JP2011172585A - 治療薬として有用な一価抗体断片 - Google Patents

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Abstract

【課題】分子生物学及び抗体医療分野の、治療薬としての使用のために特徴的性質を有する新規の安定化一価抗体断片を含有してなる組成物及び方法を提供する。
【解決手段】単一抗原結合アーム及びＦｃ領域を含有してなる抗体断片であり、該抗原結合アームを含んでなるＦａｂ分子と比較して該抗体断片の安定性が増大しており、該Ｆｃ領域が第一及び第二Ｆｃポリペプチドの複合体を含んでなり、Ｆｃポリペプチドの一方だけでなく両方がＮ末端切断型重鎖である、抗体断片。
【選択図】なし

Description

（関連出願）
本出願は、米国特許法規則１．５３(ｂ)(１)に基づき出願した非仮出願であり、２００３年１２月１９日出願の米国特許仮出願番号６０／５３１４０９号の優先権を主張し、その全体の開示が出典明記によりそのままここに組み込まれる。
（技術分野）
本発明は一般に分子生物学及び抗体医療の分野に関する。より詳細には、本発明は治療薬としての使用のために特徴的性質を有する一価抗体断片の新規の形態に関する。
（発明の背景）
近年、様々な疾患及び疾病の診断及び治療薬として抗体の使用に期待が高まっている。診断、研究及び治療目的のための一般的な抗体の重要性は、天然の抗体にみられる配列及び構造から抗体配列及び構造を研究したり修飾したりするために非常に多くの努力が費やされていることからもわかる。
一般的には、理想的な治療的抗体は標的特異性、対象患者への投与後のバイオ安定性及び生体有用性、並びに治療的効果を最大にするのに十分な標的結合親和性などの特定の最小の特徴を備えているであろうと考えられる。残念なことに、全て又は大部分のこれらの最小の特徴を備える抗体治療法を生成するには努力の割に成功が少なかった。例えば、ＩｇＧのような完全長抗体は、単一の抗体分子の２本の抗原結合アームの存在から得られる結合活性効果に応じた良好な標的結合能及び望ましい薬物動態学（例えば生体内実質的半減期）を示す。しかしながら、このような完全長抗体は、そのより大きな分子の大きさの結果として生体有用性の問題に悩む。さらに、Ｆａｂ断片として拮抗的抗体がある場合であっても、完全長抗体は標的抗原への結合の際に拮抗的効果（望ましくないもの）を場合によっては示しうる。例として、米国特許第６,４６８,５２９号参照。拮抗的効果が所望の治療的機能である場合にこの現象は好ましくない。ある場合では、この現象は、細胞表面レセプターに結合してレセプター活性を引き起こすレセプター二量体化を促進する二価抗体の「架橋性」効果によるものであり得る。
一価抗体が「架橋性」効果を有すると期待されない反面、現在まで、一価抗体はその構造／設計に固有の限界があるために治療法として望ましくなかった。例えば、Ｆａｂ型の一価抗体は、治療薬としての使用に関して劣った薬力学（例えば投与後の急速クリアランス及びインビボ不安定性）を有する。さらに、それらの多価相対物と比較して、一価抗体は、一般に結合活性結合効果の欠如により見かけの結合親和性がより低い。
一般に、治療薬としての用途のための抗体型は、各々に望ましくない制約があるという事実の許容によって選択されている。にもかかわらず、近年では完全長抗体型が、その生体内バイオ安定性に少なくともある程度依存して選択されることが明らかである。結局、バイオ安定性が生体有用性より治療有効性の因子として重要でない場合に、一価抗体が用いられ得る。例えば、完全長抗体と比較してより良好な組織浸透率に少なからず依存して、一価のＦａｂ抗体は、異種性成分、例えば異種性成分が治療的機能を発揮する標的細胞又は標的組織に対する毒素などの運搬により良好な媒体でありうる。例として、米国特許第５,１６９,９３９号参照。治療法として一価抗体を開発する試みの例には、一価性が治療的効果を得るために重要な場合、例えば、抗体の二価性により標的細胞の抗原修飾が誘発され、それによって細胞障害性剤、エフェクタ及び補体を標的細胞が回避すると考えられる場合が含まれる。このような抗体の例は、Cobbold & Waldmann, Nature (1984), 308:460-462；EP 0 131 424；Glennie & Stevenson, Nature (1982), 295:712-714；Nielsen & Routledge, Blood (2002), 100:4067-4073；Stevenson等, Anticancer Drug Des. (1989), 3(4):219-230；Routledge等, Transplantation (1995), 60:847-853；Clark等, Eur. J. Immunol. (1989), 19:381-388；Bolt等, Eur. J. Immunol. (1993), 23:403-411；Routledge等, Eur. J. Immunol. (1991), 21:2717-2725；Staerz等., Nature (1985), 314:628-631；及び米国特許第5,968,509号に記載されている。特に、これら一価抗体断片は機能的なＦｃ配列を含有する。そのエフェクター機能（例えばＴ細胞の補体媒介性細胞溶解）は治療的機能のために必要とされるので含有される。記載される場合以外の技術では、治療法として用いられる及び／又は開発される一価抗体にＦｃ領域を含有するための必要性又は有用性を認識しているようではない。Ｆｃ領域が治療的機能のために必要でない一価抗体にＦｃ領域を含むことに対しては、このような抗体を得る際の実用的な難しさが強調される。従来の抗体産生技術は、そして単一の抗原結合成分（すなわち一価性）及びＦｃ領域を具備する十分に精製された形態のヘテロ二量体を大量に得る効率的な方法を提供しない。
特に、成功の程度を変化する抗体断片のインビボ安定性を増やすために努力が成されている。例えば、Ｆａｂ断片は、ポリエチレングリコールなどの安定性成分、又は異種性のペプチドなどの他の安定化分子に付着されてもよい。例として、Dennis等, J. Biol. Chem. (2002), 277:35035-35043；ＰＣＴ公開番号ＷＯ01／45746を参照のこと。
上記からみて、抗体の形態の改良、及び、治療剤又は予防剤などとしてこのような抗体を生産して、使用する方法に著しい必要性がある。本願明細書において記載される発明は、この必要性について述べ、他の利点を提供するものである。
本明細書中に挙げる特許出願及び文献を含むすべての参考文献は、出典明記によりその全体が組み込まれる。
（本発明の開示）
本発明は、治療的有用性、機能性及びその生成の方法に関して様々な利点を提供する抗体の形態を提供する。一態様では、本発明の抗体は、特定の非免疫性応答を元にした治療的方策に必須である一価性の特徴を提供する。例えば、拮抗的機能を必要としている病的状態、および抗体の二価性により望ましくない作用効果が生じる場合、本発明の抗体の一価性の特徴により、標的分子への抗体の結合の際に拮抗的機能が生じる及び／又は確実となる。さらに、本発明の抗体は、類似の／実質的に同一の抗原結合特徴を有するＦａｂ型と比較して、優れた薬物動態学的特質（例えばインビボでのクリアランス速度の減退及び／又は改良された半減期）に特徴があり、したがって従来の一価性Ｆａｂ抗体の使用における重大な欠点を克服している。一態様では、本発明の抗体は、ほとんど免疫エフェクター機能、特に免疫エフェクタ応答が有害である病理学的症状を治療する際に有用である特徴を具備しない。他の態様では、本発明の抗体は大いに生成効率を改良する変更に特徴がある。さらに、一価性抗体断片のある従来の生産方法（例えば、酵素的消化、化学共役などに続いて行うもの）に対して、本発明の製造方法の組換え体性質は、治療薬として開発及び／又は商業化のために有用な均質性及び／又は精製度の十分に高い抗体集団を得ることを可能にする。
したがって、一態様では、本発明は単一の標的分子結合アーム及びＦｃ領域を具備する一価性抗体断片（すなわちＦｃポリペプチドの複合体）を提供し、該一価性抗体断片は、前記Ｆｃ領域を欠いている相対物抗体断片よりインビボで安定している。一態様では、本発明は、前記抗原結合アームを具備するＦａｂ分子と比較して、抗体断片（すなわち、より安定しているもの、例えばより長いインビボ半減期を示すもの）の安定性を向上する単一の抗原結合アーム及びＦｃ領域を具備する抗体断片を提供するものであり、該Ｆｃ領域は、第一及び第二のＦｃポリペプチドの複合体を具備しており、Ｆｃポリペプチドの両方でなく一方がＮ末端切断型重鎖である。一実施態様では、Ｎ末端切断型重鎖は、少なくとも一部の重鎖ＣＨ2及び／又はＣＨ3ドメインに隣接して結合されたヒンジ配列から成る又は実質的に成り、第一Ｆｃポリペプチドとの複合体を形成して前記の向上した安定性を十分に得る。一実施態様では、Ｎ末端切断型重鎖は、第一Ｆｃポリペプチドとの複合体を形成して前記の向上した安定性を獲得することができる重鎖ＣＨ2及び／又はＣＨ3ドメインに隣接して結合されたヒンジ配列から成る又は実質的に成る。一実施態様では、Ｎ末端切断型重鎖のＮ末端配列は、ヒンジ配列（すなわち、先端を切った重鎖はヒンジ配列の一部又は全体である又は含有するＮ末端を具備する）の一部又は全体である。一実施態様では、Ｎ末端切断型重鎖はＩｇＧ重鎖のものである。一実施態様では、Ｆｃ領域はＦｃＲｎに結合可能である。一実施態様では、Ｆｃ領域は、ＦｃＲｎへの結合以外の免疫エフェクター機能を備えていない。一般に及び好ましくは、Ｎ末端切断型重鎖は抗原を特異的に結合しない。
本願明細書において記載されるように、本発明の抗体断片はそのＦａｂ断片相対物と比較してかなり亢進した安定性に特徴がある。ある実施態様では、本発明の抗体断片は、そのＦａｂ断片相対物の少なくともおよそ２倍、少なくともおよそ５倍、少なくともおよそ１０倍、少なくともおよそ２５倍、少なくともおよそ５０倍、少なくともおよそ１００倍、少なくともおよそ２００倍、少なくともおよそ３００倍、少なくともおよそ３５０倍、少なくともおよそ４００倍、少なくともおよそ４５０倍、少なくともおよそ５００倍のインビボ半減期を表す。インビボ半減期は、当分野で公知の本明細書に記載する様々な方法の何れかによって測定することができる。一実施態様では、インビボ半減期は、適切な哺乳動物（例えばマウス）に抗体量を投与し、哺乳動物に投与された抗体量の減少率を測定することによって測定される。
免疫エフェクター機能は、特定の臨床環境において不必要であるか、さらに有害である。いくつかの実施態様では、本発明の抗体はアグリコシル化される。このような抗体は、Ｆｃ領域のグリコシル化に依存する実質的免疫エフェクター機能を示さない。一般に及び好ましくは、本発明のアグリコシル化抗体は、ＦｃＲｎへの結合を除いて実質的免疫エフェクター機能を示さない。いくつかの実施態様では、本発明の抗体断片はＦｃＲｎ結合以外のエフェクター機能を実質的に有さない又は完全に欠いている。一実施態様では、前記エフェクター機能は補体細胞溶解である。一実施態様では、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。一実施態様では、抗体断片はＦｃＲｎを結合する。アグリコシル化抗体は、従来技術に公知の様々な方法によって生産されることができる。便利な方法は、大腸菌などの原核生物の宿主細胞内で抗体を発現することを含んでなる。
一実施態様では、本発明の抗体断片はグリコシル化される。グリコシル化は、当分野に公知の方法、例えば抗体を哺乳類の宿主細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で生産することによって達成されることができる。
いくつかの実施態様では、本発明の抗体断片は免疫応答の構成成分を標的にしないため、治療的活動のメカニズムは免疫応答の調節及び／又は連動を具備しない。例えば、一実施態様では、本発明の抗体断片は、ほとんど免疫抑制性特性を有しない。例えば、前記免疫抑制性特性は、直接又は間接的にＴ細胞枯渇をもたらす能力を具備してもよい。一実施態様では、前記抗体断片はＴ細胞表面抗原に特異的に結合せず、いくつかの実施態様ではその抗原はＣＤ３又はＣＤ４である。一実施態様では、前記Ｔ細胞表面抗原はＣＤ3である。さらに他の実施態様では、抗体断片は、イムノグロブリンポリペプチドを特異的に結合しない、例えば、表面イムノグロブリンのλ鎖上の定常決定基又は表面イムノグロブリン上のイディオタイプ決定基に特異的に結合しない。
本発明の抗体断片は、対象とする標的分子に、特異的に結合可能である。例えば、いくつかの実施態様では、抗体断片は腫瘍抗原を特異的に結合する。いくつかの実施態様では、抗体断片はレセプタ多量体化（例えば二量体化）で活性化される細胞表面レセプタを特異的に結合する。いくつかの実施態様では、標的分子への本発明の抗体の結合により、該標的分子への他の分子（リガンドなど、ここで標的分子はレセプターである）の結合が阻害される。ゆえに、ある例では、標的分子へ結合する場合の本発明の抗体断片は標的分子への同系の結合パートナーの結合を阻害する。同系の結合パートナーは、リガンド又はヘテロ二量体化分子ないしはホモ二量体化分子であり得る。一実施態様では、標的分子へ結合する場合の本発明の抗体断片は標的分子の多量体化を阻害する。例えば、本発明の抗体断片がアンタゴニストであるいくつかの実施態様では、細胞表面レセプターに対する抗体断片の結合はレセプターの他の単位とのレセプターの二量体化を阻害しうる。これによって、レセプターの活性化は阻害される（少なくともある程度レセプター二量体化の欠如に起因する）。数多くのレセプター分子は従来技術において周知であるため、それらの通常機能をもたらすための二量体化（ホモ又はヘテロの二量体化）を必要及び／又は可能とする。このようなレセプターは、線維芽細胞成長因子レセプター及びＨＧＦレセプター、ｃ-ｍｅｔのようなレセプターチロシンキナーゼを含む。他のタンパク質-タンパク質相互作用には、受容体-リガンド相互作用、例えばｆｌｔに結合するＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ｆｌｋなど、及びｃ-ｍｅｔへの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）結合が含まれる。一実施態様では、本発明の抗体断片は、ｃ-ｍｅｔへの結合についてＨＧＦと競合しうる。他の実施態様では、本発明の抗体断片は、ＶＥＧＦレセプターへの結合についてＶＥＧＦと競合しうる。
一態様では、本発明は、単一アーム型のアンタゴニストである（本願明細書において記載されるように）が２アーム型のアゴニスト又はアゴニスト活性を有している（すなわち、２つのアームが同じ抗原結合能を有する）抗体断片を提供する。
一態様では、本発明は以下のものを具備する抗体断片を提供する：(i)軽鎖可変ドメインを含有する第一ポリペプチド（及びいくつかの実施態様では更に軽鎖定常ドメインを含有する）、(ii)重鎖可変ドメイン、第一Ｆｃポリペプチド配列を含有する第二ポリペプチド（及びいくつかの実施態様では更に非Ｆｃ重鎖定常ドメイン配列を含有する）、及び(iii)第二Ｆｃポリペプチド配列を含有する第三ポリペプチド。通常、第二ポリペプチドは、重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメイン（例えばＣＨ１の全部又は一部）並びに第一Ｆｃポリペプチドを含有する単一のポリペプチドである。例えば、第一Ｆｃポリペプチド配列は、通常、ペプチド結合[すなわち非ペプチジル結合でない]によって、重鎖定常ドメインに連結される。一実施態様では、第一ポリペプチドは、ヒト軽鎖定常ドメインに融合された非ヒト軽鎖可変ドメインを具備する。一実施態様では、第二ポリペプチドは、ヒト重鎖定常ドメインに融合された非ヒト重鎖可変ドメインを具備する。一実施態様では、第三ポリペプチドは、そのＮ末端に少なくとも一部のヒンジ配列を含有するＮ末端切断型重鎖を具備する。一実施態様では、第三ポリペプチドは、そのＮ末端に機能的な又は野生型ヒンジ配列を具備しないＮ末端切断型重鎖を具備する。いくつかの実施態様では、本発明の抗体断片の２つのＦｃポリペプチドは共有結合により連結される。例えば、ヒンジ領域のシステイン残基間の分子間ジスルフィド結合などの分子間ジスルフィド結合を介して２つのＦｃポリペプチドが連結されてもよい。
一態様では、本発明は、少なくとも（又は少なくともおよそ）５０％、７５％、８５％、９０％、９５％のイムノグロブリンが本発明の抗体断片であるイムノグロブリン集団を具備する組成物を提供する。イムノグロブリンの前記集団を具備する組成物が、宿主細胞溶解物、細胞培養培地、宿主細胞ペースト又はその半精製されたないしは精製された型を含むがこれに限らず、様々な形態のうちの何れかであればよい。精製法は公知技術であり、その幾つかは本願明細書において記載される。
一態様では、本発明は、抗体断片内のＦｃ配列のホモ二量体化を最小化する一方、ヘテロ二量体化を促進する少なくとも１つの特徴を具備する抗体断片を提供する。本願明細書において記載されるように、このような特徴は本発明の方法によって入手できるイムノグロブリン集団の効率及び／又は精製度及び／又は均質性を改良する。一実施態様では、第一Ｆｃポリペプチドと第二Ｆｃポリペプチドは作用領域で会合／相互作用する。第一及び第二のＦｃポリペプチドが作用領域で会合するいくつかの実施態様において、第二Ｆｃポリペプチド（配列）の作用領域は、第一Ｆｃポリペプチド（配列）の作用領域内のキャビティに位置しうる***を具備する。一実施態様では、第一Ｆｃポリペプチドはキャビティをコードするために鋳型／元のポリペプチドから変更されているか、あるいは、第二Ｆｃポリペプチドは***をコードする鋳型／元のポリペプチドから変更されているか、あるいはその両方である。一実施態様では、第一Ｆｃポリペプチドはキャビティをコードするために鋳型／元のポリペプチドから変更されており、第二Ｆｃポリペプチドは***をコードするために鋳型／元のポリペプチドから変更されている。一実施態様では、第二Ｆｃポリペプチドの作用領域は第一Ｆｃポリペプチドの作用領域内のキャビティに位置しうる***を具備し、キャビティ又は***又はその両方がそれぞれ第一及び第二のＦｃポリペプチドの作用領域に導入されている。第一Ｆｃポリペプチドと第二Ｆｃポリペプチドが作用領域で会合するいくつかの実施態様において、第一Ｆｃポリペプチド（配列）の作用領域は、第二Ｆｃポリペプチド（配列）の作用領域内のキャビティに位置しうる***を具備する。一実施態様では、第二Ｆｃポリペプチドはキャビティをコードするために鋳型／元のポリペプチドから変更されているか、あるいは、第一Ｆｃポリペプチドは***をコードするために鋳型／元のポリペプチドから変更されているか、あるいはその両方である。一実施態様では、第二Ｆｃポリペプチドはキャビティをコードするために鋳型／元のポリペプチドから変更されており、第一Ｆｃポリペプチドは***をコードするために鋳型／元のポリペプチドから変更されている。一実施態様では、第一Ｆｃポリペプチドの作用領域は第二Ｆｃポリペプチドの作用領域内のキャビティに位置しうる***を具備し、***又はキャビティ又はその両方がそれぞれ第一及び第二のＦｃポリペプチドの作用領域に導入されている。
一実施態様では、***及びキャビティは、それぞれ天然に生じるアミノ酸残基を具備する。一実施態様では、***を具備するＦｃポリペプチドは、鋳型／元のポリペプチドの作用領域の元の残基を元の残基より大きな側鎖容量を有する移入残基に置換することによって生成される。一実施態様では、***を具備するＦｃポリペプチドは、該ポリペプチドの作用領域の元の残基をコードする核酸が元のものより大きな側鎖容量を有する移入残基をコードする核酸に置換される工程を含んでなる方法によって生成される。一実施態様では、元の残基はスレオニンである。一実施態様では、元の残基はＴ３６６である。一実施態様では、移入残基はアルギニン(Ｒ)である。一実施態様では、移入残基はフェニルアラニン(Ｆ)である。一実施態様では、移入残基はチロシン(Ｙ)である。一実施態様では、移入残基はトリプトファン(Ｗ)である。一実施態様では、移入残基はＲ、Ｆ、Ｙ又はＷである。一実施態様では、***は鋳型／元のポリペプチド内の２以上の残基を置換することによって生成される。一実施態様では、***を具備するＦｃポリペプチドはカバット等のＥＵ番号付けスキームによるアミノ酸番号３６６位のスレオニンのトリプトファンへの置換を具備する（Sequences of proteins of immunological interest, 第５版, １号の688-696頁 (1991; NIH, Bethesda, MD)）。
いくつかの実施態様では、キャビティを具備するＦｃポリペプチドは、鋳型／元のポリペプチドの作用領域内の元の残基を元の残基より小さな側鎖容量を有する移入残基に置換することによって生成される。例えば、キャビティを具備するＦｃポリペプチドは、該ポリペプチドの作用領域の元の残基をコードする核酸が元のものより小さな側鎖容量を有する移入残基をコードする核酸に置換される工程を含んでなる方法によって生成されてもよい。一実施態様では、元の残基はスレオニンである。一実施態様では、元の残基はロイシンである。一実施態様では、元の残基はチロシンである。一実施態様では、移入残基はシステイン(Ｃ)でない。一実施態様では、移入残基はアラニン(Ａ)である。一実施態様では、移入残基はセリン(Ｓ)である。一実施態様では、移入残基はスレオニン(Ｔ)である。一実施態様では、移入残基はバリン(Ｖ)である。キャビティは、鋳型／元のポリペプチドの一つ以上の元の残基を置換することによって生成することができる。例えば、一実施態様では、キャビティを具備するＦｃポリペプチドは、スレオニン、ロイシン及びチロシンからなる群から選択される２以上の元のアミノ酸の置換を具備する。一実施態様では、キャビティを具備するＦｃポリペプチドは、アラニン、セリン、スレオニン及びバリンからなる群から選択される２以上の移入残基を具備する。いくつかの実施態様では、キャビティを具備するＦｃポリペプチドはスレオニン、ロイシン及びチロシンからなる群から選択される２以上の元のアミノ酸の置換を具備し、該元のアミノ酸はアラニン、セリン、スレオニン及びバリンからなる群から選択される移入残基に置換されたものである。いくつかの実施態様では、置換される元のアミノ酸は、Ｔ３６６、Ｌ３６８及び／又はＹ４０７である。一実施態様では、キャビティを具備するＦｃポリペプチドは、上掲のカバット等のＥＵ番号付けスキームによるアミノ酸番号３６６位のスレオニンのセリンへの置換を具備する。一実施態様では、キャビティを具備するＦｃポリペプチドは、上掲のカバット等のＥＵ番号付けスキームによるアミノ酸番号３６８位のロイシンのアラニンへの置換を具備する。一実施態様では、キャビティを具備するＦｃポリペプチドは、上掲のカバット等のＥＵ番号付けスキームによるアミノ酸番号４０７位のチロシンのバリンへの置換を具備する。一実施態様では、キャビティを具備するＦｃポリペプチドは、上掲のカバット等のＥＵ番号付けスキームによるアミノ酸番号Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖからなる群から選択される２以上のアミノ酸置換を具備する。これらの抗体断片のいくつかの実施態様では、***を具備するＦｃポリペプチドは、上掲のカバット等のＥＵ番号付けスキームによるアミノ酸番号３６６位のスレオニンのトリプトファンへの置換を具備する。
一態様では、本発明の抗体断片は、同一の抗原結合アーム（配列）を具備するＦａｂ断片と相対的にみて、抗体断片の安定性が増強するためにその存在が必要とされるＦｃ領域を具備する。前記Ｆｃ領域は、異なるＦｃポリペプチド配列の錯体形成（多量体化）により形成される。前記異なるＦｃポリペプチド配列は、同じ配列及び／又はドメインを含有していてもしていなくてもよく、それらがＦｃ領域を形成するために二量体化させるものである（本明細書で定義されるように）。第一Ｆｃポリペプチドは、一般に、単一ポリペプチドのイムノグロブリン重鎖の一以上のドメインに例えばヒンジ、定常及び／又は可変ドメイン配列などを隣接して連結される。一実施態様では、第一Ｆｃポリペプチドは、少なくとも一部のヒンジ配列、少なくとも一部のＣＨ２ドメインで及び／又は少なくとも一部のＣＨ３ドメインを具備する。一実施態様では、第一Ｆｃポリペプチドは、イムノグロブリンのヒンジ配列及びＣＨ２及びＣＨ３ドメインを具備する。一実施態様では、第二Ｆｃポリペプチド（すなわちＮ末端切断型重鎖の一部であるＦｃポリペプチド）は、少なくとも一部のヒンジ配列、少なくとも一部のＣＨ２ドメイン及び／又は少なくとも一部のＣＨ３ドメインを具備する。一実施態様では、第二Ｆｃポリペプチドは、イムノグロブリンのヒンジ配列及びＣＨ２及びＣＨ３ドメインを具備する。一実施態様では、本発明の抗体断片は、第一及び第二のＦｃポリペプチドを具備しており、それぞれいずれが少なくとも一抗体定常ドメインを少なくとも一部含むものである。一実施態様では、抗体定常ドメインはＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインである。定常ドメインを具備する本発明の抗体断片の任意の実施態様では、抗体定常ドメインが任意のイムノグロブリンクラス、例えばＩｇＧ由来であり得る。イムノグロブリン供与源は、元の型（例えば、ＩｇＧはヒトＩｇＧ１であってもよい）あるいは合成型の任意の適切な種のものであり得る。
本発明の抗体は、単一の抗原結合アームを具備する。単一抗原への結合には、一つ以上の結合標的（例えば決定基／エピトープ）が関与しうる。一実施態様では、本発明の抗体は、単一特異性である。他の実施態様では、本発明の抗体はイムノアドへシンであり、一実施態様では、単一特異性である。
本発明の抗体断片は、異種性成分とコンジュゲートしてもよい。抗体へのコンジュゲートが抗体の所望の機能及び／又は特徴を実質的に減退しない限り、どの異種性成分でも適するであろう。例えば、いくつかの実施態様では、免疫コンジュゲートは、細胞障害性剤である異種性成分を具備する。いくつかの実施態様では、前記細胞障害性剤は、放射性同位体、化学療法剤及び毒素からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、前記毒素は、カリケアマイシン、メイタンシン及びトリコセン(trichothene)からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、免疫コンジュゲートは検出可能なマーカーである異種性成分を具備する。いくつかの実施態様では、前記検出可能なマーカーは、放射性同位体、リガンド-レセプタ対のメンバー、酵素-基質対のメンバー及び蛍光共鳴エネルギー転移対のメンバーからなる群から選択される。
様々な環境において、本発明の抗体断片の非常に均質な集団を具備する組成物を得ることは、たいへん望ましい。これは、従来技術において公知の様々な方法によって提供されうる。例えば、本発明の抗体断片を形成しているポリペプチドは、一般に、組み換え遺伝子的に発現される（例えば完全長イムノグロブリンの酵素学的消化に対して）。いくつかの実施態様では、本発明の組成物は、結合アームのＮ末端及び／又はＦｃ領域のＣ末端に関して実質的に均質である抗体断片を具備する。本発明の抗体断片の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％が結合アームのＮ末端及び／又はＦｃ領域のＣ末端に同じアミノ酸残基を有する場合、組成物は「実質的に均質」である。前記組成物は、抗体断片がまず最初に生成される供与源組成物の精製されていない型か、半精製されている型か、精製型であり得る。
一態様では、本発明は、本発明の抗体断片及び担体を具備する組成物を提供するものであり、それは一実施態様では、薬学的に受容可能な担体である。一実施態様では、抗体断片は異種性成分にコンジュゲートされる。
他の態様では、本発明は、容器及び容器に内包される組成物を具備する製造品を提供するものであり、該組成物は本発明の抗体断片を具備する。いくつかの実施態様では、製造品は更に、前記組成物を用いるための指示書を具備する。一実施態様では、抗体断片は、治療上有効量で提供される。
さらに他の態様では、本発明は、本発明の抗体断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の抗体断片の構成成分は、単一のポリヌクレオチド又は独立した（複数の）ポリヌクレオチドによってコードされうる。一実施態様では、単一のポリヌクレオチドは、(ａ)抗原結合アームの軽鎖及び重鎖の構成成分、及び(ｂ)Ｎ末端切断型重鎖ポリペプチドをコードする。一実施態様では、単一のポリヌクレオチドは抗原結合アームの軽鎖及び重鎖の構成成分をコードしており、独立したポリヌクレオチドはＮ末端切断型重鎖ポリペプチドをコードする。一実施態様では、独立したポリヌクレオチドは、それぞれ、抗原結合アームの軽鎖構成成分、抗原結合アームの重鎖構成成分及びＮ末端切断型重鎖ポリペプチドをコードする。
一態様では、本発明は本発明の抗体を発現するための組み換えベクターを提供する。
一態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド又は組換えベクターを具備する宿主細胞を提供する。一実施態様では、宿主細胞は原核細胞、例えば大腸菌である。一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞などの哺乳類の細胞である。
一態様では、本発明は、本発明の抗体断片の生成方法を提供するものであり、前記方法は抗体断片の形成が生じるヘテロ多量体化を可能にする条件下にて抗体断片をコードする核酸を好適な宿主細胞（例えば、大腸菌又はＣＨＯ）内で発現させることを含んでなるものである。一実施態様では、宿主細胞培養物において生成されたイムノグロブリンポリペプチドの少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％少なくとも９５％が本発明の抗体断片である。一実施態様では、本願明細書において記載されるように、本発明の方法によって生成される抗体断片は一方のＦｃポリペプチド中の***と他方のＦｃポリペプチド中のキャビティを具備する。一実施態様では、本発明は、宿主細胞中に３つのポリヌクレオチドを発現させることを含んでなる方法を提供するものであり、第一ポリヌクレオチドは抗原結合アームの第一構成成分（例えば重鎖ＣＤＲ配列（一つないしは複数）又は可変ドメイン（非Ｆｃ重鎖定常ドメイン配列を更に含有するものもある））と第一Ｆｃポリペプチドをコードし、第二ポリヌクレオチドは抗原結合アームの第二構成成分（例えば軽鎖ＣＤＲ配列（一つないしは複数）又は可変ドメイン（軽鎖定常ドメインを更に含有するものもある）をコードし、第三ポリヌクレオチドは第二Ｆｃポリペプチドを含有してなるＮ末端切断型重鎖をコードしており、本発明の抗体断片はこれらポリペプチドのヘテロ多量体化によって形成される。一実施態様では、前記方法は前記ポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に導入することを含んでなる。一実施態様では、前記方法は、細胞培養物、例えば細胞溶解物又は培養液から本発明の抗体断片を回収することを含んでなる。
一態様では、本発明は、本発明の抗体断片の構成成分をコードする核酸を適切な宿主細胞内で発現させることを含んでなる方法を提供するものであり、それぞれの構成成分をコードするシストロンは、前記構成成分をコードする核酸配列に作用可能に連結した翻訳開始領域（ＴＩＲ）を含有し、各々のＴＩＲの強さは前記抗体断片の所望の量を生成するための構成成分の発現レベルが適切な割合となるように調整される。一実施態様では、ＴＩＲｓはほぼ等しい強さである。一実施態様では、例えばSimmons & Yansura, Nature Biotechnol. (1996), 14:629-634及びSimmons等, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147に従うと、相対的なＴＩＲは１である。いくつかの実施態様では、ＴＩＲは、原核生物の分泌シグナル配列又はその変異形を含有する。いくつかの実施態様では、原核生物の分泌シグナル配列は、ＳＴＩＩ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＥ、ＬａｍＢ、ＭＢＰ及びＰｈｏＡ分泌シグナル配列からなる群から選択される。
本発明の抗体は、様々な環境の中で様々な用途を提供する。例えば、本発明の抗体は、通常治療的抗体である。本発明の抗体は、様々なメカニズムの何れかによってその治療効果を発揮しうる。例えば、本発明の抗体は、アゴニスト抗体であってもよい。他の例では、本発明の抗体は拮抗的抗体であってもよい。さらに他の例では、本発明の抗体は遮断抗体であってもよい。他の例では、本発明の抗体は中和抗体である。
一態様では、本発明は、疾患の経過を治療するかないしは遅延させる方法を提供するものであり、疾患を有する対象体に疾患の経過を治療するかないしは遅延させる際に効果的な本発明の抗体断片を有効量投与することを含んでなる。一実施態様では、疾患は腫瘍又は癌である。一実施態様では、疾患は免疫学的疾患、例えば自己免疫性疾患、例えば関節リウマチ、免疫性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、乾癬、シェーグレン症候群、インシュリン依存性糖尿病などである。他の実施態様では、疾患は異常な脈管化（例えば血管新生）を伴う。さらに他の実施態様では、疾患は、成長因子-レセプターシグナル伝達の調節不全を伴う。ある例では、前記成長因子-レセプターシグナル伝達はチロシンキナーゼを伴う。ある例では、前記成長因子-レセプターシグナル伝達は、ＨＧＦ-ｃ-ｍｅｔ系を伴う。
本発明の抗体は、多くの細胞性、遺伝性及び／又は生化学性の異常の何れかから生じる任意の多くの病理学的症状を治療するかないしは予防するために好適である。例えば、本発明の抗体は、特にＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路内の異常を伴う病理学的症状を治療及び／又は予防するために好適である。一実施態様では、本発明の抗体はｃ-ｍｅｔアンタゴニストである。一実施態様では、抗体は、キメラ抗体、例えば異種性の非ヒト配列、ヒト配列又はヒト化配列（例えばフレームワーク及び／又は定常ドメイン配列）に移植した非ヒトドナーから抗原結合配列を含有する抗体である。一実施態様では、非ヒトドナーはマウスである。一実施態様では、抗原結合配列は、例えば突然変異誘発（例えばファージディスプレイスクリーニングなど）によって得られるような合成のものである。一実施態様では、本発明のキメラ抗体は、マウスのＶ領域及びヒトＣ領域を有する。一実施態様では、マウスの軽鎖Ｖ領域は、ヒトカッパ軽鎖に融合される。一実施態様では、マウスの重鎖Ｖ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｃ領域に融合される。一実施態様では、抗原結合配列は、軽鎖及び／又は重鎖の少なくとも１つか、少なくとも２つか、あるいは３つすべてのＣＤＲを含有する。一実施態様では、抗原結合配列は、重鎖ＣＤＲ３を含有する。一実施態様では、抗原結合配列は、アメリカ培養細胞系統保存機関寄託番号ＡＴＣＣ ＨＢ-１１８９４(ハイブリドーマ１Ａ３.３.１３)又はＨＢ-１１８９５(ハイブリドーマ５Ｄ５.１１.６)の下に寄託されるハイブリドーマ細胞系統によって生産されるモノクローナル抗体の可変ドメイン配列及び／又はＣＤＲの一部又はすべてを含有する。一実施態様では、抗原結合配列は、少なくともハイブリドーマ細胞系統１Ａ３.３.１３又は５Ｄ５.１１.６によって生産されるモノクローナル抗体の重鎖のＣＤＲ３を含有する。本発明のヒト化抗体には、ＦＲ内のアミノ酸置換を有するものと移植されたＣＤＲ内に変異を有する親和性成熟変異形が含まれる。ＣＤＲ又はＦＲ内の置換されたアミノ酸は、ドナー又はレシピエントの抗体にあるものに限定されない。他の実施態様では、本発明の抗体は更に、亢進したＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ機能及びＢ細胞殺傷を含む改良されたエフェクター機能を引き起こすＦｃ領域内のアミノ酸残基に変異を有する。本発明の他の抗体には、安定性を改善する特定の変異を有するものが含まれる。また、本発明の抗体は、生体内でＡＤＣＣ機能を高めたフコース欠陥変異形が含まれる。
一実施態様では、本発明の抗体断片は、SYWLH（配列番号：１）、MIDPSNSDTRFNPNFKD（配列番号：２）及びYGSYVSPLDY（配列番号：３）からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つないしは３つすべてのＣＤＲ配列を含有する重鎖を具備する抗原結合アームを含有してなる。一実施態様では、抗原結合アームは、アミノ酸配列SYWLHを有する重鎖ＣＤＲ-Ｈ１を含んでなる。一実施態様では、抗原結合アームは、アミノ酸配列MIDPSNSDTRFNPNFKDを有する重鎖ＣＤＲ-Ｈ２を含んでなる。一実施態様では、抗原結合アームは、アミノ酸配列YGSYVSPLDYを有する重鎖ＣＤＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体断片は、KSSQSLLYTSSQKNYLA（配列番号：４）、WASTRES（配列番号：５）及びQQYYAYPWT（配列番号：６）からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＣＤＲ配列を含有する軽鎖を具備する抗原結合アームを含んでなる。一実施態様では、抗原結合アームは、アミノ酸配列KSSQSLLYTSSQKNYLAを有する重鎖ＣＤＲ-Ｌ１を含んでなる。一実施態様では、抗原結合アームは、アミノ酸配列WASTRESを有する重鎖ＣＤＲ-Ｌ２を含んでなる。一実施態様では、抗原結合アームは、アミノ酸配列QQYYAYPWTを有する重鎖ＣＤＲ-Ｌ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体断片は、SYWLH（配列番号：１）、MIDPSNSDTRFNPNFKD（配列番号：２）及びYGSYVSPLDY（配列番号：３）からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＣＤＲ配列を含有する重鎖と、KSSQSLLYTSSQKNYLA（配列番号：４）、WASTRES（配列番号：５）及びQQYYAYPWT（配列番号：６）からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ又は３つすべてのＣＤＲ配列を含有する軽鎖を具備する抗原結合アームを含んでなる。
本発明は、ヒトｃ-ｍｅｔ又はその抗原結合断片を結合するヒト化抗体を提供するものであり、抗体は生体内ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔ活性の阻害効果を有し、該抗体は、Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）内に、アメリカ培養細胞系統保存機関ＡＴＣＣ ＨＢ-１１８９４（ハイブリドーマ１Ａ３.３.１３）又はＨＢ-１１８９５（ハイブリドーマ５Ｄ５.１１.６）の下に寄託されるハイブリドーマ細胞系統によって産生されるモノクローナル抗体の少なくともＣＤＲ３と、実質的なヒトのコンセンサス配列（例えば、ヒト重鎖サブグループIII（ＶＨIII）の実質的なヒトコンセンサスフレームワーク（ＦＲ）残基）を含んでなる。一実施態様では、抗体は更に、アメリカ培養細胞系統保存機関ＡＴＣＣ ＨＢ-１１８９４（ハイブリドーマ１Ａ３.３.１３）又はＨＢ-１１８９５（ハイブリドーマ５Ｄ５.１１.６）の下に寄託されるハイブリドーマ細胞系統株によって産生されるモノクローナル抗体のＨ鎖ＣＤＲ1配列及び／又はＣＤＲ2配列を含んでなる。他の実施態様では、前記抗体は、アメリカ培養細胞系統保存機関ＡＴＣＣ ＨＢ-１１８９４（ハイブリドーマ１Ａ３.３.１３）又はＨＢ-11895（ハイブリドーマ５Ｄ５.１１.６）の下に寄託されるハイブリドーマ細胞系統株によって産生されるモノクローナル抗体のＬ鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及び／又はＣＤＲ３配列を、ヒト軽鎖ｋサブグループＩ(ＶｋI)の実質的なヒトコンセンサスフレームワーク(ＦＲ)残基と共に含んでなる。
一実施態様では、本発明の抗体断片は、以下の配列を有する重鎖可変ドメインを含有してなる抗原結合アームを含んでなる：
QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS (配列番号：７)
一実施態様では、本発明の抗体断片は、以下の配列を有する軽鎖可変ドメインを含有してなる抗原結合アームを含んでなる：
DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTKLEIK (配列番号：８)
一態様では、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性（例えば自己免疫性）疾患及び／又は血管新生関連疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の核酸（例えば本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体断片）の使用を提供する。
一態様では、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性（例えば自己免疫性）疾患及び／又は血管新生関連疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の抗体断片（例えば本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体断片をコードする核酸）の使用を提供する。
一態様では、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性（例えば自己免疫性）疾患及び／又は血管新生関連疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の発現ベクター（例えば本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体断片をコードするベクター）の使用を提供する。
一態様では、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性（例えば自己免疫性）疾患及び／又は血管新生関連疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の宿主細胞（例えば本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体断片をコードするベクターを含んでなる宿主細胞）の使用を提供する。
一態様では、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性（例えば自己免疫性）疾患及び／又は血管新生関連疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の製造品（例えば本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体断片及び／又は本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体断片をコードする核酸を含んでなる製造品）の使用を提供する。
一態様では、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍、細胞増殖性疾患、免疫性（例えば自己免疫性）疾患及び／又は血管新生関連疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明のキット（例えば本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体断片及び／又は本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体断片をコードする核酸を含んでなるキット）の使用を提供する。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ活性化細胞増殖を阻害する方法を提供するものであり、該方法は本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体断片の有効量と細胞又は組織とが接触することを含んでなり、それによってｃ-ｍｅｔ活性化を伴う細胞増殖が阻害される方法である。
一態様では、本発明は、対象体のｃ-ｍｅｔ活性化の調節不全を伴う病的状態の治療方法を提供するものであり、該方法は本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体断片の有効量が対象体に投与されることを含んでなり、それによって外傷上を治療する方法である。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子ないしはその両方を発現する細胞の成長を阻害する方法を提供するものであり、該方法は本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体断片と該細胞とが接触することを含んでなり、これによって該細胞の成長が阻害される方法である。一実施態様では、細胞は異なる細胞によって発現されるＨＧＦに（例えば、傍分泌効果を介して）接触する。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子ないしはその両方を発現する細胞を含有する癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置する方法を提供するものであり、該方法は該哺乳動物に本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体断片の有効量が投与されることを含んでなり、それによって、該哺乳動物が効果的に治療される方法である。一実施態様では、細胞は異なる細胞によって発現されるＨＧＦに（例えば、傍分泌効果を介して）接触する。
一態様では、本発明は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞成長ないしはその両方の発現増加又は活性増強を伴う細胞増殖性疾患を治療ないしは予防するための方法を提供するものであり、該方法は、このような治療を必要とする対象体に本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体断片の有効量が投与されることを含んでなり、このことにより該細胞増殖性疾患が効果的に治療ないしは予防される方法である。一実施態様では、前記増殖性疾患は癌である。
一態様では、本発明は、細胞の成長を阻害する方法を提供するものであり、該細胞の成長がｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子ないしはその両方の成長潜在的効果に少なくとも少しは依存しており、該方法は本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体断片の有効量と該細胞とが接触することを含んでなり、このことにより該細胞の成長が阻害される方法である。一実施態様では、細胞は異なる細胞によって発現されるＨＧＦに（例えば、傍分泌効果を介して）接触する。
一態様では、本発明は、哺乳動物の腫瘍を治療的に処置する方法を提供するものであり、該腫瘍の成長がｃ-ｍｅｔ又は肝細胞増殖因子ないしはその両方の成長潜在的効果に少なくとも少しは依存しており、該方法は本発明のｃ-ｍｅｔアンタゴニスト抗体断片の有効量と該腫瘍とが接触することを含んでなり、このことにより該腫瘍が効果的に治療される方法である。一実施態様では、細胞は異なる細胞によって発現されるＨＧＦに（例えば、傍分泌効果を介して）接触する。
本発明の方法は、任意の適切な病理学的状態、例えばＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達経路の調節不全を伴う細胞及び／又は組織に作用するために用いられうる。一実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は癌細胞である。例えば、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭カルシノーマ細胞（例えば、甲状腺のもの）、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、頸癌細胞、中枢神経系癌細胞、骨原性肉種細胞、腎臓カルシノーマ細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、胃カルシノーマ細胞、頭頸部扁平上皮癌細胞、メラノーマ細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞（例えば多発性骨髄腫）、膠腫／神経膠芽腫細胞（例えば未分化星状細胞腫、神経膠芽腫多形、退形成乏突起膠腫、退形成乏突起星状細胞腫）及び白血病細胞からなる群から選択されたものである。一実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は、過剰増殖性及び／又は過形成性細胞である。一実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は形成異常細胞である。さらに他の実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は転移性細胞である。
本発明の方法は更に付加的処置工程を含むことができる。例えば、一実施態様では、方法は更に、標的細胞及び／又は組織（例えば癌細胞）が放射線治療又は化学療法剤にさらされる工程を含む。
ｃ-ｍｅｔの活性化は、その調節不全により数多くの病的状態に至る重要な生物学的過程である。したがって、本発明の方法の一実施態様では、標的とされる細胞（例えば癌細胞）は、同じ組織起源の正常細胞と比較して、ｃ-ｍｅｔの活性化が亢進されるものである。一実施態様では、本発明の方法によって標的細胞が死に至る。例えば、本発明のアンタゴニスト抗体断片との接触により細胞はｃ-ｍｅｔ経路を介するシグナル伝達ができなくなり、細胞死に至る。
ｃ-ｍｅｔ活性化（及びその後のシグナル伝達）の調節不全は、例えば、ＨＧＦ（ｃ-ｍｅｔの同系リガンド）の過剰発現及び／又はｃ-ｍｅｔ自体を含む多くの細胞性変異から生じうる。したがって、いくつかの実施態様では、本発明の方法は、ｃ-ｍｅｔ又は肝細胞成長因子あるいはその両方が、同じ組織起源の正常細胞と比較して、細胞（例えば癌細胞）により多く発現される細胞を標的とすることを含んでなる。ｃ-ｍｅｔ発現細胞は様々な起源からのＨＧＦによって、すなわち自己分泌又は傍分泌方法で、調整されうる。例えば、本発明の方法の一実施態様では、標的細胞は、異なる細胞において発現される肝細胞成長因子に（例えば、傍分泌を介して）接触／結合する。前記異なる細胞は、同じ組織起源のもの又は異なる組織起源のものでありうる。一実施態様では、標的細胞は、標的細胞自体によって発現されるＨＧＦに（例えば、自己分泌効果／ループを介して）接触／結合する。一実施態様では、標的細胞のｃ-ｍｅｔ活性（又は活性化）はリガンド依存性である。一実施態様では、ｃ-ｍｅｔ活性（又は活性化）は、リガンド非依存性である。
（本発明の実施形態）
本発明は、特定の病理学的症状を治療するための使用に特に有用とする固有の特徴を有する一価性抗体断片を用いるための方法、組成物、キット及び製造品を提供する。さらに、抗体断片は、実用的効率かつ望ましい精製度で確実に調製されうる。本発明の抗体断片は、従来の一価性抗体と比較して、優れた物理化学的及び／又は治療的能力に特徴がある。一般に、本発明の一価性抗体断片は、単一の抗原結合アーム及びＦｃ領域を含んでなるものであり、該抗体断片は該抗原結合アームを有しているが該Ｆｃ領域を欠いているＦａｂ抗体断片と比較して生体内安定性が改良されている。いくつかの実施態様では、本発明の抗体断片は、Ｆｃ領域を補う両Ｆｃポリペプチド間に多量体化作用領域を形成する各々のＦｃ配列の残基に一又は複数の変異を含有する。本発明は、本発明の抗体断片を製作して使用する方法を提供する。本発明により、本発明の新規の抗体断片の効率的かつ商業性に富む生成が可能となる。抗体断片は、本質的に一価性であり非常に安定した治療的抗体の使用が望まれる及び／又は必要とされる病的状態の治療に使用されうる。本発明の方法、組成物、キット及び製造品の詳細は本願明細書において記載する。
典型的技術
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技術範囲内の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を使用して行う。このような技術は、例えば以下のような文献に完全に明記されている。「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 第２版(Sambrookら, 1989)；「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait, 編, 1984)；「Animal Cell Culture」(R. I. Freshney, 編, 1987)；「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubelら, 編., 1987, and periodic updates)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullisら, 編, 1994)；「A Practical Guide to Molecular Cloning」(Perbal Bernard V., 1988)。
定義
ここで使用される「ベクター」という用語は、それが結合している他の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味するものである。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントが結合されうる円形の二重鎖ＤＮＡループを意味する。他の型のベクターはファージベクターである。他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへ結合させうる。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する。更に、所定のベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターはここでは「組換え発現ベクター」（又は単に「組換えベクター」）と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」を相互交換可能に使用する場合が多い。
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識との結合により、さらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤を含むもの(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。さらに、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体又は半固体支持体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有するアミン又は有機キャップ基部分で置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。さらにポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
ここで使用される場合、「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
本願明細書において用いられるように、「肝細胞増殖因子」又は「ＨＧＦ」なる用語は、特別に又は文脈上別途示されない限り、ＨＧＦ／ｃ-ｍｅｔシグナル伝達過程を起こす条件下においてこの経路を活性化しうる任意の（天然／天然に生じるもの又は合成のもののいずれにせよ）天然の又は変異形のＨＧＦポリペプチドを指す。「野生型ＨＧＦ」なる用語は、一般に、天然に生じるＨＧＦタンパク質のアミノ酸配列を含有してなるポリペプチドを指す。「野生型ＨＧＦ配列」なる用語は、一般に、天然に生じるＨＧＦにおいてみられるアミノ酸配列を指す。
「抗体」及び「免疫グロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われ、モノクローナル抗体（例えば完全長又は無傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、単価抗体、多価抗体、多特異性抗体（例えば所望の生物学的活性を示す限りの二重特異性抗体）及び本明細書で記載される抗体断片が含まれる。抗体はヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟したものであり得る。
「抗体断片」は、無傷の抗体の部分のみを含有するものであり、該部分は完全な抗体中に存在する場合、その部分に通常伴う機能の少なくとも一、好ましくはほとんど又はすべてを保持する。
本願明細書において用いられるように、「抗原結合アーム」なる句は対象とする標的分子を特異的に結合する能力を有する本発明の抗体断片の構成成分を指す。一般に、そして、好ましくは、抗原結合アームはイムノグロブリンポリペプチド配列の複合体、例えばイムノグロブリンの軽鎖及び重鎖の可変ドメイン配列及び／又はＣＤＲである。
本願明細書において用いられるように、「Ｎ末端切断型重鎖」なる句は、完全長イムノグロブリン重鎖の全てでなく部分を含んでなるポリペプチドを指すものであり、欠損する部分は通常重鎖のＮ末端領域に位置するものである。欠損する部分には、可変ドメイン、ＣＨ1及びヒンジ配列の一部又は全体が制限されることなく含まれ得る。一般に、野生型ヒンジ配列が存在しない場合、Ｎ末端切断型重鎖の残りの定常ドメイン（一又は複数）は他のＦｃ配列（すなわち、本願明細書において記載される「第一」Ｆｃポリペプチド）に結合可能な構成成分を含有するであろう。例えば、前記構成成分は、ジスルフィド結合を形成することが可能な修飾残基又は付加システイン残基でありうる。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原に対している。さらに、典型的に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体、あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同性があり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体、あるいは他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか又は相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りこのような抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号;及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。また、以下の概説文献及びここに挙げる引用文献も参照のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、及び／又は本明細書中に開示したヒト抗体をつくるためのいずれかの技術を使用して、つくられたものである。この定義におけるヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特別に除く。
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のCDRに1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994); Schier他、Gene, 169:147-155 (1995); Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995); Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995); およびHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」、例えばレセプター、リガンド又は酵素））の「結合ドメイン」とイムノグロブリン定常ドメインのエフェクター成分とを組み合わす抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位（抗原結合部位）以外であるアドへシンアミノ酸配列（すなわち「異種性」）と、イムノグロブリン定常ドメイン配列との融合物を含んでなる。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意のイムノグロブリンから得ることができる。
「ヘテロ多量体」、「ヘテロ多量体性複合体」又は「ヘテロ多量体性ポリペプチド」は少なくとも第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドを含有する分子であり、該第二ポリペプチドはアミノ酸配列において少なくとも一アミノ酸残基が該第一ポリペプチドとは異なるものである。ヘテロ多量体は第一及び第二のポリペプチドにより形成される「ヘテロダイマー」を含有するかないしは、第一及び第二のポリペプチドにポリペプチドの付加が存在する高次の三次構造を形成することができる。
本明細書中で用いる「ポリペプチド」は、一般におよそ１０アミノ酸以上を有するペプチド及びタンパク質を意味する。
本明細書中で用いる「免疫抑制性質」なる句又はその異なる言い回しは、体液性免疫及び細胞性免疫に限らず、免疫系を伴う一又は複数の正常活性及び／又は機能の抑制を直接的又は間接的に引き起こす抗体の性質を意味する。
本明細書中で用いる「Ｆｃ領域」なる用語は、一般的にイムノグロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含有してなるダイマー複合体を指すものであり、Ｃ末端ポリペプチド配列は無傷の抗体のパパイン消化により生成されるものである。Ｆｃ領域は天然のＦｃ配列又は変異体Ｆｃ配列を含有しうる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ配列の境界はまちまちであるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ配列は、通常、およそCys226位又はおよそPro230位のアミノ酸残基からFc配列のカルボキシル末端まで延びていると定義される。免疫グロブリンのＦｃ配列は、通常、２つの定常ドメイン、１つのＣＨ２ドメイン及び１つのＣＨ３ドメインを含み、場合によってはＣＨ４ドメインを含む。ここでの「Ｆｃポリペプチド」はＦｃ領域を形成するポリペプチド鎖の一つを意味する。Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の好適なイムノグロブリンから得ることができる。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドは野生型のヒンジ配列の一部又はすべてを（一般的にはそのＮ末端に）含有してなる。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドは機能的ヒンジ配列又は野生型ヒンジ配列を含有していない。
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害（抗体依存性細胞性障害）」及び「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）が標的細胞上に結合した抗体を認識して、続く標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性応答を意味する。
「Ｆｃレセプター」及び「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。例えば、ＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。一般的には、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマレセプター）と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。他のイソ型(isotype)の免疫グロブリンもまた特定のＦｃＲに結合しうる（例としてJanewayら, Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (第４版, 1999)を参照のこと）。活性レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫レセプターチロシン依存性活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ）を含んでいる。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫レセプターチロシン依存性阻害性モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ）を含んでいる（Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照）。ＦｃＲに関しては、 Ravetch及びKinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲはここでの「ＦｃＲ」という用語によって包含される。また、該用語には、母性ＩｇＧが胎児に受け継がれる要因となっている新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる（Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))。
ここで用いる「ヒンジ配列」及びその異なる言い回しは、例えば、Janewayら, Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (第４版, 1999); Bloomら, Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreysら, J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202に示すように、当分野に公知のものを含む。
ここで使用される「シストロン」という用語は、概してポリペプチド鎖及び隣接コントロール領域をコードしているヌクレオチド配列を含む翻訳単位に相当する遺伝子要素を指すことを意図する。「隣接コントロール領域」は例えば、翻訳開始領域（ＴＩＲ；下記に定義されるようなもの）及び末端領域を含む。
ここで使用される、「翻訳開始領域」又はＴＩＲとは、関心のある遺伝子の翻訳開始の効力を提供する核酸領域を意図する。一般的に、特定のシストロン内にあるＴＩＲは、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と５'及び３'からＲＢＳの配列を包含する。ＲＢＳは、最小で、シャイン-ダルガーノ領域及び開始コドン（ＡＵＧ）を含むと定義される。従って、ＴＩＲはまた、翻訳される核酸配列の少なくとも一部を含む。いくつかの実施態様では、本発明のＴＩＲは、シストロン内の軽鎖又は重鎖をコードする配列の前にくるシグナルペプチドをコードする分泌シグナル配列を含む。ＴＩＲ変異体は、ＴＩＲの特性、例えば以下に定義されるようなその翻訳強度等を変えるＴＩＲ領域内配列変異（特に置換）を含んでなる。好ましくは、本発明のＴＩＲ変異体は、シストロン内の軽鎖及び重鎖をコードする配列の前にくる分泌シグナル配列の初めの２〜約１４、好ましくは約４〜１２、より好ましくは約６のコドン内での配列置換を含んでなる。
ここで使用される用語「翻訳強度」とは、ＴＩＲの一以上の変異体がポリペプチドの直接分泌に使用され、その結果を同じ培地及びアッセイ条件下で野生型ＴＩＲ又は幾つかの他のコントロールに比較して得た、コントロールシステムにおける分泌ポリペプチドの測定を意図する。いずれかの見解に限定する訳ではないが、ここで使用される「翻訳強度」は、例えば、ｍＲＮＡ安定性、リボソーム結合部位に結合するリボソームの能力、及び膜を超える転位座の機序の測定を含みうる。
「分泌シグナル配列」又は「シグナル配列」とは、細胞膜、例えば原核生物の内側の膜又は内側と外側の両方の膜を通して、対象となる新しく合成されたタンパク質の方向付けに使用することのできる短いシグナルペプチドをコードする核酸配列を意図する。このようにして、対象となるタンパク質、例えば免疫グロブリン軽鎖又は重鎖ポリペプチドは、原核宿主細胞の周辺に、あるいは培地中に分泌される。分泌シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドは、宿主細胞に内在しても、あるいはそれらは外因性でもよく、発現されるポリペプチドに本来あるシグナルペプチドを含む。分泌シグナル配列は、典型的には発現されるポリペプチドのアミノ末端に存在し、典型的にはポリペプチドの生合成と分泌の間に細胞質から酵素的に取り除かれる。従って、シグナルペプチドは、通常、成熟タンパク質産物には存在しない。
「遮断（ブロック）」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原（例えば、ｃ-ｍｅｔ及びＶＥＧＦレセプター）の生物学的活性を抑制又は減退させるものである。
本明細書中で用いる「アゴニスト抗体」は、対象となるポリペプチド（例えば、ＨＧＦ及びＶＥＧＦ）の少なくとも一の機能的活性を模倣する抗体である。
ここで用いる「腫瘍抗原」には、当分野でよく知られた意味であり、正常細胞と比較して腫瘍細胞上に差次的に発現する任意の分子が含まれる。いくつかの実施態様では、前記分子は正常細胞と比較して腫瘍細胞で検出可能なレベル又は有意に高レベルで発現される。いくつかの実施態様では、前記分子は正常細胞と比較して腫瘍細胞で検出可能なレベル又は有意に低レベルの生物学的活性を表す。いくつかの実施態様では、前記分子は、腫瘍細胞の腫瘍原性特定に関与することが知られているか又は考えられている。多くの腫瘍抗原が当分野で公知である。また、分子が腫瘍抗原であるかどうかも、例えばクローン原性アッセイ、形質転換アッセイ、インビトロ又はインビボ腫瘍形成アッセイ、ゲル移動アッセイ、遺伝子ノックアウト分析などの当業者に公知の技術及びアッセイに従って測定することができる。
「疾病」は、本発明の方法又は抗体を用いた治療によって利益を得る任意の症状である。これには、問題とする疾患に哺乳動物がかかりやすくなる病理学的症状を含む慢性及び急性の疾病又は疾患を含む。限定的なものではなく、ここで治療する疾患の例には、悪性及び良性の腫瘍；非白血病性及びリンパ球性悪性腫瘍；神経系、神経膠系、星状性、視床下部系及び他の腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性及び胚盤胞性疾患；及び炎症性、免疫性及び他の血管形成性関連疾患が含まれる。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)、腹膜癌、骨髄腫（例えば多発性骨髄腫）、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫／膠腫（例えば退形成星状細胞腫、多形性神経膠芽腫、退形成乏突起細胞腫、退形成乏樹状星状細胞腫）、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓性癌、並びに頭部及び頸部の癌が含まれる。
ここで言う「自己免疫性疾患」は個体自身の組織に由来する又はその組織に対して生じる非悪性疾患又は疾病である。ここでは、自己免疫性疾患は、特にＢ細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄芽球性白血病を除く悪性腫瘍又は癌性疾患ないし症状を明確に除く。自己免疫性疾患ないし疾病の例には、限定するものではないが、炎症反応、例えば乾癬および皮膚炎（例えば過敏性皮膚炎）を含む炎症性皮膚病；全身強皮症及び硬化症；炎症性腸疾患関連の反応（例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎）；呼吸窮迫症候群（成人呼吸窮迫症候群；ＡＲＤＳを含む）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；アレルギー性症状、例えばＴ細胞の浸潤ないし慢性炎症反応を伴う湿疹及び喘息及び他の症状；アテローム性動脈硬化；白血球癒着不全；慢性関節リウマチ；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；真正糖尿病（例えばＩ型糖尿病又はインシュリン依存性糖尿病）；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年型糖尿病；及び、一般的に結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症及び脈管炎でみられるサイトカイン及びＴリンパ球に媒介される急性及び遅発性過敏症と関連する免疫応答；悪性貧血（アジソン病）；白血球血管外遊出を伴う疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性疾患；多器官損傷症候群；溶血性貧血（限定するものではなく、クリオグロブリン血症又はクームズ陽性貧血症を含む）；重症筋無力症；抗原-抗体複合体媒介性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート-イートン筋無力症症候群；水疱性類天ぽうそう；ペンフィグス；自己免疫多腺性内分泌障害；ライター症候群；全身強直性症候群；ベーチェット疾患；巨細胞動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡネフロパシ；ＩｇＭ多発性神経炎；免疫血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）又は自己免疫血小板減少などが含まれる。
ここで使用されるところの「治療」は、治療されている個体又は細胞の天然の過程を改変するための臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床的病理の過程中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾病の発生又は再発の防止、症状の寛解、疾病の任意の直接的又は間接的病理的結果の低減、転移の防止、疾病の進行速度の低減、疾病状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が含まれる。ある実施態様では、本発明の抗体は疾患又は疾病の進行を遅らせるために用いられる。一実施態様では、本発明の抗体及び方法は腫瘍退行に効果を示す。一実施態様では、本発明の抗体及び方法は腫瘍／癌の成長の抑制に効果を示す。
「有効量」とは所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。本発明の抗体の「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び個体の体重、並びに個体に所望の応答を誘発する抗体の能力のような因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は抗体の任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回るものである。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には、予防的用量は疾患の初期ステージ又はその前の患者に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
本明細書中で用いる、本発明の抗体断片に関して「実質的にエフェクター機能を有さない」という句は、本発明の抗体断片の検出可能なエフェクター機能活性の量と該抗体の野生型グリコシル化相対物によって表される活性の量の差が当業者にとって明確に統計学的に有意であり、この場合に、本発明の抗体断片の活性量が野生型相対物によって表される活性量より低いことを意味する。一実施態様では、本発明の抗体断片は、統計的有意差である上記のバックグラウンドレベルであるエフェクター機能活性レベル（ＦｃＲｎ結合以外の）を表さない。本明細書中で用いる、本発明の抗体断片に関して「ほとんどあるいは全く免疫抑制性質がない」という句は、抗体が対象体に投与される際に生物学的に意味のある量の免疫抑制を誘発しないことを意味する。当分野で理解されるように、本発明の抗体と参照する相対物との間で比較できる限りにおいて、量的に又は質的に測定されてもよい。前記活性は、例えば本明細書で記載されるものを含み、当分野で公知の任意のアッセイ又は技術に従って測定又は検出することができる。本発明の抗体及びその参照する相対物についての活性量は平行して又は別々に実施して測定することができる。
ここで用いる「実質的に類似」、「実質的に同一」、「実質的に同じ」及びその異なる言い回しは、当業者が２つの数値（典型的には本発明の抗体に関与するものとその参照する相対物に関与するその他）の差異に、該値によって測定される生物学的、物理学的又は量的な性質上わずかに又は全く生物学的重要性がないと認められるほど、２つの数値が十分に高く類似していることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照する相対物の値の好ましくは約５０％以下、好ましくは約４０％以下、好ましくは約３０％以下、好ましくは約２０％以下、好ましくは約１０％以下である。
ここで用いる、他の抗体の形態（例えばＦａｂ断片相対物）と比較して本発明の抗体断片が「より安定している」又は「安定性が亢進している」及びその異なる言い回しは、本発明の抗体断片が参照する抗体（例えばＦａｂ断片相対物）と比較してインビボでの安定性において検出可能な／測定可能な増加を表すことを意味する。安定性は、本発明の抗体断片が対象体への該抗体断片の投与後のある時点で対象体内にどの程度残存しているかの指標として、半減期、クリアランス率及び／又は当分野で理解される任意の他のパラメータに基づくことができる。半減期及び／又はクリアランス率などの安定性パラメータの測定方法は当分野で公知であり、そのいくつかは本明細書中に記載されるものである。
「補体依存性細胞障害」及び「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。補体活性化経路は、補体系の第一補体（Ｃ１ｑ）が同系の抗原と複合体化した分子（例えば抗体）に結合することによって開始する。
一般的に「結合親和性」は、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原又はＦｃＲｎレセプター）との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（Ｋｄ）として表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原（又はＦｃＲｎレセプター）に弱く結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原（又はＦｃＲｎレセプター）により密接により長く結合したままとなる。
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、及び毒素、例えば細菌、糸状菌、植物又は動物起源のその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は酵素的に活性な毒素を含むように意図されている。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、MARINOL（登録商標）；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログトポテカン（HYCAMTIN（登録商標）、CPT-11（イリノテカン、CAMPTOSAR（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照）；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣＩリポソーム注射剤(DOXIL(登録商標))及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(gemcitabine) (GEMZAR(登録商標))、テガフル(tegafur) (UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(capecitabine) (XELODA(登録商標))、エポチロン(epothilone)、及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, OR）；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン（ELDISINE（登録商標）、FILDESIN（登録商標））；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ａｒａ-Ｃ」）；チオテパ；タキソイド類、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標))、パクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ)、及びドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン（VELBAN（登録商標））；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン（ONCOVIN（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標)）；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、及び5-FU及びロイコボビン(leucovovin)とオキサリプラチン（ELOXATINTM）を組み合わせた治療法の略称であるFOLFOXが含まれる。
またこの定義に含まれるものには、癌の成長を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）を含み、例えば、タモキシフェン（NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン(raloxifene)(EVISTA(登録商標))、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(ＦＡＲＥＳＴＯＮ(登録商標))；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節剤（ERD）；エストロゲンレセプターアンタゴニスト、例えばフルベストラント(fulvestrant) (FASLODEX(登録商標))；卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）アゴニスト、例えば酢酸リュープロリド(LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標))、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；その他抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール(ＭＥＧＡＳＥ(登録商標))、エキセメスタン(ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標))、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ボロゾール(ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標))、レトロゾール(ＦＥＭＡＲＡ(登録商標))、及びアナストロゾール(ＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標))である。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート（例えばBONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標)）、エチドロン酸(DIDROCAL(登録商標))、NE-58095、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ZOMETA(登録商標))、アレンドロネート(FOSAMAX(登録商標))、パミドロン酸(AREDIA(登録商標))、チルドロン酸(SKELID(登録商標))、又はリセドロン酸(ACTONEL(登録商標))、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)（１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮成長因子レセプター（EGF-R）；THERATOPE（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、及びＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤(例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標))；ラパチニブ（lapatinib ditosylate）（GW572016としても知られるErbB-2及びEGFR二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）；セレコシブ(celecoxib)などのＣＯＸ-２阻害剤(CELEBREX(登録商標)；４-(５-(４-メチルフェニル)-３-(トリフルオロメチル)-１Ｈ-ピラゾル-１-イル)ベンゼンスルホンアミド；及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
文脈により特に示されない限り、「第一」ポリペプチド及び「第二」ポリペプチドなる用語及びその異なる言い回しは、単に遺伝的同一性のみであり、特定のポリペプチド又は本発明の抗体の構成成分を特定するものではない。
「***」は、第一ポリペプチドの作用領域から突出する少なくとも一つのアミノ酸側鎖であり、したがって、ヘテロ多量体を安定化させるために隣接した作用領域（すなわち第二ポリペプチドの作用領域）内の代償的なキャビティ内に位置し、これによって例えばホモ多量体形成よりも好ましいヘテロ多量体形成を起こすものを意味する。***は、元の作用領域の中に存在してもよいかまたは総合的に導入されてもよい（例えば、作用領域をコード化している核酸を変えることによって）。通常、第一ポリペプチドの作用領域をコードする核酸は、***をコードするように変更される。これを達成するために、第一ポリペプチドの作用領域内の少なくとも一つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸は、元のアミノ酸残基より大きな側鎖容量を有する少なくとも一つの「移入」アミノ酸残基をコードする核酸によって置換される。複数の元の残基及び対応する移入残基があることが好ましいであろう。置換される元の残基の数の上限は、第一ポリペプチドの作用領域内のすべての残基の数である。様々なアミノ残基の側鎖容量は、以下の表に示される。
表１ アミノ酸残基の性質
Figure 2011172585
ａ 分子量アミノ酸から水の分子量を除したもの。Handbook of Chemistry and Physics, 第４３版. Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961からの値。
ｂ A.A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24:107-123, 1972からの値。
ｃ C. Chothia, J. Mol. Biol. 105:1-14, 1975からの値。近接可能な表面領域はこの引例の図６ないし２０に定義される。
***の形成のために好適な移入残基は、通常、天然に生じるアミノ酸残基であって、アルギニン(Ｒ)、フェニルアラニン(Ｆ)、チロシン(Ｙ)及びトリプトファン(Ｗ)から選択されるのが好ましい。トリプトファン及びチロシンは最も好適である。一実施態様では、***の形成のための元の残基は小さな側鎖容量、例えばアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、スレオニン又はバリンを有する。
「キャビティ」とは、第二ポリペプチドの作用領域から窪んでいるために第一ポリペプチドの近接する作用領域上の一致する***に対応する少なくとも一のアミノ酸側鎖を指す。前記キャビティは元の作用領域内に存在するかあるいは、合成的に導入されてもよい（例えば作用領域をコードする核酸を変更することによって）。通常、第二ポリペプチドの作用領域をコードする核酸は、キャビティをコードするために変更される。これを達成するために、第二ポリペプチドの作用領域内の少なくとも一つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸は、元のアミノ酸残基より小さな側鎖容量を有する少なくとも一つの「移入」アミノ酸残基をコードするＤＮＡによって置換される。複数の元の残基及び対応する移入残基があることが好ましいであろう。置換される元の残基の数の上限は、第二ポリペプチドの作用領域内のすべての残基の数である。様々なアミノ残基の側鎖容量は上記の表１に示される。キャビティの形成のために好適な移入残基は、通常天然に生じるアミノ酸残基であって、アラニン(Ａ)、セリン(Ｓ)、スレオニン(Ｔ)及びバリン(Ｖ)から選択されるのが好ましい。セリン、アラニン又はスレオニンが最も好適である。一実施態様では、キャビティの形成のための元の残基は、大きな側鎖容量、例えばチロシン、アルギニン、フェニルアラニン又はトリプトファンを有する。
「元の」アミノ酸残基は、元の残基より小さいかあるいはより大きな側鎖容量を有することができる「移入」残基によって置換されるものである。移入アミノ酸残基は、天然に生じるアミノ酸残基あるいは非天然に生じるアミノ酸残基でありえるが、好ましくは前者である。「天然に生じる」アミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされるものであり、上記の表１において列記されるものである。「非天然に生じる」アミノ酸残基とは、遺伝コードによってコードされないが、ポリペプチド鎖の隣接したアミノ酸残基（一又は複数）を共有結合することが可能である残基を意味する。非天然に生じるアミノ酸残基の例は、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及びその他アミノ酸残基類似体、例えばEllman等, Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)などに記載されるものである。このような非天然に生じるアミノ酸残基を生成するために、Noren等 Science 244: 182 (1989)及び上掲のEllman等の手順を用いることができる。簡単に言うと、これは、非天然に生じるアミノ酸残基によってサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化した後にＲＮＡのインビトロ転写及び翻訳を伴う。本発明の方法には少なくとも一の元のアミノ酸残基の置換を伴うが、複数の元の残基が置換されうる。通常、第一又は第二のポリペプチドの作用領域内の全残基のみに、置換される元のアミノ酸残基を含有しうる。典型的に、置換のための元の残基は「埋没される」。「埋没される」とは、残基が基本的に溶媒に近接しないことを意味する。一般に、移入残基は、起こりうる酸化ないしはジスルフィド結合の誤対合を防止するためのシステインではない。
***がキャビティ内に「配位可能」であるとは、第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドそれぞれの作用領域上の***及びキャビティの空間的位置と、***及びキャビティの大きさが、該***が作用領域での第一及び第二のポリペプチドの正常な会合を有意に混乱させることなくキャビティ内に位置する程度であることを意味する。Ｔｙｒ、Ｐｈｅ及びＴｒｐなどの***は典型的には作用領域の軸から垂直に伸びておらず、好適な高次構造をとらないので、対応するキャビティを有する***の配置は、Ｘ線結晶学又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって得られるような、三次元構造に基づいた***／キャビティ対のモデル化によるものである。これは、従来技術において広く認められた技術を用いて達成される。
「元の又は鋳型の核酸」とは、***又はキャビティをコードするために「変更する」ことができる（すなわち遺伝子操作するかないしは突然変異させる）対象とするポリペプチドをコードする核酸を意味する。元のあるいははじめの核酸は、天然に生じる核酸でもよいし、事前に変更させてある（例えばヒト化抗体断片）核酸を含んでもよい。核酸を「変更する」とは、元の核酸が対象とするアミノ酸残基をコードする少なくとも一つのコドンを挿入、欠損又は置換することによって変異させることを意味する。通常、元の残基をコードするコドンは、移入残基をコードするコドンによって置換される。このように遺伝的にＤＮＡを修飾する技術は、Mutagenesis: a Practical Approach, M.J. McPherson, 編集, (IRL Press, Oxford, UK. (1991)に概説されており、例えば、部位特異的突然変異、カセット突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異誘発が含まれる。したがって、元の／鋳型の核酸を変異させることによって、元の／鋳型の核酸によってコードされる元の／鋳型のポリペプチドは同様に変更される。
***又はキャビティは、合成手段、例えば組換え技術、インビトロペプチド合成法、前記の非天然に生じるアミノ酸残基を導入するための技術によって、ペプチドの酵素的又は化学的共役によって又はこれらの技術のいくつかの組合せによって、第一又は第二のポリペプチドの作用領域に「導入する」ことができる。したがって、「導入される」***又はキャビティは、「非天然に生じる」又は「非天然の」ものであり、天然のポリペプチド又は元のポリペプチド（例えばヒト化モノクローナル抗体）において存在しないことを意味する。
一般に、***を形成するための移入アミノ酸残基は、相対的に小さな数の「回転異性体」（例えば約３−６）を有する。「回転異性体(rotomer)」はアミノ酸側鎖のエネルギー的に好適な高次構造である。様々なアミノ酸残基の回転異性体の多くは、Ponders及びRichards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987)に概説される。
「単離された」ヘテロ多量体とは、その自然細胞培養物環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、ヘテロ多量体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。いくつかの実施態様では、ヘテロ多量体は、(１)ローリー(Lowry)法によって定量して９５重量％超の、最も好ましくは９９重量％超のタンパク質まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルー又は銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。
本発明のヘテロ多量体は通常、実質的な均質にまで精製される。「実質的に均質な」、「実質的に均質な形態」及び「実質的均質性」なる句は、産物が望ましくないポリペプチドの組合せ（例えばホモ多量体）に由来する副産物を実質的に欠いていることを表すために用いられる。精製度に関して表すとき、実質的均質性は副産物の量が、割合を重量で表すときに１０％を上回らないか、または５％以下であるか、または１％以下であるか、または０．５％以下であることを意味する。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、リボソーム結合部位、あるいは滅多に用いられない配列などの他のものを含む。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
（ベクター、宿主細胞及び組換え方法）
本発明の抗体の組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物（一般的に哺乳動物）由来の細胞である。
（原核生物の宿主細胞を用いた抗体生成）
ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はＰＣＲ法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能（異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方）及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
一般には、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種に由来するコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、宿主細胞と関連して使用される。そのベクターは、通常、複製開始点並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、一般的に大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性のコード遺伝子を含んでいるため、形質転換細胞を容易に同定することができる。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージも外来性タンパク質を発現する微生物によって使用可能なプロモータを含むか、含むように変更される。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例はCarter等の米国特許第５６４８２３７号に詳細に記載されている。
また、レプリコン及び宿主微生物と適合性のあるコントロール配列を含んでいるファージベクターを、これらの宿主との関連でトランスフォーミングベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ.ＴＭ.-１１のようなバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２のような感受性の宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターを作製する際に利用することができる。
本発明の発現ベクターは各ポリペプチド成分をコードする２又はそれ以上のプロモータ−シストロン（翻訳単位）対を含みうる。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流（５'）に位置している非翻訳配列である。原核生物のプロモーターは典型的には誘導性と構成的との二つのクラスのものがある。誘導性プロモーターは、例えば栄養分の有無又は温度の変化のような、培養条件の変化に応答してその調節下でシストロンの転写レベルを増大させるように誘導するプロモーターである。
様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータが非常にたくさん公知となっている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモータを除去し、本発明のベクター内に単離したプロモータを挿入することによって軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を生じさせるために使用することができる。ある実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、βガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターが含まれる。しかし、細菌中で機能性である他のプロモーター（例えば他の既知の細菌又はファージプロモーター）も好適である。そのヌクレオチド配列は発表されており、よって当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するリンカー又はアダプターを使用して標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを作用可能に結合させることができる（Siebenlist等 (1980) Cell 20:269）。
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を貫通して発現されるポリペプチドの転写を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるか、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部でありうる。この発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる（つまりシグナルペプチダーゼにより切断される）ものでなければならない。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識せずプロセシングする原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。一実施態様では、発現系の双方のシストロンに使用されるシグナル配列はＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。
他の態様では、本発明による免疫グロブリンは宿主細胞の細胞質内で産生されるので、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は必要でない。この点において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は発現され、折り畳まれ、集合して細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件を示し、発現したタンパク質サブユニットを好適に折り畳み、集合することができる宿主系が存在する（例として大腸菌ｔｒｘＢ−系）。Proba及びPluckthun Gene, 159:203 (1995)。
本発明は、発現されるポリペプチド成分の量的割合を本発明の抗体の分泌及び好適な集積効率が最大となるように調節することができる発現系を提供する。ポリペプチド成分の翻訳強度を同時に調節することによって少なくともある程度その調節が達成される。
翻訳強度を調節する一つの方法は、Simmons等の米国特許第５８４０５２３号に開示されている。このアプローチはシストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異体を利用する。与えられたＴＩＲに対して、ある範囲の翻訳強さを持つ一群のアミノ酸又は核酸配列変異体をつくり出すことができ、それによって、所望の発現レベルの特異的鎖に対してこの因子を調節するための簡便な手段を提供する。ＴＩＲ変異体はアミノ酸配列を改変することができるコドン変化を生じる一般的な突然変異誘発法によって産生することができるが、ヌクレオチド配列のサイレント変化が好ましい。ＴＩＲの変異には、例えばシグナル配列の変更と共に、シャイン-ダルガーノ配列の数又は間隔の変更が含まれうる。変異体シグナル配列を作成するためのある方法はシグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（つまり変化がサイレントである）コード配列の最初での「コドンバンク」の産生である。これは、各コドンの第三のヌクレオチド位置を変化させることによって、達成できる；加えて、幾つかのアミノ酸、例えばロイシン、セリン、及びアルギニンはバンクの作製に複雑さを付加し得る複数の第一及び第二の位置を有している。この突然変異誘発の方法はYansura等(1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158に詳細に記載されている。
好ましくは、そこの各シストロンに対してある範囲のＴＩＲ強さを有する一群のベクターが産生される。この制限された群は各鎖の発現レベルと様々なＴＩＲ強さの組合せ下で所望の抗体産物の収量の比較をもたらす。ＴＩＲ強さはSimmons等の米国特許第５８４０５２３号に記載されているレポーター遺伝子の発現レベルを定量することによって決定することができる。翻訳強度を比較することによって、所望の個々のＴＩＲｓが選択されて、本発明の発現ベクターコンストラクト中で組み合わされる。
本発明の抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属（例えば大腸菌）、バシラス属（例えば枯草菌）、エンテロバクター属、シュードモナス種（例えば緑膿菌）、ネズミチフス菌、霊菌(Serratia marcescans）、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ(Vitreoscilla)又はパラコッカス(Paracoccus)が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR を有する３３Ｄ３株(米国特許第5,639,635号)を含むW3110株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁；ATCC寄託番号27,325)及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌294 (ATCC 31,446), 大腸菌B, 大腸菌λ 1776 (ATCC 31,537)及び大腸菌RV308(ATCC 31,608) など、他の株及びその誘導体も好適である。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義した遺伝子型を有する上記の何れかの細菌の誘導体の構築方法は当業者に公知であり、例として, Bassら., Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。
抗体産生
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、そのＤＮＡを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地（ＬＢ）プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
炭素、窒素及び無機リン酸源の他に任意の必要なサプリメントを、単独で、又は複合窒素源のような他のサプリメント又は培地との混合物として導入される適切な濃度で含有させられうる。場合によっては、培養培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール及びジチオトレイトールからなる群から選択される一又は複数の還元剤を含みうる。
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、好適な温度は約２０℃から約３９℃、より好ましくは約２５℃から約３７℃の範囲、更により好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５から約９の範囲の任意のｐＨでありうる。大腸菌に対しては、ｐＨは好ましくは約６．８から約７．４、より好ましくは約７．０である。
本発明の発現ベクターに誘導性プロモータが用いられる場合、プロモータの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにＰｈｏＡプロモータが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。好ましくは、リン酸限定培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例として、Simmonsら., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照）。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。
一実施態様では、発現された本発明のポリペプチドは宿主細胞の細胞膜周辺中に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、一般的には浸透圧ショック、超音波処理又は溶解のような手段によって典型的には微生物を破壊することを含む。ひとたび細胞が破壊されると、細胞片又は全細胞を遠心分離又は濾過によって除去することができる。タンパク質は、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製することができる。あるいは、タンパク質は培養培地に輸送しそこで分離することができる。細胞を培養物から除去することができ、培養上清は濾過され、生成したタンパク質の更なる精製のために濃縮される。発現されたポリペプチドを更に単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロットアッセイ法のような一般的に知られている方法を使用して同定することができる。
本発明の一側面では、抗体産生は発酵法によって多量に受け継がれる。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１０００から１０００００リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ１００リットル以下の容積で、約１リットルから約１００リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約１８０−２２０のＯＤ５５０まで増殖したところで開始される。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約１２−５０時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
本発明のポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの正しい組み立てとフォールディングを改善するために、例えばＤｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ）又はＦｋｐＡ（シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ）のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999) J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等, 米国特許第６０８３７１５号；Georgiou等, 米国特許第６０２７８８８号；Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
発現された異種タンパク質（特にタンパク分解を受けやすいもの）のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、原核生物宿主細胞株を改変して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998)；Georgiou等, 米国特許第５２６４３６５号；Georgiou等, 米国特許第５５０８１９２号；Hara等 (1996) Microbial Drug Resistance 2:63-72に記載されている。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
抗体精製
ある実施態様では、本明細書に記載の生成した抗体タンパク質をさらに精製して、更なるアッセイ及び使用のために実質的に均一な調製物を得る。当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽***換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いたゲル濾過法。
一態様では、固形層に固定したプロテインＡを本発明の完全長抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Lindmark ら (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。プロテインＡを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面、より好ましくは孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムが好ましい。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインＡ固定固形層に適応し、プロテインＡに対象とする抗体を特異的に結合させる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
真核生物の宿主細胞を用いた抗体の生成
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む：シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末因子。
（ｉ）シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、多価抗体をコードするＤＮＡに読み枠を一致させて結合される。
（ｉｉ）複製開始点
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である（例として、ＡＴＣＣ ＣＲＬ-９０９６）。
あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
（ｉｖ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体ポリペプチド核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターにょって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体ポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
（ｖｉ）転写終結成分
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）;サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７); ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２); イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４); バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２); ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５); ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５); マウス***腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１);ＴＲＩ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
（ｉｘ）抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986)）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度（例として、約０−０．２５Ｍ塩）の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
活性のアッセイ
本発明の抗体は当該分野で知られている様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び生物学的機能について特徴付けることができる。
精製された免疫グロブリンは、限定されるものではないが、Ｎ末端シークエンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含む一連のアッセイによって更に特徴付けることができる。
本発明の特定の実施態様では、ここで生産された免疫グロブリンはその生物学的活性について分析される。ある実施態様では、本発明の免疫グロブリンはその抗原結合活性について試験される。当該分野で知られ、ここで使用することができる抗原結合アッセイには、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、エライザ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイのような技術を用いた任意の直接的又は競合的結合アッセイが制限なく含まれる。抗原結合アッセイは以下の実施例の項で解説する。
一実施態様では、本発明はすべてではなくいくつかのエフェクター機能を有する変更した抗体を考慮し、このことによって抗体のインビボ半減期が重要なある種のエフェクター機能（補体又はＡＤＣＣなど）が不要で有害である多くの手法の所望する候補となる。特定の実施態様では、生成した免疫グロブリンのＦｃ活性を測定して、所望の特性が維持されていることを確認する。インビボ及び／又はインビトロ細胞障害アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠損している（すなわちＡＤＣＣ活性をほとんど欠損している）が、ＦｃＲｎ結合能は維持していることを確認することができる。ＡＤＣＣに関与している第一細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現しており、その一方で単核細胞はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現している。造血系細胞でのＦｃＲ発現については、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の464頁の表3に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第5,500,362号又は同第5,821,337号に記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes ら. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデル内でインビボに評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合できない、つまりＣＤＣ活性を欠損していることを確認してもよい。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro ら., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載のように、ＣＤＣアッセイを行ってもよい。また、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期測定を、当分野で公知の方法、例えば実施例の項目で示す方法を用いて行うことができる。
ヒト化抗体
本発明は、ヒト抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は当分野でよく知られている。例えば、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワークとして受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、一方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
抗体変異体
一態様では、本発明は、Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドの作用面内に修飾を有する抗体断片を提供するものであり、ここでいう修飾によって異種性二量体化を容易にする及び／又は促進される。この修飾は、第一Ｆｃポリペプチド内への***と第二Ｆｃポリペプチド内への腔の導入を含むものであり、ここでいう***は第一Ｆｃポリペプチドと第二Ｆｃポリペプチドの複合体化を促進するために腔内に位置する。これらの修飾を有する抗体の生成方法は当分野で公知であり、例えば米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている。
ある実施態様では、本明細書中に記載の抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれうる。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体核酸中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせをその最終コンストラクトに達するまでなされることによって最終コンストラクトが所望の特徴を有する。配列を作製すると同時に目的の抗体アミノ酸配列にアミノ酸修飾を導入するのがよい。
突然変異誘発の好ましい位置である抗体の所定の残基又は領域の特定のために有用な方法は、Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され（例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）に置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。ついで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の変異体を導入することにより精製される。しかして、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体ないし細胞障害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素(例えばＡＤＥＰＴ)又はポリペプチドへの、抗体のＮ又はＣ末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基で置換されている。置換突然変異に対して最も興味深い部位は高頻度可変領域を含むが、ＦＲ変化も考えられる。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表２に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、以下の表に「例示的置換」と名前を付け、又はアミノ酸の分類に関して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてもよい。
表２
Figure 2011172585
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づくグループに分けられる：
(1) 疎水性：ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile；
(2) 中性親水性：Cys, Ser, Thr；
(3) 酸性：Asp, Glu；
(4) 塩基性：Asn, Gln, His, Lys, Arg；
(5) 鎖配向に影響する残基：Gly, Pro；及び
(6) 芳香族：Trp, Tyr, Phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
ある型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異を含む。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位（例えば６−７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）又は初期に調製された抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
本発明の免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域内に一以上のアミノ酸修飾を導入してＦｃ領域変異型を生成することが望ましい。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステイン修飾を含む、一以上のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾（例えば、置換）を有するヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含みうる。
当分野での記載や教示に従って、ある実施態様では、本発明の方法を用いた抗体が野生型の対応抗体と比較して例えばＦｃ領域内に一以上の変異を有することを考慮する。にもかかわらず、この抗体はその野生型対応物と比較して治療的有用性を示す実質的に同じ特徴を維持している。例えば、ＷＯ９９／５１６４２などに記載のようにＣ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を変更する（すなわち改良又は減少する）結果となるＦｃ領域内に特定の変異を生じさせることが考えられる。また、Ｆｃ領域変異型の他の例に関するDuncan & Winter Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第5,648,260号；米国特許第5,624,821号；及びWO94/29351を参照。
免疫コンジュゲート
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片）、又は放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）などの細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲート又は抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。
細胞障害性又は細胞***停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体−薬剤コンジュゲートを用いると(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第4,975,278号)、論理的に腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwinら., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowlandら., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowlandら., (1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liuら., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lodeら (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinmanら (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞***停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
ゼバリン(ZEVALIN)（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec）は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と111In又は90Y放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体−放射性同位体コンジュゲートである(Wisemanら (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wisemanら (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球（ＮＨＬ）に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)（登録商標）（ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals）は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として２０００年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第4970198号；同第5079233号；同第5585089号；同第5606040号；同第5693762号；同第5739116号；同第5767285号；同第5773001号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)は、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃などの治療用に第ＩＩ相試験へと進んでいる。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療の開発段階にある。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ（ＡＥ）及びモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌細胞上のルイスＹに特異的）及びｃＡＣ１０（血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的）(Doroninaら (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
このような免疫複合体（免疫コンジュゲート）の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。例として１９９３年１０月２８日公開のＷＯ９３／２１２３２を参照。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
メイタンシン及びメイタンシノイド
一実施態様では、本発明の抗体(完全長又は断片)は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する***阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
メイタンシノイド-抗体コンジュゲート
治療指標を改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、同５，４１６，０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
抗体-メイタンシノイドコンジュゲート(免疫コンジュゲート)
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１ Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ １(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
他の細胞障害剤
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)より)、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考察する。
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したＡＤＣが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの４６７−４９８頁を参照。
抗体薬剤コンジュゲートの調製
本発明の抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）において、抗体（Ａｂ）を、リンカー（Ｌ）を介して、一つ以上の薬剤部分（Ｄ）、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式ＩのＡＤＣはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態および試薬を用いて調製されうる：(１)共有結合の後に薬剤部分Ｄと反応してＡｂ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応；及び(２)共有結合の後に抗体の求核基と反応してＤ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ Ｉ
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、および（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオールおよび水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群およびリンカー試薬により共有結合を形成することができる：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ（ジチオトレイトール）による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン（トラウトの試薬）を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。
また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する（リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基を用いて反応させることができる）ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；US 5362852)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステルおよびアリールヒドラジド基：(ｉ)活性エステル（例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物）；(ｉｉ)アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(ｉｉｉ)アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基、が含まれる。
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
抗体誘導体
本発明の抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーかランダムコポリマー）、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
抗原特異性
本発明は任意の適切な抗原結合特異性を有する抗体に適用できる。好ましくは、本発明の方法に用いる抗体は、生物学的に重要なポリペプチドである抗原に特異的である。より好ましくは、本発明の抗体は哺乳動物の疾病又は疾患の治療又は診断に有用である。本発明の抗体は、限定するものではないが、遮断用抗体、アゴニスト抗体、中和用抗体又は抗体コンジュゲート（抱合体）が含まれる。治療用抗体の非限定的な例には、抗ｃ-ｍｅｔ、抗ＶＥＧＦ、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１、抗ＣＤ１８、抗ＣＤ４０、抗組織因子（ＴＦ）、抗ＨＥＲ２及び抗ＴｒｋＣ抗体が含まれる。非ポリペプチド抗原（例えば腫瘍関連糖脂質抗原）に対する抗体もまた考えられる。
抗原がポリペプチドである場合、抗原は膜貫通分子(例えばレセプター)あるいはリガンド、例えば成長因子でありうる。抗原の例には、例えば、レニン；ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α-１-アンチトリプシン；インシュリンＡ-鎖；インシュリンＢ-鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；ＶＩＩＩＣ因子、ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、及びフォン・ウィルブランド因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性物質；ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子-α及び-β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症タンパク質(ＭＩＰ-１-α)；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミューラー阻害物質；リラキシンＡ-鎖；リラキシンＢ-鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β-ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ-４のような細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原(ＣＴＬＡ)；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子のレセプター；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３、-４、-５又は-６（ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-５、又はＮＴ-６）、又はＮＧＦ-β等の神経成長因子等の神経栄養因子；血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の線維芽細胞成長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４、又はＴＧＦ-β５を含む、ＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インシュリン様成長因子-Ｉ及び-ＩＩ（ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩ）；ｄｅｓ(１-３)-ＩＧＦ-Ｉ（脳ＩＧＦ-Ｉ）、インシュリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ４０等のＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばＭ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、及びＧ-ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ-１からＩＬ-１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス性抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部等；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ-４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター；及び上に列挙したポリペプチドの何れかの断片が含まれる。
本発明の一実施態様に包含される抗体に対する抗原には、ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４及びＣＤ４６；ＥｒｂＢレセプターファミリーのメンバー、例えばＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター；細胞接着分子、例えばＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０.９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ、α４／β７インテグリン及びそのα又はβサブユニット（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）を何れか含むαｖ／β３インテグリン；成長因子、例えばＶＥＧＦ；組織因子（ＴＦ）、及びＴＧＦ-βアルファインターフェロン（α-ＩＦＮ）；インターロイキン、例えばＩＬ-８；ＩｇＥ；血液型抗原Ａｐｏ２、デスレセプター；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満(ＯＢ)レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ等々が含まれる。一実施態様では、ここでの最も好ましい標的はＶＥＧＦ、ＴＦ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＴＧＦ-β、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、Ａｐｏ２及びＣ２４である。
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は腫瘍抗原に特異的に結合可能である。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、腫瘍抗原がクラスター分化因子（すなわちＣＤタンパク質）でない腫瘍抗原に、特異的に結合可能である。いくつかの実施態様では、本発明の抗体はＣＤタンパク質に特異的に結合可能である。いくつかの実施態様では、本発明の抗体はＣＤ３又はＣＤ４以外のＣＤタンパク質に特異的に結合可能である。いくつかの実施態様では、本発明の抗体はＣＤ１９又はＣＤ２０以外のＣＤタンパク質に特異的に結合可能である。いくつかの実施態様では、本発明の抗体はＣＤ４０以外のＣＤタンパク質に特異的に結合可能である。いくつかの実施態様では、本発明の抗体はＣＤ１９又はＣＤ２０に特異的に結合可能である。いくつかの実施態様では、本発明の抗体はＣＤ４０に特異的に結合可能である。いくつかの実施態様では、本発明の抗体はＣＤ１１に特異的に結合可能である。一実施態様では、本発明の抗体は免疫細胞で発現されない抗原に結合する。一実施態様では、本発明の抗体はＴ細胞で発現されない抗原に結合する。一実施態様では、本発明の抗体はＢ細胞で発現されない抗原に結合する。
一実施態様では、本発明の抗体は細胞生存調節性因子に特異的に結合可能である。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は細胞増殖調節性因子に特異的に結合可能である。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は細胞周期調節に関与する分子に特異的に結合可能である。他の実施形態では、本発明の抗体は、組織発達又は細胞分化に関与する分子に特異的に結合可能である。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は細胞表面分子に特異的に結合可能である。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、細胞表面レセプターポリペプチドでない腫瘍抗原に結合可能である。
一実施態様では、本発明の抗体はリンホカインに特異的に結合可能である。他の実施態様では、本発明の抗体はサイトカインに特異的に結合可能である。
一実施態様では、本発明の抗体は脈管形成に関与する分子に特異的に結合可能である。他の実施態様では、本発明の抗体は血管形成に関与する分子に特異的に結合可能である。
他の分子と場合によっては抱合していてもよい可溶型抗原又はその断片を、抗体を産生するための免疫原として使用することができる。レセプターのような膜貫通分子に対しては、これらの分子の断片(例えばレセプターの細胞外ドメイン)を免疫原として使用することができる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として使用することもできる。そのような細胞は天然源(例えば癌細胞株)から取り出すことができ、又は膜貫通分子を発現するように組換え技術により形質転換された細胞であってもよい。抗体の調製に有用な他の抗原とその型は当業者には明らかであろう。
医薬製剤
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより（Remington's Pharmaceutical Sciences １６版, Osol, A. 編 (1980)）、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
ここでの製剤は、治療される特定の徴候のために必要ならば一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を持つものも含んでよい。そのような分子は、好適には、意図する目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル）に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences １６版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、本発明の免疫グロブリンを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、３７℃の水分に暴露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。
使用
例えば、本発明の免疫グロブリンは、インビトロ、エクスビボ及びインビボの治療法で用いてもよい。本発明は、従来の一価性抗体と比較して優れた特性を有する一価性抗体断片を用いることに基づく様々な方法を提供する。特定の病的状態では、一価性抗体を利用することが必要及び／又は望ましい。また、ある例では、治療的抗体は、免疫系媒介性活性、例えばエフェクター機能ＡＤＣＣ、食作用及びＣＤＣなどを伴わない治療的作用に効果を示しうる。このような場合、このような活性が実質的に減退するか又は排除される抗体の形態を生成することが望ましい。また、抗体が有効かつ効率よく作製されうる形態であれば有用である。本発明は、例えば治療法、予防薬及び診断法などの様々な目的のために使用することができる抗体を提供する。例えば、本発明は疾患の治療方法を提供するものであり、該方法は、治療を必要とする対象体に、単一抗原結合アームを含んでなる安定性の高い抗体断片が投与されることを含んでなるものであり、これによって疾患が治療される方法である。本明細書中に記載される何れかの本発明の抗体断片は、本明細書中に記載される治療的（又は予防的又は診断的）方法に使用することができる。
本発明の抗体は、インビトロ、エクスビボ及び／又はインビボで特異的抗原活性を部分的に又は完全にブロック（遮断）するアンタゴニストとして用いることができる。さらに、本発明の少なくともいくつかの抗体は、他の種から抗原活性を中和することができる。したがって、本発明の抗体は、例えば、抗原を含んでいる細胞培養物中、患者、又は、本発明の抗体が交差反応する抗原を有する他の哺乳類対象動物（例えばチンパンジ、ヒヒ、マーモセット、カニクイザルおよび赤毛猿、ブタ又はマウス）の特異的抗原活性を阻害するために用いることができる。一実施態様において、本発明の抗体は、抗原活性が阻害されるように抗原と抗体とを接触させることによって抗原活性を阻害するために用いることができる。抗原はヒトタンパク質分子であることが好ましい。
一実施態様において、本発明の抗体は、抗原活性が有害である疾患に罹患している対象体の抗原を阻害する方法に用いることができ、その方法は対象体の抗原活性が阻害されるように本発明の抗体を対象体に投与することを含む。好ましくは、抗原はヒトタンパク質分子であり、対象体は患者である。あるいは、対象体は、本発明の抗体が結合する抗原を発現する哺乳動物でありうる。また更に、対象体は、抗原が導入された哺乳動物でありえる（例えば、抗原の投与や、抗原導入遺伝子の発現による）。本発明の抗体は、治療的目的のために患者に投与することができる。さらに、本発明の抗体は、免疫グロブリンが獣医学の分野で、又はヒト疾患の動物モデルとして交差反応する抗原を発現する人間以外の哺乳動物（例えば霊長類、ブタ又はマウス）に投与することができる。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性（例えば用量のテストおよび投与の時間経過）を評価するために有効であるかもしれない。治療的に有効である本発明の遮断抗体には、例えば、限定するものではなく、抗ｃ-ｍｅｔ、抗ＶＥＧＦ、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１、抗インターフェロン、及び抗組織因子抗体が含まれる。本発明の抗体は一以上の抗原分子の異常発現及び／又は活性が関与する疾患、疾病又は症状、の治療、阻害、経過を遅延、再発を予防／遅延、寛解、又は予防に用いることができる。この疾患、疾病又は症状には、限定するものではないが、悪性及び良性の腫瘍；非白血病及びリンパ系の悪性腫瘍；神経系、神経膠、星状膠、視床下部、他の腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性、胞胚腔性の疾患；及び炎症性、血管形成性、免疫系の疾患が含まれる。
一態様では、本発明の遮断抗体はリガンド抗原に特異的で、リガンド抗原を伴うリガンド-レセプタ相互作用をブロックするかまたは妨げることによって、対応するシグナル経路および他の分子又は細胞性の現象を阻害することによって抗原活性を阻害する。また、本発明は必ずしもリガンド結合を阻害するというわけではなくて、レセプター活性化を妨ぐレセプター特異的な抗体を特徴とし、それによって通常リガンド結合によって開始する任意の応答を阻害する。また、本発明は、好ましくは又は排他的にリガンド-レセプター複合体と結合する抗体を包含する。また、本発明の抗体は、特定の抗原レセプターのアゴニストとして作用し、それによって、リガンド媒介性のレセプター活性の活性化を完全に又は部分的に潜在化、亢進又は活性化する。
ある実施態様では、細胞障害性剤とコンジュゲートした抗体を含んでなる免疫コンジュゲートを患者に投与する。いくつかの実施態様では、免疫コンジュゲート及び／又はそれが結合する抗原が細胞に内在化されていると、結合する標的細胞を殺す際の免疫コンジュゲートの治療効果が増す。一実施態様において、細胞障害性剤は標的細胞内の核酸を標的とするか又は妨げる。このような細胞障害性剤の例には、本明細書に記載の何れかの化学療法剤（例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシン）、放射性同位元素、又はＲＮＡ分解酵素ないしＤＮＡエンドヌクレアーゼが含まれる。
本発明の抗体は、単独で、または、他の組成物と組み合わせて治療に用いることができる。例えば、本発明の抗体は、他の抗体、化学療法剤（一又は複数）（化学療法剤の混合を含む）、他の細胞障害性剤（一又は複数）、抗血管形成剤（一又は複数）、サイトカインおよび／または増殖阻害性剤（一又は複数）と同時に投与してもよい。本発明の抗体が腫瘍成長を阻害する場合、腫瘍成長を阻害する一つ以上の他の治療薬と組み合わせることが特に望ましい。例えば、転移性乳癌の治療に、ＶＥＧＦ活性を遮断する抗ＶＥＧＦ抗体を抗ＥｒｂＢ抗体（例えばハーセプチン(登録商標)抗ＨＥＲ２抗体）と組み合わせてもよい。あるいは又は加えて、放射線療法（例えば、外部光線照射、又は放射性標識した抗体などの作用剤を用いた治療）を患者に併用してもよい。上記の併用治療には、併用投与（２以上の作用剤が同じか又は別の製剤に包含される）及び別々の投与、別々の場合には、本発明の抗体は補助治療（一又は複数）の前及び／又はその後に投与することができる。
本発明の抗体（及び補助治療薬）は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与する。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下的な投与を含む。加えて、抗体を、特に抗体の用量を減少して、パルス注入によって好適に投与する。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって投与することができる。
本発明の抗体組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与する。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、および医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するかまたは治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の本発明の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。一般的に、以前用いたのと同じ用量及び投与経路で、又は前回用いた用量の１〜９９％で用いる。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の好適な用量は（単独で用いる場合、又は化学療法剤などの他の作用剤と組み合わせて用いる場合）、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量である。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体の用量の例は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。ゆえに、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一以上の用量を（又はそれらを組み合わせて）患者に投与してもよい。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は３週ごとに投与してもよい（例えば患者に約２〜約２０、例えば約６用量の抗体が投与される）。初期のより高い負荷投与量の後、一以上のより低い用量を投与してもよい。例示的用量療法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量の後、約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量抗体を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
製造品
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器の又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、それのみによって又は他の組成物と組み合わせて症状を治療、予防及び／又は診断するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる）。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌のような選択した症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）組成物を中に収容し、その組成物が本発明の抗体を含む第一の容器と；（ｂ）組成物を中に収容し、その組成物が更なる細胞毒性剤を含む第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二の抗体組成物を癌などの特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の（又は第三の）容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
以下に、本発明の方法及び組成物の実施例を示す。上記の概要的解説に示した様々な他の実施態様が実施しうる。
実施例１ 本発明の抗体断片の生成及び特徴づけ（以下、「一アーム形抗体」又は「Ｆａｂ／ｃ抗体」とも呼称する）
発現ベクターの構築
完全長又はＦａｂ／ｃ抗ｃ-ｍｅｔ抗体の発現のためのプラスミドはすべて、重鎖及び軽鎖及びＦｃ断片の転写のための独立したｐｈｏＡプロモータ（ＡＰ）（Kikuchi等, Nucleic Acids Res., 9: 5671-5678 (1981)）を基として、それに転写開始のためのシャイン-ダルガーノ配列（Yanofsky等, Nucleic Acids Res., 9: 6647-6668 (1981)及びChang等, Gene, 55: 189-196 (1987)）が続く、独立したシストロンシステム（Simmons等, J. Immunol. Methods, 263: 133-147 (2002)）に基づくものであった。加えて、耐熱性毒素ＩＩシグナル配列（ＳＴＩＩ）（Picken等, Infect. Immun., 42: 269-275 (1983)及びLee等, Infect. Immun., 42: 264-268 (1983)）を、重鎖及び軽鎖及びＦｃ断片の周辺質分泌に用いた。翻訳開始領域（ＴＩＲ）内にサイレントコドン変異を含有する、相対的な翻訳強度を測定した前述のＳＴＩＩシグナル配列変異形を用いて、両鎖及びＦｃ断片の翻訳を良好にコントロールした（Simmons及びYansura, Nature Biotechnol., 14: 629-634 (1996) and Simmons et al., J. Immunol. Methods, 263: 133-147 (2002)）。最後に、λｔ0転写ターミネータ（Schlosstissek及びGrosse, Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987)）、を両鎖及びＦｃ断片のコード配列の下流に配置した。すべてのプラスミドはｐＢＲ３２２ベースのベクター系のフレームワークを用いる（Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43: 77-90 (1978)）。起源抗ｃ-ｍｅｔ抗体は、米国特許第５,６８６,２９２号；同第５，６４６，０３６号；同第６，２０７，１５２号；同第６，２１４，３４４号及び同第６，４６８，５２９号に記載される5Ｄ5抗体であった。5Ｄ5起源抗体のハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣ番号ＨＢ-１１８９５（ハイブリドーマ５Ｄ５.１１.６）として、アメリカ培養細胞系統保存機関（12301 Parklawn Drive, Rockville, Md., USA）に既に寄託された（寄託日：１９９５年５月２３日）。
プラスミドｐｘｃＭ１１Ｃ
キメラ５Ｄ５ 抗ｃ-ｍｅｔ抗体をコードする所望のｐｘｃＭ１１Ｃプラスミドを生成するするために２つの中間型(intermediate)プラスミドを用いた。。始めに、５Ｄ５重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々の鎖の発現のためにｐＢＲ３２２ベースのプラスミド上に別々に移入した。以下はこれら中間型プラスミドｐｘｃＭＬＣ及びｐｘｃＭＨＣの調製の後のｐｘｃＭ１１Ｃの構築について記載する。
ｐｘｃＭＬＣ
このプラスミドは、マウス５Ｄ５抗体の軽鎖可変ドメインを完全長抗体生成に関して互換性を持つヒト軽鎖フレームワークへ移入するために構築した。このプラスミドの構築には３つのＤＮＡ断片のライゲーションが伴う。第一ものは、小さなＭｌｕＩ-ＢａｍＨＩ断片が除去されているｐＰｈｏ５１ベクターであった（Simmons及びYansura, Nature Biotechnol, 14: 629-634 (1996)、変異形１）。ライゲーションの第二部分は、軽鎖の最後の１５アミノ酸、λｔ0転写終結区及びｔｅｔ遺伝子を開始領域をコードするｐＳＴ７ＬＣ由来のおよそ５１６の塩基対のＡｌｗＮＩ-ＢａｍＨＩ断片であった。プラスミドｐＳＴ７ＬＣは、ＳＴＩＩシグナル配列の下流にヒトκ軽鎖を有する変異形６の誘導体である（上記参照）。ライゲーションの第三部分は、５Ｄ５ Ｆａｂ配列を含有するプラスミドから以下のプライマー：
5’ - TAAATTTAACGCGTACGCTGACATTATGATGTCCCAGTCTCCATCC (配列番号：９)
5’ - GGGCGAGCTCAGGCCCTGATGGGTGACTTCGCAGGC (配列番号：１０)
を用いて生成されるおよそ６２３塩基対のＭｌｕＩ-ＡｌｗＮＩ ＰＣＲ断片であった（以下の実施例２では「５Ｄ５ Ｆａｂのクローニング及び組み換え発現」と記載）。
ｐｘｃＭＨＣ
このプラスミドは、マウス５Ｄ５抗体の重鎖可変ドメインを完全長抗体生成に関して互換性を持つヒト重鎖フレームワークへ導入するために構築した。このｐｘｃＭＨＣの構築には２つのＤＮＡ断片のライゲーションが伴う。第一のものは、小さなＭｌｕＩ-ＢｓｔＥＩＩ断片が除去されているｐＳＴ２ＨＣベクターであった。プラスミドｐＳＴ２ＨＣは、ヒトＩｇＧ１重鎖とＳＴＩＩシグナル配列の下流を融合した変異形３の誘導体である（上記参照）。ライゲーションの第二部分は、５Ｄ５ Ｆａｂ配列を含有するプラスミドから以下のプライマー：
5’ - GCTACAAACGCGTACGCTCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGG (配列番号：１１)
5’ - AAGAGACGGTGACCGAGGTTCCTTGACC (配列番号：１２)
を用いて生成されるおよそ３４６塩基対のＭｌｕＩ-ＢｓｔＥＩＩ ＰＣＲ断片であった（以下の実施例２では「５Ｄ５ Ｆａｂのクローニング及び組み換え発現」と記載）。
ｐｘｃＭ１１Ｃ
ｐｘｃＭ１１Ｃプラスミドは、完全長５Ｄ５キメラ抗体を発現するように構築した。プラスミドの構築には４つのＤＮＡ断片のライゲーションが伴う。第一のものは、小さなＭｌｕＩ-ＢｓｔＥＩＩ断片が除去されているｐａＴＦ２０ベクターであった（Simmons等, J. Immunol. Methods, 263: 133-147 (2002)、ｐａＴＦ２０は１の軽鎖及び１の重鎖のＴＩＲを有する多シストロン性ベクターである）。ライゲーションの第二部分は、ｐｘｃＭＬＣ由来のおよそ６２３塩基対のＭｌｕＩ-ＡｌｗＮＩ断片であった。第三部分は、ｐａＴＦ５０由来のおよそ５４７塩基対のＡｌｗＮＩ-ＢｓｉＷＩ断片であった（上記を参照；ｐａＴＦ５０は、１の軽鎖及び１の重鎖のＴＩＲを有する独立したシストロンベクターである）。ライゲーションの最終部分は、ｐｘｃＭＨＣ由来のおよそ３４９塩基対のＢｓｉＷＩ-ＢｓｔＥＩＩ断片であった。
プラスミドｐｘｃＭ１１Ｃ-Ｆｃ
ｐｘｃＭ１１Ｃ-Ｆｃの構築のために、ＡＰプロモーター、ＳＴＩＩシグナル配列及びλｔ0転写終結区を含む上記の調節要素すべてを有するＦｃ断片の発現をコードするカセットを、ｐｘｃＭ１１Ｃプラスミドに加えた。ｐｘｃＭ１１ｃ-Ｆｃの構築につながる２つのプラスミド、ｐＢＲ３２２.ＶＮＥＲＫ.ＨＣ及びｐＢＲ３２２.Ｆｃが始めに記載のように必要である。
ｐＢＲ３２２.ＶＮＥＲＫ.ＨＣ
ｐＢＲ３２２.ＶＮＥＲＫ.ＨＣプラスミドは、ＳＴＩＩシグナル配列の下流にヒト重鎖を有する変異形１の誘導体である（Simmons及びYansura, Nature Biotechnol, 14: 629-634 (1996)）。このプラスミドは、２つのＤＮＡ断片を共にライゲーションすることによって構築した。第一ものは、小さなＥｃｏＲＩ-ＣｌａＩ断片が除去されているベクターｐＢＲ３２２であった。ライゲーションの第二部分は、ＡＰプロモーター、ＳＴＩＩシグナル配列、重鎖、λｔ0転写終結区及びｔｅｔ遺伝子の開始領域をコードするｐＶＧ11.ＶＮＥＲＫから以下のプライマー：
5’ - TTTCCCTTTGAATTCTTGGTTGTTAACGTTGCCGACGCGCATC (配列番号：１３)
5’ -TTTCCCTTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGTAAACAATAAAAAACGCCC (配列番号：１４)
を用いて生成されるおよそ１８８５塩基対のＥｃｏＲＩ-ＣｌａＩ ＰＣＲ断片であった。
プラスミドｐＶＧ１１.ＶＮＥＲＫは、軽鎖及び重鎖可変ドメインが抗ＶＥＧＦ抗体（ＶＮＥＲＫ）に変化されている１の軽鎖及び１の重鎖のＴＩＲｓを有する独立したシストロンベクターの誘導体である（Simmons等, J. Immunol. Methods, 263: 133-147 (2002)）。
ｐＢＲ３２２.Ｆｃ
ｐＢＲ３２２.Ｆｃプラスミドは、上記の調節要素をすべて有するＦｃ断片の発現をコードするｐＢＲ３２２.ＶＮＥＲＫ.ＨＣプラスミドの誘導体である。
ｐＢＲ３２２.Ｆｃプラスミドは、２つのＤＮＡ断片を共に連結させることによって構築した。第一のものは、小さなＭｌｕＩ-ＮｓｉＩ断片が除去されたベクターｐＢＲ３２２.ＶＮＥＲＫ.ＨＣであった。ライゲーションの第二部分は、アミノ酸ＳＧＴＴの後にヒトＩｇＧ1のアミノ酸２２１〜４２９をコードするｐＪＡＬ２２６からのおよそ１３１９塩基対のＭｌｕＩ-ＮｓｉＩ断片であった。ｐＪＡＬ２２６は、ＳＴＩＩシグナル配列の下流にヒトＦｃ断片を有する変異形３の誘導体である（Simmons及びYansura, Nature Biotechnol, 14: 629-634 (1996)）。
ｐｘｃＭ１１Ｃ-Ｆｃ
ｐｘｃＭ１１Ｃ-Ｆｃは、２つのＤＮＡ断片を共に連結させることによって構築した。第一のものは、小さなＨｐａＩ-ＣｌａＩ断片が除去されたベクターｐｘｃＭ１１Ｃであった。ライゲーションの第二部分は、ｐＢＲ３２２.Ｆｃ由来のおよそ１１９８塩基対のＨｐａＩ-ＣｌａＩ断片であった。このライゲーションにより、所望のプラスミド消化型ｐｘｃＭ１１Ｃ-Ｆｃが生じた。
プラスミドｐｘｃＭ１１Ｃ.Ｈ-Ｆｃ.Ｋ
プラスミドｐｘｃＭ１１Ｃ.Ｈ-Ｆｃ.Ｋは、ｐｘｃＭ１１Ｃ重鎖のＣＨ３ドメインを「孔」（本明細書において「キャビティ」とも称する）突然変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を有するＣＨ３ドメインで置換したｐｘｃＭ１１Ｃ-Ｆｃの誘導体である（Merchant等, Nature Biotechnology, 16:677-681 (1998)）。加えて、Ｆｃ断片のＣＨ３ドメインを、「ノブ(knob)」（本明細書において「***」とも称する）突然変異（Ｔ３６６Ｗ）を有するＣＨ３ドメインで置換した（上記を参照）。
ｐｘｃＭ１１Ｃ.Ｈ
プラスミドを２工程で構築した。第１工程では、２つのＤＮＡ断片を共にライゲーションすることによって「孔」突然変異導入した。第一のものは、小さなＳａｃＩＩ-ＮｓｉＩ断片が除去されたベクターｐｘｃＭ１１Ｃであった。ライゲーションの第二部分は、ｐＢＲ３２２.ＶＮＥＲＫ.ＨＣ.Ｈ由来のおよそ４１１塩基対のＳａｃＩＩ-ＮｓｉＩ断片であった。ｐＢＲ３２２.ＶＮＥＲＫ.ＨＣ.Ｈは「孔」突然変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）が導入されたｐＢＲ３２２.ＶＮＥＲＫ.ＨＣプラスミドの誘導体である（上記参照）（Merchant等, Nature Biotechnology, 16:677-681 (1998)）。この中間型プラスミドをｐｘｃＭ１１Ｃ.Ｈと呼称する。
ｐｘｃＭ１１Ｃ.Ｈ-Ｆｃ.Ｋ
第２工程により、「ノブ」突然変異をＦｃ断片に導入して、２つのＤＮＡ断片のライゲーションを行った。第一のものは、小さなＣｌａＩ-ＨｐａＩ断片が除去されたベクターｐｘｃＭ１１Ｃ.Ｈであった。ライゲーションの第二部分は、「ノブ」突然変異を有するＦｃ断片の発現カセットをコードするｐＢＲ３２２.Ｆｃ.Ｋ由来のおよそ１１９８塩基対のＣｌａＩ-ＨｐａＩ断片であった。ｐＢＲ３２２.Ｆｃ.Ｋは、「ノブ」突然変異（Ｔ３６６Ｗ）（Merchant等, Nature Biotechnology, 16:677-681 (1998)）及び上記すべての調節要素を有するＦｃ断片の発現をコードするｐＢＲ３２２.Ｆｃプラスミド（上記参照）の誘導体である。このライゲーションにより、ｐｘｃＭ１１Ｃ.Ｈ-Ｆｃ.Ｋと称する所望のプラスミドが生じた。
抗ｃ-Ｍｅｔ一アーム形Ｆａｂ／ｃ抗体の発現及び特徴づけ
親のコンストラクト（５Ｄ５抗ｃ-ＭｅｔのｐｘｃＭ１１Ｃ）及び一アーム形Ｆａｂ／ｃ抗体コンストラクト（ｐｘｃＭ１１Ｃ-Ｆｃ）を用いて抗体の小規模誘導を行った。各々のコンストラクトの小規模発現のために、宿主細胞として、大腸菌株３３Ｄ３（Ｗ３１１０ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ-ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲ）を用いた。形質転換後、選択された形質転換体選択候補を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を添加した５ｍＬのＬｕｒｉａ―Ｂｅｒｔａｎｉ培地に播種して、終夜培養振とう器上で３０℃で生育した。次いで、それぞれの培養物を、メディアをＣ.Ｒ.Ａ.Ｐ.リン酸制限培地にて希釈（１:１００）した（Simmons等, J. Immunol. Methods 263:133-147 (2002)）。次いで、カルベニシリンを５０μｇ／ｍＬの濃度で誘導培養物に添加し、培養物を培養振とう器上で３０℃、およそ２４時間生育した。特に明記しない限り、振とうフラスコ誘導はすべて５ｍＬの容量で行った。
誘導された培養物からの非還元型全細胞溶解物を、以下の通りに調製した：（１）１ＯＤ600ｍＬの誘導試料を、微量遠心管チューブにて遠心分離した；（２）それぞれのペレットを、９０μＬのＴＥ（１０ｍＭ トリスｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した；（３）１０μＬの１００ｍＭ ヨード酢酸（Sigma I-2512）を各々の試料に添加して、任意の遊離システインのブロック及びジスルフィド混合の予防を行った；（４）２０μＬの１０％ ＳＤＳを、各々の試料に加えた。試料をボルテックス混合して、およそ９０℃で３分間加熱し、それから再びボルテックス混合した。試料が室温までに冷却した後、７５０μＬのアセトンを加えてタンパク質を沈殿させた。試料をボルテックス混合し、およそ１５分間、室温に置いた。マイクロ遠心機にて５分間、遠心した後、各々の試料の上清を吸引除去し、それぞれのタンパク質ペレットを、５０μＬ ｄＨ２Ｏ＋５０μＬ ２Ｘ ＮＯＶＥＸ ＳＤＳサンプルバッファに再懸濁した。次いで、試料をおよそ９０℃で４分間加熱し、よくボルテックス混合して、室温まで冷却した。そうして、最終的に５分間の遠心分離を行い、上清をきれいなチューブへ移した。
誘導された培養物からの還元型全細胞溶解物を、以下の通りに調製した：（１）１ＯＤ600ｍＬの誘導試料を、微量遠心管チューブにて遠心分離した；（２）それぞれのペレットを、９０μＬのＴＥ（１０ｍＭ トリスｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した；（３）１０μＬの１Ｍ ジチオスレイトール（Sigma D-5545）を各々の試料に添加して、ジスルフィド結合を還元した；（４）２０μＬの１０％ ＳＤＳを、各々の試料に加えた。試料をボルテックス混合して、およそ９０℃で３分間加熱し、それから再びボルテックス混合した。試料が室温までに冷却した後、７５０μＬのアセトンを加えてタンパク質を沈殿させた。試料をボルテックス混合し、およそ１５分間、室温に置いた。マイクロ遠心機にて５分間、遠心した後、各々の試料の上清を吸引除去し、それぞれのタンパク質ペレットを、１０μＬの１Ｍ ジチオスレイトール＋４０μＬ ｄＨ２Ｏ＋５０μＬ ２Ｘ ＮＯＶＥＸ ＳＤＳサンプルバッファに再懸濁した。次いで、試料をおよそ９０℃で４分間加熱し、よくボルテックス混合して、室温まで冷却した。そうして、最終的に５分間の遠心分離を行い、上清をきれいなチューブへ移した。
調製後、各々の試料の５−８μＬを１．０ｍｍ ＮＯＶＥＸ製の１２％ トリス-グリシン ＳＤＳ-ＰＡＧＥの１０のウェルに流し、〜１２０ボルトで１．５〜２時間、電気泳動にかけた。次いで、結果として生じるゲルを、クーマシーブルーで染色するかあるいはウエスタンブロット分析に用いた。
ウエスタンブロット分析のために、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを１０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液, ｐＨ１１＋３％ メタノール中のニトロセルロース膜（ＮＯＶＥＸ）上で電気的にブロットした。次いで、膜を、１×ＮＥＴ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ トリス ｐＨ７．４、０．０５％ トリトンＸ-１００）＋０．５％ ゼラチン溶液を用いて、およそ３０分から１時間室温で振とうして反応を遮断した。遮断工程後、抗Ｆａｂウエスタンブロット分析のために膜を１×ＮＥＴ＋０．５％ ゼラチン＋抗Ｆａｂ抗体（ヒトＩｇＧ Ｆａｂに対するペルオキシダーゼ抱合ヤギＩｇＧ分画；ＣＡＰＰＥＬ＃５５２２３）溶液中に置いた。抗Ｆａｂ抗体希釈液は、抗体のロットに従って、１：５０,０００から１：１,０００,０００までの範囲とした。あるいは、抗Ｆｃウエスタンブロット分析のために、膜を１×ＮＥＴ＋０．５％ ゼラチン＋抗Ｆｃ抗体（ヒトＦｃ断片に対するペルオキシダーゼ抱合ヤギＩｇＧ分画；ＢＥＴＨＹＬ＃Ａ８０-１０４Ｐ-４１）溶液に置いた。抗Ｆｃ抗体希釈液は、抗体のロットに従って、１：５０,０００から１:２５０,０００までの範囲とした。何れの場合の膜も室温で浸透しながら終夜抗体溶液に置いた。翌朝、膜を、１×ＮＥＴ＋０．５％ ゼラチンにて最低１０分で３回、その後ＴＢＳ（２０ｍＭ トリスｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ）にて１５分で１回洗浄した。抗Ｆａｂ抗体及び抗Ｆｃ抗体に結合したタンパク質バンドは、Amersham Pharmacia Biotech ECL検出法及びＸ線フィルムに膜を曝すことによって可視化した。
抗ｃ-Ｍｅｔ Ｆａｂ／ｃ抗体発現についての抗Ｆａｂウエスタンブロットの結果を図１に示す。レーン１では完全に折り畳まれて集積した完全長抗体、レーン２では一アーム形Ｆａｂ／ｃ抗体の発現が示された。抗Ｆａｂ抗体がＦｃ断片を結合することができないために検出されないことを注記する。非還元試料では、完全長抗ｃ-Ｍｅｔ抗体とＦｃ断片との共発現により、完全に折り畳まれて集積した完全長抗体から、完全に折り畳まれて集積した一アーム形Ｆａｂ／ｃ抗体まで、実質的に推移した。還元試料では、完全長抗ｃ-Ｍｅｔ抗体及び一アーム形抗ｃ-Ｍｅｔ Ｆａｂ／ｃ抗体について検出された重鎖及び軽鎖の量は同じである。おそらく分泌経路にわずかな補助機能があるために、一アーム形抗ｃ-Ｍｅｔ Ｆａｂ／ｃコンストラクトの軽鎖前駆体の量にわずかな増加がみられた。
同様に、抗Ｆｃウエスタンブロットの結果を図２に示す。それらもレーン２では完全に折り畳まれて集積した一アーム形Ｆａｂ／ｃ抗体の発現が示された。抗Ｆｃ抗体は軽鎖を結合できないので検出されない。非還元試料では、完全長抗ｃ-Ｍｅｔ抗体とＦｃ領域との共発現により、完全に折り畳まれて集積した完全長抗体から完全に折り畳まれて集積した一アーム形Ｆａｂ／ｃ抗体までの推移が示された。加えて、Ｆｃポリペプチド単量体及び二量体も、抗Ｆｃウエスタンブロットで検出される。還元試料では、完全長抗ｃ-Ｍｅｔ抗体及び一アーム形抗ｃ-Ｍｅｔ Ｆａｂ／ｃ抗体発現について検出される重鎖の量が同じである。おそらく一アーム形Ｆａｂ／ｃ抗体コンストラクトにより分泌経路にいくらか補助機能があるために、前駆体Ｆｃ断片の量も少ない。
上記のデータから明らかなように、一次抗体種が所望の一アーム形Ｆａｂ／ｃ抗体であるイムノグロブリン集団を生成することは可能である。しかしながら、抗体の完全な形態（すなわち完全に折り畳まれて集積された抗ｃ-Ｍｅｔ完全長抗体）は、抗Ｆａｂ及び抗Ｆｃ両方のウエスタンブロット分析によって依然として検出可能だった。抗ｃ-ｍｅｔ ５Ｄ５抗体の完全な形態がｃ-ｍｅｔレセプターのアゴニストであり、アンタゴニスト効果を必要とする治療的スキームでは望ましくないため、通常、生成される抗体の完全な形態の量を最小限にすることが望ましい。
***及びキャビティ（以下、「孔へのノブ」とも称する）を含んでなる一アーム形Ｆａｂ／ｃ 抗ｃ-Ｍｅｔ抗体の発現及び特徴づけ
抗ｃ-Ｍｅｔ Ｆａｂ／ｃ抗体の調製において完全長抗ｃ-Ｍｅｔ抗体の形成を更に最小化するために、Merchant等（Nature Biotechnology, 16:677-681 (1998)）に記載されるように、「孔へのノブ」突然変異を基本的にＦｃのＣＨ３ドメインに作製した。コンストラクトは、「孔」突然変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を完全長重鎖に、「ノブ」突然変異（Ｔ３６６Ｗ）をＦｃ断片に導入することによって、一アーム形Ｆａｂ／ｃ抗ｃ-Ｍｅｔ抗体（ｐｘｃＭ１１Ｃ.Ｈ-Ｆｃ.Ｋ）について調製した。
完全長抗ｃ-Ｍｅｔ抗体（ｐｘｃＭ１１Ｃ）、一アーム形Ｆａｂ／ｃ抗ｃ-Ｍｅｔ抗体（ｐｘｃＭ１１Ｃ-Ｆｃ）及び一アーム形Ｆａｂ／ｃ「孔へのノブ」抗ｃ-Ｍｅｔ抗体（ｐｘｃＭ１１Ｃ.Ｈ.Ｆｃ.Ｋ）コンストラクトが上記と同様に発現された。全細胞溶解物を調製し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースへ転移し、前記のヤギ抗ヒトＦａｂ抱合抗体及びヤギ抗ヒトＦｃ抱合抗体を用いて検出した。
抗Ｆａｂウエスタンブロットの結果を図３に示す。一アーム形Ｆａｂ／ｃ「孔へのノブ」抗ｃ-Ｍｅｔ抗体の折りたたみ及び集積に顕著な改善が示された。加えて、抗Ｆａｂウエスタンブロットの結果では、検知されないレベルにまで完全長抗ｃ-Ｍｅｔ抗体が減少したことが示される。また、抗Ｆａｂ抗体がＦｃ断片を結合できない点に注意することが重要である。非還元試料では、一アーム形「孔へのノブ」抗ｃ-Ｍｅｔ抗体の発現により、完全に折り畳まれて集積された完全長抗体から完全に折り畳まれて集積された一アーム形Ｆａｂ／ｃ抗体までの実質的な推移が生じる。野生型Ｆｃから「孔へのノブ」Ｆｃまで移動する一アーム形Ｆａｂ／ｃ抗体の折りたたみ及び集積にも顕著な改善がある。還元試料では、完全長であるもの、一アーム形Ｆａｂ／ｃ及び一アーム形Ｆａｂ／ｃ「孔へのノブ」抗ｃ-Ｍｅｔ抗体について検出される重鎖の量は同じである。また、プロセシングされた軽鎖の量は増加し、一アーム形Ｆａｂ／ｃ「孔へのノブ」抗ｃ-Ｍｅｔコンストラクトにより軽鎖前駆体が減少したようである。
同様に、図４の抗Ｆｃウエスタンブロットの結果は、野生型一アーム形Ｆａｂ／ｃ抗ｃ-Ｍｅｔ抗体に対して一アーム形Ｆａｂ／ｃ「孔へのノブ」の折りたたみ及び集積に顕著な改善がみられる。また、抗Ｆｃウエスタンブロットの結果により、検知されないレベルにまで完全長抗ｃ-Ｍｅｔ抗体の減少がみられた。抗Ｆｃ抗体は軽鎖を結合することができないので検出されない。還元試料では、完全長のもの、野生型一アーム形Ｆａｂ／ｃ及び一アーム形Ｆａｂ／ｃ「孔へのノブ」抗ｃ-Ｍｅｔ抗体について検出される重鎖の量は同じである。
実施例２ 本発明の抗体の薬物動態学的特徴及び治療有効性
材料及び方法
材料−前記の（８；１４）ように、ＨＧＦ及びｃ-Ｍｅｔ ＩｇＧはGenentechで生産された。NUNC (Rosklide, Denmark)からＭａｘｉｓｏｒｂミクロタイタープレートを購入した。Jackson Immunochemical (West Grove, PA)から抗ｈＦｃを購入した。Zymed (South San Francisco, CA)からＨＲＰ-ストレプトアビジンを購入した。Amersham, Inc. (Arlington Heights, IL)から３Ｈチミジンを購入した。ＭＤＡ-ＭＢ-４３５細胞はＡＴＣＣ (Rockville, MD)から得た。ピログルタミン酸アミノペプチダーゼはTakara Biochemicals (Berkeley, CA)から得た。Research Organics (Cleveland, OH)からＮＨＳ-Ｘ-ビオチンを購入した。Millipore (Marlborough, MA)からイモビロン-ＰＳＱ ＰＶＤＦを購入した。スーパースクリプトＩＩ ＲＮアーゼＨ−逆転写酵素は、Gibco-BRL (Gaithersburg, MD)からのものであった。ＴａｑポリメラーゼはPerkin Elmer-Cetus (Foster City, CA)から、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ、４０ｍ孔径はJ. T. Baker (Phillipsburg, NJ)から、ＳＰ-セファロース高性能樹脂はPharmacia Biotech, Inc. (Piscataway, NJ)から得た。ビオチン-抗Ｐ-ＴｙｒはUpstate Biotech (Lake Placid, NY)から、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質はＫＰＬ (Gaithersburg, MD)から購入した。
抗体及びＦａｂ断片の生成
抗ｃ-Ｍｅｔモノクローナル抗体の生成
５Ｄ５抗体を含む抗ｃ-ｍｅｔモノクローナル抗体の生成は記載した。例えば、米国特許第５，６８６，２９２号；同第５，６４６，０３６号；同第６，２０７，１５２号；同第６，２１４，３４４号及び同第６，４６８，５２９号を参照。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、第０、７、１４、２１、２８、２６６、２７３及び２７９日目に、ＭＰＬ／ＴＤＭアジュバントに懸濁した２．５μｇの可溶性ｃ-Ｍｅｔ-ＩｇＧ (Mark等, J.Biol.Chem. (1992), 267:26166-26171)をそれぞれ後部足蹠に注入して免疫化した。最後の免疫化の４日後に、リンパ節細胞を回収して、記載されている(Laskov等,Cell.Immunol. (1980), 55:251)ように、３５％のポリエチレングリコールを用いてＰ３／Ｘ６３-Ａｇ８Ｕ１骨髄腫細胞(Yelton等, Curr.Top.Microbio.Immunol. (1978), 81:1)と融合させた。ｃ-Ｍｅｔ特異的な抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を、始めに捕獲ＥＬＩＳＡによって選択し、その後ｃ-Ｍｅｔを発現するＢＡＦ３形質転換細胞を用いてフローサイトメトリによってスクリーニングした。更に、選択されたハイブリドーマを、後述するように、ｃ-Ｍｅｔ-ＩｇＧへのビオチン-ＨＧＦ結合を阻害する能力について試験した。ハイブリドーマを限界希釈によって二回クローン化し、次いでそれらの拮抗性及び作用性能力について更に特徴づけした。腹水をｂａｌｂ／ｃマウスにおいて生産させ、モノクローナル抗体をタンパク質Ｇアフィニティーカラムを用いて精製した。タンパク質濃度は、吸光係数１．４を用いて２８０ｎｍの吸光度で測定した。
天然のＦａｂの生成及び精製
抗体５Ｄ５は、２０ｍＭ リン酸塩、１０ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液にて終夜透析し、次いで、セントリコン３０に７ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。半量ｍｌの固定されたパパイン(Pierce, Rockford, II)を消化緩衝液にて洗浄し、次いで１０ｍｇの５Ｄ５を加えて、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で、終夜インキュベートした。１．５倍量ｍｌの結合用緩衝液を混合液に加え、上清をビーズから分離して、結合用緩衝液にて予め平衡化したプロテインＡカラムに通した。付加的な結合用緩衝液をカラムに流し、溶出液を１ｍｌ分画に回収した。各々の分画の吸光度は２８０ｎｍで読み取り、Ｆａｂ断片を含有する溶出液をプールした。タンパク質はＰＢＳにて終夜透析し、吸光係数１．５３を用いて２８０ｎｍの吸光度によりタンパク質濃度を測定した。更にＦａｂ断片をゲル濾過によって精製し、残余Ｆ（ａｂ´）２を除去した。
５Ｄ５ ＦａｂのＮ末端配列決定
５Ｄ５ Ｆａｂの一定分量を、４−２０％の勾配ＳＤＳゲル上に分割して、BioRadトランス-ブロット転移細胞(Matsudaira, J.Biol.Chem. (1987), 262:10035-10038)中で２５０ｍＡの定電流で１時間、ＰＶＤＦ(Immobilon-PSQ)膜上に電気的にブロットした。膜を０．１％ クーマシーブルーＲ-２５０を含む５０％ メタノールにて０．５分染色し、１０％ 酢酸を含む５０％ メタノールにて２−３分間脱色した。膜を水にて完全に洗浄して乾燥させ、Ｂｌｏｔｔ(登録商標)カートリッジ(Applied Biosystem)を用いて、モデル４７３Ａ自動タンパク質配列決定器にて配列決定を行った。ピークは、Nelson分析機７６０インターフェイスを用いたJustice Innovationソフトウェアにて積算した。ＤＥＣα(Henzel等, J.Chromatog. (1996), 404:41-52)にて配列解読を行った。
５Ｄ５重鎖の配列を得るためには、以下のように行う非ブロック化を必要とした。Ｆａｂ断片を、４５℃で１時間、７ｍＭ ＤＴＴにて還元し、２５℃で２０分、１８０ｍＭ イソプロピルアセトアミドでアルキル化した(Krutzsch & Inman, Anal.Biochem. (1993), 209:109-116)。次いで、アルキル化されたＦａｂ断片を、１０ｍＭ ＤＴＴ（消化緩衝液）を含有する０．１Ｍ リン酸ナトリウムにて、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ-１０中で３回交換し、２０μｌの消化緩衝液中で４５℃で３時間、１ｍＵ ピログルタミン酸アミノペプチダーゼによって消化した。次いで、非ブロック化されたＦａｂをＰＶＤＦへ移し、上記の通りに配列決定した。
５Ｄ５ Ｆａｂのクローニング及び組換え発現
Ｎ末端配列データを用いて、ＰＣＲプライマーを軽鎖及び重鎖の可変領域の５'末端に特異的に設定し、３'プライマーは各々の鎖のコンセンサスフレームワーク４にアニール化されるように設定した(Kabat等, Sequences of proteins of immunological interest (1991), Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)。また、プライマーは、クローニングのための制限酵素部位が付加されるように設計した。Stratagene ＲＮＡ単離キットを用いてハイブリドーマ５Ｄ５の１０８細胞から抽出した全ＲＮＡを、ＲＴ-ＰＣＲの基質として用いた。フレームワーク４特異的なプライマーとSuperscript II ＲＮアーゼＨ-逆転写酵素を用いて、標準的条件下にて逆転写を行った(Kawasaki, Amplification of RNA. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 21-27頁 (M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky及びT.J. White, 編集) (Academic Press, Inc., San Diego; 1990))。２％ ＤＭＳＯが反応混合液に含まれること以外は記載されている通りに(Kawasaki, Amplification of RNA. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 21-27頁 (M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky及びT.J. White, 編集) (Academic Press, Inc., San Diego; 1990))、Ｔａｑポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅されたＤＮＡ断片は、制限酵素ＳｆｉＩ及びＲｓｒＩＩ（軽鎖）又はＭｌｕＩ及びＡｐａＩ（重鎖）を用いて消化し、ゲル精製して、発現プラスミドｐＡＫ１９(Carter等, Bio/Technol. (1992), 10:163-167)の誘導体にクローン化した。このベクターｐＸＣＡ７３０は部位特異的突然変異(Kunkel, Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1985), 82:488)によって修飾して、ＳＴＩＩシグナル配列と可変ドメインの間、及び、各々の鎖の可変ドメイン及び定常ドメインの接合部に固有の制限酵素部位を含有するようにした。軽鎖及び重鎖の可変ドメインｃＤＮＡを、ヒトＣｋ及びＣＨ１ドメインのフレームの上流及びフレーム内に挿入した。ジスルフィド架橋を形成してＦ(ａｂ')２分子を与えうるｐＡＫ１９の重鎖のＣ末端システインを取り除いて、抗体のＦａｂ型だけが発現できるようにした。
Carter等 (Carter等, Bio/Technol. (1992), 10:163-167)の記載に従って、組換え５Ｄ５ Ｆａｂを大腸菌Ｋ１２株３３Ｂ６(Ｗ３１１０ ｔｏｎＡ ｐｈｏＡ Ｅ１５ ｄｅｏＣ ＫａｎＲ ｉｌｖＧＲ ｄｅｇＰＤ)ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９)において発現した(Rodriques等, Cancer Res. (1995), 55:63-70)。１０Ｌの発酵からの細胞ペレットを連続的供給遠心分離によって回収し、凍結して−７０℃に保存した。.一部のペレットを、１２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６及び５ｍＭ ＥＤＴＡ（５ｍｌ／ｇのペースト）からなる抽出緩衝液に懸濁した。ultraturrax(Janke and Kunkel)を用いておよそ１５分間、４℃で、懸濁液を完全に混合した。次いで、完全細胞を、冷却コイルを取り付けた細胞破砕機(Microfluidizer, by Microfluidics Corporation, Newton, MA)に２回通して破壊した。次いで、懸濁液を、ｐＨ６に調製してある５％(ｖ／ｖ)貯蔵液(stock)を用いて０．１％(ｖ／ｖ)ポリエチレンイミンに調製した。完全細胞及びＰＥＩ-凝集した細片を、２５４００×ｇで３０分間、遠心することによって可溶性分画から分離した。上清を、純水を加えて４ｍＳ未満の伝導率に調整して、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ、４０μ孔径のカラム（１×１０ｃｍ）に流した。カラムを、５０ｍＭ ＭＥＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６で平衡化した。全ての処置は線流速１００ｃｍ／ｈで行った。調整された上清を流した後に、カラム溶出物の吸光度が基準線と同じになるまで、カラムを平衡化緩衝液で洗浄した。溶出は、０から１００ｍＭの硫酸アンモニウムの直線濃度勾配平衡化緩衝液の１６-カラム容量を用いて行った。カラム分画をＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、Ｆａｂを含有する分画をプールした。ＡＢＸカラムのプールの伝導率を４ｍＳ未満まで下げて、２５ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．９）において平衡化されたSP-Sepharose高性能樹脂のカラム（１×１０ｃｍ）に流した。全ての処置は、線流速１００ｃｍ／ｈで行った。流した後、カラムを、平衡化緩衝液の１カラム容量にて洗浄した。次いで、５Ｄ５ Ｆａｂを、０から２００ｍＭの酢酸ナトリウムの直線濃度勾配平衡化緩衝液の１６-カラム容量を用いてカラムから溶出した。カラム分画をＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、ＦＡｂを含有した分画をプールした。
一アーム形5Ｄ5タンパク質小規模生成
発現プラスミドｐｘｃＭ１１Ｃ.Ｈ-Ｆｃ.Ｋ（上記）を用いてＥ.ｃｏｌｉ株３３Ｄ３（Ｗ３１１０ ｋａｎＲ ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃＩｑ ｌａｃＬ８ ｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ-ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ）を形質転換して、次いで形質転換体をカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢ培地中で３０℃で終夜生育した。ＬＢ培養物を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）含有のＣ.Ｒ.Ａ.Ｐ.培地(１)に１００倍希釈し、３０℃で振盪しながらおよそ２４時間生育した。少ない分割量を取り除き、抗Ｆａｂ抗体（ヒトＩｇＧ Ｆａｂへのペルオキシダーゼ抱合ヤギＩｇＧ分画；ＣＡＰＰＥＬ＃５５２２３）又は抗Ｆｃ抗体（ヒトＦｃ断片へのペルオキシダーゼ抱合ヤギＩｇＧ分画；Ｂｅｔｈｙｌ＃Ａ０８-１０４Ｐ-４１）を用いたウェスタンブロット及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって抗体発現を検査した。次いで、残りの培養物を遠心分離し、抗体精製工程を始めるまで細胞ペーストを−７０℃に凍らせた。
一アーム形５Ｄ５の精製。冷凍された細胞ペーストを解凍して、１０容量(ｗ／ｖ)の溶解緩衝液（２５ｍＭ トリス-ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に懸濁して、遠心分離した。不溶性ペレットは、ポリトロンホモジナイザ(Kinematica A.G, Switzerland)を用いて溶解緩衝液に再懸濁し、ミクロフルイダイザー (Microfluidics, Newton, Mass)を通して細胞を破壊した。ポリエチレンイミン(Sigma)０．１％（ｖ／ｖ）を溶解物に加え、４℃で１時間撹拌し、その後１５０００×ｇで遠心分離した。結果として生じた上清をプロテインＡ親和性樹脂と混合し、４℃で終夜撹拌した。樹脂を沈め、上清を流し出し、樹脂を液体クロマトグラフィシステム(Varian Inc, Palo Alto, CA)に付着されたカラムに注入した。カラムを、１０ｍＭ トリス-ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ７．５の後、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む同じ緩衝液にて洗浄し、ｐＨ６からｐＨ２への勾配を有する５０ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液にて溶出させた。溶出された分画を、直ちに最終濃度２Ｍ 尿素及びｐＨ５．４に調整して、ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分析した。一アーム形抗ｃＭｅｔを含有する分画をプールして、２５ｍＭ ＭＥＳ、２Ｍ 尿素ｐＨ５．４にて平衡化したＳＰセファロースカラム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)上の陽イオン交換クロマトグラフィを行った。カラムは、０Ｍ〜１Ｍ ＮａＣｌの勾配を有する２５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．４にて溶出した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析後、プールされた溶出液を０．４Ｍ 硫酸ナトリウム、ｐＨ６に調製し、０．４Ｍ 硫酸ナトリウム、２５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６にて平衡化したＨｉ-Ｐｒｏｐｙｌ (J.T.Baker, Phillipsburg, NJ)カラムに流した。カラムを０．４Ｍ〜０Ｍ 硫酸ナトリウムの勾配を有する２５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６にて溶出した。結果として生じた溶出液を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析後、CentriPrep 10(Millipore Corp, Bedford, MA)を用いて濃縮し、１０ｍＭ 琥珀酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０にて平衡化したSuperdex 200カラム(Amersham Biosciences)にてサイズ排除クロマトグラフィを行った。
タンパク質濃度は定量的アミノ酸分析で測定した。エンドトキシンレベルはＬＡＬアッセイで測定した。これらの抗体調製はその後の分析に用いた。
アッセイ
細胞培養
Ａ５４９肺カルシノーマ細胞を１０％ ＦＢＳ添加の最小必須培地中で培養した。既に記載(Schwall等, J.Cell Biol. (1996), 133:709-718)のようにヒトｃＭｅｔを形質移入したＢａＦ３-ｃＭｅｔ細胞、及びベクターを形質移入したＢａＦ３ネオ細胞を、１０％ ＦＣＳ、５％ ＷＥＨＩ-２３１細胞培養条件培地（ＩＬ-３を含有）、２ｍＭ グルタミン、β-メルカプトエタノール（４μｌ／Ｌ）、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を添加したＲＰＭＩ １６４０中で培養した。Ｕ87及びＵ118神経膠芽腫細胞、７８６-０腎臓カルシノーマ細胞を１０％ ＦＣＳ含有のＲＰＭＩ １６４０中で培養した。
ＨＧＦ-ｃＭｅｔ結合
ｃ-Ｍｅｔ-ＩｇＧがミクロタイタープレート上のＩｇＧドメインを介して捕獲される固相システムのビオチン-ＨＧＦを用いてＨＧＦ結合研究を行った。ＨＧＦは、２０倍モルの過剰なＮＨＳ-Ｘ-ビオチンと共に０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５中でインキュベートすることによってビオチン化した。ＮＨＳ-Ｘ-ビオチンを４分割して、室温で撹拌しながら、それぞれを１５分間隔で加えた。非抱合型ビオチンを透析によって除去し、ラベルをつけて材料を４℃で保存した。ミクロタイタープレートは、２μｇ／ｍｌのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅウサギ抗ヒトＩｇＧ, Ｆｃ (Jackson ImmunoResearch)を用いてコーティング緩衝液（０．０５Ｍ 炭酸塩／重炭酸塩, ｐＨ９．６）中で終夜、４℃でコートした。プレートは０．５％ ＢＳＡ, ｐＨ７．４を含有するＰＢＳによって室温(RT)で１時間、ブロックした後、２μｇ／ｍｌのｃＭｅｔ-ＩｇＧと共に２時間インキュベートした。次いで、０．０１−１０００ｎＭの競合物質である非標識(cold)ＨＧＦ、抗ｃＭｅｔ ５Ｄ５ ｍＡｂ、Ｆａｂ又は一アーム形抗体と共に又はこれらを含まないで５３ｎｇ／ｍｌのビオチン標識ＨＧＦを、ＲＴで１時間、添加した。プレートに西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）-ストレプトアビジン（１：１００００希釈、Amersham）をＲＴで１時間、添加した後、ホスファターゼ基質ＣＰ-ニトロフェニルリン酸塩(Kirkegaard & Perry Laboratories)を添加して、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
結果を図５に示す。競合的結合アッセイにおいて、一アーム形抗ｃ-ｍｅｔ５Ｄ５抗体は、抗ｃ-ｍｅｔ Ｆａｂと同様であった。
ＫＩＲＡによるｃ-Ｍｅｔのチロシン-リン酸化
ｃ-Ｍｅｔのチロシンリン酸化は、Sadick等の方法に基づいてサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。その測定方法は可溶化されたレセプターが抗レセプター抗体でコートされたプレート上で捕獲され、抗Ｐ-Ｔｙｒで検出されるものである (Sadick等, Anal.Biochem. (1996), 235:207-214)。１０６／ｍｌのＵ８７細胞を９６ウェルプレート中で終夜、３７℃でプレート培養した。次いで、培地をＭＥＭ、０．１％ ＦＢＳに交換して、ＨＧＦ及び／又は抗体と共に１０分間置いた。次いで、細胞を１００μｌの溶菌緩衝液（２０ｍＭ トリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、１ｎＭ ＥＧＴＡ、１％ トリトン、１×プロテアーゼインヒビター反応混液（Sigma）、１×ホスファターゼインヒビター反応混液ＩＩ（Sigma）にてプレート振とう器上でＲＴで３０分間抽出し、氷上又は−７０℃に保存した。溶解物を抗ｃ-Ｍｅｔ ｍＡｂ １９４９（Genentech）でコートしたプレートに加えて終夜置いた。ホスホチロシンｃＭｅｔは、１：４０００希釈のビオチン化抗ホスホチロシン(4G10, Upstate)の後にＨＲＰ-ストレプトアビジン及びＴＭＢを用いた発色により検出した。総ｃＭｅｔは、１：１０,０００抗ｃ-Ｍｅｔ抗体を用いて同様に測定した。
結果を図６に示す。
細胞増殖、移動アッセイ
ＢａＦ３は、通常ｃＭｅｔを発現せず、ＨＧＦに反応しないマウスＩＬ-３依存性リンパ系細胞である。しかしながら、ヒトｃ-Ｍｅｔの正常な完全長ｃＤＮＡの形質移入によって得たＢａＦ３-ｈＭｅｔ (Schwall等, J.Cell Biol. (1996), 133:709-718)では、ＨＧＦは、ＩＬ-３の非存在下で増殖及び生存を促進する。ＢａＦ３-ｈＭｅｔ及びＢａＦ３-ｎｅｏ細胞は通常、ＩＬ-３の起源として、ＲＰＭＩ １６４０、５％ ウシ胎児血清、４μｌ／Ｌ β-ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ 硫酸ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ-グルタミン及び５％ ＷＥＨＩ条件培地にて継代した。ＨＧＦ依存性増殖を測定するために、３日間の治療の後、２５μｌ Alarma Blue (Trek Diagnostic Systems)を加えて４時間後の蛍光強度を測定することによって細胞数を定量化した。特異性の対象のために、一アーム形５Ｄ５も、ＩＬ-３にて刺激したＢａＦ３-ｈＭｅｔ細胞において試験した。
結果を図７に示す。
ＭＤＡＭＢ-４３５-ＰＧＬ細胞及びＵ８７細胞の移動は、変性ボイデンチャンバアッセイを用いて評価した。１０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンでコートした５μｍ孔のポリカーボネートを有する上部試験糟に細胞を播いた（２×１０４／ウェル）。上記の量の５Ｄ５ Ｆａｂ又は一アーム形抗体と共に又は伴わない１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを、下部試験糟中の培地に加えた。細胞は終夜培養した。細胞は特別なスポンジ綿を用いたフィルター膜の上側から濾し出され、フィルタの下面に移動した細胞は固定されて、ＹＯ-ＰＲＯ-３ヨウ化物(Molecular Probes)で着色され、それから蛍光顕微鏡検査法によって計数した。
結果を図８に示す。
薬物動態学
ＯＡ-５Ｄ５又は５Ｄ５ Ｆａｂ（５ｍｇ／ｋｇ）をヌードマウスに静脈内注射した。一定の時間点で、４匹のマウスから血清試料を回収して、ｃＭｅｔ-ＩｇＧでコートしたプレート上で捕獲されるサンドイッチＥＬＩＳＡによって検定して、次いで軽鎖特異的な二次抗体を用いて検出した。
結果を図９Ａに示す。一アーム形５Ｄ５抗体の半減期は、そのＦａｂ相対物と比較して有意に増加した。
ＯＡ-５Ｄ５が生体内で分解するかどうかを調べるために、７日目のＰＫ試料からのＯＡ-５Ｄ５でＥＬＩＳＡによる４０ｎｇ相当の血清量を還元又は非還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルに流した。ゲルをニトロセルロース上に転写して、ＨＲＰ抱合抗ヒトＦｃによってブロットした（１：５０００、ヒト特異的、Jackson Labs）。対照として、ナイーヴマウスからの血清の等量を平行に流した。
結果を図９Ｂに示す。血清一アーム形５Ｄ５抗体は投与後７日目では完全であった。
インビボ腫瘍有効性研究
２５０００００個のＡ５４９（ヒト肺癌）細胞又はＵ８７ＭＧ細胞（自己分泌ＨＧＦを分泌してｃＭｅｔを発現するヒト神経膠芽腫）を皮下的に接種した４〜６週齢の雌性胸腺欠損ヌードマウスを用いて有効性研究を行った。一アーム形５Ｄ５抗体、５Ｄ５ Ｆａｂ抗体又は対照抗体（抗ｇｐ１２０）を用いた処置を、腫瘍細胞接種（すなわちアジュバント治療）又は腫瘍が〜１５０ｍｍ３に成長した後の何れかのときに開始した。全ての抗体は、週に１回で４週間、腹膜内投与した。一アーム形５Ｄ５抗体だけがアジュバント治療投薬計画において（抗ｇｐ１２０対照を用いて）試験した点を注記する。
図１０は、Ｕ８７ＭＧ細胞の接種によって生成される腫瘍の結果を示す。図１０Ａ（アジュバント治療）及び図１０Ｂ（腫瘍発達後の治療）に示すように、一アーム形５Ｄ５抗体は、腫瘍の後退を阻害するかまたは引き起こすことが可能であった。図１０Ｂに示すように、一アーム形５Ｄ５抗体は、そのＦａｂ相対物と比較して優れた治療有効性を有した。（面白いことに、１００ｎＭの一アーム形５Ｄ５抗体は、インビトロでのＵ８７細胞数に対する効果が最小であった。）
Ａ５４９細胞の接種から生成される腫瘍の治療の結果は陰性であった。これは特異的対照であり、Ｕ８７腫瘍に対する一アーム形５Ｄ５ 抗ｃ-ｍｅｔ抗体の効果が非特異的毒性によるものでないことが確認された。
また、一アーム形５Ｄ５抗ｃ-ｍｅｔ抗体は、他の確立されたインビボ腫瘍モデル技術、例えば米国特許第６,２７１,３４２号に記載される腫瘍試験モデルを用いた腫瘍発達調整能力について試験できる。一アーム形５Ｄ５抗体が３０ｍｇ／ｋｇ、２×／週で投与される場合に、ＭＲＣ-５線維芽細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ-１７１）を共接種したＢｘＰＣ-３（膵臓）（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ-１６８７）細胞の腫瘍成長は５０％阻害された。他の例証となるデータを以下に一覧にする：
・ 一アーム形５Ｄ５抗体、ｑ７ｄ（すなわち７日間毎日）、１０ｍｇ／ｋｇを用いた腫瘍試験ＲＸＦ１２２０（腎臓）における腫瘍成長の〜30％阻害；
・ (ｉ) １０ｍｇ／ｋｇ、ｑ7ｄを用いた腫瘍試験ＰＡＸＦ７３６（膵臓）；(ｉｉ)１０ｍｇ／ｋｇ、ｑ７ｄを用いた腫瘍試験ＧＸＦ９７（胃）；(ｉｉｉ) ３０ｍｇ／ｋｇ、ｑ７ｄを用いた腫瘍試験ＬＸＦＡ５２６（肺）；(ｉｖ)３０ｍｇ／ｋｇ、ｑ７ｄを用いた腫瘍試験ＬＳＦＡ２９７（肺）；における腫瘍成長の＜２０％の阻害；
・ １０ｍｇ／ｋｇ、ｑ７ｄの一アーム形５Ｄ５抗体を用いたＡ５４９異種移植片において活性は観察されなかった；
・ ３０ｍｇ／ｋｇ、ｑ７ｄを用いたＬＸＦＡ６５０（肺）において活性は観察されなかった。
抗ｃ-ｍｅｔ Ｆａｂ／ｃ抗体（一アーム形抗体）発現についての抗Ｆａｂウェスタンブロットを示す。 抗ｃ-ｍｅｔ Ｆａｂ／ｃ抗体（一アーム形抗体）発現についての抗Ｆｃウェスタンブロットを示す。 Ｆｃ領域内に***及びキャビティを含有する抗ｃ-ｍｅｔ Ｆａｂ／ｃ抗体（一アーム形抗体）の発現についての抗Ｆａｂウェスタンブロットを示す。 Ｆｃ領域内に***及びキャビティを含有する抗ｃ-ｍｅｔ Ｆａｂ／ｃ抗体（一アーム形抗体）の発現についての抗Ｆｃウェスタンブロットを示す。 一アーム抗ｃ-ｍｅｔ抗体がｃ-ｍｅｔへのＨＧＦ結合を遮断した競合的結合アッセイの結果を示す。 ＨＧＦ及び／又は抗ｃ-ｍｅｔ ５Ｄ５一アーム形抗体で処理したＵ８７細胞又は処理しないＵ８７細胞におけるＫＩＲＡアッセイの結果を示す。 様々な量の抗ｃ-ｍｅｔ ５Ｄ５抗体の存在下におけるＢａＦ３-ｈＭｅｔ細胞の細胞増殖を示す。 一アーム形抗ｃ-ｍｅｔ抗体がＨＧＦ機能を遮断した細胞移動アッセイを示す。 一アーム形抗ｃ-ｍｅｔ抗体の薬物動態学的分析の結果を示す。 一アーム形抗ｃ-ｍｅｔ抗体を用いた腫瘍治療の結果を示す。図１０Ｂの「ＯＡ」は一アーム形を示す。

Claims (97)

  1. 単一抗原結合アーム及びＦｃ領域を含有してなる抗体断片であり、該抗原結合アームを含んでなるＦａｂ分子と比較して該抗体断片の安定性が増大しており、該Ｆｃ領域が第一及び第二Ｆｃポリペプチドの複合体を含んでなり、Ｆｃポリペプチドの一方だけでなく両方がＮ末端切断型重鎖である、抗体断片。
  2. 前記抗体断片がアグリコシル化されている、請求項１に記載の抗体断片。
  3. 前記抗体断片が免疫抑制性質をほとんど持たない、請求項１又は２に記載の抗体断片。
  4. 前記免疫抑制性質がＴ細胞枯渇に影響する能力を含む、請求項３に記載の抗体断片。
  5. ＦｃＲｎ結合以外の実質的なエフェクター機能を保持しない、請求項１ないし４の何れか一に記載の抗体断片。
  6. 前記エフェクター機能が補体溶解である、請求項５に記載の抗体断片。
  7. 前記抗体断片がＦｃＲｎに結合する、請求項１ないし６の何れか一に記載の抗体断片。
  8. Ｔ細胞表面抗原に特異的に結合しない、請求項１ないし７の何れか一に記載の抗体断片。
  9. 前記Ｔ細胞表面抗原がＣＤ３又はＣＤ４である、請求項８に記載の抗体断片。
  10. 前記Ｔ細胞表面抗原がＣＤ３である、請求項９に記載の抗体断片。
  11. 腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項１ないし１０の何れか一に記載の抗体断片。
  12. レセプター二量体化により活性化される細胞表面レセプターに特異的に結合する、請求項１ないし１１の何れか一に記載の抗体断片。
  13. 前記抗体断片が軽鎖可変ドメインを含有してなる第一ポリペプチド、重鎖可変ドメイン及び該第一Ｆｃポリペプチドを含有してなる第二ポリペプチド、並びに、該第二Ｆｃポリペプチドを含有してなる第三ポリペプチドを含んでなる、請求項１ないし１２の何れか一に記載の抗体断片。
  14. 前記第一ポリペプチドがヒト軽鎖定常ドメインに融合した非ヒト軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項１３に記載の抗体断片。
  15. 前記第一ポリペプチドがヒト化又はヒトフレームワーク配列に融合した非ヒト種由来のＣＤＲを含んでなる、請求項１３に記載の抗体断片。
  16. 前記第二ポリペプチドがヒト重鎖定常ドメインに融合した非ヒト重鎖可変ドメインを含んでなる、請求項１３に記載の抗体断片。
  17. 前記第二ポリペプチドがヒト化又はヒトフレームワーク配列に融合した非ヒト種由来のＣＤＲを含んでなる、請求項１３に記載の抗体断片。
  18. 前記第三ポリペプチドがＮ末端に少なくとも一のヒンジ配列を含有するＮ末端切断型重鎖を含んでなる、請求項１３に記載の抗体断片。
  19. 前記２つのＦｃポリペプチドが共有結合している、請求項１ないし１８の何れか一に記載の抗体断片。
  20. 前記２つのＦｃポリペプチドがヒンジ領域で分子内ジスルフィド結合を介して連結している、請求項１ないし１９の何れか一に記載の抗体断片。
  21. 標的分子に結合する場合に、前記抗体断片が標的分子の多量体化を阻害する、請求項１ないし２０の何れか一に記載の抗体断片。
  22. 標的分子に結合する場合に、前記抗体断片が同系結合パートナーの標的分子への結合を阻害する、請求項１ないし２１の何れか一に記載の抗体断片。
  23. 前記第一Ｆｃポリペプチドと前記第二Ｆｃポリペプチドが作用領域で会合し、該第二Ｆｃポリペプチドの作用領域が第一Ｆｃポリペプチドの作用領域内のキャビティ内に位置しうる***を含んでなる、請求項１ないし２２の何れか一に記載の抗体断片。
  24. 前記第二Ｆｃポリペプチドが鋳型／起源ポリペプチドから変更されて前記***をコードしているかあるいは、前記第一Ｆｃポリペプチドが鋳型／起源ポリペプチドから変更されて前記キャビティをコードしているか、その両方である、請求項１ないし２３の何れか一に記載の抗体断片。
  25. 前記第二Ｆｃポリペプチドが鋳型／起源ポリペプチドから変更されて前記***をコードしており、第一Ｆｃポリペプチドが鋳型／起源ポリペプチドから変更されて前記キャビティをコードしているか、その両方である、請求項１ないし２４の何れか一に記載の抗体断片。
  26. 前記第一Ｆｃポリペプチドと前記第二Ｆｃポリペプチドが作用領域で会合し、該第二Ｆｃポリペプチドの作用領域が第一Ｆｃポリペプチドの作用領域内のキャビティ内に位置しうる***を含んでなり、該キャビティ又は該***あるいはその両方が該第一Ｆｃポリペプチド及び該第二Ｆｃポリペプチドのそれぞれの作用領域内に取り込まれている、請求項１ないし２５の何れか一に記載の抗体断片。
  27. 前記***及び前記キャビティが前記それぞれのＦｃポリペプチドの作用領域内に取り込まれている、請求項２４ないし２６の何れか一に記載の抗体断片。
  28. 前記***及び前記キャビティのそれぞれが天然に生じるアミノ酸残基を含んでなる、請求項２４ないし２７の何れか一に記載の抗体断片。
  29. 前記***を含有してなる前記Ｆｃポリペプチドが、鋳型／起源のポリペプチドの作用領域の元の残基を元の残基より大きい側鎖容量を有する移入残基で置換することによって生成される、請求項２４ないし２８の何れか一に記載の抗体断片。
  30. 前記***を含有してなる前記Ｆｃポリペプチドが、前記ポリペプチドの作用領域の元の残基をコードする核酸を元の残基より大きい側鎖容量を有する移入残基をコードする核酸で置換する工程を含んでなる方法により生成される、請求項２４ないし２９の何れか一に記載の抗体断片。
  31. 前記元の残基がスレオニンである、請求項２９又は３０の抗体断片。
  32. 前記移入残基がアルギニン(Ｒ)である、請求項２９ないし３１の何れか一に記載の抗体断片。
  33. 前記移入残基がフェニルアラニン(Ｆ)である、請求項２９ないし３１の何れか一に記載の抗体断片。
  34. 前記移入残基がチロシン(Ｙ)である、請求項２９ないし３１の何れか一に記載の抗体断片。
  35. 前記移入残基がトリプトファン(Ｗ)である、請求項２９ないし３１の何れか一に記載の抗体断片。
  36. キャビティを具備する前記Ｆｃポリペプチドは、鋳型／元のポリペプチドの作用領域内の元の残基を元の残基より小さな側鎖容量を有する移入残基に置換することによって生成される、請求項２３ないし２８の何れか一に記載の抗体断片。
  37. キャビティを具備する前記Ｆｃポリペプチドは、該ポリペプチドの作用領域の元の残基をコードする核酸を元の残基より小さな側鎖容量を有する移入残基をコードする核酸に置換する工程を含む方法によって生成される、請求項２３ないし２８及び３６の何れか一に記載の抗体断片。
  38. 元の残基がスレオニンである、請求項３６又は３７に記載の抗体断片。
  39. 元の残基がロイシンである、請求項３６又は３７に記載の抗体断片。
  40. 元の残基がチロシンである、請求項３６又は３７に記載の抗体断片。
  41. 移入残基がシステイン(Ｃ)でない、請求項３６ないし４０の何れか一に記載の抗体断片。
  42. 移入残基がアラニン(Ａ)である、請求項３６ないし４０の何れか一に記載の抗体断片。
  43. 移入残基がセリン(Ｓ)である、請求項３６ないし４０の何れか一に記載の抗体断片。
  44. 移入残基がスレオニン(Ｔ)である、請求項３６ないし４０の何れか一に記載の抗体断片。
  45. 移入残基がバリン(Ｖ)である、請求項３６ないし４０の何れか一に記載の抗体断片。
  46. キャビティを具備する前記Ｆｃポリペプチドが、スレオニン、ロイシン及びチロシンからなる群から選択される２以上の元のアミノ酸の置換を具備する、請求項３６ないし４５の何れか一に記載の抗体断片。
  47. キャビティを具備する前記Ｆｃポリペプチドが、アラニン、セリン、スレオニン及びバリンからなる群から選択される２以上の移入残基を具備する、請求項３６ないし４６の何れか一に記載の抗体断片。
  48. キャビティを具備する前記Ｆｃポリペプチドがスレオニン、ロイシン及びチロシンからなる群から選択される２以上の元のアミノ酸の置換を具備し、該元のアミノ酸がアラニン、セリン、スレオニン及びバリンからなる群から選択される移入残基で置換される、請求項３６ないし４７の何れか一に記載の抗体断片。
  49. キャビティを具備する前記Ｆｃポリペプチドが、カバットのＥＵ番号付けスキームに従ったアミノ酸番号３６６位のスレオニンからセリンへの置換を具備する、請求項２３ないし４８の何れか一に記載の抗体断片。
  50. キャビティを具備する前記Ｆｃポリペプチドが、カバットのＥＵ番号付けスキームに従ったアミノ酸番号３６８位のロイシンからアラニンへの置換を具備する、請求項２３ないし４８の何れか一に記載の抗体断片。
  51. キャビティを具備する前記Ｆｃポリペプチドが、チロシンのバリンへの置換を具備する、請求項２３ないし５０の何れか一に記載の抗体断片。
  52. キャビティを具備する前記Ｆｃポリペプチドが、T366S, L368A及びY407Vからなる群から選択される２以上のアミノ酸置換を具備する、請求項２３ないし５１の何れか一に記載の抗体断片。
  53. ***を具備する前記Ｆｃポリペプチドが、カバットのＥＵ番号付けスキームに従ったアミノ酸番号３６６位のスレオニンからトリプトファンへの置換を具備する、請求項２３ないし５２の何れか一に記載の抗体断片。
  54. 第一Ｆｃポリペプチド及び第二Ｆｃポリペプチドのそれぞれが抗体定常ドメインを具備する、請求項１ないし５３の何れか一に記載の抗体断片。
  55. 前記抗体定常ドメインがＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインである、請求項５４に記載の抗体断片。
  56. 前記抗体定常ドメインがＩｇＧ由来である、請求項５４又は５５に記載の抗体断片。
  57. 前記ＩｇＧがヒトＩｇＧ１である、請求項５６に記載の抗体断片。
  58. 単一特異性である、請求項１ないし５７の何れか一に記載の抗体断片。
  59. 単一特異性イムノアドへシンである、請求項１ないし５８の何れか一に記載の抗体断片。
  60. 抗体-イムノアドへシンキメラである、請求項１ないし５９の何れか一に記載の抗体断片。
  61. イムノグロブリンの少なくとも７５％が請求項１ないし６０の何れか一に記載の抗体断片であるイムノグロブリンの集合を含んでなる組成物。
  62. (ａ)抗体断片をコードする核酸を含有してなる宿主細胞を培養し；
    (ｂ)宿主細胞培養物から抗体断片を回収する
    ことを含んでなる、請求項１ないし６０の何れか一に記載の抗体断片の調整方法。
  63. 抗体断片を含有してなるポリペプチドが、イムノグロブリンの少なくとも５０％が請求項１ないし６０の何れか一に記載の抗体断片であるイムノグロブリンの集合となる割合で発現される、請求項６２に記載の方法。
  64. 該ポリペプチドがほぼ等モル量で発現される、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記ポリペプチドをコードする核酸がほぼ等しい強さの翻訳開始領域（ＴＩＲｓ）に作用可能に結合される、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記宿主細胞が原核生物である、請求項６２ないし６５の何れか一に記載の方法。
  67. 宿主細胞が大腸菌である、請求項６６に記載の方法。
  68. 大腸菌が内在性プロテアーゼ活性欠陥株のものである、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記宿主細胞が真核生物のものである、請求項６２ないし６５の何れか一に記載の方法。
  70. 前記宿主細胞がＣＨＯである、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記抗体断片が培養液から回収される、請求項６２ないし７０の何れか一に記載の方法。
  72. 前記抗体断片が細胞溶解物から回収される、請求項６２ないし７０の何れか一に記載の方法。
  73. (ａ)第二Ｆｃポリペプチドの作用領域をコードする核酸が***をコードするように第二Ｆｃポリペプチドの元の作用領域をコードする核酸から変更されているか、あるいは第一Ｆｃポリペプチドの作用領域をコードする核酸がキャビティをコードするように第一Ｆｃポリペプチドの元の作用領域をコードする核酸から変更されているか、あるいはその両方である抗体断片をコードする核酸を含有してなる宿主細胞宿主細胞を培養し、
    (ｂ)前記宿主細胞培養物から抗体断片を回収する
    工程を含んでなる、請求項２３ないし６０の何れか一に記載の抗体断片の調整方法。
  74. 第二Ｆｃポリペプチドをコードする核酸が***をコードするように元の核酸から変更されており、第一ポリペプチドをコードする核酸がキャビティをコードするように元の核酸から変更されている、請求項７３に記載の方法。
  75. 第二Ｆｃポリペプチドの作用領域の元のアミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基より大きな側鎖容量を有する移入アミノ酸残基をコードする核酸で置換される工程が工程(ａ)に先行するものであり、大きな側鎖容量を有する移入残基が***を含有してなる、請求項７３に記載の方法。
  76. 第一Ｆｃポリペプチドの作用領域の元のアミノ酸残基をコードする核酸が、キャビティを形成するように元のアミノ酸残基より小さい側鎖容量を有する移入アミノ酸残基をコードする核酸で置換される工程が工程(ａ)に先行するものである、請求項７３に記載の方法。
  77. 第一Ｆｃポリペプチド及び第二Ｆｃポリペプチドをコードする核酸が宿主細胞に導入される工程が工程(ａ)に先行するものである、請求項７３に記載の方法。
  78. (ａ)抗体断片を形成するポリペプチドを調製し；
    (ｂ)ヘテロ多量体化を起こす；
    工程を含んでなり、これによって抗体断片が形成される、請求項１ないし６０の何れか一に記載の抗体断片の調整方法。
  79. 形成されたイムノグロブリンポリペプチド複合体の少なくとも５０％が請求項１ないし６０の何れか一に記載の抗体断片である、請求項６２ないし７８の何れか一に記載の方法。
  80. 形成されたイムノグロブリンポリペプチド複合体の少なくとも５０％がヘテロ三量体である、請求項６２ないし７８の何れか一に記載の方法。
  81. 工程(ｂ)が第一Ｆｃポリペプチドと第二Ｆｃポリペプチドのインビトロでの結合を含んでなる、請求項６２ないし７８の何れか一に記載の方法。
  82. 元の作用領域のアミノ酸配列が遺伝子操作した作用領域内に***及びキャビティを生成するように変更されている、請求項６２ないし７８の何れか一に記載の方法。
  83. 請求項１ないし６０の何れか一に記載の抗体断片をコードする単離した核酸。
  84. 請求項１ないし６０の何れか一に記載の抗体断片を集合的にコードする二以上の組み換え核酸を含有してなる組成物。
  85. 請求項８３又は８４に記載の核酸を含有してなる宿主細胞。
  86. 抗原結合アームをコードする核酸が単一ベクター内に存在する、請求項８５に記載の宿主細胞。
  87. 抗原結合アームをコードする核酸が別々のベクター内に存在する、請求項８５に記載の宿主細胞。
  88. 抗原結合アーム及びＮ末端切断型重鎖をコードする核酸が単一ベクター内に存在する、請求項８５に記載の宿主細胞。
  89. ポリペプチドが発現するように請求項８３又は請求項８４に記載の核酸を含有する宿主細胞を培養して、該細胞培養物から抗体断片を回収することを含んでなる、請求項１ないし６０の何れか一に記載の抗体断片の作製方法。
  90. 前記抗体断片が細胞溶解物から回収される、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記抗体断片が細胞培養液から回収される、請求項８９に記載の方法。
  92. 前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項８９に記載の方法。
  93. 前記宿主細胞が大腸菌である、請求項９０に記載の方法。
  94. 前記宿主細胞が哺乳類のものである、請求項８９に記載の方法。
  95. 請求項１ないし６０の何れか一に記載の抗体断片と担体を含有してなる組成物。
  96. 単一抗原結合アームを含有してなるＦａｂ分子と比較して抗体断片の安定性を向上させる単一抗原結合アーム及びＦｃ領域を含有してなる抗体断片の生成方法であり、抗原結合アームの形成と該Ｆｃ領域が形成されるための第一Ｆｃポリペプチドと第二Ｆｃポリペプチドの二量体化とが起こる条件下にて抗原結合アームと第一及び第二のＦｃポリペプチドをコードする好適な宿主細胞核内で発現させることを含んでなり、該Ｆｃポリペプチドの両方ではなく他方がＮ末端切断型重鎖である方法。
  97. 前記方法がイムノグロブリンの異種性集団を生成し、イムノグロブリンの少なくとも５０％が単一抗原結合アームを含有してなるＦａｂ分子と比較して抗体断片の安定性を向上させるＦｃ領域及び単一抗原結合アームを含有してなる、請求項９６に記載の方法。
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