JP7181878B2 - Ｐｄ－１に対するモノクローナル抗体及びその適用 - Google Patents

Ｐｄ－１に対するモノクローナル抗体及びその適用 Download PDF

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Description

本開示は、免疫学及び抗体工学の分野に関し、特にプログラム死（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ）－１（ＰＤ－１）に対するモノクローナル抗体及びその適用に関する。
現在、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）様抗体（特に天然に生じるＩｇＧ様抗体）の血清半減期を延長させ、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対するＩｇＧ様抗体の結合親和性を増加させる方法が依然として必要とされている。
ＣＤ２８に相同な免疫グロブリンスーパーファミリーの阻害メンバーとしてのプログラム死因子１（ＰＤ－１）（ＣＤ２７９、遺伝子ＩＤ：ＰＤＣＤ１、遺伝子バンク登録番号：ＮＰ＿００５００９）としても知られる）は、免疫系における刺激シグナル及び阻害シグナル間のバランスの制御及び末梢性トレランスの維持において重要な細胞表面受容体である。ＰＤ－１は、免疫グロブリン可変領域様細胞外ドメイン、並びに免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシン系スイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を有する細胞質ドメインからなる単量体型Ｉ型膜貫通タンパク質である。ＰＤ－１の発現は、例えばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）のシグナル伝達を介したリンパ球の活性化後に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び単球に対して誘導性である。ＰＤ－１は、２つの既知のリガンド、即ち細胞表面に発現されるＢ７ファミリーのメンバーであるＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１、ＣＤ２７４など）及びＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ、ＣＤ２７３など）を有する。リガンドを結合するとき、ＰＤ－１はホスファターゼ（ＳＨＰ－１及びＳＨＰ－２など）をその細胞内チロシンモチーフに会合し、続いてＴＣＲ又はＢＣＲのシグナル伝達を介して活性化されたエフェクター分子を脱リン酸化する。したがって、ＰＤ－１は、ＴＣＲ又はＢＣＲと同時に結合した場合にのみ、Ｔ細胞及びＢ細胞に阻害シグナルを伝達することができる。
ＩｇＧ様抗体など特異的にＰＤ－１を認識する抗体（即ち、ＰＤ－１に対するモノクローナル抗体）は、一般的に治療に使用されている。しかしながら、天然のＩｇＧ様抗体は、血液循環における短い有効性の期間と短い血清半減期を示し、処置の有効性に直接影響し、患者に副作用をもたらし、薬剤投与の頻度及び用量を増加させ、更に処置費用を増加させるので、天然のＩｇＧ様抗体は、まだ改善されるべきである。したがって、ＩｇＧ様抗体（特に、天然のＩｇＧ様抗体）の血清半減期を延長させ、ＦｃＲｎに対するＩｇＧ様抗体の結合親和性を増加させるためには、血清半減期を延長することと同様に、ＦｃＲｎに対する結合親和性を増加させることができる新しいＩｇＧ様抗体を開発することは非常に重要である。
本開示の実施形態は、関連技術に存在する問題の少なくとも１つを少なくともある程度まで解決することを目的とする。この目的のために、本開示の目的は、ＦｃＲｎに対する増加した結合親和性及び延長した血清半減期を示す、プログラム死－１（ＰＤ－１）に対する新規モノクローナル抗体を提供することである。本開示は、以下の発見及び研究に従って本発明者らによって達成されることに留意されるべきである。
ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ抗体のヒンジ領域のＮ末端におけるジスルフィド結合を切断することによって、パパインで加水分解されることができ、それによって３つのフラグメント、即ち抗体結合性の２つの同一のフラグメント（即ち、Ｆａｂ）及び結晶化できるフラグメント（即ち、Ｆｃ）を得ることができる。抗体の結晶化できるフラグメントＦｃは、様々なＦｃ受容体及びリガンドと相互作用し、それによって、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、ファゴサイトーシス、及び抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の開始、並びにトランスサイトーシスを介した細胞バリアによる抗体の輸送を含む、抗体に対して重要なエフェクター機能を与える。更に、Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ様抗体の血清半減期を維持するのに重要である。
胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、上皮細胞による免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の能動輸送を担う受容体であり、非共有結合で結合されている、α鎖サブユニットとβ鎖サブユニットからなるヘテロ二量体である。ＩｇＧ抗体のＦｃフラグメントは、２つの同一のポリペプチド鎖を含み、それぞれはその個々のＦｃＲｎ結合部位によって単一のＦｃＲｎ分子に結合する。成体哺乳動物において、ＩｇＧ抗体は、Ｆｃフラグメントを介してＦｃＲｎに結合し、それによってＩｇＧ抗体を分解から保護するので、Ｆｃフラグメントは血清抗体レベルを維持する上で極めて重要である。内皮細胞によって形質膜陥入された後にＦｃＲｎに結合したＩｇＧ抗体は、血流中を循環し、一方ＦｃＲｎに結合しなかったＩｇＧ抗体は、リソソームによって分解される。したがって、Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ抗体がＦｃＲｎにどれだけ強力に結合するかにおいて重要である。
上記に基づき、本発明者らは、対象としてのＰＤ－１を特異的に認識するＩｇＧ様抗体Ｈ２Ｌ２を用いて、ＩｇＧ様抗体の重鎖定常領域の配列（即ち、Ｆｃフラグメントの配列）を変更することにより、ＩｇＧ様抗体の血清半減期を延長させ、ＦｃＲｎに対するＩｇＧ様抗体の結合親和性を増加させることを試みた。即ち、本発明者らは、ＩｇＧ様抗体Ｈ２Ｌ２のＦｃフラグメント中のアミノ酸を変異させることによって、血清半減期及びＦｃＲｎに対する結合親和性を向上させることを目的とする。驚くべきことに、一連の実験計画及び研究の後、Ｈ２Ｌ２抗体のＦｃフラグメントにアミノ酸変異を導入することによって、ＦｃＲｎに対するＩｇＧ様抗体Ｈ２Ｌ２の結合親和性が改善されることができ、それによってＩｇＧ様抗体Ｈ２Ｌ２の血清半減期を増加させることが、本発明者らによって見出された。具体的には、ＩｇＧ様抗体Ｈ２Ｌ２のＦｃフラグメントは、アミノ酸２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置で、野生型ＩｇＧ様抗体（アミノ酸変異を含まない）におけるものとは異なるアミノ酸で変異し、それによって野生型ＩｇＧ様抗体と比べて延長した血清半減期を示す最適化された抗体を得て、抗原ＰＤ－１に対する結合親和性及び認識特異性が維持される。
したがって、一態様において、実施形態における本開示は、ＰＤ－１に対するモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。幾つかの実施形態においては、前記モノクローナル抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を有する胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）－結合部位を含む。
Figure 0007181878000001
 四角で囲まれているアミノ酸は、それぞれ、前記ＰＤ－１に対するモノクローナル抗体の重鎖定常領域のＦｃＲｎ－結合部位における２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置のアミノ酸を表す。即ち、実施形態においては、本開示のＰＤ－１に対するモノクローナル抗体（即ち、ＩｇＧ様抗体）は、前記重鎖定常領域のＦｃＲｎ－結合部位において、２５４番目の位置のアミノ酸トレオニン、３０８番目の位置のアミノ酸プロリン、及び４３４番目の位置のアミノ酸アラニンを有する。驚くべきことに、本発明者らは、前記ＰＤ－１に対するモノクローナル抗体が、ＦｃＲｎに対する強い結合親和性及び延長された血清半減期、並びに抗原ＰＤ－１に対する強い結合親和性及び良好な認識特異性を示すことを見出した。
幾つかの実施形態においては、前記ＰＤ－１に対するモノクローナル抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号３のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。本明細書では、Ｈ８Ｌ２と名付けられた前記ＰＤ－１に対するモノクローナル抗体は、野生型Ｈ２Ｌ２抗体と比べて、前記重鎖定常領域のＦｃＲｎ－結合部位において、２５４番目の位置におけるトレオニンへのアミノ酸変異、３０８番目の位置におけるプロリンへのアミノ酸変異、及び４３４番目の位置におけるアラニンへのアミノ酸変異を有する。したがって、本開示のＰＤ－１に対するモノクローナル抗体（即ち、Ｈ８Ｌ２）は、前記野生型Ｈ２Ｌ２抗体と比べて、ＦｃＲｎに対する強い結合親和性及び延長された血清半減期を示し、抗原ＰＤ－１に対する結合親和性及び認識特異性は維持される。
他の態様においては、実施形態における本開示は、単離されたポリヌクレオチドを提供する。幾つかの実施形態においては、前記ポリヌクレオチドは、上記に記載される抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする。幾つかの実施形態においては、前記単離されたポリヌクレオチドによってコードされた抗体は、ＦｃＲｎに対する強い結合親和性及び延長された血清半減期、並びに抗原ＰＤ－１に対する強い結合親和性及び良好な認識特異性を示す。
幾つかの実施形態においては、前記ポリヌクレオチドは、配列番号６のヌクレオチド配列又はその相補的配列を含み、前記配列番号６のヌクレオチド配列は、前記配列番号５のアミノ酸配列を有するＦｃＲｎ－結合部位をコードする。
Figure 0007181878000002
したがって、前記単離されたポリヌクレオチドによってコードされた抗体は、前記重鎖定常領域のＦｃＲｎ－結合部位において、アミノ酸２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置で、それぞれトレオニン、プロリン、及びアラニンを有する。更に、前記抗体は、ＦｃＲｎに対する強い結合親和性及び延長された血清半減期、並びに抗原ＰＤ－１に対する強い結合親和性及び良好な認識特異性を示す。
幾つかの実施形態においては、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２のヌクレオチド配列のものである。したがって、前記単離されたポリヌクレオチドによってコードされた抗体は、前記野生型Ｈ２Ｌ２抗体と比べて、前記重鎖定常領域のＦｃＲｎ－結合部位において、２５４番目の位置におけるトレオニンへのアミノ酸変異、３０８番目の位置におけるプロリンへのアミノ酸変異、４３４番目の位置におけるアラニンへのアミノ酸変異を有する。更に、本開示のＰＤ－１に対するモノクローナル抗体は、前記野生型Ｈ２Ｌ２抗体と比べて、ＦｃＲｎに対する強い結合親和性及び延長された血清半減期を示し、抗原ＰＤ－１に対する結合親和性及び認識特異性が維持される。
他の態様においては、実施形態における本開示は、発現ベクターを提供する。幾つかの実施形態においては、前記発現ベクターは、上記に記載されたポリヌクレオチドを含む。
更に他の態様においては、実施形態における本開示は、組換え細胞を提供する。幾つかの実施形態においては、前記組換え細胞は、上記に記載された発現ベクターを含む。
本発明者らは、上記に記載された組換え細胞を培養することにより、幾つかの実施形態に係るＰＤ－１を特異的に認識する抗体又はその抗原結合性フラグメントが効率的に合成され得ることを見出した。したがって、更なる態様において、実施形態における本開示は、上記に記載された抗体又はその抗原結合性フラグメントを調製するための方法を提供する。幾つかの実施形態においては、前記方法は、上記に記載された組換え細胞を培養することを含む。前記ＰＤ－１を特異的に認識する抗体又はその抗原結合性フラグメントに関して、上記に記載された特徴及び利点は、前記方法に等しく適用可能であり、本明細書では記載しない。
更に別の態様においては、実施形態における本開示は、抗体又はその抗原結合性フラグメントの調製における、上記に記載されたポリヌクレオチド、発現ベクター、又は組換え細胞の使用も提供し、前記抗体は、ＰＤ－１に対して特異的に結合する。したがって、本発明者らは、上記に記載されたポリヌクレオチド、発現ベクター、又は組換え細胞を用いることで、延長された血清半減期、ＦｃＲｎに対する強い結合親和性、並びに抗原ＰＤ－１に対する強い結合親和性及び良好な認識特異性を有する、ＰＤ－１に特異的に結合することができる抗体又はその抗原結合性フラグメントが効率的に生成されることができることを見出した。更に、その受容体に対するＰＤ－１の結合は、調製された抗体又はその抗原結合性フラグメントによって、効果的に遮断され、更にＰＤ－１受容体（ＳＨＰ１／２など）関連シグナル経路を遮断し、それによって効果的に腫瘍の増殖を抑制する。
更なる態様においては、実施形態における本開示は、Ｔ細胞の活性化及び増殖を促進する、サイトカインの発現及び分泌を制御する、又は抗腫瘍細胞を刺激し、より強い免疫応答を生じさせるための医薬の調製における、上記に記載された抗体又はその抗原結合性フラグメント、ポリヌクレオチド、発現ベクター、又は組換え細胞の使用を提供する。
更なる態様においては、実施形態における本開示は、医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態においては、前記医薬組成物は、上記に記載された抗体又はその抗原結合性フラグメント、ポリヌクレオチド、発現ベクター、又は組換え細胞を含む。したがって、前記医薬組成物は、Ｔ細胞の活性化及び増殖を効果的に促進すること、サイトカインの発現及び分泌を制御すること、又は抗腫瘍細胞を刺激し、より強い免疫応答を生じさせることにおいて有用であることができる。
更に他の態様においては、実施形態における本開示は、ＰＤ－１に結合することができる医薬を同定する方法を提供する。幾つかの実施形態においては、前記方法は、候補物質の存在下で、上記に記載された抗体又はその抗原結合性フラグメントをＰＤ－１又はそのフラグメントである抗原に接触させ、前記抗原に対する前記抗体又はその抗原結合性フラグメントの第１の結合量を決定することと；前記候補物質の非存在下で、上記で記載された抗体又はその抗原結合性フラグメントをＰＤ－１又はそのフラグメントである抗原に接触させ、前記抗原に対する前記抗体又はその抗原結合性フラグメントの第２の結合量を決定することと、を含み、前記第１の結合量よりも高い前記第２の結合量は、前記候補物質が、ＰＤ－１に結合する能力を有することの指標である。したがって、ＰＤ－１に結合する候補物質は、この方法を使用することによってスクリーニングされることができる。
ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４の両方を遮断することは、通常、標準的な腫瘍療法（例えば化学療法）と組み合わせて適用されることに留意すべきである。例えば、ＰＤ－１ブロッキング剤及びＣＴＬＡ－４ブロッキング剤の両方が化学療法下で組織に効果的に結合するであろう。抗ＰＤ－１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体の両方と組み合わせて用いられる場合、少ない用量で化学療法薬剤によって同じ有効性が達成され得ることが臨床試験によって実証されている。抗ＰＤ－１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体の両方と組み合わせたデカルバジン（Ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）（ドセタキセル、抗癌薬剤）又はインターロイキン－２（ＩＬ－２）がメラノーマの処置に有用であることが、文献で報告されている。一方で、化学療法薬剤は、細胞死を誘導し、次に腫瘍細胞によって発現される抗原のレベルを増加させる。他方で、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４の組み合わせた遮断は、放射線療法、外科手術、ホルモン療法などとの相乗効果を高め、これらはそれぞれ体内の抗原の供給源を拡大する。更に、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＣＴＬＡ－４抗体の両方と組み合わせて、血管新生抑制剤を用いて血管増殖を阻害し、それによって体内での抗原の発現増加からも生じ得る腫瘍細胞増殖を更に抑制することもできる。
更に別の態様では、実施形態における本開示は、合剤を提供する。幾つかの実施形態においては、前記合剤は、
ａ）上記に記載される抗体又はその抗原結合性フラグメント、ポリヌクレオチド、発現ベクター、又は組換え細胞と；
ｂ）ａ）とは異なる免疫増強剤と、
を含む。
したがって、前記合剤は、腫瘍に対するより良好な治療効果を達成する。
幾つかの実施形態においては、前記ａ）とは異なる免疫増強剤は、抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）抗体、抗ＣＤ４０抗体、ブデソニド、及びサリチレートからなる群から選択される少なくとも１つを含み；任意に、前記サリチレートは、スルファサラジン、オルサラジン、バルサラジド、及びメサラミンの少なくとも１つを含む。
更に、本明細書で用いられる「アミノ酸」という用語は、特定の定義された位置に存在することができる２０個の天然アミノ酸又はその非天然類似体の任意の１つを意味することに留意されたい。前記２０個の天然アミノ酸は、３文字コード又は１文字コードに略されることができる。
Figure 0007181878000003
２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置のアミノ酸などの「ｎ番目の位置のアミノ酸」という表現は、タンパク質のアミノ酸配列における特定のアミノ酸位置を指す。本開示のＦｃフラグメントについて、アミノ酸位置は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従って番号付けされることができる。
本開示の更なる態様及び利点は、部分的に以下の説明に記載され、その一部は、その説明から明らかになるか、又は本開示の実施から理解されるであろう。
本開示の上記及び／又は追加の態様及び利点は、以下の図と組み合わせた実施例の記載から明らかとなり、容易に理解されるであろう。
図１は、本開示の幾つかの実施形態に係るＰＤ－１に結合しているＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体のＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。 図２は、本開示の幾つかの実施形態に係る、ＰＤ－１の結合においてＰｄＬ１と競合しているＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の競合ＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。 図３は、本開示の幾つかの実施形態に係る、ＰＤ－１の結合においてＰｄＬ２と競合しているＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の競合ＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。 図４は、本開示の幾つかの実施形態に係るＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の速度論的特性パラメータを示すグラフである。 図５は、本開示の幾つかの実施形態に係るＰＤ－１タンパク質の活性化のブロッキングを介して、Ｈ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の刺激下でＴ細胞によって分泌されたＩＬ－２の含有量を示すグラフである。 図６は、本開示の幾つかの実施形態に係るＰＤ－１タンパク質の活性化のブロッキングを介して、Ｈ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２の刺激下でＴ細胞によって分泌されたＩＦＮγの含有量を示すグラフである。 図７は、本開示の幾つかの実施形態に係るカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の血清濃度研究においてＥＬＩＳＡによって測定されたＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の濃度―時間の曲線を示すグラフである。 図８は、本開示の幾つかの実施形態に係るカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の薬物動態研究において、１ｍｇ／ｋｇのＨ８Ｌ２抗体の投与後の個々の血漿濃度を示すグラフである。 図９は、本開示の幾つかの実施形態に係るカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の薬物動態研究において、３ｍｇ／ｋｇのＨ８Ｌ２抗体の投与後の個々の血漿濃度を示すグラフである。 図１０は、本開示の幾つかの実施形態に係るカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の薬物動態研究において、１０ｍｇ／ｋｇのＨ８Ｌ２抗体の投与後の個々の血漿濃度を示すグラフである。 図１１は、本開示の幾つかの実施形態に係るカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の薬物動態研究において、１０ｍｇ／ｋｇの野生型のＨ２Ｌ２抗体の投与後の個々の血漿濃度を示すグラフである。 図１２は、本開示の幾つかの実施形態に係るカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の薬物動態研究において、野生型Ｈ２Ｌ２抗体及びＨ８Ｌ２抗体の有効平均半減期を示すグラフである。 図１３は、本開示の実施形態に係るＨ８Ｌ２抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示すグラフである。 図１４は、本開示の実施形態に係るＨ８Ｌ２抗体のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示すグラフである。 図１５は、本開示の実施形態に係るＦＡＣＳ法で検出されたＰＤ－１に対するＨ８Ｌ２抗体の結合活性を示すグラフである。 図１６は、本開示の実施形態に係るＦＡＣＳ法で検出されたＰＤ－Ｌ１の存在下で、ＰＤ－１に対するＨ８Ｌ２抗体の結合活性を示すグラフである。 図１７は、本開示の実施形態に係るＡＤＣＣ効果及びＣＤＣ効果の研究において、ＦｃγＲＩＩＩａとＨ８Ｌ２抗体との結合係数の検出結果を示すグラフである。 図１８は、本開示の実施形態に係るＡＤＣＣ効果及びＣＤＣ効果の研究において、Ｃ１ｑとＨ８Ｌ２抗体の結合係数の検出結果を示すグラフである。
本開示の実施例を詳細に参照する。当業者であれば、以下の実施例は説明のためのものであり、本開示の範囲を限定するものと解釈されることができないことを理解するであろう。具体的な技術又は条件が実施例において明記されていない場合、当技術分野における文献（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｈｕａｎｇ ＰＴにより翻訳）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓを参照）に記載されている技術又は条件に従って、又は製品の説明書に従って、工程が行われる。試薬又は機器の製造元が明記されていない場合、試薬又は機器は、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｃｏｍｐａｎｙから商業的に利用可能であることがある。
実施例１ Ｈ８Ｌ２抗体のタンパク質発現
ヒト化Ｈ２Ｌ２抗体（ＰＤ－１に対するＩｇＧ様抗体）において、重鎖定常領域のＦｃＲｎ－結合部位における２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置のアミノ酸は、それぞれトレオニン、プロリン、及びアラニンに変異し、ＰＤ－１に対するＩｇＧ様抗体Ｈ８Ｌ２（即ち、Ｈ８Ｌ２抗体）として名付けられたバリアントを得る。
即ち、目的のＨ８Ｌ２抗体は、重鎖定常領域のＦｃＲｎ－結合部位におけるアミノ酸位置２５４番目でトレオニン変異、アミノ酸位置３０８番目でプロリン変異、及びアミノ酸位置４３４番目でアラニン変異を有し、残ったアミノ酸は、ヒト化Ｈ２Ｌ２抗体と比較して変わらなかった。
実際には、遺伝子合成を介して形成されたヒト化Ｈ８Ｌ２抗体をコードする核酸配列を発現ベクター中で構築し、哺乳類細胞２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、哺乳類細胞２９３細胞によって、ヒト化Ｈ８Ｌ２抗体が発現され、分泌された。次いで、得られたヒト化Ｈ８Ｌ２抗体をプロテイン－Ａアフィニティーカラムで精製し、精製されたヒト化Ｈ８Ｌ２抗体を得て、標準的なＳＤＳ－ＰＡＧＥ法及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ法による品質同定後の薬理学研究に使用される。
これらの中でも、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法及びＳＥＣ－ＨＰＬＣ法によって同定されたヒト化Ｈ８Ｌ２抗体の結果をそれぞれ図１３及び図１４に示す。
図１３は、Ｈ８Ｌ２抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示し、レーン１は、還元されていないＨ８Ｌ２を指し、レーン２は、還元されたＨ８Ｌ２を指し、レーン３は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を指し、レーンＭは、ＤＮＡスタンダード（１４．４ＫＤａ、１８．４ＫＤａ、２５ＫＤａ、３５ＫＤａ、４５ＫＤａ、６６．２ＫＤａ、及び１１６ＫＤａを含む）を指す。候補物質抗体１８Ａ１０ Ｈ８Ｌ２は、全体として高い純度のものであることとが理解できる。
図１４は、Ｈ８Ｌ２抗体のＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示し、候補物質抗体１８Ａ１０ Ｈ８Ｌ２は、積分定量によって確認された後、９８．１９％の純度のものであることが理解できる。
上記に記載されるように、ヒト化Ｈ２Ｌ２抗体とヒト化Ｈ８Ｌ２抗体との間の差は、重鎖定常領域のＦｃＲｎ－結合部位における２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置のアミノ酸のみにあるので、参考までに単にＨ８Ｌ２抗体のアミノ酸配列を提供する。
ヒト化Ｈ８Ｌ２抗体の重鎖は、下記のアミノ酸配列のものである。
Figure 0007181878000004
 Ｈ８Ｌ２抗体の重鎖可変領域に下線を引き、Ｈ８Ｌ２抗体の変異部位（Ｈ２Ｌ２抗体に対して）は、四角で囲み、それぞれ、重鎖定常領域のＦｃＲｎ－結合部位における２５４番目、３０８番目、及び４３４番目の位置のアミノ酸変異である。
具体的には、Ｈ８Ｌ２抗体の重鎖定常領域のＦｃＲｎ－結合部位におけるアミノ酸変異について、ヒト化Ｈ２Ｌ２抗体と比較して、２５４番目の位置のアミノ酸は、セリンからトレオニンに変異し、３０８番目の位置のアミノ酸は、バリンからプロリンに変異し、４３４番目の位置のアミノ酸は、アスパラギンからアラニンに変異している。
ヒト化Ｈ８Ｌ２抗体の重鎖をコードする核酸配列は、下記の通りである。
Figure 0007181878000005
 重鎖可変領域をコードする核酸配列に線が引かれる。
ヒト化Ｈ８Ｌ２抗体の軽鎖は、下記のアミノ酸配列のものである。
Figure 0007181878000006
 Ｈ８Ｌ２抗体の軽鎖可変領域に下線が引かれる。
ヒト化Ｈ８Ｌ２抗体の軽鎖をコードする核酸は、下記のヌクレオチド配列のものである。
Figure 0007181878000007
 軽鎖可変領域をコードする核酸配列に線が引かれる。
実施例２ 組み換えのヒト化Ｈ８Ｌ２抗体のＥＬＩＳＡ実験
ヒト化Ｈ２Ｌ２抗体及び実施例１で調製したヒト化Ｈ８Ｌ２抗体を、以下に詳細に記載されるように、比較のためにＥＬＩＳＡ結合実験及び競合ＥＬＩＳＡ実験に付した。
２．１ １８Ａ１０ Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０ Ｈ２Ｌ２抗体のＥＬＩＳＡ結合実験
具体的には、ＥＬＩＳＡ結合実験を下記の通り行った。
工程ａ）：抗体コーティング
ＥＬＩＳＡプレートを０．２５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のＰＤ－１－ｈｉｓ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
工程ｂ）：ブロッキング
ＰＢＳバッファ中１％ＢＳＡを用いて、ＰＤ－１－ｈｉｓ抗原で塗布したＥＬＩＳＡプレートを３７℃で２時間ブロッキングし、１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。
工程ｃ）：一次抗体によるインキュベーション
１８Ａ１０ Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０ Ｈ２Ｌ２抗体を、それぞれ２μｇ／ｍｌから１：３ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。ブランクコントロールとしてのＰＢＳ溶液と共に、１８Ａ１０ Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０ Ｈ２Ｌ２抗体のそれぞれの７つの勾配抗体溶液を、ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
工程ｄ）：二次抗体とのインキュベーション
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、二次抗体として、１：１００００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）（ウェル当たり１００μｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
工程ｅ）発色（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ）
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）としての３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウェル当たり１００μｌ添加し、５分間～１０分間室温でインキュベーションした。
工程ｆ）：発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
工程ｇ）：読み（ｒｅａｄｉｎｇ）
マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの波長で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
図１は結果を示し、ＰＤ－１に結合するＨ８Ｌ２及びＨ２Ｌ２のＥＣ５０値は、それぞれ０．０４ｎＭ及び０．０５ｎＭであると算出される。図１から分かるように、ＦｃＲＮ－結合部位における変異は、ＰＤ－１への抗体の結合に影響を及ぼさない。
Figure 0007181878000008
２．２ ＰＤＬ１と、１８Ａ１０ Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０ Ｈ２Ｌ２抗体との競合ＥＬＩＳＡ実験
具体的には、以下のようにして競合ＥＬＩＳＡ実験を行った。
工程ａ）：抗体コーティング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを０．５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり５０μｌ）の濃度のＰＤ－１－ｈＩｇＧＦｃ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
工程ｂ）：ブロッキング
ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、３７℃で２時間、ＰＢＳバッファ中１％ＢＳＡで、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをブロッキングし、１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで３回洗浄した。
工程ｃ）：一次抗体によるインキュベーション
１８Ａ１０ Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０ Ｈ２Ｌ２抗体を、それぞれ６μｇ／ｍｌから１：３ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。ブランクコントロールとしてのＰＢＳ溶液と共に、１８Ａ１０ Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０ Ｈ２Ｌ２抗体のそれぞれの７つの勾配抗体溶液（ウェル当たり５０μｌ）を、ブロッキングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、室温で１０分間インキュベーションした。
工程ｄ）：リガンドとのインキュベーション
ウェル当たり５０μｌで、０．６μｇ／ｍｌのＰＤＬ１－ｍＩｇＧ２ａＦｃ溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
工程ｅ）：二次抗体とのインキュベーション
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、二次抗体としての１：５０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｈ＋Ｌ）（ウェル当たり５０μｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
工程ｆ）：発色
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり５０μｌ添加し、５分間～１０分間室温でインキュベーションした。
工程ｇ）：発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
工程ｈ）：読み
マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの波長で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
図２は結果を示し、ＰＤ－Ｌ１の存在下でＰＤ－１に競合的に結合するＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体のＥＣ５０値は、それぞれ０．４７４ｎＭ及び０．７８３ｎＭであり、ＦｃＲＮ－結合部位における変異は、ＰＤ－Ｌ１の存在下で、ＰＤ－１に対する競合的な結合に影響を及ぼさないことを実証する。
Figure 0007181878000009
２．３ ＰＤＬ２と、１８Ａ１０ Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０ Ｈ２Ｌ２抗体との競合ＥＬＩＳＡ実験
具体的には、以下のようにして競合ＥＬＩＳＡ実験を行った。
工程ａ）：抗体コーティング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１．０μｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度のＰＤ－１－ｈＩｇＧＦｃ抗原で塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。
工程ｂ）：ブロッキング
ＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、３７℃で２時間、ＰＢＳバッファ中１％ＢＳＡで、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをブロッキングし、１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有する１×ＰＢＳＴバッファで４回洗浄した。
工程ｃ）：一次抗体によるインキュベーション
１８Ａ１０ Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０ Ｈ２Ｌ２抗体を、それぞれ２０μｇ／ｍｌから１：３ずつ段階希釈し、７つの勾配抗体溶液を得た。ブランクコントロールとしてＰＢＳ溶液と共に、１８Ａ１０ Ｈ８Ｌ２抗体及び１８Ａ１０ Ｈ２Ｌ２抗体のそれぞれの７つの勾配抗体溶液（ウェル当たり５０μｌ）を、ブロッキングした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ添加し、室温で１０分間インキュベーションした。
工程ｄ）：リガンドとのインキュベーション
１．０μｇ／ｍｌのＰＤＬ２－ｈｉｓ ｔａｇ溶液をウェル当たり５０μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
工程ｅ）：二次抗体とのインキュベーション
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで５回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、１：７５０希釈（ウェル当たり５０μｌ）で、二次抗体としてのＨＲＰ－結合モノクローナルマウス抗ｈｉｓ ｔａｇを添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。
工程ｆ）：発色
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで６回洗浄し、再び穏やかに叩いて乾燥させた後、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり１００μｌ添加し、３０分間室温でインキュベーションした。
工程ｇ）：発色の終了
ウェル当たり５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４溶液を添加して、発色を終了させた。
工程ｈ）：読み
マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの波長で各ウェル中の溶液の吸光度を測定した。
図３は結果を示し、ＰＤＬ２の存在下でＰＤ－１に競合的に結合するＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体のＥＣ５０値は、それぞれ１．８３ｎＭ及び１．５８ｎＭであり、ＦｃＲＮ－結合部位における変異は、ＰＤＬ２の存在下で、ＰＤ－１に対する競合的な結合に影響を及ぼさないことを実証する。
Figure 0007181878000010
２．４ カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＰＤ１－ｈＦｃに対するＨ８Ｌ２抗体の結合活性
この実験では、非ヒト抗原（カニクイザルのＰＤ１など）に対するＨ８Ｌ２抗体の結合活性をＥＬＩＳＡ法で検出し、Ｈ８Ｌ２抗体と非ヒト抗原との交差反応性を反映させた。
０．１２５μｇ／ｍｌ（ウェル当たり５０μｌ）の濃度のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＰＤ１－ｈＦｃで、ＥＬＩＳＡプレートを塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。ＰＢＳＴバッファで１回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、ＰＢＳバッファ中１％ＢＳＡ（ウェル当たり３００μｌ）でＥＬＩＳＡプレートを３７℃で２時間ブロッキングした。ＰＢＳバッファで、ブロックされたＥＬＩＳＡプレートを１回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。プレート中で、ブランクコントロールとしてのＰＢＳ溶液と共に、開始濃度として７ｎＭに希釈したＨ８Ｌ２抗体を１：３で更に段階希釈し、続いてブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートにウェル当たり１００μｌで添加し、３７℃で３０分間インキュベーションし、二重測定で行った。ＰＢＳＴバッファでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄した後、二次抗体としてのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２－ＨＲＰをウェル当たり５０μｌ添加し、３７℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳＴバッファでＥＬＩＳＡプレートを４回洗浄し、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり５０μｌ添加し、暗所において５分間室温でインキュベーションした。２ＭのＨ２ＳＯ４溶液をウェル当たり５０μｌ添加し、発色を終了し、マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの波長でＥＬＩＳＡプレートを測定し、各ウェルにおける溶液の吸光度を得て、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１ソフトウェアによるデータ分析と処理を行った。
波長４５０ｎｍにおけるカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＰＤ１－ｈＦｃに対するＨ８Ｌ２抗体の結合活性の検出結果を下記の表に示す。
Figure 0007181878000011
表中の４５０ｎｍの波長における結果は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）のＰＤ１－ｈＦｃに結合するＨ８Ｌ２抗体のＥＣ５０値が０．２１９ｎＭであることを示す。
２．５ ラットのＰＤ１に対するＨ８Ｌ２抗体の結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
この実験において、非ヒト抗原（ラットのＰＤ１など）に対するＨ８Ｌ２抗体の結合活性をＥＬＩＳＡ法によって検出し、Ｈ８Ｌ２抗体と非ヒト抗原との交差反応性を反映させた。
１μｇ／ｍｌ（ウェル当たり５０μｌ）の濃度のラットのＰＤ１で、ＥＬＩＳＡプレートを塗布し、４℃で一晩インキュベーションした。ＰＢＳＴバッファで１回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた後、ＰＢＳバッファ中１％ＢＳＡ（ウェル当たり３００μｌ）でＥＬＩＳＡプレートを３７℃で２時間ブロッキングした。ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴバッファで３回洗浄し、穏やかに叩いて乾燥させた。プレート中で、ブランクコントロールとしてのＰＢＳ溶液と共に、開始濃度として７ｎＭに希釈したＨ８Ｌ２抗体を１：３で更に段階希釈し、続いてブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートにウェル当たり１００μｌ添加し、３７℃で３０分間インキュベーションし、二重測定で行った。ＰＢＳＴバッファでＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄した後、二次抗体としてのヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰをウェル当たり５０μｌ添加し、３７℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳＴバッファでＥＬＩＳＡプレートを４回洗浄し、発色剤としてのＴＭＢをウェル当たり５０μｌ添加し、暗所において５分間室温でインキュベーションした。２ＭのＨ２ＳＯ４溶液をウェル当たり５０μｌ添加し、発色を終了し、マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの波長でＥＬＩＳＡプレートを測定し、各ウェルにおける溶液の吸光度を得て、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ６．２．１ソフトウェアによるデータ分析及び処理を行った。
波長４５０ｎｍにおけるラットのＰＤ１に対するＨ８Ｌ２抗体の結合活性の検出結果を下記の表に示す。
Figure 0007181878000012
表中の４５０ｎｍの波長における結果は、ラットのＰＤ１とＨ８Ｌ２抗体との間にほとんど結合活性がないことを示す。
実施例３ Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分子間相互作用機器を用いたＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の速度論的特性パラメータの決定
比較のために、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分子間相互作用機器を用いて、実施例１で調製したＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の速度論的特性パラメータを決定し、詳細を下記に記載する。
ＳＡセンサーの表面にビオチン標識ＰＤ－１抗原を固定化した。ＰＢＳＴバッファで平衡化した後、ＰＢＳＴを用いて１：３で段階希釈したＨ８Ｌ２抗体（それぞれ２００ｎＭ、６６．６７ｎＭ、２２．２２ｎＭ、７．４１ｎＭ、２．４７ｎＭ、０．８２ｎＭ、０．２７ｎＭ、及び０ｎＭ）をビオチン標識ＰＤ－１抗原に結合するためのＳＡセンサーに適用し、その後、解離（ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）のためにＰＢＳＴをＳＡセンサーに適用した。Ｈ２Ｌ２抗体についてのアッセイは、Ｈ８Ｌ２抗体と同じである。Ｈ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の速度論的特性パラメータの結果を図４に示し、ＦｃＲＮ－結合部位における変異は抗体の速度論的特性パラメータに影響を及ぼさないことが理解できる。
実施例４：ＦＡＣＳ法によるＨ８Ｌ２抗体の直接的及び競合的結合活性の検出
以下に詳細に記載されるＦＡＣＳ法を用いることによって、実施例１で調製したＨ８Ｌ２抗体の直接的及び競合的結合活性を検出した。
４．１ ＦＡＣＳ法を用いたＰＤ１に対するＨ８Ｌ２抗体の結合活性の検出
この実験においては、実験細胞としてＰＤ１と安定的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞株を用いて、細胞膜の表面上のＰＤ１に対するＨ８Ｌ２抗体の結合活性をＦＡＣＳ法によって検出した。
具体的には、以下のようにして結合実験を行った。
工程ａ）ＰＤ１を安定的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞株を消化し、１０６細胞／ｍｌの最終濃度の細胞懸濁液を得るために数えた。
工程ｂ）各群について１．５ｍｌのＥＰチューブに、１００μｌの細胞懸濁液を添加し、１群当たり１０５細胞とした。
工程ｃ）個々の群に、Ｈ８Ｌ２抗体（０．０１ｎＭ、０．１０ｎＭ、１．００ｎＭ、２．５０ｎＭ、５．００ｎＭ、１０．００ｎＭ、２０．００ｎＭ、及び５０．００ｎＭの濃度）をそれぞれ添加し、氷上で１時間インキュベーションした。
工程ｄ）各群を遠心分離した後、ＰＢＳバッファで１回洗浄した。
工程ｅ）各群に、二次抗体としてのＦＩＴＣヤギ抗ヒトＩｇＧを添加し、氷上で暗所にて１時間インキュベーションした。
工程ｆ）４０００ｒ／分間で、５分間低温で各群を遠心分離した後、ＰＢＳバッファで１回洗浄し、２００μｌの懸濁用のＰＢＳを添加して、オンライン検出用の懸濁液を得た。
図１５及び下記の表は、ＦＡＣＳ法を用いて検出された細胞膜の表面上のＰＤ１に対するＨ８Ｌ２抗体の結合活性の結果を示す。
Figure 0007181878000013
図１５及び表は、ＰＤ－１に結合するＨ８Ｌ２抗体のＥＣ５０値が３．４０ｎＭであることを示す。
４．２ ＦＡＣＳ法を用いたＰＤＬ１存在下でのＰＤ１に対するＨ８Ｌ２抗体の結合活性の検出
この実験では、実験細胞としてＰＤ１を安定にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞株を用いて、細胞膜表面上のＰＤ１へのＰＤＬ１（即ち、競合タンパク質）の結合活性をＦＡＣＳ法で検出し、ＰＤＬ１の存在下でのＰＤ１へのＨ８Ｌ２抗体の結合活性を反映させた。
具体的には、以下のようにして結合実験を行った。
工程ａ）ＰＤ１を安定的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞株を消化し、１０６細胞／ｍｌの最終濃度の細胞懸濁液を得るために数えた。
工程ｂ）各群について１．５ｍｌのＥＰチューブに、１００μｌの細胞懸濁液を添加し、１群当たり１０５細胞とした。
工程ｃ）個々の群に、Ｈ８Ｌ２抗体（０．１０ｎＭ、１．００ｎＭ、２．５０ｎＭ、５．００ｎＭ、１０．００ｎＭ、２０．００ｎＭ、５０．００ｎＭ、及び１００．００ｎＭの濃度）をそれぞれ添加し、氷上で０．５時間インキュベーションした。
工程ｄ）リガンドＰＤＬ１－ｍＦｃを２０ｎＭの最終濃度で各群に添加し、続いて更に０．５時間インキュベーションした。
工程ｅ）各群を遠心分離した後、ＰＢＳバッファで１回洗浄した。
工程ｆ）各群に、二次抗体としてのＦＩＴＣヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭを添加し、氷上で暗所にて１時間インキュベーションした。
工程ｇ）４０００ｒ／分間で、５分間低温で各群を遠心分離した後、ＰＢＳバッファで１回洗浄し、２００μｌの懸濁用のＰＢＳを添加して、オンライン検出用の懸濁液を得た。
図１６及び以下の表は、ＦＡＣＳ法を用いて検出されたＰＤＬ１の存在下での細胞膜表面上のＰＤ１に対するＨ８Ｌ２抗体の結合活性の結果を示す。
Figure 0007181878000014
図１６及び表は、ＰＤＬ１の存在下で、ＰＤ－１に結合する１８Ａ１０ Ｈ８Ｌ２抗体のＥＣ５０値が１９．６５ｎＭであることを示す。
実施例５ 混合リンパ反応下のＰＤ１に対する抗体の生物学的活性のアッセイ
比較のために、混合リンパ反応（ＭＬＲ）により、実施例１で調製したＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の刺激下で、ＩＬ－２分泌及びＩＦＮγ分泌についてＴリンパ球を分析し、以下に詳細に記載される。
ＭＬＲについては、ＤＣ細胞の抗原提示機能下で、Ｔ細胞がＩＬ－２及びＩＦＮγを分泌するように、異なるヒト供給源からのＴ細胞（ＴＣ）及び樹状細胞（ＤＣ）を混合した。具体的には、サイトカインＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４の誘導下で血中の単球が未成熟ＤＣ細胞に分化し、その後、未成熟ＤＣ細胞が腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の刺激を介して成熟するように誘導された。続いて、成熟ＤＣ細胞と同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）ＴＣ細胞を混合し、５日間培養した後、細胞上清中の分泌されたＩＬ－２及びＩＦＮγを決定した。この実施例では、ＴＣ細胞（ウェル当たり１×１０５）及び成熟ＤＣ細胞（ウェル当たり１×１０４）を９６ウェルプレート中で混合し、その後個々の抗体の存在下で、８つの勾配濃度（即ち、１０μＭ～０．０９７６５６２５ｎＭ）で５日間培養し、その後細胞上清中のＩＬ－２の量をＩＬ－２アッセイキットで検出した。同様に、ＴＣ細胞（ウェル当たり１×１０５）及び成熟ＤＣ細胞（ウェル当たり１×１０４）を９６ウェルプレート中で混合し、その後個々の抗体の存在下で、５つの勾配濃度（即ち、３００ｎＭ～０．１ｎＭ）で５日間培養し、その後、細胞上清中のＩＦＮγの量をＩＦＮγアッセイキットで検出した。
図５は、それぞれＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の刺激下でＴ細胞によって分泌されたＩＬ－２の含有量を示し、Ｈ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体は、Ｔ細胞を刺激し、効果的にＩＬ－２を分泌することができることが分かり、ＦｃＲＮ－結合部位における変異が抗体の刺激下で、Ｔ細胞によるＩＬ－２分泌に影響を及ぼさないことを実証する。
図６は、それぞれＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の刺激下でＴ細胞によって分泌されたＩＦＮγの含有量を示し、Ｈ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体は、Ｔ細胞を刺激し、効果的にＩＦＮγを分泌することができることが分かり、ＦｃＲＮ－結合部位における変異が抗体の刺激下で、Ｔ細胞によるＩＦＮγ分泌に影響を及ぼさないことを実証する。図６中の「ＩｇＧ」は、コントロールとしてのアイソタイプ抗体である。
実施例６ カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の血清濃度研究
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）における、実施例１で調製したＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の血清濃度を比較のためにそれぞれ検出し、以下に詳細に記載する。
４頭のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）について、１群当たり２頭の動物で、それらの体重として２つの群に無作為に分け、それぞれＨ８Ｌ２群とＨ２Ｌ２群と名付けた。それぞれ投与前、及び投与後５分間、５時間、２４時間、７２時間、１６８時間、及び２４０時間で、全血をサンプリングして、１ｍｇ／ｋｇの用量で各群をその個々の抗体で静脈内注射により投与した。血清を全血から分離し、Ｈ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の含有量をそれぞれＥＬＩＳＡ法によって測定し、図７及び下記の表で見ることができる。
Figure 0007181878000015
実施例７ カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の薬物動態研究
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）における、実施例１で調製したＨ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の薬物動態を比較のために試験し、詳細を下記に記載する。
２４頭のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）について、群当たり６頭の動物（各群において雄と雌半分）で、それらの体重として４つの群に無作為に分け、それぞれＨ２Ｌ２群（１０ｍｇ／ｋｇ）と、異なる投与量における３つのＨ８Ｌ２群（投与量が低い１ｍｇ／ｋｇ、中程度の３ｍｇ／ｋｇ、及び高い１０ｍｇ／ｋｇ）と名付けた。静脈内注射により、各群にその個々の抗体を投与し、それぞれ投与前、及び投与後５分間、３０分間、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、１４４時間、及び２１６時間で全血をサンプリングした。全血から血清を分離し、ＰｈｏｅｎｉｘＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）６．４によって計算された関連する薬物動態パラメータを用いて、Ｈ８Ｌ２抗体及びＨ２Ｌ２抗体の含有量をそれぞれ、ＥＬＩＳＡ法によって測定した。
単回投与前には、全カニクイザルの個体におけるＨ２Ｌ２抗体及びＨ８Ｌ２抗体の血清濃度は、定量の下限値よりも低い。投与後、３つのＨ８Ｌ２群のカニクイザルにおけるＨ８Ｌ２抗体の血清濃度は、投与量につれて上昇し、低投与量群（即ち、１ｍｇ／ｋｇ）、中投与量群（即ち、３ｍｇ／ｋｇ）、及び高投与量群（即ち、１０ｍｇ／ｋｇ）の有効平均半減期は、それぞれ、２１５．７２時間（図８を参照）、２８８．７８時間（図９を参照）、及び２６８．９２時間（図１０を参照）である。更に、野生型Ｈ２Ｌ２群の有効平均半減期（１０ｍｇ／ｋｇの投与量）は２２４時間である（図１１を参照）。１０ｍｇ／ｋｇの同じ投与量下で、Ｈ８Ｌ２群は野生型Ｈ２Ｌ２群よりも長い有効平均半減期を示すことが見られる（図１２を参照）。
実施例８ ヒト非小細胞肺癌ＨＣＣ８２７細胞株の皮下移植腫瘍ＭｉＸｅｎｏモデルにおけるＨ８Ｌ２抗体の抗腫瘍効果
ＮＳＧマウスにおいてヒト非小細胞肺癌ＨＣＣ８２７細胞株を用いて樹立された皮下移植腫瘍ＭｉＸｅｎｏモデルを使用することによって、実施例１で調製したＨ８Ｌ２抗体の抗腫瘍効果を調査し、詳細を下記に記載する。
非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）、Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ、及びＩＬ２ｒｇｎｕｌｌ欠失又は変異を特徴とするＮＳＧマウスは、最も高い免疫不全を有すので、ヒト由来細胞及び組織に対して拒絶することなく、ヒト由来細胞移植に最も適したツールとなる。上記に基づき、本発明者らは、ＮＳＧマウスへのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の養子移植によって樹立された移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルによって、ｉｎ ｖｉｖｏでのＨ８Ｌ２抗体の薬学的効果を評価した。また、本発明者らは、ＮＳＧマウスを用いて皮下移植腫瘍モデル（即ち、ＭｉＸｅｎｏモデル）を樹立し、ヒト非小細胞肺癌ＨＣＣ８２７細胞株の皮下移植腫瘍ＭｉＸｅｎｏモデルにおけるＨ８Ｌ２抗体の抗腫瘍効果を更に見出した。
具体的には、０日目（Ｄａｙ０）にマウス当たり５×１０６細胞の用量で、各４０頭のＮＣＧマウス（３２頭の実験用マウス及び予備用に８頭のマウス）の背面右側に、皮下注射によってＨＣＣ８２７細胞を接種した。接種後６日目（Ｄａｙ６）に、６６ｍｍ３までの腫瘍の大きさを有する３２頭のＮＣＧマウスを１群当たり８頭のマウスで４つの群に分け、そして各マウスを０．１ｍｌのＰＢＭＣ（ＰＢＳバッファ中で懸濁）の尾静脈内移植に付した。表１に示されるように、４つの群（即ち、３２頭のマウス）において、Ｈ８Ｌ２ ５ｍｇ／ｋｇ処置群（群１）、Ｈ８Ｌ２ １０ｍｇ／ｋｇ処置群（群２）、ポジティブコントロールとしてのＯｐｄｉｖｏ ５ｍｇ／ｋｇ処置群（群３）、及びコントロールとしてのアイソタイプ抗体（ヒトＩｇＧ４）５ｍｇ／ｋｇ群（群４）をそれぞれ接種後６日目、９日目、１３日目、１６日目、１９日目、及び２２日目に、全部で６回の投与によって、尾静脈を介して皮下投与した。相対腫瘍増殖抑制値（ＴＧＩＲＴＶ）に従って有効性を評価し、マウスの体重変化及び死亡によって、安全性を評価した。
Figure 0007181878000016
表２を参照すると、コントロールとしてのアイソタイプ抗体（ヒトＩｇＧ４）５ｍｇ／ｋｇ群に対して、Ｈ８Ｌ２ １０ｍｇ／ｋｇ処置群は、腫瘍細胞の接種後９日目及び１３日目に、腫瘍増殖の有意な抑制を示し、相対腫瘍増殖抑制値（ＴＧＩＲＴＶ）は、それぞれ、３０％（ｐ＝０．００７）及び３０％（ｐ＝０．０３９）であり、Ｈ８Ｌ２ ５ｍｇ／ｋｇ処置群も、腫瘍細胞の接種後９日目及び１３日目に、腫瘍増殖の有意な抑制を示し、相対腫瘍増殖抑制値（ＴＧＩＲＴＶ）は、それぞれ、１８％（ｐ＝０．０４９）及び２５％（ｐ＝０．０４１）であるが、一方、Ｏｐｄｉｖｏ ５ｍｇ／ｋｇ処置群は、腫瘍細胞の接種後９日目及び１３日目に、腫瘍増殖の有意な抑制を示さず、相対腫瘍増殖抑制値（ＴＧＩＲＴＶ）は、それぞれ、１７％（ｐ＝０．０８４）及び２３％（ｐ＝０．０７３）である。結果は、Ｈ８Ｌ２抗体が、ポジティブコントロールとして使用されるＯｐｄｉｖｏ群よりも更に良好な有効性で、ヒト非小細胞肺癌ＨＣＣ８２７細胞株の腫瘍ＭｉＸｅｎｏモデルの腫瘍増殖を有意に抑制することができることを実証する。更に、Ｈ８Ｌ２ ５ｍｇ／ｋｇ処置群及びＨ８Ｌ２ １０ｍｇ／ｋｇ処置群は、最初の投与から１６日間以内に（即ち、接種後６日目から２２日目）に、Ｏｐｄｉｖｏ ５ｍｇ／ｋｇ処置群と同様の薬剤関連毒性（重度の体重減少又は死亡など）を発症せず、Ｈ８Ｌ２抗体の処置に対する良好な寛容性を示す。
Figure 0007181878000017
Ｈ８Ｌ２抗体（即ち、ＰＤ－１に対するモノクローナル抗体）は、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇの投与量で注射した場合、ヒト非小細胞肺癌ＨＣＣ８２７細胞株の腫瘍ＭｉＸｅｎｏモデルにおいて腫瘍増殖の有意な抑制を示し、１０ｍｇ／ｋｇの投与量でＨ８Ｌ２抗体が腫瘍増殖の更に有意な抑制を示し、ポジティブコントロールとしてのＯｐｄｉｖｏ ５ｍｇ／ｋｇ処置群よりも良好な有効性を示し、１０ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇの両方の用量下で担癌マウスにおける良好な寛容性を有する。
実施例９ ＭＣ３８マウス結腸直腸癌細胞株のＨｕＧＥＭＭモデルにおけるＨ８Ｌ２抗体の抗腫瘍効果
結腸直腸癌の処置に対する実施例１で調製したＨ８Ｌ２抗体の有効性は、ＰＤ－１ ＨｕＧＥＭＭ ＭＣ３８保有マウスにおいて臨床前に検証され、下記に詳細に記載される。
ＭＣ３８細胞株は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するマウス結腸直腸癌細胞株である。ＰＤ－１ ＨｕＧＥＭＭモデルは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス中のＰＤ－Ｌ１タンパク質分子と相互作用するマウスＰＤ－１タンパク質の幾つかのフラグメントを対応するヒト由来タンパク質で置き換えることによって遺伝子操作されたモデル化マウスである。
マウス１頭当たり１×１０６細胞の用量で、皮下注射により各対象マウスの右側にＭＣ３８細胞を接種した。１３４ｍｍ３までの腫瘍の大きさを有するマウスを腫瘍の大きさとして４つの群に無作為に分け、１群当たり８頭のマウス及びケージ当たり４頭のマウスとし、群１～群４と名付け、それぞれ、Ｈ８Ｌ２ ５ｍｇ／ｋｇ処置群、Ｈ８Ｌ２ １０ｍｇ／ｋｇ処置群、ポジティブコントロールとしてのＫｅｙｔｒｕｄａ １０ｍｇ／ｋｇ処置群、及びコントロールとしてのアイソタイプ抗体（ヒトＩｇＧ４）５ｍｇ／ｋｇ群である。各群に対応する抗体をマウスの尾静脈を介して静脈内投与し、合計６回投与した（表３を参照）。
Figure 0007181878000018
群分け後１３日目に、群１のマウスは、１９３３．６７ｍｍ３までの平均腫瘍の大きさを有し、群２（Ｋｅｙｔｒｕｄａ １０ｍｇ／ｋｇ処置群、高用量）、群３（Ｈ８Ｌ２ ５ｍｇ／ｋｇ処置群、低用量）、及び群４（Ｈ８Ｌ２ １０ｍｇ／ｋｇ処置群、高用量）は、それぞれ８５％、９３％、及び９０％の腫瘍増殖抑制（ＴＧＩ）（％）を有し（表４を参照）、４つの群は、それぞれ８．７２％、０．９４％、－２．０７％、及び１．６８％の体重変化率を有する。各マウスは、有意な予想外の体重減少又は死亡を示さない。群２～群４は、群１と比較して抑制効果において統計的に有意な差を示し、それぞれＰ＜０．０５である。
Figure 0007181878000019
群２～群４では、Ｔ－Ｃ値（マウスの腫瘍の大きさが１０００ｍｍ３までに達したとき）は、それぞれ１０日、１４日、及び１４日超（＞１４日）であった。更に、群２～群４については、５５日目に実験が完了したときに、１ヵ月以上も腫瘍が完全に退行したマウスが、それぞれ３頭、５頭、及び５頭残った（表５を参照）。
Figure 0007181878000020
Ｈ８Ｌ２抗体（５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇのそれぞれの用量において）は、ＰＤ－１ ＨｕＧＥＭＭ ＭＣ３８保有マウスにおいて、統計的に有意な抗腫瘍効果を示し、Ｋｅｙｔｒｕｄａ １０ｍｇ／ｋｇ処置群と比較して腫瘍の完全な退行においてより効果的である。
実施例１０ Ｈ８Ｌ２ 抗体のＡＤＣＣ効果及びＣＤＣ効果
実施例１で調製したＨ８Ｌ２抗体のＡＤＣＣ効果及びＣＤＣ効果を調べ、以下に詳細に記載する。
１０．１ ＦｃγＲＩＩＩａとのＨ８Ｌ２抗体の結合定数の決定
Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａとも呼ばれる）は、ＩｇＧ抗体のＦｃフラグメントに結合することができるので、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する。治療用モノクローナル抗体の安全性及び有効性は、モノクローナル抗体のＦｃ受容体への結合能力によって影響を受けるであろう。この実験において、ＦｃγＲＩＩＩａとＨ８Ｌ２抗体との結合定数をＦｏｒｔｅｂｉｏ分子間相互作用機器を用いて検出し、Ｆｃ受容体に対するＨ８Ｌ２抗体の結合能力を評価した。
ＦｃγＲＩＩＩａとＨ８Ｌ２抗体との結合定数は、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ分子間相互作用機器を用いて検出した。具体的には、ＰＢＳＴバッファ中の１μｇ／ｍｌのＦｃγＲＩＩＩａ－ビオチンをＳＡセンサーの表面に３００秒間固定化した。４０００ｎＭの濃度のＨ８Ｌ２抗体をＳＡセンサーに適用し、ＦｃγＲＩＩＩａに結合させた。１２０秒間結合させた後、ＰＢＳＴバッファをＳＡセンサーに適用して解離させ、１８０秒間保持した。Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ７．０ソフトウェアでデータを集め、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ７．０ソフトウェアで分析した。
図１７は結果を示し、Ｈ８Ｌ２抗体とＦｃγＲＩＩＩａとの間に結合がないことを示す。
１０．２ Ｃ１ｑとＨ８Ｌ２抗体との結合定数の決定
血清補体Ｃ１ｑは、ＩｇＧ抗体のＦｃフラグメントに結合することができ、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与する。治療用モノクローナル抗体の安全性及び有効性は、モノクローナル抗体の血清補体Ｃ１ｑへの結合能力によって影響されるであろう。この実験において、血清補体Ｃ１ｑとＨ８Ｌ２抗体との結合定数は、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ分子間相互作用機器を用いて検出し、血清補体Ｃ１ｑに対するＨ８Ｌ２抗体の結合能力を評価した。
血清補体Ｃ１ｑとＨ８Ｌ２抗体との結合定数は、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ分子間相互作用機器を用いて検出した。具体的には、ＰＢＳＴバッファ中の１００μｇ／ｍｌのＨ８Ｌ２抗体をＦＡＢ２Ｇセンサーの表面に３００秒間固定化した。３．１３ｎＭ～２００ｎＭの濃度の血清補体Ｃ１ｑをＦＡＢ２Ｇセンサーに適用し、Ｈ８Ｌ２抗体に結合させた。１２０秒間結合させた後、ＰＢＳＴバッファをＳＡセンサーに適用して解離させ、１８０秒間保持した。Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ７．０ソフトウェアでデータを集め、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ７．０ソフトウェアで分析した。
図１８は結果を示し、Ｈ８Ｌ２抗体と血清補体Ｃ１ｑとの間に結合がないことを示す。
本開示のＰＤ－１に対するモノクローナル抗体は、ＦｃＲｎに対する強い結合親和性及び延長された血清半減期、並びに抗原ＰＤ－１に対する強い結合親和性及び良好な認識特異性を示す。更に、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ＰＤ－１又はその受容体に特異的に結合することができ、それによってＰＤ－１受容体（ＳＨＰ１／２など）関連シグナル経路を遮断し、それによって腫瘍増殖を効果的に抑制する。
本開示の実施形態が詳細に説明されたが、当業者であれば、開示された教示としてこれらの実施形態において様々な修正及び置換が可能であり、そのような変更が全て、添付された特許請求の範囲及び任意の均等物によって与えられる本開示の範囲内であることが理解される。
本開示の明細書において、「実施形態」、「幾つかの実施形態」、「特定の実施形態」、「例」、「特定の例」、「幾つかの例」などの用語は、実施例又は実施形態によって記載される特定の特徴、構造、材料、又は特性を指すことを意図し、本開示の少なくとも１つの実施形態又は実施例に含まれる。本明細書においては、上記の用語の概略図は、必ずしも同じ実施形態又は例を指すものではない。更に、記載された特定の特徴、構造、材料、又は特性は、１つ以上の実施形態又は実施例において任意の適切な方法で組み合わされることができる。

Claims (13)

  1. 配列番号５のアミノ酸配列を含む胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）－結合部位を含むことを特徴とするプログラム死－１（ＰＤ－１）に対するモノクローナル抗体。
  2. 配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖と；配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  3. 請求項１から２のいずれかに記載のモノクローナル抗体をコードすることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
  4. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号６のヌクレオチド配列又はその相補的配列を含み、前記配列番号６のヌクレオチド配列が、前記配列番号５のアミノ酸配列を含む前記ＦｃＲｎ－結合部位をコードする請求項３に記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号２のヌクレオチド配列のものである請求項３に記載のポリヌクレオチド。
  6. 請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
  7. 請求項６に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする組換え細胞。
  8. 請求項１から２のいずれかに記載のモノクローナル抗体を調製する方法であって、
    請求項７に記載の組換え細胞を培養することを含むことを特徴とする方法。
  9. プログラム死－１（ＰＤ－１）に特異的に結合するモノクローナル抗体の調製における、請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用、請求項６に記載の発現ベクターの使用、又は請求項７に記載の組換え細胞の使用。
  10. 請求項１から２のいずれかに記載のモノクローナル抗体、請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項６に記載の発現ベクター、又は請求項７に記載の組換え細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。
  11. プログラム死－１（ＰＤ－１）に結合することができる医薬を同定する方法であって、
    候補物質の存在下で、請求項１から２のいずれかに記載のモノクローナル抗体をＰＤ－１又はそのフラグメントである抗原に接触させ、前記抗原に対する前記モノクローナル抗体の第１の結合量を決定することと、
    前記候補物質の非存在下で、請求項１から２のいずれかに記載のモノクローナル抗体をＰＤ－１又はそのフラグメントである抗原に接触させ、前記抗原に対する前記モノクローナル抗体の第２の結合量を決定することと、
    を含み、
    前記第１の結合量よりも高い前記第２の結合量は、前記候補物質が、ＰＤ－１に結合する能力を有することの指標であることを特徴とする方法。
  12. ａ）請求項１から２のいずれかに記載のモノクローナル抗体、請求項３から５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項６に記載の発現ベクター、又は請求項７に記載の組換え細胞と、
    ｂ）ａ）とは異なる免疫増強剤と、
    を含むことを特徴とする合剤。
  13. 免疫増強剤が、抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）抗体、抗ＣＤ４０抗体、ブデソニド、及びサリチレートからなる群から選択される少なくとも１つであり；
    前記サリチレートが、スルファサラジン、オルサラジン、バルサラジド、及びメサラミンからなる群から選択される少なくとも１つである請求項１２に記載の合剤。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112018000768A2 (pt) 2015-07-13 2018-09-25 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-pd-1, anticorpos anti-pd-1 ativáveis e métodos de uso dos mesmos
ES2902670T3 (es) * 2017-01-13 2022-03-29 Taizhou Hanzhong Biopharmaceutics Inc Anticuerpo monoclonal contra PD-1 y aplicaciones del mismo

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015085847A1 (zh) 2013-12-12 2015-06-18 上海恒瑞医药有限公司 Pd-1抗体、其抗原结合片段及其医药用途
JP2016026144A (ja) 2008-10-14 2016-02-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫グロブリン変異体及びその用途
WO2016023960A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Alligator Bioscience Ab Combination therapies with anti cd40 antibodies
WO2016071376A2 (en) 2014-11-06 2016-05-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with modified fcrn-binding and methods of use

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4098661A1 (en) * 2007-12-26 2022-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
US20140377253A1 (en) * 2013-03-15 2014-12-25 Abbvie Biotherapeutics Inc. Fc variants
CN105622753B (zh) * 2014-11-04 2019-04-09 博生吉医药科技(苏州)有限公司 一种pd-1单克隆抗体及其应用
MA41414A (fr) * 2015-01-28 2017-12-05 Centre Nat Rech Scient Protéines de liaison agonistes d' icos
KR20180093127A (ko) * 2015-07-30 2018-08-20 마크로제닉스, 인크. Pd-1-결합 분자 및 그것의 사용 방법
ES2902670T3 (es) * 2017-01-13 2022-03-29 Taizhou Hanzhong Biopharmaceutics Inc Anticuerpo monoclonal contra PD-1 y aplicaciones del mismo

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016026144A (ja) 2008-10-14 2016-02-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 免疫グロブリン変異体及びその用途
WO2015085847A1 (zh) 2013-12-12 2015-06-18 上海恒瑞医药有限公司 Pd-1抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2016023960A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Alligator Bioscience Ab Combination therapies with anti cd40 antibodies
WO2016071376A2 (en) 2014-11-06 2016-05-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with modified fcrn-binding and methods of use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
薬学雑誌，２０１５，Ｖｏｌ．１３５，Ｎｏ．７，ｐ．８５７－８６６

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