CN113637084A - 生物大分子靶向特异性补体抑制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

生物大分子靶向特异性补体抑制剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种融合蛋白，其包含：(i)CRIg胞外结构域，(ii)补体抑制结构域和(iii)增效结构域，还涉及该融合蛋白的制备方法和用途，以及包含该融合蛋白的药物组合物。本申请的融合蛋白不但具有明显的靶向性补体抑制效果，而且有利于增加成药性和/或生产，可用于多种与补体异常激活有关的人类疾病的治疗和预防。

Description

生物大分子靶向特异性补体抑制剂及其制备方法与应用
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种生物大分子靶向特异性补体抑制剂的设计、制备和临床应用。
背景技术
补体***是固有免疫的重要组成部分，也是获得性免疫的重要调节者，是沟通固有免疫与适应性免疫的重要桥梁。补体***主要存在于血液循环，是一个包含30多个激活因子，抑制因子和补体受体共同组成的、可自我调节的高度复杂的级联反应体系，其主要生理功能为清除入侵的病原菌微生物和宿主细胞碎片，并协调整个免疫和炎症过程，是免疫监视与自稳的关键***(Ricklin et al.,2010)。
补体***一般可通过三条途径被激活：经典途径可被IgG和IgM型抗体激活；凝集素途径可被细菌表面的甘露糖激活；而替补途径可被病原体胞壁/胞膜成分或补体C3b类似物如蛇毒素等多种成分激活，另外还可通过C3的水化而自动激活。
而补体激活后又主要通过三种方式发挥生理效应(Dunkelberger and Song,2010)。第一，补体组分C3和C5激活后产生的C3a尤其是C5a，分别可以通过与其表达于免疫细胞的受体C3aR或C5aR1和C5L2结合，招募多种免疫细胞，分泌促炎细胞因子(TNF-α,IL-1,IL-6等)和趋化因子(MCP-1,MIP-2,KC,CINC等)(Riedemann et al.,2003)，从而在补体激活的局部产生强烈的促炎作用，即促炎效应。第二，C3激活后另一产物C3b及其进一步降解产物iC3b可***被补体攻击的靶细胞表面，对这些异己成分进行“标记”，并与表达于免疫细胞的多种受体如CR1/CR2/CR3/CR4/CRIg结合，最终免疫细胞吞噬或裂解这些异己成分，即调理吞噬效应。第三，C5激活后另一产物C5b也可***被补体攻击的靶细胞表面，与补体C6和C7结合形成稳定复合物C5b-7，该复合物进一步与C8和C9结合，最终C9多聚化形成C5b-9n复合物，也称膜攻击复合物(Membrane Attack Complex,MAC)，最终在靶细胞膜上形成一个内径5nm，外径20nm，高度15nm的孔洞，使得细胞内外渗透压改变而直接裂解细胞(Teglaet al.,2011)，即细胞裂解效应。
为了避免补体激活后上述生理效应对正常机体细胞的“误伤”效应，机体进化产生了10余种补体调控蛋白，它们表达于细胞膜或者循环于血液***，在补体激活的不同阶段抑制补体的激活。例如，表达于细胞膜上的补体抑制蛋白CR1、CD46、CD55和CD59，游离于血液循环的C1-INH、C4BP、FH、Vitronectin和S protein等。正是由于这些补体调控蛋白，使得在补体激活时机体细胞能避免补体的杀伤。
补体***是人体正常状况下的一种自我保护免疫机制，但机体某些异常条件下，补体激活产物水平升高或者补体调控蛋白水平下降甚至缺失，均可导致补体过度激活，导致对自身组织细胞的杀伤，最终导致疾病的发生发展，包括阵发性夜间血红蛋白尿(Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria,PNH)、非典型溶血尿毒综合征(atypicalHaemolytic Uraemic Syndrome,aHUS)、全身型重症肌无力(generalized MyastheniaGravis，gMG)、视神经脊髓炎谱系疾病(Neuromyelitis Optica Spectrum Disorders，NMOSD)、年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration,AMD)、自身溶血性贫血、自身免疫性血小板减少、再生障碍性贫血、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、动脉粥样硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默病(老年性痴呆)、哮喘、过敏、银屑病、多发性硬化、克隆氏肠病等(Ricklin and Lambris,2007)。补体的过度激活与自身免疫性疾病的发生发展，尤其是在致病早期，关系密切。所以，补体***抑制剂可在上述疾病进展早期即行干预，在临床上具有巨大的优势和需求。
正是基于补体***对众多自身免疫性疾病和急慢性感染等疾病发病的重要性，有近30家药物公司近50种补体抑制剂处在不同的研发阶段，也间接地说明仍需要研发更理想的补体抑制剂。
发明内容
本申请提供了一种融合蛋白，其包含：(i)CRIg胞外结构域；(ii)补体抑制结构域，所述补体抑制结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：factor H(FH)、CD55和CD59；和(iii)增效结构域，所述增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：IgG Fc结构域和人血清白蛋白。本申请的发明人出乎意料地发现CRIg与其他补体调控蛋白FH、CD55或CD59相连，进一步与IgG Fc段连接，不但具有明显的补体抑制效果，而且可有利于生产纯化和增加成药性，如改善药代动力学(PK)/药效动力学(PD)效果。在某些情形中，本申请通过能与补体成分C3激活后形成的片段C3b和/或iC3b结合而产生靶向作用的CRIg，与具有补体抑制效果的另一组分例如FH、CD55、或CD59，进一步与IgG Fc段或HSA相连，制备一种融合蛋白(例如，通过基因工程的方法)，把重组联接的补体调控蛋白运送至局部补体激活部位，最终达到靶向性抑制补体激活的效果。该类型药物可应用于多种与补体异常激活有关的人类疾病的治疗和预防。
一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含：(i)CRIg胞外结构域；(ii)补体抑制结构域，所述补体抑制结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：factor H(FH)、CD55、CD46和CD59；和(iii)增效结构域，所述增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：IgG Fc结构域和人血清白蛋白。
在某些实施方式中，所述CRIg胞外结构域包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CRIg胞外结构域的C端与所述补体抑制结构域的N端直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述补体抑制结构域的C端与所述增效结构域的N端直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述间接连接包括通过连接子连接。
在某些实施方式中，所述连接子包含SEQ ID NO.44、46、48和50中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述补体抑制结构域包含SEQ ID NO:8、18、20和22中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述增效结构域为人血清白蛋白。
在某些实施方式中，所述人血清白蛋白包含SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的融合蛋白为单链结构。
在某些实施方式中，所述的融合蛋白以自N端至C端的顺序依次包括所述CRIg胞外结构域、所述补体抑制结构域和所述增效结构域。
在某些实施方式中，所述的融合蛋白包含SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述增效结构域包含IgG Fc结构域。
在某些实施方式中，所述IgG包括选自下组的蛋白质：人IgG1和人IgG4。
在某些实施方式中，所述IgG Fc结构域包含SEQ ID NO:10、30、32和34中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的融合蛋白包括第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含所述CRIg胞外结构域、第一所述补体抑制结构域和第一所述IgG Fc结构域，所述第二多肽链包含所述CRIg胞外结构域、第二所述补体抑制结构域和第二所述IgG Fc结构域，
其中第一所述IgG Fc结构域和第二所述IgG Fc结构域能够相互作用形成二聚体。
在某些实施方式中，第一所述补体抑制结构域和第二所述补体抑制结构域各自独立地包含选自下组的蛋白质或其功能片段：factor H(FH)、CD55、CD46和CD59。
在某些实施方式中，第一所述补体抑制结构域与第二所述补体抑制结构域相同。
在某些实施方式中，第一所述IgG Fc结构域和第二所述IgG Fc结构域相同。
在某些实施方式中，第一所述IgG Fc结构域和第二所述IgG Fc结构域包含SEQ IDNO：10和30中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一多肽链和所述第二多肽链相同。
在某些实施方式中，所述第一多肽链和/或所述第二多肽链包含SEQ ID NO.14、24、26和28中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，第一所述补体抑制结构域和第二所述补体抑制结构域不同。
在某些实施方式中，第一所述补体抑制结构域和第二所述补体抑制结构域各自独立地包含选自下组的蛋白质或其功能片段：CD59和CD55。
在某些实施方式中，第一所述补体抑制结构域和第二所述补体抑制结构域各自独立地包含选自下组的蛋白质或其功能片段：FH和CD55。
在某些实施方式中，第一所述补体抑制结构域和第二所述补体抑制结构域各自独立地包含选自下组的蛋白质或其功能片段：CD46和CD59。
在某些实施方式中，第一所述IgG Fc结构域和第二所述IgG Fc结构域相同。
在某些实施方式中，第一所述IgG Fc结构域和第二所述IgG Fc结构域不同。
在某些实施方式中，第一所述IgG Fc结构域包含SEQ ID NO.32和34中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，第二所述IgG Fc结构域包含SEQ ID NO.32和34中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一多肽链包含SEQ ID NO.36、38、40和42所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二多肽链包含SEQ ID NO.36、38、40和42中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的融合蛋白中：
所述第一多肽链包含SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列；且所述第二多肽链包含SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽链包含SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列；且所述第二多肽链包含SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列；
所述第一多肽链包含SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列；且所述第二多肽链包含SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了一种或多种分离的核酸分子，其编码所述的融合蛋白或其片段。
另一方面，本申请提供了载体，其包含所述的核酸分子。
另一方面，本申请提供了细胞，其包含所述的载体，或者表达所述的融合蛋白。
另一方面，本申请提供了制备所述的融合蛋白的方法，其包括以下的步骤：合成所述的融合蛋白，和/或，在表达所述的融合蛋白的条件下培养所述的细胞。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包括所述的融合蛋白和任选地药学上可接受的载体。
另一方面，本申请提供了所述的融合蛋白或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗靶向抑制补体激活相关的疾病。
在某些实施方式中，所述疾病包括自身免疫性疾病。
在某些实施方式中，所述疾病包括自身免疫性重症肌无力。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是(CRIg-FH-IgG4Fc)×2和CRIg-FH-HSA设计示意图。
图2显示的是(CRIg-FH-IgG4Fc)×2和CRIg-FH-HSA重组蛋白的鉴定。
图3显示的是(CRIg-FH-IgG4Fc)×2对人血清补体经典途径的抑制效果。
图4显示的是(CRIg-FH-IgG4Fc)×2对人血清补体替补途径的抑制效果。
图5显示的是CRIg-FH-HSA对人血清补体经典途径的抑制效果。
图6显示的是CRIg-FH-HSA对人血清补体替补途径的抑制效果。
图7显示的是(CRIg-FH-IgG4Fc)×2在大鼠体内的药物代谢动力学检测。
图8显示的是CRIg-FH-HSA在大鼠体内的药物代谢动力学检测。
图9显示的是(CRIg-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2和(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2设计示意图。
图10显示的是(CRIg-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2和(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2四种重组蛋白的鉴定。
图11显示的是(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2对人血清补体经典途径的抑制效果。
图12显示的是(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2对人血清补体替补途径的抑制效果。
图13显示的是(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2对人血清补体经典途径的抑制效果。
图14显示的是(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2对人血清补体替补途径的抑制效果。
图15显示的是(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2对人血清补体经典途径的抑制效果。
图16显示的是(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2对人血清补体替补途径的抑制效果。
图17显示的是(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-FH-IgG1 Fc)、(CRIg-CD46-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)和(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)三种重组蛋白的设计示意图。
图18显示的是(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-FH-IgG1 Fc)、(CRIg-CD46-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)和(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)三种重组蛋白的鉴定。
图19显示的是(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-FH-IgG1 Fc)对人血清补体经典途径的抑制效果。
图20显示的是(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-FH-IgG1 Fc)对人血清补体替补途径的抑制效果。
图21显示的是(CRIg-CD46-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)对人血清补体经典途径的抑制效果。
图22显示的是(CRIg-CD46-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)对人血清补体替补途径的抑制效果。
图23显示的是(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)对人血清补体经典途径的抑制效果。
图24显示的是(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)对人血清补体替补途径的抑制效果。
图25显示的是(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2药物治疗EAMG大鼠的体重变化。
图26显示的是(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2药物治疗EAMG大鼠的临床评分变化。
图27显示的是(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2药物治疗EAMG大鼠的死亡率变化。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“补体抑制结构域”通常是指能够抑制补体***激活的物质。补体***一般可通过三条途径被激活：经典途径可被IgG和IgM型抗体激活；凝集素途径可被细菌表面的甘露糖激活；而替补途径可被病原体胞壁/胞膜成分或补体C3b类似物如蛇毒素等多种成分激活，另外还可通过C3的水化而自动激活。所述补体抑制结构域能够在激活的不同阶段进行抑制。本申请所述补体抑制结构域可以来自补体调控蛋白或其功能性片段，涵盖存在于血液循环中的补体抑制剂和与细胞膜表面的补体膜调控蛋白，包括但不限于，C1-INH(C1inhibitor，C1抑制蛋白)、C4BP(C4 binding protein，C4结合蛋白)、factor I(I因子，FI)、factor H(H因子，FH)、S-protein(S蛋白)、Clusterin(簇集蛋白)、CD35(也称为CR1)、CD46(也称为MCP)、CD55(也称为DAF)和/或CD59，甚至CRIg本身等的全长或部分序列。
在本申请中，术语“CD55”通常是指一种补体调控蛋白，也成为补体衰变加速因子或DAF。CD55可以调节补体***，它识别在激活补体组分C4(经典或凝集素途径)或C3(替代途径)过程中产生的C4b和C3b片段。CD55可以与经典途径和凝集素途径的细胞相关C4b的相互作用，干扰C2向C2b的转化，从而阻止C4b2b C3转化酶的形成；CD55也可以与替代途径的C3b的相互作用，干扰因子B将Bb转化，从而阻止了替代途径的C3bBb C3转化酶的形成。本申请所述CD55可包括全长CD55蛋白或其片段，以及其各种变体(例如，突变体、异构体)。例如，编码所述CD55的示例性的核酸分子可包括SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列，示例性的CD55蛋白可包括SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列。
在本申请中，术语“CD59”通常是指一种补体调控蛋白，也可称为“膜攻击复合物(MAC)抑制蛋白”(MAC-inhibitory protein,MAC-IP)、“膜反应性溶血抑制物”(membraneinhibitor of reactive lysis,MIRL)、“膜攻击复合物抑制因子”(membrane attackcomplex inhibitory factor,MACIF)或保护素(protectin)，属于LY6/uPAR/α-神经毒素蛋白家族。CD59可以通过糖磷脂酰肌醇(GPI)锚连接到宿主细胞。当补体激活导致C5b678复合物沉积在宿主细胞上时，CD59可以阻止C9聚合并形成补体膜攻击复合物。本申请所述CD59可包括全长CD59蛋白或其片段，以及其各种变体(例如，突变体、异构体)。例如，编码所述CD59的示例性的核酸分子可包括SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列，示例性的CD59蛋白可包括SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列。
在本申请中，术语“CD46”通常是指一种补体调控蛋白，也可称为膜辅因子蛋白(Membrane Cofactor Protein，MCP)。一般来说，CD46具有辅因子活性，可通过血清因子I灭活(通过裂解)补体成分C3b和C4b，从而保护宿主细胞免受补体的破坏。本申请所述CD46可包括全长CD46蛋白或其片段，以及其各种变体(例如，突变体、异构体)。例如，编码所述CD46的示例性的核酸分子可包括SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列，示例性的CD59蛋白可包括SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列。
在本申请中，术语“factor H(FH)”通常是指一种补体调控蛋白，是补体激活家族的调节因子的成员。FH的主要功能是调节补体***的替代途径，确保补体***针对病原体或其他危险物质发挥功能，而不会损坏宿主组织。FH的序列中通常具有一些高度保守基序，称为短共有重复(short consensus repeat，SCR)。每个SCR由大约60个氨基酸组成，并带有两个二硫键，一个高度取代的高变环和3-8个残基的短SCR接头。FH通常由20个SCR组成，FH的功能特性通常定位于SCR上。本申请所述FH可包括全长FH蛋白或其片段(例如，一个或多个SCR)，以及其各种变体(例如，突变体、异构体)。例如，编码所述FH的示例性的核酸分子可包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，示例性的FH蛋白可包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。例如，本申请所述的FH可包含SCR1-5结构域，编码所述FH SCR1-5结构域的示例性的核酸分子可包括SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，示例性的FH SCR1-5结构域可包括SEQ IDNO.8所示的核苷酸序列。在某些情形种，所述FH可包含其他的SCR片段。
在本申请中，术语“单链结构”通常是指通过共价键(例如，肽键)连接而成的氨基酸链。所述单链结构可以由多肽片段连接产生，也可以先将编码多肽片段的核酸连接再表达产生。例如，多个相同或不同来源的多肽链可形成具有单链结构的融合蛋白。
在本申请中，术语“人血清白蛋白((human serum albumin，HSA)”通常是指一种由人类基因ALB所编码的球状蛋白质，通常存在血浆中。天然的HSA由一条多肽单链组成，包含三个结构域：Domain I、Domain II和Domain III。每个结构域可包括A、B两个亚区，以槽口相对的方式形成一个圆筒状结构，从而使HSA的结构相对比较柔韧。具有亲水性。在本文中，该术语可包括天然来源的(例如，血浆来源的)HSA，人工合成的(例如，基因重组技术合成的)HSA。该术语涵盖全长的HSA或其功能性片段。示例性的编码HSA蛋白的核酸分子可包含如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，示例性的HSA蛋白可包含SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“增效结构域”通常是指能够增强补体抑制效果的多肽结构域。所述补体抑制效果可包括增强具有补体抑制活性的物质(例如，补体抑制结构域)的补体抑制活性的强度、增加强具有补体抑制活性的物质(例如，补体抑制结构域)的补体抑制作用的时间、减少具有补体抑制活性的物质(例如，补体抑制结构域)降解的时间，和/或延长具有补体抑制活性的物质(例如，补体抑制结构域)的药物半衰期。所述增效结构域可包括来自HAS、IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4 Fc的结构域。在本申请中，所述增效结构域和补体抑制结构域在同一多肽链上，也可以位于不同的多肽链上。
在本申请中，术语“IgG Fc结构域”通常是指免疫球蛋白Fc区或其结构域，其可包括来自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4的Fc结构域。
在本申请中，术语“CRIg”通常是指一种补体膜调控蛋白，属于免疫球蛋白超家族。CRIg可通过特异性识别iC3b(非活化的C3b)并抑制C3转换酶的激活，从而在补体级联反应的早期即产生抑制效应。所述CRIg可包含不同物种来源的CRIg，例如，人或小鼠。在某些情形中，所述CRIg可以来自人CRIg。人CRIg可包括长形式的CRIg，其包括V型和C2型末端Ig结构域。人CRIg还包括短形式的的CRIg，其包括V型末端Ig结构域。编码CRIg的示例性的核酸序列可以如SEQ ID NO:1所示，示例性的CRIg蛋白可包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。通常来说，CRIg的功能区位于其胞外结构域。术语“CRIg胞外结构域”通常包含CRIg的胞外功能区，编码CRIg胞外结构域的示例性的核酸序列可以如SEQ ID NO:5所示，示例性的CRIg胞外结构域可包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将***的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA***细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞、细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的、意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在某些情形中，所述细胞可以是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞。在本申请中，术语“重组细胞”通常是指在其中引入了重组表达载体的细胞。所述重组宿主细胞不仅包括某种特定的细胞，还包括这些细胞的后代。
在本申请中，术语“药学上可接受的载体”通常包括药剂学可接受的佐剂、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是PH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子可包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽，蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM，聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
在本申请中，术语“靶向抑制补体激活相关的疾病”通常是指抑制补体激活异常、补体过度激活导致的疾病，其可能是补体激活产物水平和/或活性升高或补体调控蛋白(例如，CD55、CD59和/或FH)水平和/或活性降低导致的。例如，与正常状态相比，补体调控蛋白表达下降、补体调控蛋白基因复制和/或转录水平下降、补体调控蛋白翻译过程异常等，导致无法调控补体激活。补体过度激活后，可能会引起促炎反应、调理吞噬效应和/或细胞裂解效应异常(例如，过度)。在某些情形中，机体产生了针对正常自身抗原的自身抗体，这些自身抗体与抗原结合后，激活补体途径，由于补体抑制激活相关的物质(例如，补体调控蛋白)水平和/或活性降低，对自身的组织器官与细胞产生免疫损伤，最终导致自身免疫性疾病。在某些情形中，靶向抑制补体激活相关的疾病包括自身免疫性疾病。在某些情形中，所述靶向抑制补体激活相关的疾病可能是由急慢性感染引起的。在某些情形中，所述靶向抑制补体激活相关的疾病可能是由基因突变。靶向抑制补体激活相关的疾病可以选自：阵发性夜间血红蛋白尿(Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria，PNH)、非典型溶血尿毒综合征(atypical Haemolytic Uraemic Syndrome，aHUS)、全身型重症肌无力(generalizedMyasthenia Gravis，gMG)、视神经脊髓炎谱系疾病(Neuromyelitis Optica SpectrumDisorders，NMOSD)、年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration，AMD)、自身溶血性贫血、自身免疫性血小板减少、再生障碍性贫血、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、动脉粥样硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默病(老年性痴呆)、哮喘、过敏、银屑病、多发性硬化和克隆氏肠病。例如，所述疾病为自身免疫性重症肌无力。
在本申请中，术语“自身免疫性重症肌无力”通常是指一种神经与肌肉信号传递受阻，进而累及骨骼肌强度的慢性自身免疫性疾病。该病可以由补体过度激活导致的，免疫应答攻击了神经肌肉接头突触后膜的蛋白质，即乙酰胆碱受体或受体相关蛋白。随着时间的推移，，自身免疫性重症肌无力的症状将从眼部肌肉逐渐蔓延至面部和颈部肌肉，引发无力、口齿不清、咀嚼和吞咽困难、和/或呼吸困难，并从头部和颈部逐步扩散至身体的其他部位，最终导致全身型重症肌无力。
发明详述
融合蛋白
一方面，本申请提供一种融合蛋白，所述融合蛋白可包含(i)CRIg胞外结构域。本申请的所述CRIg胞外结构域可包含如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述CRIg胞外结构域可以包含与SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
在本申请中，所述融合蛋白可包含(ii)补体抑制结构域。
在某些情形中，所述补体抑制结构域可以包含源自FH的蛋白或其功能片段，所述FH可以包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述FH可以包含与SEQ IDNO.4所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。在某些情形中，所述补体抑制结构域可以包含FH的一种或多种SCR结构域。例如，所述补体抑制结构域可以包含FH的SCR1-5结构域，所述FH的SCR1-5结构域可包含如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述FH可以包含与SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
在某些情形中，所述补体抑制结构域可以包含源自CD55的蛋白或其功能片段，所述CD55可包含如SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述CD55可以包含与SEQID NO.18所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
在某些情形中，所述补体抑制结构域可以包含源自CD59的蛋白或其功能片段，所述CD59可包含如SEQ ID NO.22所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述CD59可以包含与SEQID NO.22所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
在某些情形中，所述补体抑制结构域可以包含源自CD46的蛋白或其功能片段，所述CD46可包含如SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述CD46可以包含与SEQID NO.20所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
本申请的所述补体抑制结构域可以包含源自选自下组的蛋白质或其功能片段：factor H(FH)、CD55、CD46和CD59。在某些情形中，所述补体抑制结构域可以包含如SEQ IDNO:8、18、20和22中任一项所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述补体抑制结构域可以包含与SEQ ID NO.8、18、20和22中任一项所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
本申请的所述补体抑制结构域可以包含源自选自下组的蛋白质或其功能片段：factor H(FH)、CD55和CD59。在某些情形中，所述补体抑制结构域可以包含如SEQ ID NO:8、18和22中任一项所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述补体抑制结构域可以包含与SEQID NO.8、18和22中任一项所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
在本申请中，所述融合蛋白可包含(iii)增效结构域。
在某些情形中，所述增效结构域可以包含IgG Fc结构域或其功能片段。在某些情形中，所述IgG Fc结构域可以为IgG Fc4结构域，所述IgG Fc4结构域可以包含如SEQ IDNO.10中所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述增效结构域可包含与SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
在某些情形中，所述IgG Fc结构域可以为IgG Fc1结构域，所述IgG Fc1结构域可以包括其突变体。例如，所述IgG Fc结构域可以突变以获得所期望的空间结构，如，形成knob-hole结构以更好的形成二聚体。例如，所述IgG Fc1可以包含如SEQ ID NO.30、32和34中任一项所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述增效结构域可以包含与SEQ ID NO.30、32和34中任一项所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
在本申请中给，所述增效结构域可以包含人血清白蛋白或其功能片段，所述人学血清白蛋白可以包含如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述增效结构域可以包含与SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
在本申请中，所述融合蛋白可以包含(i)CRIg胞外结构域，(ii)补体抑制结构域和(iii)增效结构域。在所述融合蛋白中，所述CRIg胞外结构域的C端可以与所述补体抑制结构域的N端直接或间接连接，所述补体抑制结构域的C端可以与所述增效结构域的N端直接或间接连接。例如，所述融合蛋白自N端至C端，可依次包含所述CRIg胞外结构域、所述补体抑制结构域和所述增效结构域。
在本申请中，所述间接连接可以包含通过连接子连接，例如，所述连接子可以包括连接肽。
在某些情形中，所述CRIg胞外结构域的C端可以与所述补体抑制结构域的N端通过连接子连接，且所述连接子可包含SEQ ID NO.44、46、48和50中任一项所示的氨基酸序列。在某些情形中，编码所述连接子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO.43、45、47和49中任一项所示。
在某些情形中，所述补体抑制结构域的C端可以与所述增效结构域的N端通过连接子连接，所述连接子可包含SEQ ID NO.44、46、48和50中任一项所示的氨基酸序列。在某些情形中，编码所述连接子的核苷酸序列可以如SEQ ID NO.43、45、47和49中任一项所示。
在本申请中，所述融合蛋白可以为单链结构。
例如，所述融合蛋白自N端至C端，可依次包含所述CRIg胞外结构域、所述FH SCR1-5和所述人血清白蛋白。例如，所述融合蛋白可包含SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列。例如，所述融合蛋白可以包含与SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
在本申请中，所述融合蛋白可以包括第一多肽链和第二多肽链。
在某些情形中，所述第一多肽链可以包含所述CRIg胞外结构域、第一所述补体抑制结构域和第一所述IgG Fc结构域。在某些情形中，第一所述补体抑制结构域可以包含选自下组的蛋白质或其功能片段：factor H(FH)、CD55、CD46和CD59。在某些情形中，第一所述补体抑制结构域可以包含选自下组的蛋白质或其功能片段：factor H(FH)、CD55和CD59。在某些情形中，第一所述IgG Fc结构域可以包含选自下组的蛋白质或其功能片段：IgG1 Fc和IgG4Fc。
在某些情形中，所述第二多肽链可以包含所述CRIg胞外结构域、第二所述补体抑制结构域和第二所述IgG Fc结构域。在某些情形中，第二所述补体抑制结构域可以包含选自下组的蛋白质或其功能片段：factor H(FH)、CD55、CD46和CD59。在某些情形中，第二所述补体抑制结构域可以包含选自下组的蛋白质或其功能片段：factor H(FH)、CD55和CD59。在某些情形中，第二所述IgG Fc结构域可以包含选自下组的蛋白质或其功能片段：IgG1 Fc和IgG4Fc。
在某些情形中，所述第一多肽链可以包含SEQ ID NO.14、24、26、28、38、40和42中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述第一多肽链可以包含与SEQ ID NO.14、24、26、28、38、40和42中任一项所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
在某些情形中，所述第一多肽链可以包含SEQ ID NO.14、24、28、38、40和42中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述第一多肽链可以包含与SEQ ID NO.14、24、28、38、40和42中任一项所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
在某些情形中，所述第二多肽链可以包含SEQ ID NO.14、24、26、28、38、40和42中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述第二多肽链可以包含与SEQ ID NO.14、24、26、28、38、40和42中任一项所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
在某些情形中，所述第二多肽链可以包含SEQ ID NO.14、24、28、38、40和42中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述第二多肽链可以包含与SEQ ID NO.14、24、28、38、40和42中任一项所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
在本申请中，所述融合蛋白可包含第一多肽链和第二多肽链，其中，所述第一多肽链的第一所述IgG Fc结构域和所述第二多肽链的第二所述IgG Fc结构域能够相互作用形成二聚体。
在本申请中，融合蛋白的所述第一多肽链的第一所述补体抑制结构域与所述第二多肽链的第二所述补体抑制结构域可以相同。例如，第一所述补体抑制结构域与第二所述补体抑制结构域可以包含选自下组的蛋白质或其功能片段：factor H(FH)、CD46、CD55和CD59。例如，第一所述补体抑制结构域与第二所述补体抑制结构域可以包含选自下组的蛋白质或其功能片段：factor H(FH)、CD55和CD59。
在某些情形中，融合蛋白的所述第一多肽链的第一所述IgG Fc结构域和所述第二多肽链的第二所述IgG Fc结构域可以相同。例如，第一所述IgG Fc结构域和/或第二所述IgG Fc结构域可以包含SEQ ID NO.10和30中任一项所示的氨基酸序列。例如，第一所述IgGFc结构域和/或第二所述IgG Fc结构域可以包含与SEQ ID NO.10和30中任一项所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
例如，所述融合蛋白可包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链和所述第二多肽链可以相同。例如，所述第一多肽链和/或所述第二多肽链可以包含SEQ ID NO.14、24、26和28中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述第一多肽链和/或所述第二多肽链可以包含SEQ ID NO.14、24和28中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述第一多肽链和/或所述第二多肽链可以包含与SEQ ID NO.14、24、26和28中任一项所示的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源的任意一种氨基酸序列。
在本申请中，融合蛋白的所述第一多肽链的第一所述补体抑制结构域与所述第二多肽链的第二所述补体抑制结构域可以不同。例如，第一所述补体抑制结构域和第二所述补体抑制结构域各自独立地包含选自下组的蛋白质或其功能片段：CD59和CD55。例如，第一所述补体抑制结构域和第二所述补体抑制结构域各自独立地包含选自下组的蛋白质或其功能片段：FH和CD55。例如，第一所述补体抑制结构域和第二所述补体抑制结构域各自独立地包含选自下组的蛋白质或其功能片段：CD46和CD59。
在某些情形中，融合蛋白的所述第一多肽链的第一所述IgG Fc结构域和所述第二多肽链的第二所述IgG Fc结构域可以相同。例如，所述第一所述IgG Fc结构域和/或所述第二所述IgG Fc结构域可以包含SEQ ID NO.10和30中任一项所示的氨基酸序列。
在某些情形中，融合蛋白的所述第一多肽链的第一所述IgG Fc结构域和所述第二多肽链的第二所述IgG Fc结构域可以不同。例如，所述第一所述IgG Fc结构域可以包含SEQID NO.32所示的氨基酸序列，所述第二所述IgG Fc结构域可以包含SEQ ID NO.34所示的氨基酸序列。
例如，所述融合蛋白的所述第一多肽链或所述第二多肽链自N端至C端，可依次包含所述CRIg胞外结构域、CD46和IgG1 Fc。例如，所述第一多肽链可以包含SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列。
例如，所述融合蛋白的所述第一多肽链或所述第二多肽链自N端至C端，可依次包含所述CRIg胞外结构域、CD55和IgG1 Fc。例如，所述第一多肽链可以包含SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列。
例如，所述融合蛋白的所述第二多肽链或所述第二多肽链自N端至C端，可依次包含所述CRIg胞外结构域、FH和IgG1 Fc。所述第二多肽链可以包含SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列。
例如，所述融合蛋白的所述第二多肽链或所述第二多肽链自N端至C端，可依次包含所述CRIg胞外结构域、CD59和IgG1 Fc。所述第二多肽链可以包含SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列。
例如，所述第一多肽链可以包含SEQ ID NO.36、38、40和42中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述第一多肽链可以包含SEQ ID NO.38、40和42中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述第二多肽链可以包含SEQ ID NO.36、38、40和42中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述第二多肽链可以包含SEQ ID NO.38、40和42中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述融合蛋白的所述第一多肽链可以包含SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列，所述第二多肽链可以包含SEQ ID NO.40和42中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述融合蛋白的所述第一多肽链可以包含SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列；且所述第二多肽链可以包含SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列。
例如，所述融合蛋白的所述第一多肽链可以包含SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列；且所述第二多肽链可以包含SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列。
例如，所述融合蛋白的所述第一多肽链可以包含SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列；且所述第二多肽链可以包含SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述第一多肽连、所述第二多肽链、所述CRIg胞外结构域、所述补体抑制结构域(例如，所述factor H(FH)、CD46、CD55和CD59)、所述增效结构域(例如所述IgGFc结构域和/或人血清白蛋白和/或所述融合蛋白，不仅包括上述各自的氨基酸序列，还可以包括各自的氨基酸序列的变异体。
在本申请中，所述氨基酸序列的变异体可包含：1)与相应氨基酸序列具有至少90％(例如，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同源性的氨基酸序列；和/或，
2)在相应氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(例如，1-2个，1-3个，1-4个，1-5个，1-6个，1-7个，1-8个，1-9个，1-10个，1-11个，1-12个或更多)氨基酸而获得的氨基酸序列。
在本申请中，术语“同源性”通常是指两个或更多个多核苷酸序列间或者两个或更多个多肽序列间的序列相似性或可互换性。当使用计算机程序或软件(例如，EmbossNeedle或BestFit)来确定不同氨基酸序列间的序列同一性、相似性或同源性时，可使用默认的参数设置。也可以选择适当的记分矩阵，例如blosum45或blosum80，来优化同一性、相似性或同源性分数。在某些实施方式中，同源的多核苷酸包括下述多核苷酸：其能够在严紧条件下与对照多核苷酸序列杂交并且与对照多核苷酸序列相比具有至少60％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％甚至至少100％序列同一性。同源的多肽可以是下述多肽：当在优化条件下进行序列比对时，其与对照多肽序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％、甚至至少100％的序列同一性。
为了确定序列同一性，可进行序列比对，其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数，包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。
在本申请中，所述氨基酸的取代可以是保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代。经取代后的所述第一多肽连、所述第二多肽链、所述CRIg胞外结构域、所述补体抑制结构域(例如，所述factor H(FH)、CD55和CD59)和/或所述增效结构域(例如所述IgG Fc结构域和/或人血清白蛋白仍具有与取代前的所述第一多肽连、所述第二多肽链、所述CRIg胞外结构域、所述补体抑制结构域(例如，所述factor H(FH)、CD55和CD59)和/或所述增效结构域(例如所述IgG Fc结构域和/或人血清白蛋白相同或相近的功能活性。
例如，所述氨基酸取代可以为非保守取代。所述非保守取代可包括以非保守的形式改变目标蛋白或多肽中的氨基酸残基，例如将具有某种侧链大小或某种特性(例如，亲水性)的氨基酸残基变为具有不同侧链大小或不同特性(例如，疏水性)的氨基酸残基。
所述氨基酸取代也可以为保守取代。所述保守取代可包括以保守的形式改变目标蛋白或多肽中的氨基酸残基，例如将具有某种侧链大小或某种特性(例如，亲水性)的氨基酸残基变为具有相同或相似侧链大小或者相同或相似特性(例如，仍为亲水性)的氨基酸残基。这样的保守取代通常不会对所产生的蛋白质的结构或功能带来很大影响。在本申请中，作为所述第一多肽连、所述第二多肽链、所述CRIg胞外结构域、所述补体抑制结构域(例如，所述factor H(FH)、CD46、CD55和CD59)和/或所述增效结构域(例如所述IgG Fc结构域和/或人血清白蛋白的氨基酸序列变体可包括不显著改变蛋白质结构或其功能的保守氨基酸取代。
作为示例，下述各组中每组内各氨基酸间的相互取代在本申请中可被认为是保守取代：具有非极性侧链的氨基酸组：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
不带电荷、具有极性侧链的氨基酸组：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。
负电荷、具有极性侧链的氨基酸组：天冬氨酸和谷氨酸。
带正电荷的碱性氨基酸：赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
带苯基的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
核酸分子、载体和细胞
在另一个方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子。所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述的融合蛋白或其片段。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述融合蛋白(例如，当融合蛋白是单链时)，也可以编码融合蛋白的一部分，例如，所述第一多肽连、所述第二多肽链、所述CRIg胞外结构域、所述补体抑制结构域(例如，所述factor H(FH)、CD46、CD55和CD59)和/或所述增效结构域(例如所述IgG Fc结构域和/或人血清白蛋白，或其中的一种或多种。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述融合蛋白或其片段的核酸，这些方法包括但不限于，采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR，具体操作可参见Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York N.Y.，1993。
在另一个方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。所述表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。在本申请中，适当的启动子可包括，例如用于SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(如CMV)，其中启动子的某部分可与其他细胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子的某部分融合，其可包含或不包含另外的内含子。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。
在另一个方面，本申请提供了宿主细胞，所述宿主细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。
药物组合物
在另一个方面，本申请提供了药物组合物，其包括所述的融合蛋白和任选地药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体通常是指可用于制备药物组合物或制剂的载体，通常安全、无毒，且既不是生物学上也非其它方面不合需要的。所使用的载体通常是适合施用于人体或其他哺乳动物的载体。在制备组合物时，活性成分通常与载体混合，由载体稀释或封闭。当载体用作稀释剂时，其可以是固体，半固体或液体材料，其充当抗体活性成分的媒介物，载体或介质。所述药学上可接受的载体可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。
在本申请中，所述药物组合物可被配制用于口服给药、静脉内给药、肌肉内给药、在肿瘤部位的原位给药、吸入、直肠给药、***给药、经皮给药或通过皮下储存库给药。用于经皮给药或通过皮下储存库的溶液或悬液可包括以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和调节张力的物质如氯化钠或右旋糖。pH可用酸或碱调节，例如盐酸或氢氧化钠。
方法和用途
在另一个方面，本申请提供了制备所述的融合蛋白或其片段的方法。所述方法可包括以下步骤：合成所述的融合蛋白或其片段，和/或，在表达所述的融合蛋白或其片段的条件下培养所述的细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
本申请可以利用基因工程技术，连接本申请所述的融合蛋白或其片段，例如，所述第一多肽连、所述第二多肽链、所述CRIg胞外结构域、所述补体抑制结构域(例如，所述factor H(FH)、CD46、CD55和CD59)和/或所述增效结构域(例如所述IgG Fc结构域和/或人血清白蛋白)，或者，可以按照蛋白质的序列依次连接氨基酸残基。
本申请也可以利用基因工程技术，连接本申请所述的融合蛋白或其片段的编码序列，例如，例如，所述第一多肽连、所述第二多肽链、所述CRIg胞外结构域、所述补体抑制结构域(例如，所述factor H(FH)、CD46、CD55和CD59)和/或所述增效结构域(例如所述IgG Fc结构域和/或人血清白蛋白)的编码序列；或者可以按照核酸的序列依次连接碱基。
在另一个方面，本申请提供了所述融合的那白或所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物可以用于治疗靶向抑制补体激活相关的疾病。所述靶向抑制补体激活相关的疾病可以选自：阵发性夜间血红蛋白尿(Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria，PNH)、非典型溶血尿毒综合征(atypical Haemolytic Uraemic Syndrome，aHUS)、全身型重症肌无力(generalized Myasthenia Gravis，gMG)、视神经脊髓炎谱系疾病(NeuromyelitisOptica Spectrum Disorders，NMOSD)、年龄相关性黄斑变性(Age-related MacularDegeneration，AMD)、自身溶血性贫血、自身免疫性血小板减少、再生障碍性贫血、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、动脉粥样硬化、帕金森氏病、阿尔茨海默病(老年性痴呆)、哮喘、过敏、银屑病、多发性硬化和克隆氏肠病。本申请所述药物可以抑制抑制补体激活和/或保护细胞免受补体攻击。在某些情形中，所述疾病可以包括自身免疫性疾病。例如，所述疾病可以包括自身免疫性重症肌无力。
本申请还涉及如下实施方案：
1.融合蛋白，其包含:
(i)CRIg胞外结构域；
(ii)补体抑制结构域，所述补体抑制结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：factor H(FH)、CD55、CD46和CD59；和
(iii)增效结构域，所述增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：IgG Fc结构域和人血清白蛋白。
2.根据实施方式1所述的融合蛋白，其中所述CRIg胞外结构域包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
3.根据实施方式1-2中任一项所述的融合蛋白，其中所述CRIg胞外结构域的C端与所述补体抑制结构域的N端直接或间接连接。
4.根据实施方式1-3中任一项所述的融合蛋白，其中所述补体抑制结构域的C端与所述增效结构域的N端直接或间接连接。
5.根据实施方式1-4中任一项所述的融合蛋白，其中所述间接连接包括通过连接子连接。
6.根据实施方式5所述的融合蛋白，其中所述连接子包含SEQ ID NO.44、46、48和50中任一项所示的氨基酸序列。
7.根据实施方式1-6中任一项所述的融合蛋白，其中所述补体抑制结构域包含SEQID NO:8、18、20和22中任一项所示的氨基酸序列。
8.根据实施方式1-7中任一项所述的融合蛋白，其中所述增效结构域为人血清白蛋白。
9.根据实施方式1-8中任一项所述的融合蛋白，其中所述人血清白蛋白包含SEQID NO.12所示的氨基酸序列。
10.根据实施方式1-9中任一项所述的融合蛋白，其为单链结构。
11.根据实施方式1-10中任一项所述的融合蛋白，其以自N端至C端的顺序依次包括所述CRIg胞外结构域、所述补体抑制结构域和所述增效结构域。
12.根据实施方式1-11中任一项所述的融合蛋白，其包含SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列。
13.根据实施方式1-7中任一项所述的融合蛋白，其中所述增效结构域包含IgG Fc结构域。
14.根据实施方式1-13中任一项所述的融合蛋白，其中所述IgG包括选自下组的蛋白质：人IgG1和人IgG4。
15.根据实施方式1-14中任一项所述的融合蛋白，其中所述IgG Fc结构域包含SEQID NO:10、30、32和34中任一项所示的氨基酸序列。
16.根据实施方式13-14中任一项所述的融合蛋白，其包括第一多肽链和第二多肽链，其中所述第一多肽链包含所述CRIg胞外结构域、第一所述补体抑制结构域和第一所述IgG Fc结构域，所述第二多肽链包含所述CRIg胞外结构域、第二所述补体抑制结构域和第二所述IgG Fc结构域，
其中第一所述IgG Fc结构域和第二所述IgG Fc结构域能够相互作用形成二聚体。
17.根据实施方式16所述的融合蛋白，其中第一所述补体抑制结构域和第二所述补体抑制结构域各自独立地包含选自下组的蛋白质或其功能片段：factor H(FH)、CD55、CD46和CD59。
18.根据实施方式16-17中任一项所述的融合蛋白，其中第一所述补体抑制结构域与第二所述补体抑制结构域相同。
19.根据实施方式18所述的融合蛋白，其中第一所述IgG Fc结构域和第二所述IgGFc结构域相同。
20.根据实施方式18-19中任一项所述的融合蛋白，其中第一所述IgG Fc结构域和第二所述IgG Fc结构域包含SEQ ID NO.10和30中任一项所示的氨基酸序列。
21.根据实施方式18-20中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链相同。
22.根据实施方式18-21中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一多肽链和/或所述第二多肽链包含SEQ ID NO.14、24、26和28中任一项所示的氨基酸序列。
23.根据实施方式16-17中任一项所述的融合蛋白，其中第一所述补体抑制结构域和第二所述补体抑制结构域不同。
24.根据实施方式23所述的融合蛋白，其中第一所述补体抑制结构域和第二所述补体抑制结构域各自独立地包含选自下组的蛋白质或其功能片段：CD59和CD55。
25.根据实施方式23-24中任一项所述的融合蛋白，其中第一所述补体抑制结构域和第二所述补体抑制结构域各自独立地包含选自下组的蛋白质或其功能片段：FH和CD55。
26.根据实施方式23-25中任一项所述的融合蛋白，其中第一所述补体抑制结构域和第二所述补体抑制结构域各自独立地包含选自下组的蛋白质或其功能片段：CD46和CD59。
27.根据实施方式23-26中任一项所述的融合蛋白，其中第一所述IgG Fc结构域和第二所述IgG Fc结构域相同。
28.根据实施方式23-26中任一项所述的融合蛋白，其中第一所述IgG Fc结构域和第二所述IgG Fc结构域不同。
29.根据实施方式28所述的融合蛋白，其中第一所述IgG Fc结构域包含SEQ IDNO.32和34中任一项所示的氨基酸序列。
30.根据实施方式28-29中任一项所述的融合蛋白，其中第二所述IgG Fc结构域包含SEQ ID NO.32和34中任一项所示的氨基酸序列。
31.根据实施方式28-30中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一多肽链包含SEQID NO.36、38、40和42中任一项所示的氨基酸序列。
32.根据实施方式28-31中任一项所述的融合蛋白，其中所述第二多肽链包含SEQID NO.36、38、40和42中任一项所示的氨基酸序列。
33.根据实施方式23-32中任一项所述的融合蛋白，其中：
所述第一多肽链包含SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列；且所述第二多肽链包含SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列；
所述第一多肽链包含SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列；且所述第二多肽链包含SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列；或者，
所述第一多肽链包含SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列；且所述第二多肽链包含SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列。
34.一种或多种分离的核酸分子，其编码实施方式1-33中任一项所述的融合蛋白或其片段。
35.载体，其包含实施方式34所述的核酸分子。
36.细胞，其包含实施方式35所述的载体，或者表达实施方式1-33中任一项所述的融合蛋白。
37.制备实施方式1-33中任一项所述的融合蛋白的方法，其包括以下的步骤：合成实施方式1-33中任一项所述的融合蛋白，和/或，在表达实施方式1-33中任一项所述的融合蛋白的条件下培养实施方式36所述的细胞。
38.药物组合物，其包括实施方式1-33中任一项所述的融合蛋白和任选地药学上可接受的载体。
39.实施方式1-33中任一项所述的融合蛋白或实施方式37所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗靶向抑制补体激活相关的疾病。
40.根据实施方式39所述的用途，其中所述疾病包括自身免疫性疾病。
41.根据实施方式39-40中任一项所述的用途，其中所述疾病包括自身免疫性重症肌无力。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。ns:no significance,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
实施例
实施例1通过增加IgG4 Fc片段可延长CRIg-FH药物半衰期
实验目的：在CRIg-FH补体抑制剂中引入人类IgG Fc或HSA，构建(CRIg-FH-IgG4Fc)×2和His×6-CRIg-FH-HSA两种重组蛋白的表达载体并进行真核表达和纯化，检测其补体抑制活性以及体内半衰期，最终筛选并确定可延长CRIg-FH半衰期而又不影响其补体抑制效果的蛋白片段。
1.仪器与材料：
电热恒温水槽(DK-8D型，上海精宏实验设备有限公司)，PCR仪(Mastercyclerpro-Eppendorf，德国Eppendorf公司)，RNA/DNA浓度/纯度检测仪(NANODROP 2000c，美国Thermo Scientific)，，凝胶成像仪(Tanon 1600，上海天能科技有限公司)，CO2细胞培养箱(240i，美国Thermo Scientific公司)，BioRAD Mini protein Tera system(美国BioRAD公司)，低温水平离心机(Allegra X-15R Centrifuge，美国Beckman Coulter公司)。
2.实验方法：
2.1基因克隆和载体构建
利用NucleoZOL(德国Macherey-Nagel公司)从人肝癌细胞系Hep3B提取总RNA，再利用反转录酶(PrimeScriptTMRT Master Mix，日本Takara公司)把总RNA反转录为cDNA。上述cDNA经相应的引物利用PCR方法扩增编码FH补体抑制功能片段的SCR1-5结构域(E19-K323)和人血清白蛋白HSA的基因序列；另外，采用类似的方法从淋巴瘤细胞U937细胞中提取总RNA，经反转录成cDNA后再通过PCR方法扩增编码CRIg基因胞外结构域(G19-K137)基因序列。
编码FH蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:3所示，FH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码FH的SCR1-5结构域的核酸序列如SEQ ID NO:7所示，FH的SCR1-5结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
编码HAS蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:11所示，HAS蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:12所示。
编码CRIg蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，CRIg蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。编码CRIg胞外结构域的核酸序列如SEQ ID NO:5所示，CRIg胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
设计同时包含CRIg胞外结构域和FH SCR1-5结构域序列引物，应用重叠PCR(Overlapping PCR)的方法将CRIg胞外结构域基因和FH SCR1-5基因连接起来，***到pFUSE-hIgG4-Fc1真核表达载体(InvivoGen公司)中。其中，编码hIgG4-Fc的核酸序列如SEQID NO:9所示，hIgG4-Fc蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。另外，上述CRIg胞外结构域基因和FH SCR1-5连接后再通过重叠PCR方法与HSA基因连接，***到pcDNA3.1/His A(Invitrogen公司)表达载体中。以上载体经过双向测序确认鉴定***序列正确后，再进行后续试验，载体分别命名为pFUSE-CRIg-FH-hIgG4Fc1和pCDNA/His-CRIg-FH-HSA。
2.2蛋白表达
按照2.0×107个细胞/培养皿的293FT细胞密度均匀铺在直径15cm的细胞培养皿中，待细胞至生长至对数期，利用Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)试剂分别转染上述构建的PFUSE-CRIg-FH-hIgG4-Fc1或pCDNA/His-CRIg-FH-HSA大抽质粒，在37℃，5％CO2培养箱中培养6小时后更换293蛋白表达无血清培养基(美国Gibco公司)，继续培养三天后收取细胞培养上清，离心去除细胞及细胞碎片并使用超滤管将上清进行浓缩后待纯化。
2.3蛋白亲和纯化、缓冲液置换和浓缩
应用Protein A抗体纯化磁珠试剂盒(中国海狸纳米科技(苏州)有限公司)，将细胞上清中(CRIg-FH-IgG4Fc)×2重组蛋白纯化洗脱至洗脱缓冲液中，转移至超滤管管中(美国Millipore公司)，通过低温离心的方法将缓冲液置换为PBS，并浓缩蛋白。或者应用His·Bind affinity Purification Kit(Novagen/MerckMillipore公司)按照生产说明书纯化表达的His×6-CRIg-FH-HSA融合蛋白，同样通过类似的方法置换缓冲液为PBS并浓缩保存。获得的重组蛋白分别命名为(CRIg-FH-IgG4Fc)×2和CRIg-FH-HSA(图1)
2.4补体抑制活性检测
采用商业化市售试剂盒
Figure BDA0002486876650000251
Complement System Classical Pathway(COMPLCP310)和
Figure BDA0002486876650000252
Complement Alternative Pathway(COMPLAP330)分别检测上述两种重组蛋白对补体经典途径和替补途径的抑制效果。
2.5重组蛋白体内药物半衰期的检测
选用SD大鼠，雌雄各半，静脉注射(CRIg-FH-IgG4Fc)×2，分别于给药前(D-1)，给药D1开始后5min(即给药结束后2min)、30min、4h、24h，2d、3d、5d、7d、10d、14d、21d、28d不同时间点采血，分离血清。经ELISA法分析各样本中重组蛋白的浓度。或静脉注射CRIg-FH-HSA,1mg/kg，分别于药前，给药开始后5min、30min、1h、3h、6h、12h、24h，2d、3d、5d、7d、10d、14d、21d、28d，分离血清。
ELISA检测方法为：包被兔抗人CRIg单抗(克隆号202，sino biological公司，Catalog#12163-H08H)，与标准品重组蛋白或血清中重组蛋白结合后，通过小鼠抗人IgG4fragment Secondary(5c7)[HRP](NOVUS公司，Catalog#NB110-7081H)酶标二抗检测(CRIg-FH-IgG4Fc)×2，或者通过人血清白蛋白多克隆抗体,HRP(ThermoFisher公司，Catalog#PA1-72058)酶标二抗检测CRIg-FH-HSA。通过标准曲线计算血清中重组蛋白的血药浓度，绘制时间-药物血清浓度曲线，计算半衰期。
3.实验结果：
3.1通过上述方法应用真核***诱导表达和纯化得到(CRIg-FH-IgG4Fc)×2和His×6-CRIg-FH-HSA两种重组蛋白，进行PAGE电泳检测，纯度大于95％，它们的理论分子量分别为146kDa和114kDa，实际大小与理论值吻合(图2)。编码CRIg-FH-IgG4 Fc的核酸序列如SEQ ID NO:13所示，CRIg-FH-IgG4 Fc蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；编码CRIg-FH-HSA的核酸序列如SEQ ID NO:15所示，CRIg-FH-HSA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
3.2我们检测了(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2和CRIg-FH-HSA对人血清补体经典途径和替补途径的抑制活性。结果表明(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2和CRIg-FH-HSA对补体均有抑制效果。前者抑制补体经典途径的IC50为91.38nM(图3)，抑制补体替补途径的IC50为1.04nM(图4)，后者抑制补体经典途径的IC50为1355nM(图5)，抑制补体替补途径的IC50为10.39nM(图6)。
3.3(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2和CRIg-FH-HSA
检测不同时间点采集的血清中(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2或CRIg-FH-HSA浓度，绘制时间-浓度的药代动力学曲线，其中(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2的药代动力学曲线见图7，半衰期为142.2小时；而CRIg-FH-HSA的药代动力学曲线见图8，半衰期为32.8小时。
实施例2FH是补体抑制效果优异的与CRIg连接的补体抑制片段
实验目的：通过构建(CRIg-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2和(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2共四种重组蛋白的表达载体并进行真核表达和纯化、以及检测其补体活性，判断在四种重要补体抑制蛋白FH、CD55、CD46和CD59中与CRIg连接后何种抑制蛋白具有最优的补体抑制效果。
1.仪器与材料：
电热恒温水槽(DK-8D型，上海精宏实验设备有限公司)，PCR仪(Mastercyclerpro-Eppendorf，德国Eppendorf公司)，RNA/DNA浓度/纯度检测仪(NANODROP 2000c，美国Thermo Scientific)，，凝胶成像仪(Tanon 1600，上海天能科技有限公司)，CO2细胞培养箱(240i，美国Thermo Scientific公司)，BioRAD Mini protein Tera system(美国BioRAD公司)，低温水平离心机(Allegra X-15R Centrifuge，美国Beckman Coulter公司)。
2.实验方法：
2.1基因克隆和载体构建
利用NucleoZOL(德国Macherey-Nagel公司)从人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7提取总RNA，再利用反转录酶(PrimeScriptTMRT Master Mix，日本Takara公司)把总RNA反转录为cDNA。上述cDNA经相应的引物利用PCR方法扩增编码CD55、CD46、CD59的DNA序列(均不包含编码信号肽的DNA序列)。通过同样的方法利用NucleoZOL从人肝癌细胞系Hep3B细胞中提取总RNA，经反转录成cDNA后再通过PCR方法扩增编码FH补体抑制功能片段的SCR1-5结构域(E19-K323)，从淋巴瘤细胞U937细胞中提取总RNA，经反转录成cDNA后再通过PCR方法扩增编码CRIg基因胞外结构域(G19-K137)基因序列。其中，编码CD55的核酸序列如SEQ IDNO:17所示，CD55蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；编码CD46的核酸序列如SEQ IDNO:19所示，CD46蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；编码CD59的核酸序列如SEQ IDNO:21所示，CD59蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
设计同时包含CRIg胞外结构域和FH SCR1-5结构域、CD55、CD46或CD59编码序列引物，应用重叠PCR(Overlapping PCR)的方法将CRIg胞外结构域基因和FH SCR1-5、CD46、CD55、或CD59基因连接起来，***到pFUSE-hIgG4-Fc1真核表达载体(InvivoGen公司)中。以上载体经过双向测序确认鉴定***序列正确后进行后续试验，载体分别命名为pFUSE-CRIg-FH-IgG4Fc、pFUSE-CRIg-CD55-IgG4Fc、pFUSE-CRIg-CD46-IgG4Fc和pFUSE-CRIg-CD59-IgG4Fc。
2.2蛋白表达
按照2.0×107个细胞/培养皿的293FT细胞密度均匀铺在直径15cm的细胞培养皿中，待细胞至生长至对数期，利用Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)试剂分别转染上述构建的pFUSE-CRIg-FH-IgG4Fc、pFUSE-CRIg-CD55-IgG4Fc、pFUSE-CRIg-CD46-IgG4Fc或pFUSE-CRIg-CD59-IgG4Fc大抽质粒，在37℃，5％CO2培养箱中培养6小时后更换293蛋白表达无血清培养基(美国Gibco公司)，继续培养三天后收取细胞培养上清，离心去除细胞及细胞碎片并使用超滤管将上清进行浓缩后待纯化。
2.3蛋白亲和纯化、缓冲液置换和浓缩
应用Protein A抗体纯化磁珠试剂盒(中国海狸纳米科技(苏州)有限公司)，将细胞上清中(CRIg-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2重组蛋白纯化洗脱至洗脱缓冲液中，转移至超滤管管中(美国Millipore公司)，通过低温离心的方法将缓冲液置换为PBS，并浓缩蛋白保存。
2.4补体抑制活性检测
采用商业化市售试剂盒
Figure BDA0002486876650000282
Complement System Classical Pathway(COMPLCP310)和
Figure BDA0002486876650000281
Complement Alternative Pathway(COMPLAP330)分别检测上述重组蛋白对补体经典途径和替补途径的抑制效果。
3.实验结果：
3.1通过上述方法应用真核***诱导表达和纯化得到(CRIg-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2和(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2四种重组蛋白(图9)，进行PAGE电泳检测，纯度大于95％，它们的理论分子量分别为146、153、157和101kDa，实际大小与理论值吻合(图10)。编码CRIg-CD55-IgG4Fc的核酸序列如SEQ ID NO:23所示，CRIg-CD55-IgG4Fc蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；编码CRIg-CD46-IgG4Fc的核酸序列如SEQ ID NO:25所示，CRIg-CD46-IgG4Fc蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:26所示；编码CRIg-CD59-IgG4Fc的核酸序列如SEQ ID NO:27所示，CRIg-CD59-IgG4Fc蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示。
3.2我们检测了(CRIg-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2和(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2四种重组蛋白对人血清补体经典途径和替补途径的抑制活性。(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2对补体的经典和替补途径抑制效果分别见图3和图4，(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2对补体的经典和替补途径抑制效果分别见图11和图12，(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2对补体的经典和替补途径抑制效果分别见图13和图14，(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2对补体的经典和替补途径抑制效果分别见图15和图16。它们抑制补体经典途径的IC50详见表1。具体的，(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2抑制补体的经典和替补途径IC50分别为91.38nM和1.04nM；(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2抑制补体的经典和替补途径IC50分别为23.25nM和19.66nM；(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2抑制补体的经典途径IC50为44.06nM；(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2抑制补体的经典途径IC50为44.84nM。四种融合蛋白均具有经典途径和/或替补途径的抑制效果。
实施例3双特异性靶向性补体抑制剂的研发
实验目的：通过构建(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-FH-IgG1Fc)、(CRIg-CD46-IgG1Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)和(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)共三种双特异性靶向性重组蛋白表达载体，并真核表达和纯化这些融合蛋白，以及检测其补体抑制活性，检测筛选更有效的补体抑制剂。
1.仪器与材料：
电热恒温水槽(DK-8D型，上海精宏实验设备有限公司)，PCR仪(Mastercyclerpro-Eppendorf，德国Eppendorf公司)，RNA/DNA浓度/纯度检测仪(NANODROP 2000c，美国Thermo Scientific公司)，凝胶成像仪(Tanon 1600，上海天能科技有限公司)，CO2细胞培养箱(240i，美国Thermo Scientific公司)，BioRAD Mini protein Tera system(美国BioRAD公司)，低温水平离心机(Allegra X-15R Centrifuge，美国Beckman Coulter公司)。
2.实验方法：
2.1基因克隆和载体构建
通过设计突变引物，利用点突变试剂盒(日本TOYOBO公司)将pFUSE-hIgG1-Fc1真核表达载体引物突变位点(Alegre et al.,1992；Carter,2001；Merchant et al.,1998；Ridgway et al.,1996；Xu et al.,2000)，改造成pFUSE-hIgG1-Fc1 knob mutant和pFUSE-hIgG1-Fc1 hole mutant两个突变载体。
其中，编码IgG1 Fc的核酸序列如SEQ ID NO:29所示，IgG1 Fc蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；编码Knob mutant的核酸序列如SEQ ID NO:31所示，Knob mutant蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示；编码Hole mutant的核酸序列如SEQ ID NO:33所示，Hole mutant蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
以实施例1和2中构建的CRIg-FH、CRIg-CD46、CRIg-CD55和CRIg-CD59基因序列，应用一步法快速克隆试剂盒(上海翌圣生物科技有限公司)将以上融合片段CRIg-CD46、CRIg-CD55分别***至pFUSE-hIgG1-Fc knob mutant载体中，质粒分别命名为pFUSE-CRIg-CD46-hIgG1 Fc knob、pFUSE-CRIg-CD55-hIgG1 Fc knob，再应用一步法快速克隆试剂盒将融合片段CRIg-FH、CRIg-CD59分别***至pFUSE-IgG1-Fc hole mutant载体中，质粒分别命名为pFUSE-CRIg-FH-IgG1 Fc hole、pFUSE-CRIg-CD59-IgG1 Fc hole。
其中，编码CRIg-CD46-IgG1 Fc knob的核酸序列如SEQ ID NO:35所示，CRIg-CD46-IgG1 Fc knob蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示；编码CRIg-CD55-IgG1 Fcknob的核酸序列如SEQ ID NO:37所示，CRIg-CD55-IgG1 Fc knob蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:38所示；编码CRIg-FH-IgG1 Fc hole的核酸序列如SEQ ID NO:39所示，CRIg-FH-IgG1 Fc hole蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示；编码CRIg-CD59-IgG1 Fc hole的核酸序列如SEQ ID NO:41所示，CRIg-CD59-IgG1 Fc hole蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示。
2.2蛋白表达
按照2.0×107个细胞/培养皿的293FT细胞密度均匀铺在直径15cm的细胞培养皿中，待细胞至生长至对数期，利用Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)试剂同时转染pFUSE-CRIg-CD46-hIgG1 Fc knob和pFUSE-CRIg-CD59-hIgG1 Fc hole大抽质粒、pFUSE-CRIg-CD55-hIgG1 Fc knob和pFUSE-CRIg-CD59-hIgG1 Fc hole、pFUSE-CRIg-CD55-hIgG1Fc knob和pFUSE-CRIg-FH-hIgG1 Fc hole，在37℃，5％CO2培养箱中培养6小时后更换293蛋白表达无血清培养基(美国Gibco公司)，继续培养三天后收取细胞培养上清，离心去除细胞及细胞碎片并使用超滤管将上清进行浓缩后待纯化。
2.3蛋白亲和纯化、缓冲液置换和蛋白浓缩
应用Protein A抗体纯化磁珠试剂盒(海狸纳米科技(苏州)有限公司)，将细胞上清中(CRIg-CD46-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)、(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1Fc)和(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-FH-IgG1 Fc)重组蛋白纯化洗脱至洗脱缓冲液中，转移至超滤管管中(美国Millipore公司)，通过低温离心的方法将缓冲液置换为PBS，并浓缩蛋白。
2.4补体抑制活性检测
采用商业化市售试剂盒
Figure BDA0002486876650000302
Complement System Classical Pathway(COMPLCP310)和
Figure BDA0002486876650000303
Complement Alternative Pathway(COMPLAP330)分别检测上述两种重组蛋白对补体经典途径和替补途径的抑制效果。数据使用Graphpad Prism 7.0软件进行分析。
3.实验结果：
3.1通过上述方法应用真核***诱导表达和纯化得到(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-FH-IgG1 Fc)、(CRIg-CD46-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)和(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)三种类抗体重组蛋白(图17)，进行PAGE电泳检测，纯度大于95％，它们的理论分子量分别为151、130和128kDa，实际大小与理论值吻合(图18)。
3.2三种双特异性靶向性补体抑制剂对补体经典与替补途径的IC50抑制活性如表1所示。(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-FH-IgG1 Fc)抑制补体经典和替补途径的效果分别如图19和图20所示；(CRIg-CD46-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)抑制补体经典和替补途径的效果分别如图21和图22所示；(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)抑制补体经典和替补途径的效果分别如图23和图24所示。三种双特异性靶向性补体抑制剂均能抑制补体经典途径或替补途径。
表1 补体抑制剂的体外补体抑制效果比较
Figure BDA0002486876650000301
Figure BDA0002486876650000311
实施例4(CRIg-FH-IgG4Fc)×2治疗大鼠重症肌无力模型的药效
实验目的：在上述融合蛋白中，我们选择了(CRIg-FH-IgG4Fc)×2补体抑制剂检测了体内补体过度激活疾病的药效。抗乙酰胆碱受体(AChR)的自身抗体与神经肌肉接头处的AChR结合以后直接下调AChR表达水平，或通过激活补体的经典途径间接引起AChR功能障碍或表达水平下降，均导致神经肌肉传导障碍，最终出现肌无力等MG的临床表现(Gomez etal.,2010；Phillips and Vincent,2016)。我们在大鼠重症肌无力模型——实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)中检测了(CRIg-FH-IgG4Fc)×2补体抑制剂的治疗效果，为后续潜在的临床应用奠定基础。
1.仪器与材料：
动物称量天平(上海精密科学仪器有限公司，YP2001N)，Lewis大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，InVivo MAb anti-human/rat/fish AChR(Bio X Cell,WestLebanon,NH)。
2.实验方法：
2.1EAMG的诱导
给予四周左右雌性大鼠腹腔注射抗AChR抗体mAb35(1～3mg/kg)是国际上诱导全身型重症肌无力样实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)模型的通用方法(Hepburn etal.,2007；Liu et al.,2007；Papanastasiou et al.,2000；Poulas et al.,2000)。大鼠分为未注射抗AChR抗体的正常组、腹腔注射抗AChR抗体(1.5mg/kg)及注射PBS组、腹腔注射抗AChR抗体及注射5种不同剂量(0.5，1，2，5和10mg/kg)(CRIg-FH-IgG4Fc)×2药物治疗组，上述共7组，分两次实验完成。第一次实验40只，第二次实验50只大鼠。分组如表2所示。
表2(CRIg-FH-IgG4Fc)×2药物对抗AChR抗体诱导的大鼠EAMG疗效观察分组
Figure BDA0002486876650000312
Figure BDA0002486876650000321
2.2EAMG表型的监测
大鼠经过至少5-7天适应期后进行实验，实验前、实验后每个24小时称重，并进行临床评分。具体评分标准为可抓紧并抬起笼盖，0分；可抓紧但不能抬起笼盖，1分；不能抓紧笼盖，2分；不能抓物且后肢瘫痪，3分；死亡或濒死状态，4分(Piddlesden et al.,1996；Soltys et al.,2009)。实验发现模型组中PBS对照组大部分大鼠在48小时死亡或面临死亡，因此根据伦理该组在48小时时间点结束观察，而(CRIg-FH-IgG4Fc)×2药物治疗组在96小时时临床评分基本都已恢复，因此该组在96小时时间点结束观察，并统计24和48小时的动物死亡率。
2.3统计学处理
实验数据应用平均数±标准误表示(Mean±SEM)，体重用two tails t-test分析，临床评分用双因素方差分析(Two-way ANOVA)，死亡率用卡方检验(Chi-Square andFisher’s Exact Test)，ns:no significance,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
3.实验结果：
未注射抗AChR抗体和(CRIg-FH-IgG4Fc)×2药物的正常大鼠体重逐渐增加，而注射抗AChR抗体未经药物治疗的大鼠则体重24小时下降11.2％，48小时下降15.5％，临床评分24小时3-4分占比达82％(14/17)，48小时3-4分占比达88％(15/17)，且在17只大鼠中发现，24小时有2只大鼠濒临死亡或已死亡，至48小时则共有9只已经死亡，死亡率52.9％(9/17)，其余8只存活动物中6只也接近濒死状态，说明EAMG大鼠模型构建成功(图25至图27)。
经(CRIg-FH-IgG4Fc)×2药物预处理后可显著改善EAMG的症状，经0.5mg/kg最低药物剂量处理后体重在24小时仅下降1.6％，临床评分1.1分，48小时体重仅下降2.3％，临床评分1.3分，动物死亡率14.3％(1/7)，疗效明显。经更高剂量药物处理后在24小时体重同样没有明显下降，临床评分基本成剂量依赖关系逐渐下降；在48小时，体重逐渐恢复，临床评分也逐渐降低，且与剂量存在一定量效关系，即剂量越高，体重增加越多，而临床评分则越低(图25至图27)。另外，所有药物治疗组动物均观察至96小时，48小时存活大鼠的体重均呈逐渐增加的趋势，临床评分逐渐下降至正常值，表明EAMG症状逐渐恢复至正常。
4.讨论：
四周左右雌性大鼠腹腔注射抗AChR抗体mAb35(1.5mg/kg)可诱导EAMG表型，表现为48小时内大鼠体重明显下降，运动能力快速丧失，前肢抓力下降，动物死亡，建模成功。大鼠体重监测，临床评分以及动物死亡监测结果表明，LM007在0.5mg/kg药物剂量即可发挥明显的EAMG治疗效果，随着剂量的增加，疗效与剂量存在一定的剂量依赖关系，在5mg/kg及以上剂量时几乎完全阻断疾病进程。在抗AChR抗体诱导的大鼠EAMG模型中，补体的过度激活发挥了主要作用，但极个别大鼠可能不依赖激活补体而发挥致病作用。
序列表
<110> 上海康景生物医药科技有限公司
<120> 生物大分子靶向特异性补体抑制剂及其制备方法与应用
<130> 0175-PA-001
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1200
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 1
atggggatct tactgggcct gctactcctg gggcacctaa cagtggacac ttatggccgt 60
cccatcctgg aagtgccaga gagtgtaaca ggaccttgga aaggggatgt gaatcttccc 120
tgcacctatg accccctgca aggctacacc caagtcttgg tgaagtggct ggtacaacgt 180
ggctcagacc ctgtcaccat ctttctacgt gactcttctg gagaccatat ccagcaggca 240
aagtaccagg gccgcctgca tgtgagccac aaggttccag gagatgtatc cctccaattg 300
agcaccctgg agatggatga ccggagccac tacacgtgtg aagtcacctg gcagactcct 360
gatggcaacc aagtcgtgag agataagatt actgagctcc gtgtccagaa actctctgtc 420
tccaagccca cagtgacaac tggcagcggt tatggcttca cggtgcccca gggaatgagg 480
attagccttc aatgccaggc tcggggttct cctcccatca gttatatttg gtataagcaa 540
cagactaata accaggaacc catcaaagta gcaaccctaa gtaccttact cttcaagcct 600
gcggtgatag ccgactcagg ctcctatttc tgcactgcca agggccaggt tggctctgag 660
cagcacagcg acattgtgaa gtttgtggtc aaagactcct caaagctact caagaccaag 720
actgaggcac ctacaaccat gacatacccc ttgaaagcaa catctacagt gaagcagtcc 780
tgggactgga ccactgacat ggatggctac cttggagaga ccagtgctgg gccaggaaag 840
agcctgcctg tctttgccat catcctcatc atctccttgt gctgtatggt ggtttttacc 900
atggcctata tcatgctctg tcggaagaca tcccaacaag agcatgtcta cgaagcagcc 960
agggcacatg ccagagaggc caacgactct ggagaaacca tgagggtggc catcttcgca 1020
agtggctgct ccagtgatga gccaacttcc cagaatctgg gcaacaacta ctctgatgag 1080
ccctgcatag gacaggagta ccagatcatc gcccagatca atggcaacta cgcccgcctg 1140
ctggacacag ttcctctgga ttatgagttt ctggccactg agggcaaaag tgtctgttaa 1200
<210> 2
<211> 399
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 2
Met Gly Ile Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Gly His Leu Thr Val Asp
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro
20 25 30
Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly
35 40 45
Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro
50 55 60
Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala
65 70 75 80
Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val
85 90 95
Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr
100 105 110
Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp
115 120 125
Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Ser Val Ser Lys Pro Thr
130 135 140
Val Thr Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Val Pro Gln Gly Met Arg
145 150 155 160
Ile Ser Leu Gln Cys Gln Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ile Ser Tyr Ile
165 170 175
Trp Tyr Lys Gln Gln Thr Asn Asn Gln Glu Pro Ile Lys Val Ala Thr
180 185 190
Leu Ser Thr Leu Leu Phe Lys Pro Ala Val Ile Ala Asp Ser Gly Ser
195 200 205
Tyr Phe Cys Thr Ala Lys Gly Gln Val Gly Ser Glu Gln His Ser Asp
210 215 220
Ile Val Lys Phe Val Val Lys Asp Ser Ser Lys Leu Leu Lys Thr Lys
225 230 235 240
Thr Glu Ala Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr
245 250 255
Val Lys Gln Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr Leu Gly
260 265 270
Glu Thr Ser Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro Val Phe Ala Ile Ile
275 280 285
Leu Ile Ile Ser Leu Cys Cys Met Val Val Phe Thr Met Ala Tyr Ile
290 295 300
Met Leu Cys Arg Lys Thr Ser Gln Gln Glu His Val Tyr Glu Ala Ala
305 310 315 320
Arg Ala His Ala Arg Glu Ala Asn Asp Ser Gly Glu Thr Met Arg Val
325 330 335
Ala Ile Phe Ala Ser Gly Cys Ser Ser Asp Glu Pro Thr Ser Gln Asn
340 345 350
Leu Gly Asn Asn Tyr Ser Asp Glu Pro Cys Ile Gly Gln Glu Tyr Gln
355 360 365
Ile Ile Ala Gln Ile Asn Gly Asn Tyr Ala Arg Leu Leu Asp Thr Val
370 375 380
Pro Leu Asp Tyr Glu Phe Leu Ala Thr Glu Gly Lys Ser Val Cys
385 390 395
<210> 3
<211> 3696
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 3
atgagacttc tagcaaagat tatttgcctt atgttatggg ctatttgtgt agcagaagat 60
tgcaatgaac ttcctccaag aagaaataca gaaattctga caggttcctg gtctgaccaa 120
acatatccag aaggcaccca ggctatctat aaatgccgcc ctggatatag atctcttgga 180
aatgtaataa tggtatgcag gaagggagaa tgggttgctc ttaatccatt aaggaaatgt 240
cagaaaaggc cctgtggaca tcctggagat actccttttg gtacttttac ccttacagga 300
ggaaatgtgt ttgaatatgg tgtaaaagct gtgtatacat gtaatgaggg gtatcaattg 360
ctaggtgaga ttaattaccg tgaatgtgac acagatggat ggaccaatga tattcctata 420
tgtgaagttg tgaagtgttt accagtgaca gcaccagaga atggaaaaat tgtcagtagt 480
gcaatggaac cagatcggga ataccatttt ggacaagcag tacggtttgt atgtaactca 540
ggctacaaga ttgaaggaga tgaagaaatg cattgttcag acgatggttt ttggagtaaa 600
gagaaaccaa agtgtgtgga aatttcatgc aaatccccag atgttataaa tggatctcct 660
atatctcaga agattattta taaggagaat gaacgatttc aatataaatg taacatgggt 720
tatgaataca gtgaaagagg agatgctgta tgcactgaat ctggatggcg tccgttgcct 780
tcatgtgaag aaaaatcatg tgataatcct tatattccaa atggtgacta ctcaccttta 840
aggattaaac acagaactgg agatgaaatc acgtaccagt gtagaaatgg tttttatcct 900
gcaacccggg gaaatacagc aaaatgcaca agtactggct ggatacctgc tccgagatgt 960
accttgaaac cttgtgatta tccagacatt aaacatggag gtctatatca tgagaatatg 1020
cgtagaccat actttccagt agctgtagga aaatattact cctattactg tgatgaacat 1080
tttgagactc cgtcaggaag ttactgggat cacattcatt gcacacaaga tggatggtcg 1140
ccagcagtac catgcctcag aaaatgttat tttccttatt tggaaaatgg atataatcaa 1200
aatcatggaa gaaagtttgt acagggtaaa tctatagacg ttgcctgcca tcctggctac 1260
gctcttccaa aagcgcagac cacagttaca tgtatggaga atggctggtc tcctactccc 1320
agatgcatcc gtgtcaaaac atgttccaaa tcaagtatag atattgagaa tgggtttatt 1380
tctgaatctc agtatacata tgccttaaaa gaaaaagcga aatatcaatg caaactagga 1440
tatgtaacag cagatggtga aacatcagga tcaattacat gtgggaaaga tggatggtca 1500
gctcaaccca cgtgcattaa atcttgtgat atcccagtat ttatgaatgc cagaactaaa 1560
aatgacttca catggtttaa gctgaatgac acattggact atgaatgcca tgatggttat 1620
gaaagcaata ctggaagcac cactggttcc atagtgtgtg gttacaatgg ttggtctgat 1680
ttacccatat gttatgaaag agaatgcgaa cttcctaaaa tagatgtaca cttagttcct 1740
gatcgcaaga aagaccagta taaagttgga gaggtgttga aattctcctg caaaccagga 1800
tttacaatag ttggacctaa ttccgttcag tgctaccact ttggattgtc tcctgacctc 1860
ccaatatgta aagagcaagt acaatcatgt ggtccacctc ctgaactcct caatgggaat 1920
gttaaggaaa aaacgaaaga agaatatgga cacagtgaag tggtggaata ttattgcaat 1980
cctagatttc taatgaaggg acctaataaa attcaatgtg ttgatggaga gtggacaact 2040
ttaccagtgt gtattgtgga ggagagtacc tgtggagata tacctgaact tgaacatggc 2100
tgggcccagc tttcttcccc tccttattac tatggagatt cagtggaatt caattgctca 2160
gaatcattta caatgattgg acacagatca attacgtgta ttcatggagt atggacccaa 2220
cttccccagt gtgtggcaat agataaactt aagaagtgca aatcatcaaa tttaattata 2280
cttgaggaac atttaaaaaa caagaaggaa ttcgatcata attctaacat aaggtacaga 2340
tgtagaggaa aagaaggatg gatacacaca gtctgcataa atggaagatg ggatccagaa 2400
gtgaactgct caatggcaca aatacaatta tgcccacctc cacctcagat tcccaattct 2460
cacaatatga caaccacact gaattatcgg gatggagaaa aagtatctgt tctttgccaa 2520
gaaaattatc taattcagga aggagaagaa attacatgca aagatggaag atggcagtca 2580
ataccactct gtgttgaaaa aattccatgt tcacaaccac ctcagataga acacggaacc 2640
attaattcat ccaggtcttc acaagaaagt tatgcacatg ggactaaatt gagttatact 2700
tgtgagggtg gtttcaggat atctgaagaa aatgaaacaa catgctacat gggaaaatgg 2760
agttctccac ctcagtgtga aggccttcct tgtaaatctc cacctgagat ttctcatggt 2820
gttgtagctc acatgtcaga cagttatcag tatggagaag aagttacgta caaatgtttt 2880
gaaggttttg gaattgatgg gcctgcaatt gcaaaatgct taggagaaaa atggtctcac 2940
cctccatcat gcataaaaac agattgtctc agtttaccta gctttgaaaa tgccataccc 3000
atgggagaga agaaggatgt gtataaggcg ggtgagcaag tgacttacac ttgtgcaaca 3060
tattacaaaa tggatggagc cagtaatgta acatgcatta atagcagatg gacaggaagg 3120
ccaacatgca gagacacctc ctgtgtgaat ccgcccacag tacaaaatgc ttatatagtg 3180
tcgagacaga tgagtaaata tccatctggt gagagagtac gttatcaatg taggagccct 3240
tatgaaatgt ttggggatga agaagtgatg tgtttaaatg gaaactggac ggaaccacct 3300
caatgcaaag attctacagg aaaatgtggg ccccctccac ctattgacaa tggggacatt 3360
acttcattcc cgttgtcagt atatgctcca gcttcatcag ttgagtacca atgccagaac 3420
ttgtatcaac ttgagggtaa caagcgaata acatgtagaa atggacaatg gtcagaacca 3480
ccaaaatgct tacatccgtg tgtaatatcc cgagaaatta tggaaaatta taacatagca 3540
ttaaggtgga cagccaaaca gaagctttat tcgagaacag gtgaatcagt tgaatttgtg 3600
tgtaaacggg gatatcgtct ttcatcacgt tctcacacat tgcgaacaac atgttgggat 3660
gggaaactgg agtatccaac ttgtgcaaaa agatag 3696
<210> 4
<211> 1231
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 4
Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys
1 5 10 15
Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile
20 25 30
Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala
35 40 45
Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Val Ile Met
50 55 60
Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys
65 70 75 80
Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe
85 90 95
Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr
100 105 110
Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu
115 120 125
Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val
130 135 140
Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser
145 150 155 160
Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe
165 170 175
Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys
180 185 190
Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile
195 200 205
Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys
210 215 220
Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly
225 230 235 240
Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp
245 250 255
Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile
260 265 270
Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp
275 280 285
Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly
290 295 300
Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys
305 310 315 320
Thr Leu Lys Pro Cys Asp Tyr Pro Asp Ile Lys His Gly Gly Leu Tyr
325 330 335
His Glu Asn Met Arg Arg Pro Tyr Phe Pro Val Ala Val Gly Lys Tyr
340 345 350
Tyr Ser Tyr Tyr Cys Asp Glu His Phe Glu Thr Pro Ser Gly Ser Tyr
355 360 365
Trp Asp His Ile His Cys Thr Gln Asp Gly Trp Ser Pro Ala Val Pro
370 375 380
Cys Leu Arg Lys Cys Tyr Phe Pro Tyr Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Gln
385 390 395 400
Asn His Gly Arg Lys Phe Val Gln Gly Lys Ser Ile Asp Val Ala Cys
405 410 415
His Pro Gly Tyr Ala Leu Pro Lys Ala Gln Thr Thr Val Thr Cys Met
420 425 430
Glu Asn Gly Trp Ser Pro Thr Pro Arg Cys Ile Arg Val Lys Thr Cys
435 440 445
Ser Lys Ser Ser Ile Asp Ile Glu Asn Gly Phe Ile Ser Glu Ser Gln
450 455 460
Tyr Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Lys Ala Lys Tyr Gln Cys Lys Leu Gly
465 470 475 480
Tyr Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Ser Gly Ser Ile Thr Cys Gly Lys
485 490 495
Asp Gly Trp Ser Ala Gln Pro Thr Cys Ile Lys Ser Cys Asp Ile Pro
500 505 510
Val Phe Met Asn Ala Arg Thr Lys Asn Asp Phe Thr Trp Phe Lys Leu
515 520 525
Asn Asp Thr Leu Asp Tyr Glu Cys His Asp Gly Tyr Glu Ser Asn Thr
530 535 540
Gly Ser Thr Thr Gly Ser Ile Val Cys Gly Tyr Asn Gly Trp Ser Asp
545 550 555 560
Leu Pro Ile Cys Tyr Glu Arg Glu Cys Glu Leu Pro Lys Ile Asp Val
565 570 575
His Leu Val Pro Asp Arg Lys Lys Asp Gln Tyr Lys Val Gly Glu Val
580 585 590
Leu Lys Phe Ser Cys Lys Pro Gly Phe Thr Ile Val Gly Pro Asn Ser
595 600 605
Val Gln Cys Tyr His Phe Gly Leu Ser Pro Asp Leu Pro Ile Cys Lys
610 615 620
Glu Gln Val Gln Ser Cys Gly Pro Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gly Asn
625 630 635 640
Val Lys Glu Lys Thr Lys Glu Glu Tyr Gly His Ser Glu Val Val Glu
645 650 655
Tyr Tyr Cys Asn Pro Arg Phe Leu Met Lys Gly Pro Asn Lys Ile Gln
660 665 670
Cys Val Asp Gly Glu Trp Thr Thr Leu Pro Val Cys Ile Val Glu Glu
675 680 685
Ser Thr Cys Gly Asp Ile Pro Glu Leu Glu His Gly Trp Ala Gln Leu
690 695 700
Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Glu Phe Asn Cys Ser
705 710 715 720
Glu Ser Phe Thr Met Ile Gly His Arg Ser Ile Thr Cys Ile His Gly
725 730 735
Val Trp Thr Gln Leu Pro Gln Cys Val Ala Ile Asp Lys Leu Lys Lys
740 745 750
Cys Lys Ser Ser Asn Leu Ile Ile Leu Glu Glu His Leu Lys Asn Lys
755 760 765
Lys Glu Phe Asp His Asn Ser Asn Ile Arg Tyr Arg Cys Arg Gly Lys
770 775 780
Glu Gly Trp Ile His Thr Val Cys Ile Asn Gly Arg Trp Asp Pro Glu
785 790 795 800
Val Asn Cys Ser Met Ala Gln Ile Gln Leu Cys Pro Pro Pro Pro Gln
805 810 815
Ile Pro Asn Ser His Asn Met Thr Thr Thr Leu Asn Tyr Arg Asp Gly
820 825 830
Glu Lys Val Ser Val Leu Cys Gln Glu Asn Tyr Leu Ile Gln Glu Gly
835 840 845
Glu Glu Ile Thr Cys Lys Asp Gly Arg Trp Gln Ser Ile Pro Leu Cys
850 855 860
Val Glu Lys Ile Pro Cys Ser Gln Pro Pro Gln Ile Glu His Gly Thr
865 870 875 880
Ile Asn Ser Ser Arg Ser Ser Gln Glu Ser Tyr Ala His Gly Thr Lys
885 890 895
Leu Ser Tyr Thr Cys Glu Gly Gly Phe Arg Ile Ser Glu Glu Asn Glu
900 905 910
Thr Thr Cys Tyr Met Gly Lys Trp Ser Ser Pro Pro Gln Cys Glu Gly
915 920 925
Leu Pro Cys Lys Ser Pro Pro Glu Ile Ser His Gly Val Val Ala His
930 935 940
Met Ser Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Glu Glu Val Thr Tyr Lys Cys Phe
945 950 955 960
Glu Gly Phe Gly Ile Asp Gly Pro Ala Ile Ala Lys Cys Leu Gly Glu
965 970 975
Lys Trp Ser His Pro Pro Ser Cys Ile Lys Thr Asp Cys Leu Ser Leu
980 985 990
Pro Ser Phe Glu Asn Ala Ile Pro Met Gly Glu Lys Lys Asp Val Tyr
995 1000 1005
Lys Ala Gly Glu Gln Val Thr Tyr Thr Cys Ala Thr Tyr Tyr Lys Met
1010 1015 1020
Asp Gly Ala Ser Asn Val Thr Cys Ile Asn Ser Arg Trp Thr Gly Arg
1025 1030 1035 1040
Pro Thr Cys Arg Asp Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr Val Gln Asn
1045 1050 1055
Ala Tyr Ile Val Ser Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro Ser Gly Glu Arg
1060 1065 1070
Val Arg Tyr Gln Cys Arg Ser Pro Tyr Glu Met Phe Gly Asp Glu Glu
1075 1080 1085
Val Met Cys Leu Asn Gly Asn Trp Thr Glu Pro Pro Gln Cys Lys Asp
1090 1095 1100
Ser Thr Gly Lys Cys Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile
1105 1110 1115 1120
Thr Ser Phe Pro Leu Ser Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr
1125 1130 1135
Gln Cys Gln Asn Leu Tyr Gln Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys
1140 1145 1150
Arg Asn Gly Gln Trp Ser Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val
1155 1160 1165
Ile Ser Arg Glu Ile Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr
1170 1175 1180
Ala Lys Gln Lys Leu Tyr Ser Arg Thr Gly Glu Ser Val Glu Phe Val
1185 1190 1195 1200
Cys Lys Arg Gly Tyr Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg Thr
1205 1210 1215
Thr Cys Trp Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys Arg
1220 1225 1230
<210> 5
<211> 357
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 5
ggccgtccca tcctggaagt gccagagagt gtaacaggac cttggaaagg ggatgtgaat 60
cttccctgca cctatgaccc cctgcaaggc tacacccaag tcttggtgaa gtggctggta 120
caacgtggct cagaccctgt caccatcttt ctacgtgact cttctggaga ccatatccag 180
caggcaaagt accagggccg cctgcatgtg agccacaagg ttccaggaga tgtatccctc 240
caattgagca ccctggagat ggatgaccgg agccactaca cgtgtgaagt cacctggcag 300
actcctgatg gcaaccaagt cgtgagagat aagattactg agctccgtgt ccagaaa 357
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 6
Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys
1 5 10 15
Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr
20 25 30
Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr
35 40 45
Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr
50 55 60
Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu
85 90 95
Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile
100 105 110
Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys
115
<210> 7
<211> 915
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 7
gaagattgca atgaacttcc tccaagaaga aatacagaaa ttctgacagg ttcctggtct 60
gaccaaacat atccagaagg cacccaggct atctataaat gccgccctgg atatagatct 120
cttggaaatg taataatggt atgcaggaag ggagaatggg ttgctcttaa tccattaagg 180
aaatgtcaga aaaggccctg tggacatcct ggagatactc cttttggtac ttttaccctt 240
acaggaggaa atgtgtttga atatggtgta aaagctgtgt atacatgtaa tgaggggtat 300
caattgctag gtgagattaa ttaccgtgaa tgtgacacag atggatggac caatgatatt 360
cctatatgtg aagttgtgaa gtgtttacca gtgacagcac cagagaatgg aaaaattgtc 420
agtagtgcaa tggaaccaga tcgggaatac cattttggac aagcagtacg gtttgtatgt 480
aactcaggct acaagattga aggagatgaa gaaatgcatt gttcagacga tggtttttgg 540
agtaaagaga aaccaaagtg tgtggaaatt tcatgcaaat ccccagatgt tataaatgga 600
tctcctatat ctcagaagat tatttataag gagaatgaac gatttcaata taaatgtaac 660
atgggttatg aatacagtga aagaggagat gctgtatgca ctgaatctgg atggcgtccg 720
ttgccttcat gtgaagaaaa atcatgtgat aatccttata ttccaaatgg tgactactca 780
cctttaagga ttaaacacag aactggagat gaaatcacgt accagtgtag aaatggtttt 840
tatcctgcaa cccggggaaa tacagcaaaa tgcacaagta ctggctggat acctgctccg 900
agatgtacct tgaaa 915
<210> 8
<211> 305
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 8
Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile Leu Thr
1 5 10 15
Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala Ile Tyr
20 25 30
Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Val Ile Met Val Cys
35 40 45
Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn Pro Leu Arg Lys Cys Gln Lys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr Pro Phe Gly Thr Phe Thr Leu
65 70 75 80
Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly Val Lys Ala Val Tyr Thr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu Ile Asn Tyr Arg Glu Cys Asp
100 105 110
Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro Ile Cys Glu Val Val Lys Cys
115 120 125
Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly Lys Ile Val Ser Ser Ala Met
130 135 140
Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly Gln Ala Val Arg Phe Val Cys
145 150 155 160
Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp Glu Glu Met His Cys Ser Asp
165 170 175
Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Val Glu Ile Ser Cys
180 185 190
Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser Pro Ile Ser Gln Lys Ile Ile
195 200 205
Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr Lys Cys Asn Met Gly Tyr Glu
210 215 220
Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys Thr Glu Ser Gly Trp Arg Pro
225 230 235 240
Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys Asp Asn Pro Tyr Ile Pro Asn
245 250 255
Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys His Arg Thr Gly Asp Glu Ile
260 265 270
Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr Pro Ala Thr Arg Gly Asn Thr
275 280 285
Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile Pro Ala Pro Arg Cys Thr Leu
290 295 300
Lys
305
<210> 9
<211> 675
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 9
cccccatgcc catcatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 60
cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 120
gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 180
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 240
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 300
tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 360
cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 420
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 480
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 540
ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 600
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 660
tctctgggta aataa 675
<210> 10
<211> 224
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 10
Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
165 170 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
180 185 190
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215 220
<210> 11
<211> 1758
<212> DNA
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 11
gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60
gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120
aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180
aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240
cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300
tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360
gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420
gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480
tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540
aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600
gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660
cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720
gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780
gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840
aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900
gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960
gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020
tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc 1080
tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140
gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200
tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260
ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320
cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380
tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc 1440
ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500
gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560
agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620
aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680
gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740
gctgccttag gcttataa 1758
<210> 12
<211> 585
<212> PRT
<213> 人类（Homo sapiens）
<400> 12
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 13
<211> 1950
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-FH-IgG4 Fc核酸序列
<400> 13
atgggccgtc ccatcctgga agtgccagag agtgtaacag gaccttggaa aggggatgtg 60
aatcttccct gcacctatga ccccctgcaa ggctacaccc aagtcttggt gaagtggctg 120
gtacaacgtg gctcagaccc tgtcaccatc tttctacgtg actcttctgg agaccatatc 180
cagcaggcaa agtaccaggg ccgcctgcat gtgagccaca aggttccagg agatgtatcc 240
ctccaattga gcaccctgga gatggatgac cggagccact acacgtgtga agtcacctgg 300
cagactcctg atggcaacca agtcgtgaga gataagatta ctgagctccg tgtccagaaa 360
gaagattgca atgaacttcc tccaagaaga aatacagaaa ttctgacagg ttcctggtct 420
gaccaaacat atccagaagg cacccaggct atctataaat gccgccctgg atatagatct 480
cttggaaatg taataatggt atgcaggaag ggagaatggg ttgctcttaa tccattaagg 540
aaatgtcaga aaaggccctg tggacatcct ggagatactc cttttggtac ttttaccctt 600
acaggaggaa atgtgtttga atatggtgta aaagctgtgt atacatgtaa tgaggggtat 660
caattgctag gtgagattaa ttaccgtgaa tgtgacacag atggatggac caatgatatt 720
cctatatgtg aagttgtgaa gtgtttacca gtgacagcac cagagaatgg aaaaattgtc 780
agtagtgcaa tggaaccaga tcgggaatac cattttggac aagcagtacg gtttgtatgt 840
aactcaggct acaagattga aggagatgaa gaaatgcatt gttcagacga tggtttttgg 900
agtaaagaga aaccaaagtg tgtggaaatt tcatgcaaat ccccagatgt tataaatgga 960
tctcctatat ctcagaagat tatttataag gagaatgaac gatttcaata taaatgtaac 1020
atgggttatg aatacagtga aagaggagat gctgtatgca ctgaatctgg atggcgtccg 1080
ttgccttcat gtgaagaaaa atcatgtgat aatccttata ttccaaatgg tgactactca 1140
cctttaagga ttaaacacag aactggagat gaaatcacgt accagtgtag aaatggtttt 1200
tatcctgcaa cccggggaaa tacagcaaaa tgcacaagta ctggctggat acctgctccg 1260
agatgtacct tgaaaccccc atgcccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 1320
tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 1380
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 1440
gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 1500
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1560
tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1620
gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1680
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1740
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1800
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 1860
gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1920
aagagcctct ccctgtctct gggtaaataa 1950
<210> 14
<211> 649
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-FH-IgG4 Fc蛋白序列
<400> 14
Met Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp
1 5 10 15
Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr
20 25 30
Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val
35 40 45
Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys
50 55 60
Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys
85 90 95
Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys
100 105 110
Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro
115 120 125
Arg Arg Asn Thr Glu Ile Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr
130 135 140
Pro Glu Gly Thr Gln Ala Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser
145 150 155 160
Leu Gly Asn Val Ile Met Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu
165 170 175
Asn Pro Leu Arg Lys Cys Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp
180 185 190
Thr Pro Phe Gly Thr Phe Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr
195 200 205
Gly Val Lys Ala Val Tyr Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly
210 215 220
Glu Ile Asn Tyr Arg Glu Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile
225 230 235 240
Pro Ile Cys Glu Val Val Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn
245 250 255
Gly Lys Ile Val Ser Ser Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe
260 265 270
Gly Gln Ala Val Arg Phe Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly
275 280 285
Asp Glu Glu Met His Cys Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys
290 295 300
Pro Lys Cys Val Glu Ile Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly
305 310 315 320
Ser Pro Ile Ser Gln Lys Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln
325 330 335
Tyr Lys Cys Asn Met Gly Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val
340 345 350
Cys Thr Glu Ser Gly Trp Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser
355 360 365
Cys Asp Asn Pro Tyr Ile Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile
370 375 380
Lys His Arg Thr Gly Asp Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe
385 390 395 400
Tyr Pro Ala Thr Arg Gly Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp
405 410 415
Ile Pro Ala Pro Arg Cys Thr Leu Lys Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
420 425 430
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
435 440 445
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
450 455 460
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
465 470 475 480
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
485 490 495
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
500 505 510
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
515 520 525
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
530 535 540
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
545 550 555 560
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
565 570 575
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
580 585 590
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
595 600 605
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
610 615 620
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
625 630 635 640
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
645
<210> 15
<211> 3030
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-FH-HSA核酸序列
<400> 15
ggccgtccca tcctggaagt gccagagagt gtaacaggac cttggaaagg ggatgtgaat 60
cttccctgca cctatgaccc cctgcaaggc tacacccaag tcttggtgaa gtggctggta 120
caacgtggct cagaccctgt caccatcttt ctacgtgact cttctggaga ccatatccag 180
caggcaaagt accagggccg cctgcatgtg agccacaagg ttccaggaga tgtatccctc 240
caattgagca ccctggagat ggatgaccgg agccactaca cgtgtgaagt cacctggcag 300
actcctgatg gcaaccaagt cgtgagagat aagattactg agctccgtgt ccagaaagaa 360
gattgcaatg aacttcctcc aagaagaaat acagaaattc tgacaggttc ctggtctgac 420
caaacatatc cagaaggcac ccaggctatc tataaatgcc gccctggata tagatctctt 480
ggaaatgtaa taatggtatg caggaaggga gaatgggttg ctcttaatcc attaaggaaa 540
tgtcagaaaa ggccctgtgg acatcctgga gatactcctt ttggtacttt tacccttaca 600
ggaggaaatg tgtttgaata tggtgtaaaa gctgtgtata catgtaatga ggggtatcaa 660
ttgctaggtg agattaatta ccgtgaatgt gacacagatg gatggaccaa tgatattcct 720
atatgtgaag ttgtgaagtg tttaccagtg acagcaccag agaatggaaa aattgtcagt 780
agtgcaatgg aaccagatcg ggaataccat tttggacaag cagtacggtt tgtatgtaac 840
tcaggctaca agattgaagg agatgaagaa atgcattgtt cagacgatgg tttttggagt 900
aaagagaaac caaagtgtgt ggaaatttca tgcaaatccc cagatgttat aaatggatct 960
cctatatctc agaagattat ttataaggag aatgaacgat ttcaatataa atgtaacatg 1020
ggttatgaat acagtgaaag aggagatgct gtatgcactg aatctggatg gcgtccgttg 1080
ccttcatgtg aagaaaaatc atgtgataat ccttatattc caaatggtga ctactcacct 1140
ttaaggatta aacacagaac tggagatgaa atcacgtacc agtgtagaaa tggtttttat 1200
cctgcaaccc ggggaaatac agcaaaatgc acaagtactg gctggatacc tgctccgaga 1260
tgtaccttga aagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 1320
gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 1380
gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 1440
gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 1500
gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 1560
gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 1620
agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 1680
aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 1740
tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 1800
tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 1860
agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 1920
gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 1980
gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 2040
agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 2100
gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 2160
gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 2220
aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 2280
aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 2340
ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 2400
tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 2460
cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 2520
caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 2580
tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 2640
ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc 2700
tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 2760
tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 2820
tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt gaaacacaag 2880
cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag 2940
aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt 3000
gctgcaagtc aagctgcctt aggcttataa 3030
<210> 16
<211> 1009
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-FH-HSA蛋白序列
<400> 16
Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys
1 5 10 15
Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr
20 25 30
Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr
35 40 45
Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr
50 55 60
Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu
85 90 95
Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile
100 105 110
Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg
115 120 125
Arg Asn Thr Glu Ile Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro
130 135 140
Glu Gly Thr Gln Ala Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu
145 150 155 160
Gly Asn Val Ile Met Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu Asn
165 170 175
Pro Leu Arg Lys Cys Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp Thr
180 185 190
Pro Phe Gly Thr Phe Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr Gly
195 200 205
Val Lys Ala Val Tyr Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly Glu
210 215 220
Ile Asn Tyr Arg Glu Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile Pro
225 230 235 240
Ile Cys Glu Val Val Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn Gly
245 250 255
Lys Ile Val Ser Ser Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe Gly
260 265 270
Gln Ala Val Arg Phe Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly Asp
275 280 285
Glu Glu Met His Cys Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys Pro
290 295 300
Lys Cys Val Glu Ile Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly Ser
305 310 315 320
Pro Ile Ser Gln Lys Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln Tyr
325 330 335
Lys Cys Asn Met Gly Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Cys
340 345 350
Thr Glu Ser Gly Trp Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser Cys
355 360 365
Asp Asn Pro Tyr Ile Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile Lys
370 375 380
His Arg Thr Gly Asp Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ala Thr Arg Gly Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp Ile
405 410 415
Pro Ala Pro Arg Cys Thr Leu Lys Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
420 425 430
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
435 440 445
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
450 455 460
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
465 470 475 480
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
485 490 495
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
500 505 510
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
515 520 525
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
530 535 540
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
545 550 555 560
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
565 570 575
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
580 585 590
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
595 600 605
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
610 615 620
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
625 630 635 640
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
645 650 655
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
660 665 670
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
675 680 685
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
690 695 700
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
705 710 715 720
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
725 730 735
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
740 745 750
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
755 760 765
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
770 775 780
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
785 790 795 800
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
805 810 815
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
820 825 830
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
835 840 845
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
850 855 860
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
865 870 875 880
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
885 890 895
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
900 905 910
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
915 920 925
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
930 935 940
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
945 950 955 960
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
965 970 975
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
980 985 990
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
995 1000 1005
Leu
<210> 17
<211> 1041
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD55核酸序列
<400> 17
gactgtggcc ttcccccaga tgtacctaat gcccagccag ctttggaagg ccgtacaagt 60
tttcccgagg atactgtaat aacgtacaaa tgtgaagaaa gctttgtgaa aattcctggc 120
gagaaggact cagtgatctg ccttaagggc agtcaatggt cagatattga agagttctgc 180
aatcgtagct gcgaggtgcc aacaaggcta aattctgcat ccctcaaaca gccttatatc 240
actcagaatt attttccagt cggtactgtt gtggaatatg agtgccgtcc aggttacaga 300
agagaacctt ctctatcacc aaaactaact tgccttcaga atttaaaatg gtccacagca 360
gtcgaatttt gtaaaaagaa atcatgccct aatccgggag aaatacgaaa tggtcagatt 420
gatgtaccag gtggcatatt atttggtgca accatctcct tctcatgtaa cacagggtac 480
aaattatttg gctcgacttc tagtttttgt cttatttcag gcagctctgt ccagtggagt 540
gacccgttgc cagagtgcag agaaatttat tgtccagcac caccacaaat tgacaatgga 600
ataattcaag gggaacgtga ccattatgga tatagacagt ctgtaacgta tgcatgtaat 660
aaaggattca ccatgattgg agagcactct atttattgta ctgtgaataa tgatgaagga 720
gagtggagtg gcccaccacc tgaatgcaga ggaaaatctc taacttccaa ggtcccacca 780
acagttcaga aacctaccac agtaaatgtt ccaactacag aagtctcacc aacttctcag 840
aaaaccacca caaaaaccac cacaccaaat gctcaagcaa cacggagtac acctgtttcc 900
aggacaacca agcattttca tgaaacaacc ccaaataaag gaagtggaac cacttcaggt 960
actacccgtc ttctatctgg gcacacgtgt ttcacgttga caggtttgct tgggacgcta 1020
gtaaccatgg gcttgctgac t 1041
<210> 18
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD55蛋白序列
<400> 18
Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala Leu Glu
1 5 10 15
Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys Cys Glu
20 25 30
Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile Cys Leu
35 40 45
Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg Ser Cys
50 55 60
Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro Tyr Ile
65 70 75 80
Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu Cys Arg
85 90 95
Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr Cys Leu
100 105 110
Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys Lys Ser
115 120 125
Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val Pro Gly
130 135 140
Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly Tyr
145 150 155 160
Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly Ser Ser
165 170 175
Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr Cys Pro
180 185 190
Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg Asp His
195 200 205
Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly Phe Thr
210 215 220
Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp Glu Gly
225 230 235 240
Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu Cys Arg Gly Lys Ser Leu Thr Ser
245 250 255
Lys Val Pro Pro Thr Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Asn Val Pro Thr
260 265 270
Thr Glu Val Ser Pro Thr Ser Gln Lys Thr Thr Thr Lys Thr Thr Thr
275 280 285
Pro Asn Ala Gln Ala Thr Arg Ser Thr Pro Val Ser Arg Thr Thr Lys
290 295 300
His Phe His Glu Thr Thr Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly
305 310 315 320
Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu
325 330 335
Leu Gly Thr Leu Val Thr Met Gly Leu Leu Thr
340 345
<210> 19
<211> 1074
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD46核酸序列
<400> 19
tgtgaggagc caccaacatt tgaagctatg gagctcattg gtaaaccaaa accctactat 60
gagattggtg aacgagtaga ttataagtgt aaaaaaggat acttctatat acctcctctt 120
gccacccata ctatttgtga tcggaatcat acatggctac ctgtctcaga tgacgcctgt 180
tatagagaaa catgtccata tatacgggat cctttaaatg gccaagcagt ccctgcaaat 240
gggacttacg agtttggtta tcagatgcac tttatttgta atgagggtta ttacttaatt 300
ggtgaagaaa ttctatattg tgaacttaaa ggatcagtag caatttggag cggtaagccc 360
ccaatatgtg aaaaggtttt gtgtacacca cctccaaaaa taaaaaatgg aaaacacacc 420
tttagtgaag tagaagtatt tgagtatctt gatgcagtaa cttatagttg tgatcctgca 480
cctggaccag atccattttc acttattgga gagagcacga tttattgtgg tgacaattca 540
gtgtggagtc gtgctgctcc agagtgtaaa gtggtcaaat gtcgatttcc agtagtcgaa 600
aatggaaaac agatatcagg atttggaaaa aaattttact acaaagcaac agttatgttt 660
gaatgcgata agggttttta cctcgatggc agcgacacaa ttgtctgtga cagtaacagt 720
acttgggatc ccccagttcc aaagtgtctt aaagtgctgc ctccatctag tacaaaacct 780
ccagctttga gtcattcagt gtcgacttct tccactacaa aatctccagc gtccagtgcc 840
tcaggtccta ggcctactta caagcctcca gtctcaaatt atccaggata tcctaaacct 900
gaggaaggaa tacttgacag tttggatgtt tgggtcattg ctgtgattgt tattgccata 960
gttgttggag ttgcagtaat ttgtgttgtc ccgtacagat atcttcaaag gaggaagaag 1020
aaaggcacat acctaactga tgagacccac agagaagtaa aatttacttc tctc 1074
<210> 20
<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD46蛋白序列
<400> 20
Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu Ala Met Glu Leu Ile Gly Lys Pro
1 5 10 15
Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys
20 25 30
Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu Ala Thr His Thr Ile Cys Asp Arg
35 40 45
Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr
50 55 60
Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu Asn Gly Gln Ala Val Pro Ala Asn
65 70 75 80
Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln Met His Phe Ile Cys Asn Glu Gly
85 90 95
Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser
100 105 110
Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro Pro Ile Cys Glu Lys Val Leu Cys
115 120 125
Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val
130 135 140
Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala
145 150 155 160
Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu Ile Gly Glu Ser Thr Ile Tyr Cys
165 170 175
Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val
180 185 190
Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu Asn Gly Lys Gln Ile Ser Gly Phe
195 200 205
Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys
210 215 220
Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp Thr Ile Val Cys Asp Ser Asn Ser
225 230 235 240
Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys Cys Leu Lys Val Leu Pro Pro Ser
245 250 255
Ser Thr Lys Pro Pro Ala Leu Ser His Ser Val Ser Thr Ser Ser Thr
260 265 270
Thr Lys Ser Pro Ala Ser Ser Ala Ser Gly Pro Arg Pro Thr Tyr Lys
275 280 285
Pro Pro Val Ser Asn Tyr Pro Gly Tyr Pro Lys Pro Glu Glu Gly Ile
290 295 300
Leu Asp Ser Leu Asp Val Trp Val Ile Ala Val Ile Val Ile Ala Ile
305 310 315 320
Val Val Gly Val Ala Val Ile Cys Val Val Pro Tyr Arg Tyr Leu Gln
325 330 335
Arg Arg Lys Lys Lys Gly Thr Tyr Leu Thr Asp Glu Thr His Arg Glu
340 345 350
Val Lys Phe Thr Ser Leu
355
<210> 21
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD59核酸序列
<400> 21
ctgcagtgct acaactgtcc taacccaact gctgactgca aaacagccgt caattgttca 60
tctgattttg atgcgtgtct cattaccaaa gctgggttac aagtgtataa caagtgttgg 120
aagtttgagc attgcaattt caacgacgtc acaacccgct tgagggaaaa tgagctaacg 180
tactactgct gcaagaagga cctgtgtaac tttaacgaac agcttgaaaa tggtgggaca 240
tccttatcag agaaaacagt tcttctgctg gtgactccat ttctggcagc agcctggagc 300
cttcatccc 309
<210> 22
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD59蛋白序列
<400> 22
Leu Gln Cys Tyr Asn Cys Pro Asn Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr Ala
1 5 10 15
Val Asn Cys Ser Ser Asp Phe Asp Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly
20 25 30
Leu Gln Val Tyr Asn Lys Cys Trp Lys Phe Glu His Cys Asn Phe Asn
35 40 45
Asp Val Thr Thr Arg Leu Arg Glu Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys
50 55 60
Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe Asn Glu Gln Leu Glu Asn Gly Gly Thr
65 70 75 80
Ser Leu Ser Glu Lys Thr Val Leu Leu Leu Val Thr Pro Phe Leu Ala
85 90 95
Ala Ala Trp Ser Leu His Pro
100
<210> 23
<211> 2076
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-CD55-IgG4Fc核酸序列
<400> 23
atgggccgtc ccatcctgga agtgccagag agtgtaacag gaccttggaa aggggatgtg 60
aatcttccct gcacctatga ccccctgcaa ggctacaccc aagtcttggt gaagtggctg 120
gtacaacgtg gctcagaccc tgtcaccatc tttctacgtg actcttctgg agaccatatc 180
cagcaggcaa agtaccaggg ccgcctgcat gtgagccaca aggttccagg agatgtatcc 240
ctccaattga gcaccctgga gatggatgac cggagccact acacgtgtga agtcacctgg 300
cagactcctg atggcaacca agtcgtgaga gataagatta ctgagctccg tgtccagaaa 360
gactgtggcc ttcccccaga tgtacctaat gcccagccag ctttggaagg ccgtacaagt 420
tttcccgagg atactgtaat aacgtacaaa tgtgaagaaa gctttgtgaa aattcctggc 480
gagaaggact cagtgatctg ccttaagggc agtcaatggt cagatattga agagttctgc 540
aatcgtagct gcgaggtgcc aacaaggcta aattctgcat ccctcaaaca gccttatatc 600
actcagaatt attttccagt cggtactgtt gtggaatatg agtgccgtcc aggttacaga 660
agagaacctt ctctatcacc aaaactaact tgccttcaga atttaaaatg gtccacagca 720
gtcgaatttt gtaaaaagaa atcatgccct aatccgggag aaatacgaaa tggtcagatt 780
gatgtaccag gtggcatatt atttggtgca accatctcct tctcatgtaa cacagggtac 840
aaattatttg gctcgacttc tagtttttgt cttatttcag gcagctctgt ccagtggagt 900
gacccgttgc cagagtgcag agaaatttat tgtccagcac caccacaaat tgacaatgga 960
ataattcaag gggaacgtga ccattatgga tatagacagt ctgtaacgta tgcatgtaat 1020
aaaggattca ccatgattgg agagcactct atttattgta ctgtgaataa tgatgaagga 1080
gagtggagtg gcccaccacc tgaatgcaga ggaaaatctc taacttccaa ggtcccacca 1140
acagttcaga aacctaccac agtaaatgtt ccaactacag aagtctcacc aacttctcag 1200
aaaaccacca caaaaaccac cacaccaaat gctcaagcaa cacggagtac acctgtttcc 1260
aggacaacca agcattttca tgaaacaacc ccaaataaag gaagtggaac cacttcaggt 1320
actacccgtc ttctatctgg gcacacgtgt ttcacgttga caggtttgct tgggacgcta 1380
gtaaccatgg gcttgctgac tcccccatgc ccatcatgcc cagcacctga gttcctgggg 1440
ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc 1500
cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac 1560
tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc 1620
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc 1680
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc 1740
tccaaagcca aagggcagcc ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag 1800
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac 1860
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1920
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg 1980
tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 2040
acacagaaga gcctctccct gtctctgggt aaataa 2076
<210> 24
<211> 691
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-CD55-IgG4Fc蛋白序列
<400> 24
Met Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp
1 5 10 15
Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr
20 25 30
Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val
35 40 45
Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys
50 55 60
Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys
85 90 95
Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys
100 105 110
Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val
115 120 125
Pro Asn Ala Gln Pro Ala Leu Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp
130 135 140
Thr Val Ile Thr Tyr Lys Cys Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly
145 150 155 160
Glu Lys Asp Ser Val Ile Cys Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile
165 170 175
Glu Glu Phe Cys Asn Arg Ser Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser
180 185 190
Ala Ser Leu Lys Gln Pro Tyr Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly
195 200 205
Thr Val Val Glu Tyr Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser
210 215 220
Leu Ser Pro Lys Leu Thr Cys Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala
225 230 235 240
Val Glu Phe Cys Lys Lys Lys Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg
245 250 255
Asn Gly Gln Ile Asp Val Pro Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile
260 265 270
Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser
275 280 285
Phe Cys Leu Ile Ser Gly Ser Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro
290 295 300
Glu Cys Arg Glu Ile Tyr Cys Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly
305 310 315 320
Ile Ile Gln Gly Glu Arg Asp His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr
325 330 335
Tyr Ala Cys Asn Lys Gly Phe Thr Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr
340 345 350
Cys Thr Val Asn Asn Asp Glu Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu
355 360 365
Cys Arg Gly Lys Ser Leu Thr Ser Lys Val Pro Pro Thr Val Gln Lys
370 375 380
Pro Thr Thr Val Asn Val Pro Thr Thr Glu Val Ser Pro Thr Ser Gln
385 390 395 400
Lys Thr Thr Thr Lys Thr Thr Thr Pro Asn Ala Gln Ala Thr Arg Ser
405 410 415
Thr Pro Val Ser Arg Thr Thr Lys His Phe His Glu Thr Thr Pro Asn
420 425 430
Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly His
435 440 445
Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr Met Gly
450 455 460
Leu Leu Thr Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
465 470 475 480
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
485 490 495
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
500 505 510
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
515 520 525
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
530 535 540
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
545 550 555 560
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
565 570 575
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
580 585 590
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
595 600 605
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
610 615 620
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
625 630 635 640
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
645 650 655
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
660 665 670
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
675 680 685
Leu Gly Lys
690
<210> 25
<211> 2109
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-CD46-IgG4Fc核酸序列
<400> 25
atgggccgtc ccatcctgga agtgccagag agtgtaacag gaccttggaa aggggatgtg 60
aatcttccct gcacctatga ccccctgcaa ggctacaccc aagtcttggt gaagtggctg 120
gtacaacgtg gctcagaccc tgtcaccatc tttctacgtg actcttctgg agaccatatc 180
cagcaggcaa agtaccaggg ccgcctgcat gtgagccaca aggttccagg agatgtatcc 240
ctccaattga gcaccctgga gatggatgac cggagccact acacgtgtga agtcacctgg 300
cagactcctg atggcaacca agtcgtgaga gataagatta ctgagctccg tgtccagaaa 360
tgtgaggagc caccaacatt tgaagctatg gagctcattg gtaaaccaaa accctactat 420
gagattggtg aacgagtaga ttataagtgt aaaaaaggat acttctatat acctcctctt 480
gccacccata ctatttgtga tcggaatcat acatggctac ctgtctcaga tgacgcctgt 540
tatagagaaa catgtccata tatacgggat cctttaaatg gccaagcagt ccctgcaaat 600
gggacttacg agtttggtta tcagatgcac tttatttgta atgagggtta ttacttaatt 660
ggtgaagaaa ttctatattg tgaacttaaa ggatcagtag caatttggag cggtaagccc 720
ccaatatgtg aaaaggtttt gtgtacacca cctccaaaaa taaaaaatgg aaaacacacc 780
tttagtgaag tagaagtatt tgagtatctt gatgcagtaa cttatagttg tgatcctgca 840
cctggaccag atccattttc acttattgga gagagcacga tttattgtgg tgacaattca 900
gtgtggagtc gtgctgctcc agagtgtaaa gtggtcaaat gtcgatttcc agtagtcgaa 960
aatggaaaac agatatcagg atttggaaaa aaattttact acaaagcaac agttatgttt 1020
gaatgcgata agggttttta cctcgatggc agcgacacaa ttgtctgtga cagtaacagt 1080
acttgggatc ccccagttcc aaagtgtctt aaagtgctgc ctccatctag tacaaaacct 1140
ccagctttga gtcattcagt gtcgacttct tccactacaa aatctccagc gtccagtgcc 1200
tcaggtccta ggcctactta caagcctcca gtctcaaatt atccaggata tcctaaacct 1260
gaggaaggaa tacttgacag tttggatgtt tgggtcattg ctgtgattgt tattgccata 1320
gttgttggag ttgcagtaat ttgtgttgtc ccgtacagat atcttcaaag gaggaagaag 1380
aaaggcacat acctaactga tgagacccac agagaagtaa aatttacttc tctcccccca 1440
tgcccatcat gcccagcacc tgagttcctg gggggaccat cagtcttcct gttcccccca 1500
aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 1560
gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat 1620
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1680
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1740
aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagag 1800
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1860
acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1920
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1980
ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc 2040
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc cctgtctctg 2100
ggtaaataa 2109
<210> 26
<211> 702
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-CD46-IgG4Fc蛋白序列
<400> 26
Met Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp
1 5 10 15
Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr
20 25 30
Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val
35 40 45
Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys
50 55 60
Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys
85 90 95
Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys
100 105 110
Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu
115 120 125
Ala Met Glu Leu Ile Gly Lys Pro Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu
130 135 140
Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu
145 150 155 160
Ala Thr His Thr Ile Cys Asp Arg Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser
165 170 175
Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu
180 185 190
Asn Gly Gln Ala Val Pro Ala Asn Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln
195 200 205
Met His Phe Ile Cys Asn Glu Gly Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile
210 215 220
Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro
225 230 235 240
Pro Ile Cys Glu Lys Val Leu Cys Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn
245 250 255
Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala
260 265 270
Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu
275 280 285
Ile Gly Glu Ser Thr Ile Tyr Cys Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg
290 295 300
Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Gln Ile Ser Gly Phe Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala
325 330 335
Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp
340 345 350
Thr Ile Val Cys Asp Ser Asn Ser Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys
355 360 365
Cys Leu Lys Val Leu Pro Pro Ser Ser Thr Lys Pro Pro Ala Leu Ser
370 375 380
His Ser Val Ser Thr Ser Ser Thr Thr Lys Ser Pro Ala Ser Ser Ala
385 390 395 400
Ser Gly Pro Arg Pro Thr Tyr Lys Pro Pro Val Ser Asn Tyr Pro Gly
405 410 415
Tyr Pro Lys Pro Glu Glu Gly Ile Leu Asp Ser Leu Asp Val Trp Val
420 425 430
Ile Ala Val Ile Val Ile Ala Ile Val Val Gly Val Ala Val Ile Cys
435 440 445
Val Val Pro Tyr Arg Tyr Leu Gln Arg Arg Lys Lys Lys Gly Thr Tyr
450 455 460
Leu Thr Asp Glu Thr His Arg Glu Val Lys Phe Thr Ser Leu Pro Pro
465 470 475 480
Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
485 490 495
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
500 505 510
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
515 520 525
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
530 535 540
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
545 550 555 560
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
565 570 575
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
580 585 590
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
595 600 605
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
610 615 620
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
625 630 635 640
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
645 650 655
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
660 665 670
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
675 680 685
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
690 695 700
<210> 27
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-CD59-IgG4Fc核酸序列
<400> 27
atgggccgtc ccatcctgga agtgccagag agtgtaacag gaccttggaa aggggatgtg 60
aatcttccct gcacctatga ccccctgcaa ggctacaccc aagtcttggt gaagtggctg 120
gtacaacgtg gctcagaccc tgtcaccatc tttctacgtg actcttctgg agaccatatc 180
cagcaggcaa agtaccaggg ccgcctgcat gtgagccaca aggttccagg agatgtatcc 240
ctccaattga gcaccctgga gatggatgac cggagccact acacgtgtga agtcacctgg 300
cagactcctg atggcaacca agtcgtgaga gataagatta ctgagctccg tgtccagaaa 360
ctgcagtgct acaactgtcc taacccaact gctgactgca aaacagccgt caattgttca 420
tctgattttg atgcgtgtct cattaccaaa gctgggttac aagtgtataa caagtgttgg 480
aagtttgagc attgcaattt caacgacgtc acaacccgct tgagggaaaa tgagctaacg 540
tactactgct gcaagaagga cctgtgtaac tttaacgaac agcttgaaaa tggtgggaca 600
tccttatcag agaaaacagt tcttctgctg gtgactccat ttctggcagc agcctggagc 660
cttcatcccc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 720
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1320
ctctccctgt ctctgggtaa ataa 1344
<210> 28
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-CD59-IgG4Fc蛋白序列
<400> 28
Met Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp
1 5 10 15
Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr
20 25 30
Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val
35 40 45
Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys
50 55 60
Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys
85 90 95
Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys
100 105 110
Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Gln Cys Tyr Asn Cys Pro Asn
115 120 125
Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr Ala Val Asn Cys Ser Ser Asp Phe Asp
130 135 140
Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly Leu Gln Val Tyr Asn Lys Cys Trp
145 150 155 160
Lys Phe Glu His Cys Asn Phe Asn Asp Val Thr Thr Arg Leu Arg Glu
165 170 175
Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe Asn
180 185 190
Glu Gln Leu Glu Asn Gly Gly Thr Ser Leu Ser Glu Lys Thr Val Leu
195 200 205
Leu Leu Val Thr Pro Phe Leu Ala Ala Ala Trp Ser Leu His Pro Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 29
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG1 Fc核酸序列
<400> 29
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 420
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcacgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 30
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG1 Fc蛋白序列
<400> 30
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 31
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Knob mutant核酸序列
<400> 31
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcgagggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 420
aaccaggtca gcctgtactg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcacgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 32
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Knob mutant蛋白序列
<400> 32
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 33
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hole mutant核酸序列
<400> 33
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcgagggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 420
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcac cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcacgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 34
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Hole mutant蛋白序列
<400> 34
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 35
<211> 2118
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-CD46-IgG1 Fc knob核酸序列
<400> 35
atgggccgtc ccatcctgga agtgccagag agtgtaacag gaccttggaa aggggatgtg 60
aatcttccct gcacctatga ccccctgcaa ggctacaccc aagtcttggt gaagtggctg 120
gtacaacgtg gctcagaccc tgtcaccatc tttctacgtg actcttctgg agaccatatc 180
cagcaggcaa agtaccaggg ccgcctgcat gtgagccaca aggttccagg agatgtatcc 240
ctccaattga gcaccctgga gatggatgac cggagccact acacgtgtga agtcacctgg 300
cagactcctg atggcaacca agtcgtgaga gataagatta ctgagctccg tgtccagaaa 360
tgtgaggagc caccaacatt tgaagctatg gagctcattg gtaaaccaaa accctactat 420
gagattggtg aacgagtaga ttataagtgt aaaaaaggat acttctatat acctcctctt 480
gccacccata ctatttgtga tcggaatcat acatggctac ctgtctcaga tgacgcctgt 540
tatagagaaa catgtccata tatacgggat cctttaaatg gccaagcagt ccctgcaaat 600
gggacttacg agtttggtta tcagatgcac tttatttgta atgagggtta ttacttaatt 660
ggtgaagaaa ttctatattg tgaacttaaa ggatcagtag caatttggag cggtaagccc 720
ccaatatgtg aaaaggtttt gtgtacacca cctccaaaaa taaaaaatgg aaaacacacc 780
tttagtgaag tagaagtatt tgagtatctt gatgcagtaa cttatagttg tgatcctgca 840
cctggaccag atccattttc acttattgga gagagcacga tttattgtgg tgacaattca 900
gtgtggagtc gtgctgctcc agagtgtaaa gtggtcaaat gtcgatttcc agtagtcgaa 960
aatggaaaac agatatcagg atttggaaaa aaattttact acaaagcaac agttatgttt 1020
gaatgcgata agggttttta cctcgatggc agcgacacaa ttgtctgtga cagtaacagt 1080
acttgggatc ccccagttcc aaagtgtctt aaagtgctgc ctccatctag tacaaaacct 1140
ccagctttga gtcattcagt gtcgacttct tccactacaa aatctccagc gtccagtgcc 1200
tcaggtccta ggcctactta caagcctcca gtctcaaatt atccaggata tcctaaacct 1260
gaggaaggaa tacttgacag tttggatgtt tgggtcattg ctgtgattgt tattgccata 1320
gttgttggag ttgcagtaat ttgtgttgtc ccgtacagat atcttcaaag gaggaagaag 1380
aaaggcacat acctaactga tgagacccac agagaagtaa aatttacttc tctcgacaaa 1440
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcgagg ggggaccgtc agtcttcctc 1500
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 1560
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 1620
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 1680
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1740
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1800
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1860
gtcagcctgt actgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1920
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1980
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 2040
ttctcatgct ccgtgatgca cgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 2100
ctgtctccgg gtaaataa 2118
<210> 36
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-CD46-IgG1 Fc knob蛋白序列
<400> 36
Met Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp
1 5 10 15
Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr
20 25 30
Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val
35 40 45
Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys
50 55 60
Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys
85 90 95
Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys
100 105 110
Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Cys Glu Glu Pro Pro Thr Phe Glu
115 120 125
Ala Met Glu Leu Ile Gly Lys Pro Lys Pro Tyr Tyr Glu Ile Gly Glu
130 135 140
Arg Val Asp Tyr Lys Cys Lys Lys Gly Tyr Phe Tyr Ile Pro Pro Leu
145 150 155 160
Ala Thr His Thr Ile Cys Asp Arg Asn His Thr Trp Leu Pro Val Ser
165 170 175
Asp Asp Ala Cys Tyr Arg Glu Thr Cys Pro Tyr Ile Arg Asp Pro Leu
180 185 190
Asn Gly Gln Ala Val Pro Ala Asn Gly Thr Tyr Glu Phe Gly Tyr Gln
195 200 205
Met His Phe Ile Cys Asn Glu Gly Tyr Tyr Leu Ile Gly Glu Glu Ile
210 215 220
Leu Tyr Cys Glu Leu Lys Gly Ser Val Ala Ile Trp Ser Gly Lys Pro
225 230 235 240
Pro Ile Cys Glu Lys Val Leu Cys Thr Pro Pro Pro Lys Ile Lys Asn
245 250 255
Gly Lys His Thr Phe Ser Glu Val Glu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Ala
260 265 270
Val Thr Tyr Ser Cys Asp Pro Ala Pro Gly Pro Asp Pro Phe Ser Leu
275 280 285
Ile Gly Glu Ser Thr Ile Tyr Cys Gly Asp Asn Ser Val Trp Ser Arg
290 295 300
Ala Ala Pro Glu Cys Lys Val Val Lys Cys Arg Phe Pro Val Val Glu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Gln Ile Ser Gly Phe Gly Lys Lys Phe Tyr Tyr Lys Ala
325 330 335
Thr Val Met Phe Glu Cys Asp Lys Gly Phe Tyr Leu Asp Gly Ser Asp
340 345 350
Thr Ile Val Cys Asp Ser Asn Ser Thr Trp Asp Pro Pro Val Pro Lys
355 360 365
Cys Leu Lys Val Leu Pro Pro Ser Ser Thr Lys Pro Pro Ala Leu Ser
370 375 380
His Ser Val Ser Thr Ser Ser Thr Thr Lys Ser Pro Ala Ser Ser Ala
385 390 395 400
Ser Gly Pro Arg Pro Thr Tyr Lys Pro Pro Val Ser Asn Tyr Pro Gly
405 410 415
Tyr Pro Lys Pro Glu Glu Gly Ile Leu Asp Ser Leu Asp Val Trp Val
420 425 430
Ile Ala Val Ile Val Ile Ala Ile Val Val Gly Val Ala Val Ile Cys
435 440 445
Val Val Pro Tyr Arg Tyr Leu Gln Arg Arg Lys Lys Lys Gly Thr Tyr
450 455 460
Leu Thr Asp Glu Thr His Arg Glu Val Lys Phe Thr Ser Leu Asp Lys
465 470 475 480
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Glu Gly Gly Pro
485 490 495
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
500 505 510
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
515 520 525
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
530 535 540
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
545 550 555 560
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
565 570 575
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
580 585 590
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
595 600 605
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Tyr
610 615 620
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
625 630 635 640
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
645 650 655
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
660 665 670
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
675 680 685
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
690 695 700
Lys
705
<210> 37
<211> 2085
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-CD55-IgG1 Fc knob核酸序列
<400> 37
atgggccgtc ccatcctgga agtgccagag agtgtaacag gaccttggaa aggggatgtg 60
aatcttccct gcacctatga ccccctgcaa ggctacaccc aagtcttggt gaagtggctg 120
gtacaacgtg gctcagaccc tgtcaccatc tttctacgtg actcttctgg agaccatatc 180
cagcaggcaa agtaccaggg ccgcctgcat gtgagccaca aggttccagg agatgtatcc 240
ctccaattga gcaccctgga gatggatgac cggagccact acacgtgtga agtcacctgg 300
cagactcctg atggcaacca agtcgtgaga gataagatta ctgagctccg tgtccagaaa 360
gactgtggcc ttcccccaga tgtacctaat gcccagccag ctttggaagg ccgtacaagt 420
tttcccgagg atactgtaat aacgtacaaa tgtgaagaaa gctttgtgaa aattcctggc 480
gagaaggact cagtgatctg ccttaagggc agtcaatggt cagatattga agagttctgc 540
aatcgtagct gcgaggtgcc aacaaggcta aattctgcat ccctcaaaca gccttatatc 600
actcagaatt attttccagt cggtactgtt gtggaatatg agtgccgtcc aggttacaga 660
agagaacctt ctctatcacc aaaactaact tgccttcaga atttaaaatg gtccacagca 720
gtcgaatttt gtaaaaagaa atcatgccct aatccgggag aaatacgaaa tggtcagatt 780
gatgtaccag gtggcatatt atttggtgca accatctcct tctcatgtaa cacagggtac 840
aaattatttg gctcgacttc tagtttttgt cttatttcag gcagctctgt ccagtggagt 900
gacccgttgc cagagtgcag agaaatttat tgtccagcac caccacaaat tgacaatgga 960
ataattcaag gggaacgtga ccattatgga tatagacagt ctgtaacgta tgcatgtaat 1020
aaaggattca ccatgattgg agagcactct atttattgta ctgtgaataa tgatgaagga 1080
gagtggagtg gcccaccacc tgaatgcaga ggaaaatctc taacttccaa ggtcccacca 1140
acagttcaga aacctaccac agtaaatgtt ccaactacag aagtctcacc aacttctcag 1200
aaaaccacca caaaaaccac cacaccaaat gctcaagcaa cacggagtac acctgtttcc 1260
aggacaacca agcattttca tgaaacaacc ccaaataaag gaagtggaac cacttcaggt 1320
actacccgtc ttctatctgg gcacacgtgt ttcacgttga caggtttgct tgggacgcta 1380
gtaaccatgg gcttgctgac tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 1440
ctcgaggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 1500
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 1560
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 1620
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1680
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1740
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1800
tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgtact gcctggtcaa aggcttctat 1860
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1920
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1980
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcacga ggctctgcac 2040
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aataa 2085
<210> 38
<211> 694
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-CD55-IgG1 Fc knob蛋白序列
<400> 38
Met Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp
1 5 10 15
Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr
20 25 30
Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val
35 40 45
Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys
50 55 60
Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys
85 90 95
Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys
100 105 110
Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val
115 120 125
Pro Asn Ala Gln Pro Ala Leu Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp
130 135 140
Thr Val Ile Thr Tyr Lys Cys Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly
145 150 155 160
Glu Lys Asp Ser Val Ile Cys Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile
165 170 175
Glu Glu Phe Cys Asn Arg Ser Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser
180 185 190
Ala Ser Leu Lys Gln Pro Tyr Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly
195 200 205
Thr Val Val Glu Tyr Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser
210 215 220
Leu Ser Pro Lys Leu Thr Cys Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala
225 230 235 240
Val Glu Phe Cys Lys Lys Lys Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg
245 250 255
Asn Gly Gln Ile Asp Val Pro Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile
260 265 270
Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser
275 280 285
Phe Cys Leu Ile Ser Gly Ser Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro
290 295 300
Glu Cys Arg Glu Ile Tyr Cys Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly
305 310 315 320
Ile Ile Gln Gly Glu Arg Asp His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr
325 330 335
Tyr Ala Cys Asn Lys Gly Phe Thr Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr
340 345 350
Cys Thr Val Asn Asn Asp Glu Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu
355 360 365
Cys Arg Gly Lys Ser Leu Thr Ser Lys Val Pro Pro Thr Val Gln Lys
370 375 380
Pro Thr Thr Val Asn Val Pro Thr Thr Glu Val Ser Pro Thr Ser Gln
385 390 395 400
Lys Thr Thr Thr Lys Thr Thr Thr Pro Asn Ala Gln Ala Thr Arg Ser
405 410 415
Thr Pro Val Ser Arg Thr Thr Lys His Phe His Glu Thr Thr Pro Asn
420 425 430
Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly His
435 440 445
Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr Met Gly
450 455 460
Leu Leu Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
465 470 475 480
Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
485 490 495
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
500 505 510
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
515 520 525
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
530 535 540
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
545 550 555 560
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
565 570 575
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
580 585 590
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
595 600 605
Gln Val Ser Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
610 615 620
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
625 630 635 640
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
645 650 655
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
660 665 670
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
675 680 685
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690
<210> 39
<211> 1959
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-FH-IgG1 Fc hole核酸序列
<400> 39
atgggccgtc ccatcctgga agtgccagag agtgtaacag gaccttggaa aggggatgtg 60
aatcttccct gcacctatga ccccctgcaa ggctacaccc aagtcttggt gaagtggctg 120
gtacaacgtg gctcagaccc tgtcaccatc tttctacgtg actcttctgg agaccatatc 180
cagcaggcaa agtaccaggg ccgcctgcat gtgagccaca aggttccagg agatgtatcc 240
ctccaattga gcaccctgga gatggatgac cggagccact acacgtgtga agtcacctgg 300
cagactcctg atggcaacca agtcgtgaga gataagatta ctgagctccg tgtccagaaa 360
gaagattgca atgaacttcc tccaagaaga aatacagaaa ttctgacagg ttcctggtct 420
gaccaaacat atccagaagg cacccaggct atctataaat gccgccctgg atatagatct 480
cttggaaatg taataatggt atgcaggaag ggagaatggg ttgctcttaa tccattaagg 540
aaatgtcaga aaaggccctg tggacatcct ggagatactc cttttggtac ttttaccctt 600
acaggaggaa atgtgtttga atatggtgta aaagctgtgt atacatgtaa tgaggggtat 660
caattgctag gtgagattaa ttaccgtgaa tgtgacacag atggatggac caatgatatt 720
cctatatgtg aagttgtgaa gtgtttacca gtgacagcac cagagaatgg aaaaattgtc 780
agtagtgcaa tggaaccaga tcgggaatac cattttggac aagcagtacg gtttgtatgt 840
aactcaggct acaagattga aggagatgaa gaaatgcatt gttcagacga tggtttttgg 900
agtaaagaga aaccaaagtg tgtggaaatt tcatgcaaat ccccagatgt tataaatgga 960
tctcctatat ctcagaagat tatttataag gagaatgaac gatttcaata taaatgtaac 1020
atgggttatg aatacagtga aagaggagat gctgtatgca ctgaatctgg atggcgtccg 1080
ttgccttcat gtgaagaaaa atcatgtgat aatccttata ttccaaatgg tgactactca 1140
cctttaagga ttaaacacag aactggagat gaaatcacgt accagtgtag aaatggtttt 1200
tatcctgcaa cccggggaaa tacagcaaaa tgcacaagta ctggctggat acctgctccg 1260
agatgtacct tgaaagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcgag 1320
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 1380
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 1440
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1500
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1560
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1620
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1680
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1740
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1800
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctcaccagca agctcaccgt ggacaagagc 1860
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc acgaggctct gcacaaccac 1920
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 1959
<210> 40
<211> 652
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-FH-IgG1 Fc hole蛋白序列
<400> 40
Met Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp
1 5 10 15
Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr
20 25 30
Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val
35 40 45
Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys
50 55 60
Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys
85 90 95
Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys
100 105 110
Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro
115 120 125
Arg Arg Asn Thr Glu Ile Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr
130 135 140
Pro Glu Gly Thr Gln Ala Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser
145 150 155 160
Leu Gly Asn Val Ile Met Val Cys Arg Lys Gly Glu Trp Val Ala Leu
165 170 175
Asn Pro Leu Arg Lys Cys Gln Lys Arg Pro Cys Gly His Pro Gly Asp
180 185 190
Thr Pro Phe Gly Thr Phe Thr Leu Thr Gly Gly Asn Val Phe Glu Tyr
195 200 205
Gly Val Lys Ala Val Tyr Thr Cys Asn Glu Gly Tyr Gln Leu Leu Gly
210 215 220
Glu Ile Asn Tyr Arg Glu Cys Asp Thr Asp Gly Trp Thr Asn Asp Ile
225 230 235 240
Pro Ile Cys Glu Val Val Lys Cys Leu Pro Val Thr Ala Pro Glu Asn
245 250 255
Gly Lys Ile Val Ser Ser Ala Met Glu Pro Asp Arg Glu Tyr His Phe
260 265 270
Gly Gln Ala Val Arg Phe Val Cys Asn Ser Gly Tyr Lys Ile Glu Gly
275 280 285
Asp Glu Glu Met His Cys Ser Asp Asp Gly Phe Trp Ser Lys Glu Lys
290 295 300
Pro Lys Cys Val Glu Ile Ser Cys Lys Ser Pro Asp Val Ile Asn Gly
305 310 315 320
Ser Pro Ile Ser Gln Lys Ile Ile Tyr Lys Glu Asn Glu Arg Phe Gln
325 330 335
Tyr Lys Cys Asn Met Gly Tyr Glu Tyr Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val
340 345 350
Cys Thr Glu Ser Gly Trp Arg Pro Leu Pro Ser Cys Glu Glu Lys Ser
355 360 365
Cys Asp Asn Pro Tyr Ile Pro Asn Gly Asp Tyr Ser Pro Leu Arg Ile
370 375 380
Lys His Arg Thr Gly Asp Glu Ile Thr Tyr Gln Cys Arg Asn Gly Phe
385 390 395 400
Tyr Pro Ala Thr Arg Gly Asn Thr Ala Lys Cys Thr Ser Thr Gly Trp
405 410 415
Ile Pro Ala Pro Arg Cys Thr Leu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
420 425 430
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
435 440 445
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
450 455 460
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
465 470 475 480
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
485 490 495
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
500 505 510
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
515 520 525
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
530 535 540
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
545 550 555 560
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
565 570 575
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
580 585 590
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
595 600 605
Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
610 615 620
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
625 630 635 640
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
645 650
<210> 41
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-CD59-IgG1 Fc hole核酸序列
<400> 41
atgggccgtc ccatcctgga agtgccagag agtgtaacag gaccttggaa aggggatgtg 60
aatcttccct gcacctatga ccccctgcaa ggctacaccc aagtcttggt gaagtggctg 120
gtacaacgtg gctcagaccc tgtcaccatc tttctacgtg actcttctgg agaccatatc 180
cagcaggcaa agtaccaggg ccgcctgcat gtgagccaca aggttccagg agatgtatcc 240
ctccaattga gcaccctgga gatggatgac cggagccact acacgtgtga agtcacctgg 300
cagactcctg atggcaacca agtcgtgaga gataagatta ctgagctccg tgtccagaaa 360
ctgcagtgct acaactgtcc taacccaact gctgactgca aaacagccgt caattgttca 420
tctgattttg atgcgtgtct cattaccaaa gctgggttac aagtgtataa caagtgttgg 480
aagtttgagc attgcaattt caacgacgtc acaacccgct tgagggaaaa tgagctaacg 540
tactactgct gcaagaagga cctgtgtaac tttaacgaac agcttgaaaa tggtgggaca 600
tccttatcag agaaaacagt tcttctgctg gtgactccat ttctggcagc agcctggagc 660
cttcatcccg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cgagggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctcacc agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcacgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa taa 1353
<210> 42
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CRIg-CD59-IgG1 Fc hole蛋白序列
<400> 42
Met Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp
1 5 10 15
Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr
20 25 30
Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val
35 40 45
Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys
50 55 60
Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys
85 90 95
Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys
100 105 110
Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Gln Cys Tyr Asn Cys Pro Asn
115 120 125
Pro Thr Ala Asp Cys Lys Thr Ala Val Asn Cys Ser Ser Asp Phe Asp
130 135 140
Ala Cys Leu Ile Thr Lys Ala Gly Leu Gln Val Tyr Asn Lys Cys Trp
145 150 155 160
Lys Phe Glu His Cys Asn Phe Asn Asp Val Thr Thr Arg Leu Arg Glu
165 170 175
Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe Asn
180 185 190
Glu Gln Leu Glu Asn Gly Gly Thr Ser Leu Ser Glu Lys Thr Val Leu
195 200 205
Leu Leu Val Thr Pro Phe Leu Ala Ala Ala Trp Ser Leu His Pro Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Glu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 43
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 连接子1核酸序列
<400> 43
ggcggaggtg gatctggcgg aggtggatct ggcggaggtg gatct 45
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 连接子1蛋白序列
<400> 44
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 连接子2核酸序列
<400> 45
ggcggaggtg gaggcggagg tgga 24
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 连接子2蛋白序列
<400> 46
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 47
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 连接子3核酸序列
<400> 47
gaagctgccg caaaggaagc tgccgcaaag gaagctgccg caaag 45
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 连接子3蛋白序列
<400> 48
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
<210> 49
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 连接子4核酸序列
<400> 49
gttagtcaaa cttctaaatt aactcgtgcc gagacagttt tccctgatgt t 51
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 连接子4蛋白序列
<400> 50
Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp
1 5 10 15
Val

Claims (10)

1.融合蛋白，其包含:
(i)CRIg胞外结构域；
(ii)补体抑制结构域，所述补体抑制结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：factorH(FH)、CD55、CD46和CD59；和
(iii)增效结构域，所述增效结构域包含选自下组的蛋白质或其功能片段：IgG Fc结构域和人血清白蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述CRIg胞外结构域包含SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的融合蛋白，其中所述CRIg胞外结构域的C端与所述补体抑制结构域的N端直接或间接连接。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其中所述补体抑制结构域的C端与所述增效结构域的N端直接或间接连接。
5.一种或多种分离的核酸分子，其编码权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白或其片段。
6.载体，其包含权利要求5所述的核酸分子。
7.细胞，其包含权利要求6所述的载体，或者表达权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白。
8.制备权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白的方法，其包括以下的步骤：合成权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，和/或，在表达权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白的条件下培养权利要求7所述的细胞。
9.药物组合物，其包括权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白和任选地药学上可接受的载体。
10.权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白或权利要求9所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗靶向抑制补体激活相关的疾病。
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