mVHlgG1ACH1&bisagra, 1576), ratones que tenían una región variable de cadena pesada humana unida operativamente a una región constante de cadena pesada murina en donde las regiones Ch1 de IgG1 y bisagra de IgG1, y los genes de IgG2a e IgG2b estaban delecionados o desactivados (hVHlgG1ACH1&bisagraAIgG2b/2a; 1859), ratones que tenían una región variable de cadena pesada humana unida operativamente a una región constante de cadena pesada murina en donde las regiones Ch1 de IgG1, y los genes de IgG2a e IgG2b estaban delecionados o desactivados (hVH IgG1ACH1AIgG2b/2a; 1673), o ratones que tenían una región variable de cadena pesada humana unida operativamente a una región constante de cadena pesada murina en donde las regiones Ch1 de IgG1, y los genes de IgG2a e IgG2b, IgD, IgG3, IgE e IgA estaban delecionados o desactivados (hVHlgG1ACH1AIgG2b/2aAIgG3AIgD/A/E; 6180), para obtener los siguientes ratones progenie:

ratones homocigotos mVHlgG1ACH1&bisagra x Vk3-20Jk1 ULC o mVHlgG1ACH1&bisagra x Vk1-39Jk5 ULC (1576HO 1635HO o 1576 HO 1633 HO),

ratones homocigotos hVHlgG1ACH1&bisagraAIgG2b/2a x Vk3-20Jk1 ULC o hVH IgG1ACH1&bisagraAIgG2b/2a x Vk1-39Jk5 ULC (1859 HO 1635 HO o 1859HO 1633HO),

ratones homocigotos hVHlgG1ACH1AIgG2b/2a x Vk3-20Jk1 ULC o hVHlgG1ACH1AIgG2b/2a x Vk1-39Jk5 ULC /1673HO 1635 HO o 1673 HO 1633 HO), y

ratones homocigotos hVHlgG1ACH1&bisagraAIgG2a/2bAIgG3AIgD/A/ E x Vk3-20Jk1 ULC o hVHlgG1ACH1&bisagraAIgG2a/2bAIgG3AIgD/A/E x Vk1-39Jk5 ULC (6180 HO 1635 HO o 6180 HO 1634 HO).

Otras versiones de los ratones que comprenden una deleción o una mutación de desactivación en un dominio CH1 y una deleción o una mutación de desactivación en un gen de la región constante de inmunoglobulina se cruzan con ratones que contienen una región de cadena ligera de la línea germinal humana reorganizada sencilla como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 1.2: Inmunización de ratones con antígeno y expresión de proteínas de unión de dominio único.

Se inmunizaron ratones homocigotos para las modificaciones con diferentes antígenos y reforzaron por diferentes vías utilizando una variedad de adyuvantes. Los títulos para las respuestas específicas a IgG1 se evaluaron por ELISA o transferencia western.

Como se muestra en la FIG. 5A , los ratones homocigotos para tanto modificaciones de ACH1/bisagra como ULC de IgG1 presentan expresión aumentada de la cantidad total de IgG1 en el suero tanto antes como después de la inmunización, en comparación con un ratón que tiene solo IgG1 ACh1. Los títulos mayores en ratones ACH1/bisagra x ULC sugieren que la presencia de cadena ligera universal aumenta la probabilidad de generar una proteína de unión a antígeno de dominio único específica a antígeno. Fig. 5B.

La FIG.7 demuestra que pueden obtenerse títulos altos con diferentes versiones de ratones modificados por ingeniería genética para comprender modificaciones de ACh1 y ULC.

Adicionalmente, Las FIGs. 6 y 8 muestran que las proteínas de unión a antígeno de dominio único están presentes y pueden aislarse de ratones que comprenden tanto región variable de cadena pesada humana con una deleción en una región Ch1 como una cadena ligera reorganizada sencilla (cadena ligera universal).

Ejemplo 1.3: Desarrollo y maduración de linfocitos B en ratones que expresan proteínas de unión de dominio único y una cadena ligera reorganizada sencilla (ULC)

Se analizaron los contenidos de linfocitos B de los compartimentos del bazo, sangre y médula ósea de ratones homocigotos para un dominio C^h1 modificado y una cadena ligera reorganizada sencilla (ULC) (véase la FIG. 2) para la progresión a través del desarrollo de los linfocitos B y la maduración de los linfocitos B utilizando citometría de flujo de diferentes marcadores de superficie celular como se indica en el presente documento.

Resumiendo, los ratones ULC y los ratones homocigotos con un dominio C^h1 modificado y una cadena ligera reorganizada se sacrificaron y se extrajo sangre, el bazo y la médula ósea. La sangre se recogió en tubos Microtainer con EDTA (BD Biosciences). La médula ósea se recogió de fémures lavando por descarga con medio RPMI completo (medio RPMI complementado con suero fetal de ternera, piruvato de sodio, Hepes, 2-mercaptoetanol, aminoácidos no esenciales, y gentamicina). Los RBC de preparaciones de bazo y de médula ósea se lisaron con tampón de lisis ACK (Lonza Walkersville), seguido de lavado con medio RPMI completo.

Se incubaron (1x106) con anti-CD16/CD32 de ratón (2.4G2, BD) sobre hielo durante diez minutos, seguido de marcado con los siguientes anticuerpos durante treinta minutos sobre hielo: anti-CD19 de ratón conjugado con APC-H7 (clon 1D3, BD), anti-CD3 de ratón conjugado con Pacific Blue (clon 17A2, BIOLEGe Nd®), PeCy7-IgM (II/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BIOLEGEND®), APC-eFluor 780-B220 (RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-CD19 (MB19-1, EBIOSCIENCE®), PE-CD93 (AA4.1, BIOLEGEND®), FITC-CD23 (B3B4, BD), APC-CD21/CD35 (7G6, BD). Médula ósea: linfocitos B inmaduros (B220intIgM+), linfocitos B maduros (B220hiIgM+). Sangre y bazo: linfocitos B (CD19+), linfocitos B maduros (CD19+IgMintIgDhi), linfocitos B transicionales/inmaduros (CD19+IgMhiIgDint).

Después de la tinción, las células se lavaron y fijaron en formaldehído al 2 %. La adquisición de datos se realizó en un citómetro de flujo LSRII y se analizaron con el programa informático FLOWJO™ (Tree Star, Inc). La FIG. 9 muestra que estos ratones tienen niveles de IgM e IgG en estado de reposo en suero normales. Las FIGs. 10 y 11 muestran los resultados para el compartimento esplénico, demostrando números de linfocitos B casi normales y maduración de linfocitos B casi normal en el bazo. Las FlG. 12 y 13 muestran los resultados para el compartimento de médula ósea, demostrando números de linfocitos B normales y desarrollo de linfocitos B casi normal en la médula ósea.

Ejemplo 2: Ratones que codifican una proteína de unión de dom inio único V^l: Ratones que comprenden una cadena de inm unoglobulina que tiene una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena pesada que carece de un dom inio C^h1 funcional.

Ejemplo 2.1: Generación de animales

Se generó un ratón que tenía segmentos génicos de cadena ligera introducidos en un locus de cadena pesada como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos n.° 2012/0096572. Específicamente, se produjeron diferentes construcciones de mutagénesis dirigida utilizando tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® para modificar bibliotecas de cromosoma artificial bacteriano (BAC) (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 6.586.251 y Valenzuela, D.M., Murphy, A.J., Frendewey, D., Gale, N.W., Economides, A.N., Auerbach, W., Poueymirou, W.T., Adams, N.C., Rojas, J., Yasenchak, J., Chernomorsky, R., Boucher, M., Elsasser, A.L., Esau, L., Zheng, J., Griffiths, J.A., Wang, X., Su, H., Xue, Y., Domínguez, M. G., Noguera, I., Torres, R., Macdonald, L.E., Stewart, A.F., DeChiara, T.M., Yancopoulos, G.D. (2003). "High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis". Nat. Biotechnol 21,652-659). Se modificó el ADN de BAC de ratón por recombinación homóloga para desactivar el locus de cadena pesada de ratón endógeno por deleción dirigida de segmentos génicos V^h, D^hy J^hpara la consiguiente inserción de secuencias del gen de cadena ligera k de la línea germinal humana no reorganizadas (parte superior de la FIG. 15).

Resumiendo, el locus de cadena pesada de ratón se sometió a deleción en dos sucesos de mutagénesis dirigida sucesivos utilizando recombinación mediada por recombinasa. El primer suceso de mutagénesis dirigida incluía mutagénesis dirigida en el extremo 5' del locus de cadena pesada de ratón utilizando un vector de mutagénesis dirigida que comprendía de 5' a 3' un brazo de homología de ratón 5', un sitio de reconocimiento de recombinasa, un casete de neomicina y un brazo de homología 3'. Los brazos de homología 5' y 3' contenían secuencia 5' del locus de cadena pesada de ratón. El segundo suceso de mutagénesis dirigida incluía mutagénesis dirigida en el extremo 3' del locus de cadena pesada de ratón en la región de los segmentos génicos J^hutilizando un segundo vector de mutagénesis dirigida que contenía de 5' a 3' un brazo de homología de ratón 5', un sitio de reconocimiento de recombinasa 5', un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa, un casete de higromicina, un tercer sitio de reconocimiento de recombinasa, y un brazo de homología de ratón 3'. Los brazos de homología 5' y 3' contenían secuencia flanqueante de los segmentos génicos J^hde ratón y 5' de potenciador intrónico y las regiones constantes. Las células CME positivas que contenían un locus de cadena pesada modificado dirigido con ambos vectores de mutagénesis dirigida (como se ha descrito anteriormente) se confirmaron por cariotipificación. A continuación, se aisló ADN de las células CME doblemente dirigidas y se sometió a tratamiento con una recombinasa mediando así la deleción del ADN genómico del locus de cadena pesada de ratón entre el sitio de reconocimiento de recombinasa 5' en el primer vector de mutagénesis dirigida y el sitio de reconocimiento de recombinasa 5' en el segundo vector de mutagénesis dirigida, dejando un sitio de reconocimiento de recombinasa sencillo y el casete de higromicina flanqueado por dos sitios de reconocimiento de recombinasa (véase la parte superior de la FIG. 15). Por tanto, se creó un locus de cadena pesada de ratón modificado que contenía genes de C^hintactos para la inserción progresiva de segmentos génicos k de la línea germinal humanos de una manera precisa utilizando vectores de mutagénesis dirigida como se esboza en la FIG. 15.

Se modificaron por ingeniería genética cuatro vectores de mutagénesis dirigida separados para insertar progresivamente 4o segmentos génicos Vk humanos y cinco segmentos génicos Jk humanos en el locus de cadena pesada de ratón desactivado (anteriormente descrito) (FIG. 15). Los segmentos génicos k humanos utilizados para la creación por ingeniería genética de las cuatro construcciones de mutagénesis dirigida se encuentran de manera natural en el cóntigo proximal del locus de cadena ligera k humano de la línea germinal (FIG. 14B).

Se cruzaron ratones heterocigotos para dichos loci de cadena pesada modificados para obtener un ratón homocigoto para el locus de cadena pesada como se ha descrito anteriormente. Las células madre embrionarias que comprenden dichos loci de cadena pesada modificados que comprenden segmentos génicos de la región variable de cadena ligera se modificaron de acuerdo con el esquema proporcionado en la FIG. 16 y utilizando los métodos descritos en la Publicación de Patente de Estados Unidos n.° US2011/0145937, Macdonald et al., para obtener ratones homocigotos para un locus de cadena pesada que comprende una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena pesada que carece de un dominio C^h1 funcional en el gen de IgG1, y carece además los genes de IgG2b e IgG2a.

Por tanto, la línea germinal de los ratones con loci de cadena pesada modificados que comprenden segmentos génicos de la región variable de cadena ligera descritos, por ejemplo, en el documento US 2012/0096572, se modificaron más utilizando vectores de mutagénesis dirigida como se describen en la FIG. 16 para modificar el locus de cadena pesada de modo que el segmento génico de IgG1 carece de un dominio C^h1 y los genes de IgG2a e IgG2b se someten a deleción para obtener ratones homocigotos para una proteína de unión a antígeno de dominio único que comprende un dominio variable kappa humano y una región constante de IgG1 murina, en donde el dominio constante de IgG1 carece de una región C^h1 funcional (hVKlgG1ACHlAIgG2a AIgG2b; 6082 HO). Se realizan variaciones adicionales de combinaciones de deleciones de CH1 y/o deleciones del gen constante de inmunoglobulina, por ejemplo, se obtiene un ratón que comprende un locus de cadena pesada que comprende una región variable de cadena ligera kappa humana en donde tanto IgG1 como IgG2a comprenden deleciones de dominio CH1, y el ratón también comprende una deleción de IgD, IgE, IgG3 e IgG2b.

La transferencia Western ha confirmado que las proteínas de unión de dominio único con solo cadena ligera están presentes y pueden aislarse de ratones genéticamente modificados para comprender un dominio variable kappa humano y una región constante de IgG1 murina, en donde el dominio constante de IgG1 carece de una región C^h1 funcional (6082 HO, datos no mostrados).

Ejemplo 2.2: Confirmación de la reorganización productiva de secuencias de gen que codifican proteínas de unión de dominio único VL

Se aisló el ARNm de linfocitos B del bazo y la médula ósea de (a) ratones homocigotos para un locus de cadena pesada que comprende una región variable de cadena ligera y una secuencia del gen constante de cadena pesada que carece de un dominio C^h1 funcional en el gen de IgG1, y carece además los genes de IgG2b e IgG2a, (b) tipo silvestre control y (c) ratones homocigotos C^h1 del x ULC control para un locus de cadena pesada de ratón modificado que expresa segmentos V, D y J de cadena pesada humanos, carece de un dominio C^h1 funcional en los genes de IgG1, y también carece de genes de IgG2b e IgG2a funcionales y comprende un locus de cadena ligera reorganizada sencilla también denominada cadena ligera común o universal, véase, por ejemplo, la publicación de Patente de Estados Unidos N.° 2011/0195454. Se analizó la reorganización productiva en el ARNm aislado utilizando las siguientes sondas y cebadores en una prueba TAQMAN:

hJk/mIgG1 bisagra-conjunto 71 (solicitado a Biosearch Technologies)

(codificante) 5'-GGACCAAGCTGGAGATCAAAC-3' (SEQ ID NO:1),

(no codificante) 5'-CTTCTGGGACTGTACATATGCAA-3' (SEQ ID NO:2),

(sonda) 5'-FAMCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCBHQ1-3' (SEQ ID NO:3);

hJk/mIgG1 bisagra-conjunto 72 (solicitado a Applied Biosystems)

(codificante) 5'-TGGTCACCGTCTCCTCAGTG -3' (SEQ ID NO:4),

(no codificante) 5'-CACACGTGACCTTAGGAGTCAGAG -3' (SEQ ID NO:5),

(sonda) 5'-FAMTGGTTGTAAGCCTTGC -MGB-3' (SEQ ID NO:6);

mHPRT1-conjunto 51 (soicitado a Biosearch Technologies)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un roedor genéticamente modificado que comprende en su línea germinal

(a) una deleción de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio Ch1 de al menos un gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, en donde el al menos un gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno es de IgG, IgA, IgE, IgD o una combinación de los mismos, y (b) un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina Vl/Jl reorganizada sencilla que comprende las secuencias de segmento génico Vl y Jl, en donde la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina Vl/Jl reorganizada sencilla está unida operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina y, opcionalmente,

(c) una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos un segmento génico de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl) no reorganizada y al menos un segmento génico de unión de cadena ligera de inmunoglobulina (Jl) no reorganizada, en donde los segmentos génicos Vl y Jl no reorganizados son capaces de recombinarse para formar una secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl/Jl) reorganizada unida operativamente al gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la deleción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio Ch1,

en donde el roedor además comprende en su suero una proteína de unión a antígeno de domino único específica a antígeno que carece de un dominio Ch1 funcional, opcionalmente en donde la proteína de unión a antígeno de dominio único es una proteína de unión de dominio único Vl codificada por la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl/Jl) reorganizada unida operativamente al gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la deleción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio Ch1,

en donde el roedor además comprende una cadena pesada de IgM que comprende un dominio Ch1 funcional, y en donde la cadena pesada de IgM está asociada a una cadena ligera universal cognada codificada por la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina Vl/Jl reorganizada sencilla que comprende las secuencias de segmento génico Vl y Jl unidas operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina.

2. El roedor genéticamente modificado de la reivindicación 1, en donde:

(a) el al menos un segmento génico VL no reorganizado, el al menos un segmento génico JL no reorganizado, y/o la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina Vl/Jl es humano, opcionalmente en donde la secuencia del gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina y/o el gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina son de roedor, o el al menos un segmento génico Vl no reorganizado y el al menos un segmento génico Jl no reorganizado son cada uno un segmento kappa humano; (b) el al menos un segmento génico Vl no reorganizado y el al menos un segmento génico Jl no reorganizado reemplaza uno o más segmentos génicos Vh, Dh, Jh en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, opcionalmente, en donde el al menos un segmento génico Vl no reorganizado y el al menos un segmento génico Jl no reorganizado reemplaza todos los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de roedor endógenos funcionales en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina de roedor endógeno; o

(c) todos los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada endógenos funcionales y/o todos los segmentos génicos de la región variable de cadena ligera endógenos funcionales estaban delecionados o desactivados funcionalmente.

3. El roedor genéticamente modificado de la reivindicación 1, en donde:

(a) la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina VL/JL es una secuencia de gen Vk1-39/J humana, o una secuencia de gen Vk3-20/J humana, opcionalmente en donde la secuencia de gen Vk1-39/J humana comprende una secuencia de gen Vk1-39 humana reorganizada con un segmento génico Jk5 humano o la secuencia de gen Vk3-20/J humana comprende un segmento génico Vk3-20 humano reorganizado con un segmento génico Jk1 humano;

(b) el roedor no comprende la secuencia de ácido nucleico que comprende al menos un segmento génico de la región variable de cadena ligera (Vl) de inmunoglobulina no reorganizado y al menos un segmento génico de unión de cadena ligera (Jl) de inmunoglobulina no reorganizado, en donde los segmentos génicos Vl y Jl no reorganizados son capaces de recombinarse para formar una secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl/Jl) reorganizada unida operativamente al gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la deleción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio Ch1, y

en donde el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno comprende segmentos génicos de la región variable de cadena pesada;

(c) el roedor no comprende la secuencia de ácido nucleico que comprende al menos un segmento génico de la región variable de cadena ligera (Vl) de inmunoglobulina no reorganizado y al menos un segmento génico de unión de cadena ligera (Jl) de inmunoglobulina no reorganizado, en donde los segmentos génicos Vl y Jl no reorganizados son capaces de recombinarse para formar una secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl/Jl) reorganizada unida operativamente al gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la deleción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio Ch1, y

en donde el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno comprende segmentos génicos de la región variable de cadena pesada humanos, opcionalmente en donde los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada reemplazan todos los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógenos;

(d) la secuencia del gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina es una secuencia del gen de la región de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina o una secuencia del gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina;

(e) la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina Vl/Jl reorganizada sencilla reemplaza todos los segmentos génicos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina endógenos; o (f) la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina l/Jl reorganizada sencilla y comprende secuencias de segmento génico Vl de la línea germinal humanas y Jl de la línea germinal humanas.

4. El roedor genéticamente modificado de la reivindicación 1, en donde:

(a) el al menos un gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina además comprende una región bisagra desactivada;

(b) la deleción de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio Ch1 está en una secuencia de IgG1 y en donde el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno además comprende una deleción o una mutación de desactivación de un gen de inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en de IgD, IgG3, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgE, IgA, y una combinación de los mismos, opcionalmente en donde el locus de cadena pesada de inmunoglobulina además comprende una deleción o una mutación de desactivación en los genes de inmunoglobulina IgG2a e IgG2b, los genes de inmunoglobulina IgG2b e IgG2c, o los genes de inmunoglobulina IgG3, IgD, IgA e IgE;

(c) el roedor además comprende un gen de Adam6 o parte del mismo funcional en un roedor macho, en donde el gen de Adam6 es un gen de Adam6a, un gen de Adam6b, o ambos; o

(d) el roedor es una rata o un ratón.

5. El roedor genéticamente modificado de la reivindicación 1, en donde:

(a) el roedor además comprende en su suero una proteína de unión a antígeno de domino único específica a antígeno que carece de un dominio Ch1 funcional, en donde (I) al menos una cadena pesada de la proteína de unión a antígeno de dominio único además carece de una región bisagra funcional, (II) la proteína de unión a antígeno de dominio único tiene un isotipo IgG seleccionado del grupo que consiste en IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c e IgG3, (III) la proteína de unión a antígeno de dominio único comprende un dominio variable humano y un dominio constante no humano, o (IV) la proteína de unión a antígeno de dominio único es monomérica; o

(b) el roedor además comprende en su suero un título alto de una proteína de unión a antígeno de domino único específica a antígeno que carece de un dominio Ch1 funcional; opcionalmente en donde el título de la proteína de unión a antígeno de dominio único específica a antígeno es (I) al menos 1 x 1012 pg/ml, al menos 1 x 103 pg/ml, al menos 1 x 104 pg/ml o al menos 1 x 105 pg/ml, (II) al menos 5 veces más, al menos 10 veces más, al menos 100 veces más que un correspondiente roedor control que no expresa una cadena ligera universal modificada por ingeniería genética codificada por la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera Vl/Jl de inmunoglobulina reorganizada sencilla que comprende secuencias de segmento génico Vl y JLunida operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina, o (III) determinada por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima.

6. Un roedor genéticamente modificado que es un ratón que comprende

(a) un reemplazo en un locus de cadena pesada de ratón de todos los segmentos génicos V, D y J de cadena pesada de inmunoglobulina endógenos funcionales por

(1) al menos un segmento génico Vh de cadena pesada de inmunoglobulina humano reorganizado, al menos un segmento génico DH de cadena pesada de inmunoglobulina humano no reorganizado, y al menos un segmento génico JH de cadena pesada de inmunoglobulina humano no reorganizado, en donde los segmentos génicos VH, DH, y JH de cadena pesada de inmunoglobulina no reorganizada están unidos operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena pesada de ratón, o

(2) al menos un segmento génico Vl de cadena ligera humano no reorganizado, y al menos un segmento génico Jl de cadena ligera no reorganizado humano, en donde los segmentos génicos Vl, y JLde cadena ligera humanos no reorganizados están unidos operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena pesada de ratón, y en donde los segmentos génicos Vl y Jl humanos no reorganizados son capaces de recombinarse para formar una secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (Vl y Jl ) reorganizada unida operativamente a la secuencia del gen de la región constante de cadena pesada de ratón,

en donde la secuencia del gen de la región constante de cadena pesada de ratón comprende un gen de IgM de longitud completa y una deleción de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio C^h1 en un gen de IgG seleccionado entre el grupo que consiste en uno de IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3 y una combinación de los mismos, y

(b) un reemplazo de todos los segmentos génicos V y J de cadena ligera de inmunoglobulina endógenos funcionales por una secuencia del gen de Vk/Jk variable humana reorganizada sencilla, en donde la secuencia del gen de la región variable Vk/Jk humana reorganizada sencilla está unida operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina,

en donde el ratón además comprende en su suero una proteína de unión a antígeno de domino único específica a antígeno que carece de un dominio C^h1 funcional, opcionalmente en donde la proteína de unión a antígeno de dominio único es una proteína de unión de dominio único V^lcodificada por la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera (V^l/J^l) de inmunoglobulina reorganizada unida operativamente a la secuencia del gen de la región constante de cadena pesada de ratón que comprende la deleción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio C^h1,

y en donde el ratón expresa un receptor de linfocitos B que comprende una cadena pesada de IgM asociada a una cadena ligera universal cognada codificada por la secuencia del gen de la región variable Vk/Jk humana reorganizada sencilla que comprende secuencias del segmento génico Vk y Jk unidas operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina.

7. Un método para obtener un roedor genéticamente modificado de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende

(a) modificar al menos una región constante de cadena pesada de roedor en un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno del roedor de modo que la región constante de cadena pesada comprenda una deleción de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio C^h1 de IgG, IgA, IgE, IgD o una combinación de los mismos, y

(b) introducir un locus de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina V^l/J^lreorganizada sencilla que comprende secuencias del segmento génico V^ly J^l, en donde la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera V^l/J^lde inmunoglobulina reorganizada sencilla está unida operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina y opcionalmente

(c) insertar una secuencia de ácido nucleico en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende al menos un segmento génico de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (V^l) no reorganizado y al menos un segmento génico de unión de cadena ligera de inmunoglobulina (J^l) no reorganizado, en donde los segmentos génicos V^ly J^lno reorganizados son capaces de recombinarse para formar una secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (V^l/J^l) reorganizada unida operativamente al gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la deleción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio C^h1.

8. El método de la reivindicación 7, en donde:

(a) la etapa de modificación además comprende deleción o desactivación de una región bisagra de IgG, IgA, IgE, IgD o una combinación de los mismos, que comprende el dominio C^h1 modificado;

(b) la etapa de modificación además comprende reemplazar uno o más segmentos génicos de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógenos del locus de cadena pesada de inmunoglobulina por segmentos génicos de la región variable de cadena pesada humanos de modo que la expresión del locus de inmunoglobulina de cadena pesada da como resultado un dominio variable de cadena pesada que comprende idiotipos humanos, y en donde el método no comprende la etapa de inserción de una secuencia de ácido nucleico en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende al menos un segmento génico de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (V^l) no reorganizado y al menos un segmento génico de unión de cadena ligera de inmunoglobulina (J^l) no reorganizado, en donde los segmentos génicos V^ly J^lno reorganizados son capaces de recombinarse para formar una secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (V^l/J^l) reorganizada unida operativamente al gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la deleción de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio C^h1;

(c) la etapa de inserción comprende reemplazar uno o más segmentos génicos de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógenos del locus de inmunoglobulina de cadena pesada por los segmentos génicos V^ly J^lde cadena ligera no reorganizados de modo que la expresión del locus de cadena pesada de inmunoglobulina da como resultado una proteína de unión de dominio único V^lque comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina y un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que carece de un dominio C^h1;

(d) la etapa de inserción comprende reemplazar uno o más segmentos génicos de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógenos del locus de inmunoglobulina de cadena pesada por los segmentos génicos V^ly J^lde cadena ligera no reorganizados de modo que la expresión del locus de cadena pesada de inmunoglobulina da como resultado una proteína de unión de dominio único Vl que comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina y un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que carece de un dominio Ch1, en donde el gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es de roedor, opcionalmente en donde los segmentos génicos Vl y Jl de cadena ligera no reorganizados son segmentos humanos, (II) son segmentos kappa humanos o, (III) son segmentos lambda humanos; o

(e) la etapa de inserción comprende reemplazar uno o más segmentos génicos de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógenos del locus de inmunoglobulina de cadena pesada por los segmentos génicos Vl y Jl de cadena ligera no reorganizados de modo que la expresión del locus de cadena pesada de inmunoglobulina da como resultado una proteína de unión de dominio único VL que comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina y un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que carece de un dominio Ch1, en donde los segmentos génicos Vl y Jl de cadena ligera no reorganizados reemplazan todos los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de roedor en el locus de cadena pesada de inmunoglobulina de roedor endógeno.

9. El método de la reivindicación 7, en donde:

(a) la deleción de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio Ch1 está en un gen de IgG, opcionalmente en donde la deleción de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio Ch1 está en un gen de IgG1; (b) el locus de cadena pesada de inmunoglobulina comprende segmentos génicos de la región variable que codifican un dominio variable humano y un gen de la región constante que codifica un domino constante de roedor; (c) la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina Vl/Jl reorganizada sencilla unida operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina codifica una cadena ligera universal, opcionalmente en donde la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina Vl/Jl reorganizada sencilla es (I) una secuencia del gen de Vl/Jl humana, (II) una secuencia del gen de Vk1-39/J humana, o una secuencia del gen de Vk3-20/J humana, (III) una secuencia del gen de Vk1-39/J humana que comprende un segmento génico Vk1-39 humano reorganizado con un segmento génico Jk5 humano, o (IV) la secuencia del gen de Vk3-20/J humana que comprende un segmento génico de Vk3-20 humano reorganizado con un segmento génico Jk1 humano; o

(d) la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina Vl/Jl reorganizada sencilla (I) está unida operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina de roedor, (II) está unida operativamente a una secuencia del gen de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana, o (III) reemplaza todos los segmentos génicos Vl y Jl de cadena ligera de inmunoglobulina endógenos del roedor.

10. El método de la reivindicación 7, en donde:

(a) la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia del gen de la región variable de cadena ligera VL/JLde inmunoglobulina está en la línea germinal del roedor;

(b) la deleción de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio Ch1 está un gen de IgG1 y el método además comprende (c) deleción o desactivación de un gen de inmunoglobulina seleccionado entre el grupo que consiste en de IgD, IgG3, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgE, IgA, y una combinación de los mismos, opcionalmente en donde los genes de inmunoglobulina IgG2a e IgG2b están delecionados o desactivados, los genes de inmunoglobulina IgG2b e IgG2c están delecionados o desactivados, o los genes de inmunoglobulina IgG3, IgD, IgA e IgE están delecionados o desactivados; o

(c) el roedor es una rata o un ratón.