JP4309656B2 - 原核生物で生成させた抗体とその用途 - Google Patents
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Description
その他の抗体生産システムに比べ、細菌、特に大腸菌は数多くの独特な利点を提供する。用いる未加工材料(すなわち、細菌細胞)は高価なものではなく、かつ増殖させやすく、従って、生産コストを削減できる。世代時間が短く、かつ、スケールアップが容易であることから、大規模タンパク質生産にとって細菌培養はより実用的な手段となる。大腸菌などの多くの細菌種のゲノム構造および生物学的活性は詳しく研究されており、かつ、広範な発現ベクターが利用でき、望ましい抗体の発現がより便宜になっている。真核生物に比べ、この生産プロセスには組換え遺伝子の操作、宿主へのマルチコピーの安定した形質転換、発現誘導および産物の特徴付けをはじめとする少ない工程しか関与しない。Pluckthun及びPack Immunotech 3:83-105 (1997)。さらに、大腸菌によりランダムなアプローチへの独特な方法が可能となる。プラスミドによる形質転換やファージによるトランスフェクションの圧倒的な効率のために、大腸菌系は多くの種類の抗体変異体のファージライブラリー構築のために使用でき、このことは機能的ゲノム研究において特に重要である。
Opper等、米国特許第6,008,023号には、そこで抗体断片(例えば、Fab)を標的腫瘍治療における使用のために酵素と融合させる大腸菌の細胞質発現系が記載されている。Zemel-Dreasen等 Gene 27:315-322 (1984)は大腸菌における抗体軽鎖の分泌およびプロセッシングを報告している。Lo等,PCT国際公開、WO93/07896はその重鎖のCH2領域を欠く四量体抗体の大腸菌生産を報告している。軽鎖をコードする遺伝子およびCH2欠失重鎖が同一の発現ベクター、ある単一プロモーターの制御下に構築された。この著者らは発現系は最適化されておらず、かつ、発現レベルは中程度であるということを認めていた。2つの発現単位(すなわち、シストロン)が1つのプロモーターの制御下にある同様のポリシストロン性の系は、大腸菌で抗体断片を生産するためにCarter等によって米国特許第5,648,237号でも用いられている。
研究および臨床研究における最近の進展により多くの場合で、完全抗体は抗体断片よりも好ましいということが示唆されている。Fc領域を含む完全抗体はイン・ビボ(in vivo)において分解およびクリアランスに対しより抵抗力があり、それにより循環においてより長い生物学的半減期を有する傾向がある。この特徴は抗体を持続性治療を必要とする疾病の治療薬として用いる場合には特に望ましい。
本明細書に記載される全長抗体の種々の診断および治療的使用も考慮される。ある治療的用途では、患者に全長抗体をもう1つの治療薬と組み合わせて用いる。
ここで使用されているように、「ベクター」という用語は、その他の核酸を、それが連結している場所へ輸送することのできる核酸分子を指す。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、付加的なDNAセグメントをライゲーションすることができる環状二重鎖DNAループを指す。他のタイプのベクターはファージベクターである。その他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なDNAセグメントをウイルスゲノムへライゲーションすることができる。所定のベクターは、それらが導入された宿主内において自己複製することができる(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入によって宿主細胞のゲノムと一体化し、宿主ゲノムと共に複製する。さらに、所定のベクターは、それらが作用可能に連結している遺伝子の発現を方向づける。このようなベクターは、ここでは、「組換え発現ベクター」(あるいは単に「組換えベクター」)と呼ばれている。一般的に、組み換えDNA技術での用途の発現ベクターは、しばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」及び「ベクター」は相互交換可能に使用することができる。
ここで使用される「シストロン」という用語は、概してポリペプチド鎖及び隣接コントロール領域をコードしているヌクレオチド配列を含む翻訳単位に相当する遺伝子要素を指すことを意図する。「隣接コントロール領域」は例えば、翻訳開始領域(TIR;下記に定義されるようなもの)及び末端領域を含む。
本発明に係る「個別シストロン性」発現ベクターとは、各シストロンがそれぞれのプロモーターの支配下にある、少なくとも2つの別々のプロモーター-シストロンの対を有する単一のベクターを意図する。個別シストロン性発現ベクターの発現では、別々の遺伝子の転写と翻訳の両段階が分離し、独立している。
ここで使用される用語「翻訳強度」とは、TIRの一以上の変異体がポリペプチドの直接分泌に使用され、その結果を同じ培地及びアッセイ条件下で野生型TIR又は幾つかの他のコントロールに比較して得た、コントロールシステムにおける分泌ポリペプチドの測定を意図する。いずれかの見解に限定する訳ではないが、ここで使用される「翻訳強度」は、例えば、mRNA安定性、リボソーム結合部位に結合するリボソームの能力、及び膜を超える転位座の機序の測定を含みうる。
ここで使用される「宿主細胞」(又は「組換え宿主細胞」)という用語は、遺伝的に変化した、又は外因性ポリヌクレオチド、例えば組換えプラスミド又はベクター等の挿入によって遺伝的に変化された細胞を呼ぶことを目的とする。この用語は、特定の対象細胞だけではなく、これらの細胞の子孫をも意味すると理解される。突然変異又は環境による影響のどちらかによって、ある種の修飾が次の世代で生じるため、実際は、このような子孫は親細胞と同一ではない可能性があるが、やはりここで使用されるような「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。
あらゆる脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる、定常ドメインのアミノ酸配列に基づく2つの明らかに異なる型の1つに当てはまる。
用語「全長抗体」、「無傷の抗体」及び「完全抗体」は、ここで互換性をもって使用され、下記に定義されるような抗体断片ではない、実質的に無傷の形態である抗体を意図する。この用語は、特にFc領域を含む重鎖をもった抗体を意図する。全長抗体は、天然配列抗体又は抗体変異体でありうる。全長抗体は、ヒト、ヒト化及び/又は親和性成熟したものであり得る。
ここで用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらには、典型定期に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)であって、そのレシピエントの高頻度可変領域由来の残基が、マウス、ラット又はウサギなどのヒト以外の種の高頻度可変領域(ドナー抗体)に由来する所望の特異性、親和性及び容量を持つ残基で置換されている。ある場合は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基が対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、ドナー抗体にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精密化するために施される。一般にヒト化抗体は、高頻度可変領域の全て又は実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域の全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全部を含有するであろう。また、任意にはヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含有するであろう。さらなる詳細については、Jones等, Nature 321: 522-525 (1986);Riechmann等, Nature 332: 323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)を参照のこと。また、次の論文及びそこで挙げられている文献を参照:Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
「親和性成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較し、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、抗体の一又は複数のCDRにおける一又は複数の変化を伴うものである。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該分野において知られる手順によって生産される。Marks等 Bio/Technology 10:779-783(1992)は、VH及びVLドメイン混合による親和性成熟について記載している。CDR及び/又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas等, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994);Schier 等, Gene 169:147-155(1995);Yelton等, J. Immunol. 155:1994-2004(1995);Jackson等, J. Immunol. 154(7):3310-9(1995);及びHawkins等, J. Mol. Biol. 226:889-896(1992)に記載されている。
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」及び「ADCC」とは、Fcレセプター(FcRs)
を発現する非特異的細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球及びマクロファージ)が標的細胞上で結合抗体と認識され、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞介在性反応を意味する。ADCCを媒介する主要な細胞NK細胞はFcγRIIIのみを発現するのに対し、単球はFcγRI、FcγRII及びFcγRIIIを発現する。造血細胞でのFcRの発現は、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の464頁の表3に要約されている。関心ある分子のADCC活性を評価するために、米国特許第5,500,362号又は同5,821,337号に記載されているようなインビトロADCCアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー細胞(NK細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、関心ある分子のADCC活性は、例えば、Clynes等 PNAS (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
「補体依存性細胞障害」もしくは「CDC」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。補体の活性化経路は補体系(Clq)の第1補体が、同族抗原と結合した分子(例えば、抗体)に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、CDCアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
ここで用いられる「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害し又は妨害し、及び/又は細胞の破壊を引き起こす物質のことをいう。この用語は放射性同位体(例えばAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、及びLuの放射性同位体)、化学療法剤、及び断片及び/又はその変異体を含む細菌性、真菌性、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素又は小分子毒素等の毒素を含むことが意図されている。
「アゴニスト抗体」はレセプターのような抗原に結合しそれを活性化する抗体である。一般には、アゴニスト抗体のレセプター活性化能は、レセプターの天然のアゴニストリガンドに少なくとも質的に類似し(また本質的に量的に類似し)ている。
哺乳動物細胞系で作られる対応抗体「と実質的に等しい有効性で抗原に結合する」本発明の抗体は、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞によって発現される抗体の結合親和性の、約10倍、好ましくは約5倍、より好ましくは約2倍以内の親和性又は結合活性を有する抗原に結合する能力を有するものである。
「疾患」は抗体で治療することで恩恵を得るあらゆる症状のことである。これには、問題の疾患に哺乳動物を罹患させる素因になる病理状態を含む、慢性及び急性の疾患又は病気が含まれる。ここで治療される疾患の例は、これに限定されるものではないが、良性及び悪性の腫瘍;非白血病性及びリンパ悪性腫瘍;ニューロン、神経膠、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮、ストロマ及び割腔の疾患;及び炎症、血管形成及び免疫性疾患が含まれる。
本明細書において「治療」とは、処理されている個体または細胞の自然の経過を変更しようとする臨床的介入をさし、予防のためかまたは臨床病理学の治療単位の間に実施され得る。治療の望ましい作用としては疾病の発生または再発生の防止、症状の軽減、疾病のいずれかの直接もしくは間接的病的結果の減少、転移の防止、疾病進行速度の低下、病状の改善もしくは緩和、および予後の寛解もしくは改善が挙げられる。
「有効量」とは、所望の治療または予防結果を達成するために、用量で、および必要な時間の間有効な量をさす。抗体の「治療上有効量」は病状、年齢、性別、個体の体重、および個体において所望の応答を惹起する抗体の能力などの因子によって異なり得る。また治療上有効量は治療上有益な作用が抗体のいずれかの毒性または有害な作用に優る場合のものである。「予防上有効量」とは、所望の予防結果を達成するために、用量で、および必要な時間の間有効な量をさす。典型的には、予防用量は疾病に先立って、またはその初期段階で対象に用い、予防上有効な量は治療上有効量よりも少ない。
本発明は原核生物系における免疫グロブリンの組換え生産に関する。本発明は免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖の発現が独立に調節される独自に設計された発現ベクター(すなわち、個別シストロン系)に基づくものである。本明細書に示されるいくつかの実施例で例示するように、抗体生産のための既存の原核生物系には重大な問題があり、それでは軽鎖および重鎖遺伝子の転写が1つのプロモーターの制御下にある(すなわち、ポリシストロン性系)。かかる系では2種の免疫グロブリン鎖の発現レベルが不均衡となる傾向がある。2種の遺伝子が単一の転写単位から発現される場合には、典型的には第1の遺伝子が第2の遺伝子よりも高レベルで発現される。この作用は第2の遺伝子の2種の遺伝子間のリボソーム結合効率のようなさらなる因子への翻訳依存性に起因する。従って、ポリシストロン性系は重鎖を上回る過剰の軽鎖を生産する。この特別な問題は理論上は実験的に翻訳カップリングを増加させることで改善される。しかしながら、鎖の間に効率的な翻訳カップリングが得られるとしても、ポリシストロン性系は好ましい軽鎖と重鎖の発現比の決定を複雑にするさらなる困難がある。両鎖は同一メッセージ上でつながっているので第1の遺伝子(軽鎖)の翻訳を操作すると第2の遺伝子(重鎖)の翻訳に影響を及ぼす。軽鎖と重鎖の望ましい発現比を達成するためにかかる複雑な配置を克服するのには相当な時間と努力が必要であろう。
本発明の個別シストロン発現系は主として免疫グロブリンの生産について例示されているが、本明細書に記載されるアプローチは多量体タンパク質が産生され、かつ、機能的であるためには最終タンパク質複合体が個々の単位/鎖の適切な構成を必要とするいずれの系にも適用可能であると理解されるべきである。本アプローチは、限定されるものではないが、例えば、T細胞受容体、クラスIおよびクラスII MHC分子、インテグリン、CD8、CD28および因子VIII分子、および関連誘導体、変異体および融合タンパク質をはじめとするジスルフィド結合を含むタンパク質複合体の生産に特に有用である。
本発明はどんな適当な抗原結合特異性を有する抗体にも適用可能である。本発明の抗体は生物学的に重要なポリペプチドである抗原に特異的であるのが好ましい。より好ましくは、本発明の抗体は哺乳類における疾病または疾患の治療または診断に有用である。本発明に従って作製された全長の非グリコシル化された抗体は阻止抗体、アゴニスト抗体または抗体接合体などの治療用抗体として特に有用である。治療用抗体の限定するものではない例としては、抗VGEF、抗IgE、抗CD11、抗CD18、抗CD40、抗組織因子(TF)、抗HER2、および抗TrkC抗体が挙げられる。非ポリペプチド抗原(腫瘍関連糖脂質抗原など)に対して向けられる抗体も考慮される。
他の分子と場合によっては結合されていてもよい、可溶型抗原又はその断片を、抗体を産生するための免疫原として使用することができる。レセプターのような膜貫通分子に対しては、これらの分子の断片(例えば、レセプターの細胞外ドメイン)を免疫原として使用することができる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として使用することもできる。そのような細胞は天然源(例えば、癌株化細胞)から取り出すことができ、又は膜貫通分子を発現するために組換え法により形質転換された細胞でありうる。抗体の調製に対して有用な他の抗原とその形態は当業者には明らかであろう。
本発明の抗体は単一特異性、二特異性、三特異性またはより多い多特異性であってもよい。多特異性抗体は単一分子の異なるエピトープに特異的であってもよく、または異なる分子上のエピトープに特異的であってもよい。多特異性抗体を設計および作製する方法は当技術分野で周知である。例えば、Millstein等 (1983) Nature 305:537-539;Kostelny等(1992) J. Immunol. 148:1547-1553;WO93/17715参照。
本発明の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を用いて入手すればよい。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離および配列決定すればよい。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチドシンセサイザーまたはPCR技術を用いて合成してもよい。入手したら、軽鎖および重鎖をコードする配列を原核生物の宿主において異種ポリヌクレオチドを複製および発現可能な組換えベクターに挿入する。本発明の目的のためには、入手でき当技術分野で周知である多数のベクターが使用できる。適当なベクターの選択は主としてベクターに挿入される核酸の大きさおよびベクターで形質転換される特定の宿主細胞によって異なる。各ベクターは種々の成分を含むが、これはその機能(異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはその双方)およびそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性によって異なる。一般に、ベクター成分としては限定されるものではないが、複製開始点、選抜マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種核酸挿入部分および転写終結配列が挙げられる。
さらに、レプリコンと宿主微生物と適合する制御配列とを含むファージベクターを形質転換ベクターとしてこれらの宿主とともに用いてもよい。例えば、λGEM.TM.−11などのバクテリオファージを組換えベクターの作製に利用してもよく、これを用いて大腸菌LE392などの感受性宿主細胞を形質転換してもよい。
構成および誘導プロモーターの双方ともを本発明に使用してよいが、本明細書に開示される発現ベクターでは高度に調節する誘導プロモーターが好ましい。種々の可能性ある宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。制限酵素消化によって供給源DNA由来のプロモーターを除去し、単離したプロモーター配列を本発明のベクターに挿入することで、選択したプロモーターを軽鎖および重鎖をコードするシストロンDNAに機能しうる形で連結すればよい。天然のプロモーター配列および多数の異種プロモーターの双方とも、これを用いて標的遺伝子の増幅および/または発現に向けることができる。しかしながら、異種プロモーターが好ましく、これはそれらが一般に天然の標的ポリペプチドプロモーターと比べ、より多量の転写および発現された標的遺伝子のより多い産生量を可能にするからである。
本発明のある態様では、組換えベクター内の各シストロンは分泌シグナル配列要素を含んでなり、これは発現されたポリペプチドの、膜を超える移行を方向付けする。一般に、シグナル配列はベクターの成分であってよく、またはベクターに挿入される標的ポリペプチドDNAの一部であってもよい。本発明の目的のために選択されたシグナル配列は宿主細胞によって認識され、プロセシングされる(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものであるべきである。異種ポリペプチド本来のシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核生物の宿主細胞については、シグナル配列を例えば、アルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ipp、または熱安定性エンテロトキシンII(STII)リーダー、LamB、PhoE、PelB、OmpAおよびMBPからなる群から選択される原核生物のシグナル配列で置換する。本発明の好ましい実施形態では、発現系の両シストロンに用いるシグナル配列はSTIIシグナル配列またはその変異体である。
本発明は、分泌され、かつ、適切に構築された全長抗体の産生量を最大化するために発現される軽鎖と重鎖の量比を調節できる発現系を提供する。かかる調節は軽鎖と重鎖の翻訳強度を同時に調節することで達成される。
宿主細胞を前記の発現ベクターで形質転換して誘導プロモーター用に必要に応じて改変した従来の栄養培地で培養し、形質転換体を選抜し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅する。
形質転換とはDNAが染色体外要素としてか、または染色体成分によってのいずれかで複製可能であるようにDNAを原核生物の宿主に導入することを意味する。形質転換は、用いる宿主細胞に応じてかかる細胞に適当な標準的な技術を用いて行う。一般に、かなりの細胞壁障壁を含む細菌細胞には塩化カルシウムを用いるカルシウム処理を用いる。もう1つの形質転換法はポリエチレングリコール/DMSOを用いる。用いられるさらにもう1つの技術はエレクトロポレーションである。
本発明のポリペプチドを生産するために用いられる原核細胞は当技術分野で周知であり、かつ、選択した宿主細胞の培養に好適な培地で増殖させる。好適な培地の例としては必要な栄養素を補ったルリア−ブロス(LB)が挙げられる。好ましい実施形態では、発現ベクターを含有する原核細胞の増殖を選択的に可能にするために培地は発現ベクターの構成を基に選択した選抜剤も含んでもよい。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖のために、アンピシリンを培地に加える。
原核生物の宿主細胞を好適な温度で培養する。大腸菌増殖には、例えば、好ましい温度は約20℃ないし約39℃、より好ましくは約25℃ないし約37℃にわたり、さらにより好ましくは約30℃である。培地のpHは、主として宿主生物にもよるが、約5ないし約9にわたるいずれpHであってもよい。大腸菌には、pHは好ましくは約6.8ないし約7.4であり、より好ましくは約7.0である。
本発明の発現ベクターに誘導プロモーターを用いる場合には、タンパク質発現はプロモーターの活性化に好適な条件下で誘導する。本発明のある態様では、2個のPhoAプロモーターを用いて軽鎖および重鎖の転写を制御する。従って、形質転換された宿主細胞を誘導のためにリン酸制限培地で培養する。好ましくは、リン酸制限培地は以下の実施例2に詳細に記載されるシー・アール・エー・ピー(C.R.A.P)培地である。用いるベクター構築物によっては、当技術分野で周知のように種々の他の誘導物質を用いてもよい。
本発明のある態様では、抗体生産を培養プロセスによって大量に実施する。組換えタンパク質の生産には種々の大規模流加培養手順が利用できる。大規模培養は少なくとも1000リットルの容量を有し、好ましくは約1,000ないし100,000リットルの容量を有する。これらの発酵槽は攪拌羽根を用いて酸素および栄養素、特にグルコース(好ましい炭素/エネルギー供給源)を分配する。小スケール培養とは一般に容積が約100リットルしかない培養槽での培養をさし、約1リットルないし約100リットルにわたり得る。
本発明のポリペプチドの産生量および品質を改善するために、種々の培養条件を改変してよい。例えば、分泌された抗体ポリペプチドの適切な構成および折りたたみを向上させるために、Dsbタンパク質(DsbA、DsbB、DsbC、DsbDおよびもしくはDsbG)またはFkpA(シャペロン活性を有するペプチジルプロリルシス、トランスイソメラーゼ)などのシャペロンタンパク質を過剰発現するさらなるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換してもよい。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞で産生された異種タンパク質の適切な折りたたみおよび可溶性を促進すると実証されている。Chen等 (1999) J. Bio. Chem. 274:19601-19605;Georgiou等,米国特許第6,083,715号;Georgiou等,米国特許第6,027,888号;Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105;Ramm及びPluckthun (2000) J. Bio. Chem. 275:17106-17113;Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。2つの重鎖および2つの軽鎖を含む全長の、二価抗体の形成および折りたたみには十分なジスルフィド結合が特に重要である。
好ましい実施形態では、タンパク質分解酵素を欠き、かつ、1種以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。これらの株のいくつかを下記の実施例の項でさらに記載する。
好ましい実施形態では、本明細書で生産された抗体タンパク質をさらに精製して、さらなるアッセイおよび使用のために実質的に均質な調製物を得る。当技術分野で周知の標準的なタンパク質精製法を用いればよい。以下の手順は好適な精製手順の例である:免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカまたはDEAEなどの陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、SDS−PAGE、硫酸アンモニウム沈殿、および例えばセファデックスG−75を用いるゲル濾過。
ある態様では、本発明の全長抗体産物の免疫親和性精製に固相に固定したタンパク質Aを用いる。タンパク質Aは黄色ブドウ球菌由来の41kDの細胞壁タンパク質であり、高親和性で抗体のFc領域と結合する。Lindmark等 (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。タンパク質Aを固定する固相はガラスまたはシリカ表面を含んでなるカラムであることが好ましく、制御された孔を有するガラスカラムまたはケイ酸カラムがより好ましい。いくつかの適用では、夾雑物の非特異的付着を防ごうとしてカラムをグリセロールなどの試薬でコーティングした。
精製の第1の工程として、前記の細胞培養物由来の調製物を固相に固定したタンパク質Aに適用して全長抗体をタンパク質Aに特異的に結合させる。次いで、固相を洗浄して固相に非特異的に結合した夾雑物を除去する。最後に、全長抗体を溶出させることで固相から回収する。
本発明の全長非グリコシル化抗体は、種々の当技術分野で周知のアッセイによってその物理的/化学的特性および生物学的機能について特性決定すればよい。本発明のある態様では、本発明の原核生物の宿主細胞で作製された抗体と異なる発現ベクター設計または異なる宿主細胞系などのその他の発現系で作製された同様の抗体とを比較することが重要である。特に、本発明の個別シストロンベクターによって発現された全長抗体量を種々のポリシストロン性ベクターによって発現されたものとを比較すればよい。タンパク質定量化法は当技術分野で十分に知られている。例えば、発現されたタンパク質のサンプルをクーマシー染色したSDS−PAGEでその定量的強度について比較すればよい。あるいは、注目される特定のバンド(例えば、全長バンド)を例えば、ウェスタンブロットゲル解析および/またはAME5−RPアッセイによって検出すればよい。
精製した全長抗体は、限定されるものではないが、N末端配列決定、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析、イオン交換クロマトグラフィーおよびパパイン消化をはじめとする一連のアッセイによってさらに特性決定してもよい。
ある実施形態では、本発明は非グリコシル化された全長抗体を考慮する。この抗体の独特の特徴(すなわち、エフェクター機能は欠くが完全なFc領域を有すること)によりインビボでの抗体の半減期が重要であるがエフェクター機能(すなわち、補体およびADCC)は不必要であるか有害である多数の適用にとって所望の候補となる。特定の実施形態では、産生された全長抗体のFc活性を測定して確実に望ましい特性のみが維持されているようにする。例えば、Fc受容体(FcR)結合アッセイを実施して確実に抗体がFcγR1結合を欠くが(従って、ADCC毒性を欠く)、FcRn結合能力は保持するようにする。また、C1q結合アッセイを実施して抗体がC1qと結合できず、従ってCDC活性を欠くということを確認してもよい。インビトロおよびインビボ細胞障害性アッセイを実施してCDCおよびまたはADCC活性の枯渇を確認してもよい。これらのアッセイを実施するための技術は当技術分野で周知である。例示的な手順の詳細を実施例の項で示す。
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する方法は当該分野でよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体は非ヒトである供給源からそこに導入された一又は複数のアミノ酸残基を有している。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と称され、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は本質的には高頻度可変領域配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより、Winterと共同研究者(Jones等 (1986) Nature, 321:522-525;Riechmann等 (1988) Nature, 332:323-327;Verhoeyen等 (1988) Science, 239:1534-1536)の方法に従って実施できる。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかの高頻度可変領域残基及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
抗原性を軽減するには、ヒト化抗体を産生するために使用するヒトの軽及び重可変ドメインの両方の選択が非常に重要である。いわゆるベストフィット法では、齧歯類抗体の可変領域の配列を既知のヒト可変配列ライブラリー全体に対してスクリーニングする。齧歯類のものと最も類似するヒトの配列をヒト化抗体のヒトフレームワークとして受け入れる(Sims等 (1993) J. Immunol., 151:2296、Chothia等 (1987) J. Mol. Biol., 196:901)。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から取り出す特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを複数の異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285、Presta等 (1993) J. Immunol. 151:2623)。
ここに記載する抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれうる。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の核酸中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び/又は挿入及び/又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特徴を有するとするならば、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、その最終コンストラクトに達するまでなされる。アミノ酸変化は、配列が作製される時点で対象抗体アミノ酸配列に導入されてもよい。
突然変異誘発の好ましい位置である抗体の所定の残基又は領域の特定のために有用な方法は、Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され(例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基)、中性又は負荷電アミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリアラニン)に置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。ついで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の変異体を導入することにより精密にされる。しかして、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、alaスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された全長抗体を所望の活性についてスクリーニングする。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基で置換されている。置換突然変異に対して最も興味深い部位は高頻度可変領域を含むが、FR変化も考えられる。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表1に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表1に「例示的な置換」と名前を付け、又はアミノ酸の分類に関して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてもよい。
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
抗体の適切な配置の維持に関与しない任意のシステイン残基は、一般にセリンで置換し、分子の酸化的安定性を向上させて異常な架橋を防止する。逆に、抗体にシステイン結合を付加して、その安定性を向上させてもよい。
本発明の抗体のFc領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入し、それによって変異体Fc領域を作成することが望ましい。Fc領域変異体は一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトFc領域配列(例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4Fc領域)を含みうる。
一実施態様では、Fc領域変異体は、変更された新生児Fcレセプター(FcRn)結合親和性を示しうる。そのような変異体Fc領域は、Fc領域のアミノ酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439又は477の任意の一又は複数においてアミノ酸修飾を含んでいてもよく、ここでFc領域の残基の番号付けはKobatのEUインデックスのものである。FcRnへの減少した結合性も持つFc領域変異体は、Fc領域のアミノ酸位置252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439又は447の任意の一又は複数においてアミノ酸修飾を含んでいてもよく、ここでFc領域の残基の番号付けはKobatのEUインデックスのものである。上述のFc領域変異体は、あるいはFcRnへの増加した結合性を示し、Fc領域のアミノ酸位置238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424又は434の任意の一又は複数においてアミノ酸修飾を含んでいてもよく、ここでFc領域の残基の番号付けはKobatのEUインデックスのものである。
例えば、Fc領域変異体はFcγRIへの減少した結合性を示し、Fc領域のアミノ酸位置238、265、269、270、327又は329の任意の一又は複数においてアミノ酸修飾を含んでいてもよく、ここでFc領域の残基の番号付けはKobatのEUインデックスのものである。
Fc領域変異体はFcγRIIへの減少した結合性を示し、Fc領域のアミノ酸位置238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438又は439の任意の一又は複数においてアミノ酸修飾を含んでいてもよく、ここでFc領域の残基の番号付けはKobatのEUインデックスのものである。
変更された(すなわち改善されたか減少させられた)C1q結合性及び/又は補体依存性細胞障害性(CDC)を持つFc領域変異体は国際公開第99/51642号に記載されている。そのような変異体はFc領域のアミノ酸位置270、322、326、327、329、331、333又は334の一又は複数においてアミノ酸置換を含みうる。Fc領域変異体については、Duncan及びWinter Nature 322:738-40 (1988);米国特許第5,648,260号;米国特許第5,624,821号;及び国際公開第94/29351号をまた参照のこと。
本発明は、また、細胞障害剤、例えば化学療法剤(ここで上に定義及び記載したようなもの)、毒素(例えば、小分子毒素又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的に活性な毒素で、その断片及び/又は変異体を含む)、又は放射性同位元素(すなわち、放射性コンジュゲート)に結合した抗体を含有する免疫複合体に関する。
抗体と一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシン(米国特許第5,208,020号)、トリコテン(trichothene)、及びCC1065のコンジュゲートがまたここで考えられる。
本発明の一実施態様では、抗体は一又は複数のメイタンシン分子(例えば1抗体分子当たり約1から約10のメイタンシン)に結合される。メイタンシンは、例えばMay-SH3に還元されていてもよいMay-SS-Meに転換され、修飾された抗体と反応して(Chari等, Cancer Research 52: 127-131 (1992))メイタンシノイド-抗体免疫複合体を生じうる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素A鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば1993年10月28日に公開された国際公開第93/21232号を参照のこと。
本発明は更に抗体と核溶解(nucleolytic)活性を持つ化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はDNAエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ;DNase)の間に形成された免疫複合体を更に考える。
様々な放射性同位元素が放射性コンジュゲート抗体の生産に利用できる。例には、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32及びLuの放射性同位元素が含まれる。
あるいは、抗体と細胞障害剤を含む融合タンパク質を、例えば組換え法又はペプチド合成法によって作製してもよい。
他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体を結合させることができ、ここで、抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いてキレート剤を使用して、循環系から未結合コンジュゲートを除去し、ついで細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)に結合した「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
本発明の抗体および抗体変異体をさらに改変して当技術分野で周知であり、かつ、容易に入手できるさらなる非タンパク質部分を含めてもよい。好ましくは、抗体の誘導体化に好適な部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの限定するものではない例としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキソラン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダム共重合体のいずれか)およびデキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、およびその混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドがその水中安定性のために製造において有利であり得る。ポリマーはいずれの分子量のものであってもよく、分枝していてもよいし、していなくてもよい。抗体に結合するポリマー数は異なってよく、1以上のポリマーを結合する場合にはそれらは同一分子であっても異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に用いるポリマーの数およびまたは種類は、限定されるものではないが、改良される抗体の特定の性質または機能、抗体誘導体が所定の条件下で治療に用いられるかどうかをはじめとする考慮を基に決定すればよい。
全長抗体の治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A. 編, (1980))、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製され貯蔵される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質複合体);及び/又はTWEEN(商品名)、PLURONICS(商品名)又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリペプチド-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A. 編, (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。このことは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
本発明の抗体は、例えば、それが認識する特定ポリペプチドを精製、検出、及び標識するのに使用され、インビトロ及びインビボの診断及び治療方法を含む。
一態様では、本発明の抗体は、生物学的試料の特定抗原を質的及び量的に測定する免疫測定法に使用することができる。抗原-抗体結合を検出するための通常の方法には、例えば酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、放射免疫アッセイ(RIA)又は組織免疫組織化学を含む。多くの方法では、検出の目的で抗体に結合する標識を使用する。抗体とともに使用される標識は、抗体への結合を妨害しないあらゆる検出可能な機能性を有する。多くの標識が知られ、放射性同位体である32P, 32S, 14C, 125I, 3H及び131I、希土類キレートなどのフルオロフォアー、又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、アンベリフェロン(umbelliferone)、例えばホタルルシフェラーゼ及びバクテリアルシフェラーゼ(米国特許第4,737,456号)などのルシフェラーゼ、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼなどのサッカライドオキシダーゼ、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなどのヘテロサイクリックオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ビオチン/アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル、放射性核種の画像(例えばTechnocium)などである。
抗体を標識する代わりに、抗原を生物学的流体において検出可能な物質を含む競合標識抗原標準と非標識抗体とを利用する競合イムノアッセイによってアッセイしてもよい。このアッセイでは、生物学的サンプル、標識抗原標準および抗体を結合させ、非標識抗体と結合した標識抗原標準の量を求める。生物的サンプル中の試験した抗原の量は抗体と結合した標識抗原標準の量と反比例する。
本発明の抗体をアンタゴニストとして用いてインビトロおよびインビボの双方で特定の抗原活性を部分的にまたは完全にブロックしてもよい。さらに、本発明の少なくともいくつかの抗体は他の種由来の抗原活性を中和できる。従って、本発明の抗体を用いて例えば、抗原を含有する細胞培養物において、本発明の抗体と交差反応する抗原を有するヒト被験者においてまたは他の哺乳類被験体(例えば、チンパンジー、ヒヒ、マモセット、カニクイザルおよびアカゲザル、ブタまたはマウス)において特定の抗原活性を阻害することができる。ある実施形態では、本発明の抗体を、抗体を抗原と接触させ、その結果抗原活性が阻害されることによって抗原活性を阻害するために使用してもよい。好ましくは抗原はヒトタンパク質分子である。
本発明の抗体は、単独で又は他の治療用組成物と組み合わせて使用することができる。例えば、抗体は、別の抗体、化学療法剤(群)(化学療法剤のカクテルを含む)、他の細胞障害剤(群)、抗血管形成剤(群)、サイトカイン、及び/又は成長阻害剤(群)と共に同時投与されうる。全長抗体が腫瘍成長を阻害する場合、腫瘍成長もまた阻害する一又は複数の他の治療剤(群)と全長抗体を組み合わせることが特に望ましいであろう。例えば、転移性乳癌の治療において、VEGF活性を阻害する抗VEGF抗体は、抗ErbB抗体(例えばHERCEPTIN(登録商標)抗HER2抗体)と組み合わせることができる。別法として、又は付加的に、患者は併用放射線療法(例えば外的ビーム照射あるいは抗体のような放射標識剤での治療法)を受けてもよい。上に言及したそのような併用療法には併用投与(2又はそれ以上の薬剤が同一の又は別の製剤中に含まれる)、及び別個の投与が含まれ、後者の場合は、全長抗体の投与が補助療法又は療法群の投与の前、及び/又はそれに続いて行われ得る。
本発明の全長抗体組成物が処方され、用量決定(dose)され、良好な医学的実務に適合する方式で投与される。ここで考慮すべき因子には、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、及び医学実務者に知られている他の因子が含まれる。全長抗体は、問題の疾患の予防又は治療に現在使用されている一又は複数の他の薬剤と共に製剤する必要はないが、場合によってはそのようにされる。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する全長抗体の量、疾患又は治療のタイプ、及び上述した他の因子に依存する。これらは、一般にはこれまでに使用されているのと同じ用量と投与経路で、あるいはこれまでに使用された用量の約1から99%で用いられる。
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器の又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は全長抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌のような選択した症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)組成物を中に収容し、その組成物が全長抗体を含む第1の容器と;(b)組成物を中に収容し、その組成物が更なる細胞障害剤を含む第2の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、第1及び第2抗体組成物を癌の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第2の(又は第3の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
組織因子に特異的な抗体(抗TF抗体)および血管内皮細胞増殖因子に特異的な抗体(抗VEGF抗体)の発現のために種々の発現ベクターを作製した。各ベクター構築物のために、発現カセットを大腸菌プラスミドpBR322のフレームワークにEcoRI部位でクローニングした。Sutcliffe (1978) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43:77-90。各発現カセットは少なくとも以下の構成要素を含む:(1)転写制御のためのphoAプロモーター;(2)翻訳開始のための、大腸菌trp由来のシャイン−ダルガーノ配列または熱安定性エンテロトキシンII(STII)遺伝子、または双方の組み合わせ;および(3)転写を終結させるλt0ターミネーター。細菌の発現カセットの基本的構成要素は当技術分野で周知であり、例えば、菊池ら,Nucleic Acids Res. 9 (21):5671-5678 (1981)(phoAプロモーターについて);Scholtissek及びGrosse, Nucleic Acids Res. 15;3185 (1987)(λt0ターミネーターについて);Yanofsky等,Nucleic Acids Res. 9:6647-6668 (1981)(trpについて);Picken等,Infect. Immun. 42:269-275 (1983)(STIIについて);Chang等,Gene 55:189-196 (1987)(trpとSTIIシャイン−ダルガーノ配列の併用について)に記載されている。さらに、STIIシグナル配列またはそのサイレントコドン変異体が軽鎖または重鎖のコード配列の前にあり、ポリペプチドのペリプラズムへの分泌に向かわせる。Picken等, Infect. Immun. 42:269-275 (1983);Simmons及びYansura, Nature Biotechnology 14:629-634 (1996)。
本発明の個別シストロン系の増強された特性を例示するために、比較のために全長抗体のためのいくつかのポリシストロン性ベクターを構築した。ポリシストロン性ベクターでは、軽鎖および重鎖遺伝子のための2個のシストロンは単一のPhoAプロモーターの転写制御下にある。
抗TF抗体発現のための最初のポリシストロン性ベクター、pxTFPVはこれまでに公開されているベクター、pAK19(これは抗体断片Fab’発現のためのものであった)の発現カセットを用いて構築した。Carter等(1992) Bio/Technoligy10:12-16。本来のpAK19の構造および全長形pxTFPVの構成が図1に示されている。発現カセットは5’から3’末端に、PhoAプロモーター、軽鎖のシストロン、重鎖のシストロンおよび転写ターミネーターλt0を含む。
軽鎖停止コドンと重鎖の前のSTIIシグナル配列の先頭の間の距離は81塩基対である。ポリシストロン性抗VEGFベクターを構築するために、抗VEGF軽鎖および重鎖のコード配列をpxTFPV中の抗TF軽鎖および重鎖のコード配列と置換した。抗VEGF発現カセットをPhoAプロモーターの〜50bpのHindIII断片上流を欠失させることでさらに改変し、重鎖シャイン−ダルガーノ配列の非翻訳領域上流でいくつかのヌクレオチド変更も行った。得られた抗VEGFのためのポリシストロン性ベクターはpY0317.Fab_CH3と名づけた。
いくつかのさらなるポリシストロン性抗TF構築物、paTF20、paTF30、paTF40、paTF90、paTF110、paTF100、paTF120を同様に作製した。これらのポリシストロン性プラスミドの発現カセット配列はpxTFPVのものとは主として5’非翻訳領域および重鎖の分泌シグナル配列の前の領域において異なる。さらに、構築物によっては、pxTFPVといくつかのさらなるポリシストロン性プラスミドの間にはSTIIシグナル配列にサイレントコドンの相違も存在する。Simmons及びYansura, Nature Biotechnology 14:629-634 (1996)。
本発明を実施するために、個別シストロンを含むベクターを免疫グロブリン軽鎖および重鎖遺伝子の独立した発現を提供するよう設計した。かかるベクターでは、各鎖のシストロン単位はそれ自身のPhoAプロモーターの制御下にあり、λt0ターミネーターが続く。さらに、各シストロン単位は軽鎖または重鎖のコード配列のTIR上流を含んでなる。個別シストロンベクターの構成は図7に示されている。発現カセットは5’から3’に第1のPhoAプロモーター、次いで軽鎖のシストロン(TIR−L+軽鎖)および第1のλt0ターミネーター、ならびに第2のPhoAプロモーター、次いで重鎖のシストロン(TIR−H+重鎖)および第2のλt0ターミネーターを含んでなる。TIR−LおよびTIR−Hの双方ともそれにさらにSTII分泌シグナル配列またはその変異体を含む。paTF50の(抗TF用;配列番号1)およびpxVG2AP11の(抗VEGF用;配列番号2)発現カセット配列がそれぞれ図20および21に示されている。抗TF用のさらなる個別シストロンベクター、paTF70、paTF60、paTF80、paTF130、paTF140、およびpxTF2AP77は軽鎖および重鎖翻訳についてのTIR強度の種々の組み合わせを表し、前記のようにpaTF50とはSTIIシグナル配列におけるサイレントコドン変更に関して異なっている。Simmons及びYansura, Nature Biotechnology 14:629-634 (1996)。
まず、全長抗体を公開されているベクター、pAK19から誘導したポリシストロン性ベクターを用いて実施例1に記載の方法に従って大腸菌で作製した。まず、小スケール誘導を行って種々の構築物を用いて得られた発現レベルを評価および比較した。
材料および方法
各構築物の小スケール発現には、大腸菌株33D3(W3110・fhuA(・tonA)ptr3 lac Iq lacL8・ompT・(nmpc−fepE)degP41kanR)を宿主細胞として用いた。形質転換後、選抜した形質転換体ピックアップをカルベニシリン(50ug/ml)を添加した5mlのルリア−ベルタニ培地に播種し、30℃にて培養ホイール上で一晩増殖させた。次いで、各培養物をC.R.A.Pリン酸制限培地(pHをKOHで7.3に調節し、qsをSQ H2Oで872mlとしてオートクレーブし;55℃まで冷却し、110mlの1M MOPS pH7.3、11mlの50%グルコース、7mlの1M MgSO4を添加した、3.57gの(NH4)2SO4、0.71gのクエン酸ナトリウム−2H2O、1.07gのKCl、5.36gの酵母抽出物(食用)、5.36gのHycaseSF Sheffield)に希釈した(1:50または1:100)。次いで、培養物を誘導するためにカルベニシリンを50ug/mlの濃度で加え、この培養物を培養ホイール上で30℃にて約24時間増殖させた。特に断りのない限り、すべての振盪フラスコ誘導は2mlの容量で実施した。
工程(2)で細胞再懸濁溶液に10ulの1M DTTを加え、かつ、工程(3)でIAAの添加を省略した以外は非還元サンプルのための前記のものと同様の以下の工程によって還元サンプルを調製した。タンパク質沈殿を2Xサンプルバッファー+dH2Oに再懸濁するときに還元剤も100mMの濃度まで加えた。
調製後、各サンプルの5〜10ulを10ウェル、1.0mmノベックス(NOVEX)製12%Tris−グリシンSDS−PAGに乗せて〜120ボルトで1.5〜2時間電気泳動した。次いで、得られたゲルをクーマシーブルーで染色するか、またはウェスタンブロット解析に用いるのいずれかとした。
発現されたタンパク質バンドのいくつかをさらにN末端配列解析に付し、これではSDS−PAG電気泳動後に誘導培養物由来のサンプルをPVDF膜にエレクトロブロットした(松平,J. Bio. Chem. 262:p.10035−10038(1987))。適当なPVDFバンドを140Cまたは140DオンラインPTHアナライザーを備えたアプライド・バイオシステム(Applied Biosystems)(フォスターシティ、カリフォルニア)494HTまたは494cLCシーケンサーで配列決定した(Henzel等, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 6:239-247 (1994))。
ポリシストロン性ベクターは限られた量の全長抗体しか産生しなかった
抗TF抗体(pxTFPV)および抗VEGF抗体(pY0317.Fab_CH3)のためのポリシストロン性プラスミドを構築し、33D3株に形質転換し、実施例1および前記の方法および材料に記載のように誘導した。次いで、非還元全細胞溶解物サンプルを調製してウェスタンブロットによって解析した。結果が図2に示されている。矢印が示すように、抗TF抗体については少量の明らかに全長の、正しく折りたたまれた抗体が認められ(レーン2)、抗VEGF抗体サンプルでは全長バンドは実質的に検出されなかった(レーン3)。次いで、還元サンプルを調製し、SDS−PAGEによって分離し、PVDF膜にトランスファーした。次いで、抗TFおよび抗VEGF抗体双方について誘導したタンパク質バンドを切り出し、N末端アミノ酸解析に付した。結果は両構築物について最大のプロセッシングされた成熟タンパク質およびプロセッシングされていない前駆体タンパク質(これでは分泌シグナル配列が切断されていない)を示した。従って、ポリシストロン性ベクターpxTFPVおよびpY0317.Fab_CH3は全長抗TFまたは抗VEGF抗体の相当な分泌および構成に向かわせることはできなかった。
効率の悪い分泌という問題を解決するために、図3に示されるように軽鎖および重鎖のTIR強度組み合わせを調節したさらなるポリシストロン性ベクターを作製した。本実験の目的は軽鎖および重鎖のよりよい分泌を達成する翻訳レベルを決定することであった。TIR強度の種々の組み合わせを用いて全長抗体の最大蓄積のための軽鎖と重鎖の好ましい発現比を決定することもできよう。すべての構築物は実施例1の技術に従って設計し構築した。種々のTIR強度組み合わせの以下の構築物を構築した:paTF20(1−軽鎖、1−重鎖)、paTF30(3−軽、1−重)、paTF40(1−軽、3−重)、paTF90(3−軽、3−重)、paTF100(3−軽、7−重)、paTF110(7−軽、3−重)、paTF120(7−軽、7−重)。括弧内の数はSimmons等, Nature Biotechnology 14:629-634 (1996)、および米国特許第5,840,523号に記載のように軽鎖および重鎖のTIR相対強度を表す。
TIR強度組み合わせを調節した個別シストロンベクターを構築するために、まず軽鎖または重鎖のみを発現させるために構築した一連の単一シストロンプラスミドで個々の鎖各々の分泌のための好ましいTIR強度を求めた(図5)。従って、抗TF軽鎖および重鎖双方の個々の発現のための種々のTIRを含む一連の単一シストロンプラスミドを構築した。ベクター構築およびタンパク質発現に用いた方法および材料はポリシストロン性ベクター発現に用いたものと同様であり、これは前記の実施例1および2に記載されている。
調べたTIR強度の範囲は1の相対強度から13の最大相対強度に及んだ。このように構築したプラスミドで形質転換し誘導した培養物由来の還元全細胞溶解物をSDS−PAGEによって解析し、その結果が図6に示されている。重鎖および軽鎖の双方について、TIRを7の相対強度まで増加させるにつれ分泌タンパク質レベルが上昇する。次いで重鎖の場合には、TIR相対強度が13まで上がると成熟タンパク質レベルが低下する。軽鎖発現に13のTIR相対強度を用いる場合には、成熟タンパク質レベルは一定のままであるが、この構築物を用いると前駆体物質が蓄積し始める。この結果は軽鎖および重鎖の個々の発現について、最も好ましいのTIRは7であるということを示唆した。7のTIRを用いて産生される軽鎖および重鎖タンパク質バンドをN末端アミノ酸解析によって完全にプロセッシングされた成熟型のタンパク質であることを確認した。
pAK19から誘導したポリシストロン性プラスミドと個別シストロンプラスミド間の同様の比較により大腸菌における全長抗体の発現のためのこの新規技術の利点がさらに示される。解析には抗組織因子および抗VEGF抗体双方のための発現プラスミドを含めた。抗組織因子の発現に関しては、ポリシストロン性プラスミドpxTFPVおよび個別シストロンプラスミドpaTF50(1−軽、1−重)を33D3株に形質転換し、リン酸制限培地で誘導した。非還元サンプルを調製し(IAA処理)、クーマシー染色SDS−PAGEによって解析した(図12)。検出法としてクーマシーブルー染色のみを用いて、個別シストロンサンプルから誘導された全長抗体タンパク質バンドが認められた(レーン3)。次いで、N末端アミノ酸解析によってこのタンパク質バンドが予想通り抗組織因子軽鎖および重鎖の双方を含むと決定した。かかるタンパク質バンドはポリシストロン性プラスミドを用いるクーマシー染色では明らかでない(レーン2)。またサンプルをポリクローナルヤギ抗ヒトFab抗体を用いるウェスタンブロットによって解析した(図13)。この高感度検出法を適用することにより、ポリシストロン性プラスミドを用いて少量の全長抗体が認められる(レーン2)が、個別シストロンプラスミドを用いると発現レベルは著しく上昇する(レーン3)。
また、全長抗TF及び抗VGEF抗体を、培養工程を利用して大規模に生産した。これらの培養に使用される生物は:59A7 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 deoC degP41 kanS ilvG+Δ prc::kanR prc suppressor; 43H1 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 ptr3 degP41 kanS ΔompTΔ(nmpc-fepE) ilvG+ prc:: kanR prc suppressor; 33D3 W3110 ・fhuA (・tonA) ptr3 lac Iq lacL8 ・ompT・(nmpc-fepE) degP41 kanR; and 58H7 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) Δ ptr3 ΔompT ΔdegP lac Iq ΔlacYを含む。
各10リットル培養のために、0.5mLの凍結保存培養物(10−15%のDMSOを含む)を解凍し、0.5mlのテトラサイクリン溶液(5mg/ml)または10mLのアンピシリン溶液(2mg/mL)のいずれかと2.5mlの1Mリン酸ナトリウム溶液とを添加した500mlのLB培地を含む2Lの振盪フラスコに播種するのに用いた。この種培養物を30℃にて振盪しながら約16時間増殖させ、次いで、10リットル培養層に播種するのに用いた。
可溶性画分のサンプルをAME5−RPアッセイによる解析に付した。このアッセイは第1カラムが軽鎖を捕捉する親和性カラムであり、かつ、第2カラムが逆相カラムであるデュアルカラムHPLCアッセイである。デュアルカラム形式には一体ワークステーションが組み込まれていた。溶媒リザーバーは溶媒1A、アフィニティーローディングバッファー;溶媒1B、逆相水性バッファーおよびアフィニティー溶出バッファー、水中の0.1%TFA;溶媒2A、水;溶媒2B,逆相有機溶出バッファー、0.09%TFA/80%アセトニトリルである。第1カラムは制御された孔を含むガラス上に固定化された固定化抗軽鎖(カッパ)Fab抗体(AMES)を含むアフィニティーカラム(30×2.1mm)であった。アフィニティーカラムに関するすべての手順は周囲温度で実施した。第2のカラムはポリマーベースのPOROS R220充填剤を含む逆相カラム(30×2.1mm)であった。逆相カラム温度は60℃に維持した。
次いで、逆相カラムへの接続を解除した後ローディングバッファー(4ml)でアフィニティーカラムの再平衡化を実施した。
ロードした逆相カラムは0.1%TFA水溶液(2ml)で洗浄した。流速は1ml/分に設定し、迅速グラジエント(1分)を35%の溶媒2B(0.1%TFA/80%アセトニトリル)まで、次いで、緩降下グラジエントを14分にわたって50%溶媒2Bまで実施した。溶出は4分にわたる90%溶媒2Bまでのグラジエントで完了する。次いで、1分にわたって逆相カラムを初期状態に戻し、2ml/分で3分間再平衡化した。カラム溶出液は280および214nmでモニターした。定量は積分したピーク面積を既知の濃度の標準のものと比較することで実施した。
大腸菌43H1株においてポリシストロン性プラスミドpaTF20(1−軽、1−重)またはpaTF40(1−軽、3−重)を用いる全長抗TF抗体の産生を個別シストロンベクターpaTF50(1−軽、1−重)を用いるものと比較した。また、培養はpaTF50プラスミドで形質転換した33D3および59A7株で実施した。培養サンプルのAME5−RPアッセイによる解析により表2に示される以下のAME5−RPアッセイピークの5個の力価を得た。
(表2)
抗TFプラスミド 大腸菌宿主 AME5-RP Peak 5 (mg/L)
paTF20 43H1 13
paTF40 43H1 18
paTF50 43H1 134
paTF50 33D3 115
paTF50 59A7 156
培養産物は以下のように精製した:細菌細胞ペーストを20mMリン酸ナトリウムpH7.4、0.14MのNaClで1:5(w/v)希釈し、次いでM110Yマイクロフリューダイザー(microfluidizer)(マイクロフリューディクス・コーポレーション(Microfluidics Corp.),ニュートン、マサチューセッツ)を用いて溶解した。溶解した細胞を含有する溶液を遠心分離して(4300xg、30分)清澄にし細胞細片を除去した。上清にポリエチレンイミン(ビーエーエスエフ・コーポレーション(BASF Corp.), レンセリア、ニューヨーク)を加え最終濃度を0.2%とし、次いで遠心分離した(4300xg、30分)。上清を濾過(0.2um)してタンパク質Aアフィニティー樹脂、プロセップ(Prosep)A(ミリポア社、ベッドフォード、マサチューセッツ)に適用した。0.1M酢酸pH2.9を用いて大腸菌由来IgG1を溶出した。タンパク質Aプールを尿素を加えて調整し最終濃度を2Mとし、pHを5.5に調整し、次いで精製水で希釈してSPセファロースFF(アマシャムファルマシアバイオテク株式会社、ウプサラ、スウェーデン)に適用した。SPセファロースFFカラムを20mMのMES pH5.5で洗浄し、次いで、20mMのMES pH5.5中の0から0.25MまでのNaClの直線グラジエントを用いてIgG1を溶出した。SPセファロースFFグラジエント画分をSDS−PAGEで解析してプールした。SPセファロースFFプールはpH8.0に調整してQセファロースFF(アマシャムファルマシアバイオテク株式会社、ウプサラ、スウェーデン)に適用した。QセファロースFFカラムを25mMのTris pH8.0、50mM NaClで洗浄し、次いで25mM Tris pH8.0、150mM NaClを用いてIgG1を溶出した。QセファロースFFプールは10kDaの再生セルロース膜(ミリポア社、ベッドフォード、マサチューセッツ)を用いる限外濾過、次いで20mM 酢酸ナトリウムpH5.5、0.14M NaClへのダイアフィルトレーションによって作製した。
本発明の大腸菌宿主細胞で産生された全長抗体が所望の特性を有していることをさらに確認するために、培養によって調製し、実施例4の手順にしたがって精製した抗TF抗体産物を質量分析、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アミノ酸解析およびN末端配列決定をはじめとする一連のアッセイによってさらに特性決定した。
MALDI−TOF−MSをディレイドエクストラクションを備えたボイジャー・ディーイー・バイオスペクトロメトリー・ワークステーション(Voyager DE Biospectrometry WorkStation)(ペルセプティブ・バイオシステムズ(Perseptive Biosystems),フレーミングハム、マサチューセッツ)で実施した。窒素レーザーを用いてサンプルに紫外光(337nm)を照射し、240スキャンの平均をとった。この装置は直線配置(1.2mの飛行経路)で操作し、20kVの加速電圧を用いて60ns遅れた後にイオンをフライトチューブの下方に進ませる。サンプル(1.0ul)を1ulのマトリックスと混合しこの混合物の1ulを標的に加えて真空乾燥させた(50×10−3Torr)。タンパク質標準を用いてイオンの質量割当のために2点外部較正を行った。4−ヒドロキシ桂皮酸マトリックスを全長抗TF抗体の解析に用いた。
HP1100装置でベーカー・ボンド・シーエスエックス(Baker Bond CSX)カラム(4.6×250mm)を用いて陽イオン交換クロマトグラフィーを実施した。カラムはバッファーA(25mMの酢酸ナトリウム、pH4.8)を用いて1ml/分の流速で20分間平衡化した。サンプルはバッファーAで約1mg/mlに希釈し、約50ugを注入した。カラム温度は40℃に維持した。直線グラジエントを40分にわたって60%バッファーB(バッファーA+500mM NaCl)まで適用し、5分間60%バッファーBの状態にした。カラム流出液を280nmでモニターした。
HP1100装置でのサイズ排除クロマトグラフィーにはTSK G3000SW−XLカラム(7.8×300mM;トソハス(TosoHaas))を用いた。カラムは250mMの塩化ナトリウムを含有する100mMのリン酸カリウムバッファーpH6.3を用いて0.5ml/分の流速で平衡化した。サンプルは溶出バッファーで1mg/mlに希釈し、約100ugをカラムに注入した。実施時間は30秒とした。ゲル濾過標準のサンプル(バイオ−ラッド(Bio-Rad))も溶出バッファーで5倍希釈した後に注入した。
サンプルを透析によって0.1%酢酸に交換した。83ugを含有するアリコートをアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)477A/120A自動化タンパク質シーケンサーを用いるエドマン分解法によるN末端配列解析用にロードした。外部標準とのピーク高比較を用いてPTHアミノ酸を定量化した。
15ugの脱塩サンプルを含有するアリコートを加水分解アンプル中でサバント・スピードバック(Savant SpeedVac.)において蒸発乾固させた。6NのHCl(ピアス(Pierce))を加えた後、アンプルを減圧下で密閉し、110℃にて24または72時間インキュベートした。さらなるアリコートを1時間前に調製した10%過酸化水素および90%蟻酸を含有する溶液とともに0−5℃にて4時間インキュベートすることによる過蟻酸酸化に付した。次いで、過蟻酸をサバント・スピードバック(Savant SpeedVac)中で蒸発によって除去し、その後サンプルを前記のように6N HCl中での24時間加水分解に付した。Trp決定のために、25ugの各ロットを含有する三つ組のアリコートをアンプル中で乾燥させ、窒素雰囲気下、減圧下で、7%メルカプト酢酸(ベーカー(Baker))/93%6N HCl(ピアス(Pierce))溶液中で110℃にて24時間インキュベートした。加水分解後、すべてのサンプルをサバント・スピードバック(Savant SpeedVac.)中で蒸発乾固させた。
加水分解物を0.2Nのクエン酸ナトリウムバッファー、pH2.2(ベックマン(Beckman))中で再構成し、ポストカラムニンヒドリン検出を行うベックマン(Beckman)6300陽イオン交換装置を用いるアミノ酸解析に付した。440nmおよび570nmでの吸光度の合計を表すシグナルをピーイーネルソン・ターボクロム(PE Nelson Turbochrom)4データシステムによってモニターした。アミノ酸定量は1または2nmolの各成分を含有する外部標準混合物とのピーク面積またはピーク高比較によって達成した。
前記の種々のアッセイから得られた結果から本発明の発現ベクターを用いて大腸菌において産生された全長抗TF抗体はCHO細胞などの真核生物の宿主細胞において産生された抗TF抗体のものと同様の構造特性を共有するということが確認された。
これまでの実施例に従って大腸菌から産生され精製された抗体は全長であり、かつ、非グリコシル化されている。以下の実験は抗体が1)堅固な二価の抗原結合活性を示し;2)C1q結合活性を欠き、そのためにCDC機能が枯渇しており;3)FcγR1結合能を欠き、そのためにADCC機能が枯渇しており;4)クリアランスに対する耐性が改良されているために強力なFcRn結合を示し、そのためによりイン・ビボ(in vivo)での半減期をより長くするということを示すために実施した。
全長抗TF抗体をELISAアッセイを用いて抗原結合について評価した。マキシソープ(MaxiSorp)96ウェルマイクロウェルプレート(ヌンク,ロスキレ,デンマーク)(Nunc, Roskilde, Denmark)を4℃にて50mMの炭酸塩バッファーpH9.6中の1ug/mlの残基1−219を含んでなる可溶性組織因子(TF)(ジェネンテック)で一晩コーティングした。プレートを室温にてPBS、0.5%ウシ血清アルブミン、10ppmのプロクリン300(スペルコ(Supelco)、ベレフォンテ、ペンシルバニア)、pH7.2で1時間ブロッキングした。PBS、0.5%ウシ血清アルブミン、0.05%のポリソルベート20、0.25%のCHAPS、0.2%のウシγグロブリン(シグマ、セントルイス、ミズーリ)、pH7.2(アッセイバッファー)中の抗体の3連続希釈液(0.27−200ng/ml)をプレートに加え、プレートを2時間インキュベートした。結合したIgGはペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトF(ab’)2抗体(ジャクソン・イムノリサーチ、ウェストグローブ(WestGrove)、ペンシルバニア)をアッセイバッファーに加え、プレートを1時間インキュベートし、基質として3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(キルケゴール&ペリー研究所、ゲイサーズバーグ、メリーランド)を加えることで検出した。プレートを工程の間にPBS、0.05%ポリソルベート20、pH7.2で洗浄した。450nmの吸光度をチテレック・スタッカー・リーダー(Titerek stacker reader)(アイシーエヌ(ICN)、コスタメサ、カリフォルニア)で読み取った。滴定曲線は4パラメーター非直線回帰曲線フィッティングプログラム(カレイダグラフ、シナジーソフトウェア、リーディング、ペンシルバニア)を用いてフィッティングした。
TF抗原結合ELISAアッセイの結果が図15に示されている。大腸菌で作製された全長抗TF抗体をCHO細胞で作製された異なるイソ型の抗TF抗体と比較する。大腸菌製IgG1抗体はCHO細胞系で作成された他の抗TF抗体に少なくとも匹敵する抗原結合活性を示す。
ヒトC1qの精製した大腸菌産生抗TF抗体への結合をイヅソギー(Idusogie)ら(2000)、ジャーナル・オブ・イムノロジー164:p.4178−4184に記載されるようにELISA結合アッセイを用いて測定した。便宜には、コスター(Costar)96ウェルプレートを4℃にてコーティングバッファー(0.05M炭酸ナトリウムバッファー)、pH9中の種々の濃度の抗体で一晩コーティングした。次いで、プレートをPBS/0.05%TWEEN20(商標)、pH7.4で3回洗浄し、200ulのチメロサールを含まないELISA希釈液(0.1M NaPO4/0.1M NaCl/0.1%ゼラチン/0.05%TWEEN20(商標)/0.05%プロクリン300)で室温にて1時間ブロッキングした。プレートを洗浄バッファーで3回洗浄し、2ug/mlのC1q(キデル(Quidel)、サンディエゴ、カリフォルニア)の100ulのアリコートを各ウェルに加え、室温で2時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄バッファーで6回洗浄した。100ulのヒツジ抗ヒトC1qペルオキシダーゼ結合抗体(バイオデザイン(Biodesign))の1:1000希釈液を各ウェルに加え、室温にて1時間インキュベートした。このプレートを洗浄バッファーで6回再洗浄し、100ulのOPD(O−フェニレンジアミンジヒドロクロリド(シグマ))を含有する基質バッファー(PBS/0.012%H2O2)を各ウェルに加えた。黄色の外見によって認められる酸化反応を30分間進行させ、100ulの4.5N H2SO4を加えて停止した。次いで、マイクロプレートリーダー(SPECRA MAX250(商標)、モレキュラー・デバイスズ・コーポレーション(Molecular Devices Corporation))を用いて(492−405)nmで吸光度を読み取った。平行して、適当な対照を実施した(すなわち、用いた各濃度の抗体についてC1qを含まずにELISAを実施し、また抗体を含まずにELISAを実施した)。各サンプルについて、C1q結合はug/mlでの濃度に対する吸光度(492−405)nmをプロットし、4パラメーター曲線フィッティングプログラム(カレイダグラフ(商標))を用いてEC50値を比較することで求めた。このアッセイの結果が図16に示されている。CHO細胞により発現された抗体、I−1095−1−リツキシマブを陽性対照として用いた。大腸菌製全長抗TF抗体からは高抗体濃度でさえC1q結合が検出されなかった。
FcγR1の精製した抗TF抗体への結合を以下のELISA結合アッセイを用いて測定した。100ulのPBS中の1ug/mlの受容体−GST融合物を加えることでFcγR1αサブユニット−GST融合物をヌンク(Nunc)F96マキシソーブ(Maxisorb)プレート(カタログ番号439454)上にコーティングし、4℃で48時間インキュベートした。アッセイに先立って、プレートを250ulの洗浄バッファー(0.5%TWEEN20を含有するPBS pH7.4)で3回洗浄し、250ulのアッセイバッファー(50mM Tris緩衝生理食塩水、0.05%のTWEEN20、0.5%のRIA級ウシアルブミン(シグマA7888)および2mMのEDTA pH7.4)でブロッキングした。1mlのアッセイバッファーで10ug/mlに希釈したサンプルをFcγR1αサブユニットコーティングしたプレートに加え、オービタルシェーカー上で25℃にて120分間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで5回洗浄して非結合複合体を除去し、100ulのアッセイバッファー中の1:10,000で特異的なセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗ヒトIgGγ重鎖(ベーリンガー・マンハイム1814249)を加え、25℃にてオービタルシェーカー上で90分間インキュベートすることでIgG結合を検出した。プレートを洗浄バッファーで5回洗浄して非結合HRPヤギ抗ヒトIgGを除去し、100ulの基質溶液(PBS中の0.4mg/mlのo−フェニレンダイミンジヒドロクロリド、シグマP6912、6mMのH2O2)を加えることで結合した抗IgGを検出し、25℃で8分間インキュベートした。酵素反応を100ulの4.5N H2SO4を加えて停止させ、比色産物を96ウェルプレートデンシトメーター(モレキュラー・デバイス)で490nmで測定した。このアッセイの結果が図17に示されている。陽性対照、哺乳類293発現抗体は受容体と結合するが、FcγR1結合は大腸菌産生抗TF抗体については検出されない。
精製した抗TF抗体のFcRnへの結合を以下のELISA結合アッセイを用いて解析した。ELISAプレートを可溶性組織因子でコーティングし、前記のようにブロッキングした。PBS、0.5%ウシ血清アルブミン、0.05%ポリソルベート20、pH6.0(サンプルバッファー)中の抗TF抗体の2連続希釈液(1.6−200ng/ml)をプレートに加え、プレートを室温で2時間インキュベートした。サンプルバッファー中の3.6ug/mlのビオチン標識FcRn(リサーチ・オーガニクス(Research Organics)、クリーブランド、オハイオ製のビオチン−X−NHSを用いて調製した)をプレートに加えた。1時間インキュベートした後、サンプルバッファー中のストレプトアビジン標識したペルオキシダーゼ(アムデックス(Amdex)、コペンハーゲン、デンマーク)を加えることで結合したFcRnを検出し、プレートを1時間インキュベートし、基質として3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(キルケゴール&ペリー研究所)を加えた。プレートを工程の間にPBS、0.5%BSA、0.05%ポリソルベート20、pH6.0で洗浄した。450nmの吸光度をサーモマックス・プレート・リーダー(Thermomax plate reader)(モレキュラー・デバイスズ(Molecular Devices)、メンロパーク、カリフォルニア)で読み取った。滴定曲線を前記のようにフィッティングした。図18は大腸菌製全長抗TF抗体のFcRn結合活性は哺乳類の宿主細胞で作製された他の抗TF抗体(IgG4、IgG4b、IgG2)に匹敵するということを示す。
大腸菌製全長抗TF抗体(IgG1大腸菌)を、対照としてCHO細胞で作製された2種の他の抗TF抗体(IgG2 CHOおよびIgG4b CHO)とともに単回IVボーラス投与チンパンジー薬物動態学(PK)研究に付した。3個体のチンパンジーは抗TF抗体の存在について陰性反応が出た。各動物は0.10mg/kgの抗TF抗体(IgG1大腸菌、IgG2 CHOまたはIgG4 CHO)の単回IVボーラス投与を受けた。血漿サンプルを以下のスケジュールに従って投与後28日まで採取した:投与前30および15分;IVボーラス投与後2、15、30分;1、2、3、4、6、12時間;1、2、4、7、14、21および28日。血漿サンプルを、TFをコーティングとして、抗Fcモノクローナル抗体を検出抗体として用いるELISAによって抗TF抗体(ATF)含量についてアッセイした。チンパンジー血漿における定量化の限界は0.102ug/mlであった。
ELISA結果が図19に血漿ATF濃度対時間曲線の形で示されている。データをウィン・ノンリン(Win Nonlin)3.0のある1コンパートメント排出プロフィールにフィッティングした。クリアランス(CL)、排除半減期(T1/2)および容積(V)のPKパラメーター推定値が表3に記載されている。3個体のチンパンジーでのこの実験をもとに、大腸菌で作製された抗体とCHO細胞で作製されたものの間でPKパラメーター推定値に明らかな相違は認められなかった。
以下の全長抗体:抗VEGF(VNERK)、Presta等,Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)に記載されるヒト化抗体のより高い親和性の変異体;Presta等,J. Immunol. 151:2623-2632 (1993)に記載されるヒト化抗IgE抗体;抗CD40、フランシスコ(Francisco)ら,Cancer Res. 60:3225-3231 (2000)に記載される抗CD40抗体のヒト化型;抗HER−2(4D5および2C4型;Carter等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:4285-4289 (1992)およびFendly等,Cancer Res. 50:1550-1558 (1990));およびヒト化抗CD18(Eigenbrot等,Proteins: Structure, Function, and Genetics 18:49-62 (1994))の発現のための個別シストロンベクターも構築した。
個別シストロンプラスミドの構築のために、paTF50のVLおよびVH領域(TIR1−軽、TIR1−重;実施例1参照)を列記された抗体の各々のVLおよびVHで置換した。実施例3に記載のように33D3株で発現誘導を実施した。サンプルを非還元条件下でのSDS−PAGE分離およびイムノブロットのために回収した。図22に示されるように、全長型の抗体である抗VEGF、抗IgE、抗CD40、4D5、2C4および抗CD18は個別シストロンベクターを用いて大腸菌で上手く発現された。このデータは個別シストロン発現系は大腸菌での抗体発現のための一般的に適用可能なアプローチであるということを示す。
これらの培養に使用された生物は:33D3 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR; 61D6 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41; and 62A7 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 ilvG修復型を含む。
列挙した抗体の培養は、10リットルの規模で行われ、可溶性サンプルを調製し、実施例4に記載されるようなAME5−RPアッセイを施した。主に四量体型(2つのL鎖と2つのH鎖)の全長抗体を含有する最大5のAME5−PRアッセイ力価が、表4に示される。
(表4)
抗体 大腸菌宿主 AME5-RP ピーク5, mg/L
抗TF 61D6 112
抗CD18 61D6 34
抗IgE (E25変異体) 33D3 77
抗VEGF (VNERK変異体) 61D6 53
抗CD40 62A7 45
抗Her2 (4D5変異体) 62A7 55
抗Her2 (2C4変異体) 62A7 73
さらに、本発明の個別シストロン系を用いて、全長抗TF抗体を、抗体の適切な折り畳み及び構築を促進する能力を有する一以上のDsbタンパク質と同時発現させた。
これらの培養に使用された生物は:58H7 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) Δ ptr3 ΔompT ΔdegP lac Iq ΔlacY; 及び61D6 W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41を含む。
抗TFをコードするプラスミドpaTF50またはpxTF2AP22(軽鎖および重鎖の双方のための2つのTIRを含むpaTF50変異体)を用いて前記の生物のコンピテント細胞を形質転換した。dsbC(pJJ141)、dsbA(pJJ142)、またはdsbA/C(pJJ247)のいずれかをコードするプラスミドを抗TFプラスミドpaTF50またはpxTF2AP22と同時形質転換した。
dsbCプラスミドpJJ141を構築するために、カナマイシン耐性プラスミドpACYC177をAatIIおよびHincIIで消化してアンピシリン耐性を破壊した。米国特許第5,639,635号に記載されるtac−dsbCプラスミドpJJ40をClaIで消化し、次いでクレノーおよびデオキシヌクレオチドで埋めた。フェノール:クロロホルム抽出して沈殿させた後、直線化ベクターをAatIIで消化して1.6kb断片をアガロースゲルから精製し、AatII/HincII消化したpACYC177に連結した。最終プラスミドpJJ141はtac−dsbCをコードし、カナマイシン耐性を付与する。同様に、同一のpJJ37由来のAatII/ClaI(ClaI部位は埋めてある)断片と連結したAatII/HincII切断親ベクターを用いてdsbAプラスミドpJJ142を構築したが、これはdsbAをコードし、これもまた米国特許第5,639,635号に記載されている。
tacdsbCf1: CATACTGGTACCAGGATCTAGAGGGAAGATTTATG (配列番号:3)
tacdsbCr2: CTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTG (配列番号:4)
プライマーは制限部位(KpnI、ScaI)を含み、これには下線が引いてある。PCR増幅させた後、断片をアガロースゲル電気泳動で精製して適当な酵素で消化してKpnI/ScaI消化したpJJ142に連結した。得られたプラスミド、pJJ247はdsbAおよびdsbCを、一連の中ではdsbAを最初に発現させるtacプロモーターをコードする。プラスミドをdsbA遺伝子の中央からdsbC遺伝子の3’末端まで配列決定した。
軽鎖と重鎖双方のための1つのTIRを含む抗TFとDsbC(pJJ241)またはDsbA(pJJ237)のいずれかの双方をコードする単一プラスミドを構築してコンピテント宿主細胞を形質転換した場合もある。
抗TFとdsbAとを同時発現するプラスミドpJJ237を構築するために、抗TFプラスミドpATF50をAatIIおよびHpaIで消化し、pJJ223由来のAatII/HpaI切断断片と連結した。この後者の断片はaraC、pBADプロモーター、dsbA、カナマイシン耐性、colE1複製開始点、およびβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む。連結産物は個別phoAプロモーター下に抗TFのLおよびH鎖の双方、dsbAを発現させ、プラスミドにカナマイシンおよびアンピシリン耐性を付与するアラビノース誘導プロモーター(pBAD)を含む。このプラスミドをpJG9と名づけた。pJJ237を作製するために、PCR増幅によってアラビノースレギュロンをtacプロモーターに変更した。このために、以下のプライマーを用いた:
dsbAf11: TGCACGGTTAACATGCTGTGGTGTCATGGTCGG (配列番号:5)
dsbAr12: TTTACCGTTAACAAACATCGCCGGAAC (配列番号:6)
抗TFとdsbCとを同時発現するプラスミドpJJ241を構築するために、pJG9をHpaIおよびNgoMIVで消化した。NgoMIVはNaeIと同一部位で切断する代わりに付着端を残す。DsbCを鋳型としてpJJ141からdsbAと同一の正のプライマー(dsbAf11;配列番号5)および以下の逆のプライマーを用いてPCR増幅した:
dsbCr12: TCAGCTGCCGGCGTCCGATGCGAATTATTTACCG (配列番号:7)
下線を引いた部位はNgoMIV部位である。増幅した断片をゲル精製してNgoMIVとHpaIで消化し、pJG9に連結した。得られたプラスミドは抗TF LおよびH鎖を発現させる個別phoAプロモーターならびにdsbCを発現させるtacプロモーターを含む。
実施例4に記載のように培養を10リットル規模で実施し、OD550が150−200に到達した時点で50mLのイソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)の200mM溶液を培養物に加えた。記載されたものとは異なる回数でIPTGを添加してもよいし、記載されたものとは異なる量のIPTGを添加してもよい。実施例4に記載のように可溶性サンプルを調製してAME5−RPアッセイに付した。種々のプラスミド/宿主株および得られたピーク5の力価が表5に要約されている。
(表5)
抗TFプラスミド 大腸菌宿主 Dsb プラスミド AME5-RP Peak 5 (mg/L)
paTF50 58H7 なし 100
paTF50 61D6 なし 127
paTF50 58H7 pJJ141 174
pJJ241 58H7 pJJ241 212
paTF50 58H7 pJJ142 125
pJJ237 58H7 pJJ237 135
paTF50 61D6 pJJ247 584
pxTF2AP22 61D6 なし 118
pxTF2AP22 58H7 pJJ141 349
pxTF2AP22 58H7 pJJ142 134
pxTF2AP22 61D6 pJJ247 881
また、全長抗TF抗体をFkpA、シャペロン活性を有するペプチジルプロピルcis, trans-イソメラーゼと同時発現させた。
これらの培養に使用された生物は:58H7 (genotype W3110 ΔfhuA (ΔtonA) Δ ptr3 ΔompT ΔdegP lac Iq ΔlacY); 及び59A7 (genotype W3110 ΔfhuA (ΔtonA) phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 deoC degP41 kanS ilvG+Δ prc::kanR prc suppressor)を含む。
tacIIプロモーターの制御下にfkpAをコードする個別プラスミド(pJVG2)を抗TFプラスミドpaTF50と同時形質転換させた。pJVG2を作製するために、プラスミドpJJ222fkpAをNheIおよびNgoMIVで消化してfkpAを含む0.8kb断片を作製した。この断片を電気泳動およびフェノール:クロロホルム抽出および沈殿によって精製した。pACYC177ベクター、pJJ142の類似体上にtac−DsbDを含むプラスミドpJJ239をXbaIおよびNgoMIVで消化して誘導tacプロモーターおよびカナマイシン耐性を含む3.9kbの断片を作製した。この断片を電気泳動およびフェノール:クロロホルム抽出および沈殿によって精製した。これら2種の断片を連結して誘導tacプロモーター、fkpAおよびカナマイシン耐性を含有するpJVG2を作製した。このプラスミドはfkpAをpBR322を基にしたプラスミドと同時発現させるのに使用できる適合性pACYC177プラスミドであるという点でpJJ141およびpJJ142と同様である。
抗組織因子プラスミドpaTF50およびfkpAプラスミドpJVG2を共に用いてコンピテント細胞を形質転換した場合には、形質転換体を50μg/mLのカルベニシリンおよびカナマイシン双方を含有するLBアガープレート上に置いた。単一のプラスミド、pJG9fkpAB3で細胞を形質転換した場合には、50μg/mLのカナマイシンを含有するLBアガープレート上で形質転換体を選抜した。
paTF50で形質転換した59A7宿主を用いる培養はpJG9fkpAB3プラスミドで形質転換した59A7宿主の247mg/Lと比べ約156mg/LのAME5−RPピーク5力価をもたらした。同様に、プラスミドpaTF50で形質転換した58H7宿主を用いる培養は、paTF50とpJVG2で同時形質転換された58H7宿主の180mg/Lと比べ約100mg/LのAME5−RPピーク5力価をもたらした。
前記は特定の実施形態を指したが、本発明はそのように限定されるものではないということは理解されよう。当業者ならば、開示された実施形態に本発明の全体的な考えか逸脱することなく種々の改変をなすことができるということは思い浮かぶであろう。すべてのかかる改変は本発明の範囲内にあると意図される。
Claims (27)
- 免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド分子であって、(1)第1のプロモーター−シストロン対を形成する第1のプロモーターと第1のシストロン及び(2)第2のプロモーター−シストロン対を形成する第2のプロモーターと第2のシストロンを含み、前記第1のプロモーター−シストロン対の第1のシストロンが免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸配列に作用可能に連結した第1の翻訳開始領域(TIR-L)を含み、前記第2のプロモーター−シストロン対の第2のシストロンが免疫グロブリン重鎖をコードする核酸配列に作用可能に連結した第2の翻訳開始領域(TIR-H)を含み、原核宿主細胞の前記ポリヌクレオチドの発現において軽鎖及び重鎖が生物学的に活性な免疫グロブリンを形成するように折り畳まれ構築されたポリヌクレオチド分子。
- 第1及び第2のプロモーターが、phoA、tac、lpp、lac−lpp、lac、ara、trp、trc及びT7プロモーターからなる群から選択される原核生物プロモーターである、請求項1に記載のポリヌクレオチド分子。
- 両プロモーターが、PhoAプロモーターである、請求項2に記載のポリヌクレオチド分子。
- TIR−L及びTIR−Hのそれぞれが原核生物分泌シグナル配列又はそのTIR変異体を含み、ここで該TIR変異体は該分泌シグナル配列の初めの2から14コドン内での配列置換を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド分子。
- 原核生物分泌シグナル配列がSTII、OmpA、PhoE、LamB、MBP及びPhoA分泌シグナル配列からなる群から選択される、請求項4に記載のポリヌクレオチド分子。
- TIR−LとTIR−Hが等しい翻訳強度となる、請求項1のポリヌクレオチド分子。
- 相対翻訳強度の組合せがTIR−L及びTIR−Hに対し、それぞれ1及び1であって、1は13のTIR相対翻訳強度レベルの最小レベルである、請求項6のポリヌクレオチド分子。
- 原核宿主細胞で免疫グロブリンを発現させるための組換えベクターであって、請求項1のポリヌクレオチド分子を含んでなるベクター。
- 請求項8の組換えベクターを含んでなる原核宿主細胞。
- グラム陰性細菌細胞である、請求項9の原核宿主細胞。
- 大腸菌である、請求項10に記載の宿主細胞。
- DsbA、DsbC、DsbG及びFkpAからなる群から選択される少なくとも1つの原核生物ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを更に含む、請求項11に記載の宿主細胞。
- ポリヌクレオチドがDsbA及びDsbCの両方をコードする、請求項12の宿主細胞。
- 大腸菌が内因性プロテアーゼ活性の欠乏した株のものである、請求項11に記載の宿主細胞。
- 大腸菌株の遺伝子型がdegP及びprc遺伝子を欠き、突然変異spr遺伝子をもつ、請求項14に記載の宿主細胞。
- 原核宿主細胞で生物学的に活性な免疫グロブリンを生産する方法であって、宿主細胞内での(1)第1のプロモーター−シストロン対を形成する第1のプロモーターと第1のシストロンと(2)第2のプロモーター−シストロン対を形成する第2のプロモーターと第2のシストロンとを含むポリヌクレオチドの発現であって、前記第1のプロモーター−シストロン対の第1のシストロンが免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸配列に作用可能に連結した第1の翻訳開始領域(TIR-L)を含み、前記第2のプロモーター−シストロン対の第2のシストロンが免疫グロブリン重鎖をコードする核酸配列に作用可能に連結した第2の翻訳開始領域(TIR-H)を含み、前記ポリヌクレオチドの発現において軽鎖及び重鎖が生物学的に活性な免疫グロブリンを形成するように折り畳まれ構築される発現;及び前記免疫グロブリンの回収を含む方法。
- 第1及び第2のプロモーターが、phoA、tac、lpp、lac−lpp、lac、ara、trp、trc及びT7プロモーターからなる群から選択される原核生物プロモーターである、請求項16に記載の方法。
- 両プロモーターが、PhoAプロモーターである、請求項17に記載の方法。
- TIR−L及びTIR−Hのそれぞれが原核生物分泌シグナル配列又はそのTIR変異体を含み、ここで該TIR変異体は分泌シグナル配列の初めの2から14コドン内での配列置換を含む、請求項16に記載の方法。
- 原核生物分泌シグナル配列がSTII、OmpA、PhoE、LamB、MBP及びPhoA分泌シグナル配列からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
- TIR−LとTIR−Hが等しい翻訳強度となる、請求項16の方法。
- 相対翻訳強度の組合せがTIR−L及びTIR−Hに対し、それぞれ1及び1であって、1は13のTIR相対翻訳強度レベルの最小レベルである、請求項21の方法。
- 原核宿主細胞が大腸菌である、請求項16に記載の方法。
- 原核宿主細胞でのDsbA、DsbC、DsbG及びFkpAからなる群から選択される少なくとも1つの原核生物ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を更に含む、請求項16に記載の方法。
- ポリヌクレオチドがDsbA及びDsbCの両方をコードする、請求項24の方法。
- 大腸菌が内因性プロテアーゼ活性の欠乏した株のものである、請求項23に記載の方法。
- 大腸菌株の遺伝子型がdegP及びprc遺伝子を欠き、突然変異spr遺伝子をもつ、請求項26に記載の方法。
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