JP2016026144A - 免疫グロブリン変異体及びその用途 - Google Patents

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Abstract

【課題】ヒト腫瘍細胞株の増殖を抑制し、虚血性網膜疾患のモデルにおいて眼球内血管新生を阻害する、抗ＶＥＧＦ中和抗体において、投薬の量及び／又は頻度の減少や不便さ並びに追加的な医療費用を最小にするために、インビボでの半減期を増加させ、循環中における残留性を高めた免疫グロブリンの提供。
【解決手段】野生型ヒトＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾があり、野生型より高いＦｃＲｎへの結合親和性を有する、変異体免疫グロブリンの作製。
【選択図】図１Ａ

Description

（関連出願）
この出願は、内容を出典明示によりここに援用する２００８年１０月１４日出願の仮出願第６１／１０５０８６号、２００９年２月１２日出願の仮出願第６１／１５２１３１号、２００９年４月２２日出願の仮出願第６１／１７１７６８号、２００９年６月２５日出願の仮出願第６１／２２０５１４号に対して米国特許法第１１９条第（ｅ）項の下の優先権を主張する米国特許法施行規則１．５３（ｂ）（１）条の下に出願した非仮出願である。
（発明の分野）
本発明は一般的に分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、改変された生物学的性質を有するＩｇＧ免疫グロブリン変異体と、同変異体を使用する方法に関する。
長年にわたって治療剤としての免疫グロブリンの使用は劇的に増加した。免疫系の重要な部分を構成する免疫グロブリン（Ｉｇ）分子は、それらが（１）多様なファミリーのリガンドと反応し、（２）異なったエフェクター機能を有し、かつ（３）生物学的に非常に重要であるので、非常に興味深い。今日、抗体ベースの薬剤の使用は、癌、自己免疫疾患並びに様々な全身性及び感染性疾患の治療を含む。また、免疫グロブリンは、インビボ診断ツールとして、例えば画像診断法において有用である。
ＩｇＧはヒト及び他の哺乳動物において最も高頻度に見られる免疫グロブリンクラスであり、様々なタイプの免疫療法及び診断法において利用されている。ヒトIgG1は治療目的で最も一般的に使用される抗体である。現在、臨床試験において多くの抗体が主要関連抗原に対して産生されている。特に、抗ＶＥＧＦ中和抗体はヌードマウスにおける様々なヒト腫瘍細胞株の増殖を抑制し（Kim等 Nature 362:841-844 (1993)；Warren等 J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995)；Borgstrom等 Cancer Res. 56:4032-4039 (1996)；及びMelnyk等 Cancer Res. 56:921-924 (1996)）、また虚血性網膜疾患のモデルにおいて眼球内血管新生を阻害する（Adamis等 Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)）ことが知られている。確かに、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体のベバシズマブ（アバスチン（登録商標）、Genentech, South San Francisco, CA）は、血管新生を阻害するように設計された最初の米国ＦＤＡ承認治療である。
その潜在性にかかわらず、免疫グロブリン免疫療法での問題の一つは循環中における免疫グロブリンの残留性であった。免疫グロブリンクリアランス速度は免疫グロブリンの投薬の量と頻度に直接影響する。増加した投薬量及び投薬の頻度は患者において有害事象を引き起こし得、また医療費用を増加させる。
循環におけるＩｇＧ異化反応の機序は、齧歯類における胎盤又は卵黄嚢を通じて又は初乳を通じて母から胎仔／新生仔への受動免疫の移行（経細胞輸送を経由したＩｇＧの母胎間移行）に関した研究を通じて解明されている（Brambell, Lancet, ii:1087-1093, 1966；Rodewald, J. Cell Biol., 71:666-670, 1976；Morris等, In: Antigen Absorption by the Gut, pp. 3-22, 1978, University Park Press, Baltimore；Jones等, J. Clin. Invest., 51:2916-2927, 1972）。新生仔Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）は哺乳動物におけるＩｇＧの経細胞輸送及び恒常性維持において重要な役割を担っている。ＦｃＲｎは、腫瘍組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子と構造的に相同であり、膜貫通α鎖とβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）からなる。ノックアウトマウスにおける過去の研究は、FcRn-又はβ2m-欠損マウスにおけるＩｇＧの血清半減期が大きく減少したことを例証しており(Roopenian等, J Immunol 170(7), 3528-3533, 2003；Israel等, Immunology 89(4), 573-578, 1996)、循環 IgGのレベルの調節におけるＦｃＲｎの保護的役割を証明している。マウスＩｇＧｓのＦｃ領域における様々な部位特異的変異誘発実験は、IgG及びFcRn間の相互作用に関与するある重要なアミノ酸残基の同定に至っている (Kim等, Eur. J. Immunol., 24:2429-2434, 1994；Medesan等, Eur. J. Immunol., 26:2533, 1996；Medesan等, J. Immunol., 158:2211-2217, 1997)。また、様々な刊行物が、ＩｇＧｓのＦｃＲｎ結合領域を導入するか又は改変することによって半減期が変更された生理学的に活性な分子を得るための方法を記載している（国際公開第９７／４３３１６号；米国特許第５８６９０４６号；米国特許第５７４７０３５号；国際公開第９６／３２４７８号；国際公開第２００６０５３３０１号；米国特許第７０８３７８４号；米国特許第７３７１８２６号）。
分子レベルでは、ＦｃＲｎはＣＨ２−ＣＨ３ドメイン領域中のＩｇＧのＦｃ部分に結合する。Ｆｃ−ＦｃＲｎ相互作用は非常にｐＨ依存性である；ＩｇＧｓはｐＨ６で高親和性でもってＦｃＲｎに結合するが、ｐＨが７．４に上がると、結合親和性はかなり低下する。このｐＨ依存的相互作用が、ＩｇＧの分解からの保護に重要である。すなわち、飲作用ＩｇＧは酸性エンドソーム中においてＦｃＲｎによって捕捉され、細胞表面までリサイクルされ、ついで７．４の生理学的血清ｐＨで循環中に放出されて戻される（Ober等 Proc Natl Acad Sci U S A 101(30), 11076-11081, 2004；Ober等 J Immunol 172(4), 2021-2029, 2004；Prabhat等 Proc Natl Acad Sci U S A 104(14), 5889-5894, 2007）。ＦｃＲｎが結合しないＩｇＧはリソソームに標的にされ分解される。ＦｃＲｎはＩｇＧ恒常性維持の調節に重要であるので、タンパク質工学によってＦｃとＦｃＲｎ間の相互作用を調節することは治療用抗体の薬物動態を改善するための一方法である（Shields等 J Biol Chem 276(9), 6591-6604, 2001；Dall'Acqua等 Nat Biotechnol 15(7), 637-640, 1997；Dall'Acqua等, J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002；Hinton等 J Biol Chem 279(8), 6213-6216, 2004；Hinton等 J Immunol 176(1), 346-356, 2006；Datta-Mannan等 Drug Metab Dispos 35(1), 86-94, 2007；Datta-Mannan等 J Biol Chem 282(3), 1709-1717, 2007）。マウス、アカゲザル及びカニクイザルにおける多くの研究は、ＩｇＧｓのｐＨ６結合親和性の増大が半減期を延長しうることを証明している（Dall'Acqua等 Nat Biotechnol 15(7), 637-640, 1997；Dall'Acqua等, J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002；Hinton等 J Biol Chem 279(8), 6213-6216, 2004；Hinton等 J Immunol 176(1), 346-356, 2006）。更に、他の研究は、ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合親和性がＩｇＧの薬物動態の更なる決定因子であることをまた証明している。すなわち、マウスＦｃＲｎへの増加したｐＨ７．４結合親和性を有するある種の変異体はマウスにおいて増加したクリアランス（つまり、減少した半減期）を示した（Dall'Acqua等, J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002）。にもかかわらず、過去の研究は全て限られた範囲のＦｃＲｎ親和性内での少数の変異体に関するものであったので、ＦｃＲｎ親和性と半減期の間の詳細な関係は解明されていない。Ｆｃ：ＦｃＲｎ相互作用を操作することにより達成することができる最大の半減期延長は不明である。
薬剤治療に対するアドヒアランス（コンプライアンス）が重要であるという事実にかかわらず、医薬が処方されている者の半分が推奨された形では医薬を飲まないと推定されている。例えば、最近の研究では、過去１０年に発症した乳癌薬を飲む女性の三分の一と多くの女性が推奨された５年コースを完了しないことが示されている。乏しいコンプライアンスの原因の幾つかは、失念、コンプライアンスにおける物理的困難性（例えば旅行又は治療場所からの移動）、不便さ、副作用、複雑なレジメン及び薬剤の費用を含む。薬剤治療に対する乏しいアドヒアランスは、医薬が患者に提供しうる十分な健康の恩恵より少ない達成状態に至りうる。例えば、癌治療の推奨された過程を完了しないと、疾患の再発を生じたり、生存の見込みを減じうる。
薬剤コンプライアンスを改善する方策は、患者が治療の推奨過程を終了することをより簡便にすることを含む。免疫治療法の下の患者に対してこれを達成しうる方法の一つは、免疫グロブリンが循環中にある時間を増加させることによる。免疫グロブリンのクリアランス速度は免疫グロブリンの投薬の量及び頻度に直接影響を及ぼす。従って、増加したインビボ半減期を付与する免疫グロブリンの開発は、投薬の量及び／又は頻度を減少させ得、よって不便さ並びに追加的な医療費用を最小にする。
従って、治療目的のために増加したインビボ半減期を与える修飾された免疫グロブリンがあれば非常に有利である。次の開示を見れば明らかなように、本発明はこれらの必要性及び他の必要性に取り組むものである。
本発明は新規なＩｇＧ変異体及びその用途を提供する。多くのＩｇＧ変異体が本発明において提供される。例えば、本発明は、カバットのＥＵインデックスに従った番号付けで、アミノ酸残基２５１、２５２、３０７、３０８、３７８、４２８、４３０、４３４、及び４３６の二以上において野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に対して二以上のアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む新規なＩｇＧ変異体を開示し、ここで、変異体ＩｇＧは野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して増加した半減期を有し、アミノ酸置換の少なくとも二つがアミノ酸残基２５１、２５２、３０７、３０８、３７８、４２８、４３０、４３４、又は４３６にあり、アミノ酸残基２５１におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸又はグルタミン酸での置換であり、アミノ酸残基２５２におけるアミノ酸置換がチロシンでの置換であり、アミノ酸残基３０７におけるアミノ酸置換がグルタミンでの置換であり、アミノ酸残基３０８でのアミノ酸置換がプロリンでの置換であり、アミノ酸残基３７８におけるアミノ酸置換がバリンでの置換であり、アミノ酸残基４２８におけるアミノ酸置換がロイシンでの置換であり、アミノ酸残基４３０におけるアミノ酸置換がアラニン又はリジンでの置換であり、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換がアラニン、セリン又はチロシンでの置換であり、及びアミノ酸残基４３６におけるアミノ酸置換がイソロイシンでの置換である。
ある実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、アミノ酸２５１にアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸２５１におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸又はグルタミン酸での置換である。ある実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、アミノ酸３０７にアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸３０７におけるアミノ酸置換がグルタミンでの置換である。ある実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、アミノ酸３０８にアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸３０８におけるアミノ酸置換がプロリンでの置換である。ある実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、アミノ酸３７８にアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸３７８におけるアミノ酸置換がバリンでの置換である。ある実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、アミノ酸４３６にアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸４３６におけるアミノ酸置換がイソロイシンでの置換である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧｓは、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧよりも高いＦｃＲｎに対する結合親和性を有する。
一実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、アミノ酸３０７のグルタミンでのアミノ酸置換及びアミノ酸４３４のアラニンでのアミノ酸置換を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、アミノ酸３０７のグルタミンでのアミノ酸置換及びセリンでのアミノ酸４３４のアミノ酸置換を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、プロリンでのアミノ酸３０８のアミノ酸置換及びアミノ酸４３４のアラニンでのアミノ酸置換を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、チロシンでのアミノ酸２５２のアミノ酸置換及びアミノ酸４３４のアラニンでのアミノ酸置換を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、バリンでのアミノ酸３７８のアミノ酸置換及びアミノ酸４３４のアラニンでのアミノ酸置換を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、ロイシンでのアミノ酸４２８のアミノ酸置換及びアミノ酸４３４のアラニンでのアミノ酸置換を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、アミノ酸４３４のアラニンでのアミノ酸置換及びイソロイシンでのアミノ酸４３６のアミノ酸置換を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、プロリンでのアミノ酸３０８のアミノ酸置換及びチロシンでのアミノ酸４３４のアミノ酸置換を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、アミノ酸３０７のグルタミンでのアミノ酸置換及びイソロイシンでのアミノ酸４３６のアミノ酸置換を含む。
本発明はまたカバットのＥＵインデックスに従った番号付けで、アミノ酸残基２５１、２５２、３０７、３０８、３７８、３８０、４２８、４３０、４３４、及び４３６の三以上において野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に対して三以上のアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む新規なＩｇＧ変異体であって、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して増加した半減期を有し、かつ、アミノ酸置換の少なくとも三つがアミノ酸残基２５１、２５２、３０７、３０８、３７８、３８０、４２８、４３０、４３４、又は４３６にあり、アミノ酸残基２５１におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸又はグルタミン酸での置換であり、アミノ酸残基２５２におけるアミノ酸置換がチロシンでの置換であり、アミノ酸残基３０７におけるアミノ酸置換がグルタミンでの置換であり、アミノ酸残基３０８でのアミノ酸置換がプロリンでの置換であり、アミノ酸残基３７８におけるアミノ酸置換がバリンでの置換であり、アミノ酸残基３８０におけるアミノ酸置換がアラニンでの置換であり、アミノ酸残基４２８におけるアミノ酸置換がロイシンでの置換であり、アミノ酸残基４３０におけるアミノ酸置換がアラニン又はリジンでの置換であり、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換がアラニン、セリン、チロシン又はヒスチジンでの置換であり、及びアミノ酸残基４３６におけるアミノ酸置換がイソロイシンでの置換である変異体ＩｇＧを開示する。
ある実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、アミノ酸２５１にアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸２５１におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸又はグルタミン酸での置換である。ある実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、アミノ酸３０７にアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸３０７におけるアミノ酸置換がグルタミンでの置換である。ある実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、アミノ酸３０８にアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸３０８におけるアミノ酸置換がプロリンでの置換である。ある実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、アミノ酸３７８にアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸３７８におけるアミノ酸置換がバリンでの置換である。ある実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、アミノ酸４３６にアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸４３６におけるアミノ酸置換がイソロイシンでの置換である。ある実施態様では、変異体IgGsは、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧよりも高いＦｃＲｎに対する結合親和性を有する。
一実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、アミノ酸３０７のグルタミンでのアミノ酸置換、アミノ酸３８０のアラニンでのアミノ酸置換及びアミノ酸４３４のセリンでのアミノ酸置換を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、グルタミンでのアミノ酸３０７のアミノ酸置換、アラニンでのアミノ酸３８０のアミノ酸置換及びアミノ酸４３４のアラニンでのアミノ酸置換を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、チロシンでのアミノ酸２５２のアミノ酸置換、プロリンでのアミノ酸３０８のアミノ酸置換及びチロシンでのアミノ酸４３４のアミノ酸置換を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、アスパラギン酸でのアミノ酸２５１のアミノ酸置換、アミノ酸３０７のグルタミンでのアミノ酸置換及びヒスチジンでのアミノ酸４３４のアミノ酸置換を含む。
ある実施態様では、本発明は、アラニンへの２９７位のアミノ酸置換を更に含む変異体ＩｇＧｓ又はその断片を提供する。
ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧは、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧよりも高いＦｃＲｎに対する結合親和性を有する。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、ｐＨ７．４においてよりもｐＨ６．０においてＦｃＲｎに対して高い結合親和性を有する。ある実施態様では、変異体ＩｇＧはヒト又はヒト化ＩｇＧである。ある実施態様では、変異体ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧのＩｇＧ Ｆｃ領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧのＩｇＧ Ｆｃ領域はＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧは抗ＶＥＧＦ抗体である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧはベバシズマブの変異体である。ある実施態様では、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧはベバシズマブである。ある実施態様では、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域はベバシズマブのＦｃ領域である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、重鎖可変ドメイン（配列番号：１）及び軽鎖可変ドメイン（配列番号：２）を含む。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、重鎖可変ドメイン（配列番号：３）及び軽鎖可変ドメイン（配列番号：４）を含む。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、重鎖可変ドメイン（配列番号：７）及び軽鎖可変ドメイン（配列番号：８）を含む。
本発明は、ここに記載の変異体ＩｇＧｓの何れかと薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的組成物を更に開示する。ここに記載の変異体ＩｇＧを容器中に、また使用のための指示書を含むキットがまたここに提供される。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧの半減期は、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して少なくとも５０％、１００％、１５０％、２００％、３００％又はそれ以上増加している。ある実施態様では、変異体ＩｇＧの半減期は、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して少なくとも２倍増加している。ある実施態様では、変異体ＩｇＧの半減期は、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して少なくとも３倍増加している。ある実施態様では、変異体ＩｇＧの半減期は、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して少なくとも４倍増加している。ある実施態様では、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧはベバシズマブである。ある実施態様では、変異体ＩｇＧの半減期はベバシズマブの半減期である。ある実施態様では、ベバシズマブの平均半減期は、カニクイザルで測定して約１０から１２日、又はヒトで測定して約３週間である。
ある実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む変異体ＩｇＧｓが提供され、ここで、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、カバットのＥＵインデックスに従った番号付けでアミノ酸残基３０７及び４３４において野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に対してアミノ酸置換を含み、ここで、変異体ＩｇＧが野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して増加した半減期を有し、アミノ酸残基３０７におけるアミノ酸置換がグルタミンでの置換であり、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換がアラニンでの置換である。一実施態様では、変異体ＩｇＧは、重鎖可変ドメイン（配列番号：１）及び軽鎖可変ドメイン（配列番号：２）を含み、カバットのＥＵインデックスに従った番号付けでアミノ酸残基３０７及び４３４において野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に対してアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む変異体ＩｇＧ１であり、ここで、変異体ＩｇＧ１は野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有するＩｇＧ１の半減期と比較して増加した半減期を有し、アミノ酸残基３０７におけるアミノ酸置換がグルタミンでの置換であり、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換がアラニンでの置換である。
他の実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む変異体ＩｇＧｓが提供され、ここで、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が、カバットのＥＵインデックスに従った番号付けでアミノ酸残基３０７及び４３４において野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に対してアミノ酸置換を含み、変異体ＩｇＧが野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して増加した半減期を有し、アミノ酸残基３０７におけるアミノ酸置換がグルタミンでの置換であり、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換がセリンでの置換である。
他の実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む変異体ＩｇＧｓが提供され、ここで、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、カバットのＥＵインデックスに従った番号付けでアミノ酸残基３０８及び４３４において野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に対してアミノ酸置換を含み、ここで、変異体ＩｇＧ１が、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して増加した半減期を有し、アミノ酸残基３０８におけるアミノ酸置換がプロリンでの置換であり、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換がアラニンでの置換である。
他の実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む変異体ＩｇＧｓが提供され、ここで、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、カバットのＥＵインデックスに従った番号付けでアミノ酸残基３０７、３８０及び４３４において野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に対してアミノ酸置換を含み、ここで、変異体ＩｇＧが、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して増加した半減期を有し、アミノ酸残基３０７におけるアミノ酸置換がグルタミンでの置換であり、アミノ酸残基３８０におけるアミノ酸置換がアラニンでの置換であり、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換がセリンでの置換である。
ある実施態様では、上述のヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む変異体ＩｇＧは、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧよりも高いＦｃＲｎに対する結合親和性を有している。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、ｐＨ７．４においてよりもｐＨ６．０においてＦｃＲｎに対して高い結合親和性を有している。ある実施態様では、変異体ＩｇＧはヒト又はヒト化ＩｇＧである。ある実施態様では、変異体ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧのＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧのＩｇＧ Ｆｃ領域はＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは抗ＶＥＧＦ抗体である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧはベバシズマブの変異体である。ある実施態様では、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧはベバシズマブである。ある実施態様では、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域はベバシズマブのＦｃ領域である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、重鎖可変ドメイン（配列番号：１）及び軽鎖可変ドメイン（配列番号：２）を含む。ある実施態様では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む変異体ＩｇＧｓの何れかと薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的組成物がここに提供される。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む変異体ＩｇＧｓの何れかを容器に、また使用のための指示書を含むキットがまたここに提供される。
ある実施態様では、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む変異体ＩｇＧｓが提供され、ここで、変異体ＩｇＧｓは、重鎖可変ドメイン（配列番号：１）及び軽鎖可変ドメイン（配列番号：２）を含み、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、カバットのＥＵインデックスに従った番号付けでアミノ酸残基４３４における野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に対してアミノ酸置換を含み、変異体ＩｇＧは野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して増加した半減期を有し、変異体ＩｇＧは、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有するＩｇＧのＦｃＲｎに対する結合親和性と比較して高いＦｃＲｎに対する結合親和性を有し、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換がヒスチジンでの置換である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは変異体ＩｇＧ１である。
ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００％増加している。一実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して、少なくとも５０％増加している。他の実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、野生型ヒトＩｇＧＦｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して、少なくとも７５％増加している。更に他の実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、野生型ヒトＩｇＧＦｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して、少なくとも１００％増加している。
ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、又は４０日である。一実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、少なくとも約１５日である。他の実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、少なくとも約２０日である。他の実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、少なくとも約２５日である。他の実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、少なくとも約３０日である。他の実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、少なくとも約３５日である。他の実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、少なくとも約４０日である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは変異体ＩｇＧ１である。
ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、ヒトにおいて測定された半減期である。ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、カニクイザルにおいて測定された半減期である。ある実施態様では、野生型ＩｇＧ又は野生型ヒトＩｇＧＦｃ領域を有するＩｇＧはベバシズマブである。ある実施態様では、ベバシズマブの半減期は、カニクイザルにおいて測定して約１０から１２日であり、又はヒトにおいて測定して約２０日である。
ＩｇＧ変異体を使用する多くの方法が本発明において提供される。患者において腫瘍を治療する方法が提供される。例えば、該方法は上述のここに記載の任意の変異体ＩｇＧｓの有効量を患者に投与することを含む。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは抗ＶＥＧＦ抗体である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧはベバシズマブの変異体である。ある実施態様では、方法は、有効量の化学療法剤を患者に投与することを更に含む。
患者においてＶＥＧＦ活性を阻害する方法が本発明において提供される。例えば、該方法は、上述のここに記載の任意の変異体ＩｇＧｓの有効量を上記患者に投与することを含む。ある実施態様では、ＶＥＧＦ活性は血管新生である。
患者において血管透過性を調節する方法が本発明において提供される。例えば、該方法は、上述のここに記載の任意の変異体ＩｇＧｓの有効量を上記患者に投与することを含む。
患者において非腫瘍性疾患を治療する方法が本発明において提供される。例えば、該方法は、上述のここに記載の任意の変異体ＩｇＧｓの有効量を上記患者に投与することを含む。ある実施態様では、非腫瘍性疾患は自己免疫疾患である。ある実施態様では、非腫瘍性疾患がアルツハイマー病である。ある実施態様では、患者は加齢黄斑変性であると診断されている。
患者においてＨＥＲ発現腫瘍を治療する方法が本発明において提供される。例えば、該方法は、上述のここに記載の任意の変異体ＩｇＧｓの有効量を上記患者に投与することを含む。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは重鎖可変ドメイン(配列番号:7) 及び軽鎖可変ドメイン (配列番号:8)を含む。
患者において癌細胞の増殖を阻害し又は防止する方法が本発明において提供される。例えば、該方法は、上述のここに記載の任意の変異体ＩｇＧｓの有効量を上記患者に投与することを含む。
有効量の変異体ＩｇＧを患者に投与する方法が本発明において提供される。これらの投与方法は、ここに記載の他の方法（例えば治療方法）と組み合わせて使用されうる。ある実施態様では、方法は、上述のここに記載の任意の変異体ＩｇＧｓの有効量を上記患者に投与することを含み、ここで、変異体ＩｇＧは４週間毎又はそれより長い間隔で患者に投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは５週間毎又はそれより長い間隔で患者に投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは６週間毎又はそれより長い間隔で患者に投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは７週間毎又はそれより長い間隔で患者に投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは８週間毎又はそれより長い間隔で患者に投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは９週間毎又はそれより長い間隔で患者に投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは１０週間毎又はそれより長い間隔で患者に投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは１１週間毎又はそれより長い間隔で患者に投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは１２週間毎又はそれより長い間隔で患者に投与される。ある実施態様では、方法は、任意の変異体ＩｇＧの有効量を上記患者に投与することを含み、ここで、変異体ＩｇＧは野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧの推奨され又は処方された投薬頻度よりも少ない頻度で投与される。ある実施態様では、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧはベバシズマブである。ある実施態様では、変異体ＩｇＧ、例えばベバシズマブの変異体が、ベバシズマブの処方された投薬頻度よりも少ない頻度で投与される。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、最初は２週間毎に投与され、後で４週間毎又はそれより長い間隔で投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、最初は３週間毎に投与され、後で６週間毎又はそれより長い間隔で投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、最初は４週間毎に投与され、後で８週間毎又はそれより長い間隔で投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、最初は５週間毎に投与され、後で１０週間毎又はそれより長い間隔で投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、最初は６週間毎に投与され、後で１２週間毎又はそれより長い間隔で投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧ、例えばベバシズマブの変異体が、ベバシズマブの処方された投薬頻度で投与され、後でベバシズマブの処方された投薬頻度よりも少ない頻度で投与される。
ここに記載された方法のある実施態様では、変異体ＩｇＧは抗ＶＥＧＦ抗体である。一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、重鎖可変ドメイン（配列番号：１）及び軽鎖可変ドメイン（配列番号：２）を含む。他の実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブの変異体である。
ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧｓは患者に静脈内投与される。ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧｓは患者に皮下的に投与される。
ここに記載された方法のある実施態様では、患者はヒトである。ある実施態様では、患者は癌と診断されている。ある実施態様では、癌は、非小細胞肺癌、肝細胞癌、卵巣癌、神経膠芽腫、乳癌、及び結腸直腸癌からなる群から選択される。
またここに提供されるものは、患者における良性、前癌性又は非転移性癌を治療する方法であり、患者に変異体ＩｇＧの有効量を投与することを含む。ある実施態様では、変異体ＩｇＧの投与は、良性, 前癌性、又は非転移性癌が浸潤又は転移性癌になるのを防止する。例えば、良性、前癌性又は非転移性癌は、ステージ0,ステージI、又はステージII 癌であり得、ある実施態様では、変異体ＩｇＧの投与は、良性, 前癌性又は非転移性癌が次のステージ、例えばステージI、ステージII、ステージIII又はステージIVの癌に進行するのを防ぐ。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、患者における良性、前癌性、又は非転移性腫瘍を治療するために、又は良性、前癌性、又は非転移性腫瘍が浸潤又は転移性癌になるのを防止するために十分な時間と量で投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧの投与は、良性、前癌性、又は非転移性腫瘍の腫瘍サイズ、腫瘍量、又は腫瘍数を減少させる。変異体ＩｇＧはまた良性、前癌性、又は非転移性腫瘍における血管密度を減少させる量及び時間、投与されうる。
ここに記載されたように、本発明の方法は、例えば、ステージ0 (例えば、上皮内癌),ステージI、又はステージII 癌を治療するために使用することができる。ネオアジュバント及びアジュバント治療方法を、任意のタイプの癌、例えば良性又は悪性癌を治療するために使用することができる。本発明のある実施態様では、癌は、限定しないが、結腸癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、メラノーマ、卵巣癌、膵臓癌、胃腸癌、頭頸部癌、肝臓癌及び軟部組織癌（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、例えばＮＨＬ及び多発性骨髄腫及び白血病、例えば慢性リンパ性白血病）を含む固形腫瘍である。他の実施態様では、良性、前癌性、又は非転移性腫瘍は、ポリープ、腺腫、線維腫、脂肪腫、ガストリン産生腫瘍、インスリノーマ、軟骨腫、骨腫、血管腫、リンパ管腫、髄膜腫、平滑筋腫、横紋筋腫、扁平上皮乳頭種、聴神経腫瘍、神経線維腫、胆管嚢胞腺腫(cystanoma)、平滑筋腫、中皮腫、テラトーマ、粘液腫、トラコーマ、肉芽腫、過誤腫、移行細胞乳頭腫、唾液腺の多形性腺腫、類腱腫、類皮嚢胞乳頭種、嚢腺腫、局所性の結節性の過形成、又は結節性の再生性過形成である。他の実施態様では、方法は、望ましくは腺腫を治療するために用いられる。腺腫の非限定的な例には、肝細胞腺腫、腎臓腺腫、後腎腺腫、気管支腺腫、胞状の腺腫、副腎腺腫、下垂体腺腫、副甲状腺腺腫、膵臓腺腫、唾液腺腺腫、肝細胞性腺腫、胃腸腺腫、管状腺腫、及び胆管腺腫が含まれる。
また、本発明は、患者における良性、前癌性、又は非転移性癌の発症又は再発を予防するために有効量の変異体ＩｇＧを患者に投与することを含む方法を特徴とする。本発明のある実施態様では、患者は、癌、ポリープ又は癌症候群の危険がある。一例では、患者は、癌、ポリープ又は遺伝性癌症候群の家族歴を有する。本発明のある態様では、患者は、良性、前癌性又は非転移性腫瘍を発症するリスクがある。ある実施態様では、該方法は、腫瘍を有したことがない患者、臨床的に検出可能な癌を有したことがない患者、又は良性腫瘍しか有したことのない患者における前記良性、前癌性又は非転移性の癌の発症又は再発を防止する。
他の態様では、患者における癌の再発の可能性を防ぐか又は低減するために十分な時間と量で変異体ＩｇＧを患者に投与することを含む患者における癌の再発の可能性を防止又は低減する方法が提供される。本発明は、腫瘍を取り除き(例えば根治手術を使用して)、その後患者に変異体ＩｇＧを投与する工程を含む、腫瘍を有する患者における癌の再発を予防する方法を含む。本発明は、腫瘍を取り除き(例えば根治手術を使用して)、その後患者にＶ変異体ＩｇＧを投与する工程を含む、患者における腫瘍の再増殖を防止する方法を含む。関連した態様では、本発明には、患者における癌の再発を防止し、又は患者の癌の再発の可能性を低減する方法であって、場合によって、手術の前に変異体ＩｇＧの有効量を患者に投与し、根治手術を行い、手術後に変異体ＩｇＧの有効量を投与することを含み、この手術後の変異体ＩｇＧの投与により、癌の再発が妨げられるか又は癌の再発の可能性が低減される方法が含まれる。他の関連した態様では、本発明は、患者における癌の再発を予防し又は患者の癌の再発の可能性を低減する方法であって、任意の更なる抗癌治療剤が存在しない場合に、変異体ＩｇＧの有効量を患者に投与することを含み、この投与により、患者における癌の再発が妨げられるか又は患者の癌の再発の可能性が低減される方法を含む。
上記態様の各々に対して、腫瘍は、ここに記載の固形腫瘍、特に腫瘍及び腺腫を含むがこれに限らない何れかのタイプの腫瘍でありうる。患者は、臨床的に検出可能か又は検出可能でない休止中の腫瘍又は微小転移性癌を有しうる。この態様の一実施態様では、変異体ＩｇＧは、休止中の腫瘍又は微小転移性癌の血管新生を低減するために十分な時間と量で投与される。他の実施態様では、変異体ＩｇＧは、臨床上検出可能な腫瘍の発症又はその転移を予防するため、又は患者の生存期間を増加させるために十分な時間と量とで投与される。
一実施態様では、変異体ＩｇＧは単独療法である。他の実施態様では、患者は、例えば抗癌療法を用いて腫瘍について過去に治療されている。一例では、抗癌療法は手術である。他の実施態様では、患者は、変異体ＩｇＧの投与の前、最中(例えば、同時)、又は後に更なる抗癌療法で更に治療されうる。抗癌療法の例には、手術、放射線療法(放射線治療)、生物療法、免疫療法、化学療法又はこれら療法の組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
患者が根治手術を経た実施態様では、変異体ＩｇＧは、患者が手術から回復した期間の後に一般に投与される。この期間には、外科的な切開の創傷治癒又は治癒に必要な期間、創傷裂開のリスクが低くなるために必要な期間、又は手術前の健康レベルと本質的に類似するか又はそれより良好な健康レベルに回復するために患者に必要とされる期間が含まれうる。また、根治手術の完了と変異体ＩｇＧの第一投与との間の期間には、患者が治療計画の間に一定の時間を必要とするか又は患者が求める休薬期間に必要な期間が含まれうる。一般に、根治手術の完了と変異体ＩｇＧ療法の開始との間の期間には、１週間未満、１週間、２週間、３週間、４週間(２８日)、５週間、６週間、７週間、８週間、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１年、２年、３年、それ以上が含まれうる。一実施態様では、根治手術と変異体ＩｇＧの投与との間の期間は、２週間を超え、１年未満である。一実施態様では、根治手術と変異体ＩｇＧの投与との間の期間は、４週間（２８日）を超える。
ある実施態様では、上記態様の各々は、癌の再発について患者をモニタリングすることを更に含みうる。
また、本発明は、患者、例えばヒト患者の手術可能な癌の外科的除去前のネオアジュバント療法の方法であって、変異体ＩｇＧの有効量を患者に投与することを含み、該患者が腫瘍又は癌と診断されている方法を提供する。変異体ＩｇＧは、単独で又は少なくとも一種の化学療法剤と組み合わせて投与されうる。
また、本発明は、手術前に変異体ＩｇＧの有効量を患者に投与し、その後手術を行うことによって癌が切除されることを含む、手術可能な癌を有する患者を治療する方法を含む。一実施態様では、該方法は、癌の再発を防止するために、手術後に変異体ＩｇＧの有効量を患者に投与する工程を更に含む。
他の態様では、本発明は、根治手術の前に、変異体ＩｇＧの有効量と、少なくとも一種の化学療法剤とを、手術可能な癌を有する患者に投与することを含む、ネオアジュバント療法の方法に関する。前記方法は、被検体の無病生存率(ＤＦＳ)又は全生存率(ＯＳ)を延長させるために用いられうる。
他の態様では、本発明は、変異体ＩｇＧの有効量を患者に投与することを含み、この投与によって腫瘍サイズが低減し腫瘍の完全な切除が可能となる、切除不可能な腫瘍を有する患者における腫瘍サイズを低減する方法を含む。一実施態様では、該方法は、腫瘍の完全な切除の後に、患者に変異体ＩｇＧの有効量を投与することを更に含む。
他の態様では、本発明は、以下の工程を含む、患者における癌の治療方法に関する：ａ) 各サイクルが、予め定まった間隔で、変異体ＩｇＧの有効量と、少なくとも一種の化学療法剤を患者に投与することを含む、複数の治療サイクルを含む第一段階、ｂ) 癌が取り除かれる根治手術；及びｃ）各サイクルが、予め定まった間隔で、如何なる化学療法剤も伴わずに、変異体ＩｇＧの有効量を患者に投与することを含む、複数の維持サイクルを含む第二段階。一実施態様では、第一段階は、変異体ＩｇＧと第一化学療法計画が投与される第一の複数の治療サイクルの後に、変異体ＩｇＧと第二化学療法計画が投与される第二の複数の治療サイクルを含む。
本発明は、根治手術の後に、変異体ＩｇＧの有効量を、転移性又は非転移性癌を有する患者に投与することを含む方法を提供する。ある実施態様では、該方法は少なくとも一種の化学療法剤の使用を更に含む。
一態様では、該方法は、ａ) 各サイクルが、予め定まった間隔で、変異体ＩｇＧの有効量と、少なくとも一種の化学療法剤を患者に投与することを含む、複数の治療サイクルを含む第一段階と、ｂ) 各サイクルが、予め定まった間隔で、如何なる化学療法剤も伴わずに、変異体ＩｇＧの有効量を患者に投与することを含む、複数の維持サイクルを含む第二段階とを含む、工程を含む。一実施態様では、第一段階は、変異体ＩｇＧと第一化学療法計画が投与される第一の複数の治療サイクルの後に、変異体ＩｇＧと第二化学療法計画が投与される第二の複数の治療サイクルを含む。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、ＶＥＧＦに結合するか又はＶＥＧＦ発現もしくは生物学的活性を低減させる抗ＶＥＧＦ抗体である。抗ＶＥＧＦ抗体、又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、完全なヒト抗体、又はヒト化抗体でありうる。ある実施態様では、本発明の方法において有用な例示的な抗体には、ベバシズマブ(ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標))、Ｇ６-３１、Ｂ２０-４．１、Ｂ２０-４．１．１、及びその断片が含まれる。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体ハーセプチン(HERCEPTIN)(登録商標)である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧはキメラ抗ＣＤ２０抗体リツキサン(Rituxan)(登録商標)、抗ＩｇＥ抗体ＸＯＬＡＩＲ(登録商標)、抗ＣＤ２０抗体、抗CD11a抗体 Raptiva(登録商標)、抗Ｈｅｒ２抗体Ｏｍｎｉｔａｒｇ(登録商標)、抗ｏｘＬＤＬ抗体、抗CD4抗体ＭＴＲＸ１０１１Ａ、抗ＨＣＶ抗体、抗ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体、抗Ａ−ベータ抗体、抗ＤＲ６抗体、抗ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗体、抗ＨＥＲレセプターファミリー抗体、抗組織因子抗体、ＭＬＮ−０２抗体、ヒト化抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）２抗体、又はヒト化抗ＩｇＥ ＩｇＧ１抗体ｒｈｕＭａｂ−Ｅ２５である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、標的抗原がＩＬ−４及びＩＬ−１３である二重特異性抗体である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧはｓｔａｐｈ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）のエピトープを標的とする抗体である。
患者は、変異体ＩｇＧの投与の前、最中又は後に多くの異なる方法で治療されうるが、ある実施態様では、患者は手術又は化学療法なしで治療される。他の実施態様では、変異体ＩｇＧによる治療は、臨床医によって評価されるか又はここに記載されるように、単独療法であるか、又は変異体ＩｇＧ治療期間の間単独療法である。
他の実施態様では、変異体ＩｇＧによる治療は、更なる抗癌療法、例えば限定するものではないが、手術、放射線療法、化学療法、鑑別療法、生物療法、免疫療法、血管新生インヒビター及び抗増殖性化合物と組み合わされる。また、変異体ＩｇＧによる治療は、上記のタイプの治療計画の任意の組合せを含みうる。ある実施態様では、細胞傷害性剤、抗血管新生剤及び抗増殖性剤が、変異体ＩｇＧと組み合わせて用いられうる。一実施態様では、抗癌療法は化学療法である。ある実施態様では、化学療法剤及び変異体ＩｇＧは同時に投与される。
ある実施態様では、本発明の方法は、初期段階の腫瘍を治療し予防することによって、進行した癌に伴う罹病率及び死亡率の減少を生じさせる、より進行した段階への進行を妨ぐもに有益である。また、本発明の方法は、腫瘍の再発、又は腫瘍、例えば原発性腫瘍の除去の後に存続する休止中の腫瘍の再増殖を予防するのに、又は微小転移性癌の発症又は増殖を低減又は予防するのにもまた有益である。
本発明の方法では、癌は、固形腫瘍、例えば乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、肺癌、腎細胞癌、神経膠腫（例えば、未分化星状細胞腫、退形成性乏突起星細胞腫、退形成乏突起神経膠腫、多形神経膠芽腫）、腎臓癌、前立腺癌、肝臓癌、 膵臓癌、軟部組織肉腫、 カルチノイド癌、頭頸部癌、メラノーマ、及び卵巣癌でありうる。
本発明の方法はまた癌又は腫瘍の再発について患者をモニタリングすることを含みうる。
本発明の他の特徴及び利点は、次の詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
ここに記載の任意の実施態様又はその任意の組合せはここに記載の本発明の任意の及び全ての変異体ＩｇＧｓ及び方法に適用される。
パネルＡ：ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎに対する抗ＶＥＧＦ野生型（ＷＴ） 及び抗ＶＥＧＦ変異体の結合性。チップに異なったレベルのＦｃＲｎが結合した二つの別個の実験を実施した。各実験に対して、定常状態応答単位を変異体濃度の関数としてプロットし、解離定数を推定する。 パネルＢ：ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎに対する抗ＶＥＧＦ野生型（ＷＴ） 及び抗ＶＥＧＦ変異体の結合性。チップに異なったレベルのＦｃＲｎが結合した二つの別個の実験を実施した。各実験に対して、定常状態応答単位を変異体濃度の関数としてプロットし、解離定数を推定する。 ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎに対する抗ＶＥＧＦ野生型（ＷＴ）及び抗ＶＥＧＦ変異体の解離定数。ＫＤは図１に示した二つの異なった実験から推定した。 ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する抗ＶＥＧＦ野生型（ＷＴ）及び抗ＶＥＧＦ変異体の結合性。定常状態応答単位を抗ＶＥＧＦ変異体濃度の関数としてプロットする。 パネルＡ：ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎに対する抗ＶＥＧＦ野生型及び抗ＶＥＧＦ変異体の結合性。 パネルＢ：ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する抗ＶＥＧＦ野生型及び抗ＶＥＧＦ変異体の結合性。 パネルＣ：ｐＨ６．０でのｃｙｎｏＦｃＲｎに対する抗ＶＥＧＦ野生型及び抗ＶＥＧＦ変異体の結合性。 パネルＤ：ｐＨ７．４でのｃｙｎｏＦｃＲｎに対する抗ＶＥＧＦ野生型及び抗ＶＥＧＦ変異体の結合性。 ｐＨ６．０及び２５℃でのヒトＦｃＲｎに対する様々な抗ＶＥＧＦ変異体の動態パラメータ及び一価解離定数（ＫＤ）。結果は３回の独立した実験を代表する。 ｐＨ６．０及び２５℃でのｃｙｎｏＦｃＲｎに対する様々な抗ＶＥＧＦ変異体の動態パラメータ及び一価解離定数（ＫＤ）。結果は３回の独立した実験を代表する。 パネルＡ：異なったｐＨでの異なった抗ＶＥＧＦ変異体に対するヒトＦｃＲｎの解離速度（ｋｏｆｆ）。 パネルＢ：異なったｐＨでの異なった抗ＶＥＧＦ変異体に対するｃｙｎｏＦｃＲｎの解離速度（ｋｏｆｆ）。 抗ＶＥＧＦ野生型に対する 抗ＶＥＧＦ変異体のヒトＦｃＲｎ親和性改善のまとめ。データは図５及び５からまとめている。 パネルＡ：（１）抗ＶＥＧＦ野生型及び抗ＶＥＧＦ変異体（２）Ｎ４３４Ｈ、（３）Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、（４）Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｓ、（５）Ｔ３０７Ｑ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ｓ及び（６）Ｖ３０８Ｐ／Ｎ４３４ＡのＶＥＧＦ結合性。抗体のＶＥＧＦ結合性を、ＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)３０００を使用して、３７℃でＶＥＧＦ−Ａ１０９被覆センサーチップに対して抗ＶＥＧＦ野生型及び抗ＶＥＧＦ変異体を注入することにより決定した。 パネルＢ：（１）抗ＶＥＧＦ野生型及び抗ＶＥＧＦ変異体（２）Ｎ４３４Ｈ、（３）Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、（４）Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｓ、（５）Ｔ３０７Ｑ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ｓ及び（６）Ｖ３０８Ｐ／Ｎ４３４ＡのＶＥＧＦ結合性。５０ｎＭ及び１００ｎＭ注入に対するセンサーグラム。各センサーグラムベースラインは、より良好に見えるように４ＲＵだけオフセットした。 アバスチン（登録商標）、抗ＶＥＧＦ野生型（ベバシズマブ）及び抗ＶＥＧＦ変異体のインビトロＨＵＶＥＣ増殖阻害。ヒト臍血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＶＥＧＦ及び様々な濃度の抗ＶＥＧＦ抗体の存在下で培養した。培養４日後の生存率を評価した。 ５ｍｇ／ｋｇの単一ＩＶ用量後のカニクイザルにおける抗ＶＥＧＦ野生型及び５種の抗ＶＥＧＦ変異体の薬物動態。抗体の血清中濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。データは平均±標準偏差として表される（１１匹の動物のＶ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ群を除き、ｎ＝１２匹の動物／群）。 カニクイザルへの５ｍｇ／ｋｇの単一ＩＶ用量後の抗ＶＥＧＦ野生型及び５種の抗ＶＥＧＦ変異体の薬物動態パラメーター。 抗ＶＥＧＦ野生型及び５種の抗ＶＥＧＦ変異体に対するカニクイザルにおける終末半減期とｐＨ６．０のＦｃＲｎ親和性の間の関係を示すグラフ。エラーバーは群当たり１１又は１２匹の動物の標準偏差を表す。 パネルＡ：０．３又は５ｍｇ／ｋｇの単一ＩＶ用量後のヒト化ＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおける抗ＶＥＧＦ野生型及び抗ＶＥＧＦ変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａの薬物動態プロファイル。抗体の血清中濃度を、ＶＥＧＦキャプチャーＥＬＩＳＡを使用して測定した。データは平均±標準偏差として表す。 パネルＢ：０．３又は５ｍｇ／ｋｇの単一ＩＶ用量後のヒト化ＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおける抗ＶＥＧＦ野生型及び抗ＶＥＧＦ変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａの薬物動態プロファイル。抗体の血清中濃度をヒトＦｃキャプチャーＥＬＩＳＡを使用して測定した。データは平均±標準偏差として表す。 ヒト化ＶＥＧＦトランスジェニックマウスへの０．３又は５ｍｇ／ｋｇの単一静脈内用量後の抗ＶＥＧＦ野生型及び抗ＶＥＧＦ変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａび薬物動態パラメータ−。 パネルＡ：０．３又は５ｍｇ／ｋｇの多用量後ヒト化ＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおけるの抗ＶＥＧＦ変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａの薬物動態プロファイル。抗体を０、３、６、及び９日目に投与した。抗体の血清中濃度は、ＶＥＧＦキャプチャーＥＬＩＳＡを使用して測定した。データは平均±標準偏差として表す。 パネルＢ：０．３又は５ｍｇ／ｋｇの多用量後ヒト化ＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおけるの抗ＶＥＧＦ変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａの薬物動態プロファイル。抗体を０、３、６、及び９日目に投与した。抗体の血清中濃度は、ヒトＦｃキャプチャーＥＬＩＳＡを使用して測定した。データは平均±標準偏差として表す。 ヒト化ＶＥＧＦトランスジェニックマウスへの０、３、６、及び９日目での０．３又は５ｍｇ／ｋｇの４回の静脈内用量後のＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａに対する薬物動態パラメーター。 パネルＡ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＨＭ−７異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体び効果。５ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。ＨＭ−７腫瘍の増殖曲線。データは平均±標準誤差として表す。 パネルＢ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＨＭ−７異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体び効果。５ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇ治療群に対するＨＭ−７腫瘍の増殖曲線。 パネルＣ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＨＭ−７異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体び効果。５ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。治療の終了時（抗ブタクサ治療群では１８日目、抗ＶＥＧＦ治療群では２１日目）における血清中抗ＶＥＧＦ抗体濃度。濃度はＶＥＧＦキャプチャーＥＬＩＳＡを使用して測定した。データは平均±標準偏差として表す。 パネルＡ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＨＭ−７異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の繰り返しの効果研究。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。ＨＭ−７腫瘍の増殖曲線。データは平均±標準誤差として表す。 パネルＢ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＨＭ−７異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の繰り返しの効果研究。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇ治療群に対するＨＭ−７腫瘍の増殖曲線。データは平均±標準誤差として表す。 パネルＣ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＨＭ−７異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の繰り返しの効果研究。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。ＨＭ−７腫瘍の最後の重量は治療の終了時（抗ブタクサでは１６日目、０．０５ｍｇ／ｋｇ群では１９日目、残りの群では２２日目）に決定した。データは平均±標準誤差として表す。 パネルＤ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＨＭ−７異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の繰り返しの効果研究。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。治療の終了時における血清中抗ＶＥＧＦ抗体濃度。濃度は、ヒトＦｃキャプチャーＥＬＩＳＡを使用して測定した。データは平均±標準偏差として表す。 パネルＥ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＨＭ−７異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の繰り返しの効果研究。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。血中濃度に対する腫瘍中の抗体濃度の比。腫瘍抗体濃度は、腫瘍可溶化物の全量及び腫瘍可溶化物中の抗ＶＥＧＦ抗体の量を測定することにより決定した。データは平均±標準偏差として表す。 パネルＡ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＨＭ−７異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の第三の効果研究。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。治療の終了時における（２２日目）各群の平均腫瘍体積。データは平均±標準誤差として表す。 パネルＡ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＨＭ−７異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の第三の効果研究。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。ＨＭ−７腫瘍の最後の重量。データは平均±標準誤差として表す。 パネルＡ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＨＭ−７異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の第三の効果研究。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。治療の終了時における血清中抗ＶＥＧＦ抗体濃度。濃度は、抗ヒトＦｃキャプチャーＥＬＩＳＡを使用して測定した。データは平均±標準偏差として表す。 パネルＡ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＨＭ−７異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の第三の効果研究。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。血中濃度に対する腫瘍中の抗体濃度の比。腫瘍抗体濃度は、腫瘍可溶化物の全量及び腫瘍可溶化物中の抗ＶＥＧＦ抗体の量を測定することにより決定した。データは平均±標準偏差として表す。 パネルＡ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＨＴ−５５異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の効果。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。ＨＴ−５５腫瘍の増殖曲線。データは平均±標準誤差として表す。 パネルＢ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＨＴ−５５異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の効果。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。ＨＴ−５５腫瘍の最後の重量は治療の終了時（３５日目）に決定した。データは平均±標準誤差として表す。 パネルＣ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＨＴ−５５異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の効果。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。治療の終了時における血清中抗ＶＥＧＦ抗体濃度。濃度は、ヒトＦｃキャプチャーＥＬＩＳＡを使用して測定した。データは平均±標準偏差として表す。 パネルＡ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＨＴ−５５異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の効果。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。血中濃度に対する腫瘍中の抗体濃度の比。腫瘍抗体濃度は、腫瘍可溶化物の全量及び腫瘍可溶化物中の抗ＶＥＧＦ抗体の量を測定することにより決定した。データは平均±標準偏差として表す。 パネルＢ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＣｏｌｏ−２０５異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の効果。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。Ｃｏｌｏ−２０５腫瘍の増殖曲線。データは平均±標準誤差として表す。 パネルＢ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＣｏｌｏ−２０５異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の効果。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇ治療群でのＣｏｌｏ−２０５腫瘍の増殖曲線。 パネルＣ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＣｏｌｏ−２０５異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の効果。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。Ｃｏｌｏ−２０５腫瘍の最後の重量は治療の終了時（３８日目）に決定した。データは平均±標準誤差として表す。 パネルＤ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＣｏｌｏ−２０５異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の効果。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。治療の終了時における血清中抗ＶＥＧＦ抗体濃度。濃度は、ヒトＦｃキャプチャーＥＬＩＳＡを使用して測定した。データは平均±標準偏差として表す。 パネルＥ：ＲＡＧ２ＫＯ中に皮下移植したＣｏｌｏ−２０５異種移植片；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウスの治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の効果。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。血中濃度に対する腫瘍中の抗体濃度の比。腫瘍抗体濃度は、腫瘍可溶化物の全量及び腫瘍可溶化物中の抗ＶＥＧＦ抗体の量を測定することにより決定した。データは平均±標準偏差として表す。 パネルＡ：Ｃｏｌｏ−２０５異種移植片の治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の繰り返しの効果研究。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。Ｃｏｌｏ−２０５腫瘍の増殖曲線。データは平均±標準誤差として表す。 パネルＢ：Ｃｏｌｏ−２０５異種移植片の治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の繰り返しの効果研究。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇ治療群に対するＣｏｌｏ−２０５腫瘍の増殖曲線。データは平均±標準偏差として表す。 パネルＣ：Ｃｏｌｏ−２０５異種移植片の治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の繰り返しの効果研究。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。Ｃｏｌｏ−２０５腫瘍の最後の重量は治療の終了時（３２日目）に決定した。データは平均±標準誤差として表す。 パネルＤ：Ｃｏｌｏ−２０５異種移植片の治療における抗ＶＥＧＦ野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ（ＱＡ）変異体の繰り返しの効果研究。５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの野生型及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ及び５ｍｇ／ｋｇの抗ブタクサコントロールを毎週二回、腹腔内投与した。治療の終了時における血清中抗ＶＥＧＦ抗体濃度。濃度は、ヒトＦｃキャプチャーＥＬＩＳＡを使用して測定した。データは平均±標準偏差として表す。 ＢＩＡｃｏｒｅを使用するｐＨ６．０及び２５℃でのヒトＦｃＲｎに対する抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ）ＩｇＧ１ Ｆｃ変異体の一価解離定数（ＫＤ）。結果は二つの独立した実験を代表するものである。 異なったヒト腫瘍細胞株におけるＦｃＲｎの発現レベル。各細胞株の５百万の細胞を実験に使用した。Ｒａｊｉ細胞（ヒトＢ細胞リンパ腫）をネガティブコントロールとして使用する一方、７ｋＤａの膜貫通及び細胞質領域がない可溶型ヒトＦｃＲｎタンパク質をポジティブコントロールとしてブロットした。可溶型ＦｃＲｎタンパク質の希釈物を、ＦｃＲｎ発現レベルを定量するための標準として使用した。ここに示す結果は、少なくとも３回の独立した実験を代表するものである。 ヒトＦｃＲｎに対する抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ）ＩｇＧ１Ｆｃ変異体のｐＨ依存性結合性。変異をＬ２５１、Ｌ３１４、及びＥ４３０に持つ変異体を構築した。２５℃でＢＩＡｃｏｒｅを使用して６から７．２の範囲のｐＨで結合性を測定した。抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ１野生型に対する変異体の親和性の比を決定し、ｐＨの関数としてプロットした。 パネルＡ：ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎに対する抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ）ＩｇＧ１野生型、変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｈ及び変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｈ／Ｙ４３６Ｉの結合性。結合性は２５℃でＢＩＡｃｏｒｅを使用して測定した。 パネルＢ：ｐＨ７．１でのヒトＦｃＲｎに対する抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ）ＩｇＧ１野生型、変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｈ及び変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｈ／Ｙ４３６Ｉの結合性。結合性は２５℃でＢＩＡｃｏｒｅを使用して測定した。 パネルＢ：ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ）ＩｇＧ１野生型、変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｈ及び変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｈ／Ｙ４３６Ｉの結合性。結合性は２５℃でＢＩＡｃｏｒｅを使用して測定した。図２７ＣにおけるｐＨ７．４ではヒトＦｃＲｎに対する変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｈの結合は検出できなかった。 異なったｐＨでの様々な抗ＶＥＧＦ及び抗ＨＥＲ２変異体に対するヒトｆｃＲｎの解離速度（ｋｏｆｆ）。抗ＶＥＧＦ変異体はＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ３０７Ｑ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ｓ及びＶ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａである。抗ＨＥＲ２変異体はＬ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｈ／Ｙ４３６Ｉである。異なったｐＨでのｋｏｆｆ値を、各変異体に対するｐＨに対してフィットさせ、ベストフィット線の傾きを得た（式：ｌｏｇ（ｋｏｆｆ）＝傾き×ｐＨ＋ｙ−切片）。
本発明は、増加したインビボ半減期を有する、抗体、Ｆｃ融合体、及びイムノアドヘシンに見出されるものを含むＦｃドメインの新規変異体に関する。これらの変異体は、その修飾がＦｃＲｎに対するＩｇＧ Ｆｃ領域又はその断片の親和性を増加させる、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に対する一又は複数のアミノ酸修飾を含むヒトＩｇＧ Ｆｃ領域、又はＦｃＲｎに結合するその断片を含む。
ここに記載され又は参照される技術及び手順は、一般によく理解され、例えばSambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel 等編集 (2003))；シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames 及び G. R. Taylor 編集 (1995))、Harlow及びLane編 (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, 及びANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney編 (1987))；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis編, 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R. I. Freshney)編, 1987)；Introduction to Cell 及びTissue Culture (J. P. Mather 及びP. E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell 及びTissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, 及び D. G. Newell編, 1993-8) J. Wiley 及びSons；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir 及び C. C. Blackwell編)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller 及び M. P. Calos編, 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 等編, 1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan 等編, 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley & Sons, 1999)；Immunobiology (C. A. Janeway 及び P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: a practical approach (D. Catty.編, IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd 及び C. Dean編, Oxford University Press, 2000)；Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow 及び D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti 及び J. D. Capra編, Harwood Academic Publishers, 1995)；及び Cancer: Principles 及びPractice of Oncology (V. T. DeVita 等編, J.B. Lippincott Company, 1993)に記載されている広く利用されている方法のような、当業者によって常套的な方法を使用して一般的に用いられる。
特に別に定義しない限り、ここで使用する技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。Singleton等, Dictionary of Microbiology 及びMolecular Biology 2版, J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)、及びMarch, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms 及びStructure 4版, John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)は、本出願において使用される用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供する。特許出願及び刊行物を含むここで引用される全ての文献は出典明示によりその全体が援用される。
定義
この明細書を解釈する目的には、次の定義が適用され、適切な場合には、単数で使用される用語は複数をまた含み、その逆もある。ここで使用される用語法は特定の実施態様を説明する目的だけのものであって、限定することを意図するものではない。以下に記載される何れかの定義が、出典明示によりここに援用される何れかの文献と矛盾している場合には、以下に記載の定義が優先するものである。
本明細書と特許請求の範囲を通して、免疫グロブリン重鎖中の残基の番号付けは、ここに出典を明示して明示的に援用されるKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」とはヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。
ここで使用される「インビボ半減期」又は「インビボでの抗体の半減期」なる用語は、所定の動物の循環における特定のタイプのＩｇＧ分子又はＦｃＲｎ結合部位を含むその断片の生物学的半減期を意味し、所定の分子の循環濃度が５０％減少するのに必要とされる時間によって表される。ある実施態様では、所定のＩｇＧの濃度を時間の関数としてプロットすると、曲線は、 通常は、血管内及び血管外空間の間の注入されたＩｇＧ分子の平衡を表す迅速なα相と、血管内空間からのＩｇＧ分子の排除を表す長いβ相を持つ二相性である。ある実施態様では、「インビボ半減期」なる用語は、β相におけるＩｇＧ分子の半減期に対応する。ある実施態様では、所定のＩｇＧの濃度対時間曲線は、三相性であり、α相及びβ相中に対応して分布しγ相によって表される終末消失を含む。従って、ある実施態様では、インビボ半減期は終末消失相、又はγ相に対応する。ある実施態様では、所定のＩｇＧの濃度対時間曲線は、単相性であり、単一の消失相を有する。従って、ある実施態様では、インビボ半減期は単一消失相の半減期に対応する。
ここで使用される「親ポリペプチド」又は「野生型ポリペプチド」は、未修飾ポリペプチド、天然に生じるポリペプチド、又はここに開示された一又は複数のＦｃ領域アミノ酸修飾を欠き、ここに開示された変異体ＩｇＧと比較してエフェクター機能が異なる天然に生じるポリペプチドの遺伝子操作修飾型を意味する。親ポリペプチドは天然配列Ｆｃ領域又は（例えば付加、欠失及び／又は置換のような）既存のアミノ酸配列修飾を持つＦｃ領域を含みうる。親ポリペプチドはまた以下に記載される非天然アミノ酸を含みうる。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、又はそれをコードするアミノ酸配列を意味しうる。親ポリペプチドは、限定しないが、親免疫グロブリン、野生型免疫グロブリン、親抗体及び野生型抗体を含む。
従って、ここで使用される「親免疫グロブリン」、「親ＩｇＧ」、「野生型免疫グロブリン」又は「野生型ＩｇＧ」は、未修飾免疫グロブリン、天然に生じる免疫グロブリン、又はここに開示された一又は複数のＦｃ領域アミノ酸修飾を欠き、ここに開示された変異体ＩｇＧと比較してエフェクター機能が異なる天然に生じる免疫グロブリンの遺伝子操作修飾型を意味する。親免疫グロブリンは天然配列Ｆｃ領域又は（例えば付加、欠失及び／又は置換のような）既存のアミノ酸配列修飾を持つＦｃ領域を含みうる。親免疫グロブリンはまた以下に記載される非天然アミノ酸を含みうる。親免疫グロブリンは、免疫グロブリン自体、親免疫グロブリンを含む組成物、又はそれをコードするアミノ酸配列を意味しうる。
ここで使用される「親抗体」又は「野生型抗体」は、未修飾抗体、天然に生じる抗体、又はここに開示された一又は複数のＦｃ領域アミノ酸修飾を欠き、ここに開示された変異体ＩｇＧと比較してエフェクター機能が異なる天然に生じる抗体の遺伝子操作修飾型を意味する。親抗体は、天然配列Ｆｃ領域又は既存のアミノ酸配列修飾（例えば挿入、欠失及び／又は置換）を有するＦｃ領域を含みうる。親免疫グロブリンはまた以下に記載される非天然アミノ酸を含みうる。親抗体は、抗体自体、親抗体を含む組成物、又はそれをコードするアミノ酸配列を意味しうる。
ある実施態様では、「親ＩｇＧ」、「親抗体」、「野生型ＩｇＧ」、又は「野生型抗体」は、限定しないが、ここに記載された既知の市販の組換え的に製造された抗体を含む。ある実施態様では、野生型ＩｇＧは、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧである。ある実施態様では、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、ここに開示されたＦｃ領域アミノ酸修飾の一又は複数を欠くＦｃ領域を意味する。ある実施態様では、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、ここに開示されたＦｃ領域アミノ酸修飾の一又は複数を有するＦｃ領域を意味する。ある実施態様では、野生型ＩｇＧはベバシズマブである。ある実施態様では、野生型抗体は、Ｆｃ領域を含まない抗体断片である。ある実施態様では、そのような野生型抗体の変異体ＩｇＧは、野生型抗体のＦａｂドメイン断片、又は非抗体タンパク質のドメイン又はドメイン群、及びここに開示されたＦｃ領域の一又は複数を含むＦｃドメイン断片を含むＦｃ融合タンパク質である。ある実施態様では、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、Ｆｃ変異Ｌ２５１Ｄ又はＬ２５１Ｄ／４３４Ｈを有するが、ここに開示された他のＦｃ領域アミノ酸修飾を有していないＩｇＧＦｃ領域を意味する。
ここで使用される「変異体」、「変異体タンパク質」又は「タンパク質変異体」は、少なくとも一のアミノ酸修飾によって親タンパク質のものとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質変異体は、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、又はそれをコードするアミノ酸配列を意味しうる。ある実施態様では、タンパク質変異体は、親ポリペプチドと比較して少なくとも一つのアミノ酸修飾、例えば約１から約１０のアミノ酸修飾を有する。ある実施態様では、タンパク質変異体はＩｇＧ Ｆｃ領域に少なくとも二つのアミノ酸修飾を有する。ある実施態様では、タンパク質変異体はＩｇＧ Ｆｃ領域に少なくとも３つのアミノ酸修飾を有する。ここでのタンパク質変異体配列は、好ましくは親タンパク質配列と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有するであろう。タンパク質変異体はまた以下に記載の非天然アミノ酸を含みうる。「タンパク質変異体」なる用語は、ここに記載の免疫グロブリン変異体及び抗体変異体を含む。
ここで使用される「免疫グロブリン変異体」、「変異体免疫グロブリン」、「変異体ＩｇＧ」又は「ＩｇＧ変異体」は、少なくとも一のアミノ酸修飾によって親又は野生型免疫グロブリンのものとは異なる免疫グロブリン配列を意味する。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、野生型ＩｇＧに対して少なくとも二つのアミノ酸修飾を有する。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、野生型ＩｇＧに対して少なくとも三つのアミノ酸修飾を有する。ある実施態様では、変異体IgGは変異体抗体である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは抗ＶＥＧＦ抗体である。一実施態様では、変異体ＩｇＧは、抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を含むベバシズマブの変異体である。
ここで使用される「抗体変異体」又は「変異体抗体」は、少なくとも一のアミノ酸修飾によって親抗体とは異なる抗体を意味する。ある実施態様では、変異体抗体は、野生型抗体に対してＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を有する。
ここで使用される「位置」はタンパク質の配列中の位置を意味する。位置は、順次、又は例えばカバットにおけるＥＵインデックスのような確立された形式に従って、番号が付与されうる。
「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」又は「Ｆｃポリペプチド」なる用語は、Ｆｃ領域の全て又は一部を含むポリペプチドを意味する。例えば、Ｆｃポリペプチドは、抗体、Ｆｃ融合体、単離されたＦｃｓ、及びＦｃ断片を意味する。
「Ｆｃ領域含有抗体」なる用語は、Ｆｃ領域を含む抗体を意味する。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）は、例えば抗体の精製中に、又は抗体をコードする核酸の組換え操作によって、除去されうる。従って、Ｆｃ領域を有する抗体を含む組成物は、Ｋ４４７を有する抗体、全てのＫ４４７が除去されたもの、又はＫ４４７残基を伴う抗体と伴わない抗体の混合物を含みうる。
「アミノ酸修飾」は、予め決められたアミノ酸配列のアミノ酸配列における変化を意味する。例示的な修飾には、アミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失が含まれる。ある実施態様では、アミノ酸修飾は置換である。
例えばＦｃ領域の特定位置「におけるアミノ酸修飾」は、特定された残基の置換もしくは欠失、又は特定された残基に隣接する少なくとも一のアミノ酸の挿入を意味する。特定された残基に「隣接する」挿入とは、その一又は二の残基内の挿入を意味する。挿入は、特定された残基のＮ末端又はＣ末端でありうる。
「アミノ酸置換」は、予め決められたアミノ酸配列中の少なくとも一の既存のアミノ酸残基を他の異なる「置換」アミノ酸残基で置き換えることを意味する。置換残基もしくは残基群は「天然に生じるアミノ酸残基」（つまり、遺伝コードによってコードされるもの）であり得、アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択されうる。ある実施態様では、置換残基はシステインではない。一又は複数の非天然発生アミノ酸残基との置換もまたここでのアミノ酸置換の定義に包含される。
「非天然のアミノ酸残基」は、上に列挙した天然に生じるアミノ酸残基以外の残基で、ポリペプチド鎖においてアミノ酸残基(群)に隣接して共有結合し得るものを意味する。非天然発生アミノ酸の例には、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、及びEllman 等 Meth, Enzym. 202: 301-336 (1991)；米国特許第６５８６２０７号；国際公開第９８／４８０３２号；国際公開第０３／０７３２３８号；米国特許出願公開第２００４−０２１４９８８Ａ１号；国際公開第０５１３５７２７Ａ２号；国際公開第０５／７４５２４Ａ２号；J. W. Chin等, (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027；J. W. Chin,及びP. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137；及びJ. W. Chin等, (2002), PICAS United States of America 99:11020-11024（全て全体を出典明示により援用する）に記載されているもののような他のアミノ酸残基アナログが含まれる。
「アミノ酸挿入」は、予め決められたアミノ酸配列中への少なくとも一のアミノ酸の導入を意味する。挿入は通常は一又は二のアミノ酸残基の挿入からなるが、本出願においては、より長い「ペプチド挿入」、例えば約３から約５又は更には約１０のアミノ酸残基の挿入を考慮する。挿入された残基(群)は、上に開示した天然に生じるかもしくは非天然のアミノ酸でありうる。
「アミノ酸欠失」は、予め決められたアミノ酸配列からの少なくとも一のアミノ酸残基の除去を意味する。
ある実施態様では、「増加」、「増加した半減期」又は「増加したインビボ半減期」なる用語は、野生型ＩｇＧ又は野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧと比較して、ここに記載されたもののような標準的な既知の方法によって検出したときの本発明の変異体ＩｇＧのインビボ半減期の少なくとも約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％又はそれ以上の全体的増加を意味する。ある実施態様では、該用語は、変異体ＩｇＧの増加した半減期を意味し、ここで、該増加は、野生型ＩｇＧ又は野生型ヒトＩｇＧＦｃ領域を有するＩｇＧと比較して少なくとも約１．２５Ｘ、１．５Ｘ、１．７５Ｘ、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、又は１０Ｘ又はそれ以上である。ある実施態様では、野生型ＩｇＧ又は野生型ヒトＩｇＧＦｃ領域を有するＩｇＧはベバシズマブである。ある実施態様では、ベバシズマブの平均半減期は、カニクイザルにおいて測定して約１０から１２日、又はヒトにおいて測定して約２０日である。
「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０まで延びていると定義される(Burton, Molec. Immunol.22:161-206(1985))。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置に内部重鎖Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を配置することによりＩｇＧ１と整列させることができる。
Ｆｃ領域の「低ヒンジ領域」は、通常、Ｃ末端からヒンジ領域、すなわち、Ｆｃ領域の残基２３３から２３９までの伸展として定義される。本発明に先立ち、ＦｃγＲの結合には、一般に、ＩｇＧ Ｆｃ領域の低ヒンジ領域内のアミノ酸残基が寄与しているとされていた。
「Ｃ１ｑ」は免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは二つのセリンプロテアーゼＣ１ｒ及びＣ１ｓと共に、補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)経路の最初の成分である複合体Ｃ１を形成する。ヒトＣ１ｑは例えばQuidel, San Diego, CAから購入することができる。
「結合ドメイン」なる用語は、他の分子に結合するポリペプチドの領域を意味する。ＦｃＲの場合には、結合ドメインはＦｃ領域の結合の原因であるそのポリペプチド鎖の一部(例えばそのα鎖)を含みうる。一つの有用な結合ドメインはＦｃＲα鎖の細胞外ドメインである。
ここでの「抗体」なる用語は、最も広い意味で使用され、特にモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を包含する。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の研究、診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質を含みうる。ある実施態様では、抗体は、（１）例えばローリー法で決定して９５重量％を越える抗体まで、ある実施態様では９９重量％を越えるまで、（２）例えばスピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端又は内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（３）クーマシーブルー又は銀染色を用いた非還元又は還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで、精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
「天然抗体」は、通常は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
「定常ドメイン」なる用語は、免疫グロブリンの他の部分、つまり抗原結合部位を含む可変ドメインに対してより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の一部を意味する。定常ドメインは重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインと軽鎖のＣＨＬドメインを含む。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを意味する。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と呼ぶことができる。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と呼ぶことができる。これらのドメインは一般に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＨＶＲは、ＦＲ領域に近接して結合され、他の鎖のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat等, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD(1991)を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞性傷害性への抗体の関与を示す。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる二つの明らかに区別されるタイプの一方に分類できる。
ここで使用されるＩｇＧ「アイソタイプ」又は「サブクラス」なる用語は、その定常領域の化学的及び抗原性特徴によって定まる免疫グロブリンのサブクラスの何れかを意味する。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分類される。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、一般に例えばAbbas等, Cellular 及びMol. Immunology, 4版 (W.B. Saunders, Co., 2000)に記載されている。抗体は、一又は複数の他のタンパク質又はペプチドとの抗体の共有又は非共有結合によって形成されるより大きな融合分子の一部であってもよい。
ここで使用される「ＩｇＧサブクラス修飾」なる用語は、あるＩｇＧアイソタイプの一つのアミノ酸を異なったアラインされたＩｇＧアイソタイプにおける対応するアミノ酸に転換するアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧ１はチロシンを、ＩｇＧ２はフェニルアラニンをＥＵ位置２９６に含むので、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換はｌｇＧサブクラス修飾であると考えられる。
ここで使用される「天然に生じる修飾」は、アイソタイプではないアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧｓの何れもグルタミン酸を３３２位に含まないので、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４におけるグルタミン酸での３３２位の置換（３３２Ｅ）は、非天然発生修飾と考えられる。
「完全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」という用語は、ここでは交換可能に使用され、その実質的にインタクトな形態の抗体を指す。この用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
ここでの目的にとって、「ネイキッド抗体」とは、細胞傷害性部分又は放射標識にコンジュゲートされていない抗体である。
「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合を含む、インタクトな抗体の一部を含んでなる。ある実施態様では、抗体断片はＦｃ領域又はここに開示された一又は複数のＦｃ領域を含むＦｃ領域の一部を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位と、残りは名前がその容易に結晶化する能力を反映する残りの「Ｆｃ」断片とを有する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を持ち、抗原に尚も架橋可能であるＦ(ａｂ')２断片を生じる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。一実施態様では、二本鎖Ｆｖ種は強固な非共有結合の一つの重鎖可変ドメインと一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、一つの重鎖可変ドメインと一つの軽鎖可変ドメインが、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種におけるものに類似した「二量体」構造で会合しうるように、可動性ペプチドリンカーによって共有的に連結されうる。各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成するのはこの構造においてである。集合的には、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＨＶＲだけを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性でではあるが、抗原を認識しそれに結合する能力を有している。
Ｆａｂ断片は重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、また軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含んでいる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加される点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ’についてのここでの標記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片対として元々は生産された。抗体断片の他の化学的カップリングもまた知られている。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般には、ｓＦｖポリペプチドは、ｓｃＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨ及びＶＬドメイン間に更に含む。ｓｃＦｖの概説については、例えばPluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315を参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持ち、その断片が同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に結合した重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む抗体断片を指す。非常に短いために同一鎖上で二つのドメイン間での対形成を可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは二価又は二重特異的でありうる。ダイアボディは、例えば欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；及びHudson等, Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)に更に十分に記載されている。トリアボディ及びダイアボディはまたHudson等, Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、例えば少量で存在しうる天然に生じる突然変異などの、可能な突然変異体を除いて、集団を含む個々の抗体が同一である。よって、「モノクローナル」との形容は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。ある実施態様では、このようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含む方法により得られる。例えば、該選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの唯一のクローンの選択でありうる。選択された標的結合配列を更に改変させることにより、例えば標的への親和性の改善、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多重特異性抗体の生成等が可能になり、また改変された標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることが理解されなければならない。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、それらが他の免疫グロブリンで典型的には汚染されていないという点で有利である。
「モノクローナル」との修飾詞は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の性質を示すものであり、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法（例えばKohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995)；Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2版 1988)；Hammerling等, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４８１６５６７号を参照）、ファージディスプレイ法（例えばClackson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1992)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等 J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)を参照）、及びヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座又は遺伝子の一部又は全てを有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば国際公開第１９９８／２４８９３号；同第１９９６／３４０９６号；同第１９９６／３３７３５号；同第１９９１／１０７４１号；Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；及び同第５６６１０１６号；Marks等, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature, 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)；及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)を参照）を含む様々な技術によって作製することができる。
ここでのモノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同であるが、鎖の残りが他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む（米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)）。キメラ抗体は、抗体の抗原結合領域が、例えば対象の抗原でマカクザルを免役化することによって、生産された抗体から誘導されるプリマタイズ（PRIMATIZED(登録商標)）抗体を含む。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体はレシピエントのＨＶＲからの残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト霊長類などの非ヒト(ドナー抗体)のＨＶＲからの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域又はドメイン(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい。また例えば、Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994);及び米国特許第６９８２３２１号及び同第７０８７４０９号を参照のこと。
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を作製する何れかの技術を使用して作製されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含むこの分野で知られた様々な方法を用いて産生せしめることができる。Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。ヒトモノクローナル抗体の調製にまた利用できるものは、Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner等, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)に記載された方法である。また van Dijk 及びvan de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)を参照のこと。ヒト抗体は、抗原暴露に応答してかかる抗体を産生せしめるように改変されているが、その内因性遺伝子座が無能にされているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによって調製されうる(XENOMOUSETM 技術に関しては例えば米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号を参照)。またヒトＢ細胞ハイブリドーマ法によって生産されるヒト抗体に関しては、Li等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) を参照のこと。
「種依存性抗体」は、二番目の哺乳動物種からの抗原の相同体に対して有している結合親和性よりも、一番目の哺乳動物種からの抗原に対してより強力な結合親和性を有するものである。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８以下、最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）と「特異的に結合」するが、そのヒト抗原に対する結合親和性よりも、少なくとも約５０倍、又は少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１０００倍弱い、二番目の非ヒト哺乳動物種からの抗原の相同体に対する結合親和性を有する。種依存性抗体は、上で定義した様々な型の抗体の何れでもありうるが、好ましくはヒト化又はヒト抗体である。
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つのＨＶＲｓを含む；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つの高頻度可変領域のうちで最も高い多様性を示し、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすと信じられている。例えば、Xu等, Immunity 13:37-45 (2000)；Johnson 及びWu, Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)を参照のこと。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。例えば、Hamers-Casterman等, Nature 363:446-448 (1993)；Sheriff等, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)を参照のこと。
多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに包含される。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列多様性に基づいており、最も一般的に使用されている（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している（Chothia 及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＨＶＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の解析に基づく。これらのＨＶＲｓのそれぞれからの残基を以下に示す。
ループ カバット AbM Chothia 接触
---- ----- --- ------- -------
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(Kabat番号付け)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Chothia番号付け)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
ＨＶＲは、次のような「拡大ＨＶＲ」を含みうる：ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)、及びＶＨの２６−３５又は２６−３５Ａ(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々について、上掲のKabat等に従って番号が付されている。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここに定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
「カバット(Kabat)による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる言い回しは、上掲のKabat 等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列と抗体配列の相同領域でアライメントすることによって、与えられた抗体について決定されうる。
可変ドメイン（およそ軽鎖の残基１−１０７及び重鎖の残基１−１１３）中の残基に言及するとき、カバットの番号付けシステムが一般に使用される(例えばKabat等, Sequences of Immunological Interest. 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。免疫グロブリン重鎖定常領域中の残基に言及するとき、「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」が一般に使用される（例えば上掲のＫａｂａｔ等に報告されているＥＵインデックス）。「カバットにおけるようなＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。ここで別の定義を述べない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号の参照は、カバット番号付けシステムによる残基番号付けを意味する。ここで別の定義を述べない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号の参照は、ＥＵ番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する（例えば、ＰＣＴ公開第２００６０７３９４１号を参照）。
「親和成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる一又は複数の改変をその一又は複数のＨＶＲに持つものである。一実施態様では、親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られている手順によって生産されうる。Marks等, Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和成熟について記載している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘導は、例えばBarbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier等, Gene, 169：147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
「阻止(ブロック)」抗体又は「アンタゴニスト」抗体とは、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低下させる抗体である。特定の阻止抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を、実質的に又は完全に阻害する。
ここで使用される「アゴニスト」抗体は、対象とするポリペプチドの機能的活性の少なくとも一つを部分的に又は完全に模倣する抗体である。
「増殖阻害」抗体は、抗体が結合する抗原を発現している細胞の増殖を阻害又は低減するものである。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
ここでの「Ｆｃ領域」なる用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６の位置又はＰｒｏ２３０からの位置のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換え的に操作することによって取り除かれてもよい。従って、インタクト抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。ある実施態様では、免疫グロブリンのＦｃ領域は二つの定常ドメインＣＨ２及びＣＨ３を含む。
ヒトＩｇＧＦｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」(「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる)は通常アミノ酸残基で約２３１位のアミノ酸から約３４０位のアミノ酸まで伸展する。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接には対をなさないという点で独特である。むしろ、２つのＮ結合分岐糖鎖が未変性のインタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に介在されている。糖鎖はドメイン−ドメイン対形成に対する代替物を提供し得、ＣＨ２ドメインを安定化させるのに役立つと推測されてきた。Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)。
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｃ末端からＦｃ領域のＣＨ２ドメインへの残基の伸展を含む(すなわち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基）。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；ＡＤＣＣ；ファゴサイトーシス；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ)のダウンレギュレーション等が含まれる。このようなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域を結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組合せることが必要であり、様々なアッセイを使用して評価することができる。
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトＦｃ領域には、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（非Ａ−及びＡアロタイプ）；天然配列のヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域；並びにその天然に生じる変異体が含まれる（例えば、配列番号：１１から配列番号：１７を参照）。
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも一のアミノ酸修飾により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域のものとは一又は複数のアミノ酸置換が異なるアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、変異体Ｆｃ領域は、野生型ＩｇＧ又は野生型抗体のＦｃ領域と比較して少なくとも一つのアミノ酸置換を有する。ある実施態様では、変異体Ｆｃ領域は、野生型抗体のＦｃ領域に二以上のアミノ酸置換を有する。ある実施態様では、変異体Ｆｃ領域は、野生型抗体のＦｃ領域に三以上のアミノ酸置換を有する。ある実施態様では、変異体Ｆｃ領域は少なくとも一つ、二つ又は三つ以上のここに記載のＦｃ領域アミノ酸置換を有する。ある実施態様では、ここでの変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性を有するであろう。ある実施態様では、ここでの変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約９０％の相同性を有するであろう。ある実施態様では、ここでの変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約９５％の相同性を有するであろう。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載する。幾つかの実施態様では、ＦｃＲは天然ヒトＦｃＲである。幾つかの実施態様では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性化レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害レセプター」)を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫レセプターチロシン−ベース阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)を有する（例えばDaeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)を参照）。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas等, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)に概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける用語「ＦｃＲ」に包含される。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語はまた胎児への母のＩｇＧの移動(Guyer等, J. Immunol. 117:587(1976)及びKim等, J. Immunol. 24:249(1994))、及び免疫グロブリンの恒常性維持の調節の原因となる、新生児レセプターＦｃＲｎを含む。ＦｃＲｎへの結合性を測定する方法は知られている（例えば、Ghetie 及びWard, Immunology Today,18(12):592-8(1997)；Ghetie等, Nature Biotechnology, 15(7):637-40(1997)；Hinton等, J. Biol. Chem.,279(8):6213-6(2004)；国際公開第２００４／９２２１９号(Hinton等)を参照）。
ヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドのインビボ又は血清半減期は、例えば変異Ｆｃ領域を有するポリペプチドが投与されたトランスジェニックマウス、ヒト、又は非ヒト霊長類においてアッセイすることができる。例えばPetkova等 International Immunology 18(12):1759-1769 (2006)をまた参照。
「ヒトエフェクター細胞」は、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実施する白血球である。ある実施態様では、細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実施する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球を含む。エフェクター細胞は、天然源、例えば血液から単離することができる。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」又は「ＡＤＣＣ」は、ある種の細胞傷害性細胞(例えば、ＮＫ細胞、好中球、及びマクロファージ)に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)上に結合した分泌Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を、抗原担持標的細胞に特異的に結合せしめ、ついで細胞毒で標的細胞を殺すという細胞傷害性の形態を意味する。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。関心ある分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は同５８２１３３７号、又は米国特許第６７３７０５６号(Presta)に記載されているもののようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞を含む。あるいは、又は付加的に、関心ある分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 95:652-656(1998)に開示されたもののような動物モデルにおいてインビボで評価されうる。
「補体依存性細胞傷害性」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を意味する。古典的な補体経路の活性化は、補体系(Ｃｌｑ)の第１成分が、その同族抗原と結合した抗体(適切なサブクラスのもの)に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163(1996)に記載されているように実施することができる。Ｆｃ領域アミノ酸配列(変異Ｆｃ領域を有するポリペプチド)が改変され、Ｃ１ｑ結合能力が増加又は低下させられたポリペプチド変異体は、例えば米国特許第６１９４５５１号及び国際公開第１９９９／５１６４２号に記載されている。また、例えばIdusogie等, J. Immunol. 164:4178-4184(2000)を参照。
「改変された」ＦｃＲ結合親和性又はＡＤＣＣ活性を有するポリペプチド変異体は、親ポリペプチドもしくは天然配列Ｆｃ領域を有するポリペプチドと比較して亢進又は減弱化されたＦｃＲ結合活性及び／又はＡＤＣＣ活性を持つものである。ＦｃＲに対して「増加した結合性を示す」ポリペプチド変異体は、少なくとも一つのＦｃＲに親ポリペプチドよ良好な親和性で結合する。ＦｃＲに対して「減弱した結合性を示す」ポリペプチド変異体は、少なくとも一つのＦｃＲに親ポリペプチドよりは弱い親和性で結合する。そのようなＦｃＲに対して減弱化した結合性を示す変異体は、ほとんどあるいは全く認識できない弱いＦｃＲへの結合性、例えば、天然配列のＩｇＧ Ｆｃ領域と比較しておよそ０−２０％のＦｃＲへの結合性しか有していない場合がある。
親抗体よりも「ヒトエフェクター細胞の存在下において、より効果的に抗体依存性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)を媒介する」ポリペプチド変異体は、アッセイに使用されるポリペプチド変異体及び親抗体の量を本質的に同じにした場合、インビトロもしくはインビボにおいて実質的により効果的にＡＤＣＣを媒介するものである。一般に、そのような変異体は、ここに開示されるインビトロＡＤＣＣアッセイを用いて同定されるであろうが、例えば動物モデル等において、ＡＤＣＣ活性を決定するその他のアッセイもしくは方法も考慮される。
「結合親和性」は、一般に、分子(例えば抗体)の単一の結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有相互作用の合計の強度を意味する。特に示さない限り、ここで使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば、抗体と抗原)間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を意味する。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、会合定数（Ｋａ）の逆数である解離定数(Ｋｄ)により表すことができる。親和性は、ここに開示されたものを含む、当該分野で知られている一般的な方法により測定することができる。低親和性抗体は、一般に抗原にゆっくりと結合し、及び／又は容易に解離する傾向にあるが、高親和性抗体は、一般により素早く抗原に結合し、及び／又は長時間、結合したまま残る傾向にある。結合親和性を測定する様々な方法が当該分野で知られており、その何れかを本発明の目的に使用することができる。結合親和性を測定するための、特定の例証及び例示的実施態様を以下に記載する。
ある実施態様では、本発明に係る「ＫＤ」、「Ｋｄ」、「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、〜１０反応単位(ＲＵ)で、固定化抗原ＣＭ５チップを用い、２５℃にて、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)−３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を使用する表面プラズモン共鳴法により測定される。簡単に述べると、カルボキシメチル化されたデキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIACORE Inc.)は、供給者の使用説明書に従い、Ｎ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)で活性化される。抗原は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８を用いて、カップリングしたタンパク質の反応単位(ＲＵ)が約１０になるように、５μｌ／分の流量で注入する前に、５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈される。抗原を注射した後、１Ｍのエタノールアミンを注入し、未反応基をブロックする。動力学測定のために、ポリペプチド、例えば完全長抗体の連続希釈物を、約２５μｌ／分の流量で、２５℃にて、ＰＢＳに０．０５％のトゥイーン２０ＴＭ界面活性剤が入ったもの(ＰＢＳＴ)に注入する。会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を、会合と解離のセンサーグラムを同時に適合させることにより、単一の１対１のラングミュア結合モデル(BIACORE(登録商標)評価ソフトウェア・バージョン3.2)を使用して算出する。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率として算出する。例えば、Chen等,J. Mol. Biol., 293:865-881(1999)を参照。オン速度(on-rate)が、上述した表面プラズモン共鳴アッセイにより、１０６Ｍ−１ｓ−１を超過しているならば、オン速度は、分光計、例えばストップフローが具備された分光光度計(Aviv Instruments)、又は８０００シリーズのＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計(ThermoSpectronic)で攪拌キュベットを具備するもので測定される場合、増加濃度の抗原下、ＰＢＳに２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ形)が入ったものを２５℃で、蛍光発光強度(励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍの帯域通過)における増加又は減少を測定する蛍光クエンチング技術を使用して測定可能である。
この発明の「オン速度」、「解離の速度」、「解離速度」又は「ｋｏｎ」は、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)−３０００システム(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を使用し、上述にて記載したように測定することができる。
ここで使用される場合、「実質的に類似」又は「実質的に同様」なる用語は、２つの数値の間の十分高度な類似性を示し、当業者であれば、該値(例えばＫｄ値)により測定される生物学的特徴の範囲内で、２つの値の間に、ほとんど又は全く生物学的及び／又は統計的に有意な差がないとみなすであろう。ある実施態様では、前記２つの値の間の差異は、例えば、参照／比較器値の関数として、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、及び／又は約１０％未満である。
ここで使用される語句「実質的に低減」又は「実質的に異なる」は、２つの数値の間の十分高度な差異を示し、当業者であれば、該値(例えばＫｄ値)により測定される生物学的特徴の範囲内で、２つの値の間に、統計的に有意な差異があるとみなすであろう。ある実施態様では、前記２つの値の間の差異は、例えば、参照／比較器分子に対する値の関数として、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、及び／又は約５０％以上である。
ここでの目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られるＶＬ又はＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含むか、又は既存のアミノ酸配列変化を含んでいてもよい。幾つかの実施態様では、既存のアミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下又は２以下である。既存のアミノ酸変化がＶＨ中に存在する場合、好ましくは、それらの変化は位置７１Ｈ、７３Ｈ及び７８Ｈの内の３つ、２つ又は１つのみである；例えば、それらの位置のアミノ酸残基は、７１Ａ、７３Ｔ及び／又は７８Ａでありうる。一実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選別する。一般に、配列のサブグループは上掲のKabat等におけるようなサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、サブグループはKabat等におけるようなサブグループκＩである。一実施態様では、ＶＨについて、サブグループは上掲のKabat等におけるようなサブグループＩＩＩである。
「ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変重鎖サブグループＩＩＩのアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。
「ＶＬサブグループＩコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変軽鎖カッパサブグループＩのアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。
「精製された」は、分子が試料中に少なくとも９５重量％の濃度で、又はそれが含まれる試料の少なくとも９８重量％で存在することを意味する。
「単離された」核酸分子は、例えばその天然の環境において通常は付随している少なくとも一の他の核酸分子から分離されている核酸分子である。単離された核酸分子は、該核酸分子を通常は発現する細胞に含まれる核酸分子を更に含むが、該核酸分子はその天然の染色***置とは異なった染色***置に又は染色体外に存在する。
ここで使用される「ベクター」という用語は、それが連結しているその他の核酸を輸送することのできる核酸分子を指す。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、付加的なＤＮＡセグメントがライゲーションされうる環状二本鎖ＤＮＡを指す。他のタイプのベクターはファージベクターである。その他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされうる。ある種のベクターは、それらが導入される宿主内において自己複製することができる(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製される。更に、ある種のベクターは、それらが作用可能に連結している遺伝子の発現を方向づけ得る。このようなベクターは、ここでは、「組換え発現ベクター」、あるいは単に「組換えベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術で利用される発現ベクターは、しばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」及び「ベクター」は相互交換可能に使用されうる。
ここで使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらのアナログ、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込まれうる任意の基質でありうる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらのアナログを含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識への結合により、なされる修飾を含みうる。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、アナログとの自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチドの未修飾形態が含まれる。更に、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへの更なる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体又は半固体担体に結合されてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有する有機キャップ基部分又はアミンで置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されうる。またポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものを更に含み得、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖のアナログ、α-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、及び非塩基性ヌクレオシドログ、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオエート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオエート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミデート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで言及される全てのポリヌクレオチドに当てはまる。
ここで使用される「オリゴヌクレオチド」は、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述の記載はオリゴヌクレオチドに対して等しく完全に当てはまる。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれているときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合しているＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み取り枠にあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、一般的な手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
ここで使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養」という表現は相互に交換可能に用いられ、その全ての用語は子孫を含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語句は、初代対象細胞及び何度培養が継代されたかに関わらず初代のものから誘導された培養を含む。また、全ての子孫が、意図的な変異あるいは意図しない変異の影響で、正確に同一のＤＮＡを有するわけではないことも理解される。元々の形質転換細胞についてスクリーニングしたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。命名を区別することが意図される場合は、文脈から明らかであろう。
ここで使用される場合、「コドンセット」は所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列を指す。一組のオリゴヌクレオチドは、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せの全てを表し、所望のアミノ酸群をコードする配列を含み、例えば固相法によって合成することができる。標準的なコドン命名形式はＩＵＢコードのものであり、当該分野で知られておりここに記載されている。コドンセットは、典型的には３つのイタリック大文字、例えばＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＤＶＫなどで表される。よって、ここで用いられる「非ランダムコドンセット」とは、ここに記載のアミノ酸選別の基準を部分的に、好ましくは完全に満たす選択アミノ酸をコードするコドンセットを意味する。ある位置の選択されたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は当該分野でよく知られており、例えば、ＴＲＩＭ手法が知られている（Knappek等, J.Mol.Biol.(1999), 296:57-86)；Garrard及びHenner, Gene(1993), 128:103）。そのようなある種のコドンセットを有しているオリゴヌクレオチドのセットは、市販の核酸シンセサイザー(Applied Biosystems, Foster City, CAなどから入手可能)を使って合成することができ、又は市販品を入手することができる(例えば、Life Technologies, Rockville, MDから)。従って、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、典型的には、異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコドンセットによるものである。本発明で使用される、オリゴヌクレオチドは、可変ドメイン核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、そうであるとは限らないが、例えばクローニング目的に有用である制限酵素部位を含むこともできる。
「線状抗体」との表現は、Zapata等(1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062)に記載の抗体を意味する。簡単に言えば、これらの抗体は、相補的な軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する一対の直列のＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は二重特異性又は単一特異性でありうる。
ここで用いられる場合、「ライブラリー」は、複数の抗体もしくは抗体断片配列（例えば、本発明の変異体ＩｇＧｓ）、又はこれらの配列をコードする核酸を意味し、該配列は本発明の方法によってこれら配列内に導入される変異型アミノ酸の組合せにおいて異なっている。
「ファージディスプレイ」は、ポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージの粒子の表面でコートタンパク質の少なくとも一部と融合したタンパク質として提示する手法である。ファージディスプレイの有用性は、ランダム化タンパク質変異体の大きなライブラリーから対象抗原と高親和性で結合する配列を迅速かつ効率的に選別できることにある。ファージ上のペプチド及びタンパク質ライブラリーの提示は、何百万ものポリペプチドから特異的結合特性を持つものをスクリーニングするために利用されてきた。多価ファージディスプレイ法は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩとの融合体を通して小さなランダムペプチド及び小タンパク質を提示するために利用されてきた。Wells及びLowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol., 3: 355-362とその中の引用文献。一価のファージディスプレイでは、タンパク質又はペプチドのライブラリーが遺伝子ＩＩＩ又はその一部に融合され、ファージ粒子が融合タンパク質の１個又は０個のコピーを提示するように野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で低レベルで発現される。アビディティー効果は多価のファージと比較して低下しているので、選別は内在性のリガンド親和性に基づいており、ファージミドベクターが使われるが、このベクターはＤＮＡ操作を単純化する。Lowman及びWells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216。
「ファージミド」は、細菌の複製起点、例えばＣｏ１Ｅ１及びバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドは任意の既知のバクテリオファージ、例えば繊維状バクテリオファージ及びラムドイドバクテリオファージに使用できる。プラスミドは、一般に、抗生物質耐性の選択マーカーも含む。これらのベクターにクローニングされたＤＮＡセグメントは、プラスミドとして増殖することができる。これらのベクターを備える細胞がファージ粒子の生産のために必要なすべての遺伝子を備えているとき、プラスミドの複製様式はローリングサークル複製に変化し、プラスミドＤＮＡの一つの鎖のコピーとパッケージファージ粒子を生成する。ファージミドは感染性又は非感染性ファージ粒子を形成しうる。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面で提示されるように遺伝子融合体として異種ポリペプチド遺伝子と結合したファージコートタンパク質遺伝子又はその断片を含むファージミドを含む。
「ファージベクター」なる用語は、異種遺伝子を含んでいて複製ができるバクテリオファージの二本鎖複製型を意味する。ファージベクターは、ファージ複製及びファージ粒子形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは好ましくは繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージもしくはその誘導体、又はラムドイドファージ、例えばラムダ、２１、ファイ８０、ファイ８１、８２、４２４、４３４、その他もしくはその誘導体である。
ここで使用される場合、「溶媒露出位置」は、溶媒露出に潜在的に利用可能であり及び／又は抗体特異性抗原などの分子との接触可能である、抗体又は抗原結合断片の構造、構造アンサンブル及び／又はモデル化された構造に基づき決定される、ソース抗体又は抗原結合断片の重鎖及び軽鎖の可変領域中のアミノ酸残基の位置を指す。これらの位置は典型的にはＣＤＲ中で、タンパク質の外側に見出される。ここで定義される、抗体又は抗原結合断片の溶媒露出位置は、当該分野で知られている多くのアルゴリズムの何れかを使って決定できる。一実施態様では、溶媒露出位置は抗体の三次元モデルからの座標を使い、好ましくはＩｎｓｉｇｈｔＩＩプログラム(Accelrys, San Diego, CA)のようなコンピュータプログラムを使って決定される。溶媒露出位置は、当該分野で知られているアルゴリズム(例えば、Lee及びRichards (1971) J. Mol. Biol. 55, 379 及びConnolly (1983) J. Appl. Cryst. 16, 548)を使用して決定することもできる。溶媒露出位置の決定は、タンパク質モデリングに適したソフトウェア及び抗体から得られる三次元構造情報を使って行うことができる。これらの目的のために利用できるソフトウェアには、ＳＹＢＹＬ生体高分子モジュールソフトウェア(Tripos Associates)が含まれる。一般に、アルゴリズム(プログラム)がユーザーの入力サイズパラメータを必要とする場合は、計算において使われるプローブの「サイズ」は半径約１．４オングストローム以下に設定される。また、パーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用した溶媒露出領域及び面積の決定法が、Pacios (1994) Comput. Chem. 18(4): 377-386に記載されている。
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって著作され、そのソースコードは米国著作権庁(ワシントン D.C.，20559)に使用者用書類と共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社（サウスサンフランシスコ, カリフォルニア）から公的に入手可能であり、又はソースコードからコンパイルされうる。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされなければならない。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され、変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対するある程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることが理解されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて直ぐ上の段落に記載されるようにして得られる。
ここで使用される「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語は、Leung等 (1989) Science, 246:1306 、及びHouck等 (1991) Mol. Endocrin., 5:1806 によって記載されているように、１６５アミノ酸のヒト血管内皮増殖因子と、関連した１２１-、１８９-、及び２０６-アミノ酸のヒト血管内皮増殖因子、並びにそれらの天然に生じる対立遺伝子型及びプロセシング型を意味する。また、「ＶＥＧＦ」なる用語は、非ヒト種、マウス、ラット又は霊長類由来のＶＥＧＦも意味する。特定の種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦはｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦはｍＶＥＧＦなどの用語で表されることが多い。また、「ＶＥＧＦ」なる用語は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮増殖因子のアミノ酸８〜１０９、又は１〜１０９を含む切断型ポリペプチドを意味する。そのようなＶＥＧＦ型を指すときは、本明細書では、例えば、「ＶＥＧＦ(８−１０９)」、「ＶＥＧＦ(１−１０９)」又は「ＶＥＧＦ１６５」と表す。「切断型の」天然のＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然のＶＥＧＦ配列に示される数で示す。例えば、切断型の天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７(メチオニン)は、天然のＶＥＧＦ中の位置１７(メチオニン)でもある。切断型の天然ＶＥＧＦは天然のＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲ及びＦｌｔ−１レセプター結合親和性を有する。
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、限定しないが、一又は複数のＶＥＧＦレセプターへの結合を含むＶＥＧＦ活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減又は干渉することができる分子を指す。ＶＥＧＦアンタゴニストには、限定しないが、抗ＶＥＧＦ抗体及びその抗原結合性断片、レセプター分子及び一又は複数のレセプターへの結合を隔離することによってＶＥＧＦに特異的に結合する誘導体、抗ＶＥＧＦレセプター抗体、ＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、例えばＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子インヒビター及びＶＥＧＦトラップのようなＶＥＧＦに結合するイムノアドヘシンが含まれる。ここで使用される「ＶＥＧＦアンタゴニスト」なる用語は、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減又は干渉することができる、抗体、抗体断片、他の結合ポリペプチド、ペプチド、及び非ペプチド小分子を含む分子を特に含む。よって、「ＶＥＧＦ活性」なる用語は特にＶＥＧＦのＶＥＧＦ媒介生物学的活性を含む。
ＶＥＧＦポリペプチドに関する「生物学的活性」及び「生物学的に活性な」又は「ＶＥＧＦ活性」なる用語は、完全長及び／又は切断型ＶＥＧＦに伴う物理的／化学的性質及び生物学的機能を意味する。ある実施態様では、ＶＥＧＦ活性は、血管新生（angiogenesis）を誘導し、及び／又は刺激し、及び／又は促進する。ある実施態様では、ＶＥＧＦ活性は、血管新生（neovascularization）を誘導し、及び／又は刺激し、及び／又は促進する。ある実施態様では、ＶＥＧＦ活性は、血管透過性を誘導し、及び／又は調節する。ある実施態様では、ＶＥＧＦ活性は、内皮細胞遊走及び／又は内皮細胞増殖を誘導し、及び／又は刺激し、及び／又は促進する。
抗ＶＥＧＦ中和抗体は、ヌードマウスにおいて、様々なヒト腫瘍細胞株の増殖を抑制し(Kim等, Nature, 362：841-844(1993)；Warren等, J. Clin. Invest., 95：1789-1797(1995)；Borgstrom等, Cancer Res., 56：4032-4039(1996)；Melnyk等, Cancer Res., 56：921-924(1996))、また虚血性網膜疾患における眼内血管形成を阻害する。Adamis等, Arch. Ophthalmol., 114：66-71(1996)。
「抗ＶＥＧＦ抗体」又は「ＶＥＧＦに結合する抗体」なる用語は、抗体がＶＥＧＦを標的とした診断上の薬剤及び／又は治療上の薬剤として有用であるために十分な親和性と特異性をもってＶＥＧＦに結合することができる抗体を意味する。例えば、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患又は症状を標的とし、妨害する際の治療剤として使用されうる。例えば、米国特許第６５８２９５９号、同第６７０３０２０号；国際公開第９８／４５３３２号；国際公開第９６／３００４６号；国際公開第９４／１０２０２号、国際公開第２００５／０４４８５３号；;欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１；米国特許公開第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、同第２００５０１１２１２６号、同第２００５０１８６２０８号及び同第２００５０１１２１２６号；Popkov等, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)；及び国際公開第２００５０１２３５９号を参照のこと。選択した抗体は通常、ＶＥＧＦに対して十分に強い結合親和性を有する。例えば、抗体は、１００ｎＭ−１ｐＭの間のＫｄ値でｈＶＥＧＦに結合しうる。抗体親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴ベースアッセイ(ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９に記載のあるＢＩＡｃｏｒｅアッセイなど)；酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)；及び競合アッセイ(例えばＲＩＡのもの)によって決定されうる。例えば治療剤としての有効性を評価するために、抗体に他の生物学的な活性アッセイを施してもよい。このようなアッセイは当該分野で知られており、標的抗原と抗体の使用目的に依存する。例として、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ；腫瘍細胞増殖阻害アッセイ(例えば国際公開第８９／０６６９２号に記載のもの)；抗体依存性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)及び補体媒介性細胞傷害性(ＣＤＣ)アッセイ(米国特許第５５００３６２号)；及びアゴニスト活性又は造血アッセイ(国際公開第９５／２７０６２号を参照)などがある。抗ＶＥＧＦ抗体は、通常は、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ又はＶＥＧＦ-Ｅなどの他のＶＥＧＦホモログにも、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦなどの他の増殖因子にも結合しないであろう。一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体には、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ １０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４.６.１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体；Presta等 (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599に従って産生される組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であり、限定するものではないが「ベバシズマブ(ＢＶ)」とも「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」又は「ＡＶＡＳＴＩＮ(アバスチン)(登録商標)」としても知られる抗体が含まれる。ＡＶＡＳＴＩＮ(アバスチン)(登録商標)は、ヒトＶＥＧＦのそのレセプターへの結合をブロックするマウス抗体Ａ.４.６.１から、変異したヒトのＩｇＧ１フレームワーク領域と抗原結合性相補性決定領域を含む。フレームワーク領域の殆どを含む、ベバシズマブのアミノ酸配列のおよそ９３％は、ヒトのＩｇＧ１に由来し、配列の約７％はＡ４.６.１に由来する。ベバシズマブは、約１４９０００ダルトンの分子量を有し、グリコシル化されている。ベバシズマブ及び他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、２００５年２月２６日に発行の米国特許第６８８４８７９号に更に記載されている。ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９に記載されているように、更なる抗ＶＥＧＦ抗体には、Ｇ６又はＢ２０系列抗体(例えば、Ｇ６-２３、Ｇ６-３１、Ｂ２０-４.１)が含まれる。更に好ましい抗体については、米国特許第７０６０２６９号、同第６５８２９５９号、同第６７０３０２０号；同第６０５４２９７号；国際公開第９８／４５３３２号；国際公開第９６／３００４６号；国際公開第９４／１０２０２号；欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１；米国特許公開第２００６００９３６０号、同第２００５０１８６２０８号、同第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、及び同第２００５０１１２１２６号；及び、Popkov等, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)を参照のこと。
ここで使用される「Ｂ２０系列ポリペプチド」なる用語は、ＶＥＧＦに結合する抗体を含むポリペプチドを意味する。Ｂ２０系列ポリペプチドには、限定するものではないが、米国特許出願公開第２００６０２８０７４７号、米国特許出願公開第２００７０１４１０６５号及び／又は米国特許出願公開第２００７００２０２６７号に記載されたＢ２０抗体又はＢ２０誘導抗体の配列から誘導された抗体が含まれ、これらの特許出願の内容は出典明示により明示的にここに援用される。一実施態様では、Ｂ２０系列ポリペプチドは、米国特許出願公開第２００６０２８０７４７号、米国特許出願公開第２００７０１４１０６５号及び／又は米国特許出願公開第２００７００２０２６７号に記載されたＢ２０−４．１である。他の実施態様では、Ｂ２０系列ポリペプチドは、その全開示を出典明示により明示的にここに援用するＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／０７３１６０号に記載されたＢ２０−４．１．１である。
ここで使用される「Ｇ６系列ポリペプチド」なる用語は、ＶＥＧＦに結合する抗体を含むポリペプチドを意味する。Ｇ６系列ポリペプチドは、限定しないが、米国特許出願公開第２００６０２８０７４７号、米国特許出願公開第２００７０１４１０６５号及び／又は米国特許出願公開第２００７００２０２６７号に記載されたＧ６抗体又はＧ６誘導抗体の配列から誘導された抗体を含む。Ｇ６系列ポリペプチドは、米国特許出願公開第２００６０２８０７４７号、米国特許出願公開第２００７０１４１０６５号及び／又は米国特許出願公開第２００７００２０２６７号に記載されたように、限定しないが、Ｇ６−８、Ｇ６−２３及びＧ６−３１を含む。
「血管新生因子又は作用剤」は、血管の発生を刺激する、例えば、血管新生、血管内皮細胞増殖、血管の安定化及び／又は脈管形成などを促進する増殖因子である。例えば、血管形成因子には、限定するものではないが、例としてＶＥＧＦ及びＶＥＧＦファミリーのメンバー（ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄ）、Ｐ１ＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞増殖因子ファミリー(ＦＧＦ)、ＴＩＥリガンド(アンジオポイエチン)、エフリン、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、Ｄｅｌ-１、線維芽細胞増殖因子：酸性(ａＦＧＦ)及び塩基性(ｂＦＧＦ)、フォリスタチン、顆粒性コロニー刺激因子(Ｇ-ＣＳＦ)、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)／散乱係数(ＳＦ)、インターロイキン-８(ＩＬ-８)、レプチン、ミドカイン、ニューロピリン、胎盤増殖因子、血小板由来内皮細胞増殖因子(ＰＤ-ＥＣＧＦ)、血小板由来増殖因子、特にＰＤＧＦ-ＢＢ又はＰＤＧＦＲ-β、プレイオトロフィン(Pleiotrophin)(ＰＴＮ)、プログラヌリン(progranulin)、プロリフェリン(proliferin)、トランスフォーミング増殖因子-α(ＴＧＦ-α)、トランスフォーミング増殖因子-β(ＴＧＦ-β)、腫瘍壊死因子-α(ＴＮＦ-α)などが含まれる。また、創傷治癒を促進する因子、例として成長ホルモン、インスリン様増殖因子-Ｉ(ＩＧＦ-Ｉ)、ＶＩＧＦ、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、ＣＴＧＦ及びそのファミリーメンバー、及びＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βが含まれる。例えば、Klagsbrun及びD'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39；Streit及びDetmar (2003) Oncogene 22:3172-3179；Ferrara 及びAlitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364；Tonini等 (2003) Oncogene 22:6549-6556 (例えば、既知の血管形成因子を列挙している表１)；及びSato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206を参照のこと。
「抗血管新生剤」又は「血管新生(血管形成)インヒビター」は、直接的か間接的にの何れかで、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を阻害する小分子量の物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド（例えば、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ又はｓｉＲＮＡ）を含む）、単離したタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はそれらのコンジュゲート又は融合タンパク質を意味する。抗血管形成剤には、結合して血管形成因子又はそのレセプターの血管形成活性をブロックする作用剤が含まれることが理解されなければならない。例えば、抗血管形成剤は、上に定義したように血管形成剤に対する抗体又は他のアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦ-Ａに対するか又はＶＥＧＦ-Ａレセプター(例えばＫＤＲレセプター又はＦｌｔ-１レセプター)に対する抗体、Ｇｌｅｅｖｅｃ(登録商標)(イマチニブメシレート)などの抗ＰＤＧＦＲインヒビター、ＶＥＧＦレセプターシグナル伝達を阻止する小分子（例えばＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、ＳＵＴＥＮＴ(登録商標)／ＳＵ１１２４８（スミチニブマレート）、ＡＭＧ７０６、又は例えば国際特許出願ＷＯ２００４／１１３３０４に記載されたもの）である。また、抗血管新生剤には、天然の血管新生インヒビター、例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなどが含まれる。Klagsbrun及びD'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39；Streit及びDetmar (2003) Oncogene 22:3172-3179(例えば、悪性メラノーマの抗血管形成治療を列挙している表３)；Ferrara 及びAlitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364；Tonini等 (2003) Oncogene 22:6549-6556 (例えば、既知の抗血管新生因子を列挙している表２)；及びSato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206(例えば、臨床試験で用いられる抗血管形成剤を列挙している表１)を参照。
「疾患」は本発明の組成物又は方法での治療から恩恵を受ける任意の症状又は疾患である。これは、哺乳動物を当該疾患にさせる病理的症状を含む慢性及び急性疾患又は疾病を含む。本発明の抗体及び抗体断片を使用して治療できる疾患の非限定的な例は、「定義」の下でここに提供される様々な病気及び疾患を含む。
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」なる用語は、ある程度の異常な細胞増殖を伴う疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性にかかわらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、並びに全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」、「癌性」、「癌の」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」はここで言及される場合、相互に排他的ではない。
腫瘍は、固形腫瘍又は非固形又は軟部組織腫瘍でありうる。軟部組織腫瘍の例は、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、成熟Ｂ細胞急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、前リンパ球性白血病、又はヘアリーセル白血病）、又はリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、又はホジキン病）を含む。固形腫瘍は、血液、骨髄、又はリンパ系以外の体組織の任意の癌を含む。固形腫瘍は、上皮細胞由来のものと非上皮細胞のものに更に分けることができる。固形腫瘍の例は、結腸、***、前立腺、肺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、頭頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、胃腸管、肛門、胆嚢、***、上咽頭、皮膚、子宮、***、尿器、膀胱、及び皮膚の腫瘍を含む。非上皮由来の固形腫瘍は、肉腫、脳腫瘍、及び骨腫瘍を含む。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、限定しないが、扁平細胞癌（例えば上皮扁平細胞癌）、肺癌で、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)を含むもの、腹膜の癌、肝細胞癌、胃(gastric)又は腹部(stomach)癌で胃腸癌を含むもの、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿管の癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney)又は腎(renal)癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌、陰茎癌、メラノーマ、表在拡大型メラノーマ、悪性黒子由来メラノーマ、末端黒子型メラノーマ、結節性メラノーマ、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫（低級／濾胞性非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；小リンパ球(ＳＬ)ＮＨＬ；中級／濾胞性ＮＨＬ；中級びまん性ＮＨＬ；高級免疫芽細胞性ＮＨＬ；高級リンパ芽球性ＮＨＬ；高級小非分割細胞ＮＨＬ；バルキー疾患ＮＨＬ；外套細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びワルデンストロームのマクログロブリン病を含む）；慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)；急性リンパ芽球白血病(ＡＬＬ)；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、並びに母斑症に関連した異常な血管増殖、浮腫（例えば脳腫瘍に関連したもの）、メイグス症候群、脳、並びに頭頸部癌及び関連した転移が含まれる。ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧによる治療に受け入れられる癌には、乳癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵癌、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭頸部癌、卵巣癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫が含まれる。ある実施態様では、癌は小細胞肺癌、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、メラノーマ、乳癌、胃癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、及び肝細胞癌からなる群から選択される。また、ある実施態様では、癌は、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、神経膠芽腫及び乳癌で、これら癌の転移型を含むものからなる群から選択される。
癌という用語は、限定しないが、前癌性増殖、良性腫瘍、悪性腫瘍及び休止状態の腫瘍を含む増殖性疾患の群を包含する。良性腫瘍は由来の部位に局在化して残り、離れた部位に浸潤、侵入、又は転移しない。悪性腫瘍はそれらの回りの他の組織に浸潤し損傷させる。それらはまた血流を通して又はリンパ節が位置しているリンパ系を通してそれらが始まったところから離れ、体の他の部分に広がる能力を獲得しうる。休止状態の腫瘍は、腫瘍細胞が存在するが、腫瘍進行が臨床的に明らかではない無活動の腫瘍である。原発性腫瘍はそれらが生じる組織のタイプによって分類される；転移性腫瘍は癌細胞が誘導される組織タイプによって分類される。時間の経過によって、悪性腫瘍の細胞はより異常になり、正常細胞に余り似ていないものに見える。癌細胞の外観のこの変化は腫瘍悪性度と呼ばれ、癌細胞は高分化型、中分化型、低分化型、又は未分化型であるとして記載されている。高分化型細胞は、かなり正常な外観であり、それらが由来する正常細胞に似ている。未分化型細胞は、非常に異常であるので細胞の由来を決定することがもはやできない細胞である。
上皮細胞癌は一般的に良性腫瘍から、基底膜に貫通し上皮下間質に侵入した前浸潤段階（例えば上皮内癌）に進化する。
「異形成」は、組織、器官、又は細胞のあらゆる異常な増殖又は発生を意味する。ある実施態様では、異形成は高悪性度又は前癌性である。
「転移」は、その原発部位から体の他の場所への癌の広がりを意味する。癌細胞は血流を通して原発性腫瘍から離れ、リンパ及び血管中に浸透し、血流を通して循環し、体の他の場所の正常組織における遠位の病巣で増殖（転移）しうる。転移は局所的又は遠位でありうる。転移は、原発性腫瘍から別れ、血流を移動し、遠位の部位で止まる腫瘍細胞に随伴性の連続的な過程である。新しい部位で、細胞は血液供給を樹立し、成長して命を脅かす塊を形成しうる。腫瘍細胞内の刺激性経路と阻害性分離経路の双方がこの挙動を調節し、遠位部位での腫瘍細胞と宿主細胞の間の相互作用がまた顕著である。
「微小転移巣」は、原発腫瘍から体の他の部分へ広がった少数の細胞を意味する。微小転移巣はスクリーニング又は診断試験で検出され得、又はされ得ない。
「非転移性」は、良性であるか、又は原発性部位に残り、リンパ又は血管系にあるいは原発部位以外の組織に侵入しなかった癌を意味する。一般に、非転移性癌は、ステージ０、Ｉ、又はＩＩ癌、時折、ステージＩＩＩの癌である任意の癌である。
「ステージ０」、「ステージＩ」、「ステージＩＩ」、「ステージＩＩＩ」、又は「ステージＩＶ」との腫瘍又は癌の言及は、当該分野で知られている総合段階分類法(Overall Stage Grouping)又はローマ数字段階付け法(Roman Numeral Staging methods)を用いた腫瘍又は癌の分類を示す。当分野で公知の総合段階分類法(Overall Stage Grouping)又はローマ数字段階付け法(Roman Numeral Staging methods)を用いた腫瘍又は癌の分類を表す。癌の実際のステージは癌の種類に依存するが、一般には、ステージ０の癌はインサイツの病巣にあり、ステージＩの癌は小さく限局した腫瘍であり、ステージＩＩおよびＩＩＩの癌は局所のリンパ節の併発を示す局所的に進行した腫瘍であり、ステージＩＶの癌は転移性癌を表す。各種類の腫瘍に特異的なステージは臨床医に知られている。
「原発性腫瘍」又は「原発性癌」は元の癌を意味し、被検体の身体の他の組織、臓器又は部位に位置する転移性病巣を意味しない。
「良性腫瘍」又は「良性癌」は、元の部位に限局したままである腫瘍を意味し、遠位の部位への浸潤、侵入又は転移の能力を有さない。
ここでの「癌再発」は、治療の後に癌が回復することを指し、原発性臓器での癌の回復だけでなく、癌が原発性臓器以外で回復する遠位性再発も包含する。
「腫瘍休止」は、腫瘍細胞が存在するが、腫瘍進行は臨床上見られない、持続性の不活発状態を意味する。休止腫瘍はスクリーニング又は診断用試験において検出されるかもしれないし、されないかもしれない。
「腫瘍量」は、体内の癌細胞の数、腫瘍のサイズ、又は癌の量を意味する。また、腫瘍量(tumor burden)は腫瘍負荷(tumor load)とも称される。
「腫瘍数」は腫瘍の数を意味する。
本発明の抗体及び抗体断片での治療が受け入れられる非腫瘍性症状は、限定するものではないが、望ましくない又は異常な肥大、良性前立腺肥大、関節炎、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病、エイズ関連認知症、パーキンソン病、 筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症及び小脳変性症）、自己免疫疾患、乾癬、乾癬の斑、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム動脈硬化性斑、橋本甲状腺炎、血管新生疾患、眼疾患、例えば推定眼ヒストプラスマ症候群、網膜血管新生、未熟児の網膜症を含む糖尿病性及び他の増殖性の網膜症、糖尿病性腎症、水晶体後繊維増殖、血管新生緑内障、加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡叢血管新生、虹彩(angle)の血管新生（ルベオーシス）、眼性新生血管疾患、血管疾患、血管内皮細胞の異常増殖を含む症状、血管再狭窄、ギラン・バレー症候群、ポリープ、例えば結腸ポリープ、家族性大腸ポリポーシス、鼻茸又は消化管ポリープ、消化管潰瘍、乳児肥厚性幽門狭窄症、尿路閉塞性症候群、メネトリエ病、分泌腺腫又は蛋白漏出性症候群、線維腺腫、呼吸器疾患、胆嚢炎、神経線維腫症、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成（グレーブズ病を含む）、角膜及び他の組織移植、炎症性疾患、慢性炎症、肺炎症、急性肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、慢性閉塞性肺疾患、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、アテローム、火傷、外傷、放射、卒中、低酸素又は虚血語の浮腫、心筋梗塞からの浮腫、虚血傷害、大脳虚血事象後の損傷、脳浮腫（例えば、急性脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷と関連している）、血小板凝集によって引き起こされる血栓、線維性又は眼窩(edemia)疾患、例えば肝硬変、肺線維症、サルコイドーシス(carcoidosis)、甲状腺炎、過粘稠度症候群全身性、滑液炎症、ＲＡのパンヌス形成、筋炎骨化、高親和性骨形成、骨関節炎、クル病及び骨粗鬆症のような骨関連病状、抵抗性腹水、骨又は関節炎症、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、腎臓又は肝臓；Ｔ細胞媒介性過敏症疾患、パジェット病、多発性嚢胞腎疾患、液体性疾患の第３の間隔(3rd spacing)（膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾患）、慢性炎症、例えばＩＢＤ（クローン病及び潰瘍性大腸炎）、腎疾患、腎臓同種移植拒絶、移植片対宿主病又は移植拒絶反応、炎症性腸疾患、急性及び慢性腎症（増殖性糸球体腎炎及び糖尿病誘発性腎疾患を含む）、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊増殖（癌以外）、血友病関節、肥大した瘢痕、体毛成長の抑制、 オスラー・ウェーバー・ランデュ症候群、化膿性肉芽腫、後水晶体線維増殖症、強皮症、トラコーマ、脈管粘着力、関節滑膜炎、皮膚の過敏症反応、乾癬及び皮膚炎を含む皮膚疾患、湿疹、光加齢（例えばヒトの皮膚のＵＶ照射により引き起こされる）、肥大瘢痕形成、生殖性症状、例えば子宮内膜症、卵巣過剰刺激症候群、多嚢胞性卵巣疾患、子癇前症、機能性子宮出血、又は機能性子宮出血、子宮筋腫、早期分娩、腹水、心嚢貯留液（例えば心外膜炎と関連しているもの）、胸水貯留、内毒素ショック及び真菌症、アデノウイルス、ハンタウイルス、ライム病ボレリア、エルニシアｓｐｐ．、百日咳菌から選択される微生物病原を含むある種の微生物感染及び精神疾患（例えば統合失調症、双極性うつ病、自閉症、及び注意欠陥障害）を含む。
「呼吸器疾患」は呼吸器系に関与し、慢性気管支炎、急性喘息及びアレルギー性喘息を含む喘息、嚢胞性線維症、気管支拡張症、アレルギー性又は他の鼻炎又は副鼻腔炎、α１-抗トリプシン欠乏症、咳、肺気腫、肺線維症又は過敏気道、慢性閉塞性肺疾患(pulmonary disease)、及び慢性閉塞性肺障害(lung disorder)を含む。
ここで「自己免疫疾患」とは、個体の自身の組織から生じ、また該組織に対する非悪性疾患又は障害のことである。自己免疫疾患又は障害の例には、これらに限るものではないが、炎症反応、例えば乾癬及び皮膚炎(例えばアトピー性皮膚炎及び接触性皮膚炎)を含む炎症性皮膚病；全身性強皮症及び硬化症；炎症性腸疾患(例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎)に関連した反応；呼吸困難症候群(成人性呼吸困難症候群；ＡＲＤＳを含む)；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；アレルギーによる病状、例えば湿疹及び喘息及びＴ細胞の浸潤に関連した他の病状及び慢性炎症反応；アテローム性動脈硬化症；白血球付着欠損症；リウマチ様関節炎；全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)；真性糖尿病(例えば、Ｉ型真性糖尿病又はインシュリン依存性真性糖尿病)；多発性硬化症；レノー症候群；自己免疫甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；ショルゲン(Sjorgen)症候群；若年発症糖尿病；及び結核に典型的に見出されるＴリンパ球及びサイトカインにより媒介される急性及び遅延高血圧に関連した免疫反応、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽種症及び血管炎；悪性貧血(アジソン病)；白血球血管外遊出に関連した疾患；中枢神経系(ＣＮＳ)炎症疾病；多臓器傷害症候群；溶血性貧血(限定するものではないが、クリオグロブリン血症又はクームズ陽性貧血を含む)；重症筋無力症；抗原-抗体複合体媒介性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランベルト-イートン筋無力症症候群；類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫多腺性内分泌障害；ライター病；全身硬直症候群；ベーチット疾患；巨細胞動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性神経障害；免疫血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)又は自己免疫血小板減少病等が含まれる。
ここでの「血管疾患又は障害」という用語は、心臓血管系を含む血管系に影響を与える様々な疾患又は障害を意味する。そのような疾患の例には、動脈硬化症、血管再閉塞、アテローム性動脈硬化症、術後血管狭窄、再狭窄、血管閉塞又は頸動脈閉塞性疾患、冠状動脈疾患、狭心症、小血管疾患、高コレステロール血症、高血圧症、及び血管内皮細胞の異常増殖又は機能を含む症状が含まれる。
ここで使用される場合、「治療」（及び「治療する」又は「治療している」のような変形語）とは、治療される個体又は細胞の自然の経過を変化させる試みにおける臨床的介入を意味し、予防のため、又は臨床病理経過中に実施することができる。治療の所望する効果には、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾病の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾病の進行速度の低減、病状の回復又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧは、疾病又は疾患の発症を遅延させるため、又は疾病又は疾患の進行を遅延化させるために使用される。
「個体」、「被検者」又は「患者」は脊椎動物である。ある実施態様では、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、限定しないが、家畜(例えばウシ)、スポーツ用動物、ペット（例えばネコ、イヌ及びウマ）、霊長類、マウス及びラットが含まれる。ある実施態様では、哺乳動物はヒトである。
「薬学的製剤」又は「薬学的組成物」なる用語は、活性成分の生物学的活性が効果的であることを可能にするような形態であり、製剤が投与される患者に毒性が許容されない更なる成分を含まない調製物を意味する。かかる製剤は無菌でありうる。用量、製剤、及び期間と題したセクションも参照のこと。
「無菌」製剤は無菌的又はあらゆる生きている微生物やその芽胞を含まない。
「有効量」又は「治療的有効量」という用語は、患者の疾病や疾患の治療のために有効な薬剤の量を意味する。ある実施態様では、有効量は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な用量及び期間のでの効果的な量を意味する。本発明の物質／分子の治療的有効量は、個体の疾病状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する物質／分子の能力などの因子に従って変わりうる。治療的有効量は物質／分子の任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回るものである。癌の場合は、有効量の薬剤により、癌細胞の数を減少させ；腫瘍サイズを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、典型的には止める)し；腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、典型的には止める)し；腫瘍の成長をある程度阻害し；腫瘍の治療を可能にする；及び／又は疾患に関連する一又は複数の症状をある程度和らげることが可能である。薬剤が、増殖を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺す程度で、それは細胞***停止性及び／又は細胞傷害性でありうる。
「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には、必ずではないが、予防的用量は疾患の初期の状態又はその前の患者に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
前癌性、良性の、初期又は後期段階の腫瘍の場合、血管新生阻害剤の治療的有効量は、癌細胞の数を低減し；原発性腫瘍のサイズを低減し；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める)し；腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、典型的には止める)し；腫瘍の成長又は腫瘍の進行をある程度阻害又は遅延化し；及び／又は疾患に関連する一又は複数の症状をある程度和らげうる。薬剤は、増殖を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺すことが可能な程度で、細胞***停止性及び／又は細胞傷害性でありうる。
「効果」なる用語は、ここでは最も広義で使用され、所望の効果を生じせしめるための免疫グロブリン、抗体又はＦｃ融合体タンパク質の能力を意味する。ある実施態様では、効果は、飽和レベルでの免疫グロブリン、抗体又はＦｃ融合タンパク質の最大の観察された効果を意味する。ある実施態様では、効果は免疫グロブリン、抗体又はＦｃ融合タンパク質のEC50を意味する。ある実施態様では、効果は免疫グロブリン、抗体又はＦｃ融合タンパク質の作用強度を意味する。ある実施態様では、効果は、ここに定義される臨床効果を含む疾患の過程又は期間に対して有益な効果を生じせしめる免疫グロブリン、,抗体又はＦｃ融合タンパク質の能力を意味する。
「ＥＣ５０」なる用語は、ベースラインと最大値の間の半分の応答を誘導する免疫グロブリン、抗体又はＦｃ融合タンパク質の濃度を意味する。ある実施態様では、ＥＣ５０は、その最大効果の５０％が観察される免疫グロブリン、抗体又はＦｃ融合タンパク質の濃度を表す。ある実施態様では、ＥＣ５０は、最大のインビボ効果の５０％を得るのに必要とされる血漿又は血清中濃度を表す。
癌の治療における効果は、癌細胞の増殖又は転移を阻害又は低減させ、あるいは癌に付随する一又は複数の症状を寛解又は軽減する本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、又は組成物の能力を検出することによって証明されうる。治療は、本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、又は組成物の投与後に癌細胞の増殖又は転移の低減、癌に付随する一又は複数の症状の寛解があれば、又は死亡率及び／又は罹患率に減少があれば、治療的と考えられる。本発明の抗体、融合タンパク質又は組成物を、インビトロ、エキソビボ及びインビボアッセイにおいて腫瘍形成を低減させるその能力について試験することができる。癌治療に対しては、インビボにおける効力は、また例えば生存期間、無増悪期間（ＴＴＰ）、奏効率（ＲＲ）、応答期間、及び／又は生活の質の測定により測定される。また以下の治療効果と題したセクションを参照のこと。
炎症性疾患の治療における効果は、動物における炎症を低減又は阻害し、あるいは炎症性疾患に付随する一又は複数の症状を寛解又は軽減する本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、又は組成物の能力を検出することによって証明されうる。治療は、本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、又は組成物の投与後に例えば炎症の減少又は一又は複数の症状の寛解があれば、治療的と考えられる。
ウイルス感染の治療又は予防における効果は、ウイルスの複製を阻害し、伝染を阻止し又はその宿主においてウイルスが自身を樹立することを防止し、又はウイルス感染に付随する一又は複数の症状を予防、寛解又は軽減する本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、又は組成物の能力を検出することによって証明されうる。治療は、本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、又は組成物の投与後に例えばウイルス量の低減、一又は複数の症状の寛解、又は死亡率及び／又は罹患率に減少があれば、治療的と考えられる。本発明の抗体、融合タンパク質又は組成物を、またインビトロ、エキソビボ及びインビボアッセイにおいてウイルス複製を阻害し又はウイルス量を低減させるその能力について試験することができる。
細菌感染の治療又は予防における効果は、細菌の複製を阻害し、又は細菌感染に付随する一又は複数の症状を予防、寛解又は軽減する本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、又は組成物の能力を検出することによって証明されうる。治療は、本発明の抗体、融合タンパク質、コンジュゲート分子、又は組成物の投与後に例えば細菌数の低減、一又は複数の症状の寛解、又は死亡率及び／又は罹患率に減少があれば、治療的と考えられる。
臨床的利益は、様々なエンドポイント、例えば、緩徐化及び完全な停止を含む、ある程度の疾患進行の阻害；疾患発症及び／又は症状の数の減少；病巣サイズの減少；隣接する末梢器官及び／又は組織への疾患細胞浸潤の阻害(すなわち減少、緩徐化又は完全な停止)；疾患の拡がりの阻害(すなわち減少、緩徐化又は完全な停止)；必ずではないが病変の退行又は消失が生じうる自己免疫応答の低減；疾患と関係する一又は複数の症状の、ある程度の軽減；治療後に呈する疾患がない期間の増加；及び／又は治療後の所定の時点での死亡率の減少を評価することによって、測定できる。
「低減又は阻害する」とは、参照と比較して活性、機能、及び／又は量を減少又は低減させることである。ある実施態様では、「低減又は阻害する」とは、２０％又はそれ以上の全体的な減少を生じる能力を意味する。他の実施態様では、「低減又は阻害する」とは、５０％又はそれ以上の全体的な減少を生じる能力を意味する。更に他の実施態様では、「低減又は阻害する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％、はそれ以上の全体的な減少を生じる能力を意味する。低減又は阻害は、治療されている疾患の症状、転移の存在又はサイズ、原発性腫瘍のサイズ、又は血管新生疾患における血管のサイズ又は数を意味しうる。
「手術可能」な癌は、原発性器官に限局され、外科手術に適している癌である。
「生存」は、生存している患者を指し、無病生存率(ＤＦＳ)、無進行生存率(ＰＦＳ)及び全生存率(ＯＳ)を含む。生存率はカプラン・マイヤー法によって推定され得、生存率の違いは層別ログランク試験を用いて計算される。
「無病生存率(ＤＦＳ)」は、治療の開始から又は初期診断から一定期間、例えば約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約１０年などの間癌を再発せずに生存している患者を指す。本発明の一態様では、ＤＦＳは包括解析(intent-to-treat)の原則に従って分析される。つまり、患者は割り当てられた治療を基礎として評価される。ＤＦＳの分析に用いる事象には、癌の限局性、領域及び遠位的な再発、二次的な癌の発症、及び既往(例えば乳癌の再発又は二番目の原発性癌)のない患者における任意の死因の死亡が含まれうる。
「全生存率」は、治療の開始から又は初期診断から一定期間、例えば約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約１０年などの間生存している患者を指す。
「延長生存率」は、未処置の患者と比較して、又はコントロール処置プロトコル、例えば化学療法剤のみによる処置と比較して、処置した患者においてＤＦＳ及び／又はＯＳが増加していることを意味する。生存率は、処置開始後又は最初に診断された後、少なくとも約６か月、又は少なくとも約１年、又は少なくとも約２年、又は少なくとも約３年、又は少なくとも約４年、又は少なくとも約５年、又は少なくとも約１０年などの間モニターされる。
「同時に」なる用語は、投与の時間の少なくとも一部がオーバーラップしている、２以上の治療薬の投与を指すためにここで用いられる。従って、同時投与には、一又は複数の薬剤の投与が一又は複数の他の薬剤の投与をやめた後に続く場合の投薬計画が包含される。
「単独療法」は、治療期間の経過中に癌又は腫瘍の治療のために単剤しか含まない治療的投薬計画を意味する。ある実施態様では、変異体ＩｇＧを用いた単独療法は、変異体ＩｇＧがその治療期間の間に更なる抗癌療法がない状態で投与されることを意味する。
「維持療法」とは、疾患再発又は進行の可能性を低減するために施される治療的投薬計画を意味する。維持療法は、患者の寿命まで延長された時間を含む任意の長さの時間に提供されうる。維持療法は、最初の療法の後又は、最初ないしは更なる療法と共に提供されうる。維持療法のために使用される用量は変化してもよく、他の種の療法に使用する用量と比較して、減少した用量を含みうる。
ここでの「ネオアジュバント(術前補助)療法」又は「術前療法」は、手術の前に施す療法を指す。ネオアジュバント療法の目標は、即時性の全身性処置を提供することであり、標準的な一連の手術の後に全身性治療を行う場合にさもなければ増殖しうる微小転移性癌を潜在的に除去する。また、ネオアジュバント療法は、腫瘍のサイズを低減することによって、当初切除不可能であった腫瘍を完全に切除する又は一部の臓器およびその機能を保存することが可能となるための助けとなりうる。更に、ネオアジュバント療法は薬剤有効性のインビボ評価を可能とし、その評価によりその後の治療の選択が導かれる。
ここでの「アジュバント(補助)療法」は、手術後に施される治療を指し、疾患の再発のリスクを低減するために、残存する疾患の所見が検出されないものとする。アジュバント療法の目的は、癌の再発を予防することによって、癌関連の死亡の機会を低減することである。
ここでは、「標準的な治療の」化学療法は、特定の癌を治療するために通常使用する化学療法剤を指す。
「根治手術」は、医学界で用いられる用語として用いる。根治手術には、例えば、肉眼で認められる腫瘍の全てが除去又は切除されるものを含む、腫瘍が除去又は切除される手順、手術その他のものが包含される。根治手術には、例えば、腫瘍の完全ないしは治療上の切除又は完全な全体の切除が含まれる。根治手術には、一又は複数の段階で生じる手順が含まれ、例えば一又は複数の手術又は他の手順が腫瘍の切除前に行われる複数の段階の手術手順が含まれる。根治手術には、関連する臓器、一部の臓器および組織、並びに周辺臓器、例としてリンパ節、臓器の一部又は組織を含む腫瘍を除去ないしは切除するための手術が含まれる。
一又は複数の更なる治療剤と「の併用での」投与は同時（同時発生）及び任意の順序での連続敵投与を含む。
「慢性」投与とは、初期の治療効果(活性)を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる治療である。
ここで用いられる「担体」は、用いられる服用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤を含む。生理学的に許容可能な担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容可能な担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭを含む。
「リポソーム」は、哺乳動物への薬剤（例えば変異体ＩｇＧ）のデリバリーに有用な様々なタイプの脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小胞である。リポソームの成分は、一般に、生体膜の脂質配置と同様に二層構造で配されている。
「抗腫瘍性組成物」なる用語は、少なくとも一つの活性治療剤、例えば「抗癌剤」を含む、癌を治療する際に有効な組成物を指す。治療剤(抗癌剤)の例には、限定するものではないが、例えば、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害性薬剤、放射線療法に用いられる作用剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤及び癌を治療するための他の薬剤、例えば、抗ＨＥＲ-２抗体、抗ＣＤ２０抗体、表皮増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)アンタゴニスト(例えばチロシンキナーゼインヒビター)、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲインヒビター(例えばエルロチニブ(Ｔａｒｃｅｖａ(登録商標))、血小板由来成長因子インヒビター(例えばＧｌｅｅｖｅｃ(登録商標)(メシル酸イマチニブ))、ＣＯＸ-２インヒビター(例えばセレコキシブ)、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ又はＶＥＧＦレセプタの一つ以上と結合するアンタゴニスト(例えば中和抗体)、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２及び他の生理活性的で有機化学的作用剤などが含まれる。また、その組合せが本発明に含まれる。
ここで用いられる「細胞傷害剤」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制し、及び／又は細胞死又は破壊を生じせしめる物質を意味する。該用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤（例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、並びに下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むことが意図される。他の細胞傷害剤は下記に記載される。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは細胞傷害剤とコンジュゲートされうる。
「毒素」は、細胞の成長又は増殖に対して有害な作用を有することができる任意の物質である。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド(ＣＹＴＯＸＡＮ(登録商標))；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン(piposulfan)；アジリジン類、例えばベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)；アルトレトアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標）；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）を含む）、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９−アミノカンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照）；ＣＤＰ３２３、経口α−４インテグリン阻害剤；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン（ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標）、リポソームドキソルビシンＴＬＣＤ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標）、及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(gemcitabine) (GEMZAR(登録商標))、テガフル(tegafur) (UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(capecitabine) (XELODA(登録商標))、エポチロン(epothilone)、及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；コムブレタスタチン；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン類(ansamitocins)のようなメイタンシノイド類(maytansinoids)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantron)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリジンＡ(roridin A)及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標))、パクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(ABRAXANETM)、及びドキセタキセル(ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナ剤、例えばシスプラチン、オキサリプラチン（例えばＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））及びカルボプラチン；ビンカ類でチューブリン重合の微小管形成を阻害するもの、例えばビンブラスチン(ＶＥＬＢＡＮ(登録商標)、ビンクリスチン(ＯＮＣＯＶＩＮ(登録商標))、ビンデシン(ＥＬＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))、及びビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ロイコボビン(leucovovin)；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド、例えば、ベキサロテン(ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ(登録商標))；ビスホスホネート、例えばクロドロネート(例えばＢＯＮＥＦＯＳ(登録商標)又はＯＳＴＡＣ(登録商標))、エチドロン酸(ＤＩＤＲＯＣＡＬ(登録商標))、ＮＥ-５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ＺＯＭＥＴＡ(登録商標))、アレンドロネート(ＦＯＳＡＭＡＸ(登録商標))、パミドロン酸(ＡＲＥＤＩＡ(登録商標))、チルドロン酸(ＳＫＥＬＩＤ(登録商標))、又はリセドロン酸(ＡＣＴＯＮＥＬ(登録商標))；トロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)（例えばエルロチニブ（Tarceva<SUP>TM</SUP>））；細胞増殖を減少させるＶＥＧＦ−Ａ；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、及びＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害薬(例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標))；ＢＡＹ４３９００６(ソラフェニブ；Bayer)；ＳＵ-１１２４８(スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ(登録商標)、Pfizer)；ペリフォシン(perifosine)、ＣＯＸ-２阻害剤(例えばセレコキシブ又はエトリコキシブ)、プロテオゾーム阻害剤(例えばＰＳ３４１)；ボルテゾミブ(ＶＥＬＣＡＤＥ(登録商標))；ＣＣＩ-７７９；チピファルニブ(tipifarnib)(Ｒ１１５７７)；オラフィニブ(orafenib)、ＡＢＴ５１０；ＢＣＬ-２阻害剤、例えばオブリメルセンナトリウム(oblimersen sodium)(GENASENSE(登録商標))；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤；チロシンキナーゼ阻害剤；セリン−スレオニンキナーゼ阻害剤、例えばラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ(登録商標)）；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばロナファーニブ（ＳＣＨ６６３６，ＳＡＲＡＳＡＲＴＭ）; 及び上述したものの何れかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロンの併用療法の略称であるＣＨＯＰ；及び５−ＦＵ及びロイコボリンとオキサリプラチン(ELOXATINTM)を組み合わせた治療法の略称であるＦＯＬＦＯＸ、及び上述したものの何れかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体；並びに上記のうち２以上の組み合わせが含まれる。
ここで定義された化学療法剤には、癌の増殖を促進しうるホルモンの効果を調節、低減、ブロック、又は阻害するように働く「抗ホルモン剤」又は「内分泌治療剤」が含まれる。それらはそれ自体がホルモンであってもよく、限定するものではないが、抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）を含み、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標)タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ(登録商標)酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標)エキセメスタン、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標)ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標)アナストロゾール；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)（１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現阻害剤（例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ(登録商標)リボザイム）及びＨＥＲ２発現阻害剤；遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、及びＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ(登録商標)ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標)トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標)ｒｍＲＨ；ビノレルビン及びエスペラミシン（米国特許第４６７５１８７号を参照）、及び上記のものの何れかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体；並びに上記のものの二以上の組合せを含む。
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞(例えばＶＥＧＦを発現する細胞)の増殖をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期で細胞(例えばＶＥＧＦを発現する細胞)の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, 及びantineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類(パクリタキセル及びドセタキセル)は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、ローン・プーラン ローラー)は、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、ブリストル-マイヤー スクウィブ)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸***を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定にする。
「放射線療法」とは、正常に機能する能力を制限するように又は細胞を一緒に破壊するように細胞に十分な損傷を誘導する有向性のγ線又はβ線の使用を意味する。治療の用量及び治継続期間を決定するためには当該分野で知られている多くの方法があることは明らかであろう。典型的な治療は、１回の投与として、１日当たり１０から２００単位(グレイ)の典型的な用量として施される。
疾患の「病理状態」には、患者の健康を損なうあらゆる現象が含まれる。癌の場合には、これに限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞増殖、転移、隣接細胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化等々が含まれる。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン以下の分子量を持つと定義される。
「静脈内注入」なる用語は、およそ５分以上、好ましくはおよそ３０〜９０分の時間をかけて動物又はヒト患者の静脈への薬剤の導入を意味するものであり、本発明では静脈内注入があるいは１０時間未満かけて投与されることもある。
「静脈内ボーラス」又は「静脈内圧力(intravenous push)」なる用語は、動物又はヒトに静脈に薬剤を投与して、およそ１５分未満、好ましくは５分未満で身体が薬剤を受け取ることを意味する。
「皮下投与」という用語は、比較的ゆっくりと、薬剤容器からの送達が維持されることによって、動物又はヒト患者の皮膚の下に、好ましくは皮膚及び皮下組織の間のポケット内に薬剤を投入することを意味する。ポケットは、皮膚を上につまむか引き上げ皮下組織から離すことによりつくり出される。
「皮下注入」なる用語は、動物又はヒト患者の皮下、好ましくは皮膚と皮下組織の間の嚢内に、限定するものではないが３０分以下ないし９０分以下の時間をかけて、薬剤貯蔵物から相対的にゆっくりと、持続的に運搬されることによる薬剤の導入を意味する。場合によって、動物又はヒト患者の皮下にインプラントされる薬剤運搬ポンプを刺し入れることによって注入されてもよく、この場合のポンプは決まった量の薬剤を３０分、９０分又は治療期間などの決まった期間の間運搬するものである。
「皮下ボーラス」なる用語は、動物又はヒト患者の皮下への薬剤の投与であって、ボーラス薬剤運搬(ドラッグデリバリー)は好ましくはおよそ１５分未満、より好ましくは５分未満、最も好ましくは６０秒未満である。好ましくは、投与は皮膚と皮下組織の間の嚢内であり、その嚢は例えば皮膚をつまんだり引き上げたりして皮下組織を除去することによって作ったものである。
ここで用いられる「標識」という語は、ポリペプチドに直接的又は間接的に結合する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身が検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒しうる。
抗体
抗体は特定の抗原に結合特異性を示すタンパク質である。天然抗体は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主たるクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４；ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けられる。様々なヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４アロタイプが記載されている（M.-P. LeFranc 及びG. LeFranc: "The Human IgG Subclasses," F. Shakib (編), pp. 43-78, Pergamon Press, Oxford (1990)に概説）。ｌｇＧ１、ｌｇＧ２ｓ、ｌｇＧ３、及びｌｇＧ４を含むＩｇＧクラスの異なったアイソタイプは、独特の物理的、生物学的、及び臨床的性質を有する。ヒトＩｇＧ１は、治療目的に対して最も一般的に使用されている抗体であり、遺伝子操作研究の大部分はこの文脈で構成されている。
本発明は、ＩｇＧの生物学的性質を改変するアミノ酸修飾を含む変異体ＩｇＧ免疫グロブリンに関する。本出願の変異体免疫グロブリンは、野生型抗体とひかくして長いインビボでの半減期を示す修飾されたＦｃ領域を含む抗体を含む。
ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して少なくとも５０％増加している。ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、 野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して少なくとも７５％増加している。ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して少なくとも１００％増加している。
ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、少なくとも約１５日である。ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、少なくとも約２０日である。ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、少なくとも約２５日である。ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、少なくとも約３０日である。ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、少なくとも約３５日である。ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、少なくとも約４０日である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは変異体ＩｇＧ１である。
ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、ヒトにおいて測定される半減期である。 ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの半減期は、カニクイザルにおいて測定される半減期である。
抗体断片
本発明は抗体断片を包含する。特に興味深いものは、Ｆｃ領域を含む抗体、Ｆｃ融合体及び重鎖の定常領域である。ある実施態様では、抗体断片は、Ｆｃ領域を含む変異体免疫グロブリン（ＩｇＧｓ）の断片である。抗体断片は伝統的な手段、例えば酵素的消化、又は組換え技術によって産生されうる。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical 及びBiophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。 Fab, Fv 及びScFv抗体断片は全て大腸菌で発現され、分泌され得、よって多量のこれら断片の生産が容易である。抗体断片は抗体ファージライブラリーから分離することができる。ある実施態様では、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。抗体断片は、また例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体断片は単一特異性ないしは二重特異性でもよい。
ヒト化抗体
本発明は、ヒト化抗体を含む。ある実施態様では、ヒト化抗体は野生型ＩｇＧに対してＦｃ領域中に一又は複数のアミノ酸修飾を含むヒト化変異体ＩｇＧである。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当該分野で知られている。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトのソースからそれに導入された一又は複数のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と呼ばれ、これは典型的には「移入」可変ドメインに由来する。ヒト化は、本質的にヒト抗体の該当する配列を高頻度可変領域配列で置換することにより、Winter及び共同研究者(Jones等(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等(1988)Nature, 332:323-327；Verhoeyen等(1988)Science 239:1534-1536)の方法に従って実施される。従って、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかの高頻度可変領域残基が、及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖及び重鎖何れも、抗原性を減らすために重要である。いわゆる「ベストフィット」方法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。ついで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワークとして受け入れる。例えばSims等(1993)J. Immunol. 151:2296；Chothia等(1987)J. Mol. Biol. 196:901を参照。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列から得られた特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる。例えばCarter等(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285；Presta等(1993)J. Immunol., 151:2623を参照。
更には、抗体は、抗原に対する高い親和性及びその他の望ましい生物学的特性を保持してヒト化されることが一般に好ましい。この目的を達成するために、一方法では、親の配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念上のヒト化産物を分析するプロセスにより、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者に周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の、ありそうな三次元立体配置的構造を図解し表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際に残基が果たすと思われる役割を分析することができ、つまり候補免疫グロブリンの、その抗原に対する結合能に影響する残基を分析することができる。このように、レシピエント及び重要な配列からＦＲ残基を選択して組み合わせることにより、所望の抗体特性、例えば標的とする抗原に対する親和性の増大を達成することができる。一般に、高頻度可変領域残基は、抗原の結合に対する影響に、直接的にかつ最も実質的に関わっている。
ヒト抗体
ある実施態様では、本発明のヒト抗体は、野生型ＩｇＧに対してＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を含むヒト変異体ＩｇＧである。ヒト抗体は、上記のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択したＦｖクローン可変ドメイン配列を既知のヒト定常ドメイン配列と組合わせることによって構築することができる。あるいは、ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は、例えば、Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner 等, J. Immunol., 147: 86 (1991)に記載されている。
免疫化することで、内因性免疫グロブリンの生産なしに、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を生産することが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体の生産の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスでのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の転移は、抗原の投与によってヒト抗体の生産を引き起こす。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255(1993)；Jakobovits等, Nature 362, 255-258(1993)；Bruggermann等, Year in Immunol., 7: 33 (1993)を参照のこと。
また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が最初の非ヒト抗体と類似した親和性及び特性を有している場合、非ヒト、例えば齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法により、上記のファージディスプレイ技術により得られた非ヒト抗体断片の重鎖又は軽鎖可変領域の何れかをヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖ又はＦａｂキメラの集団を作成する。抗原で選択することにより、ヒト鎖が初めのファージディスプレイクローンにおいて一致した非ヒト鎖の除去により破壊された抗原結合部位を回復する、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖないしＦａｂが単離される、つまり、エピトープがヒト鎖パートナーの選択をつかさどる（インプリントする）。残りの非ヒト鎖を置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開のＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０６２１３号を参照）。伝統的なＣＤＲ移植による非ヒト抗体のヒト化と異なり、この技術により、非ヒト起源のＦＲ又はＣＤＲ残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様では、二重特異性抗体は、野生型抗体に対してＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を持つ二重特異性抗体である。ある実施態様では、二重特異性抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。ある実施態様では、結合特異性の一つはＶＥＧＦに対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。ある実施態様では、二重特異性抗体は、ＶＥＧＦの２つの異なるエピトープに結合しうる。二重特異性抗体はＶＥＧＦを発現する細胞に細胞傷害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＶＥＧＦ結合アーム及び細胞傷害剤、例えば、サポリン、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテンと結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又はＦｃ領域を含む抗体断片として調製することができる。
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において知られている。伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの重鎖は異なる特異性を持っている(Millstein及びCuello, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が１９９３年５月１３日に公開の国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は例えば、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。ある実施態様では、軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させる。免疫グロブリン重鎖の融合体と、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、構築に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチ法の一実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照のこと。
他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大にすることができる。界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロ二量体の収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合しうる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／００３７３号及び欧州特許出願公開第０３０８９号)への用途が提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は任意の簡便な架橋方法によって作製できる。適切な架橋剤は当該分野において周知であり、多くの架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号に記されている。
Hollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記載される「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替メカニズムを提供した。断片は、非常に短いために同一鎖上で２つのドメインの対形成が可能であるリンカーによって、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合されてなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインが他の断片の相補的ＶＫ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体断片を作製するための他の方策もまた報告されている。Gruber等, J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早く内部移行(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に産生せしめることができる。多価抗体は二量体化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有しうる。ある実施態様では、二量体化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ある実施態様では、多価抗体は３ないし約８の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。そのような一実施態様では、多価抗体は４つの抗原結合部位を含む（又はそれらからなる）。多価抗体は少なくとも一つのポリペプチド鎖(例えば２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖は２又はそれ以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し得、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の一つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を含みうる。ここでの多価抗体は、少なくとも２つ(例えば４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドを更に有しうる。ここでの多価抗体は、例えば約２から約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有しうる。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
単一ドメイン抗体
ある実施態様では、本発明の抗体はＦｃ領域を含む単一ドメイン抗体である。ある実施態様では、単一ドメイン抗体は野生型ＩｇＧに対してＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を有する。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む単一ポリペプチド鎖である。
抗体修飾
ある実施態様では、ここに記載された免疫グロブリンのアミノ酸配列修飾が考慮される。ある実施態様では、修飾は本発明の変異体ＩｇＧに対して一又は複数のアミノ酸修飾を含む。ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧの結合親和性、インビボ半減期及び／又は他の生物学的特性を改変させることができれば望ましい場合がある。ある実施態様では、アミノ酸修飾は、ここでは記載されていないＦｃ領域一又は複数のアミノ酸修飾を含む。変異体ＩｇＧの修飾されたアミノ酸配列は、抗体をコードする核酸中に適切な変化を導入して、又はペプチド合成により、調製されうる。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望される特徴を有しているならば、最終コンストラクトに達するために、欠失、挿入及び置換をどのように組合せることもできる。アミノ酸変化は、配列が作製されるときに主題の抗体アミノ酸配列中に導入されうる。
突然変異誘発に好ましい位置である抗体の所定の残基又は領域の同定に有益な方法は、Cunningham及びWells (1989) Science, 244:1081-1085に開示されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的となる残基又は残基の組が同定され(例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電した残基)、中性の、又は負に荷電したアミノ酸(例えばアラニン又はポリアラニン)で置換され、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を与える。ついで、置換に対する機能的感受性を示しているそのアミノ酸位置を、置換の部位において又は置換の部位に対して、更なる又は他の変異体を導入することにより精密にする。よって、アミノ酸配列修飾を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決定される必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を解析するために、標的コドン又は領域においてａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を実施し、発現した免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を有するポリペプチドまでの長さにわたるアミノ末端融合及び／又はカルボキシ末端融合、並びに単一又は複数アミノ酸残基の配列内挿入を含む。端末挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体を含む。抗体分子の他の挿入性修飾は、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチド又は(例えばＡＤＥＰＴの場合)酵素への抗体のＮ末端又はＣ末端の融合を含む。
ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧは、抗体がグリコシル化される度合いを増加又は減少させるように改変される。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いることができる。
抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を、上述のトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)の一又は複数が作製され又は取り除かれるように変化させることによって簡便に達成される。該変化はまた元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、欠失、又は置換によってなされうる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
変異体ＩｇＧのＦｃ領域に結合した炭水化物（糖鎖）を変更してもよい。哺乳動物細胞によって産生される天然の抗体は典型的にはＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって一般に結合させられる分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えばWright等 (1997) TIBTECH 15:26-32を参照。オリゴ糖は様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ-アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム部」としてＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含みうる。ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧにおけるオリゴ糖の修飾を、ある種の更に改善された性質を有する変異体ＩｇＧを作り出すためになしてもよい。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは２９７位のアラニンへのアミノ置換を更に含む。
例えば、Ｆｃ領域に（直接的に又は間接的に）結合したフコースを欠く糖鎖構造を有する抗体変異体が提供される。かかる修飾は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号 (Presta, L.)；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業）を参照のこと。「脱フコース化」又は「フコース欠失」修飾に関する文献の例には以下のものが含まれる：米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Okazaki 等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)。脱フコース化抗体を産生する細胞株の例として、タンパク質フコシル化欠損Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞 (Ripka 等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開２００３／０１５７１０８号, Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２号, Adams 等, 特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、例としてα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８，ノックアウトＣＨＯ細胞 (例えば、Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y. 等, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照)などがある。
例えば抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分された二分オリゴ糖を有する抗体変異体が更に提供される。かかる抗体変異体は低減したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。かかる抗体修飾の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairet等）；米国特許第６６０２６８４号（Umana等）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umana等）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内の少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体修飾もまた提供される。かかる抗体修飾は、例えば国際公開第９７／３００８７号（Patel等）；国際公開第９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
ある実施態様では、本発明は、これをインビボでの抗体の半減期が重要であるがある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣ）が不必要であるか有害である多くの用途のための望ましい候補にする、エフェクター機能の全てではないが幾らかを有する抗体修飾を考慮する。ある実施態様では、所望の性質のみが維持されるようにする抗体のＦｃ活性が測定される。インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイを実施して、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認できる。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（よってＡＤＣＣ活性を欠く可能性がある）が、ＦｃＲｎ結合能を保持していることを確認できる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞のＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現がRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)の４６４頁の表３にまとめられている。興味ある分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号(例えばHellstrom, I.等 Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照)及び Hellstrom, I 等, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；第５８２１３３７号(Bruggemann, M. 等, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照)に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる(例えばフローサイトメトリーのためのACTITM非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びCytoTox 96(登録商標)非放射性細胞傷害性アッセイ (Promega, Madison, WI)。このようなアッセイのために有用なエフェクター細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は加えて、興味ある分子のＡＤＣＣ活性はインビボで、例えばClynes等 Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)に開示されているもののような動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイをまた実施して、抗体がＣ１ｑに結合できず、よってＣＤＣ活性を欠くことを確認することができる。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい(例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S. 等, Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S.及びM.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照のこと)。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期決定はまた当該分野で知られている方法を使用して実施することもできる(例えばPetkova, S.B. 等, Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照)。
一又は複数のアミノ酸置換を有する他の抗体修飾が提供される。置換突然変異誘発に対して興味深い部位は高頻度可変領域を含むが、ＦＲ変化もまた考えられる。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。「例示的置換」と名前を付けた更に実質的な変化が表１に提供され、又はアミノ酸クラスに関連して以下に更に記載する。アミノ酸置換は、興味ある抗体に導入され得、生成物は、改善された抗原結合性、減少した免疫原生、改善されたＡＤＣＣ又はＣＤＣ等のような所望の活性についてスクリーニングされうる。
Figure 2016026144
抗体の生物学的性質における修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩に影響を及ぼす置換を選択することにより達成されうる。アミノ酸はその側鎖の特性の類似性に基づいてグループ分けすることができる（A. L. Lehninger, Biochemistry, 2版, pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975））：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）無荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。そのような置換された残基はまた保存的置換部位又は残りの（非保存）部位に導入されうる。置換変異体の一タイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基を置換することを含む。ある実施態様では、親抗体は野生型対応物変異体ＩｇＧ（例えば、そのアミノ酸配列に更なる改変を伴わない本発明の変異体ＩｇＧ）である。一般的に、更なる発展のために選択されて得られた抗体は、それらが産生される親抗体に対して改変された（改善された）生物学的特性を有するであろう。例示的な弛緩修飾は、ファージディスプレイベースのアフィニティ成熟技術を使用して簡便に産生されうるアフィニティ成熟抗体である。簡潔に言えば、幾つかのアミノ酸位置（例えば６−７部位）を変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生じさせる。このようにして生成された抗体が、糸状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージされたファージコートタンパク質の少なくとも一部（例えばＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物）への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ抗体は、ついで、その生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補高頻度可変領域部位を同定するために、スキャニング変異誘発（例えばアラニンスキャニング）を実施し、抗原結合性に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と抗原の間の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに入念に述べたものを含む当該分野で知られた技術に従う置換の候補である。そのような変異体がひとたび生成されると、抗体のパネルに、ここに記載されたものを含む当該分野で知られた技術を使用してスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
修飾された抗体（例えば修飾された変異体ＩｇＧ）のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該分野で知られた様々な方法によって調製される。これらの方法には、限定するものではないが、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列修飾の場合）又は先に調製された修飾された抗体又は抗体の非修飾型のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製が含まれる。
本明細書及び従来技術の教示によれば、ある実施態様では、本発明の抗体修飾は、対応する野生型の変異体ＩｇＧ（例えばそのアミノ酸配列に更なる改変を持たない発明の変異体ＩｇＧ）と比較した場合、一又は複数の変更を有すると考えられる。それでも、これらの抗体修飾は、野生型の同等物の変異体ＩｇＧと比較した場合、治療的有効性に必要な実質的に同一の特性を保持している。ある実施態様では、野生型対応物の変異体ＩｇＧはベバシズマブの変異体である。
他の態様では、本発明は、Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドの界面に修飾を含み、該修飾がヘテロ二量体化を容易にし及び／又は促進する抗体を提供する。これらの修飾は、第一のＦｃポリペプチド内に突部を、第二のＦｃポリペプチド内にキャビティを導入することを含み、ここで、第一及び第二Ｆｃポリペプチドの複合体化を促進するように突部をキャビティに位置させ得る。これらの修飾を有する抗体の産生方法は当該分野で知られており、例えば米国特許第５７３１１６８号に記載されている。
更に他の態様では、抗体の一又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば「チオＭａｂｓ」を創製することが望ましい場合がある。ある実施態様では、置換される残基は抗体の到達可能部位に生じる。その残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基を抗体の到達可能部位に位置せしめ、ここで更に記載されるように、抗体を他の部分、例えば薬剤部分又はリンカー−薬剤部分にコンジュゲートさせうる。ある実施態様では、次の残基の一又は複数をシステインと置換することができる：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。
抗体誘導体
ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧは当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは細胞傷害剤とコンジュゲートされうる。ある実施態様では、細胞傷害剤が結合した変異体ＩｇＧは細胞によって内部移行せしめられ、それが結合する癌細胞の死滅化におけるコンジュゲートの治療的効能を増加させる。一実施態様では、細胞傷害剤は癌細胞中の核酸を標的とし又はそれを妨害する。
ある実施態様では、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
他の実施態様では、放射線への暴露によって選択的に加熱されうる非タンパク質様部分及び抗体のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質様部分はカーボンナノチューブである(Kam等 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。放射線は任意の波長のものであってよく、限定するものではないが、通常の細胞に害を与えないが、抗体-非タンパク質様部分に近位の細胞が死滅させられる温度まで非タンパク質様部分を加熱する波長が含まれる。
変異体ＩｇＧの作製
変異体ＩｇＧは当該分野で知られている任意の方法によって作成されうる。ある実施態様では、変異体ＩｇＧ配列を使用して、メンバー配列をコードし、また宿主細胞にクローニングされ、発現され、所望されるならばアッセイされる核酸を作製する。これらの操作は、よく知られた手順を使用して実施され、使用されうる様々な方法が、双方ともその全体を出典明示により援用するMolecular Cloning--A Laboratory Manual, 3版(Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001)及びCurrent Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)に記載されている。変異体ＩｇＧをコードする核酸は、タンパク質を発現せしめるために発現ベクター中に導入されうる。発現ベクターは典型的にはコントロール又は調節配列と作用可能に連結された、つまり機能的関係に置かれたタンパク質、選択可能マーカー、任意の融合パートナー、及び／又は更なるエレメントを含む。変異体ＩｇＧは、変異体ＩｇＧをコードする核酸を含む核酸、好ましくは発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、タンパク質の発現を誘発又は引き起こす適切な条件下で培養することによって、産生されうる。限定するものではないが、哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、及び酵母を含む広範囲の適切な宿主細胞を使用することができる。例えば、使用が見出されうる様々な細胞株は、その全体が出典明示によりここに援用されるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できるＡＴＣＣ細胞株カタログに記載されている。宿主細胞中に外因性核酸を導入する方法は当該分野でよく知られており、使用される宿主細胞と共に変化する。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧは発現後に精製又は単離される。抗体は当業者によく知られている様々な方法で単離され又は精製されうる。標準的な精製法は、クロマトグラフィー技術、電気泳動、免疫学的、沈殿、透析、濾過、濃縮、及びクロマトフォーカシング技術を含む。当該分野でよく知られているように、例えば細菌タンパク質Ａ、Ｇ、及びＫのような様々な天然タンパク質が抗体に結合し、これらのタンパク質が精製に用途を見出しうる。しばしば、精製は特定に融合パートナーによってなされうる。例えば、タンパク質は、ＧＳＴ融合体が用いられる場合はグルタチオン樹脂を使用して、Ｈｉｓ-タグが用いられるならばNi+2 アフィニティクロマトグラフィーを使用して精製されうる。適切な精製技術における一般的なガイドについては、その全体が出典明示によりここに援用されるAntibody Purification: Principles 及びPractice, 3版, Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994, を参照のこと。
変異体ＩｇＧのスクリーニング
本発明の変異体ＩｇＧは、限定しないが、インビトロアッセイ、インビボ及び細胞ベースアッセイ、及び選択技術に使用するものを含む様々な方法を使用してスクリーニングされうる。自動化及びハイスループットスクリーニング技術がスクリーニング手順において利用されうる。スクリーニングは、融合パートナー又は標識、例えば免疫標識、同位体標識、又は蛍光もしくは熱量測定染料のような小分子標識の使用を利用する場合がある。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧの機能的及び／又は生物学的性質がインビトロアッセイにおいてスクリーニングされる。ある実施態様では、タンパク質は、機能性について、例えば反応を触媒するその能力又はその標的に対するその結合親和性についてスクリーニングされる。
スクリーニング方法のサブセットは、ライブラリーの好ましいメンバーを選択するものである。該方法はここでは「選択法」と称し、これらの方法は変異体ＩｇＧのスクリーニングに使用される。タンパク質ライブラリーが選択方法を使用してスクリーニングされる場合、ライブラリーの好ましいメンバー、つまり幾つかの選択基準を満たすメンバーのみが増殖され、単離され、及び／又は観察される。タンパク質ライブラリーのスクリーニングのために本発明で使用されうる様々な選択方法が当該分野で知られている。本発明で使用されうる他の選択方法は、インビボ方法のようなディスプレイに依存しない方法を含む。「定向進化」法と称される選択方法のサブセットは、しばしば新規な変異の導入と共に、選択中に好ましい配列の接合又はブレッディング(breading)を含むものである。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、一又は複数の細胞ベース又はインビボアッセイを使用してスクリーニングされる。そのようなアッセイでは、精製又は未精製タンパク質は典型的には細胞がライブラリーに属する個々の変異体又は変異体のプールに暴露されるように、外因的に添加される。これらのアッセイは、典型的には、必ずしもではないが変異体ＩｇＧの機能；つまり、その標的に結合し、幾つかの生化学的事象、例えばエフェクター機能、リガンド／レセプター結合阻害、アポトーシス等を媒介する変異体ＩｇＧの能力に基づく。そのようなアッセイは、ＩｇＧに対する細胞の応答、例えば細胞増殖、細胞遊走、血管新生、細胞生存、細胞死、細胞形態における変化、又は転写活性化、例えば天然遺伝子又はレポーター遺伝子の細胞性発現をモニターすることをしばしば含む。例えば、そのようなアッセイは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、又はＣＤＣを誘発するＩｇＧ変異体の能力を測定しうる。幾つかのアッセイでは、標的細胞に加えて、更なる細胞又は成分、例えば血清補体、又はエフェクター細胞、例えば末梢血単球（ＰＢＭＣｓ）、ＮＫ細胞、マクロファージ等が添加される必要がある場合がある。そのような更なる細胞は、任意の生物、好ましくはヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサル由来であり得る。ある実施態様では、抗体は血管新生を阻害し得、そのような活性をモニターする方法は当該分野でよく知られている。更に他の実施態様では、抗体は、標的を発現するある種の細胞株のアポトーシスを引き起こし得、又はそれらはアッセイに添加されている免疫細胞への攻撃を媒介しうる。細胞死又は生存率をモニターする方法は当該分野で知られており、染料、免疫化学、細胞化学、及び放射性試薬の使用を含む。転写活性化は、また細胞ベースアッセイにおける機能をアッセイするための方法となりうる。あるいは、細胞ベーススクリーニングは、変異体をコードする核酸で形質転換又は形質移入された細胞を使用して実施される。つまり、変異体ＩｇＧは細胞に外因的には添加されない。
変異体ＩｇＧの生物学的性質は、細胞、組織、及び全生物実験において特徴づけることができる。薬剤は、疾患又は疾患モデルに対する治療についての薬剤の効果を測定するため、又は薬剤の薬物動態、毒性、及び他の性質を測定するために、しばしば、限定しないが、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、及びサルを含む動物において試験される。動物は疾患モデルと称されうる。治療剤は、しばしば、限定しないが、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウス、及びトランスジェニックマウス（ノックイン及びノックアウトを含む）を含むマウスで試験される。そのような実験は、治療剤として使用されるタンパク質の潜在性を決定するための意味のあるデータを提供しうる。任意の生物、好ましくは哺乳動物を試験に使用することができる。例えば、ヒトに対するその遺伝的類似性のため、サルが適切な治療モデルであり得、よって変異体ＩｇＧの効果、毒性、薬物動態、又は他の性質を試験するために使用できる。ヒトでの試験が薬剤としての承認には最終的に必要とされ、よってこれらの実験ももちろん考慮される。よって、変異体ＩｇＧは、その治療効果、毒性、免疫原性、薬物動態、及び／又は他の臨床的性質を決定するためにヒトにおいて試験されうる。
変異体ＩｇＧの治療的使用
変異体ＩｇＧは広い範囲の製品における使用が見出されうる。ある実施態様では、ＩｇＧ変異体は治療、診断、又は研究試薬である。変異体ＩｇＧは、モノクローナル又はポリクローナルである抗体組成物における使用が見出されうる。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、ＶＥＧＦのような標的抗原をブロックし、アンタゴナイズし又はアゴナイズするために使用される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、ＶＥＧＦ活性をブロックし又は中和するために使用される。一実施態様では、ＶＥＧＦ活性は血管新生である。
変異体ＩｇＧは、限定しないが、「定義」の下にここで定義された腫瘍性及び／又は非腫瘍性疾患を持つ患者を治療することを含む様々な治療目的に使用されうる。ある実施態様では、腫瘍性疾患は癌である。ある実施態様では、患者は最初に野生型ＩｇＧで治療され、後に変異体ＩｇＧで治療される。一実施態様では、患者は最初にベバシズマブで治療され、ついで後で変異体ＩｇＧ、例えば、ベバシズマブの変異体で治療される。ある実施態様では、患者はベバシズマブで約６ヶ月間治療され、ついで後で変異体ＩｇＧ、例えば、ベバシズマブの変異体で治療される。
使用が承認され、臨床治験中で、又は開発中である多くの抗体及びＦｃ融合体はここでは「臨床品及び候補」と称される。ある実施態様では、本発明の変異体IgGは、臨床品及び候補の範囲において使用が見出されうる。修飾されうる抗体の例は、限定しないが、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）、ＣＤ２０、ＩｇＥ、ＣＤ１１、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、Ｃ型肝炎のエピトープ、Ａ−β、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＤＲ６、ＤＲ５、ヒトサイトメガロウイルスのエピトープ、ｓｔａｐｈ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）のエピトープ、組織因子、α４β７インテグリン、α５β１インテグリン、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３、ＲＳＶのエピトープ、ＮＦα、ＣＤ１４７、ＩＬ８、ＭＵＣ１８、ＭＵＣ１、α４β１（ＶＬＡ−４）インテグリン、リンホトキシンαレセプター、リンホトキシンβレセプター（ＬＴＢＲ）、ＴＧＦ−β２、ＩＬ−１２、ＴＧＦβ１、エオタキシン１、ＢＡＦＦ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＩＬ１５、ヘパラナーゼＩ；ＣＤ４０、ＣＤ１５４、ＣＤ８０、ＣＤ２３、マクロファージ遊走因子（ＭＩＦ）、ＫＤＲ、ｆｌｋ−１、ＶＥカドヘリン、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ２２、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３０、細胞接着分子−１、抗線維芽細胞増殖因子レセプター３（ＦＧＦＲ−３）、γインターフェロン、ＩＬ−１２、Ｅｐ−ＣＡＭ抗体及びβ２インテグリンのような標的抗原に結合することができる抗体を含む。
修飾されうる臨床品及び候補の例は、限定しないが、抗ＶＥＧＦ抗体アバスチン(登録商標)(ベバシズマブ, Genentech) (例えば、その全体が出典明示により援用される米国特許第7169901号を参照)；ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体 ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ, Genentech) (例えば、その全体が出典明示により援用される米国特許第6489447号を参照)；キメラ抗ＣＤ２０抗体リツキサン(登録商標)(リツキシマブ, IDEC/Genentech/Roche)；抗IgE抗体 ゾレア(登録商標)(オマリズマブ，Genentech)；他の抗ＣＤ２０抗体；抗ＣＤ１１ａ抗体ラプティバ(登録商標)(エファリズマブ, Genentech/Xoma)；抗Ｈｅｒ２抗体オムニターグ(登録商標)(パーツズマブ，Genentech)；抗ｏｘＬＤＬ抗体 (例えば、その全体が共に出典明示により援用される米国特許出願公開第２００４０２０２６５３号及び国際公開第２００４０３０６０７号を参照）；抗ＣＤ４抗体ＭＴＲＸ１０１１Ａ (例えば、その全体が出典明示により援用される国際公開第０２／１０２８５３号を参照）；標的抗原がＩＬ−４及びＩＬ−１３である二重特異性抗体；抗ＨＣＶ抗体；抗ＩＬ−１７Ａ／Ｆ抗体；抗Ａ−β抗体；抗ＤＲ６抗体；抗ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗体；抗ＨＥＲレセプターファミリー抗体；抗組織因子抗体；α４β７インテグリンに対するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体であるＭＬＮ−０２抗体(以前はＬＤＰ−０２, Genentech/Millennium Pharmaceuticals)；ヒト化抗ＣＤ１８ Ｆ（ａｂ’）２抗体；及びヒト化抗ＩｇＥ ＩｇＧ１抗体ｒｈｕＭａｂ−Ｅ２５ (Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems)を含む。
そのように修飾されうる更なる臨床品及び候補の例は、限定しないが、非ホジキンリンパ腫の治療に承認されているキメラ抗ＣＤ２０抗体；抗ＣＤ２０抗体ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０（Genmab)；抗ＣＤ２０抗体ＡＭＥ−１３３（例えば、その全体が出典明示により援用される米国特許第５５００３６２号，Applied Molecular Evolution）；ｈＡ２０（Immunomedics, Inc.）、ＨｕｍａＬＹＭ（Intracel）、及びＰＲＯ７０７６９（その全体が出典明示により援用されるＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０４２６）を含む。ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含む上皮増殖因子レセプターのファミリーのメンバーを標的とする多くの抗体はまた本発明に記載されたＦｃ領域への修飾から恩恵を受けうる。例えば、ＩｇＧ変異体は、アービタックス(登録商標)(セツキシマブ，Imclone) (双方ともその全体が出典明示により援用される米国特許第４９４３５３３号；国際公開第９６／４０２１０号）；様々な癌の臨床実験におけるキメラ抗ＥＧＦＲ抗体；ＡＢＸ−ＥＧＦ（その全体が出典明示により援用される米国特許第６２３５８８３号，Abgenix/Immunex/Amgen)；ＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ（その全体が出典明示により援用される米国特許出願第１０／１７２３１７号，Genmab)；４２５、ＥＭＤ５５９００、ＥＭＤ６２０００、及びＥＭＤ７２０００(Merck KGaA) (その全体が全て出典明示により援用される米国特許第５５５８８６４号；Murthy等 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60；Rodeck等, 1987, J Cell Biochem. 35(4):315-20；Kettleborough等, 1991, Protein Eng. 4(7):773-83)；ＩＣＲ６２ (Institute of Cancer Research)（その全体が全て出典明示により援用される国際公開第９５／２００４５号；Modjtahedi等, 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3):129-46；Modjtahedi等, 1993, Br J Cancer. 1993, 67(2):247-53；Modjtahedi等, 1996, Br J Cancer, 73(2):228-35；Modjtahedi等, 2003, Int J Cancer, 105(2):273-80)；ＴｈｅｒａＣＩＭ ｈＲ３(YM Biosciences, Canada 及びCentro de Immunologia Molecular, Cuba (その全体が全て出典明示により援用される米国特許第５８９１９９６号；同第６５０６８８３号；Mateo等, 1997, Immunotechnology, 3(1):71-81)；ｍＡｂ−８０６(Ludwig Institute for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth等 2003, Proc Natl Acad Sci U S A. 100(2):639-44)；ＫＳＢ−１０２(KS Biomedix，その全体を出典明示により援用)；ＭＲ１−１(IVAX, National Cancer Institute)（その全体が出典明示により援用される国際公開第０１６２９３１Ａ２号）；及びＳＣ１００(Scancell)（その全体が出典明示により援用される国際公開第０１／８８１３８号）と実質的に同様な抗体に用途が見出されうる。ある実施態様では、本発明のＩｇＧ変異体は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病の治療に対して現在承認されているヒト化モノクローナル抗体のキャンパス(登録商標)（アレムツズマブ，Genzyme Corporation)に用途が見出されうる。本発明のＩｇＧ変異体は、限定するものではないが、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ(Regeneron)；ムロモナブ−ＣＤ３（オルソクローンＯＫＴ３(登録商標)）、抗ＣＤ３抗体(Ortho Biotech/Johnson & Johnson)；抗ＣＤ２０抗体ゼバリン(登録商標)（イブリツモマブチウキセタン，IDEC/Schering AG）；抗ＣＤ３３抗体マイロターグ(登録商標)、(ｐ６７タンパク質)抗体 ゲムツズマブ・オゾガマイシン(Celltech/Wyeth)；抗ＬＦＡ−３ Ｆｃ融合体抗体アメビブ(登録商標)(アレファセプト，Biogen)；レオプロ(登録商標)(アブシキシマブ, Centocor/Lilly)；シムレクト(登録商標)(バシリキシマブ，Novartis)；シナジス(登録商標)(パリビズマブ，MedImmune)；抗ＴＮＦａｌｐｈａ抗体レミケード(登録商標)(インフリキシマブ，Centocor)；抗ＴＮＦα抗体ヒュミラ(登録商標)(アダリムマブ，Abbott)；ヒト化ＩｇＧ４抗ＴＮＦ抗体ＨＵＭＩＣＡＤＥ(登録商標)(Celltech)；抗ＴＮＦαＦｃ融合体エンブレル(登録商標)(エタネルセプト，Immunex/Amgen)；抗ＣＤ１４７抗体ＡＢＸ−ＣＢＬ(Abgenix)；抗ＩＬ８抗体ＡＢＸ−ＩＬ８(Abgenix)；抗ＭＵＣ１８抗体ＡＢＸ−ＭＡ１(Abgenix)；抗ＭＵＣ１抗体 ペムツモマブ(pemtumomab)(Ｒ１５４９，９０Ｙ−ｍｕＨＭＦＧ１)(Antisoma)；抗ＭＵＣ１抗体ｔｈｅｒｅｘ（Ｒ１５５０）(Antisoma)；ＡｎｇｉｏＭａｂ（ＡＳ１４０５）(Antisoma)；ＨｕＢＣ−１(Antisoma)；チオプラチン（ＡＳ１４０７）(Antisoma)；タイサブリ(登録商標)(先のアンテグレン(登録商標)，マタリズマブ)、抗α−４−β−１（ＶＬＡ−４）及びα−４−β−７抗体（Biogen）抗ＶＬＡ−１インテグリン抗体ＶＬＡ−１ｍＡｂ（Biogen）；抗リンホトキシンβレセプター（ＬＴＢＲ）抗体ＬＴＢＲｍＡｂ(Biogen)；抗ＴＧＦ−β２抗体ＣＡＴ−１５２(Cambridge Antibody Technology)；Ｊ６９５，抗ＩＬ−１２抗体 (Cambridge Antibody Technology/Abbott)；ＣＡＴ−１９２，抗ＴＧＦβ１抗体(Cambridge Antibody Technology/Genzyme)；ＣＡＴ−２１３，抗エオタキシン１抗体 (Cambridge Antibody Technology)；ＬＹＭＰＨＯＳＴＡＴ−Ｂ(登録商標)，抗Ｂｌｙｓ抗体 (Cambridge Antibody Technology/ Human Genome Sciences Inc.；ＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｍＡｂ，抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体 (Cambridge Antibody Technology/Human Genome Sciences, Inc.)；ＨＵＭＡＸ−ＣＤ４，抗ＣＤ４抗体 (Genmab)；ＨｕＭａｘ−ＩＬ１５，抗ＩＬ１５抗体(Genmab/Amgen)；ＨｕＭａｘ−Ｉｎｆｌａｍ(Genmab/ Medarex)；ＨｕＭａｘ−癌，抗ヘパラナーゼＩ抗体(Genmab/Medarex/Oxford GlycoSciences)；ＨｕＭａｘ−リンパ腫(Genmab/Amgen)；ＨｕＭａｘ−ＴＡＣ(Genmab)；ＩＤＥＣ−１３１，抗ＣＤ４０Ｌ抗体(IDEC Pharmaceuticals)； (clenoliximab), 抗ＣＤ４抗体 (IDEC Pharmaceuticals)；ＩＤＥＣ−１１４，抗ＣＤ８０抗体（IDEC Pharmaceuticals）；ＩＤＥＣ−１５２，抗ＣＤ２３抗体(IDEC Pharmaceuticals)；抗マクロファージ遊走因子（ＭＩＦ）抗体(IDEC Pharmaceuticals)；ＢＥＣ２，抗イディオタイプ抗体(Imclone)；ＩＭＣ−１Ｃ１１，抗ＫＤＲ抗体(Imclone)；ＤＣ１０１，抗ｆｌｋ−１抗体(Imclone)；抗ＶＥカドヘリン抗体(Imclone)；ＣＥＡ−ＣＩＤＥＲ(ラベツズマブ)，抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）抗体 (Immunomedics)；ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ(登録商標)(エピラツズマブ)，抗ＣＤ２２抗体 (Immunomedics)；ＡＦＰ−Ｃｉｄｅ(Immunomedics)；ＭｙｅｌｏｍａＣｉｄｅ(Immunomedics)；ＬｋｏＣｉｄｅ(Immunomedics)；ＰｒｏｓｔａＣｉｄｅ(Immunomedics)；ＭＤＸ−０１０，抗ＣＴＬＡ４抗体 (Medarex)；ＭＤＸ−０６０，抗ＣＤ３０抗体(Medarex)；ＭＤＸ−０７０(Medarex)；ＭＤＸ−０１８(Medarex)；ＯＳＩＤＥＭＲ(ＩＤＭ−１)，抗Ｈｅｒ２抗体 (Medarex /Immuno-Designed Molecules)；ＣＮＴＯ１４８，抗ＴＮＦα抗体 (Medarex/Centocor/J&J)；ＣＮＴＯ１２７５，抗サイトカイン抗体 (Centocor/J&J)；ＭＯＲ１０１及びＭＯＲ１０２，抗細胞接着分子−１（ＩＣＡＭ−１，ＣＤ５４としても知られる）抗体(MorphoSys)；ＭＯＲ２０１，抗線維芽細胞増殖因子レセプター３（ＦＧＦＲ−３）抗体(MorphoSys)；ＮＵＶＩＯＮ(登録商標)(ビジリズマブ)，抗ＣＤ３抗体 (Protein Design Labs)；ＨｕＺＡＦＲ，抗γインターフェロン抗体(Protein Design Labs)；α５β１インテグリンに対する抗体(Protein Design Labs)；抗ＩＬ−１２(Protein Design Labs)；ＩＮＧ−１，抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体 (Xoma)；及びＭＬＮ０１，抗β２インテグリン抗体 (Xoma)を含む他の臨床品及び候補に実質的に同様な様々な抗体又はＦｃ融合体に用途が見出され得、この段落中の上に引用した文献の全てを出典明示によりここに明示的に援用する。
本発明のＩｇＧ Ｆｃ領域に修飾を有する変異体ＩｇＧは、上述の臨床候補及び製品中に、又はそれらと実質的に同様の抗体及びＦｃ融合体中に導入されうる。本発明の変異体ＩｇＧは、また、ヒト化され、親和性成熟され、遺伝子操作され、又は何らかの他の方法で修飾されている上述の臨床候補及び製品のバージョン中に導入されうる。
ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧは、癌を発症するリスクのある患者において、良性、前癌性、又は非転移性癌の治療において；休止中の腫瘍又は微小転移性癌の治療に対して；腫瘍再発又は再増殖の予防に対して；又は癌の治療又は予防に対して、用途が見出されうる。例えば、ここに記載のＦｃ修飾を含む変異体ＩｇＧは、根治手術後の、非転移性癌の患者の治療においてアジュバント療法のために、又は手術可能な癌を持つ患者の治療のためのネオアジュバント療法であって、患者において手術可能な癌の外科的除去前に提供される治療法のために使用することができる。治療的応用は以下に予防、ネオアジュバント療法、及びアジュバント療法に分離されるところ、これらのカテゴリーは必ずしも相互に排他的ではないことは当業者によって理解されるであろう。
腫瘍の分類
癌段階付けシステムは、癌が解剖学的に如何に遠くに拡がるかを記述しており、同じステージの集団において類似の予後及び治療に患者を置くことを試みるものである。生検及び所定の画像法、例えば胸部Ｘ線、マンモグラム、骨スキャン、ＣＴスキャン、及びＭＲＩスキャンを含む幾つかの試験を癌の段階付けの補助として実施されうる。また、血液検査及び臨床評価を使用して、患者の全体的な健康状態を評価し、癌が所定の器官まで拡がったかどうか検出する。
癌を段階付けするために、対癌米国合同委員会は先ずＴＮＭ分類システムを使用して、癌、特に固形腫瘍に文字分類を付す。癌は、文字Ｔ(腫瘍サイズ)、Ｎ(触診可能な節)、及び／又はＭ(転移)で示される。Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、及びＴ４は、原発性病巣のサイズの増加を表し、Ｎ０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３は、次第に進行する節の併発を示し；Ｍ０及びＭ１は、遠位転移の有無を反映する。
総合段階分類法(Overall Stage Grouping)又はローマ数字段階付け法(Roman Numeral Staging methods)としても知られる第二の段階付け法では、原発性病巣のサイズと節拡散及び遠位転移の存在を取り入れて、癌はステージ０からＩＶに分けられる。このシステムでは、症例はローマ数字によって表されるＩからＩＶの４つのステージに分類されるか、又は「再発」と分類される。幾つかの癌では、ステージ０は非浸潤性乳管癌又は上皮内小葉癌などを「インサイツ」又は「Ｔｉｓ」と称されている。高グレードの腺腫もまたステージ０と分類されうる。一般に、ステージＩの癌は、通常治療可能である小さな限局した癌であるのに対して、ステージＩＶは通常手術の不可能な癌又は転移性の癌を表す。ステージＩＩ及びＩＩＩの癌は、通常局所的に進行しており、及び／又は局所のリンパ節の併発を表す。一般に、より高いステージの番号は、腫瘍サイズの拡大、及び／又は近辺リンパ節及び／又は原発性腫瘍に近接する臓器への癌の拡散を含む、より広域の疾患を表す。これらの段階付けは正確に定められるが、定義は各々の種類の癌について異なっており、当業者に知られている。
ＮＣＩのサーベイランス、疫学及び最終結果プログラム(End Results Program)(ＳＥＥＧ)などの多くの癌レジストリーは略式の段階付けを用いる。このシステムは全種類の癌に用いられる。癌の症例を５の主なカテゴリーに分類する。
インサイツ(In situ)は、発生した細胞の層にだけ存在する初期癌である。
限局(Localized)は、発生した臓器に限局しており、拡散の所見が見られない癌である。
局所(Regional)は、近くのリンパ節又は器官及び組織に起源の(原発性)部位を越えて蔓延した癌である。
遠位(Distant)は、原発性部位から遠位器官又は遠位リンパ節まで蔓延した癌である。
未知(Unknown)は、段階を表すために十分な情報がない症例を表すために用いる。
また、原発性腫瘍が取り除かれた後、癌が数か月又は数年戻ることは、一般的である。全ての目に見える腫瘍が根絶された後に繰り返される癌は、再発性疾患と呼ばれている。原発性腫瘍の領域で繰り返される疾患は局所的に再発性であり、転移として繰り返される疾患は遠位性再発と称される。休止中の腫瘍は、腫瘍細胞が存在している静止状態で存在する腫瘍であるが、腫瘍発達は臨床的に見られない。微小転移性癌(micrometastases)は、原発性腫瘍から身体の他の部分に広がった僅かな転移又は多くの細胞である。微小転移性癌は、スクリーニング又は診断検査において検出されるかもしれないし、検出されないかもしれない。本発明の方法は、例えば、休止中の腫瘍又は微小転移性癌が存在するが臨床的には検出される、もしくは検出されない環境で、休止腫瘍ないしは微小転移性癌の発症又は腫瘍の再発を予防するために有用である。
本発明の方法は、良性、前癌性又は非転移性の腫瘍を含むがこれらに限定されない初期癌の治療にも有用である。これには、任意のステージ０、Ｉ又はＩＩの腫瘍、任意の非転移性ステージＩＩ腫瘍、形成異常を含むがこれに限定されない、典型的に癌に先立つ又は癌に発達する任意の状態、及び、起源の部位に局所化されたままで、遠位の部位に浸潤、侵入ないしは転移しない任意の腫瘍が含まれる。良性、前癌性又は非転移性の腫瘍の例には、ポリープ、腺腫、線維腫、脂肪腫、ガストリン産生腫瘍、インスリノーマ、軟骨腫、骨腫、血管腫、リンパ管腫、髄膜腫、平滑筋腫、横紋筋腫、扁平細胞パピローマ、聴覚の神経腫、神経線維腫、胆管嚢胞腺腫(cystanoma)、平滑筋腫、中皮腫、テラトーマ、粘液腫、トラコーマ、肉芽腫、過誤腫、移行細胞パピローマ、唾液腺の多形性腺腫、類腱腫、類皮嚢胞乳頭種、嚢腺腫、局所性結節過形成、結節性の再生性過形成が含まれる。
血管新生は原発性腫瘍増殖と転移の双方に関与しているので、本発明によって提供される抗血管新生治療は、原発性部位での腫瘍の新生物増殖を阻害し、並びに続発性部位での腫瘍の転移を防止し、よって他の治療剤による腫瘍の攻撃を可能にする。
アジュバント及びネオアジュバント療法及び初期のステージの腫瘍の治療に関する更なる情報は、米国特許出願第１２／００２６０５号及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８８０００に開示されており、これらの特許出願の内容は出典明示によりここに明示的に援用される。
予防
ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、良性、前癌性又は早い段階の癌の治療のために、又は、腫瘍再発の治療又は防止のために使われうる。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは抗ＶＥＧＦ抗体である。一実施態様では、変異体ＩｇＧはベバシズマブの変異体である。一実施態様では、変異体ＩｇＧは、ベバシズマブの相補性決定領域を含む。他の実施態様では、変異体ＩｇＧは重鎖可変ドメイン（配列番号：１）及び軽鎖可変ドメイン（配列番号：２）を含む。更に他の実施態様では、変異体ＩｇＧは重鎖可変ドメイン（配列番号：７）及び軽鎖可変ドメイン（配列番号：８）を含む。
該方法を用いて癌その物を治療するか、又は転移性ないしは浸潤性の段階又はより高いグレードないしはステージへの癌の進行を予防することができる。例えば、本発明の方法は、ステージＩ又はより高い段階の腫瘍への進行を予防するために、ステージ０の癌又はポリープを有する患者を治療するために用いられうる。同様に、ステージＩＩの癌を有する患者では、該方法は、ステージＩＩＩ又はステージＩＶの癌への癌の進行を予防するために使用できる。
また、変異体ＩｇＧは、腫瘍の再発を予防するために用いることもできる。例えば、腫瘍が同定され、治療された場合(例えば、化学療法により又は外科的に取り除かれる)、変異体ＩｇＧは、局所的な結腸直腸腫瘍の再発又は結腸直腸腫瘍の転移を予防するために用いてもよい。腫瘍の再発の予防のために、変異体ＩｇＧは、例えば、休止中の腫瘍又は微小転移性癌を治療するため、又は休止中の腫瘍又は微小転移性癌の成長又は再成長を予防するために用いてもよく、これは臨床的に検出可能であっても又はそうでなくともよい。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、癌に罹ったことがない被験者又は癌を発症するリスクがある被験者において癌の予防に使用できる。癌と関係していることが知られている様々な危険因子があり、それらの多くをここに記載している。また、遺伝性癌症候群を有することが知られている被験者は、癌を発症する危険があると考えられる。
ネオアジュバント療法
本発明は、被検体、例えばヒト患者の手術可能な癌の外科的除去の前のネオアジュバント療法であって、患者(例えば、ここで患者は、腫瘍及び／又は癌と診断されている)に変異体ＩｇＧの有効量を投与することを含む方法を提供する。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは抗ＶＥＧＦ抗体である。一実施態様では、変異体ＩｇＧはベバシズマブの変異体である。一実施態様では、変異体ＩｇＧは、ベバシズマブの相補性決定領域を含む。他の実施態様では、変異体ＩｇＧは重鎖可変ドメイン（配列番号：１）及び軽鎖可変ドメイン（配列番号：２）を含む。更に他の実施態様では、変異体ＩｇＧは重鎖可変ドメイン（配列番号：７）及び軽鎖可変ドメイン（配列番号：８）を含む。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、少なくとも一の化学療法剤と組み合わせて投与される。また、癌の再発を予防するために手術後に被検体に変異体ＩｇＧの有効量を投与する更なる工程は、ここに記載のネオアジュバント療法によって使用されてもよい。手術後に被検体に変異体ＩｇＧの有効量を投与する更なる工程を含む方法では、ここに記載のアジュバント法の何れかが用いられうる。
例えば、一方法は、以下の工程を含む被検体の癌を治療することを含む：ａ) 各治療周期が、所定の間隔で、変異体ＩｇＧの有効量と、場合によって少なくとも一つの化学療法剤を被検体に投与することを含む、複数の治療周期を含む第一段階；ｂ) 癌が取り除かれる根治手術；及び、場合によって、ｃ) 各維持周期が、所定の間隔で、何れの化学療法剤も伴わずに、又は何れかの化学療法剤と共に、変異体ＩｇＧの有効量を被検体に投与することを含む、複数の維持周期を含む第二段階。
投与スケジュールの一実施態様では、ネオアジュバント療法は、変異体ＩｇＧ及び一又は複数の化学療法剤が複数のネオアジュバント周期で患者に投与される第一工程を含み、ついで外科手術により腫瘍が根治的に除去される。ある実施態様では、ネオアジュバント療法は１年未満続き、一実施態様では、外科手術前の６ヶ月未満続く。
アジュバント療法
本発明は、根治手術の後に、変異体ＩｇＧを非転移性の癌を有する被検体に投与することを含むアジュバント療法の方法を提供する。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは抗ＶＥＧＦ抗体である。一実施態様では、変異体ＩｇＧはベバシズマブの変異体である。一実施態様では、変異体ＩｇＧは、ベバシズマブの相補性決定領域を含む。他の実施態様では、変異体ＩｇＧは重鎖可変ドメイン（配列番号：１）及び軽鎖可変ドメイン（配列番号：２）を含む。更に他の実施態様では、変異体ＩｇＧは重鎖可変ドメイン（配列番号：７）及び軽鎖可変ドメイン（配列番号：８）を含む。
例えば、方法は、次の工程：ａ) 各治療周期が、所定の間隔で、変異体ＩｇＧの有効量と、場合によって少なくとも一つの化学療法剤を被検体に投与することを含む、複数の治療周期を含む第一段階；及びｂ) 各維持周期が、所定の間隔で、何れの化学療法剤も伴わずに、変異体ＩｇＧの有効量を被検体に投与することを含む、複数の維持周期を含む第二段階を含み得、ここで、組み合わせた第一及び第二の段階は最初の術後治療後少なくとも１年間継続する。一実施態様では、第一段階は、変異体ＩｇＧと第一化学療法投薬計画が投与される第一の複数の治療周期の後に、変異体ＩｇＧと第二化学療法投薬計画が投与される第二の複数の治療周期を含む。
変異体ＩｇＧは、一般に、被検体が手術から回復した期間の後に投与される。この期間には、外科的な切開の創傷治癒又は治癒に必要な期間、創傷裂開のリスクが低くなるために必要な期間、又は手術前の健康レベルと本質的に同等か又はそれより良好な健康レベルに回復するために被検体に必要とされる期間が含まれうる。また、根治手術の完了と変異体ＩｇＧの第一投与との間の期間には、被検体が治療的投薬の間に一定の時間を必要とするか又は患者が求める休薬期間に必要な期間が含まれうる。一般に、根治手術の完了と変異体ＩｇＧ療法の開始との間の期間には、１週間未満、１週間、２週間、３週間、４週間(２８日)、５週間、６週間、７週間、８週間、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１年、２年、３年、又はそれ以上が含まれうる。一実施態様では、根治手術と変異体ＩｇＧの投与との間の期間は、４週（２８日）を超え、１年未満である。
一実施態様では、アジュバント療法は、変異体ＩｇＧ及び一又は複数の化学療法剤が複数の治療サイクルで患者に投与される第一ステージと；変異体ＩｇＧが複数の維持サイクルにおいて単一の薬剤として使用される第二ステージとを含む。ある実施態様では、変異体ＩｇＧはベバシズマブの変異体であり、治療サイクルは８週間とでき、これは、患者が化学療法一用量と変異体ベバシズマブ一用量を８週間毎に受けることを意味する。ある実施態様では、治療サイクルはまた１２週間とでき、これは、患者が化学療法一用量と変異体ベバシズマブ一用量を１２週間毎に受けることを意味する。ある実施態様では、アジュバント療法は、治療の開始から少なくとも１年間続き、患者の進行がその後、追跡される。治療の進行は一般的な技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
投薬量、製剤、及び持続期間
変異体ＩｇＧ組成物は、良好な医療実務に一致した形で製剤化され、用量決定され、投与される。この文脈で考慮する要因は、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤のデリバリー部位、投与の方法、投与のスケジューリング、及び医師が知る他の因子を含む。疾患の予防又は治療では、（単独で又は一又は複数の他の更なる治療剤と組み合わせて使用される場合）本発明の変異体ＩｇＧ、例えば抗体の適切な投薬量は、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重篤度及び過程、抗体が予防目的か又は治療目的で投与されるかどうか、過去の療法、患者の臨床履歴及び抗体に対する応答、及び主治医の裁量に依存する。変異体ＩｇＧは一度に又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。
ここでの薬学的製剤は、治療される特定の適応症に対して必要な一を越える活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものをまた含みうる。そのような分子は、好適には、意図される目的に効果的である量で組み合わせて存在する。
投与される変異体ＩｇＧ、例えば抗体の「治療的に有効な量」は、ここで検討された考慮に支配され、疾病又は疾患を予防し、寛解させ、又は治療するのに必要な最小量である。ある実施態様では、投与される変異体ＩｇＧの「治療的に有効な量」は、良性、前癌性又は初期段階の癌を予防、寛解、又は治療、又は安定化させるために；又は例えば、ネオアジュバント又はアジュバント設定において、腫瘍、休止中の腫瘍、又は微小転移性癌の発生又は再発治療又は予防するために必要な最少量である。変異体ＩｇＧは必要ではないが場合によって、当該疾患を予防又は治療するために現在用いられている一又は複数の薬剤と共に製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する変異体ＩｇＧの量、疾患又は治療の種類、及び上で検討された他の因子に依存する。これらは、一般に、これまでに使用されるものと同じ用量及び投与経路で、又はこれまでに用いられた用量の約１から９９％で、用いられる。一般に、疾病又は疾患の寛解又は治療は、疾病又は疾患に伴う一又は複数の症状又は医療的問題を減少させることを含む。癌の場合は、治療的に有効な量の薬剤により、次のものの一つ又は組合せを成し遂げることができる：癌細胞の数の減少；腫瘍サイズの減少；癌細胞の周辺器官への浸潤の阻害(すなわち、ある程度に遅く、典型的には止める)；腫瘍の転移の阻害；腫瘍の増殖のある程度の阻害；及び／又は疾患に関連する一又は複数の症状のある程度の緩和。薬剤が増殖を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺すことが可能な程度で、それは細胞***停止性及び／又は細胞傷害性である。幾つかの実施態様では、この発明の組成物は、患者又は哺乳動物における疾病又は疾患の発症又は再発を予防するために使用できる。
ある実施態様では、治療の持続期間は、医学的に示される限り、又は所望の治療効果(例えばここに記載のもの）が達成されるまで、継続するであろう。ある実施態様では、変異体ＩｇＧ療法は、２か月、４か月、６か月、８か月、１０か月、１年、２年、３年、４年、５年間、１０年又は患者の寿命までの年数の間続けられる。
一般に、良性、前癌性又は初期の癌の緩和ないしは治療又は癌(良性又は悪性)のアジュバントないしはネオアジュバント療法は、癌に関係する一又は複数の症状又は医学的な問題を少なくすることを伴う。薬剤の治療的に有効な量により、腫瘍中の癌細胞数を(例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上)低減すること、腫瘍のサイズを低減すること、腫瘍量を低減すること、末梢器官への癌細胞浸潤を阻害する(すなわち、ある程度低減するか及び／又は停止する)こと、腫瘍の脈管密度を低減すること、腫瘍転移を阻害すること、腫瘍成長又は腫瘍細胞増殖を低減するか又は阻害すること、休止中の腫瘍の成長を低減するか又は予防すること、微小転移性癌の成長又は増殖を低減するか又は予防すること、(例えばアジュバント療法において)治療ないしは除去後の腫瘍の再増殖を低減するか又は予防すること、良性、前癌性又は非転移性腫瘍ないしは悪性腫瘍に罹りやすいか、又はそのように診断された被検体のＤＦＳ又はＯＳを増やすか又は延ばすこと、(例えばネオアジュバント療法において)手術が可能になるまで腫瘍のサイズを低減すること、及び／又は癌関連の症状の一又は複数をある程度軽減すること、の一又は組み合わせを達成することができる。幾つかの更なる実施態様では、変異体ＩｇＧは、被検体の癌の発生又は再発を予防するために用いられうる。
疾患の予防又は治療に対して、本発明の変異体ＩｇＧの適切な投薬量（単独で又は一又は複数の他の更なる治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重篤度及び過程、変異体ＩｇＧが予防目的か又は治療目的で投与されるかどうか、過去の療法、患者の臨床履歴及び変異体ＩｇＧに対する応答、及び主治医の裁量に依存する。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは一度に又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患のタイプ及び重篤度に応じて、変異体ＩｇＧの約１μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ−１５ｍｇ／ｋｇ）が、例えば一又は複数の別個の投与であれ、又は連続的注入によるものであれ、患者への投与に対する最初の候補投薬量でありうる。一つの典型的な毎日の投薬量は、上述の因子に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であるかも知れない。数日又はそれ以上にわたる繰り返し投与の場合、症状に応じて、治療は、疾患症状の所望の抑制が生じるまで一般に維持されるであろう。一実施態様では、症状に応じて、治療は、ここに記載され又は当該分野で知られている方法によって測定して、癌が治療されるまで、維持される。変異体ＩｇＧの一つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの範囲でありうる。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇ（又はその任意の組合せ）の一又は複数の用量が患者に投与されうる。そのような用量は、間欠的に、例えば３週毎、８週毎又は１２週毎（例えば患者が約２から約２０、又は例えば約６用量の抗体を受けるように）に投与されうる。ある実施態様では、最初の高い負荷用量と続く一又は複数の低用量を投与することができる。ある実施態様では、投薬計画は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量と、続く約２ｍｇ／ｋｇの抗体の毎週の維持用量を投与することを含む。しかしながら、他の投薬計画も有用な場合がある。この治療法の進行は一般的な技術及びアッセイによって容易に投与される。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧは抗ＶＥＧＦ抗体である。ある実施態様では、変異体ＩｇＧはベバシズマブの変異体である。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧの投与の頻度は、変異体ＩｇＧの増加した半減期のため、野生型ＩｇＧの投与の頻度と比較して低減される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、野生型ＩｇＧの推奨され又は処方された投薬頻度よりも少ない頻度で投与される。
変異体ＩｇＧがバシズマブの変異体である所定の実施態様では、変異体ＩｇＧは、４週間毎又はより長い間隔で投与されうる。他の実施態様では、変異体ＩｇＧは、６週間毎又はより長い間隔で投与されうる。他の実施態様では、変異体ＩｇＧは、８週間毎又はより長い間隔で投与されうる。他の実施態様では、変異体ＩｇＧは、１０週間毎又はより長い間隔で投与されうる。他の実施態様では、変異体ＩｇＧは、１２週間毎又はより長い間隔で投与されうる。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧは最初は２週間毎に、続いて４週間毎又はより長い間隔で投与されうる。他の実施態様では、変異体ＩｇＧは最初は２−３週間毎に、続いて６週間毎又はより長い間隔で投与されうる。他の実施態様では、変異体ＩｇＧは最初は２−４週間毎に、続いて８週間毎又はより長い間隔で投与されうる。他の実施態様では、変異体ＩｇＧは最初は２−５週間毎に、続いて１０週間毎又はより長い間隔で投与されうる。他の実施態様では、変異体ＩｇＧは最初は２−６週間毎に、続いて１２週間毎又はより長い間隔で投与されうる。ある実施態様では、変異体ＩｇＧ、例えば、ベバシズマブの変異体が、最初は処方された投薬頻度のベバシズマブが投与され、その後に、ベバシズマブの処方された投薬頻度よりも少ない頻度で投与される。ある実施態様では、ベバシズマブが、最初は処方された投薬頻度のベバシズマブが投与され、その後に、ベバシズマブの変異体がベバシズマブの処方された投薬頻度よりも少ない頻度で投与される。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、１４日毎又はより長い間隔で投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、２１日毎又はより長い間隔で投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、２８日毎又はより長い間隔で投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、６０日毎又はより長い間隔で投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、毎月又はより長い間隔で投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、２ヶ月毎又はより長い間隔で投与される。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、３ヶ月毎又はより長い間隔で投与される。
ある実施態様では、患者は変異体ＩｇＧ及び一又は複数の他の治療剤の組合せで治療される。併用投与には、別個の製剤又は単一の薬学的製剤を用いた同時投与又は併用投与、及び何れかの順序での連続投与が含まれ、ここで、場合によっては両方(又は全て)の活性薬剤が同時にそれらの生物学的活性を示す期間がある。変異体ＩｇＧと併用して投与される治療剤の有効量は医師又は獣医の裁量による。投薬量投与及び調節が、治療される症状の最大の管理を達成するためになされる。用量は、使用される治療剤のタイプ及び治療される特定の患者のような因子にまた依存する。ある実施態様では、変異体ＩｇＧの適切な投薬量はその野生型ＩｇＧに対して現在使用されているものであり、変異体ＩｇＧの増加した半減期及び／又は組合せ作用（相乗作用）及び使用される更なる治療剤のために低下されうる。ある実施態様では、阻害剤の組合せは単一の阻害剤の効果を増強する。「増強する」なる用語は、治療剤のその一般的な又は承認された用量での効果の改善を意味する。
ある実施態様では、ここで検討された投薬計画は、化学療法計画との組合せで使用される。ある実施態様では、化学療法計画は、伝統的な高用量間欠投与を伴う。ある実施態様では、化学療法剤は、定期的に中断することなく、より少なくより頻繁な用量を用いて投与される(「メトロノーム的化学療法」)。
ある実施態様では、患者は、変異体ＩｇＧ及び一又は複数の化学療法剤の組合せで治療される。ある実施態様では、化学療法剤は、変異体ＩｇＧの投与の前又は後に投与されうる。一実施態様では、化学療法剤の少なくとも一回の投与と変異体ＩｇＧの少なくとも一回の投与の間の時間は、およそ１ヶ月又はそれ以下である。一実施態様では、化学療法剤の少なくとも一回の投与と変異体ＩｇＧの少なくとも一回の投与の間の時間は、およそ２ヶ月又はそれ以下である。あるいは、化学療法剤及び変異体ＩｇＧは、単一製剤又は別個の製剤で、患者に同時に投与される。化学療法剤及び変異体ＩｇＧの組合せでの治療は、患者に対して相乗的又は相加以上の治療的恩恵を生じうる。
投与される場合、化学療法剤は、通常はそれに対して知られている投薬量、又は抗代謝性化学療法剤の投与に起因するネガティブな副作用ないし薬剤の組合せ作用のために場合によっては低い投薬量で投与される。このような化学療法剤の調製及び投薬計画は、製造業者の指示に従って使用されうるか、又は熟練の医師によって経験的に決定されうる。
組み合わされうる様々な化学療法剤は、例えば定義のところで、ここに開示されている。変異体ＩｇＧと組み合わされる化学療法剤の例は、限定しないが、例えば、タキソイド(ドセタキセル及びパクリタキセルを含む)、ビンカ(例えばビノレルビン又はビンブラスチン)、白金化合物(例えばカルボプラチン又はシスプラチン)、アロマターゼインヒビター(例えばレトロゾール、アナストラゾール又はエキセメスタン)、抗エストロゲン(例えばフルベストラント又はタモキシフェン)、エトポシド、チオテパ、シクロホスファミド、メトトレキセート、リポソームドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、カペシタビン、ゲムシタビン、ＣＯＸ-２インヒビター(例えばセレコキシブ)、又はプロテオゾームインヒビター(例えばＰＳ３４２)を含む。異なった化学療法剤の「カクテル」が投与されうる。
本発明の治療の進行は、一般的な技術及びアッセイによって簡単にモニターされる。
ある実施態様では、腫瘍、休止中の腫瘍又は微小転移性癌の発症は再発の治療又は予防は、一般に腫瘍の最初の治療ないしは除去(例えば、手術、化学療法又は放射線療法などの抗癌療法を使用)後の腫瘍ないしは転移の形成の予防を伴う。手術は、腫瘍細胞又は休止中の微小転移性小結節を残し得、それらは「血管形成プログラム」を再活性化して、より指数関数的な腫瘍増殖を促しうる。休止中の腫瘍又は微小転移性癌の存在が臨床測定値又は選別を使用して必ずしも検出可能であるというわけではないが、治療上有効量は、臨床医に知られている技術を使用して、休止中の腫瘍、微小転移性癌、転移又は腫瘍再発の検出を予防するか又は低減するために十分であるものである。一例では、外科的に腫瘍を除去することによって腫瘍について治療される患者は、その後変異体ＩｇＧで治療され、休止中の腫瘍、微小転移性癌又は腫瘍再発の検出のために経時的にモニターされる。変異体ＩｇＧ、例えば抗ＶＥＧＦ抗体は、（例えば、変異体ＩｇＧの前、それと共に、又はその後の)他の抗癌療法と組み合わせて投与され得、一方又は両方の療法は維持療法として継続されうる。
癌の治療における治療効果の更なる測定は米国特許出願公開第２００５０１８６２０８号に記載されている。
本発明の変異体ＩｇＧ（及び任意の更なる治療剤）は、非経口、皮下、腹腔内、脳脊髄内、肺内、及び鼻腔内、及び局所治療が望まれるならば、病巣内投与を含む任意の適切な手段によって投与されうる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。ある実施態様では、変異体ＩｇＧ、例えば、抗体は、パルス注入によって、特に減少用量の変異体ＩｇＧで適切に投与される。投薬は、任意の適切な経路、例えば投与が短期か慢性であるかどうかに部分的に依存して、静脈内又は皮下注射のような注射によるものとできる。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、例えば、ボーラスとして又は所定期間にわたる連続注入によって、静脈内に患者に投与される。
本発明の変異体ＩｇＧ、例えば抗体の結合標的の位置は、変異体ＩｇＧの調製及び投与において考慮されうる。変異体ＩｇＧの結合標的が脳内に位置している場合、本発明の所定の実施態様は、血液脳関門を横切る変異体ＩｇＧを提供する。限定するものではないが、物理的方法、脂質ベースの方法、幹細胞ベースの方法、及びレセプター及びチャンネルベースの方法を含む幾つかの従来から知られている、分子を血液脳関門を横切って輸送するためのアプローチ法が存在する。
血液脳関門を横切って変異体ＩｇＧ、例えば抗体を輸送する物理的方法は、限定するものではないが、完全に又は血液脳関門において開口を形成することにより血液脳関門を回避することを含む。回避方法は、限定されないが、脳内への直接の注入（例えばPapanastassiou等, Gene Therapy 9: 398-406 (2002)を参照）、間質注入／対流亢進デリバリー（例えば、Bobo等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)を参照）、及び脳へのデリバリー装置の移植（例えばGill等, Nature Med. 9: 589-595 (2003)；及びGliadel WafersTM, Guildford Pharmaceuticalを参照）を含む。関門に開口を形成する方法は、限定されないが、超音波（例えば、米国特許出願公開第２００２／００３８０８６号参照）、浸透圧（例えば、高浸透圧マンニトールの投与による（Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)）、例えばブラジキニン又は透過剤Ａ−７による透過（例えば米国特許第５１１２５９６号、同第５２６８１６４号、同第５５０６２０６号、及び同第５６８６４１６号）、及び変異体ＩｇＧをコードする遺伝子を含むベクターでの血液脳関門にまたがるニューロンの形質移入（ 例えば、米国特許出願公開第２００３／００８３２９９号を参照）。
血液脳関門を横切って変異体ＩｇＧ、例えば抗体を輸送する脂質ベースの方法は、限定するものではないが、血液脳関門の血管内皮上のレセプターに結合する抗体結合断片にカップリングされるリポソームへの変異体ＩｇＧのカプセル化（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３号を参照）、及び低密度リポタンパク質粒子での変異体ＩｇＧの被覆（例えば、米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号を参照）又はアポリポタンパク質（例えば、米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号を参照）を含む。
血液脳関門を横切って変異体ＩｇＧ、例えば抗体を輸送する幹細胞ベースの方法は、興味ある抗体を発現する神経前駆細胞（ＮＰＣｓ）を遺伝的に操作し、ついで治療される個体の脳中に幹細胞を移植することを伴う。Behrstock等 (2005) Gene Ther. 15 Dec. 2005 アドバンストオンライン刊行物（神経栄養因子ＧＤＮＦを発現するように遺伝子操作されたＮＰＣｓが齧歯類及び霊長類モデルの脳内に移植されたときにパーキンソン病の症状を減少させたことを報告している）を参照。
血液脳関門を横切って変異体ＩｇＧ、例えば抗体を輸送するレセプター及びチャンネルベースの方法は、限定するものではないが、血液脳関門の透過性を増加させるためのグルココルチコイドブロッカーの使用（例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、第２００３／０１６２６９５号、及び第２００５／０１２４５３３号）；カリウムチャンネルの活性化（例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号を参照）、ＡＢＣ薬剤トランスポーターの阻害（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号を参照）；抗体をトランスフェリンで被覆し、一又は複数のトランスフェリンレセプターの活性を調節すること（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号）、及び抗体のカチオン化（例えば、米国特許第５００４６９７号を参照）を含む。
本発明の変異体ＩｇＧ、例えば抗体を含んでなる薬学的製剤は、所望の純度を持つ変異体ＩｇＧを、任意成分の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより（Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20版(2000)）、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル）に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington: The Science 及びPractice of Pharmacy 20版(2000)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例は、本発明の免疫グロブリンを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された免疫グロブリンが体内に長時間残ると、３７℃の水分に暴露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。
治療の効果
変異体ＩｇＧの効果は、限定しないが、「定義」の下にここに記載された方法を含む様々な方法で測定されうる。例えば、腫瘍の治療における効果は、腫瘍の増殖又は転移を阻害又は低減させる変異体ＩｇＧの能力を検出することによって測定することができる。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、変異体ＩｇＧが野生型ＩｇＧを使用しての治療で達成される腫瘍増殖と比較して腫瘍増殖の速度を減少させることができるならば、より高い効果を有している。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、変異体ＩｇＧが腫瘍増殖の同じ最大阻害を達成するのに野生型ＩｇＧに必要な用量よりも低いＩｇＧ用量でっしゅようぞうしょくの最大阻害を達成することができるならば、より高い効果を有している。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、変異体ＩｇＧが野生型ＩｇＧに必要な用量よりも低いＩｇＧ用量で癌細胞の増殖又は転移を阻害又は低減させる能力を有しているならば、野生型ＩｇＧと比較して高い効果を有している。ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧは野生型ＩｇＧと比較して等価な又はより高い効果を有している。ある実施態様では、本発明の変異体ＩｇＧは野生型ＩｇＧと比較して低い効果は有していない。
本発明の治療の効果はまた腫瘍性又は非腫瘍性疾患を評価するのに一般的に使用される様々なエンドポイントによって測定することができる。例えば、癌治療は、例えば、限定しないが、腫瘍退縮、腫瘍重さ又はサイズ縮小、腫瘍増殖停止時間、生存期間、無増悪生存期間、奏効率、奏効期間、生活の質、タンパク質発現及び／又は活性によって、評価することができる。抗血管新生剤のようなここに記載されたある種の薬剤は、必ずしも腫瘍性細胞自体ではなく、腫瘍脈管構造を標的とするので、それらは独特のクラスの抗癌薬を表し、よって薬剤に対する臨床応答の独特の基準及び定義を必要としうる。 例えば、２次元解析における５０％を越える腫瘍縮小は、応答を断言するための標準的なカットオフである。しかしながら、本発明の阻害剤は、原発性腫瘍の縮みを伴わないで転移性広がりの阻害を生じ得、又は単に静腫瘍性効果を生じうる。従って、例えば血管新生の血漿又は尿マーカーの測定及び放射線造影法を通しての応答の測定を含む治療の効果を決定するためのアプローチを用いることができる。
併用療法
ここに記載された治療剤は、他の治療剤と共に同時に投与されうる。つまり、ここに記載された治療剤は、例えば小分子、他の生物剤、放射線療法、外科手術等を含む他の治療法又は治療剤と同時に投与されうる。
ある実施態様では、ＩｇＧ変異体は、患者に投与される唯一の治療的に活性な薬剤である。ある実施態様では、ＩｇＧ変異体は、限定しないが、抗血管新生剤、化学療法剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、キナーゼインヒビター、細胞傷害性薬剤、心保護剤、又は他の治療剤を含む一又は複数の他の治療剤との併用で投与される。ＩｇＧ変異体は一又は複数の他の治療計画と同時に投与されうる。ある実施態様では、ＩｇＧ変異体は、ＩｇＧ変異体であっても又はなくてもよい一又は複数の抗体との併用で投与されうる。ある実施態様では、ＩｇＧ変異体は外科手術のような更に他の治療技術との併用で用いることができる。
ある実施態様では、更なる薬剤、例えば、抗癌剤又は治療剤、又は抗血管新生剤を、また様々な腫瘍性又は非腫瘍性症状を治療するために変異体ＩｇＧと併用して投与することができる。一実施態様では、腫瘍又は非腫瘍性症状は、異常な又は望まれない血管新生を伴う病理疾患によって特徴付けられる。本発明の変異体ＩｇＧは、同じ組成物において又は同じ又は異なる投与経路を使用して別個の組成物として、その目的に対して効果的である他の薬剤と併用して又は連続的に投与されうる。
癌との関連の抗血管新生療法は、腫瘍増殖を支える栄養分の供給に必要な腫瘍血管の発達を阻害することを目的とした癌治療方策である。ある実施態様では、血管新生が原発性腫瘍増殖と転移の双方に関与するので、本発明によって提供される抗血管新生療法は、原発部位での腫瘍の腫瘍増殖を阻害することができ、二次部位での腫瘍の転移を予防することができ、よって他の療法による腫瘍の攻撃が可能になる。本発明の一実施態様では、抗癌剤又は治療剤は抗血管新生剤である。他の実施態様では、抗癌剤は化学療法剤である。
ここに列挙され、例えば定義の下に列挙され、また例えばCarmeliet及びJain, Nature 407:249-257 (2000)；Ferrara等, Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004)；及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)によって列挙されたものを含む多くの抗血管新生剤が同定され、当該分野で知られている。また米国特許出願公開第２００３００５５００６号を参照のこと。ある実施態様では、二以上の血管新生阻害剤は、場合によっては、本発明の変異体ＩｇＧに加えて、患者に同時投与されうる。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧと併用されうる他の治療剤はＶＥＧＦアンタゴニスト又はＶＥＧＦレセプターアンタゴニストである。ある実施態様では、変異体ＩｇＧとの併用腫瘍治療に有用な他の治療剤は、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２としてもまた知られている）ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又はＴＮＦのような腫瘍増殖に関与する他の因子のアンタゴニストを含む。ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、例えばＶＥＧＦレセプター、ＦＧＦレセプター、ＥＧＦレセプター及びＰＤＧＦレセプターのような一又は複数のチロシンキナーゼレセプターを標的とする小分子レセプターチロシンキナーゼインヒビター（ＲＴＫＩｓ）との併用で使用することができる。限定しないが、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、エルロチニブ（タルセバ(登録商標)）、ＯＳＩ−７９０４、ＺＤ６４７４（ＺＡＣＴＩＭＡ(登録商標)）、ＺＤ６１２６（ＡＮＧ４５３）、ＺＤ１８３９、スニチニブ（スーテント(登録商標)）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、ＡＭＧ７０６、ＡＧ０１３７３６、イマチニブ（グリベック(登録商標)）、ＭＬＮ−５１８、ＣＥＰ−７０１、ＰＫＣ−４１２、ラパチニブ（ＧＳＫ５７２０１６）、ベルケイド(登録商標)、ＡＺＤ２１７１、ソラフェニブ（ネクサバール(登録商標))、ＸＬ８８０、及びＣＨＩＲ−２６５を含む多くの治療用小分子ＲＴＫＩｓが知られている。
本発明はまた本発明の二以上の変異体ＩｇＧの組合せ又は一又は複数の更なる抗癌治療との少なくとも一つの変異体ＩｇＧの組合せの使用を特徴とする。抗癌治療法の例は、限定しないが、外科手術、放射線療法（照射療法）、バイオセラピー、免疫療法、化学療法、又はこれらの治療法の組合せを含む。一実施態様では、前立腺癌、卵巣癌及び乳癌に対する抗癌療法はホルモン療法でありうる。加えて、細胞傷害剤、抗血管新生剤及び抗増殖剤を変異体ＩｇＧと組み合わせて使用することができる。ある実施態様では、ＩｇＧ変異体は、化学療法、放射線療法、又は化学療法及び放射線療法の双方と共に患者に投与される。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、根治手術後の非転移性癌の治療のためのアジュバント療法として使用される。この例では、変異体ＩｇＧは少なくとも一つの更なる化学療法剤と共に又はこれを伴わないで提供されうる。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧは、外科手術前の手術可能な癌の治療に対するネオアジュバント療法として使用される。この例では、変異体ＩｇＧは少なくとも一つの更なる化学療法剤と共に又はこれを伴わないで外科手術の前に提供されうる。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧと一又は複数の他の治療剤は、腫瘍、休止中の腫瘍、又は微小転移性癌の発症又は再発を低減させ又は排除するのに十分な量及び時間、同時に又は順次投与されうる。変異体ＩｇＧと一又は複数の他の治療剤は、腫瘍の再発の可能性を防止又は減少させるために維持療法として投与することができる。
ある実施態様では、本発明は一又は複数の化学療法剤との変異体ＩｇＧ（例えばカクテル）の使用を特徴とする。化学療法剤の非限定的な例は定義の下でここに記載されている。このような化学療法剤の調製及び投薬スケジュールは、製造者の指示書に従って、又は熟練の医師によって経験的に決定されて使用されうる。また用量、製剤、及び期間と題したセクションを参照のこと。
製造品
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器の又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、それのみによって又は他の組成物と組み合わせて症状を治療、予防及び／又は診断するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる）。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択した症状の治療に使用されることを示す。ある実施態様では、製造品は、（ａ）組成物を中に収容し、その組成物が本発明の抗体を含む第一の容器と；（ｂ）組成物を中に収容し、その組成物が更なる細胞傷害性薬物を含む第二の容器とを含みうる。該製造品は、組成物を特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含みうる。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の（又は第三の）容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
ある実施態様では、変異体ＩｇＧは単独で又はキットとして他の治療用化合物との組み合わせで包装されうる。一実施態様では、治療用化合物は抗癌剤である。キットは、患者への単位用量の投与を補助する任意成分、例えば粉剤形態を再構成するためのバイアル、注射用のシリンジ、カスタマイズされたＩＶデリバリーシステム、インヘラー等を含みうる。また、単位用量キットは、組成物の調製及び投与のための指示書を含みうる。キットは、一人の患者のための頓用単位用量として、特定の患者の複数使用（一定の用量又は治療の進行に応じて個々の化合物の効能が変化しうる）として製造することができ；あるいはキットは複数患者への投与に適した複数用量を含みうる（「バルクパッケージング」）。キットコンポーネントは、大型容器、ブリスターパック、ビン、チューブ等に組み込むことができる。
次は本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的説明があれば、様々な他の実施態様を実施することができるものと理解される。
実施例１：抗ＶＥＧＦ (ベバシズマブ)変異体の製造
野生型抗ＶＥＧＦ（ベバシツマブ）ＩｇＧ１重鎖及び軽鎖のＦｖ領域を、ヒトＩｇＧ１定常ドメインを含む２つのｐＲＫベースの一過性形質移入プラスミド中に別個にクローニングした。ついで、Ｋｕｎｋｅｌベースの部位特異的突然変異誘発を使用して、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン中の残基が変異せしめられた全ての抗ＶＥＧＦ ＩｇＧ１変異体を産生させた。この研究で産生された抗ＶＥＧＦ変異体を以下の表２にまとめる。各変異体はＣＨ２及びＣＨ３ドメインに単一、二重及び三重の変異を何れか含んでいる。変異体はＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスに従って番号付けする。
Figure 2016026144
変異体の重鎖及び野生型軽鎖を含むプラスミドを、製造プロトコルに従って、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）（Roche, Basel, Switzerland）によるアデノウイルス形質転換ヒト胚性腎臓細胞株２９３中に同時形質移入した。形質移入複合体と共に２４時間インキュベートした後、形質移入細胞を、ついで、１０ｍｇ／Ｌのインスリン及び微量元素を補填した無血清培地ＰＳＯ４を用いて５日間又は５ｍＭのグルタミンを含む１．３ＸのＧＥＭＮ培地を用いて培養した。上清を集め、１ＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．０）及び５Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）で条件化し、最終濃度の３０ｍＭのＴＲＩＳ及び５０ｍＭのＮａＣｌを得た。ついで、条件化された上清を、ついでプロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。結合したＩｇＧ１を、０．１Ｍのグリシンバッファー（ｐＨ３．０）を用いてプロテインＡカラムから溶離させた。ついで、精製したＩｇＧ１を濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００サイズ排除クロマトグラフィーに注入して、あらゆる凝集物を除去した。単量体性ＩｇＧ１画分を一緒にプール化し、後で結合実験に使用した。抗ＶＥＧＦ野生型及び抗ＶＥＧＦ変異体ＩｇＧ１濃度を、２８０ｎＭでの吸光度の読み取り値を使用して計算し、１．５の吸光度が１ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ１であると推定した。
実施例２：ヒト及びカニクイザルＦｃＲｎの生産
ヒトＦｃＲｎは、α鎖とβ２−ミクログロブリンサブユニットのヘテロ二量体である。これれらの二つのサブユニットを二つのｐＲＫベースの一過性形質移入プラスミド中に別個にクローニングした。α鎖とβ2-ミクログロブリンの双方を含むプラスミドを、製造プロトコルに従って、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）（Roche, Basel, Switzerland）を使用して２９３細胞中に同時形質移入した。形質移入複合体と共に２４時間インキュベートした後、形質移入細胞を、ついで、１０ｍｇ／Ｌのインスリン及び微量元素を補填した無血清培地ＰＳＯ４に５日間切替えた。集めた上清を濾過し、１Ｍの塩酸及び５ＭのＮａＣｌで条件化し、最終ｐＨ６．０及び濃度の５０ｍＭのＮａＣｌを得た。条件化された上清をＩｇＧ−セファロースクロマトグラフィーを使用して精製した。結合したＦｃＲｎを、３０ｍＭのＴＲＩＳ及び１５０ｎＭのＮａＣｌを含むｐＨ８．０のバッファーを使用してカラムから溶離させた。溶離されたＦｃＲｎをＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５サイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用して更に精製して、あらゆる凝集物を除去した。ＦｃＲｎ濃度を、２８０ｎＭでの吸光度の読み取り値を使用して計算し、１．９の吸光度が１ｍｇ／ｍｌのＦｃＲｎに対応した。カニクイザルＦｃＲｎは、ｃｙｎｏα鎖及びｃｙｎｏβ２−ミクログロブリンを含むプラスミドが形質移入に使用されたことを除いて、ヒトＦｃＲｎと同様にして生産され、精製される。
実施例３：ＦｃＲｎ結合研究：ＦｃＲｎに対するＩｇＧ１変異体の注入
ヒトＦｃＲｎに対する抗ＶＥＧＦ変異体の結合性を、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器(GE healthcare, Piscataway, NJ)を使用して表面プラズモン共鳴によって研究した。ヒトＦｃＲｎを、アミンカップリングキットを使用してセンサーチップにカップリングさせた。すなわち、ＣＭ５センサーチップを、５μｌ／分で７分間、ＥＤＣ／ＮＨＳで活性化させた。１００μｇ／ｍｌのヒトＦｃＲｎを活性化されたチップに対して１０μｌ／分の流量で３０秒から２分の間注入して、５０から２００の最大結合応答単位（ＲＵ）を得た。コンジュゲーション後、ＦｃＲｎ結合チップを、５μｌ／分での３５μｌの１Ｍエタノールアミン塩酸塩の注入によりブロックした。
ｐＨ６．０又はｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎへの抗ＶＥＧＦ野生型（ＷＴ）及び抗ＶＥＧＦ変異体の結合性を決定した。結合実験の流通バッファーは、０．０１％のＰ２０及び０．０２％のアジド化ナトリウムを含むｐＨ６．０又はｐＨ７．４のＰＢＳである。抗ＶＥＧＦ（ベバシズマブ）ＷＴ及び抗ＶＥＧＦ変異体を、ｐＨ６．０又はｐＨ７．４の流通バッファーにバッファー交換した。全ての実験は２５℃で実施した。ｐＨ６．０の実験では、１５μＭから０．７ｎＭの範囲の濃度を持つ変異体を、定常状態を達成するために様々な時間の間、３０μｌ／分でＦｃＲｎ被覆チップに対して流通させ、ついで、５分間、チップから解離させた。ｐＨ７．４の実験では、３０μＭから３０ｎＭの範囲の濃度を持つ変異体を、定常状態を達成するために様々な時間の間、２０μｌ／分でＦｃＲｎ被覆チップに対して注入し、ついで、２分間、チップから切り離した。変異体をまたセンサーチップ上の未結合スポットに対して流通させ、ＦｃＲｎ結合チップへの結合からバックグラウンドの非特異的結合のサブトラクションを可能にした。チップを、注入間で０．１ＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．３）の３０秒パルスで再生させた。各注入のための定常状態ＲＵを各注入相の終わりに記録し、見かけの解離定数（見かけのＫＤ）を、最大ＲＵの５０％を達成したＩｇＧ濃度として後で推定した。
２回の異なった実験から得られた図１Ａ及び１Ｂの結果は、全ての変異体がｐＨ６．０で野生型に対して改善されたＦｃＲｎ親和性を有していることを示している。見かけの解離定数（ＫＤ）の推定値を図２に示す。ＦｃＲｎカップリング密度は２回の実験で異なっているので、アビディティーレベルは異なっており、同じ変異体に対して僅かに異なった見かけKD値を生じた。しかしながら、これらの変異体の親和性ランクは異なった実験に対して同じままであった。図３は、試験した抗ＶＥＧＦ変異体の全てが野生型と比較してヒトＦｃＲｎに対するより高い中性ｐＨでの結合性を示すことを示している。ｐＨ７．４結合に基づく変異体の親和性ランキングは、ｐＨ６結合を使用して決定された親和性ランキングに対応していた。
Figure 2016026144
表３に示された抗ＶＥＧＦ野生型（ＷＴ）及び抗ＶＥＧＦ変異体のヒト及びｃｙｎｏ ＦｃＲｎの結合性をこのアッセイ形式を使用して更に評価した。ヒト又はｃｙｎｏ ＦｃＲｎをセンサーチップに被覆した。抗ＶＥＧＦ野生型及び抗ＶＥＧＦ変異体を、ｐＨ６．０又はｐＨ７．４の何れかのバッファーで２５℃でＦｃＲｎ被覆チップに注入した。定常状態の応答単位を記録し、注入濃度の関数としてプロットした。全ての抗ＶＥＧＦ変異体は、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４の双方において抗ＶＥＧＦ野生型に対してヒト及びｃｙｎｏ ＦｃＲｎへの改善された結合性を示した（図４Ａ−４Ｄを参照）。このアッセイで決定された抗ＶＥＧＦ変異体の親和性ランキングは、一価ＫＤを使用して決定されたランキングと同じであった。
図２６に示された抗ＨＥＲ２野生型（ＷＴ）及び抗ＨＥＲ２変異体のヒトＦｃＲｎ結合性を、このアッセイ形式を使用してまた評価した。図２６において研究された変異体は、Ｌ２５１Ａ、Ｌ３１４Ａ、Ｌ３１４Ｄ、Ｌ３１４Ｋ、Ｅ４３０Ａ、Ｅ４３０Ｋ、Ｌ２５１Ｄ／Ｎ４３４Ｈ及びＬ３１４Ｄ／Ｎ４３４Ｈである。ヒトＦｃＲｎをセンサーチップに被覆した。抗ＨＥＲ２野生型及び抗ＨＥＲ２変異体を、６．０から７．２の範囲のｐＨのバッファー中で２５℃にてＦｃＲｎ被覆チップに対して注射した。定常状態の応答単位を記録し、各ｐＨに対して注入濃度の関数としてプロットした。ついで、野生型及び各変異体の親和性を各注入ｐＨに対して推定し、野生型に対する変異体の親和性比を図２６にｐＨの関数としてプロットした。変異体Ｅ４３０Ａ、Ｅ４３０Ｋ及びＬ２５１Ｄ／Ｎ４３４Ｈに対する親和性比はｐＨの増加と共に減少する一方、他の変異体の全ての親和性比はｐＨの増加と共に増加する。
ｐＨ６．０（図２７Ａ）、ｐＨ７．１（図２７Ｂ）、及びｐＨ７．４（図２７Ｃ）におけるヒトＦｃＲｎに対する抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ）ＩｇＧ１野生型、変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｈ及び変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｈ／Ｙ４３６Ｉの結合性を、類似のアッセイ形式を使用してまた評価した。抗ＨＥＲ２野生型及び抗ＨＥＲ２変異体を、ｐＨ６．０、ｐＨ７．１又はｐＨ７．４のバッファー中で２５℃でＦｃＲｎ被覆チップに注入した。定常状態の応答単位を記録し、各変異体に対して注入濃度の関数としてプロットした。結果は、ｐＨ６．０（図２７Ａ）では、変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｈは野生型と同様のＦｃＲｎ親和性を有し、変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｈ／Ｙ４３６Ｉは変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａと同様のＦｃＲｎ親和性を有していることを示している。ｐＨ７．１（図２７Ｂ）では、変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｈは野生型より更に低いＦｃＲｎ親和性を有しており；変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｈ／Ｙ４３６Ｉは野生型と同様のＦｃＲｎ親和性を有し、変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａより低いＦｃＲｎ親和性を有している。ｐＨ７．４（図２７Ｃ）では、変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｈ／Ｙ４３６Ｉは、野生型及び変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａより低いＦｃＲｎ親和性を有している。
実施例４：ＦｃＲｎ結合研究：ＩｇＧ１変異体に対するヒト又はｃｙｎｏ ＦｃＲｎの注入
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器（GE healthcare, Piscataway, NJ）を使用する結合形式では、抗ＶＥＧＦ野生型（ベバシズマブ）及び抗ＶＥＧＦ変異体を、アミンカップリングキットを使用してセンサーチップの異なったフローセルにコンジュゲートした。すなわち、ＣＭ５センサーチップを５μｌ／分で７分間、ＥＤＣ／ＮＨＳで活性化させた。１０から５０μｇ／ｍｌの抗体を、活性化されたチップに対して１０μｌ／分の流量で３０秒から２分注入して、５０から２００の最大結合応答単位（ＲＵ）を生じた。コンジュゲーション後、ＦｃＲｎ結合チップを、５μｌ／分で３５μｌの１Ｍのエタノールアミン塩酸塩の注射によってブロックした。
結合実験に対する流通バッファーはＰＢＳ ｐＨ６．０／０．０１％のＰ２０／０．０２％のアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）であった。２０μＭから０．１５ｎＭの可溶性ヒト又はｃｙｎｏ ＦｃＲｎ希釈物を２５℃で抗体被覆センサーチップに対して１０分間、３０μｌ／分の流量で注入した。定常状態のＲＵを、注入の終わりに記録した。チップを０．１ＭのＴＲＩＳ（ｐＨ８．５）／０．１５ＭのＮａＣｌの３０秒パルスで再生した。ＦｃＲｎをバックグラウンドサブトラクションのために未コンジュゲート表面にまた注入した。動態パラメータ及び一価平衡結合定数（ＫＤ）を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（GE healthcare, Piscataway, NJ）を使用して計算した。
図５及び図６の結果は、抗ＶＥＧＦ変異体の全てがｐＨ６．０でのヒト及びｃｙｎｏ ＦｃＲｎの双方に対して野生型より改善されたＦｃＲｎ親和性を有していることを示している。親和性の改善は、会合速度定数の増加と解離速度定数の減少の双方によっていた。総括して、異なった結合アッセイを使用する野生型に対する抗ＶＥＧＦ変異体の親和性改善を図８にまとめる。図８は、Ｖ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ変異体が表３に列挙された変異体の中で最も高いＦｃＲｎ親和性を有しており、Ｔ３０７Ｑ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｓ、及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａが続くことを示している。Ｎ４３４Ｈ変異体は野生型に対するＦｃＲｎ親和性改善量が最も少ない。
実施例５：異なったｐＨでの抗ＶＥＧＦ及び抗ＨＥＲ２変異体の解離速度
様々なｐＨでの解離速度を測定するために、２００ｎＭから２μＭのヒト又はｃｙｎｏ ＦｃＲｎを、定常状態を達成するために５分間、ＰＢＳ（ｐＨ６．０）／０．０１％のＰ２０／０．０２％のＮａＮ３中で３０μｌ／分で抗体コンジュゲートフローセルに最初に注入した。ついで、６から７．４の範囲のｐＨのＰＢＳバッファーを、８分間、フローセルに３０μｌ／分で注入して、複合体が解離するようにした。ＦｃＲｎをまたバックグラウンドのサブトラクションのために未コンジュゲート表面に注入した。解離速度定数は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（GE healthcare, Piscataway, NJ）を使用してセンサーグラムの解離相をフィットさせて決定した。図７の結果は、ヒトＦｃＲｎ（図７Ａ）及びｃｙｎｏ ＦｃＲｎ（図７Ｂ）の双方に対する変異体のｋｏｆｆがｐＨの増加と共に増加し、各変異体に対してｋｏｆｆ増加の速度が同様であったことを示している。
異なったｐＨでのヒトＦｃＲｎに対する抗ＨＥＲ２変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｈ／Ｙ４３６Ｉの解離速度（ｋｏｆｆ）を同様に測定した。ヒトＦｃＲｎに対する抗ＨＥＲ２変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｈ／Ｙ４３６Ｉのｋｏｆｆを図２８にｐＨの関数としてプロットした。図７からのヒトＦｃＲｎに対する抗ＶＥＧＦ変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ３０７Ｑ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ｓ及びＶ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａのｋｏｆｆを比較のために図２８にまたプロットした。異なったｐＨでのｋｏｆｆ値を各変異体についてｐＨに対してフィットさせ、ベストフィット線の傾きを得た（式：ｌｏｇ（ｋｏｆｆ）＝傾き×ｐＨ＋ｙ−切片）。抗ＶＥＧＦ変異体の傾きは０．７５から０．８４の範囲である一方、抗ＨＥＲ２変異体Ｌ２５１Ｄ／Ｔ３０７Ｑ／Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｈ／Ｙ４３６Ｉの傾きは約１．２である。
実施例６：ヒトＶＥＧＦに対する結合
ＶＥＧＦ-A109の組換え型を、アミンカップリングキットを使用してＣＭ５チップにコンジュゲートさせた。すなわち、CM5センサーチップを５μｌ／分で７分間、EDC/NHSで活性化させた。1から2μg/mlのＶＥＧＦ-A109 を１０μｌ／分の流量で３０秒間、活性化チップに注入して、１００から４００の最大結合応答単位（ＲＵ）を得た。コンジュゲーション後、ＦｃＲｎ結合チップを、５μｌ／分での３５μｌの１Ｍエタノールアミン塩酸塩の注入によりブロックした。100nMから6nMの抗体の２倍希釈物を、３７℃で PBS/0.05% Tween/0.02% NaN3 中、４分間、ＶＥＧＦコンジュゲートチップに注入した。複合体を１８分間解離させた。チップを２０ｍＭの塩酸の３０秒パルスで再生させた。抗体をまたバックグラウンドのサブトラクションのために未コンジュゲート表面に注入した。図９の結果は、Ｆｃ変異がＶＥＧＦ結合を改変せず、変異体の全ては野生型と同じ結合応答を有していることを示している。
実施例７：細胞増殖のインビトロ阻害
様々な濃度の抗ＶＥＧＦ野生型（ベバシズマブ）及び抗ＶＥＧＦ変異体を室温で１時間、組換えヒトＶＥＧＦと共にプレインキュベートした。抗ＶＥＧＦ野生型（ベバシズマブ）及び抗ＶＥＧＦ変異体の濃度は３３ｎＭから０．０５ｎＭの範囲であった。組換えヒトＶＥＧＦの濃度は０．２６ｎＭであった。ついで、複合体を、３７℃及び５％ＣＯ２で培養中のヒト臍血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に提示した。培養の４日後にＨＵＶＥＣの生存率を、３７℃及び５％ＣＯ２で６時間、細胞を２０％のアラマーブルー染料（Trek Diagnostic Systems, Cleveland, OH）と共に細胞をインキュベートすることによって評価した。ついで、アラマーブルーの蛍光をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Sunnyvale, CA）マイクロプレートリーダーで検出した。図１０に示されるように、変異体の全てが野生型及びアバスチン(登録商標)と同じ増殖阻害レベルを有しており、Ｆｃ変異が変異体のＶＥＧＦを中和する能力に影響しないことが再び確認される。
実施例８：カニクイザルにおける薬物動態研究
２−５ｋｇの体重の試験前の理学的検査時に２から７歳であった３６匹の雄及び３６匹の雌のナイーブなカニクイザルを、それぞれが６匹の雄と６匹の雌からなる６つの処置群に割り当てた。処置群に対して体重のバランスを達成するように設計されたコンピュータ化ブロッキング手順を使用して動物を処置群に割り当てた。健康であるように見え、明らかな異常がなかった動物のみを研究に使用した。全ての動物には、伏在静脈を介して単一の静脈内ボーラス用量と、ついで０．９％の生理食塩水流を１日目に投与した。全ての群に対する用量レベルは５ｍｇ／ｋｇであった。大腿静脈からの血液試料（およそ１．０ｍＬ）を投薬前及び投薬後の０．５、２、４、８時間、１、２、４、７、１０、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６及び７０日に採血した。全ての群に対する血清中濃度−時間曲線を、一群当たりｎ＝１１から１２匹の動物の平均血清中濃度を使用して構築した。この実験で採血した血清試料を、実施例９に記載されたＥＬＩＳＡプロトコルを使用して分析した。
実施例９：ＥＬＩＳＡによるカニクイザル血清中の抗体濃度の検出
Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY）を、５０ｍＭの炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）中の０．５μｇ／ｍｌの組換えヒトＶＥＧＦで４℃で一晩、被覆した。プレートを、ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、１０ｐｐｍのＰｒｏｃｌｉｎ，ｐＨ７．２を用いて室温で１時間ブロックし、ついで、洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／ｐＨ７．２）で洗浄した。０．５％のウシ血清アルブミン、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．２５％のＣＨＡＰＳ、０．２％のウシγグロブリン、１０ｐｐｍのＰｒｏｃｌｉｎ及び０．３５ＭのＮａＣｌを含むＰＢＳバッファー中で２倍に連続希釈した標準物質（抗ＶＥＧＦ ＩｇＧ１野生型（ベバシズマブ））並びに３倍に連続希釈したｃｙｎｏ血清試料（１：１０で出発）を、ブロックしたプレートに加え、振とうしながら室温で２時間インキュベートした。プレートを６回洗浄し、結合した薬剤を、振とうしながら室温で１時間、アッセイバッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７．４，０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１０ｐｐｍのＰｒｏｃｌｉｎ）中で１：１０Ｋで希釈したヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）−ＨＲＰ（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）で検出した。ついで、プレートを再び６回洗浄した後、発色のためにテトラメチルベンジジン基質（Moss, Pasadena, MD）を加えた。１Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）の添加によっって２０分後に反応を停止させた。プレートを、４５０−６２０ｎｍの波長にてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレートリーダーで読み取った。５ｍｇ／ｋｇの単一ＩＶ用量の後のカニクイザル中の野生型及び５種の抗ＶＥＧＦ変異体の血清プロファイルを図１１に示す。５種全ての変異体は野生型と比較して減少したクリアランスと延長した半減期を示した。
実施例１０：薬物動態データ解析
ＰＫパラメータを、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ−Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ，バージョン５．１．１（Pharsight Corporation；Mountain View, CA）を使用して推定した。ＩＶ−ボーラス投与量、一次排除、及びマイクロ速度定数を持つ２コンパートメントモデル（モデル７）を使用して観察データを記述した。濃度は、繰り返しの再秤量（ｎ＝−１乗と予想）及びＬｅｖｅｎｂｅｒｇ及びＨａｒｔｌｅｙ修正を伴うガウス・ニュートン最小化アルゴリズムを使用して計量した。次のＰＫパラメータが、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎモデル７を使用して報告された：ＡＵＣ∞＝無限大まで外挿された濃度−時間曲線下の面積として定義される全薬剤暴露；ｔ１／２，α＝α相の半減期（α半減期）；ｔ１／２，β＝β相の半減期（β半減期）；Ｃｍａｘ＝最大の観察された濃度；ＣＬ＝クリアランス；Ｖ１＝中央コンパートメントの体積；Ｖｓｓ＝定常状態での分布体積。
全用量群に対して、モデルの選択は、各動物に対する観察対予想の血清中濃度−時間プロファイルの視覚検査、重み付き残差二乗和の検査、及び標準誤差及び変動係数の検査による一致の良好性に基づいた。ＰＫパラメーターは各群の平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。
図１２は、カニクイザルへ５ｍｇ／ｋｇの単一ＩＶ用量後の、抗ＶＥＧＦ野生型及び５種の変異体Ｎ４３４Ｈ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ３０７Ｑ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ｓ及びＶ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａに対する表にした薬物動態パラメータ−を示す。変異体のβ（終末）半減期は、野生型の半減期より約１．６倍から２．２倍長く、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体は２４．９日の最も長い半減期を有している。我々の知る限りでは、変異体Ｔ３０７Ｑ／４３４Ａの半減期の約２５日は、これまで報告されたカニクイザルにおけるヒトＩｇＧの最も長い半減期である。
半減期とＦｃＲｎ親和性の間の関係を図１３に示す。ｐＨ６．０のＦｃＲｎ親和性における穏やかな増加は、Ｎ４３４Ｈ及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体によって裏付けられるように、長い終末半減期を生じる。しかしながら、中性ｐＨにおけるより遅い解離速度及び増加した親和性が酸性ｐＨ親和性増加からもたらされる恩恵を相殺するので、ｐＨ６．０のＦｃＲｎ親和性（Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｓ、Ｔ３０７Ｑ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ及びＶ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ）における更なる増加は、半減期を更に改善することはない。その代わり、ｐＨ６．０ではＦｃＲｎ親和性が高くなると半減期が減少する傾向がある。
実施例１１：トランスジェニックマウスにおける薬物動態研究
この研究に使用されるマウスの系統はＭｕ．ＶＥＧＦｈｕＸ．ＫＩ．Ｒ１．Ｂ６．１２９である。ＭｕＶＥＧＦｈｕＭＵＴＸ（＋／＋）ノックイン、ＲＡＧ２（−／−）ノックアウトマウスは、ＶＥＧＦのヒト化型の二つの対立遺伝子を含み、これが野生型抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブ）によって中和されうる。ＲＡＧ２（−／−）マウスは免疫不全性であり、機能的Ｔ及びＢ細胞を産生しない。ヒト腫瘍は、腫瘍細胞に対する明白な免疫応答の不存在下でＶＥＧＦのヒト化型を発現するこれらのマウスにおいて増殖させることができる。よって、ヒト腫瘍及びマウス間質細胞ＶＥＧＦから由来するＶＥＧＦは、マウスＶＥＧＦを中和しない野生型抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブ）によって中和されるであろう。抗ＶＥＧＦ野生型及び抗ＶＥＧＦ変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４ＡのＰＫを、これらの腫瘍を持たないトランスジェニックマウスにおいて評価した。
二つの異なったＰＫ研究を実施した。最初の研究は単一用量ＰＫ研究である。群当たり８−９匹の動物の４群があり、それぞれが０．３又は５ｍｇ／ｋｇのＰＢＳ中の野生型及び変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａの単一静脈内投薬を受ける。投与される投薬体積は、投薬溶液の濃度及び各動物の体重に応じて５から１５ｍｌ／ｋｇと変動した。ＩＶ投薬は尾静脈を経由して行った。３匹のマウスからの試料を各時点で採血し、ＰＫ解析のために約１２５ｕＬの血液試料を、投与後１５分、８時間、２４時間、２、４、７、１０、１４、２１及び２８日で集めた。血液試料は眼窩周囲洞を介して痲酔下で集めた。屠殺時点で、イソフルラン痲酔下で心穿刺によってマウスを出血させた。
第二の研究は複数用量ＰＫ研究である。群当たり９匹の動物が存在する。各動物は0, 3, 6, 及び9日目にＰＢＳ中、0.3 又は5 mg/kgの変異体T307Q/N434Aを投与された。注射及び試料収集の方法は単一用量ＰＫ研究と同様であった。しかしながら、血液試料は、最初の投薬後１５分、３日目（前用量）、６日目（前用量）、９日目（前用量）、９日目投与後１５分、１１日目、１４日目、２１日目、２８日目及び３５日目に採取した。
ＰＫ研究から集めた血清試料は、実施例１３に記載されるＥＬＩＳＡを使用して分析した。図１４Ａ及び１４Ｂは、それぞれＶＥＧＦキャプチャー（図１４Ａ）か又はヒトＦｃキャプチャー（図１４Ｂ）ＥＬＩＳＡの何れかを使用して決定した野生型及び変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａの薬物動態プロファイルを示す。変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａは、０．３又は５ｍｇ／ｋｇの単一のＩＶ用量後、野生型と類似したＰＫプロファイルを有している。図１５は、野生型及びトランスジェニックマウスノＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体の半減期が匹敵することを確認している。しかしながら、０．３ｍｇ／ｋｇで投薬された抗体は、おそらくは抗原依存性クリアランスのために５ｍｇ／ｋｇで投薬されたものよりも短い半減期を有しており、非線形ＰＫ応答が観察された。図１６は、０．３又は５ｍｇ／ｋｇの複数用量後のヒト化ＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおける変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａの薬物動態プロファイルを示しており、ＰＫパラメーターを図１７にまとめる。結果は、実験的に測定された血清中濃度が、単一用量ＰＫパラメーターを使用するシミュレーションにより予想される濃度と良く対応していたことを示している。
実施例１２：インビボ効果研究
ヒトＨＴ−５５、Ｃｏｌｏ−２０５（結腸直腸癌）及びＣａｌｕ−６（肺癌）細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Manassas, VA）から得た。ヒト結腸直腸癌ＨＭ−７細胞株は、ＬＳ１７４Ｔの誘導体である。Ｃａｌｕ−６及びＨＭ−７をハムのＦ１２、低グルコースＤＭＥＭ１：１で増殖させた。Ｃｏｌｏ−２０５及びＨＴ−５５をＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させた。双方の培地に１０％ｖ／ｖのＦＢＳ、１％ｖ／ｖのペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen, Carlsbad, CA）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Invitrogen, Carlsbad, CA）及び１ｍｇ／ｍｌのＦＵＮＧＩＺＯＮＥ(登録商標)(Invitrogen, Carlsbad, CA)を補填した。集密になるまで細胞を５％ＣＯ２中で３７℃で増殖させ、収集し、１ｍｌ当たり５０×１０６細胞で滅菌メトリゲル中に再懸濁させた。異種移植片は６週から８週齢のＲＡＧ２ ＫＯ；ｈｕｍ−Ｘ ＶＥＧＦ ＫＩ二重ホモ接合マウス（Genentech, South San Francisco, CA）中において１マウス当たり５×１０６細胞の背側腹部皮下注射によって樹立し、増殖させた。毎週２回の５、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇの用量での抗体の腹腔内治療を、腫瘍細胞接種後２４時間で開始した。移植した腫瘍を、記載されたように長軸及び直交軸に沿って毎週２回測定した。腫瘍を測定したそれぞれの日に、各マウスノ腫瘍体積を計算し、コントロール抗体群（抗ブタクサ）及び各抗ＶＥＧＦ群からの平均腫瘍体積をＰ＜０．０５のレベルでスチューデント検定によって比較した。腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達したときにマウスを殺した。
最初のＨＭ−７異種移植片研究からの結果を図１８に示す。図１８Ａ及び１８Ｂは、変異体Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａが０．５ｍｇ／ｋｇ並びに５ｍｇ／ｋｇ治療群の双方で腫瘍増殖の最大阻害を達成することができたことを示している。野生型は双方の用量で腫瘍増殖を阻害したが、０．５ｍｇ／ｋｇでは腫瘍増殖の最大阻害を達成しなかった。これらの結果は、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体が、同様のレベルの血清中ＩｇＧ濃度にもかかわらず、ＨＭ−７異種移植片の治療において０．５ｍｇ／ｋｇで野生型より効果的であることを示唆している（図１８Ｃ）。図１９に示されたＨＭ−７異種移植片の繰り返し効果研究は、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇ治療群においてＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体が野生型よりも効果的であることを確認している。確かに、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体は、野生型と比較して全ての治療群において大なる腫瘍増殖阻害を示した（図１９Ａ及び１９Ｂ）。効果の増加は、野生型と比較してＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ治療群に対して高い血中正規化抗体濃度のためであろう（図１９Ｅ）。図２０に示したＨＭ−７異種移植片の第三の効果研究は、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇ治療群において野生型に対してＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａの優れた効果を更に検証している。
ＨＴ−５５異種移植片研究では、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体は、０．０５ｍｇ／ｋｇ治療群における野生型と比較してより大きい腫瘍増殖阻害を示しており（図２１）、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａが０．０５ｍｇ／ｋｇ治療群における野生型よりも効果的であることを示唆している。Ｃｏｌｏ−２０５研究では、図２２Ｂは、０．５ｍｇ／ｋｇ野生型と０．５ｍｇ／ｋｇＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体との間の増殖曲線における有意差を示している。図２２Ａ及び２２Ｂはまた０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇ治療群におけるＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａによる腫瘍増殖の阻害の増加を示しており、０．５及び０．０５ｍｇ／ｋｇ群におけるＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａに対する僅かに高い効果を示唆している。図２３に示す繰り返しＣｏｌｏ−２０５研究は、Ｃｏｌｏ−２０５異種移植片の治療においてＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａが野生型よりも僅かにより効果的であることを示している。最後に、Ｃａｌｕ−６異種移植片におけるＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａ変異体及び野生型の効果は同様であった。
Ｆｃ変異体の効果の増加には幾つかの可能な理由が存在しうる。例えば、変異体の増加した作用強度は、ある種の腫瘍（例えば、ＨＭ−７）で発現されるヒトＦｃＲｎによって媒介される変異体抗体のリサイクリング及び／又は増加した保持のためでありうる。これは、局所的に産生されたＶＥＧＦをブロックする質量作用効果の増加を生じ得、又は腫瘍におけるＶＥＧＦの亢進された分解のメカニズムを提供しうる。しかしながら、我々は、ＨＴ−５５及びＣａｌｕ−６腫瘍に対してＨＭ−７腫瘍において検出された変異体の濃度の増加が、ＨＭ−７細胞はＨＴ−５５又はＣａｌｕ−６細胞の何れよりも低い量のＦｃＲｎを発現するので、細胞性ＦｃＲｎ発現レベルに直接的には相関していないことを見出した（図２５）。腫瘍微小環境における他の因子、例えば腫瘍ｐＨ、増殖速度、及び他の腫瘍構成成分がなたＩｇＧの分布の決定においてＦｃＲｎと協同的な役割を果たしうる。例えば、腫瘍微小環境は殆どは酸性であり、ｐＨは６．０から７．６の範囲（中央値＝７．１）であるが、正常な組織のそれは７．３から７．８の範囲（中央値＝７．５５）である。Song, C.W.等, "Influence of Tumor pH on Therapeutic Response " in Cancer Drug Resistance, 21-42 (2007)を参照。更に、異なったタイプの腫瘍は、異種性の血管供給及び血液灌流のため広い範囲のｐＨを有しうる。Song, C.W.等, Cancer Drug Resistance, 21-42 (2007), 上掲；Gillies, R.J.等, J Magn Reson Imaging 16, 430-450 (2002)を参照。複数のインビトロ研究は、細胞随伴Fc/IgGの量が、細胞が酸性ｐＨでインキュベートされると増加することを示している。Praetor, A.等, Journal of cell science 112 (Pt 14), 2291-2299 (1999)；McCarthy, K.M., Yoong, Y.及びSimister, N.E. Bidirectional transcytosis of IgG by the rat neonatal Fc receptor expressed in a rat kidney cell line: a system to study protein transport across epithelia. Journal of cell science 113 ( Pt 7), 1277-1285 (2000)；Tesar, D.B.等, Traffic 7, 1127-1142 (2006)を参照。従って、試験した腫瘍株間のｐＨ差が各腫瘍内の抗体の蓄積レベルに影響を及ぼす場合があると考えられる。加えて、酸性腫瘍微小環境がまたＶＥＧＦ発現を活性化し（上掲のSong, C.W.等, Cancer Drug Resistance, 21-42 (2007)を参照）、これがこれら抗ＶＥＧＦ抗体の保持を特異的に媒介しうる。更に、マウス中のＨＭ−７腫瘍は希薄な間質を有していることが過去に示される一方（Liang, W. C.等, J Biol Chem 281, 951-961 (2006)を参照）、Ｃａｌｕ−６腫瘍は強い宿主間質応答を誘導し、比較的に間質に富んでいた（Tejada, M. L.等, Clin Cancer Res 12, 2676-2688 (2006)を参照）。マウスＦｃＲｎを発現するマウス間質細胞の存在は、ヒト腫瘍細胞によるＩｇＧ変異体の改善されたリサイクリングをマスクしうる。これは、例えばＣａｌｕ−６のような、マウス間質の大きな成分を有するヒト異種移植片において低濃度効果を生じせしめうる。
実施例１３：ＥＬＩＳＡによるトランスジェニックマウスの血清中及び腫瘍中抗体濃度の検出
プレートに被覆した２種の異なった抗体捕捉試薬（ＶＥＧＦ又は抗ヒトＩｇＧ１Ｆｃ）の何れかを伴う二つの異なったＥＬＩＳＡアッセイ形式を使用して、トランスジェニックマウス中の抗体濃度を検出した。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY）に、４℃で一晩、５０ｍＭの炭酸塩バッファー中の０．５μｍｇ／ｍｌの組換えヒトＶＥＧＦ又は０．２５μｇ／ｍｌ（Ｆａｂ’２）ウサギ抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）の何れかを被覆した。プレートをＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、１０ｐｐｍのＰｒｏｃｌｉｎ（ｐＨ７．２）で室温にて１時間ブロックし、ついで、洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／ｐＨ７．２）で洗浄した。０．５％のウシ血清アルブミン、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．２５％のＣＨＡＰＳ、０．２％のウシγグロブリン、１０ｐｐｍのＰｒｏｃｌｉｎ及び０．３５ＭのＮａＣｌを含むＰＢＳバッファー中の１２．５ｎｇ／ｍｌまで２倍の連続希釈した標準物質（ＶＥＧＦ形式ではベバシズマブ又はＦｃ形式ではヒトＩｇＧ１）並びに３倍の連続希釈したｃｙｎｏ血清試料（１：１０で出発）をブロックしたプレートに加え、振とうしながら室温で２時間インキュベートした。プレートを６回洗浄し、結合した薬剤を、振とうしながら室温で１時間、アッセイバッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１０ｐｐｍのＰｒｏｃｌｉｎ）で１：２０Ｋから１：６０Ｋに希釈されたヤギ（Ｆａｂ’２）抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）−ＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）で検出した。ついで、プレートを６回再び洗浄した後、発色のためにテトラメチルベンジジン基質（Moss, Pasadena, MD）を加えた。反応を、１Ｍのリン酸（Ｈ３ＰＯ４）の添加によって２０分後に停止させた。プレートを４５０−６２０ｎｍの波長にてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓマイクロプレートリーダーで読み取った。
実施例１４：野生型に対して様々な親和性が改善されたＩｇＧ１ Ｆｃ変異体とそのインビボ薬物動態挙動
図２４に示されたＦｃ変異の更なる組合せを、ヒト抗ＨＥＲ２（トラツズマブ）に導入してＩｇＧ変異体を構築した。ＩｇＧ１変異体を、実施例１に記載された方法を使用して発現させた。野生型抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ１及び抗ＨＥＲ２ ＩｇＧ１変異体の解離定数を図４に記載されたようにして測定し、結果を図２４に示す。結果は、異なった変異を組み合わせることにより、我々は一桁のナノモル親和性をもってヒトＦｃＲｎに結合でき、野生型ＩｇＧ１に対して約４５０倍の改善を示すＭ２５２Ｙ／Ｖ３０８Ｐ／Ｎ４３４ＹのようなＩｇＧ変異体を構築できることを示している。
しかしながら、高親和性変異体は必ずしも改善されたインビボでの薬物動態挙動を有していない。例えば、二つのＦｃ変異Ｎ４３４Ａ及びＮ４３４Ｗを、異なったヒト抗体に導入して二つのＩｇＧ１変異体を構築した。二つのＩｇＧ１変異体Ｎ４３４Ａ変異体及びＮ４３４Ｗ変異体は、図２４に示されるように、それぞれ野生型抗体と比較してｐＨ６．０でおよそ３倍及び４０倍高いＦｃＲｎ親和性を生じた。その薬物動態挙動を、実施例８及び９に記載されているように、カニクイザルで評価し、野生型のものと（およそ６から９日）比較した。Ｎ４３４Ｗの半減期（約９．７＋／−２．４日）は、僅かに親和性が改善された変異体Ｎ４３４Ａのもの（約１４．５＋／−２．２日）よりあまり改善されていなかった。これらの結果は、ＦｃＲｎ親和性の余りに大きな増加はＦｃ変異体の半減期に有害な効果を有する場合があり、改善されたＦｃＲｎ親和性を持つＦｃ変異体が改善された半減期を有するか否かを先験的に予測することは困難であることを示唆している。
実施例１５：高親和性ＩｇＧ１変異体を有するＦｃＲｎ免疫沈降
５百万の細胞／何れかＨＭ−７、ＨＴ−５５、Ｃａｌｕ−６又はＲａｊｉ（Ｂ細胞リンパ腫）株の各々を、１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び１×のプロテアーゼインヒビター（Pierce, Rockland, IL）を含む２５ｍＭのリン酸バッファーｐＨ６．０中で４℃で１時間、インキュベートすることによって可溶化した。可溶化した細胞を４℃で１２０００ｇで３０分、遠心分離し、ついで、５０ｎＭのトラスツズマブＦｃ変異体Ｍ２５２Ｙ／Ｖ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ｙ（Yeung等, 提出済み）を上清に加えてＦｃＲｎを捕捉した。４℃での一晩のインキュベーション後、プロテイン−Ｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）樹脂を加え、４℃で４時間複合体に結合させた。ついで、樹脂を溶解バッファーで５回洗浄し、結合したタンパク質を２×の負荷バッファー（Invitrogen, Carlsbad, CA）で溶離させた。タンパク質を４−１２％のＢＩＳ−ＴＲＩＳゲル(Invitrogen)で分離し、ニトロセルロース膜(Invitrogen)上にブロットした。膜をＰＢＳ中の３％脱脂乳ブロックし、１ｎｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＦｃＲｎ抗体(Santa Cruz, Santa Cruz, CA)で室温で１時間、ついで１：１０４希釈(Pierce)のヤギ抗ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼコンジュゲートで室温で１時間、プローブした。膜は、ブロッキング工程と抗体インキュベーション工程の間において、ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎで洗浄した。ＦｃＲｎタンパク質をＥＣＬ検出キット(GE Healthcare, Piscataway, NJ)によって可視化した。図２５を参照。
結果と検討
異なった抗ＶＥＧＦ変異体を用いた二つの別個の結合実験を各ｐＨ、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４で実施した。ｐＨ６．０及びｐＨ７．４に対する濃度の関数として定常状態結合応答単位（ＲＵ）を、それぞれ図１及び図２にプロットした。ｐＨ６．０での解離定数（ＫＤ）を図１から推定し、図２にまとめた。二つの異なった実験から計算した同じ変異体の解離定数は僅かに異なっていた。例えば、変異体Ｎ４３４Ａは最初の実験では５５０ｎＭのＫＤを有していたが、第二の実験からのそのＫＤは２５０ｎＭであった。該差は、ＦｃＲｎ結合チップ上に二価抗体を流すことを含むアッセイ形式でのアビディティー効果によるものであった。入り定数へのアビディティー寄与のレベルはチップ上に結合したＦｃＲｎのレベルに依存しており、より高いレベルのＦｃＲｎ結合がより高いアビディティーを生じた。これは、第一の実験よりも約２倍高いＲＵであった第二の実験で観察されたより高い親和性を説明するかも知れない。アッセイの設定においてアビディティー効果があったが、この形式は細胞内の自然の結合プロセスに最も類似しており、そこでは、飲作用した二価抗体の膜結合ＦｃＲｎへの結合が許容される。絶対ＫＤは実験毎に異なっているかもしれないが、これらの変異体の親和性ランキングは、結合したＦｃＲｎの異なったレベルとさえ一致していた。図１及び図２は双方ともＶ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａが試験した変異体間で最も高い親和性を一貫して有しており、試験した変異体の全てがｐＨ６．０においてＦｃＲｎに対しての結合性を改善したことを示している。
ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対する抗ＶＥＧＦ変異体の親和性は、ｐＨ６．０でのその親和性よりも更に低い。ｐＨ７．４での結合親和性は非常に低いので、ｐＨ７．４での変異体の解離定数は決定されなかった。しかしながら、図３は、ｐＨ７．４でのこれら変異体の親和性ランキングが、ｐＨ６．０でのランキングと同じであり、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのＦｃＲｎへの変異体の結合がカップリングしていることを示している。変異体のｐＨ６．０結合が改善されているので、ｐＨ７．４での結合もそうである。ｐＨ６．０及び７．４のＦｃＲｎへの結合が如何に変異体の半減期に影響するかには繊細なバランスがある。ｐＨ６．０での改善された結合は、より高い親和性の変異体がＦｃＲｎに良好に結合市、よってＦｃＲｎによってよりリサイクルされうるので、変異体のインビボ半減期において有益な役割を有していることが示唆される。他方、ｐＨ７．４での実質的に高い結合性は、ＦｃＲｎ結合抗体は、それらが余りに強固に結合していると容易には循環中に放出されて戻されることがないので、変異体の半減期には好ましくないことが提案される。
高いｐＨでの親和性の増加は、低ｐＨでの増加した親和性の好ましい効果を否定できる。例えば、Dall’Acqua等, J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002は、ヒトＩｇＧ１変異体、例えばＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ及びＧ３８５Ｄ／Ｑ３８６Ｐ／Ｎ３８９Ｓは、明らかにマウスＦｃＲｎに対するその高ｐＨ結合親和性のために、マウスにおいて半減期を改善しなかったことを示している。従って、高ｐＨ結合における如何に多くの改善が、その薬物動態半減期を尚も改善しながら、ＩｇＧ１変異体において許容されうるのか不明であった。
上記の発明は理解の明確化を目的として例示と実施例によってある程度詳細に記載したが、説明と実施例は本発明の範囲を限定するものとみなしてはならない。ここで引用される全ての特許及び科学文献の開示は出典明示によりその全体を明示的に援用する。
図５及び図６の結果は、抗ＶＥＧＦ変異体の全てがｐＨ６．０でのヒト及びｃｙｎｏ ＦｃＲｎの双方に対して野生型より改善されたＦｃＲｎ親和性を有していることを示している。親和性の改善は、会合速度定数の増加と解離速度定数の減少の双方によっていた。総括して、異なった結合アッセイを使用する野生型に対する抗ＶＥＧＦ変異体の親和性改善を図８にまとめる。図８は、Ｖ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ変異体が表３に列挙された変異体の中で最も高いＦｃＲｎ親和性を有しており、Ｔ３０７Ｑ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ、Ｔ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ｓ、及びＴ３０７Ｑ／Ｎ４３４Ａが続くことを示している。Ｎ４３４Ｈ変異体は野生型に対するＦｃＲｎ親和性改善量が最も少ない。

Claims (21)

  1. カバットのＥＵインデックスに従った番号付けで、アミノ酸残基２５１、２５２、３０７、３０８、３７８、４２８、４３０、４３４、及び４３６の二以上において野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に対して二以上のアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む変異体ＩｇＧであって、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して増加した半減期を有し、かつ、アミノ酸置換の少なくとも二つがアミノ酸残基２５１、２５２、３０７、３０８、３７８、４２８、４３０、４３４、又は４３６にあり、アミノ酸残基２５１におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸又はグルタミン酸での置換であり、アミノ酸残基２５２におけるアミノ酸置換がチロシンでの置換であり、アミノ酸残基３０７におけるアミノ酸置換がグルタミンでの置換であり、アミノ酸残基３０８でのアミノ酸置換がプロリンでの置換であり、アミノ酸残基３７８におけるアミノ酸置換がバリンでの置換であり、アミノ酸残基４２８におけるアミノ酸置換がロイシンでの置換であり、アミノ酸残基４３０におけるアミノ酸置換がアラニン又はリジンでの置換であり、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換がアラニン、セリン又はチロシンでの置換であり、及びアミノ酸残基４３６におけるアミノ酸置換がイソロイシンでの置換である変異体ＩｇＧ。
  2. アミノ酸３０８におけるプロリンでのアミノ酸置換とアミノ酸４３４におけるアラニンでのアミノ酸置換を含む請求項１に記載の変異体ＩｇＧ。
  3. カバットのＥＵインデックスに従った番号付けで、アミノ酸残基２５１、２５２、３０７、３０８、３７８、３８０、４２８、４３０、４３４、及び４３６の三以上において野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に対して三以上のアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む変異体ＩｇＧであって、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧの半減期と比較して増加した半減期を有し、かつ、アミノ酸置換の少なくとも三つがアミノ酸残基２５１、２５２、３０７、３０８、３７８、３８０、４２８、４３０、４３４、又は４３６にあり、アミノ酸残基２５１におけるアミノ酸置換がアスパラギン酸又はグルタミン酸での置換であり、アミノ酸残基２５２におけるアミノ酸置換がチロシンでの置換であり、アミノ酸残基３０７におけるアミノ酸置換がグルタミンでの置換であり、アミノ酸残基３０８でのアミノ酸置換がプロリンでの置換であり、アミノ酸残基３７８におけるアミノ酸置換がバリンでの置換であり、アミノ酸残基３８０におけるアミノ酸置換がアラニンでの置換であり、アミノ酸残基４２８におけるアミノ酸置換がロイシンでの置換であり、アミノ酸残基４３０におけるアミノ酸置換がアラニン又はリジンでの置換であり、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換がアラニン、セリン、チロシン又はヒスチジンでの置換であり、及びアミノ酸残基４３６におけるアミノ酸置換がイソロイシンでの置換である変異体ＩｇＧ。
  4. 野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧより高いＦｃＲｎへの結合親和性を有する請求項１又は３に記載の変異体ＩｇＧ。
  5. ｐＨ７．４においてよりもｐＨ６．０においてＦｃＲｎへの高い結合親和性を有する請求項１又は３に記載の変異体ＩｇＧ。
  6. 野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧに等しいか又は高い効果を有する請求項１又は３に記載の変異体ＩｇＧ。
  7. 野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を有するＩｇＧよりも高い効果を有する請求項６に記載の変異体ＩｇＧ。
  8. ヒト又はヒト化ＩｇＧである請求項１又は３に記載の変異体ＩｇＧ。
  9. ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である請求項８に記載の変異体ＩｇＧ。
  10. ＩｇＧ Ｆｃ領域がＩｇＧ１ Ｆｃ領域である請求項１又は３に記載の変異体ＩｇＧ。
  11. 変異体ＩｇＧが抗ＶＥＧＦ抗体である請求項１又は３に記載の変異体ＩｇＧ。
  12. 配列番号：１を含む重鎖可変ドメインと配列番号：２を含む軽鎖可変ドメインを含む請求項１又は３に記載の変異体ＩｇＧ。
  13. 請求項１又は３に記載の変異体ＩｇＧと薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的組成物。
  14. 請求項１又は３に記載の変異体ＩｇＧを容器中に、また使用のための指示書を含むキット。
  15. カバットのＥＵインデックスに従った番号付けで、アミノ酸残基３０８及び４３４において野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に対してアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む変異体ＩｇＧ１であって、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有するＩｇＧ１の半減期と比較して増加した半減期を有し、アミノ酸残基３０８におけるアミノ酸置換がプロリンでの置換であり、アミノ酸残基４３４におけるアミノ酸置換がアラニンでの置換である変異体ＩｇＧ１。
  16. 患者における腫瘍を治療する方法において、請求項１又は３に記載の変異体ＩｇＧの有効量を患者に投与することを含んでなる方法。
  17. 患者におけるＶＥＧＦ活性を阻害する方法において、請求項１又は３に記載の変異体ＩｇＧの有効量を上記患者に投与することを含む方法。
  18. ＶＥＧＦ活性が血管新生である請求項１７に記載の方法。
  19. 患者における血管透過性を調節する方法において、請求項１又は３に記載の変異体ＩｇＧの有効量を上記患者に投与することを含む方法。
  20. 患者における癌細胞の増殖を阻害し又は防止する方法において、請求項１又は３に記載の変異体ＩｇＧの有効量を上記患者に投与することを含む方法。
  21. 変異体ＩｇＧが患者に４週間毎又はそれより長く投与される請求項１６、１７、１９又は２０に記載の方法。
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