MXPA06006985A

MXPA06006985A - Fragmentos de anticuerpo monovalente utiles como terapueticos.

Info

Publication number: MXPA06006985A
Application number: MXPA06006985A
Authority: MX
Inventors: Ralph H Schwall
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2003-12-19
Filing date: 2004-12-17
Publication date: 2006-08-31
Also published as: IL211367A; EP1718677A2; CN1922210A; US20080063641A1; BRPI0417107A; CA2548757A1; NZ547438A; US20140205593A1; KR100956913B1; JP2008504007A; EP1718677B1; US20160222115A1; AU2004309347B2; DK1718677T3; CY1112862T1; HK1099027A1; ATE554107T1; IL175885A; JP2011172585A; IL175885A0

Abstract

La invencion proporciona metodos y composiciones que comprenden un nuevo fragmento de anticuerpo monovalente estabilizado.

Description

FRAGMENTOS DE ANTICUERPO MONOVALENTE ÚTILES COMO TERAPÉUTICOS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta aplicación es una aplicación no provisional registrada bajo 37 CFR 1.53 (b) (1), reivindicando el beneficio de prioridad de la aplicación provisional número 60/531,409 registrada el 19 de diciembre de 2003, cuyos contenidos se incorporan aqui, mediante la referencia en su totalidad.

CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere generalmente a los campos de la biología molecular y a la terapéutica con anticuerpos. Más específicamente, la invención se refiere a las nuevas formas de fragmentos de anticuerpo monovalente con características únicas, para su uso como agentes terapéuticos y a los usos de dichos fragmentos de anticuerpo. ANTECEDENTES En los años recientes se han observado promesas crecientes del uso de anticuerpos como agentes de diagnóstico y terapéuticos para varios trastornos y enfermedades. La importancia de los anticuerpos en general, para propósitos de diagnóstico, investigación y terapéutica se refleja en la cantidad significante de esfuerzo que ha sido dedicado a estudiar y modificar las secuencias y las estructuras de los anticuerpos, en relación con las encontradas en los anticuerpos naturales para lograr las características deseadas . El punto de vista prevalenciente es que un anticuerpo terapéutico ideal poseería ciertas características mínimas, que incluyen especificidad del objetivo, bioestabilidad y bidisponibilidad, después de administrarlo a un paciente sujeto y también poseería suficiente afinidad de unión con el objetivo para maximizar los efectos terapéuticos. Desafortunadamente, ha habido poco éxito en los esfuerzos por generar una terapéutica con anticuerpos que posean todo, o incluso la mayoría de estas características mínimas. Por ejemplo, los anticuerpos de larga duración/longitud total tales como IgG muestran una farmacocinética deseable (e.g., vidas medias sustanciales ir¡ vivo) y adecuadas afinidades de unión con el objetivo debido a los efectos de avidez que se derivan de la presencia de dos brazos de unión en el antígeno en una sola molécula de anticuerpo. Sin embargo, tales anticuerpos de larga duración/longitud total sufren problemas de biodisponibilidad como una consecuencia de su mayor tamaño molecular. Además, un anticuerpo de larga duración/longitud total puede, en algunos casos, mostrar efectos agonistas (lo cual es indeseable) después de su unión con un antígeno objetivo aún cuando sea un anticuerpo antagonista como un fragmento Fab. Ver, e.g., Pat. E.ü. No. 6,468,529. Este fenómeno es desafortunado, en donde el efecto antagonista es la función terapéutica deseada. En algunas instancias, este fenómeno puede deberse al efecto de "elazamiento transversal" de un anticuerpo bivalente, que cuando se une a un receptor de la superficie celular promueve la dimerización del receptor que lleva a la activación del receptor. Mientras que no se esperaría que un anticuerpo monovalente tuviera el efecto de "enlazamiento transversal", hasta la fecha los anticuerpos monovalentes no han sido deseables como terapéutica debido a ciertas limitaciones inherentes en su estructura/arquitectura. Por ejemplo, el anticuerpo monovalente en forma Fab posee una farmacodínáraica inferior (e.g., inestable in vivo y con depuración rápida después de su administración) , con respecto al uso como agentes terapéuticos. Además, comparados con sus contrapartes multivalentes, los anticuerpos monovalentes generalmente tienen una afinidad más baja por la unión aparente debido a la ausencia de efectos de unión de avidez. En general, la elección de la forma del anticuerpo para su uso como agente terapéutico ha sido gobernada por una aceptación de la realidad de que cada una tiene limitaciones indeseables. No obstante parece que la forma del anticuerpo de larga duración/longitud total ha sido la forma de elección en años recientes, probablemente debido, por lo menos en parte, a su bioestabilidad in vivo . Es posible que los anticuerpos monovalentes sean aceptables en donde, en contrapeso, la bioestabilidad no sea un factor de eficacia terapéutica tan crítico como la biodisponibilidad. Por ejemplo, debido en parte a una major penetración tisular comparada con los anticuerpos de larga duración/longitud total, los anticuerpos Fab monovalentes pueden ser mejores vehículos para la administración de moléculas heterógenas tales como las toxinas, a las células o tejidos objetivos, en donde la molécula heterógena ejerce una función terapéutica. Ver e.g., Pat. E.U. No. 5,169,939. Otros ejemplos de intentos por desarrollar anticuerpos monovalentes como terapéutica incluyen ambientes en donde la monovalencia es crítica para obtener un efecto terapéutico, e.g., en donde hay procupaciones de que la bivalencia de un anticuerpo pudiera inducir una célula objetivo a pasar por la modulación antigénica, lo cual podría proporcionar, consecuentemente, un medio para que la célula objetivo evitara los agentes citotóxicos, los efectores y el complemento. Ejemplos de tales anticuerpos se describen en Cobbold & Waldmann, Nature (1984), 308:460-462; EP 0 131 424; Glennie & Stevenson, Nature (1982), 295:712-714; Nielsen & Routledge, Blood (2002), 100:4067-4073; Stevenson et al., Anticancer Drug Des. (1989), 3 (4) : 219-230; Routledge et al-, Transplantation (1995), 60:847-853; Clark et al., Eur. J. Immunol. (1989), 19:381-388; Bolt et al., Eur. J. Im unol . (1993), 23:403-411; Routledge et al., Eur. J. Immunol . (1991), 21:2717-2725; Staerz et al., Nature (1985), 314:628-631; y U.S. Pat. No. 5,968,509. Notablemente, estos fragmentos de anticuerpos monovalentes contienen secuencias Fc funcionales, las cuales se incluyen debido a que sus funciones efectoras (tales como la lisis mediada por complemento, de las células T) se necesitan para la función terapéutica. En un escenario distinto al descrito, la técnica no parece haber reconocido una necesidad o utilidad de incluir una región Fc en los anticuerpos monovalentes que se utilizan y/o que se desarrollan como terapéutica. La renuencia a incluir una región Fc en los anticuerpos monovalentes en donde la región Fc no necesariamente está destinada a la función terapéutica, es subrayada por las dificultades prácticas para obtener tales anticuerpos. La tecnología existente de producción de anticuerpos no proporciona un método eficiente para obtener heterodímeros, en cantidades altas y en forma suficientemente purificada, que comprendan un solo componente de unión del antígeno (i.e. monovalencia) y una región Fc . Notablemente, se han hecho algunos esfuerzos para incrementar la estabilidad in vivo de los fragmentos de anticuerpo con grados variables de éxito. Por ejemplo, se puede anexar un fragmento Fab a los grupos de estabilidad tales como el polietilenglicol u otras moléculas de estabilización tales como los péptidos heterógenos . Ver e.g., Dennis et al-, J. Biol.. chem. (2002), 277:35035-35043; PCT Pub. No. O01/45746. En vista de lo anterior, permanece una necesidad significante de (obtener) formas mejoradas de anticuerpos y de métodos para producir y utilizar tales anticuerpos, por ejemplo como agentes terapéuticos o profilácticos. La invención descrita aquí, se aplica a esta necesidad y proporciona otros beneficios. Todas las referencias citadas aquí, incluyendo las solicitudes y publicaciones de patente, se incorporan mediante la referencia en su totalidad. EXPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona una forma de anticuerpo que proporciona varias ventajas con respecto a la utilidad terapéutica, funcionalidad y métodos de producción de ésta. En un aspecto, un anticuerpo de la invención proporciona una característica monovalente que es esencial para cierta respuesta no-inmune basada en esquemas terapéuticos. Por ejemplo, en condiciones patológicas que requieren una función antagonista y en donde la bivalencia de un anticuerpo produce un efecto agonista indeseable, el rasgo monovalente de un anticuerpo de la invención produce y/o asegura una función antagonista después de la unión del anticuerpo con una molécula objetivo. Además, un anticuerpo de la invención se caracteriza por atributos farmacocinéticos superiores (tales como una vida media más prolongada y/o una tasa de depuración reducida in vivo) , comparado con las formas Fab que tienen características de unión del antígeno similares/sustancialmente idénticas, por lo que superan un mayor inconveniente en el uso de anticuerpos Fab monovalentes convencionales. En un aspecto, un anticuerpo de la invención comprende pocas o ninguna función efectora inmune, un rasgo que es particularmente útil en el tratamiento de condiciones patológicas en donde una respuesta efectora inmune es dañina. En otro aspecto, un anticuerpo de la invención se caracteriza por alteraciones que mejoran grandemente el rendimiento de la producción. Además, en comparación con ciertos métodos convencionales para producir fragmentos de anticuerpo monovalente (e.g., digestión enzimática, seguida en ciertas instancias por acoplamientos químicos) , la naturaleza recominante de los métodos de producción de la invención, hace posible obtener poblaciones de anticuerpos que tienen un grado suficientemente alto de homogeneidad y/o pureza útil para el desarrollo y/o comercializaicón como agentes terapéuticos . Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un fragmento de anticuerpo monovalente que comprende un solo brazo de unión de la molécula objetivo y una región Fc (i.e., un complejo de polipéptidos Fc) , en donde el fragmento de anticuerpo monovalente es más estable in vivo que un fragmento de anticuerpo duplicado que carece de dicha región Fc. En un aspecto, la invención proporciona un fragmento de anticuerpo que comprende un solo brazo de unión del antígeno y una región Fc que incrementa la estabilidad del fragmento de anticuerpo (i.e., es más estable, e.g. muestra una vida media in vivo, más prolongada, comparada con una molécula Fab que comprende dicho brazo de unión del antígeno, en donde dicha región Fc comprende un complejo de un primero y un segundo polipéptido Fc, en donde uno, mas no ambos polipéptidos Fc, es una cadena pesada truncada con extremo-N. En una modalidad, una cadena pesada truncada con extremo-N consiste o consiste esencialmente de una secuencia en bisagra unida continuamente a, por lo menos, una porción de un dominio CH2 y/o CH3 de cadena pesada suficiente para formar un complejo con el primer polipéptido Fc y conferir dicho aumento en la estabilidad. En una modalidad, una cadena pesada truncada con extremo-N consiste o consiste esencialmente de una secuencia en bisagra unida contiguamente a un dominios CH2 y/o CH3 de cadena pesada capaz de formar un complejo con el primer polipéptido Fc y conferir dicho incremento en la estabilidad. En una modalidad, la secuencia del extremo N de la cadena pesada truncada con extremo-N es parte o toda una secuencia en bisagra (i.e., la cadena pesada truncada comprende un extremo N que comprende o es parte o toda una secuencia en bisagra) . En una modalidad, la cadena pesada truncada con extremo-N es is de una cadena pesada de IgG. En una modalidad, la región Fc es capaz de unirse a FcRn. En una modalidad, la región Fc no posee una función efectora inmune distinta a la de unión a FcRn. Generalmente y preferentemente, la cadena pesada truncada con extremo-N no se une específicamente a un antígeno. Tal como se describe aquí, un fragmento de anticuerpo de la invención se caracteriza por un aumento en la estabilidad, comparada con su duplicado del fragmento Fab. En algunas modalidades, un fragmento de anticuerpo de la invención muestra por lo menos aproximadamente 2X, por lo menos aproximadamente 5X, por lo menos aproximadamente 10X, por lo menos aproximadamente 25X, por lo menos aproximadamente 50X, por lo menos aproximadamente 100X, por lo menos aproximadamente 200X, por lo menos aproximadamente 300X, por lo menos aproximadamente 350X, por lo menos aproximadamente 400X, por lo menos aproximadamente 450X, por lo menos aproximadamente 500X la vida media in vivo de su duplicado del fragmento Fab . La vida media in vivo se puede medir por cualquiera de una variedad de métodos conocidos en el campo, algunos de los cuales se describen aquí. En una modalidad, la vida media in vivo se mide por la administración a un mamífero apropiado (tal como un ratón) una cantidad de un anticuerpo y la medición de la tasa de disminución en la cantidad de anticuerpo administrado, que haya en el mamífero. Las funciones efectoras inmunes son innecesarias y aún dañinas en ciertos ambientes clínicos . En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención es aglucosilado. Tales anticuerpos no muestran funciones efectora inmunes sustanciales que sean dependientes de la glucosilación de la región Fc. Generalmente y preferentemente, un anticuerpo aglucosilado de la invención no muestra funciones efectoras inmunes sustanciales excepto por la unión con FcRn. En algunas modalidades, un fragmento de anticuerpo de la invención no posee o carece compleamente de funciones efectoras sustanciales distintas a la unión FcRn. En una modalidad, dicha función efectora es lisis complementaria. En una modalidad, dicha función efectora es citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (DAC) . En una modalidad, el fragmento de anticuerpo se une a FcRn. Los anticuerpos aglucosilados se pueden producir por una variedad de métodos conocidos en el campo. Un método conveniente comprende la expresión del anticuerpo en una célula huésped procaiótica tal como E. coli . En una modalidad, un fragmento de anticuerpo de la invención es glucosilada. La glucosilación se puede lograr por medio de métodos conocidos en el campo, e.g., por la producción del anticuerpo en una célula huésped de mamífero como la célula de ovario de hámster chino (CHO) .

En algunas modalidades, un fragmento de anticuerpo de la invención no llega a un componente de la respuesta inmune y, por lo tanto, su mecanismo de acción terapéutica no comprende la regulación y/o el compromiso de una respuesta inmune. E.g., en una modalidad, un fragmento de anticuerpo de la invención tiene de pocas a ninguna propiedad inmunosupresora. Por ejemplo, es probable que dichas propiedades inmunosupresoras comprendan la habilidad para efectuar directa o indirectamente la depleción de células T. En una modalidad, dicho fragmento de anticuerpo no se une específicamente a un antígeno de la superficie de la células/linfocitos T , el cual, en algunas modalidades es CD3 o CD4. En una modalidad, dicho antígeno de la superficie de células/linfocitos T es CD3. Y todavía en otra modalidad, el fragmento de anticuerpo no se une específicamente con un polipéptido de inmunoglublulina, por ejemplo no se une específicamente a las determinantes de la constante, sobre la cadena ? (lambda) de inmunoglubulinas de superficie o a las determinantes idiotípicas sobre las inmunoglobulinas de la superficie. Un fragmento de anticuerpo de la invención es capaz de unirse específicamente a una molécula objetivo de interés. Por ejemplo, en algunas modalidades, un fragmento de anticuerpo se une específicamente a un antígeno tumoral. En algunas modalidades, el fragmento de anticuerpo se une específicamente a un receptor de la superficie celular que se activa después de la multi erización del receptor (e.g., dimerización) . En algunas modalidades, la unión de un anticuerpo de la invención a una molécula objetivo inhibe la unión de otra molécula (tal como un ligando, en donde la molécula objetivo es un receptor) a dicha molécula objetivo. Por lo tanto, en un ejemplo, un fragmento de anticuerpo de la invención cuando está unido a una molécula objetivo inhibe la unión de un compañero de unión análogo, a la molécula objetivo. Un compañero de unión análogo puede ser un ligando o una molécula hetero u homodimerizante . En una modalidad, un fragmento de anticuerpo de la invención cuando está unido a una molécula objetivo inhibe la multimerization de la molécula objetivo. Por ejemplo, en algunas modalidades en la cual un fragmento de anticuerpo de la invención es un antagonista, la unión del fragmento de anticuerpo a un receptor de la superficie celular puede inhibir la dimerización del receptor con otra unidad del receptor, con lo cual se inhibe la activación del receptor (debido por lo menos en parte a una carencia de dimerización del receptor) . Numerosas moléculas del receptor son conocidas en el campo por ser capaces de y/o por requerir la dimerización (ya sea homo- o heterodimerización) para efectuar sus funciones normales. Tales receptores incluyen tirosin cinasas receptoras tales como los receptores del factor de crecimiento de fibroblasto y el receptor del HGF, c-met . Otras interacciones de proteína-proteína incluyen interacciones del receptor-ligando, tales como VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) que se une a flt, flk, etc., y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) que se une a c-met. En una modalidad, un fragmento del anticuerpo de la invención es capaz de competir con el HGF para unirse a c-met. En otra modalidad, un fragmento de anticuerpo de la invención es capaz de competir con el VEGF para unirse con un receptor del VEGF. En un aspecto, la invención proporciona un fragmento de anticuerpo que es un antagonista de un solo brazo (como se describe aquí) , pero es un agonista o tiene actividad agonista de dos brazos (i.e., en donde los dos brazos tienen la misma capacidad de unión del antígeno) . En un aspecto, la invención proporciona un fragmento de anticuerpo que comprende: (i) un primer polipéptido que comprende un dominio variable de cadena ligera (y en algunas modalidades que comprende además un dominio constante de cadena ligera) , (ii) un segundo polipéptido que comprende un dominio variable de cadena pesada, una primera secuencia polipéptidica Fc (y en algunas modalidades comprende además una secuencia de dominio constante de cadena pesada no-Fe) , y (iii) un tercer polipéptido que comprende una segunda secuencia polipeptídica Fc. Generalmente, el Segundo polipéptido es un polipéptido único que comprende un dominio variable de cadena pesada, dominio constante de cadena pesada (e.g., todo o parte de CHl) y el primer polipéptido Fc. Por ejemplo, la primera secuencia polipeptídica Fc generalmente se une con el dominio constante de cadena pesada por una unión peptídica [i.e., no una unión no-peptidil] . En una modalidad, el primer polipéptido comprende un dominio variable de cadena ligera no humana fundida con un dominio constante de cadana ligera humana. En una modalidad, el segundo polipéptido comprende un dominio variable de cadena pesada no-humana. En una modalidad, el tercer polipéptido comprende una cadena pesada truncada con extremo-N que comprende por lo menos una porción de una secuencia en bisagra en su extremo N. En una modalidad, el tercer polipéptido comprende una cadena pesada truncada con extremo-N la cual no comprende una secuencia en bisagra funcional o de tipo natural en su extremo N. En algunas modalidades, los dos polipéptidos Fc de un fragmento de anticuerpo de la invención se unen de forma covalente. Por ejemplo, los dos polipéptidos Fc pueden unirse a través de uniones intermoleculares de disulfuro, por ejemplo a través de uniones intermoleculares de disulfuro entre residuos de cisteina de la región en bisagra. En un aspecto, la invención proporciona una composición que comprende una población de inmunoglobulinas en la cual por lo menos (o por lo menos aproximadamente) el 50%, 75%, 85%, 90%, 95% de las inmunoglobulinas son fragmentos de anticuerpo de la invención. Una composición que comprende dicha población de inmunoglobulinas puede ser, en cualquiera de una variedad de formas, incluyendo, pero no limitadas a usado de células huésped, medio de cultivo celular, pasta de células huésped, o formas semi-purificadas o purificadas de estos. Los métodos de purificación son bien conocidos en el campo, algunos de los cuales se describen aquí . En un aspecto, la invención proporciona un fragmento de anticuerpo que comprende por lo menos una catacterística que promueve la heterodimerización, mientras que minimiza/reduce la homodimerización, de las secuencias Fc dentro del fragmento de anticuerpo. Tal (es) característica (s) mejora la producción y/o la pureza y/u homogeneidad de las poblaciones de inmunoglubulina que se obtienen por medio de los métodos de la invención, como se describen aquí. En una modalidad, un primer polipéptido Fc y un segundo polipéptido Fc cumplen/interactúan en una interfase. En algunas modalidades en donde el primero y segundo polipéptidos Fc se reúnen/se encuentran en una interfase, la interfase del segundo polipéptido Fc (secuencia) comprende una protuberancia que es posicionable en una cavidad en la interfase del primer polipéptido Fc (secuencia) . En una modalidad, el primer polipéptido Fc ha sido alterado a partir de un polipéptido modelo/original para codificar la cavidad o el segundo polipéptido Fc ha sido alterado a partir de un polipéptido modelo/original para codificar la protuberancia, o ambos: en una modalidad, el primer polipéptido Fc ha sido alterado a partir de un polipéptido modelo/original para codificar la cavidad y el segundo polipéptido Fc ha sido alterado a partir de un polipéptido modelo/original para codificar la protuberancia. En una modalidad, la interfase del Segundo polipéptido Fc comprende una protuberancia que es posicionable en una cavidad en la interfase del primer polipéptido Fc, en donde la cavidad o protuberancia, o ambos, han sido introducidos dentro de la interfase del primero y segundo polipéptidos Fc, respectivamente. En algunas modalidades en donde el primero y segundo polipéptidos Fc se encuentran en una interfase, la interfase del primer polipéptido Fc (secuencia) comprende una protuberancia que es posicionable en una cavidad en la interfase del segundo polipéptido Fc (secuencia) . En una modalidad, el segundo polipéptido Fc ha sido alterado a partir de un polipéptido modelo/original para codificar la cavidad o el primer polipéptido Fc ha sido alterado a partir de un polipéptido modelo/original para codificar la protuberancia, o ambos. En una modalidad, el segundo polipéptido Fc ha sido alterado a partir de un polipéptido modelo/original para codificar la cavidad y el primer polipéptido Fc ha sido alterado a partir de un polipéptido modelo/original para codificar la protuberancia. En una modalidad, la interfase del primer polipéptido Fc comprende una protuberancia la cual es posicionable en una cavidad en la interfase del segundo polipéptido Fc, en donde la protuberancia o cavidad, o ambos, han sido introducidos dentro de la interfase del primero y segundo polipéptido Fc, respectivamente . En una modalidad, la protuberancia y la cavidad comprenden cada una un residuo de aminoácido que aparece de manera natural. En una modalidad, el polipéptido Fc que comprende la protuberancia se genera por el remplazo de un residuo original en la interfase de un polipéptido modelo/original con un residuo de importación que tiene un volumen mayor de cadena lateral que el residuo original. En una modalidad, el polipéptido Fc que comprende la protuberancia se genera por un método que comprende una etapa en la que el ácido nucleico que codifica un residuo original de la interfase de dicho polipéptido se remplaza con ácido nucleico que codifica un residuo de importación que tiene un volumen mayor de cadena lateral que el original. En una modalidad, el residuo original es treonina. En una modalidad, el residuo original es T366. En una modalidad, el residuo de importación es arginina (R) . En una modalidad, el residuo de importación es fenilalanina (F) . En una modalidad, el residuo de importación es tirosina (Y) . En una modalidad, el residuo de importación es Triptofano (W) . En una modalidad, el residuo de importación es R, F, Y o W. En una modalidad, una protuberancia se genera por el remplazo de dos o más residuos en un polipéptido modelo/original. En una modalidad, el polipéptido Fc que comprende una protuberancia comprende el remplazo de treonina en la posición 366 con triptófano, numeración de aminoácidos de acuerdo con el esquema de numeración de E.U de Kabat et al. (pp. 688- 696 en Sequences of proteins of immunological interest, (Secuencias de proteínas de interés inmunológico) 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, MD) ) . En algunas modalidades, el polipéptido Fc que comprende una cavidad se genera por el remplazo de un residuo original en la interfase de un polipéptido modelo/original con un residuo de importación que tiene un volumen menor de cadena lateral que el residuo original. Por ejemplo, el polipéptido Fc que comprende la cavidad se puede generar por medio de un método que comprende una etapa en la cual el ácido nucleico que codifica un residuo original, a partir de la interfase de dicho polipéptido, es remplazado con ácido nucleico que condifica un residuo de importación que tiene un volumen menor de cadena lateral que el original. En una modalidad, el residuo original es treonina. En una modalidad, el residuo original es leucina. En una modalidad el residuo original es tirosina. En una modalidad el residuo de importación no es cisteína (C ) . En una modalidad, el residuo de importación es alanina (A) . En una modalidad, el residuo de importación es serina (S) . En una modalidad, el residuo de importación es valina (V) . Se puede generar una cavidad por el remplazo de uno o más residuos originales de un polipéptido modelo/original. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido Fc que comprende una cavidad comprende dos o más residuos de importación seleccionados del grupo que consiste de alanina, serina, treonina y valina. En algunas modalidades, el polipéptido Fc que comprende una cavidad comprende el remplazo de dos o más aminoácidos originales seleccionados del grupo que consiste de treonina, leucina y tirosina y en que dichos aminoácidos originales se remplazan con residuos de importación seleccionados del grupo que consiste de alanina, serina, treonina y valina. En algunas modalidades, un aminoácido original que se remplaza es T366, L368 y/o Y407. En una modalidad, el polipéptido Fc que comprende una cavidad comprende el remplazo de treonina en la posición 366 con serina, la numeración de aminoácidos es de acuerdo con el esquema de numeración de E.U. de Kabat et al. supra . En una modalidad, el polipéptido Fc que comprende una cavidad comprende el remplazo de leucina en la posición 368 con alanina, numeración de aminoácido de acuerdo con el esquema de numeración de EU de Kabat et al. supra . En una modalidad, el polipéptido Fc que comprende una cavidad comprende el remplazo de tirosina en la posición 407 con valina, numeración de aminoácido de acuerdo con el esquema de numeración de E.U. de Kabat et al. supra . En una modalidad el polipéptido Fc que comprende una cavidad comprende dos o más remplazos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste de T366S, L368A and Y407V, numeración de aminoácido de acuerdo con el esquema de numeración de E.U. de Kabat et al. supra . En algunas modalidades de estos fragmentos de anticuerpo, el polipéptido Fc que comprende la protuberancia comprende el remplazo de treonina en la posición 366 con triptófano, numeración de aminoácido de acuerdo con el esquema de numeración de E.U. de Kabat et al. supra . En un aspecto, un fragmento de anticuerpo comprende una región Fc, cuya presencia se requiere para aumentar la estabilidad del fragmento de anticuerpo relacionada con un fragmento Fab que comprende el mismo brazo de unión del antígeno (secuencias) . Dicha región Fc se forma a través de la combinación/multimerización) de secuencias separadas de polipéptido Fc. Dichas secuencias separadas de polipéptido Fc pueden contener o no las mismas secuencias y/o dominios, siempre que sean capaces de dimerizarse para formar una región Fc (como se define aquí) . Un primer polipéptido Fc se une contiguamente, por lo general, a uno o más dominios de una cadena pesada de inmunoglobulina en un polipéptido único, por ejemplo con secuencias de dominio en bisagra, constante y/o variable. En una modalidad, el primer polipéptido Fc comprende por lo menos una porción de una secuencia en bisagra, por lo menos una porción de un dominio CH2 y/o por lo menos una porción de un dominios CH3 • . En una modalidad, el primer polipéptido Fc comprende la secuencia en bisagra y los dominios CH2 y CH3 • de una inmunoglobulina. En una modalidad, el segundo polipéptido Fc (i.e., el polipéptido Fc que es parte de una cadena pesada truncada con extremo-N) comprende por lo menos una porción de una secuencia en bisagra, por lo menos una porción de un dominio CH2 y/o por lo menos una porción de un dominios CH3 • . En una modalidad, el segundo polipéptido Fc comprende la secuencia en bisagra y los dominios CH2 y CH3 de una inmunoglubulina. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo de la invención comprende el primero y segundo polipéptido Fc, cada uno de los cuales comprende por lo menos una porción de por lo menos un dominio constante de anticuerpo. En una modalidad, el dominio constante de anticuerpo es un dominios CH2 y/o CH3. En cualquiera de las modalidades de un fragmento de anticuerpo de la invención que comprende un dominio constante, el dominio constante de anticuerpo puede ser de cualquier clase de inmunoglobulina, por ejemplo una IgG. La fuente de inmunoglobulina puede ser de cualquier especie apropiada original (e.g., un IgG puede ser IgGi humana) o sintética . Un fragmento de anticuerpo de la invención comprende un solo brazo de unión del antígeno. La unión con un antígeno único puede involucrar la unión con uno o más objetivos de unión (e.g., deter inantes/epítopos) . En una modalidad, un anticuerpo de la invención es monoespecífica. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención es una inmunoadhesina, la cual en una modalidad es monoespecífica. Un fragmento de anticuerpo de la invención se puede conjugar con una porción heterógena. Cualquier porción heterógena sería adecuada mientras que su conjugación con el anticuerpo no reduzca sustancialmente una función deseada y/o característica del anticuerpo. Por ejemplo, en algunas modalidades, un inmunoconjugado comprende una porción heterógena que es un agente citotóxico. En algunas modalidades, dicho agente citotóxico es seleccionado del grupo que consiste de un isótopo radioactivo, un agente quimioterapéutico y una toxina. En algunas modalidades, dicha toxina se selecciona del grupo que consiste de calichemicina, maitansina y tricoteno. En algunas modalidades, un inmunoconjugado comprende una porción heterógena que es un marcador detectable. En algunas modalidades , dicho marcador detectable se selecciona del grupo que consiste de un isótopo radioactivo, un miembro de un par ligando-receptor, un miembro de un par enzima-sustrato y un miembro de un par de resonancia por fluorescencia-transferencia de energía. En una variedad de escenarios, es altamente deseable obtener una composición que comprenda una población altamente homogénea de fragmentos de anticuerpos de la invención. Esto se puede lograr por una variedad de métodos conocidos en el campo. Por ejemplo, los polipéptidos que hacen un fragmento de anticuerpo de la invención generalmente se expresan de forma recombinante (en oposición a, e.g., digestión enzimática de inmunoglobulinas de larga duración) . En algunas modalidades, una composición de la invención comprende fragmentos de anticuerpo que son sustancialmente homogéneos con respecto al brazo de unión con extremo-N y/o extremo C de la región Fc. Una composición es "sustancialmente homogénea" si por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% de los fragmentos de anticuerpo de la invención contenidos ahí tienen el mismo residuo de aminoácido en el extremo-N del brazo de unión y/o del extremo C de la región Fc. Dicha composición puede incluir formas no purificadas, semi-purificadas o purificadas de una composición fuente en la cual se generan inicialmente los fragmentos de anticuerpo. En un aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden un fragmento de anticuerpo de la invención y un vehículo, el cual en una modalidad es un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, el fragmento de anticuerpo se conjuga con una porción heterógena . En otro aspecto, la invención proporciona artículos de manufactura que comprenden un contenedor y una composición contenida ahí, en donde la composición comprende un fragmento de anticuerpo de la invención. En algunas modalidades, estos artículos de manufactura también comprenden la instrucción para utilizar dicha composición. En una modalidad, el fragmento de anticuerpo se proporciona en una cantidad terapéuticamente efectiva. En otro aspecto más, la invención proporciona polinucleótidos que codifican un fragmento de anticuerpo de la invención. Los componentes de un fragmento de anticuerpo de la invención se pueden codificar por medio de un solo polinucleótido o polinucléotidos separados (múltiples) . En una modalidad, un polinucleótido único codifica (a) los componentes de la cadena ligera y pesada del brazo de unión del antígeno y (b) el polipéptido de cadena pesada truncada con extremo-N. En una modalidad, un polinucléotido único codifica los componentes de la cadena ligera y pesada del brazo de unión del antígeno y un polinucleótido separado codifica el polipéptido de cadena pesada truncada con extremo-N. En una modalidad, los polinucleótidos separados codifican el componente de la cadena ligera del brazo de unión del antígeno, el componente de la cadena pesada del brazo de unión del antígeno y el polipéptido de cadena pesada truncada con extremo-N, respectivamente. En un aspecto, la invención proporciona vectores recombinants para expresar un anticuerpo de la invención. En un aspecto, la invención proporciona células huésped que comprenden un polinucleótido o un vector recombinante de la invención. En una modalidad, la célula huésped es una célula procariótica, por ejemplo, E. coli . En una modalidad, una célula huésped es una célula eucariótica, por ejemplo una célula de mamífero tal como la célula de ovario de hámster chino (CHO) En un aspecto, la invención proporciona un método para generar un fragmento de anticuerpo de la invención, dicho método comprende la expresión en ácido nucleico de una célula huésped apropiada (e.g., E. coli o CHO) que codifica el fragmento de anticuerpo bajo condiciones que permiten la heteromulti erización que produce la formación del fragmento de anticuerpo. En una modalidad, por lo menos 50%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95% de los polipéptidos de inmunoglobulina generados en el cultivo de células huésped son fragmento de anticuerpo de la invención. En una modalidad, el fragmento de anticuerpo generado por medio de un método de la invención comprende una protuberancia en un polipéptido Fc y una cavidad en otro polipéptido Fc como se describe aquí. En una modalidad, la invención proporciona un método que comprende la expresión de tres polinucleótidos en una célula huésped, en donde un primer polinucléotido codifica un primer componente de un brazo de unión del antígeno (e.g., secuencia (s) CDR de cadena pesada o dominio variable (y en algunos ejemplos, comprenden además una secuencia de dominios constantes de cadena pesada no-Fe) ) y un primer polipéptido Fc, un segundo polinucleótido codifica un segundo componente del brazo de unión del antígeno (e.g., secuencia (s) CDR de cadena ligera o dominio variable (y en algunos, ejemplos, comprenden además un dominio constante de cadena ligera) ) , un tercer polinucleótido codifica una cadena pesada truncada con extremo-N que comprende un segundo polipéptido Fc, en donde un fragmento de anticuerpo de la invención se forma por la heteromultimerización de estos polipéptidos. En una modaliad, el método comprende la introducción de dichos polinucleótidos dentro de una célula huésped adecuada. En una modalidad, el método comprende la recuperación del fragmento de anticuerpo de la invención del cultivo celular, e.g., de los lisados celulares o del medio de cultivo. En un aspecto, la invención proporciona un método que comprende la expresión en ácido nucleico de célula huésped adecuada que codifica los componentes de un fragmento de anticuerpo de la invención, en donde cada cistron que codifica un componente comprende una región de inicio de translado (TIR) unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho componente y en donde la potencia de cada TIR se ajusta para obtener una proporción apropiada de niveles de expresión de los componentes en la cual se genera una cantidad deseada de dicho fragmento de anticuerpo. En una modalidad, las TIRs son de una potencia aproximadamente igual. En una modalidad, la TIR relativa es 1, por ejemplo de acuerdo con Simmons & Yansura, Nature Biotechnol . (1996), 14:629-634 y Simmons et al., J. Immunol . Methods (2002), 263:133-147. En algunas modalidades, la TIR comprende una secuencia de señal de secreción procariótica o variante de esta. En algunas modalidades, la secuencia de señal de secreción procariótica se selecciona del grupo que consiste de secuencias de señal de secreción STII, O pA, PhoE, LamB, MBP and PhoA. Los anticuerpos de la invención encuentran una variedad de uso en una variedad de ambientes. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención es generalmente un anticuerpo terapéutico. Un anticuerpo de la invención puede ejercer su efecto terapéutico por medio de cualquiera de una variedad de mecanismos. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo agonista. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo antagonista. En otro ejemplo aún, un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo bloqueante. En otro ejemplo, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo neutralizante. En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar o demorar la progresión de una enfermedad que comprende la administración a un sujeto que tiene la enfermedad una cantidad efectiva de un fragmento de anticuerpo de la invención efectiva para tratar o demorar la progresión de la enfermedad. En una modalidad, la enfermedad es un tumor o cáncer. En una modalidad, la enfermedad es un trastorno inmunológico, e.g., una enfermedad autoinmune, e.g., artritis réumatoide, púrpura trombocitopénica inmune, lupus eritematoso sistémico, psoriasis, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus dependiente de insulina, etc. En otra modalidad, la enfermedad está asociada con vascularización anormal (tal como angiogénesis) . En otra modalidad aún, la enfermedad está asociada con la desregulación del factor de crecimiento-señal del receptor. En otro ejemplo, dicho factor de crecimiento-señal del receptor está asociado con una tirosina cinasa. En un ejemplo, dicho factor de crecimiento-señal del receptor está asociado con el eje HGF-c-met . Un anticuerpo de la invención es apropiado para tratar o prevenir cualquiera de un número de condiciones patológicas que son el resultado de cualquiera de un número de anormalidades celulares, genéticas y/o bioquímicas. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención es particularmente apropiado para tratar y/o prevenir condiciones patológicas asociadas con anormalidades dentro de la vía HGH-c-met de señalización. En una modalidad, un anticuerpo de la invención es un antagonista c-met. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo híbrido, por ejemplo, un anticuerpo que comprende secuencias de unión del antígeno a partir del injerto de donante no-humano a una secuencia heterógena no-humana, humana o humanizada (e.g., secuencias de sistema y/o de dominio constante) . En una modalidad, el donante no-humano es un ratón. En una modalidad, una secuencia de unión del antígeno es sintética, e.g., obtenida por mutagénesis (e.g., escrutinio de despliegue bacteriófago/phage display screening, etc.). En una modalidad, un anticuerpo híbrido de la invención tiene regiones V de múrido y región C humana. En una modalidad, la región V de cadena ligera de múrido se funde con una cadena ligera kappa de humano. En una modalidad, la región V de la cadena ligera de múrido se funde con una región C de IgGI humana. En una modalidad, las secuencias de unión del antígeno comprenden por lo menos una, por lo menos dos o las tres CDRs de una cadena ligera y/o pesada. En una modalidad, las secuencias de unión del antígeno comprenden una CDR3 de cadena pesada. En una modalidad, las secuencias de unión del antígeno comprenden parte o toda la CDR y/o las secuencias de dominio variable del anticuerpo monoclonal producido por la estirpe celular hibridoma depositada bajo el Número de Consentimiento de la Colección de Cultivo Tipo Americano/ American Type Culture Collection Accession Number ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) o HB-11895 (hibridoma 5D5.11.6). En una modalidad, las secuencias de unión del antígeno comprenden por lo menos CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal producida por la estirpe celular hibridoma 1A3.3.13 o 5D5.11.6. Los anticuerpos humanizados de la invención incluyen los que tienen sustituciones de aminoácido en las variantes FR y de maduración de afinidad con cambios en las CDRs injertadas. Los aminoácidos sustituidos en la CDR o FR no están limitados a los presentes en el anticuerpo donante o receptor. En otras modalidades, los anticuerpos de la invención comprenden además cambios en los residuos de aminoácido en la región Fc que lleva a mejorar la función efectora incluyendo la CDC mejorada y/o la función DAC y la aniquilación de células B. Otros anticuerpos de la invención incluyen los que tienen cambios específicos que mejoran la estabilidad. Los anticuerpos de la invención también incluyen las variantes con deficiencia de fucosa que tienen una función DAC mejorada in vivo. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo de la invención comprende un brazo de unión del antígeno que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, por lo mentos dos o las tres secuencias CDR seleccionadas del grupo que consiste de SYWLH (SEQ ID N0:1), MIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID N0:2) and YGSYVSPLDY (SEQ ID N0:3). En una modalidad, el brazo de unión del antígeno comprende CDR-Hl de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido SYWLH. En una modalidad, el brazo de unión del antígeno comprende la cadena pesada CDR-H2 que tiene la secuencia de aminoácido MIDPSNSDTRFNPNFKD. En una modalidad, el brazo de unión del antígeno comprende CDR-H3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácido YGSYVSPLDY. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo de la invención comprende un brazo de unión del antígeno que comprende una cadena ligera que comprende por lo menos una, por lo menos dos o las tres secuencias CDR seleccionadas del grupo que consiste de KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID NO:4), WASTRES (SEQ ID N0:5) y QQYYAYPWT (SEQ ID NO: 6). En una modalidad, el brazo de unión del antígeno comprende la cadena pesada CDR-Ll que tiene la secuencia de aminoácido KSSQSLLYTSSQKNYLA. En una modalidad, el brazo de unión del antígeno comprende la cadena pesada CDR-L2 que tiene la secuencia de aminoácido WASTRES. En una modalidad, el brazo de unión del antígeno comprende la cadena pesada CDR-L3 que tiene la secuencia de aminoácido QQYYAYPWT. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo de la invención comprende un brazo de unión del antígeno que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos uno, por lo menos dos o las tres secuencias CDR seleccionadas del grupo que consiste de SYWLH (SEQ ID N0:1), MIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO: 2) y YGSYVSPLDY (SEQ ID NO: 3) y una cadena ligera que consiste por lo menos de una, por lo menos de dos o las tres secuencias CDR seleccionadas del grupo que consiste de KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID N0:4), WASTRES (SEQ ID N0:5) y QQYYAYPWT (SEQ ID NO: 6). La invención proporciona un anticuerpo humanizado que se une con c-met humano, o un fragmento del antígeno-binding de este, en donde el anticuerpo es efectivo para inhibir la actividad HGF/C-MET in vivo, el anticuerpo que comprende en la región Variable de la cadena H (VH) por lo menos una secuencia CDR3 del anticuerpo monoclonal producido por la estirpe celular hibridoma depositada bajo el Número de Consentimiento de la Colección de Cultivo Tipo Americano/American Type Culture Collection Accession Number ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) o HB-11895 (hibridoma 5D5.11.6) y sustancialmente una secuencia de consenso humana (e.g., sustancialmente los residuos (FR) del sistema de consenso humano del subrupo III de cadena pesada humana (VHIII) ) . En una modalidad, el anticuerpo también comprende la secuencia CDR1 de cadena H y/o la secuencia CDR2 del anticuerpo monoclonar producido por la estirpe celular hibridoma depositada bajo el Número de Consentimiento de la Colección de Cultivo Tipo Americano /American Type Culture Collection Accession Number ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) o HB-11895 (hibridoma 5D5.11.6). En otra modalidad, el anticuerpo precedente comprende la secuencia CDRl de cadena L, la secuencia CDR2 y/o la secuencia CDR del anticuerpo monoclonal producido por la estirpe celular hibridoma depositada bajo el Número de Consentimiento de la Colección de Cultivo Tipo Americano /American Type Culture Collection Accession Number ATCC HB-11894 (hibridoma 1A3.3.13) o HB-11895 (hibridoma 5D5.11.6) sustancialmente con los residuos (FR) del sistema de consenso humano del subgrupo 1 (V?l) de cadena ligera humana. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo de la invención comprende un brazo de unión del antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia : QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWIGMI DPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCATYGSY VSPLDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 7) En una modalidad, un fragmento de anticuerpo de la invención comprende un brazo de unión del antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia: DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSPK LLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAYPW TFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 8) En un aspecto, la invención proporciona el uso de un fragmento de anticuerpo de la invención (e.g., un anticuerpo antagonista c-met de la invención) en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como el autoinmune) y/o un trastorno relacionado con angiogénesis. En un aspecto, la invención proporciona el uso de un ácido nucleico de la invención (e.g., un ácido nucleico que codifica un fragmento de anticuerpo antagonista c-met de la invención) en -la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como el autoinmune) y/o un trastorno relacionado con angiogénesis . En un aspecto, la invención proporciona el uso de un vector de expresión de la invención (e.g., un vector que codifica un fragmento del anticuerpo antagonista c-met de la invención) en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad, tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como el autoinmne) y/o un trastorno relacionado con angiogénesis. En un aspecto la invención proporciona el uso de una célula huésped de la invención (e.g., una célula huésped que comprende un vector que codifica un fragmento de anticuerpo antagonista c-met de la invención) en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como el autoinmune) y/o un trastorno relacionado con angiogénesis. En un aspecto, la invención proporciona el uso de un artículo de manufactura de la invención (e.g., un artículo de manufactura que comprende un fragmento del anticuerpo antagonista c-met de la invención y/o un ácido nucleico que codifica un fragmento del anticuerpo antagonista c-met de la invención) en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como el autoinmune) y/o un trastorno relacionado con angiogénesis . En un aspecto, la invención proporicona el uso de un equipo de la invención (e.g., un equipo que comprende un fragmento del anticuerpo antagonista c-met de la invención y/o un ácido nucleico que codifica un fragmento del anticuerpo antagonista c-met de la invención) en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de una enfermedad tal como un cáncer, un tumor, un trastorno de proliferación celular, un trastorno inmune (tal como el autoinmune) y/o un trastorno relacionado con angiogénesis. En un aspecto, la invención proporicona un método para inhibir la proliferación celular activada por c-met, dicho método comprende contactar un célula o tejido con una cantidad efectiva de un fragmento de anticuerpo antagonista c-met de la invención, en donde la proliferación celular asociada con la activación de c-met se inhibe. En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar una condición patológica asociada con la desregulación de la activación de c-met en un sujeto, dicho método comprende la administración al sujeto de una cantidad efectiva de fragmento de anticuerpo antagonista c-met de la invención, en la cual se trata dicha condición. En un aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa c-met o el factor de crecimiento de hepatocito, o ambos, dicho método comprende el contactar dicha célula con un fragmento del anticuerpo antagonista c-met de la invención, causando con eso una inhibición del crecimiento de dicha célula. En una modalidad, la célula es contactada por medio del HGF expresado por una célula diferente (e.g., a través de un efecto paracrino) . En un aspecto, la invención proporciona un método para tartar terapéuticamente a un mamífero que tiene un tumor canceroso que comprende una célula que expresa c-met o el factor de crecimiento de hepatocito, o ambos, dicho método comprende la administración a dicho mamífero de una cantidad efectiva de fragmento de anticuerpo antagonista c-met de la invención, con la cual se trató efectivamente a dicho mamífero. En una modalidad, la célula es contactada por el HGF expresado por una célula diferente (e.g., a través de un efecto paracrino) . En un aspecto, la invención proporciona un método para tartar o prevenir un trastorno de proliferación celular asociado con el incremento en la expresión o actividad de c-met o del crecimiento de hepatocito, o ambos, dicho método comprende la administración a un sujeto que necesite dicho tratamiento, una cantidad efectiva de un fragmento de anticuerpo antagonista c-met de la invención, con la cual se trata efectivamente o se previene dicho trastorno de proliferación celular. En una modalidad, dicho trastorno de proliferación es el cáncer. En un aspecto, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de una célula, con la cual el crecimiento de dicha célula es, por lo menos en parte, dependiente de un efecto potenciador del crecimiento de c-met o del factor de crecimiento hepatocito, o ambos, dicho método comprende el contactar dicha célula con una cantidad efectiva de un fragmento de anticuerpo antagonista c-met de la invención, inhibiendo con eso el crecimiento de dicha célula. En una modalidad, la célula es contactada por el HGF expresado por una célula diferente (e.g., a través de un efecto paracrino) . En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero, en donde el crecimiento de dicho tumor es, por lo menos en parte, dependiente de un efecto potenciador del crecimiento de c-met o del factor de crecimiento de hepatocito, o ambos, dicho método comprende el contactar dicha célula con una cantidad efectiva de un fragmento de anticuerpo antagonista c-met de la invención, con el cual se trata efectivamente dicho tumor. En una modalidad, la célula es contactada por medio del HGF expresado por una célula diferente (e.g., a través de un efecto paracrino) . Los métodos de la invención se pueden utilizar para afectar cualquier estado patológico adecuado, por ejemplo, células y/o tejidos asociados con la desregulación de la vía de señalización HGF/c-met. En una modalidad, una célula que se considera como objetivo en un método de la invención es una célula cancerosa. Por ejemplo, una célula cancerosa puede ser una seleccionada del grupo que consiste de célula de cáncer de mama, una célula de cáncer colorectal, una célula de cáncer pulmonar, una célula de carcinoma papilar (e.g., de la glándula tiroides), una célula de cáncer de colon, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer de ovario, célula de cáncer cervical, célula de cáncer del sistema nervioso central, una célula de sarcoma osteogénico, una célula de carcinoma renal, una célula de carcinoma hepatocelular, una célula de cáncer de vejiga, una célula de carcinoma gástrico, una célula de carcinoma escamoso de cabeza y cuello, una célula de melanoma, una célula de linforma, una célula de mieloma (e.g., mieloma múltiple), una célula de glioma/glioblastoma (e.g., astrocitoma anaplásico, glioblastoma multiforme, oligodendroglioma anaplásico, oligodendroastrocitoma anaplásico) o una célula de leucemia. En una modalidad, una célula que se origina en un métdodo de la invención es una célula hiperproliferativa y/o hiperplásica. En una modalidad, una célula que es alcanzada en un método de la invención es una célula displásica. En otra modalidad aún, una célula que es alcanzada en un método de la invención es una célula metastásica Los métodos de la invención pueden comprender además las etapas adicionales de tratamiento. Por ejemplo, en una modalidad, un método además comprende una etapa en donde la célula objetivo y/o el tejido (e.g., una célula cancerosa) se expone al tratamiento con radiación o un agente quimioterapéutico . La activación de c-met es un importante proceso biológico cuya desregulación lleva a numerosas condiciones patológicas. Consecuentemente, en una modalidad de métodos de la invención, una célula que es alcanzada ( e.g., una célula cancerosa) es una en la que la activación de c-met es aumentada en comparación con una célula normal del mismo origen tisular. En una modalidad, un método de la invención causa la muerte de una célula alcanzada. Por ejemplo, el contacto con un fragmento de anticuerpo antagonista de la invención puede ocasionar la incapacidad de una célula para enviar la señal a través de la vía c-met, lo cual ocasiona la muerte de la célula. La desregulación de la activación de c-met (y por lo tanto la señalización) puede ser el resultado de un número de cambios celulares, incluyendo, por ejemplo, la sobreexpresión del HGF (ligando análogo de c-met) y/o c-met misma. Consecuentemente, en algunas modalidades, un método de la invención comprende alcanzar una célula en donde c-met o el factor de crecimiento de hepatocito, o ambos, se expresa más abundamentemente por dicha célula (e.g., una célula cancerosa) en comparación con una célula normal del mismo origen tisular. Una célula que expresa c-met puede regularse por medio del HGF a partir* de una variedad de fuentes, i.e., de modo autocrino o paracrino. Por ejemplo, en una modalidad de métodos de la invención una célula alcanzada es contactada/enlazada por medio del factor de crecimiento de hepatocito expresado en una célula diferente (e.g., vía un efecto paracrino) . Dicha célula diferente puede tener el mismo o distinto origen tisular. En una modalidad, una célula alcanzada es contactada/enlazada por medio del HGF expresado por la célula alcanzada misma (e.g., vía un efecto/anillo autocrino) . En una modalidad, la actividad c-met (o activación) en una célula alcanzada es dependiente del ligando. En una modalidad, la actividad c-met (o activación) es independiente del ligando.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIGURA 1 muestra los resultados del Western blot anti-Fab de la expresión del anticuerpo (anticuerpo de un brazo) c/anti-c-met Fab. La FIGURA 2 muestra los resultados del análisis Western blot anti-Fc de la expresión del anticuerpo (anticuerpo de un brazo) c/anti-c-met Fab. La FIGURA 3 muestra los resultados del análisis Western blot anti-Fab de la expresión del anticuerpo (anticuerpo de un brazo) c/anti-c-met Fab que comprende una protuberancia y una cavidad en la regón Fc. La FIGURA 4 muestra los resultados del análisis Western blot anti-Fc de la expresión del anticuerpo (anticuerpo de un brazo) c/anti-c-met Fab. que comprende una protuberancia y una cavidad en la región Fc. La FIGURA 5 muestra los resultados de un ensayo de unión competitiva en donde un anticuerpo de un brazo anti-c-met bloqueó la unión del HGF a c-met. La FIGURA 6 muestra los resultados de un ensayo KIRA en células U87 tratados con o sin HGF y/o anticuerpo de un brazo 5D5 anti-c-met. La FIGURA 7 muestra la proliferación celular de células BaF3-hMet en la presencia de cantidades variables de anticuerpo 5D5 anti-c-met. La FIGURA 8 muestra un ensayo de migración celular en donde el anticuerpo de un brazo anti-c-met bloqueó la función del HGF. Las FIGURAS 9A-B muestran los resultados del análisis farmacocinético del anticuerpo anti-c-met de un brazo. Las FIGURAS 10A-B muestran los resultado del tratamiento de tumores con anticuerpo anti-c-met de un brazo. En la Figura 10B, "OA" indica que es de un solo brazo.

MODOS DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN La invención proporciona métodos, composiciones, equipos y artículos de manufactura para usar fragmentos de anticuerpo monovalente que tiene características únicas que las interpreta como particularmente ventajosas para usar en el tratamiento de ciertas condiciones patológicas. Además, los fragmentos de anticuerpo se pueden preparar fácilmente con producciones pragmáticas y pureza deseable. Los fragmentos de anticuerpo de la invención se caracterizan por capacidades fisicoquímicas y/o terapéuticas en comparación con anticuerpos monovalentes existentes. En general, los fragmentos de anticuerpo monovalente de la invención comprenden un solo brazo de unión del antígeno y una región Fc, en donde el fragmento de anticuerpo muestra mayor estabilidad in vivo en comparación con un fragmento de anticuerpo Fab que comprende dicho brazo de unión del antígeno, pero carece de dicha región Fc. En algunas modalidades, un fragmento de anticuerpo de la invención comprende una alteración en uno o más residuos de cada una de las secuencias Fc que forman la multimerización de la inferíase entre los polipéptidos Fc que forman la región Fc. La invención proporciona métodos para hacer y utilizar fragmentos de anticuerpo de la invención. La invención hace possible la producción eficiente y comercialmente viable de los fragmentos nuevos de anticuerpo de la invención. Los fragmentos de anticuerpo se pueden utilizar para tratar condiciones patológicas en las cuales el uso de un anticuerpo terapéutico que es monovalente en naturaleza y altamente estable es altamente deseable y/o requerido. Los detalles de los métodos, composiciones, equipos y artículos de manufactura de la invención se proporcionan aquí .

Técnicas Generales La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra forma, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes) microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, los cuales están dentro de las habilidades de la materia. Dichas técnicas se explican en su totalidad en la literatura, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" ("Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio"), segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Síntesis Oligonuleótida) (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (Cultivo Celular Animal) (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Métodos en Enzimología) (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (Protocolos Actuales en Biología Molecular) (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, y actualizaciones periódicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction" (RCP: La Reacción en Cadena de la Polimerasa), (Mullís et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Una Guía Práctica para la Clonación Molecular) (Perbal Bernard V., 1988). Definiciones El término "vector, " como se utiliza aquí, tiene el propósito de referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", el cual se refiere a un anillo circular de ADN con doble ramal dentro del cual se ligaron segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector fago/bacteriófago. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos adicionales de ADN pueden ser ligados dentro del genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped dentro del cual se introducen (e.g., vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (e.g., vectores no-episomales de mamífero) se pueden integrar dentro del genoma de una célula huésped después de la introducción dentro de la célula huésped y con lo cual se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se enlazan operativamente. Tales vectores se denominan aquí como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores recombinantes") . En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante tienen, frecuentemente, forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" se pueden utilizar de forma intercambiable ya que el plásmido es la forma de vector utilizada más comúnmente. "Polinucleótido" o "ácido nucleico", como se utiliza de forma intercambiable aquí, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier duración/longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos modificados o bases, y/o sus análogos, o algún sustrato que se pueda incorporar dentro de un polímero por medio de reacción de la polimerasa de ADN o ARN o por una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación a la estructura del nucléotido puede ser impartir antes o después del conjunto del polímero. La secuencia de los nucleótidos se puede interrumpir por medio de componentes no-nucleótido. Un polinucleótido se puede modificar también después de la síntesis, tal como por la conjugación con un marcador. Otros tipos de modificación incluyen, por ejemplo, "corona", sustitución de uno o más de los nucleótidos de generación natural con un análogo, modificaciones dentro del nucleótido tales como, por ejemplo, los que tienen enlaces sin cargar (e.g., metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces charged 8e.g., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), de los que contienen grupos pendientes, tales como, por ejemplo, proteínas (e.g., nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de aviso/señal, ply-L-lisina, etc.), los que tienen intercaladores (e.g., acridina, psoralen, etc.), los que contienen quelantes (e.g., metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), los que contienen alquilantes, los que tienen enlaces modificados (e.g., ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido (s) . Además, cualquiera de los grupos hidroxilo presentes ordinariamente en los sacáridos, se pueden remplazar, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándar, o activados para preparar enlaces adicionales con nucleótidos adicionales, o pueden ser conjugados con soportes semi-sólidos . El OH con extremo 5 y 3' puede fosforilarse o sustiuirse con aminas o regiones de grupo orgánico de coronamiento desde 1 hasta 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también se pueden derivarse/derivatizarse a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogoas de ribosa o sacáridos desoxyrribosa que son conocidas generalmente en el campo, incluyendo, por ejemplo, 2' -O-metil-, 2' -O' alilo, 2 ' -fluoro- o 2 ' -azido-ribosa, análogos de sacárido carbocíclico, sacáridos . alfa.-anoméricos, sacáridos epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, sacáridos puranosa, sacáridos furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos nucleósidos abásicos tales como metil ribosida. Uno o más enlaces fosfodiéster se pueden remplazar por grupos alternativos de unión. Estos grupos alternativos de unión incluyen, pero no están limitados a, modalidades en donde el fosfato se remplaza por P(0)S("tioato") , P (S) S ("ditioato") , " (O) NR. sub.2 ("amidato") , P(0)R, P(0)OR', CO o CH.sub.2 ( "formacetal" ) , en los cuales cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o no-sustituído (1-20 C.) opcionalmente, conteniendo un enlace (-0) de éter, arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o aradilo. En un polinucleótido no todos los enlaces tienen que ser idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos a los que se refieren en la presente, incluyendo ARN y ADN. "Oligonucleótido, " como se utiliza aquí, generalmente se refiere a polinucleótidos cortos, generalmente de un solo ramal, generalmente sintéticos, que generalmente tienen, pero no necesariamente, menos de aproximadamente 200 nucleótidos a lo largo. Los extremos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no se excluyen mutuamente. La descripción anterior de polinucleótidos es igualmente y completamente aplicable a los oligonucleótidos. El término "factor de crecimiento de hepatocito" o "HGF", como se utiliza en la presente, se refiere, a menos que se indique específicamente o contextualmente lo contrario, a cualquier polipéptido del HGF natural o variante (ya sea de generación natural o sintética) que sea capaz de activar la vía de señalización del HGF/c-met bajo condiciones que permitan que ocurra/se presente tal proceso. El término "HGF de tipo natural" generalmente se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido de una proteína del HGF de generación natural . Los extremos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se utilizan de forma intercambiable en el sentido más amplio e incluyen a los anticuerpos monoclonales (e.g., anticuerpos monoclonales de larga duración/longitud total o intactos) , anticuerpos policlonales, anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecífieos (e.g., anticuerpos biespecíficos, mientras que muestren la actividad biológica deseada) y fragmentos de anticuerpos como se describen aquí. Un anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o madurado por afinidad. "Fragmentos de anticuerpo" comprenden únicamente una porción de un anticuerpo intacto, en donde la porción retiene preferentemente por lo menos uno, preferentemente la mayoría o todas las funciones asociadas normalmente con esa porción cuando está presente en un anticuerpo intacto. La frase "brazo de unión del antígeno", como se utiliza aquí, se refiere a una parte componente de un fragmento de anticuerpo de la invención que tiene una habilidad para unirse a una molécula objetivo de interés. Generalmente y preferentemente, el brazo de unión del antígeno es un complejo de secuencias polipéptidas de inmunoglobulina, e.g., CDR y/o secuencias de dominio variable de una cadena ligera y pesada de inmunoglobulina. La frase "cadena truncada con extremo-N", como se utiliza aquí, se refiere a un polipéptido que comprende partes, pero no todas, de una cadena pesada de inmunoglobulina de larga duración/longitud total, en donde las partes faltantes son las que se localizan normalmente en la región del extremo-N de la cadena pesada. Las partes faltantes pueden incluir, pero no están limitadas a, el dominio variable, CHl y parte o toda la secuencia en bisagra. Generalmente, si la secuencia en bisagra de tipo natural no está presente, el dominio (s) constante remanente en la cadena pesada truncada con extremo-N comprendería un componente que tiene capacidad de enlace con otra secuencia Fc (i.e., el "primer" polipéptido Fc, como se describe aquí) . Por ejemplo, dicho componente puede ser un residuo modificado o un residuo cisteína adicionado capaz de formar un enlace disulfuro. El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, i.e., los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se ocurren naturalmente que pudieran presentarse en antidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un solo antígeno. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinante único en el antígeno. Los anticuerpos monoclonales de la presente, incluyen específicamente anticuerpos "híbridos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homologa a secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o sub-clase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la cadena (s) es idéntica a u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o sub-clase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, mientras muestren la actividad biológica deseada (Patente E.U. No. 4,816,567; y Morrison et al . , Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 81:6851-6855 (1984)). Las formas "Humanizadas" de anticuerpos no-humanos (e.g., de múrido) son anticuerpos híbridos que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no-humana.

En la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales residuos de una región hipervariable del receptor se remplazan con residuos de una región hipervariable de una especie no-humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, rata, conejo o primate no-humano que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunas instancias, los residuos de la región del sistema (FR) de la inmunoglobulina humana se remplazan por residuos no-humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en los anticuerpos del receptor o en los anticuerpos del donante. Estas modificaciones se hacen para refinar aún más el desempeño de los anticuerpos . En general, los anticuerpos humanizados comprenderán sustancialmente todos de por lo menos uno y típicamente dos dominios variables, en los cuales todos todos o sustancialmente todos los anillos hipervariables corresponden a una inmunoglobulina no-humana y todos o sustancialmente todas los FRs son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , típicamente el de una inmunoglobulina humana. Para mayores detalles, ver Jones et al . , Nature 321:522-525 (1986); Riec mann et al . , Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992) . Ver también, los siguientes artículos de revisión y referencias citadas ahí: Vas ani y Hamilton, Ann . Allergy, Asthma & Immunol . 1:105-115 (1998); Harris, Biochem . Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op . Biotech . 5:428-433 (1994). Un "anticuerpo humano" es el que posee una secuencia de aminoácido que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o que ha sido hecho utilizando cualquiera de las técnicas para elaborar anticuerpos humanos como se expone aquí. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión del antígeno no-humano.

Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más CDRs de este, lo cual ocasiona una mejoría en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, comparado con un anticuerpo original el cual no posee esas alteraciones. Los anticuerpos preferidos madurados por afinidad tendrán afinidades nanomolares o hasta picomolares por el antígeno objetivo. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen por procedimientos conocidos en el campo. Marks et al Bio /Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad por medio de la mezcla del dominio VH y VL . La mutagénesis casual de CDR y/o los residuos del sistema ha sido descrita por: Barbas et al . Proc Nat . Acad. Sci , USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al . Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al . J. Immunol . 155:1994-2004 (1995); Jackson et al . , J. Immunol . 154 (7) : 3310-9 (1995); y Ha kins et al , J. Mol . Biol . 226:889-896 (1992). Como se utiliza aquí, el término "inmunoadhesina" disigna moléculas semejantes al anticuerpo que combinan el "dominio de unión" de una proteína heteróloga (una "adhesina", (e.g. un receptor, ligando o enzima) con el componente efector de dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de la secuencia de aminoácido de adhesina con la especificidad deseada de unión la cual es distinta del sitio de reconocimiento del antígeno y del sitio de unión (sitio de combinación del antígeno) de un anticuerpo (i.e., es "heterólogo" y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. El dominios constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina se puede obtener de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgGi, IgG2, IgG3, o IgG4, o IgA, IgE, IgD or IgM. Un "heteromultímero" "complejo heteromultimérico" o polipéptido heteromultimérico" es una molécula que comprende por lo menos un polipéptido y un segundo polipéptido en donde el segundo polipéptido difiere en la secuencia de aminoácido del primer polipéptido en por lo menos un residuo de aminoácido. El heteromultímero puede comprender un "heterodímero" formado por el primer y segundo polipéptido o puede formar estructuras más altas de orden terciario en donde están presentes los polipéptidos además del primero y segundo polipéptido. Como se utiliza aquí, "polipéptido" se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente diez aminoácidos . La frase "propiedades inmunosupresoras", o variantes de este, como se utilizan aquí, se refiere a propiedades de un anticuerpo que directa o indirectamente producen la inhibición de una o más actividades normales y/o funciones que incluyen el sistema inmune, incluyendo, pero no limitándose a la inmunidad humoral y la mediada por células.

El término "región Fc", como se utiliza aquí, generalmente se refiere a un complejo dímero que comprende las secuencias de polipéptidos con extremo-C de una cadena pesada de inmunoglobulina, en donde una secuencia de polipéptido con extremo-C es la que se obtiene por la digesión de papaína de un anticuerpo intacto. La región Fc puede comprender secuencias Fc nativas/naturales o variantes. Aunque los límites de la secuencia Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina podría variar, la secuencia Fc de cadena pesada de IgG humana se define usualmente para extenderse desde un residuo aminoácido en aproximadamente la posición cys226 o desde aproximadamente la posición Pro230, hasta el término carboxilo de la secuencia Fc. La secuencia Fc de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente comprende un dominio CH4. Por "polipéptido Fc" aquí se significa uno de los polipéptidos que forman una región Fc. Un polipéptido Fc se puede obtener de cualquier inmunoglobulina adecuada, tal como los subtipos IgGi, IgG2, IgG3, o IgG4, o IgA, IgE, IgD o IgM. En algunas modalidades, un polipéptido Fc comprende parte o toda la secuencia en bisagra tipo natural (generalmente, en su extremo-N) . En algunas modalidades, un polipéptido Fc no comprende una secuencia en bisagra funcional o de tipo natural. "citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos" Y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan los receptores Fc (FcRs) (e.g. linfocitos citolíticos naturales/células agresoras naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula objetivo y subsecuentemente causan la lisis de la célula objetivo. Los extremos "receptor Fc" y "FcR" se utilizan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. Por ejemplo, un FcR puede ser un FcR humano de secuencia nativa. Generalmente, un FcR es uno que une un anticuerpo IgG (un receptor gama) e incluye receptores de las sub-clases Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII, incluyendo variantes alélicas y, alternativamente, formas empalmadas de estos receptores. Los receptores Fc(RII incluyen Fc(RIIA (un "receptor activante") y Fc(RIIB (un "receptor inhibidor"), los cuales tienen secuencias similares de aminoácido que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de este. Las inmunoglobulinas de otros isotipos también se pueden unir por ciertas FcRs (ver, e.g., Janeway et al., Immuno Biology: the immune system in health and disease (Elsevier Science Ltd., NY) (4a ed., 1999)). El receptor de activación Fc (RIIA contiene un residuo de activación en base al inmunoreceptor de tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición Fc (RIIB contiene un residuo de inhibición en base al inmunoreceptor de tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico (revisar en Daéron, Annu . Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)). FcRs se revisan en Ravetech y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al . , Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab . Clin . Med. 126:330-41 (1995). Otros FcRs, incluyendo aquellos a identificarse en el futuro, se abarcan por el término "FcR" en la presente. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn que es responsable para la transferencia de IgGs maternos para el feto (Guyer et al., J. Im unol . 117:587 (1976); y Kim et al., J. Immunol, 24:249 (1994) ) . La "región de articulación", "secuencia de articulación" y variaciones de las mismas, como se utiliza en la presente, incluyendo los significados conocidos en. la materia, que se ilustran en por ejemplo, Janeway et al., Immuno Biology: the immune system in hetalh and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4a ed., 1999); Bloon et al., Protein Science (1997), 6: 407-415; Humppherys et al., J. Immunol , Methods (1997), 209:193-202. El término "cistrón" como se utiliza en la presente, se intenta a referirse a un elemento genético ampliamente equivalente a una unidad de traslación que comprende la secuencia de nucleótido que codifica para una cadena de polipéptido y regiones de control adyacentes. Las "regiones de controlo adyacentes" incluyen por ejemplo, una región de iniciación de translación (TIR; como se define en la presente abajo) y una región de terminación. La "región de iniciación de traslación" o TIR, como se utiliza en la presente se refiere a una región de ácido nucleico que proporciona la eficiencia de la iniciación de traslación de un gen de interés. En general, una TIR dentro de un cistrón particular abarca el sitio de unión de ribosoma (RBS) y las secuencias 5' y 3' para RBS. El RBS se define que contiene mínimamente, la región Shine-Dalgarno y el codón de inicio (AUG) . De acuerdo con esto, una TIR también incluye al menos una porción de la secuencia de ácido nucleico para ser trasladado. En algunas modalidades, una TIR de la invención incluye una secuencia de señal de secreción que codifica un péptido de señal que precede la secuencia que codifica para la cadena ligera o pesada dentro de un cistrón. Una variante de TIR que contiene variantes de secuencia (particularmente sustituciones) dentro de la región TIR que alteran la propiedad de la TIR, tal como su resistencia de traslación como se define abajo en la presente. Preferentemente, una variante de TIR de la invención contiene sustituciones de secuencia dentro del primer 2 hasta aproximadamente 14, preferentemente aproximadamente 4 hasta 12, más preferentemente aproximadamente 6 codones de la secuencia de señal de secreción que preceden la secuencia que codifica para la cadena ligera o pesada dentro de un cistrón. El término "resistencia de traslación" como se utiliza en la presente se refiere a una medición de un polipéptido secretado en un sistema de control en donde una o más variantes de una TIR se utiliza para dirigir la secreción de un polipéptido y los resultados se comparan con la TIR tipo silvestre o algún otro control bajo el mismo cultivo y condiciones de ensayo. Sin limitarse a cualquier otra teoría, la "resistencia de traslación" como se utiliza en la presente puede incluir por ejemplo, una medición de la estabilidad de ARNm, la eficiencia de la unión a ribosoma hacia el sitio de unión a ribosoma y el modo de transubicación a través de una membrana. La "secuencia de señal de secreción" o "secuencia de señal" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido de señal corto que puede utilizarse para dirigir una proteína de interés nuevamente sintetizada a través de una membrana celular, por ejemplo la membrana interna o tanto las membranas interna y externa de los procariotes. Como tal, la proteína de interés tal como el polipéptido de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina puede secretarse en el periplasma de las células huésped procarióticas o en el medio de cultivo. El péptido de señal codificado por la secuencia de señal de secreción puede ser endógeno para las células huésped o pueden ser exógenas, incluyendo péptidos de señal nativos para el polipéptido a expresarse. Las secuencias de señal de secreción se presentan típicamente en la terminal amino de un polipéptido a expresarse y típicamente se retiran enzimáticamente entre la biosíntesis y la secreción del polipéptido a partir del citoplasma. Así, el péptido de señal no se presenta usualmente en un producto de proteína maduro. Un anticuerpo de "bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno que se une (e.g., receptor c-met y VEGF) . Un "anticuerpo agonista", como se utiliza en la presente, es un anticuerpo que imita al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés (e.g., HGF y VEGF) . Un "antígeno de tumor", como se utiliza en la presente, incluye el significado conocido en la materia, que incluye cualquier molécula que se expresa diferencialmente sobre una célula de tumor comparada con una célula normal. En algunas modalidades, la molécula se expresa a un nivel alto o bajo detectable o significativamente en una célula de tumor comparada con una célula normal. En algunas modalidades, la molécula exhibe un nivel alto o bajo detectable o significativamente de la actividad biológica en una célula de tumor comparada con una célula normal . En algunas modalidades, la molécula se conoce o se cree que contribuye a una característica tumorugénica de la célula de tumor. Se conocen en la técnica numerosos antígenos de tumor. Ya sea una molécula es un antígeno de tumor que puede también determinarse de acuerdo con las técnicas y ensayos bien conocidos por aquellos expertos en la materia, tal como por ejemplo, ensayos clonogénicos, ensayos de transformación, ensayos de formación de tumor in Vitro o in vivo, ensayos de migración de gel, análisis de knockout de gen, etc. Un "trastorno" es cualquier condición que puede beneficiarse a partir del tratamiento con un anticuerpo o método de la invención. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicos y agudos incluyendo aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Ejemplos no limitantes de trastornos a tratarse en la presente incluyen tumores malignos y benignos; sin leucemias y malignidades linfoides; neuronal, glial, astrocital, hipotálmico y otros trastornos glandulares, acrofagonales, epiteliales, estromales y blastocoélicos; y trastornos inflamatorios, inmunológicos y otros relacionados con la angiogénesis. Los términos "cáncer" y "canceroso" se refiere a, o describe la condición fisiológica en mamíferos que se caracterizan típicamente por el crecimiento/proliferación de la célula no regulada. Ejemplos de cáncer incluyen pero no se limitan a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma escamoso de pulmón, cáncer del peritoneo, mieloma (e.g., mieloma múltiple), cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma/glioma (e.g., astrocito a anaplástico, gliobastoma multiuniforme, oligodendroglioma anaplásico, oligodendroastrocitoma anaplásico) , cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hematoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer de la tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello. Una "enfermedad autoinmune" en la presente es una enfermedad o trastorno no maligno que viene y se dirige contra un tejido propio del individuo. Las enfermedades autoinmunes en la presente específicamente excluyen enfermedades o condiciones malignas o cancerosas, excluyendo especialmente linfoma de célula B, leucemia linfoblástica aguda (ALL) , leucemia linfocítica crónica (CLL) , leucemia de la célula Capilar y leucemia mieloblástica crónica. Ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunes incluyen pero no se limitan a, respuestas inflamatorias, tales como enfermedades inflamatorias de la piel incluyendo la soriasis y dermatitis (e.g., dermatitis atópica); escleroderma y esclerosis sitémica; respuestas asociadas con enfermedad del intestino inflamatorias (tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa) , síndrome de aflicción respiratoria (incluyendo síndrome de aflicción respiratoria de adultos; ARDS) ; dermatitis; meningitis, encefalitis; uveitis; colitis; glomerulonefritis; condiciones alérgicas tales como eczema y asma y otras condiciones que involucran la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas; arteroesclerósis; deficiencia de la adhesión de leucocitos; artritis reumatoide, lupus eritematosa sistémica (SLE) ; diabetes mellitus (e.g., diabetes mellitus Tipo I o diabetes mellitis dependiente de la insulina) ; esclerosis múltiple; síndrome de Reynaud; tiroiditis autoinmune; encefalomelitis alérgica; síndrome de Sjorgen; ataque de diabetes juvenil; y respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T típicamente encontrados en la tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis, granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison) ; enfermedades que involucran diapédesis de leucocito; trastorno inflamatoria del sistema nervioso central (CNS) ; síndrome de daño a múltiples órganos; anemia hemolítica (incluyendo pero sin limitarse a crioglobinemia o anemia combos positiva) ; miastenia gravis; enfermedades mediadas por anticuerpo-antígeno complejo; enfermedad de la membrana anti-glomerular sementada; síndrome antifosfolípida; neuritis alérgica; enfermedad de Grave; síndrome de lambert-Eaton miastémica; bullous penfigoide; pénfigo; poliendocrinopatías autoinmune; enfermedad de Reiter; síndrome de Staff-man; enfermedad de Behcet; arteritis de célula gigante; nefritis de complejo inmune; neuropatía IgA; polineuropatías IgM; púrpura trombocitopénica inmune (ITP) o trombocitopenia autoinmune, etc. Como se utiliza en la presente, "tratamiento" se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo o célula a tratarse y puede llevarse a cabo ya sea mediante profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Efectos deseables del tratamiento incluyen prevenir la ocurrencia o recurrencia de la enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevenir la metástasis, disminuir la tasa de progresión de la enfermedad, alivio o mitigación del estado de enfermedad y remisión o pronóstico mejorado. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención se utilizan para retardar el desarrollo de una enfermedad o trastorno. En una modalidad, los anticuerpos y métodos de la inhibición del efecto de la invención del crecimiento del tumor/cáncer . Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva en dosis y por periodos de tiempo necesarios para lograr el resultado terapéutico o profilático deseado. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo de la invención puede variar de acuerdo con los factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo pesa más que mediante los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente pero no necesariamente, ya que una dosis profiláctica se utiliza en sujetos antes de o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menos a la cantidad terapéuticamente efectiva. La frase "no posee función efectora sustancial" con respecto a un fragmento de anticuerpo de la invención, como se utiliza en la presente, se refiere a la diferencia entre la cantidad de la actividad de la función efectora detectable de un fragmento de anticuerpo de la invención y la cantidad de la actividad exhibida por una contraparte del anticuerpo glicosilada tipo silvestre que es estadísticamente significativa como evidente para un experto en la materia, en donde la cantidad de actividad del fragmento de anticuerpo de la invención es menor a la cantidad de actividad exhibida por la contraparte tipo silvestre. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo de la invención no exhibe un nivel de actividad de la función efectora (diferente a la unión FcRn) que se encuentra por arriba del nivel anterior que es de significancia estadística. La frase "pequeña para propiedades no inmunosupresivas" con respecto a un fragmento de anticuerpo de la invención, como se utiliza en la presente, se refiere al anticuerpo que no produce una cantidad biológicamente significativo de la inmunosupresión a la administración a un sujeto. Como puede entenderse en la materia, la cantidad de una actividad puede determinarse cuantitativa o cualitativamente, siempre que pueda darse una comparación entre un anticuerpo de la invención y una contraparte de referencia. La actividad puede medirse o detectarse de acuerdo con cualquier ensayo o técnica conocida en la materia, incluyendo, e.g., aquellas descritas en la presente. La cantidad de actividad para un anticuerpo de la invención y su contraparte de referencia puede determinarse en paralelo o en corridas separadas. La frases "sustancialmente similar", "sustancialmente idéntica", "sustancialmente la misma" y variaciones de las mismas, como se utiliza en la presente, denota un grado suficientemente grande de similitud entre dos valores numéricos (generalmente uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con su contraparte de referencia) tal como un experto en la materia puede considerar la diferencia entre dos valores a ser de significacia pequeña o no biológica dentro del contexto de la característica biológica, física o de cuantificación medida por dichos valores . La diferencia entre dichos dos valores es preferentemente menor a aproximadamente 50%, preferentemente menor de aproximadamente 40%, preferentemente menor de aproximadamente 30%, preferentemente menor de aproximadamente 20%, preferentemente menor de aproximadamente 10% como una función del valor para la contraparte de referencia. Un fragmento de anticuerpo de la invención es "más estable" o tiene "estabilidad incrementada" comparada con la otra forma de anticuerpo (tal como la contraparte del fragmento Fab) y variaciones de las mismas, como se utiliza en la presente, se refiere al fragmento de anticuerpo de la invención que exhibe un incremento detectable/medible en la estabilidad in vivo comparada con un anticuerpo de referencia (tal como una contraparte del fragmento Fab) . La estabilidad puede basarse en la vida media, tasa de despeje y/o cualquier otro parámetro observado en la técnica como indicativo de cuánto permanece el fragmento de anticuerpo de la invención en un sujeto particular en puntos de tiempo particulares después de la administración del fragmento de anticuerpo al sujeto. Los métodos para determinar los parámetros de estabilidad, tal como vida media y/o tasa de despeje, son bien conocidos en la materia, algunos de los cuales se describen en la presente. "Citotoxicidad dependiente del complemento" y "CDC" se refiere al lisado de un objetivo en la presencia del complemento. La trayectoria de activación del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema de complemento (Clq) hacia una molécula (e.g., anticuerpo) compleja con un antígeno cognado. "Afinidad de unión" en general se refiere a la resistencia de la suma total de las interacciones no covalentes entre un solo sitio de unión de una molécula (e.g., anticuerpo9 y su pareja de unión (e.g., un antígeno o receptor FcRn) . La afinidad de una molécula X para su pareja Y puede representarse en general mediante la dosiciación constante (Kd) , La afinidad puede medirse por métodos conocidos en la materia, incluyendo aquellos descritos en la presente. El antígeno de unión de anticuerpos de baja afinidad (o receptor FcRn) débil y tiende a desasociar fácilmente, en vista que el antígeno de unión de anticuerpos de alta afinidad (o receptor FcRn) son más apretados y permanecen unidos más tiempo. El término "agente citotóxico" como se utiliza en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o provoca la destrucción de las células. El término se intenta para incluir isótopos radioactivos (e.g., At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quinioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de bacterias, hongos, plantas o de origen animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agente quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación tales como tiotepa y ciclosfosfamida CITOXAN®; alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aciridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulataciniona) ; delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®) ; beta-lapachone; lapachol; colquicinas; ácido botulínico; una campotecina (incluyendo topotecan de análogo sintético (HYCAMT1N®) , CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina) ; briostatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina; ácido podofilínico; teníposida; criptoficinas (particularmente criptoficina I y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina; pancrastistaina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tal como cloroambucil, clornafacina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tal como carmustina, clorozotocina, fote ustina, lomustina, nimustina y ranimustina; antibióticos tales como los antibióticos de enedina (e.g., caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma II y caliqueamicina omega II (ver, e.g., Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como cromoforo de neocaricinostatina y cromóforos de antibiótico de cromoproteína enedina relacionada) , aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluyendo ADRIAMYCINA®, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, inyección de liposoma de doxorubicina HCl (DOXIL®) y deoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, streptonigrina, streptozocina, tubercidina, ubenimex, cinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®) , tegafur (UFTORAL®) , capecitabina (XELODA®) , una epotilona y 5-fluorouracil (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos purinos tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tal como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; regenerador de ácido fólico tal como ácido frolínico, aceglatona, aldofosfamida glicosina; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaciquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitasinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2- etilhidrazida; procarbacina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaciquona; 2, 2' , 2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurin A, roridin A y anguidina) ; uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; dacarbacina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C") ; tiotepa; taxoides, e.g., paclitaxel (TAXOL®) , formulación de nanopartícula hecha de albúmina de paclitaxel (ABAXANE™) y doxetaxel (TAXOTERE®) ; cloranbucil; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina (VELBAN®) ; platino; etoposida (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®) ; oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®) ; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinóico; sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de lo anterior tal como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisolona y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatina (ELOXATIN™) combinada con 5-FU y leucovovina. También se incluyen en esta definición los agentes anti-hormonales que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer y con frecuencia se encuentran en la forma de tratamiento sistémico o del cuerpo completo. Pueden ser hormonas por sí mismas. Ejemplos incluyen anti-estrógenos y moduladores del receptor de estrógeno selectivo (SERMs) , incluyendo por ejemplo, tamoxifen (incluyendo tamoxifen de NOLVADEX®), raloxifen (EVISTA®) , droloxifeno, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (FARESTON®) ; anti-progesteronas; sub-reguladores del receptor de estrógeno (ERDs) ; antagonistas del receptor de estrógeno tales como fulvestrant (FASLODEX®) ; agentes que funcionan para suprimir o bajar los ovarios, por ejemplo agonistas de la hormona de liberación de hormona leutinizantes (LHRH) tales como acetato de leuprolido (LUPRON® y ELIGARD®) , acetato de goserelina, acetato de buserelina y tripterelina; otros anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; e inhibidores de aromatasa que inhiben la aromatasa de la enzima, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenalaes, tal como por ejemplo 4 (5) -imidazolas, aminoglutetimida, acetato de megestrol (MEGASE®) , exemestano (AROMASIN®) , formestania, fadrozola, vorozola (RIVISOR®) , letrozola (FEMARA®) y anastrozola (ARIMIDEX®) . Además, tal definición de agentes quimioterapéuticos incluye bifosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®) , etidronato (DIDROCAL®) , NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®) , alendronato (FOSAMAX®) , pamidronato (AREDÍA®) , tiludronato (SKELID®) o risedronato (ACTONEL®) ; así como troxacitabina (un análogo de 1, 3-dioxolano nucleósido de citosina); oligonucleótidos de antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de los genes en trayectorias de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante tal como por ejemplo, el receptor del factor de crecimiento PKC-alfa, Raf, H-Ras y epidérmico (EGF-R) ; vacunas tales como la vacuna THERATOPE® y las vacunas de terapia de gen, por ejemplo vacuna de ALLOVECTIN®, vacuna de LEUVECTIN® y vacuna de VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (e.g., LURTOTECAN®) ; rmRH (e.g., ABARELIX®) ; lapatinib ditosilato (un inhibidor de la molécula pequeña de tirosina cinasa de EGFR dual también conocido como un GW572016) ; inhibidores COX-2 tales como celecoxib (CELEBREX®; 4- (5- (4-metilfenil) -3- (trifluorometil) -lH-pirazol-1-il) bencenosulfonamida; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de lo anterior. Excepto en donde se indique de otro modo en el contexto, los términos "primer" polipéptido y "segundo" polipéptido y variaciones de los mismos, son solo identificadores genéricos y no se toman como polipéptidos específicos de indentificación o componentes de anticuerpos de la invención. Una "protuberancia" se refiere a al menos una cadena lateral de aminoácido que se proyecta desde la interfaz de un primer polipéptido y se coloca por lo tanto en una cavidad compensatoria en la interfaz adyacente (i.e., la interfaz de un segundo polipéptido) a fin de estabilizar el heteromultímero y favorecer por ejemplo por lo tanto la formación de heteromultidímero sobre la formación de ho omultidímero . La protuberancia puede existir en la interfaz original o puede introducirse sintéticamente (e.g., al alterar el ácido nucleico que codifica la interfaz) . Normalmente, el ácido nucleico que codifica la interfaz del primer polipéptido se altera para codificar la protuberancia. Para lograr esto, el ácido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoácido "original" en la interfaz del primer polipéptido se reemplaza con el ácido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoácido de "importación" que tiene un volumen de cadena lateral mayor al original y corresponde con el residuo de importación. El límite superior para el número de residuos originales que se reemplazan es el número total de residuos en la interfaz del primer polipéptido. Los volúmenes de cadena lateral de los diversos residuos de aminoácido se muestran en la siguiente tabla.

TABLA 1 Porpiedades de Residuos de Aminoácidos Peso molecular de aminoácido menos aquel del agua, Valores de Hanbook of Chemistry Physics, 43ava ed. Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961. Valores de A. . Zamyatnin, Prog. Biophys . Mol . Biol . 24:107-123, 1972. c Valores de C. Chothia, J. Mol . Biol . 105: 1-14, 1975. El área de superficie accesible se define en las Figuras 6-20 de esta referencia. Los residuos de importación preferidos para la formación de una protuberancia son residuos de aminoácido que generalmente ocurren de manera natural y se seleccionan preferentemente a partir de arginina (R) , fenilalanina (F) , tirosina (Y) y triptofan (W) . Los más preferidos son triptofan y tirosina. En una modalidad, el residuo original para la formación de la protuberancia tiene un volumen de cadena lateral pequeño, tal como alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina o valina. Una "cavidad" se refiere a al menos una cadena lateral de aminoácido que se separa a partir de la interfaz de un segundo polipéptido y acomoda por lo tanto una protuberancia correspondiente sobre la interfaz adyacente de un primer polipéptido. La cavidad puede existir en la interfaz original o puede introducirse sintéticamente (e.g., al alterar el ácido nucleico que codifica la interfaz) . Normalmente, el ácido nucleico que codifica la interfaz del segundo polipéptido se altera para codificar la cavidad.

Para lograr esto, el ácido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoácido "original" en la interfaz del segundo polipéptido se reemplaza con ADN que codifica al menos el residuo de aminoácido de "importación" que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el del residuo de aminoácido original. Se apreciará que puede existir más de un residuo de importación original y correspondiente. El límite superior para el número de residuos originales que se reemplazan es el número total de residuos en la interfaz del segundo polipéptido. Los volúmenes de cadena lateral de diversos residuos amino se muestran en la Tabla 1 de arriba. Los residuos de importación preferidos para la formación de una cavidad son usualmente resiudos de aminoácido que ocurren de manera natural y se seleccionan preferentemente a partir alanina (A), serina (S) , treonina (T) y valina (V). Los más preferidos son serina, alanina o treonina. En una modalidad, el residuo original para la formación de la cavidad tiene un volumen de cadena lateral grande, tal como tirosina, arginina, fenilalanina o triptofan. Un residuo de aminoácido "original" es uno que se reemplaza por un residuo de "importación" que puede tener un volumen de cadena lateral más pequeño o más grande que el del residuo original. El residuo de aminoácido de importación puede ser un residuo de aminoácido que ocurre de manera natural o que ocurre de manera no natural, pero preferentemente es el formador. Los residuos de aminoácido que "ocurren de manera natural" son aquellos residuos codificados mediante el código genético y listado en la Tabla 1 de arriba. Por residuo de aminoácido que "no ocurre de manera natural" se refiere a un residuo que no se codifica por el código genético, pero que es capaz de unir covalentemente el (los) residuo (s) de aminoácido en la cadena de polipéptido. Ejemplos de residuos de aminoácido que no ocurren de manera natural son norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros análogos de residuo de aminoácido tales como por ejemplo aquellos descritos en Ellman et al., Meth . Enzym. 202: 301-336 (1991). Para generar tales residuos de aminoácido que no ocurren de manera natural, pueden utilizarse los procedimientos de Noren et al., Science 244:182 (1989) y Ellman et al., supra . En breve, esto involucra activar químicamente un ARNt supresor con un residuo de aminoácido que no ocurre de manera natural seguido por la transcripción in vitro y la traslación del ARN. El método de esta invención involucra reemplazar al menos un residuo de aminoácido original, pero puede reemplazrase más de un residuo de aminoácido original. Normalmente, no más de los residuos totales en la interfaz del primero o segundo polipéptido comprenderá residuos de aminoácido originales que se reemplazan. Típicamente, los residuos originales para reemplazarse se "ocultan". Por "ocultar" se refiere a que el residuo es esencialmente inaccesible al solvente. Generalmente, el residuo de importación no es cisteína para evitar la oxidación posible o el apareamiento erróneo de la uniones de disulfuro.

La protuberancia es "posicionable" en la cavidad lo cual significa la ubicación espacial de la protuberancia y la cavidad en la interfaz de un primer polipéptido y de un segundo polipéptido respectivamente y los tamaños de la protuberancia y la cavidad son tales que la protuberancia puede ubicarse en la cavidad sin pertubar significativamente la asociación normal del primero y segundo polipéptidos en la interfaz. Ya que las protuberancias tales como Tyr, Phe y Trp no se extienden típicamente de manera perpendicular a partir del eje de la interfaz y tienen conformaciones preferidas, el alineamiento de una protuberancia con una cavidad correspondiente yace en modelar el par de protuberancia/cavidad en base a una estructura tridimensional tal como aquella obtenida mediante cristalografía de rayos X o resonancia magnética nuclear (NMR) . Esto puede lograrse utilizando técnicas ampliamente aceptadas en la materia. Por "ácido nucleico original o templado" se refiere al ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés que puede "alterarse" (i.e., hacerse o imitarse genéticamente) para codificar una protuberancia o cavidad. El ácido nucleico original o de inicio puede ser un ácido nucleico que ocurre de manera natural o puede comprender un ácido nucleico que se ha sometido a una alteración anterior (e.g., un fragmento de anticuerpo humanizado) . Por "alterar" el ácido nucleico se refiere a que el ácido nucleico original se muta al insertar, suprimir o reemplazar al menos un codón que codifica un residuo de aminoácido de interés. Normalmente, un codón que codifica un residuo original se reemplaza mediante un codón que codifica un residuo de importación. Las técnicas para modificar genéticamente un ADN en esta forma se han revisado en Mutagenesis: a Practical Approach, M.J. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, UK. (1991) e incluye por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis de cassete y mutagénesis de reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Al mutar un ácido nucleico original/templado, un polipéptido original/templado codificado por al ácido nucleico original/templado original se altera así correspondientemente . La protuberancia o cavidad puede "introducirse" en la interfaz de un primer o segundo polipéptido por medios sintéticos, e.g., mediante técnicas recombinantes, síntesis de péptido in vitro, aquellas técnicas para introducir los residuos de aminoácido que no ocureen de forma natural previamente descritos, mediante acoplamiento enzimático o químico de péptido o alguna combinación de estas técnicas. De acuerdo con esto, la protuberancia o cavidad que se "introduce" "no ocurre de forma natural" o "no es nativa", que significa que esta no existe en la naturaleza o en el polipe'ptido original (e.g., un anticuerpo monoclonal humanizado) .

Generalmente, el residuo de aminoácido de importación para formar la protuberancia tiene un número relativamente pequeño de "rotámeros" (e.g., aproximadamente 3-6) . Un "rotómero" es una conformación energéticamente favorable de una cadena lateral de aminoácido. El número de rotómeros de los diversos residuos de aminoácido se revisa en Ponders and Richards, J. Mol . Biol . 193: 775-791 (1987). Heteromultímero "aislado" se refiere al heteromultímero que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente de cultivo celular .natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que pueden interferir con usos de diagnóstico o terapéuticos para el heteromultímero y puede incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En algunas modalidades, el heteromultímero se purificará (1) a más del 95% mediante el peso de la proteína como se determinó mediante el método de Lowry o más del 99% por peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácido N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de spinning cup o (3) para homogeneidad mediante SDS-PAGE bajó condiciones de reducción o no reducción utilizando azul Coomasie o tintura de plata. Los heteromultímeros de la presente invención generalmente se purifican a una homogeneidad sustancial. Las frases "sustancialmente homogéneo", "forma sustancialmente homogénea" y "homogeneidad sustancial" se utilizan para indicar que el producto se libera sustancialmente de los subproductos originados a partir de combinaciones de polipéptido no deseadas (e.g., homomultímeros) . Expresado en términos de pureza, homogeneidad sustancial se refiere que la cantidad de los sub-productos no excede el 10% o se encuentra por debajo del 5% o se encuentra por debajo del 1% o se encuentra por debajo del 0.5% en donde los porcentajes son por peso. La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operablemente enlazada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para por ejemplo los procariotes, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión a ribosoma y posiblemente otro como secuencias aún pobremente entendidas. Las células eucarióticas se conocen por utilizar promotores, señales de poliadenilación y mejoradores . El ácido nucleico se "enlaza operablemente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para un conductor de presecuencia o secretor se enlaza operablemente al ADN para un polipéptido si este se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador se enlaza operablemente a una secuencia de codificación si este afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma se enlaza operablemente a una secuencia de codificación si esta se coloca a fin de facilitar la traslación. Generalmente "operablemente enlazado" se refiere a que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y contiguo en el caso de un conductor secretor y en la fase de lectura. Sin embargo, los mejoradotes no tienen que ser contiguos. El enlace puede llevarse a cabo mediante ligación en los sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores o enlazadores del oligonucleótido sintético se utilizan de acuerdo con la práctica convencional. Vectores, Células Huésped y Métodos Recombinantes Para la producción recombinante de un anticuerpo de la invención, el ácido nucleico que codifica se aisla e inserta en un vector replicáble para clonación adicional (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se aisla y secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (e.g., al utilizar pruebas de oligonucleótido que son capaces de unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo) . Se encuentran disponibles muchos vectores. La selección del vector depende en parte de la célula huésped a utilizarse. Generalmente, las células huésped preferidas son de ya sea origen procariótico o eucariótico (generalmente mamíferos) . Generación de anticuerpos utilizando células huésped procarióticas Construcción del Vector Las secuencias de polinucleótido que codifican componentes de polipéptido del anticuerpo de la invención pueden obtenerse utilizando técnicas recombinantes estándar. Las secuencias de polinucleótido deseadas pueden aislarse y secuenciarse a partir del anticuerpo que produce células tales como células de hibridoma. Alternativamente, los polinucleótidos pueden sintetizarse utilizando sintetizador de nucleótido o técnicas PCR. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleótidos heterólogos en huéspedes procarióticos. Muchos vectores que se encuentran disponibles y se conocen en la materia pueden utilizarse para el propósito de la presente invención. La selección de un vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos a insertarse en el vector y la célula huésped particular a transformarse con el vector. Cada vector contiene varios componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión de polinucleótido heterólogo o ambos) y su compatibilidad con la célula huésped particular en la cual reside. Los componentes de vector generalmente incluyen, pero no se limitan a; un origen de replicación, un gen marcador de selección, un promotor, un sitio de unión a ribosoma (RBS) , una secuencia de señal, el inserto de ácido nucleico heterólogo y una secuencia de terminación de transcripción . En general, los vectores de plásmido que contienen secuencias de replicón y control que se derivan de las especies compatibles con la célula huésped se utilizan junto con estos huéspedes. El vector ordinariamente lleva un sitio de replicación, así como secuencias de marcación que son capaces de proporcionar la selección fenotípica en las células transformadas. Por ejemplo, E. coli, típicamente se transforma utilizando pBR322, un plásmido derivado a partir de una especie de E. coli . pBR322 contiene genes que codifican la resistencia a la ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y proporciona así medios fáciles para identificar células transformadas. pBR322 también puede contener sus derivadosu otros plásmidos microbiales o bacteriófago o pueden modificarse para contener promotores que pueden utilizarse mediante el microorganismo microbial para la expresión de proteínas endógenas. Ejemplos de derivados pB322 utilizados para la expresión de anticuerpos particulares se describen en detalle en Cárter et al., Patente de E.U. No. 5,648,237.

Además, los vectores de fago que contienen secuencias de replicón y de control que son compatibles con los microorganismos huésped pueden utilizarse como vectores de transformación junto con estos huéspedes. Por ejemplo, el bacteriófago tal como ?GEM.TM.-ll pueden utilizarse en hacer un vector recombinante que puede utilizarse para transformar células huésped susceptibles tales como E. coli LE392. El vector de expresión de la invención puede comprender dos o más pares de promotor-cistrón, codificando cada uno de los componentes de polipéptido. Un promotor es una secuencia reguladora no trasladable ubicada corriente arriba (5' ) hacia un cistrón que modula su expresión. Los promotores procarióticos típicamente caen en dos clases, inducible y constitutiva. El promotor inducible es un promotor que inicia niveles incrementados de transcripción del cistrón bajo su control en respuesta a los cambios en la condición del cultivo, e.g., la presencia o ausencia de un nutriente o cambio de temperatura. Son bien conocidos un gran número de promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales . El promotor seleccionado puede enlazarse operablemente al ADN de cistrón que codifica la cadena ligera o pesada al retirar el promotor a partir del ADN fuente a través de la restricción de la digestión de la enzima e insertar la secuencia de promotor aislada en el vector de la invención.

Tanto la secuencia promotora nativa como muchos promotores heterólogos pueden utilizarse para dirigir la amplificación y/o la expresión de los genes objetivo. En algunas modalidades, se utilizan los promotores heterólogos a mediada que generalmente permiten mayor transcripción y producciones mayores del gen objetivo expresado como se compara con el promotor de polipéptido objetivo nativo. Los promotores adecuados para utilizarse con los huéspedes procarióticos incluyen el promotor PhoA, los sistemas de promotor de ß-galactamasa y de lactosa, un sistema de promotor de triptofan (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac o el trc. Sin embargo, otros promotores son funcionales en la bacteria (tal como otros promotores conocidos bacteriales o de fago) son adecuados así. Sus secuencias de nucleótido se han publicado, por lo tanto facilitan operablemente a un trabajador experto para ligarlos a los cistrones que codifican las cadenas ligera y pesada objetivo (Siebenlist et al. (1980) Cell 20: 269) utilizando enlazadores o adaptadores para suministrar cualquiera de los sitios de restricción requeridos. En un aspecto de la invención, cada cistrón dentro del vector recombinante requiere un componente de secuencia de señal de secreción que dirige la transubicación de los polipéptidos expresados a través de una membrana. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector o puede ser parte del ADN de polipéptido objetivo que se inserta en el vector. La secuencia de señal seleccionada para el propósito de esta invención debe ser una que se reconoce y procesa (i.e. dividida por una peptidasa de señal) por la célula huésped. Para las células huésped procarióticas que no se reconocen y procesan los nativos de las secuencias de señal hacia los polipéptidos heterólogos, la secuencia de señal se sustituye mediante por ejemplo una secuencia de señal procariótica seleccionada, a partir del grupo que consiste de fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o conductores de exterotoxina II termo-estable (STII) , LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. En una modalidad de la invención, las secuencias de señal utilizadas en ambos cistrones del sistema de expresión son secuencias de señal STII o variantes de las mismas. En otro aspecto, la producción de las inmunoglobulinas de acuerdo con la invención puede ocurrir en el citoplasma de la célula huésped y por lo tanto no requiere la presencia de las secuencias de señal de secreción dentro de cada cistrón. En ese respecto, se expresan las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina, duplicadas y ensambladas para formar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Ciertas cepas huésped (e.g., las cepas E. coli trxB') proporcionan condiciones de citoplasma que son favorables para la formación de unión a disulfuro, permitiendo por lo tanto la multiplicación y ensamblaje de las subunidades de proteína expresadas. Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995). La presente invención proporciona un sistema de expresión que es la proporción cuantitativa de los componentes de polipéptido expresados que pueden modularse a fin de maximizar la producción de anticuerpos de la invención secretados y ensamblados adecuadamente. Tal modulación se lleva a cabo al menos en parte al modular simultáneamente las resistencias translacionales para los componentes de polipéptido. Una técnica para modular la resistencia translacional se describe en Simmones et al., Pat. de E.U. No. 5,840,523. Esta utiliza variantes de la región de iniciación translacional (TIR) dentro de un cistrón. Para un TIR dado de las variantes de secuencia de aminoácido o de ácido nucleico pueden crearse con un rango de resistencias translacionales, proporcionando por lo tanto un significado conveniente mediante el cual se ajusta este factor para el nivel de expresión deseado de la cadena específica. Las variantes TIR pueden generarse mediante técnicas de mutagénesis convencionales que resultan en cambios de codón que pueden alterar la secuencia de aminoácido, aunque se prefieren cambios silenciosos en la secuencia nucleótida. Las alteraciones en el TIR pueden incluir por ejemplo, alteraciones en el número o espaciamiento de las secuencias Shine-Dalgarno, junto con las alteraciones en la secuencia de señal. Un método para generar secuencias de señal mutantes es la generación de un "banco de codón" al inicio de una secuencia de codificación que no cambia la secuencia a inoácida de la secuencia de señal (i.e., los cambios son silenciosos) . Esto puede lograrse al cambiar la tercer posición nucleótida de cada codón; adicionalmente, algunos aminoácidos, tal como leucina, serina y arginina tienen múltiples primeras y segundas posiciones que pueden agregar complejidad al hacer el banco. Este método de mutagénesis se describe en detalle en Yansura et al. (1992) METHODS : A Companion to Methods in Enzymol 4:151-158. Preferentemente, se genera un conjunto de vectores con un rango de resistencias TIR para cada cistrón en la misma. este conjunto limitado proporciona una comparación de los niveles de expresión de cada cadena así como la producción de los productos de anticuerpo deseados bajo varias combinaciones de resistencia TIR. Las resistencias TIR pueden determinarse al cuantificar el nivel de expresión de un gen de reporte como se describe en detalle en Simmons et al. Pat. de E.U. No. 5,840,523. En base a la comparación de resistencia translacional, se seleccionan los TIRs individuales deseados para combinarse en las construcciones del vector de expresión de la invención.

Las células huésped procarióticas adecuadas para expresar los anticuerpos de la invención incluyen Archabacteria y Eubacteria, tal como organismos Gram-negativo o Gram-positivo. Ejemplos de bacterias útiles incluyen Escherichia (e.g., E. coli) , Bacilli (e.g.,B. subtilis) , Enterobacteria, especies de Pseudomonas (e.g., P. aeruginosa) , Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Kelbsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla o Paracoccus . En una modalidad, se utilizan células gram-negativas. En una modalidad se utilizan células E. coli como huéspedes para la invención. Ejemplos de cepas E. coli incluyen cepas W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposito No. 27,325) y derivados de las mismas, incluyendo las cepa 33D3 que tiene el genotipo W3110 ?fhuA (?tonA) ptr3 lac Iq lacL8 ?ompTA (nmpc-fepE) degPél kanR (Pat. de E.ü. No. 5,639,635). También son adecuadas otras cepas y derivados de las mismas, tal como E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coli? 1116 (ATCC 31,537) y E. coli RV308 (ATCC 31,608). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. Los métodos para construir derivados de cualquiera de las bacterias antes mencionadas tienen genotipos definidos conocidos en la materia y se describen en por ejemplo, Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990). Generalmente es necesario seleccionar la bacteria apropiada tomando en consideración la reproducción del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo E. coli, las especies Serratia o Salmonella pueden utilizarse adecuadamente como el huésped cuando se utilizan los plásmidos bien conocidos tales como pBR322, pBR325, pACY177 o pKN410 para suministrar el replicón. Típicamente la célula huésped debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas y los inhibidores de proteasa adicionales pueden incorporarse deseablemente en el cultivo celular. Producción de Anticuerpo Las células huésped se transforman con los vectores de expresión antes descritos y cultivadas en el medio nutriente convencional modificado como apropiado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas . Los medios de transformación introducen ADN en el huésped procariótico de manera que el ADN es duplicable, ya sea como un elemento extracromosomal o mediante el integrante cromosomal. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se da utilizando técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento de calcio que emplea cloruro de calcio se utiliza generalmente para células bacteriales que contienen barreras sustanciales de pared celular. Otro método de transformación emplea polietilen glicol/DMSO. Aún otra técnica que se utiliza es la electroporación. Las células procarióticas utilizadas para producir los polipéptidos de la invención crecen en un medio conocido en la materia y adecuado para el cultivo de las células huésped seleccionadas. Ejemplos de medios adecuados incluyen luria broth (LB) más los suplementos de nutrientes necesarios. En algunas modalidades, el medio también contiene un agente de selección, seleccionado en base a la construcción del vector de expresión, para permitir selectivamente el crecimiento de las células procarióticas que contienen el vector de expresión. Por ejemplo, se agrega ampicilina al medio para el crecimiento de las células que expresan el gen resistente a la ampicilina. Cualquiera de los suplementos necesarios además del carbono, nitrógeno y fuentes de fosfato inorgánico pueden también incluirse a concentraciones apropiadas introducidas solas o como una mezcla con otro suplemento o medio tal como una fuente de nitrógeno compleja. Opcionalmente el medio de cultivo puede contener uno o más agentes de reducción seleccionados del grupo que consiste de glutationa, cisteína, tioglicolato, ditioeritritol y ditiotreitol . Las células huésped procarióticas se cultivan a temperaturas apropiadas. Para el crecimiento de E. coli por ejemplo, los rangos de temperatura preferidos son desde aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 39°C, más preferentemente desde aproximadamente 25 °C hasta aproximadamente 37 °C, aún más preferentemente a aproximadamente 30 °C. El pH del medio puede ser cualquier pH que varía desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 9, dependiendo principalmente del organismo huésped. Para E. coli , el pH es preferentemente desde aproximadamente 6.8 hasta aproximadamente 7.4 y más preferentemente aproximadamente 7.0. Si se utiliza un promotor inducible en el vector de expresión de la invención, la expresión de la proteína se induce bajo condiciones adecuadas para la activación del promotor. En un aspecto de la invención, se utilizan los promotores PhoA para controlar la transcripción de los polipéptidos. De acuerdo con esto, las células huésped transformadas se cultivan en un medio limitante de fosfato para la inducción. Preferentemente, el medio limitante de fosfato es el medio C.R.A.P. (ver e.g., Simmons et al., J. Immunol . Methods (2002), 263:133-147). Puede utilizarse una variedad de otros inductores, de acuerdo con la construcción de vector empelada, como se conoce en la materia. En una modalidad, los polipéptidos expresados de la presente invención se secretan en y se recuperan a partir del periplasma de las células huésped. La recuperación de la proteína típicamente involucra el rompimiento del microorganismo, generalmente por tales medios como coque osmótico, sonicación o lisis. Una vez que se rompen las células, pueden retirarse mediante centrifugación o filtración las partículas de células o las células completas. Las proteínas pueden purificarse además por ejemplo, mediante cromatografía de resina por afinidad. Alternativamente, las proteínas pueden transportarse en el medio de cultivo y aislarse en el mismo. Las células pueden removerse del cultivo y del sobrenadante del cultivo siendo filtrado y concentrado para purificación adicional de las proteínas producidas. Los polipéptidos expresados pueden aislarse e identificarse además utilizando métodos comúnmente conocidos tales como electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) o ensayo de inmunotransferencia Western. En un aspecto de la invención, la producción del anticuerpo se conduce en una gran cantidad mediante un proceso de fermentación. Se encuentran disponibles varios procedimientos de fermentación de alimentación por lote a gran escala para la producción de proteínas recombinantes. Las fermentaciones a gran escala tienen al menos 1000 litros de capacidad, preferentemente aproximadamente 1,000 hasta 100,000 litros de capacidad. Estos termentadores utilizan propulsores agitadores para distribuir oxígeno y nutrientes, especialmente glucosa (la fuente preferida de carbón/energía) . La fermentación a pequeña escala se refiere en general a la fermentación en un fermentador que no es de más de aproximadamente 100 litros en capacidad volumétrica y puede variar desde 1 litro hasta aproximadamente 100 litros. En un proceso de fermentación, la inducción de la expresión de la proteína se inicia típicamente después de que las células han crecido bajo condiciones adecuadas a una densidad deseada, e.g., un OD550 de aproximadamente 180-220, en cuya etapa las células se encuentran en la fase estacionaria temprana. Puede utilizarse una variedad de inductores de acuerdo con la construcción de vector empleada, como se conoce en la materia y antes descrito. Las células pueden crecer por periodos más cortos antes de la inducción. Las células usualmente se inducen por aproximadamente 12-50 horas, aunque puede utilizarse un tiempo de inducción más corto o más largo. Para mejorar la producción producida y la calidad de los polipéptidos de la invención, pueden modificarse varias condiciones de fermentación. Por ejemplo, para mejorar el ensamblaje adecuado y duplicar los polipéptidos de anticuerpo secretados, las proteínas acompañantes que sobreexpresan los vectores adicionales, tales como las proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD y o DsbG) o FkpA (un peptidilprolil cis, trans-isomerasa con actividad acompañante) puede utilizarse para co-transformar las células procarióticas huéspedes. Las proteínas acompañantes se ha demostrado que facilitan la duplicidad y solubilidad adecuada de proteínas heterólogas producidas en las células huésped. Chen et al. (1999) J Bio Chem 21 A : 19601-19605; Georgiou et al., Patente de E.U. No. 6,083,715; Georgiou et al., Patente de E.U. No. 6,027,888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol . Chem . 275: 17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol . Chem. 275: 17106-17113; Arie et al., (2001) Mol . Microbiol . 39:199-210. Para minimizar la proteólisis de las proteínas heterólogas expresadas (especialmente aquellas que son proteolíticamente sensibles) , pueden utilizarse ciertas cepas huésped deficientes para las enzimas proteolíticas para la presente invención. Por ejemplo, las cepas de célula huésped pueden modificarse para efectuar la(s) mutación (es) genética (s) en los genes que codifican proteasas bacteriales conocidas tales como la Proteasa III, OmpT, DegP, Tsp, Proteasa I, Proteasa Mi, Proteasa V, Proteasa VI y combinaciones de las mismas. Algunas cepas deficientes de la proteasa E. coli se encuentran disponibles como se describe en por ejemplo Joly et al., (1998), supra; Georgiou et al., Patente de E.U. No. 5,264,365; Georgiou et al., Patente de E.U. No. 5,508,192; Hará et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996). En una modalidad, las cepas E. coli deficientes para las enzimas proteolíticas y transformadas con plásmidos que sobreexpresan una o más proteínas acompañantes se utilizan como células huésped en el sistema de expresión de la invención. Purificación del Anticuerpo En una modalidad, la proteína del anticuerpo producida en la presente se purifica además para obtener preparaciones que son sustancialmente homogéneas para ensayos y usos adicionales . Pueden emplearse los métodos de purificación de proteínas estándar conocidos en la materia. Los siguientes procedimientos son ejemplificativos de los procedimientos de purificación adecuados; fraccionación sobre inmunoafinidad o columnas de intercambio de ion, precipitación de etanol, HPLC de fase inversa, cronmatografía sobre sílice o una resina de intercambio de catión tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación de sulfato de amonio y filtración de gel utilizando por ejemplo Sephadex G-75. En un aspecto, la proteína A inmovilizada sobre una fase sólida se utiliza para la purificación por inmunoafinidad de los productos del anticuerpo de longitud completa de la invención. La Proteína A es una proteína de pared celular 41kD a partir de Staphylococcus áureas que se une con una alta afinidad a la región Fc de los anticuerpos. Lindmark et al (1983) J. Immunol . Meth. 62:1-13. La fase sólida a la cual la Proteína A se inmoviliza es preferentemente una columna que comprende una superficie de vidrio o sílice, más preferentemente una columna de vidrio de poro controlado o una columna de ácido silícico. En algunas aplicaciones, la columna se ha cubierto con un reactivo, tal como glicerol, en un intento de evitar la adherencia no específica de los contaminantes. Como la primera etapa de purificación, la preparación derivada a partir dele ultivo celular como se describe arriba se aplica sobre la fase sólida inmovilizada de Proteína A para permitir la unión específica del anticuerpo de interés a la Proteína A. La fase sólida se lava entonces para remover los contaminantes no específicamente unidos a la fase sólida. Finalmente el anticuerpo de interés se recupera a partir de la fase sólida mediante elución. Generación de anticuerpos utilizando células huésped eucarióticas : Los componentes de vector generalmente incluyen pero no se limitan a, uno o más de lo siguiente: una secuencia de señal, un origen de multiplicación, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. (i) Componente de secuencia de señal Un vector para utilizarse en una célula huésped eucariótica también puede contener una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de división específico en la N-terminal de la proteína madura o polipéptido de interés. La secuencia de señal heteróloga seleccionada preferentemente es una que se reconoce y procesa (i.e., dividida por una peptidasa de señal) por la célula huésped. En la expresión celular de mamífero, se encuentran disponibles las secuencias de señal de mamífero así como los conductores secretores virales por ejemplo la señal gD de herpes simplex. El ADN para tal región precursora se liga al leer la estructura para el ADN que codifica el anticuerpo. (ii) Origen de la multiplicación Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también llamado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, e.g., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) deficiencias auxotrópicas del complemento, en donde el relevante o (c) nutrientes críticos de suministro no se encuentran disponibles a partir del medio complejo. Un ejemplo del esquema de selección utiliza una droga para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transforman con un gen heterólogo que produce una proteína que confiere resistencia a la droga y así sobrevive al régimen de selección. Ejemplos de tal selección dominante utiliza las drogas de neomicina, ácido micofenólico e higro icina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquellos que facilitan la identificación de células competentes para tomar el ácido nucleico del anticuerpo, tal como DHFR, timidita cinasa, metalotionenina-I y _H, preferentemente genes de etalotioneina de primato, adenosina deaminasa, ornitina decarboxilasa, etc. Por ejemplos, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero al cultivar todo lo de los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR tipo silvestre es la línea celular de ovario de hámster Chino (CHO) en la actividad de DHFR (e.g., ATCC CRL-9096) . Alternativamente, las células huésped (particularmente huéspedes tipo silvestre que contienen DHFR endógenos) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, la proteína DHFR tipo silvestre y otro marcador seleccionable tal como aminoglicosida 3' -fosfotransferasa (APH) puede seleccionarse mediante el crecimiento celular en el medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosídico, e.g., canamicina, neomicina o G418. Ver la Patente de E.U. No. 4,965,199. (iv) Componente del promotor Los vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor que se reconoce por el organismo huésped y se enlaza operablemente al ácido nucleido del polipéptido del anticuerpo. Las secuencias del promotor se conocen por eucariotes. Los genes virtualmente aleucarióticos tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases corriente arriba a partir del sitio en donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 70 bases corriente arriba a partir del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de los genes más eucarióticos es una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición del tail poli A al extremo 3 ' de la secuencia de codificación. Tidas estas secuencias se insertan adecuadamente en los vectores de expresión eucarióticos. Se controla la transcripción del polipéptido del anticuerpo a partir de los vectores en las células huésped de mamíferos, por ejemplo mediante los promotores obtenidos a partir de los genomas de virus tales como un virus de polinoma, virus fowlpox, adenovirus (tal como un Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis B y Virus de Simio 40 (SV40) , a partir de promotores de mamífero heterólogos, e.g., el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir de promotores heat-shock proporcionados tal como promotores compatibles con los sistemas de la célula huésped. Los promotores tempranos o tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción SV40 que también contiene el origen viral SV40 de multiplicación. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción Hindi E. Un sistema para expresar ADN en células huéspedes de mamífero utiliza el virus de papiloma bovino como un vector que se describe en la Patente de E.U. No. 4,419,446. Una modificación de este sistema se describe en la Patente de E.U. No. 4,601,978. Ver también Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) en la expresión del ADNc de interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidita cinasa a partir del virus de herpes simple. Alternativamente, el Virus Rous Sarcoma de la repetición a largo término puede utilizarse como el promotor. (v) Componente del elemento mej orador La transcripción de ADN que codifica el polipéptido de anticuerpo de esta invención mediante eucariotes mayores con frecuencia se incrementa al insertar una secuencia mejoradota en el vector. Muchas secuencias mejoradotas ahora se conocen a partir de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina) . Típicamente, sin embargo se puede utilizar un mejorador a partir de un virus de célula eucariótica. Ejemplos incluyen el mejorador SV40 en el último lado del origen de la multiplicación (bp 100-270) , el mejorador del promotor temprano de citomegalovirus, el mejorador de polioma sobre el último lado del origen de la multiplicación y los mejoradotes del adenovirus. Ver también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) en los elementos mejoradores para la activación de promotores eucarióticos. El mejorador puede spliced en el vector en una posición 5' o 3' para la secuencia que codifica el polipéptido del anticuerpo, pero preferentemente se ubica en el sitio 5' a partir del promotor. (vi) Componente de terminación de transcripción Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucarióticas también contendrán típicamente secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias se encuentran comúnmente disponibles a partir de regiones no trasladadas 5' y ocasionalmente 3' de ADNs o ADNcs virales o eucarióticas. Estas regiones contienen segmentos de nucleótido transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no trasladada del ARNm que codifica un anticuerpo. Un componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de hormona del crecimiento bovina. Ver WO94/11026 y el vector de expresión descrito en la presente. (vii) Selección y transformación de células huésped Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores de la presente incluyen las células eucarióticas mayores descritas en la presente, incluyendo células huésped de vertebrado. La propagación de las células de vertebrado en el cultivo (cultivo de tejido) se han vuelto un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embriónico humano (293 o 293 células subclonadas para el crecimiento en al cultivo de la suspensión, Gram. et al., J. Gen Virol 36:59 (1997)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati . Acad. Sci USA 77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (TM4, Mather Biol . Reprod. 23:243-251 (1980); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL 75) ; células de hígado humanas (Hep G2, HB 8065) ; tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci . 383; 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y línea de hematoma humanas (Hep G2) . Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación antes descritos para la producción de anticuerpo y se cultivan en el medio nutriente convencional modificado como apropiado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. (viií) Cultivar las células huésped Las células huésped para producir un anticuerpo de esta invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como los medios Ham's FIO (Sigma), Medio Esencial Mínimo ( (MEM) , (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Dulbecco' s Modified Eagle' s se describen en Ham et al., Meth . Enz . 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Pat. de E.ü. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o Patente de E.U. Re. 30,985 pueden utilizarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios pueden suplementarse como sea necesario con las hormonas y/u otros factores del crecimiento (tal como insulina, transferrina o factor del crecimiento epidérmico) , sales (tal como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , amortiguadores (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como droga de GENTAMYCIN™) , oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en las concentraciones finales en el rango molecular) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro de los suplementos necesarios pueden también incluirse a concentraciones apropiadas que pueden conocerse por loes expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tal como temperatura, pH y lo similar, son aquellas previamente utilizadas con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán aparentes para los expertos ordinarios. (ix) Purificación del anticuerpo Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente o secretarse directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como una primera etapa, se retiran las partículas del particulado, ya sea células huésped o fragmentos lisados por ejemplo mediante centrifugación o ultrafiltración. Cuando se secreta el anticuerpo en el medio, los sobrenadantes a partir de tales sistemas de expresión se concentran generalmente primero utilizando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y pueden incluirse antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes extraños.

La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede purificarse utilizando por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electrofóresis de gel, diálisis y cromatografía por afinidad, siendo la cromatografía por afinidad la técnica de purificación preferida. La adecubilidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de las especies e isotipo de cualquier dominio de inmunoglobulina Fc que se encuentra presente en el anticuerpo. La Proteína A puede utilizarse para purificar anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas ?l, ?2 o ?4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol . Meth . 62:1-13 (1983)). La Proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para ?3 humano (Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). La matriz a la cual se une el ligando de afinidad es con frecuencia agarosa, pero se encuentran disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli (estirenodivinil) benceno permiten las tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que pueden lograrse con la agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteína tales como la fraccionación en una columna de intercambio de ion, precipitación de etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina SEPHAROSE™, cromatografía sobre una resina de intercambio de ion o de catión (tal como columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación de sulfato de amonio también se encuentran disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperarse. Siguiendo cualquier etapa (s) de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes pueden someterse a la cormatografía de interacción hidrofóbica de pH bajo utilizando un amortiguador de levigación a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, preferentemente llevada a cabo a concentraciones bajas de sal (e.g., desde aproximadamente 0-0.25M de sal). Ensayos de Actividad Los anticuerpos de la presente invención pueden caracterizarse por sus propiedades físicas/químicas y funciones biológicas por varios ensayos conocidos en la materia . Las inmunoglobulinas purificadas pueden caracterizarse además por una serie de ensayos incluyendo pero sin limitarse a, secuenciación de N-terminal, análisis de aminoácido, cromatografía líquida de alta presión de tamaño de exclusión sin desnaturalizar (HPLC) , espectrometría de masa, cromatografía de intercambio de ion y digestión de papaína . En ciertas modalidades de la invención, las inmunoglobulinas producidas en la presente se analizan por su actividad biológica. En algunas modalidades, las inmunoglobulinas de la presente invención se prueban por su actividad de unión a antígeno. Los ensayos de unión a antígeno que se conocen en la materia y que pueden utilizarse en la presente incluyen sin limitación cualquier ensayo de unión directo o competitivo utilizando técnicas tales como de inmunotransferencia western, radioinmunoensayos, ELISA (enzima enlazada al ensayo immosorbente) , inmunoensayos "sandwich", ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteína A. Un ensayo de unión de antígeno ilustrativo se proporciona abajo en la sección de Ejemplos. En una modalidad, la presente invención contempla un anticuerpo alterado que posee algo pero no todas las funciones efectoras, que lo hacen un candidato deseable para muchas aplicaciones en la cual la media vida del anticuerpo in vivo es importante aún en ciertas funciones efectoras (tal como complemento y ADCC) que son no necesarias o se borran. En ciertas modalidades, las actividades Fc de la inmunoglobulina producida se miden para asegurar que solo se mantienen las propiedades deseadas. Los ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo pueden conducirse para confirmar la reducción/disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, los ensayos de unión al receptor Fc (FcR) pueden conducirse para asegurar que el anticuerpo carece de la unión Fc?R (aquí igualmente carece de la actividad ADCC) , pero retiene la capacidad de unión FcRn. Las células primarias para mediar ADCC, las células NK, expresan Fc (RUI solo, en vista de que los monocitos expresan Fc(RI, Fc (RII y Fc(RIII. La expresión FcR sobre células he atopoyéticas se resumen en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetech and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Un ejemplo de un ensayo in vitro para valorar la actividad ADCC de una molécula de interés se describe en la Patente de E.U. No.5, 500, 362 o 5,821,337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células de Eliminación Natural (NK) . Alternativa o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede valorarse in vivo, e.g., en un modelo animal tal como aquel descrito en Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Los ensayos de unión Clq pueden también llevarse a cabo para confirmar que el anticuerpo es incapaz de unir Clq y en la presente carece de la actividad CDC. Para valorar la activación del complemento, puede llevarse a cabo un ensayo CDC, e.g., como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996). La unión FcRn y las determinaciones de claridad/media vida in vivo pueden llevarse a cabo también utilizando los métodos conocidos en la materia, e.g., aquellos descritos en la sección de Ejemplos . Anticuerpos Humanizados La presente invención abarca los anticuerpos humanizados. Se conocen en la materia varios métodos para humanizar anticuerpos no humanizados. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede tener uno o más residuos de aminoácido introducidos en desde una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácido no humanos con frecuencia se refieren como residuos de "importación" que se toman típicamente a partir de un dominio variable de "importación". La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), al sustituir las secuencias de región hipervariables para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de E.U. No. 4,816,567) en donde se han sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano mediante la secuencia correspondiente a partir de especies no humanas. En la práctica, los anticuerpos humanizados son anticuerpos típicamente humanos en los cuales algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen mediante residuos a partir de sitios análogos en anticuerpos de roedores . La selección de los dominios variables humanos, tanto ligera como pesada a utilizarse en elaborar los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método así llamado de "mejor-ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se clasifica contra la librería total de las secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que se encuentra más cerca es aquella del roedor que se acepta entonces como la estructura humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al (1993) J. Immunol 151:2296; Chothia et al (1987) J. Mol . Biol . 196:901. Otro método utiliza una estructura particular derivada de la secuencia de concenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de las cadenas ligera y pesada. Esta misma estructura puede utilizarse para varios diferentes anticuerpos humanizados (Cárter et al (1992) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 89:4285: Presta et al (1993) J. Immunol . , 151:2623. Es importante además que los anticuerpos se humanicen con la retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un método, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos conceptuales humanizados utilizando modelos tri-dimensionales de las secuencias parental y humanizada. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales se encuentran comúnmente disponibles y son familiares para aquellos expertos en la materia. Se encuentran disponibles programas de computadora que ilustran y despliegan estructuras conformacionales tri-dimensionales probables de las secuencias de inmunoglobulina candidato seleccionadas. La inspección de estos despliegues permite el análisis de rol similar de los residuos en el funciionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato. En esta forma, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias del recipiente y de importación por lo que se logran las características del anticuerpo deseadas, tal como afinidad incrementada para el (los) antígeno (s) objetivo. En general, los residuos de la región hipervariable son directamente y más sustancialmente involucrados con la unión de antígeno influenciante. Variantes de Anticuerpo En un aspecto, la invención proporciona un fragmento de anticuerpo que comprende modificaciones en la interfaz de los polipéptidos Fc que comprende la región Fc, en donde las modificaciones facilitan y/o promueven la heterodimerización. Estas modificaciones comprenden la introducción de una protuberancia en un primer polipéptido Fc y una cavidad en un segundo polipéptido Fc, en donde la protuberancia es posicionable en la cavidad a fin de promover la complexión del primero y segundo polipéptidos Fc. Los métodos para generar anticuerpos con estas modificaciones se conocen en la materia, e.g., como se describe en la Patente de E.U. No. 5,731,168. En algunas modalidades, se contemplan la(s) modificación (es) de la secuencia de aminoácido de los anticuerpos descritos en la presente. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencia de aminoácido del anticuerpo se preparan al introducir cambios de nucleótidos apropiadas en el ácido nucleico del anticuerpo o mediante síntesis de péptido. Tales modificaciones incluyen por ejemplo, omisiones desde y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácido del anticuerpo. Cualquier combinación u omisión, inserción y sustitución se hace para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Las alteraciones de aminoácido pueden introducirse en la secuencia de aminoácido del anticuerpo sujeto a la vez que se hace la secuencia. Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se llaman "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Aquí, se identifica un residuo o grupo de residuos objetivo (e.g., residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan mediante un aminoácido neutral o cargado negativamente (más preferentemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Aquellas ubicaciones de aminoácido demuestran la sensibilidad funcional para las sustituciones que se definen entonces al introducir variantes adicionales u otras o para los sitios de sustitución. Así, mientras se predetermina el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácido, la naturaleza de la mutación per se no necesita predeterminarse. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, se conduce la mutagénesis de exploración o aleatoria de ala en el codón o región objetivo y las inmunoglobulinas expresadas se clasifican para la actividad deseada . Las inserciones de la secuencia de aminoácido incluyen fusiones amino- y/o carboxil-terminal que varían en longitud a partir de un residuo para polipéptidos que contienen cien o más residuos así como inserciones de intrasecuencia de residuos de aminoácido sencillos o múltiples. Ejemplos de inserciones de terminal incluyen un anticuerpo con un residuo metionil de N-terminal o el anticuerpo fusionado con un polipéptido citotóxico. Otras variantes insercionales de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión a la terminal N- o C- del anticuerpo hacia una enzima (e.g., para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la media vida del suero del anticuerpo. Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo reemplazada por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan las alteraciones FR. Las sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 2 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, los cambios más sustanciales denomidados "sustituciones ejemplificativas" en la Tabla 2 o como se describe además abajo con referencia a las clases de aminoácidos, pueden introducirse y clasificarse los productos . TABLA 2 Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se llevan a cabo mediante la selección de sustituciones que difieren significativamente en su efecto en mantener (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de sustitución por ejemplo, como una conformación de hoja o de hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio de objetivo o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Residuos que ocurren de forma natural que se dividen en grupos en base a las propiedades de cadena lateral comunes. (1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílico neutral: cys, ser, thr; (3) acídico: asp, glu; (4) básico: asn, gln, his, lys, arg; (5) aromático: trp, tyr, phe. Las sustituciones no conservativas ocasionarán intercambiar un miembro de una de estas clases para otra clase . Un tipo de variante sustitutiva implica sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo original (e.g., anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante (s) resultante (s) seleccionadas para desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación al anticuerpo original a partir del cual se generaron. Una forma conveniente para generar tales variantes sustitutivas implica la maduración por afinidad utilizando el despliegue de fago. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (e.g., 6-7sitios) se maduran para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Los anticuerpos así generados se despliegan a partir de partículas de fago filamentoso como fusiones al producto de gen III de M13 empacados dentro de cada partícula. Las variantes desplegadas por fago se seleccionan entonces por su actividad biológica { e . g. , afinidad de unión) como se describe en la presente. A fin de identificar los sitios de región hipervariable candidatos para modificación, puede llevarse a cabo la mutagénesis de selección de alanina para identificar los residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente al enlace del antígeno. Alternativamente, o de manera adicional, puede ser benéfico analizar una estructura de cristal del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de contacto y residuos cercanos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que tales variantes se generan, el panel de variantes se somete a examen como se describe en la presente y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para desarrollo adicional. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la materia. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos que se presentan de manera natural) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio) , mutagénesis de PCR y mutagénesis de cásete de una variante anteriormente preparada o una versión no variante del anticuerpo. Puede ser deseable introducir una o más modificaciones de aminoácidos en una región Fc d elos polipéptidos de inmunoglobulina de la invención, generando mediante esto una variante de región Fc. La variante de región Fc puede comprender una secuencia de región Fc humana ( e . g. , una región Fc de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (e.g., una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos que incluyen la de una cisteina de articulación. De acuerdo con esta descripción y las enseñanzas de la técnica, se contempla que en algunas modalidades, un anticuerpo utilizado en los métodos de la invención puede comprender una o más alteraciones en comparación al anticuerpo contraparte tipo silvestre, e . g. , en la región Fc. Estos anticuerpos no obstante retendrían sustancialmente las mismas características requeridas para utilidad terapéutica en comparación a su contraparte tipo silvestre. Por ejemplo, se considera que pueden hacerse ciertas alteraciones en la región Fc que darían como resultado la unión Clq alterada (i.e., ya sea mejorada o disminuida) y/o Citotoxicidad Dependiente del Complemento (CDC), e . g. , como se describe en W099/51642. Ver también Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); la Patente de E.ü. No. 5,648,260; la Patente de E.U. No. 5,624,821 y W094/29351 concernientes a otros ejemplos de las variantes de región Fc. Inmunoconjugados La invención también pertenece a inmunoconjugados o conjugados de droga-anticuerpo (ADC) que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, una droga, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (e.g., una toxina enzimáticamente activa de origen bacterial, fungal, de vegetal o animal o fragmentos de los mismos), o un isótopo radioactivo (i.e., un radioconjugado) . El uso de conjugados de anticuerpo-droga para el suministro local de agentes de citotoxicidad o citostáticos, i.e., drogas para eliminar o inhibir células tumorales en el tratamiento del cáncer (Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172; Patente de E.U. 4,975,278) teroricamente permite el suministro dirigido del residuo de droga a los tumores y la acumulación intracelular en el mismo, en donde la administración sistémica de estos agentes de droga no conjugados pueden dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad a las células normales así como a las células tumorales que se pretende eliminar (Baldwin et al . , (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986) : 603-05; Torpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" ("Portadores de Anticuerpos de Agentes Citotóxicos En Terapia de Cáncer: Una Revisión") , en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al . , (ed.s), pp. 475-506). Se pretende mediante esto la máxima eficacia con toxicidad mínima. Tanto los anticuerpos policlonales como los anticuerpos monoclonales se han reportado comj útiles en estas estrategias (Rowland et al . , (1986) Cáncer Immunol . Immunother., 21:183-87). Las drogas utilizadas en estos métodos incluyen daunomicina, doxorubicina, methotrexato y vindesina (Rowland et al . , (1986) supra) . Las toxinas utilizadas en conjugados de anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacteriales tales como toxina de difteria, toxinas de plantas tales como ricina, toxinas de molécula pequeña tales como geldanamicina (Mandler et al . , (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al . , al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al . , (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), y calicheamicina (LODE et al . , (1998) Cáncer Res. 58:2928; Hinman et al . , (1993 Cáncer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden efectuar sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen la unión de tubulina, la unión de ADN o la inhibición de la topoisomerasa. Algunas drogas citotóxicas tienden a ser inactivas o menos activas cuando se conjugan a grandes anticuerpos o ligandos receptores de proteínas. ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) es un conjugado de anticuerpo-radioisótopo compuesto de un anticuerpo monoclonal kappa de IgGl murina dirigido contra el antígeno CD20 encontrado en la superficie de linfocitos B normales y malignos y un radioisótopo 1:L1In o 90Y unido por un enlazador-quelador de tiourea (Wiseman et al . , (2000)Eur. Joue. Nucí. Med. 27 (7) : 766-77; Wiseman et al . , (2000) Blood 99(12) :4336-42; Witzig et al . , (2002) J. Clin. Oncol. 20(10) :2453-63; Witzig et al . , (2002) J. Clin. Oncol. 20 (15) :3262-69) . Aunque ZEVALIN tiene actividad contra Linfoma no de Hodgkin de célula B (NHL) , la administración da como resultado severas y prolongadas citopenias en la mayoría de los pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicin, Wyeth Pharmaceuicals) , un conjugado de anticuerpo droga compuesto de un anticuerpo huCD33 enlazado a calicheamicina, se aprobó en 2000 para el tratamiento de leucemia mielide aguda meiante inyección (Drugs od the Future (2000) 25(7): 686; Patentes de E.ü. Nos. 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001) . Cantuzumab mertansin (Immunogen, Inc.), Un conjugado de anticuerpo droga compuesto del anticuerpo huC242 enlazado a través del enlazador de disulfuro SPP al residuo de droga maitansinoide, DMI, se promueve hacia ensayos de Fase II para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, tales como el de colon, pancriático, gástrico y otros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.) un conjugado de anticuerpo droga compuesto del anticuerpo monoclonal de antígeno específico de membrana anti-próstata (PSMA) enlazado al esiduo de droga maitansinoide, DMI, se encuentra bajo desarrollo para el tratamiento potencial de tumores de próstata. Los péptidos de auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE) , análogos sintéticos de dolastatina, se conjugaron a anticuerpos monoclonales quimérios cBR96 (específico para Lewis Y en carcinomas) y cAClO (específico para CD30 en malignidades hematológicas) (Doronina et al . , (2003) Nature Biotechnology 21 (7) : 778-784) y se encuentran bajo desarrollo terapéutico. Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados se han descrito en lo anterior. Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden utilizarse incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos sin unión de toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena A ricina, cadena A abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogellina, restricticina, fenomicina, enomicina y tricotecenos . Ver, e.g., WO 93/21232 publicada el 28 de octubre de 1993. Se encuentra disponible una variedad de radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados . Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y del agente citotóxico se elaboran utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl) , esteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p- azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como tolueno 2, 6-diisocianato) , y compuestos de bis- flúor activo (tales como 1, 5-difluor-2, 4-dinitrobenceno) .

Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al . , Science, 238: 1098 (1987). Un agente quelante ejemplificativo es ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminopentaacético etiquetado con Carbono-14 (MX-DTPA) para la conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026. Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como una calicheamicina, maitansinoides, una trichoteceno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se contemplan en la presente. Maitansina y maitansinoides En una modalidad un anticuerpo (de longitud total o fragmentos) de la invención se conjuga a una o más moléculas maitansinoides.

Los maitansinoides son inhibidores mitotóticos que actúan al inhibir la polimerización de la tubulina. La maitansina se airló primero a partir de Maytenus serrata de arbusto de África del Este (Patente de E.U. No. 3,896,111). Subsecuentemente se descubrió que ciertos microbios tabién producen maitansinoides, tales como esteres de maitansinol y maitansinol C-3 (Patente de E.U. No. 4,151,042). El maitansinol sintético y los derivados y análogos de los mismos se describen, por ejemplo, en las Patentes de E.U. Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663 y 4,371,533, las descripciones de las cuales se incorporan expresamente en la presente mediante la referencia. Conjugados de maitansinoide-anticuerpo En un intento para mejorar su índice terapéutico, la maitansina y los maitansinoides se han conjugado a anticuerpos que se enlazan específicamente a antígenos celulares de tumor. Los inmunoconjugados que contienen maitansinoides y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en las Patentes de E.U. Nos. 5,208,020; 5,416,064 y la Patente Europea EP 0 425 235 Bl, las descripciones de las cuales se incorporan expresamente en la presente mediante la referencia. Liu et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8618- 8623 (1996) describe inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide designado DMI enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cáncer colorectal humano. El conjugado se encontró ser altamente citotóxico hacia células de cáncer de colon cultivadas y mostró actividad antitumor en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo. Cari et al . , Cáncer Research 52:127-131 (1992) describe inmunoconjugados en los cuales un maitansinoide se conjugó a través de un enlazador de disulfuro al anticuerpo murino A7 que se enlaza a un antígeno en líneas celulares de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino TA.l que enlaza el oncogen HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado maitansinoide TA.l se probó in vitro en la línea celular de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antígenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado de droga logró un grado de citotoxicidad similar al de la droga sin maitansinoide, que pudiera incrementarse al incrementar el número de moléculas de maitansinoides por molécula de anticuerpo. El conjugado de A7-maitansinoide mostró baja citotoxicidad sistémica en ratones. Conjugados de Anticuerpo- maytansinoide (inmunoconjugados) Los conjugados de anticuerpo-maitansinoide se preparan al enlazar químicamente un anticuerpo a una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica de cualquiera el anticuerpo o la molécula de maitansinoide. Un promedio de 3-4 moléculas de maitansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha mostrado eficacia para mejorar la citotoxicidad de las células objetivo sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo, aunque incluso una molécula de toxina/anticuerpo se esperaría que mejorara la citotoxicidad durante el uso de anticuerpo puro. Los maitansinoides son muy conocidos en la técnica y pueden sintetizarse por técnicas conocidas o aislarse a partir de fuentes naturales. Los maitansinoides adecuados se describen por ejemplo en la Patente de E.U. No. 5,208,020 y en otras patentes y publicaciones no de patentes referidas en lo anterior. Los maitansinoides preferidos son maitansinoides y análogos de maitansinoides modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula maitansinoide, tal como diversos esteres de maitansinol. Existen muchos grupos enlazadores conocidos en la técnica para elaborar los conjugados de anticuerpo-maitansinoide, incluyendo , por ejemplo las descritas en la Patente de E.U. 5,208,020 o la Patente de EP 0 425 235 Bl, y Cari et al . , Cáncer Research 52:127-131 (1992). Los grupos enlazadores incluyen grupos de disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles al ácido, grupos fotolábiles, grupos lábiles a la peptidasa o grupos lábiles a estearasa, como se describe en las patentes antes identificadas, prefiriéndose los grupos de disulfuro y tioéter. Los conjugados del anticuerpo y maitansinoide pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N- succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexáno-1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipi idato HCl) , esteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como tolueno 2, 6-diisocianato) , y compuestos de bis-flúor activo (tales como 1, 5-difluor-2, 4-dinitrobenceno) . Agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al . , Biochem. J. 173:723-737) [1978]) y N-succinimidil-4- (2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace de disulfuro. El enlazador puede unirse a la molécula del maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, puede formarse un enlace de éster mediante la reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales . La reacción puede ocurrir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupohidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol . Calicheamicina Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo conjugado a una o más moléculas de calicheamicina. La familia de antibióticos de calicheamicina son capaces de producir separaciones de ADN bicatenario a concentraciones sub-picomolar . Para la preparación de conjugados de la familia de calicheamicina, ver las Patentes de E.U. Nos. 5,712,374; 5,714,586; 5,739,116; 5,767,285; 5,770,701; 5,770,710; 5,773,001; 5,877,296 (todas de American Cyanamide Company) . Análogos estructurales de calicheamicina que pueden utilizarse incluyen pero no se limitan a ?i1, a2I, a.31, N-acetil-?!1, PSAG y ?1! (Hinman et al . , Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al . , Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las Patentes de E.U. anteriormente mencionadas para American Cyanamid) . Otra droga anti-tumor a la que el anticuerpo puede conjugarse es QFA que es un antifolato. Tanto la calicheamicina como QFA tienen sitios intracelulares de acción y no cruzan fácilmente la membrana de plasma. Por lo tanto, la absorción celular de estos agentes a través del anticuerpo mediada por internalización mejora grandemente sus efectos citotóxicos. Otros agentes citotóxicos Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse a los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracil, la familia de agentes colectivamente conocidos como Complejo LL-E33288 descritos en las Patentes de E.U. 5,053,394; 5,770,710, así como las esperamicinas (Patente de E.U. 5,877,296). Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden utilizarse incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos sin unión de toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena A ricina, cadena A abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogellina, restricticina, fenomicina, enomicina y tricotecenos . Ver, e.g., WO 93/21232 publicada el 28 de octubre de 1993. La presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (e.g., una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como una desoxiribonucleasa; DNasa) . Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Se encuentra disponible una variedad de isótopos radioactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados . Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re185, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el conjugado se utiliza para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo tc99m o 1123, o una etiqueta de espín para representación de imágenes de resonancia magnética nuclear (NMR) (también conocida como imagenología de resonancia magnética, mri) , tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Las etiquetas de radio u otras pueden incorporarse en el conjugado en las formas conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o pueden sintetizarse mediante síntesis química de aminoácidos utilizando los precursores de aminoácido adecuados que implican, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Las etiquetas tales como tc99m o I123, Re186, Re188 e In111 pueden unirse a través de un residuo de cisteina en el péptido. Puede unirse itrio-90 a través de un residuo de lisina. El método IODOGEN (fraker et al . , (1978) Biochem. Biophys. Res. Común. 80:49-57 puede utilizarse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" ("Inmunoescintigrafía de Anticuerpos Monoclonales ") (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexáno-1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl) , esteres activos (tales comodisuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como tolueno 2, 6-diisocianato) , y compuestos de bis-flúor activo (tales como 1, 5-difluor-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al . , Science, 238: 1098 (1987). Un agente quelante ejemplificativo es ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminopentaacético etiquetado con Carbono-14 (MX-DTPA) para la conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador de desdoblamiento" que facilita la liberación de la droga citotóxica en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazador lábil al ácido, un enlazador sensible a peptidasa, un enlazador fotolabil, un enlazador de dimetilo o un enlazador que contiene disulfuro (Chari et al . , Cáncer Research 52:127-131 (1992); Patente de E.U. No. 5,208,020) . Los compuestos déla invención contemplan expresamente, pero no se limitan a ADC preparado con reactivos reticuladores: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB Y SVSB (succinimidil- (4-vinilsulfona) (benzoato) que se encuentran comercialmente disponibles (e.g., a partir de Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL., E.U.A.). Ver las páginas 467-498, 2003-2004 de Applications Handbook and Catalog. Preparación de conjugados de anticuerpo droga En los conjugados de anticuerpo droga (ADC) de la invención, se conjuga un anticuerpo (Ab) a uno o más residuos de droga (D) , e.g., de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 residuos de droga por anticuerpo, a través de un enlazador (L) . El ADC de la Fórmula 1 puede prepararse por varias rutas, que emplean reacciones, condiciones y reactivos de química orgánica conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen: (1) la reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un reactivo enlazador bivalente, para formar Ab-L, a través de una unión covalente, seguida por la reacción con un residuo de droga D; y (2) la reacción de un grupo nucleofílico de un residuo de droga con un reactivo enlazador bivalente, para formar D-L, a través deuna unión covalente, seguida por la reacción con el grupo nucleófilo de un anticuerpo. Ab-(L-D) 1 Los grupos de nucleófilos sobre anticuerpos incluyen, pero no se limitan a: (i) N-grupos amina terminal, (ii) grupos amina de cadena lateral, e.g., lisina, (iii) grupos tilo de cadena lateral, e.g., cisteina, y (iv) grupos hidroxilo de azúcar o amino en donde el anticuerpo es glicosilado. Los grupos amina, tilo e hidroxilo son nucleofílicos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos sobre residuos enlazadores y reactivos enlazadores que incluyen: (i) esteres activos tales como esteres NHS, esteres HOBt, haloformatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) grupos de aldehidos, cetonas, carboxilo y maleimida. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros reducibles de intercadena, i . e . , puentes de cisteina. Los anticuerpos pueden elaborarse reactivos para la conjugación con reactivos enlazadores mediante el tratamiento con un agente de reducción tal como DTT (ditiotreitol) . Cada puente de cisteina formará así, teóricamente, dos nucleófilos de tiol reactivos . Los grupos nucleófilos adiconales pueden introducirse en anticuerpos a través de la reacción de usinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) dando como resultado la conversión de una amina en un tiol. Los conjugados anticuerpo droga de la invención también pueden producirse mediante la modificación del anticuerpo para introducir residuos electrofílicos, que pueden reaccionar con sustituyentes nucleofílicos sobre el reactivo o droga enlazadores. El azúcar de los anticuerpos glicosilados pude oxidarse, e.g., con reactivos que oxidan el periodato, para formar grupos de aldehido o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina o reactivos enlazadores o residuos de droga. Los grupos de base de Schiff de imina resultantes pueden formar un enlace estable o pueden reducirse, e.g., mediante reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. En una modalidad, la reacción de la porción de carbohidrato de un anticuerpo glicosilado con cualquiera de glactosa oxidasa o meta-periodato de sodio pueden producir grupos carbonilo (aldehido y cetona) en la proteína que puede reaccionar con grupos apropiados sobre la droga (Hermanson, Bioconjugate Techniques) . En otra modalidad, las proteínas que contienen residuos de serina o treonina N-terminal pueden reaccionar con meta-periodato de sodio, dando como resultado la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852) . Tal aldehido puede reaccionar con un residuo de droga o nucleófilo enlazador.

De igual modo, los grupos nucleofílicos sobre un residuo de droga incluyen, pero no se limitan a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidracida, oxima, hidracina, tiose icarbazona, carboxilato de hidracina y arilhidracida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos sobre residuos enlazadores y reactivos enlazadores que incluyen: (i) esteres activos tales como NHS esteres, HOBt esteres, haloformatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo tales como haloacetamidas; (iii) grupos de aldehidos, cetonas, carboxilo y maleimida. Alternativamente, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y un agente citotóxico puede elaborarse, e.g., mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptido. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado ya sea adyacentes entre sí o separados por una región que codifica al péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado. En Aún otra modalidad, el anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para su utilización en pre-objetivo tumoral en donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por el retiro del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente de depuración y después la administración de un "ligando" (e.g., avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (e.g., un radionucleótido). Derivados de Anticuerpo Los anticuerpos de la presente invención pueden modificarse adicionalmente para contener residuos adicionales de no-proteinaceos que se conocen en la técnica y se encuentran fácilmente disponibles. Preferentemente, los residuos adecuados para la derivación del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a polietilén glicol (PEG) , copolímeros de etilén glicol/propilén glicol, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinil alcohol, polivinil pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1, 3, 6-trioxano, copolímero de etiléno/anhídrido maléico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli(n-vinil pirrolidona) polietilén glicol, homopolímeros de propilén glicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (e.g., glicerol), polivinil alcohol y mezclas de los mismos. El polietilén glicol propionaldehído puede tener ventajas en la elaboración debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y si se unen más de un polímero, pueden ser las mismas o diferentes moléculas. En general, el número y/o tipo de polímeros utilizados para la derivación puede determinarse en base a consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades particulares o funciones del anticuerpo a mejorarse, si el derivado de anticuerpo se utilizará en una terapia bajo condiciones definidas, etc. Especificidad del Antigeno La presente invención es aplicable a los anticuerpos de cualquier especificidad de unión a antígeno apropiada. Preferentemente, los anticuerpos utilizados en los métodos de la invención son específicos para los antígenos que son polipéptidos biológicamente importantes . Más preferentemente, los anticuerpos de la invención son útiles para terapia o diagnóstico de enfermedades o trastornos en un mamífero. Los anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a anticuerpos de bloqueo, anticuerpos agonistas, anticuerpos de neutralización o conjugados de anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de anticuerpos terapéuticos incluyen anticuerpos anti-c-met, anti-VEGF, anti-IgE, anti-CDll, anti-CDld, antiCD40, factor anti-tejido (TF) , anti-her2 Y ANTI-TrkC. También se contemplan los anticuerpos dirigidos contra antígenos no polipéptidos (tales como antígenos de glicolípidos asociados al tumor) . Cuando el antígeno es un polipéptido, puede ser una molécula transmembrana (e.g., receptor) o un ligando tal como un factor de crecimiento. Antígenos ejemplificativos incluyen moléculas tales como renina; una hormona de crecimiento, incluyendo la hormona del crecimiento humano y la hormona del crecimiento bovino; factor de liberación de la hormona del crecimiento; hormona paratiroidea; hormona que estimula la tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona que estimula el folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como el factor VIIIC, factor IX, factor de tejido (TF) y factor von Willebrands; factores anti-coagulación tales como Proteína C; factor natriurético atrial; surfactante pulmonar; activador plasminógeno, tal como urocinasa u orina humana o activador plasminógeno tipo tejido (t-PA) ; bombesina, trombina; factor del crecimiento hemopoiético; factor alfa y beta de necrosis tumoral; encefalinasa; RANTES (célula T expresada y secretata regulada en la activación normalmente) ; proteína inflamatoria de macrófago humano (MIP-1-alfa) ; albúmina de suero tal como albúmina de suero humano; sustancia de inhibición Muellerian; Cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbial, tal como beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado al linfocito T citotóxico (CTLA) , tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor del crecimiento endotelial vascular (VEGF) ; receptores para hormonas o factores del crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como el factor neurotrófico derivado óseo (BDNF) , neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT- 6) , o un factor del crecimiento nervioso tal como NGF-ß; factor del crecimiento derivado de plaqueta (PDGF) ; factor del crecimiento de fibroblastos tales como aFGF Y bFGF; factor del crecimiento epidérmico (EGF) ; factor del crecimiento de transformación (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-ßl, TGF-ß2, TGF-ß3, TGF-ß4, 0 TGF-ß5; factor-I y factor-II del crecimiento similar a insulina (IGF-I e IGF-II) ;des (l-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro), proteínas de unión del factor de crecimiento similar a insulina; proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD9, CD20 y CD40; eritropoietina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP) ; un interferón tal como interferón-alfa, -beta, y -gama; factores de estimulación de colonia (CSFs), e.g., interleucinas M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; (ILs), e.g., IL-i a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de célula T; proteínas de membrana de superficie; factor que acelera el deterioro; antígeno viral tal como por ejemplo una porción de la envoltura de HIV; proteínas de transporte; receptores autodirigidos; direccionadores; proteínas reguladoras; integrinas tales como CDlla, CDllb, CDllc, CD18, un ICAM, VLA-4 y VCAM; un tumor asociado con el antígeno tal como el receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos de cualquiera de los péptidos listados arriba. Los antígenos para los anticuerpos abarcados por una modalidad de la presente invención incluyen proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 y CD46; los miembros de la familia del receptor ErbB tal como el receptor EGF, HER2, HER3 o el receptor HER4; las moléculas de adhesión celular tales como LFA-1, Macl, pl50.95, VLA-4, ICAM-1, la integrina a4/ß7y la integrina av/ß3 incluyendo ya sea subunidades a o ß de las mismas (e.g., anticuerpos anti-CDlla, anti-CD18 o anti-CDllb) ; factores del crecimiento tales como VEGF; factor de tejido (TF) ; TGF-5; interferón alfa (V-IFN) ; una interleucina tal como IL-8; IgE; antígenos del grupo sanguíneo Apo2, receptor de muerte; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB) ; receptor mpl; CTLA-4; proteína C etc. En algunas modalidades, los objetivos de la presente son VEGF, TF, CD19, CD20, CD40, TGF-?, CDlla, CD18, Apo2 y C24. En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención es capaz de unir específicamente a un antígeno de tumor. En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención es capaz de unir específicamente a un antígeno de tumor en donde el antígeno de tumor no es un factor de diferenciación cluster (i.e., una proteína CD) . En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención es capaz de unir específicamente a una proteína CD. En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención es capaz de unir específicamente a una proteína CD diferente a CD3 o CD4. En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención es capaz de unir específicamente a una proteína CD diferente a CD19 o CD20. En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención es capaz de unir específicamente a una proteína CD diferente a CD40. En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención es capaz de unir específicamente a CD19 o CD20. En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención es capaz de unir específicamente a CD40. En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención es capaz de unir específicamente a CD11. En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención se une a un antígeno que no se expresa en una célula inmune. En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención se une a un antígeno que no se expresa en las células T. En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención se une a un antígeno que no se expresa en las células B. En una modalidad, un anticuerpo de la invención es capaz de unir específicamente a un factor regulador sobreviviente celular. En algunas modalidades un anticuerpo de la invención es capaz de unir específicamente a un factor regulador de proliferación celular. En algunas modalidades un anticuerpo de la invención es capaz de unir específicamente a una molécula involucrada en la regulación del ciclo celular. En otras modalidades, un anticuerpo de la invención es capaz de unir específicamente a una molécula involucrada en el desarrollo del tejido o la diferenciación celular. En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención es capaz de unir específicamente a una molécula de superficie celular. En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención es capaz de unir a un antígeno de tumor que no es un polipéptido del receptor de superficie celular. En una modalidad, un anticuerpo de la invención es capaz de unir específicamente a una linfocina. En otra modalidad, un anticuerpo de la invención es capaz de unir específicamente a una citosina. En una modalidad, los anticuerpos de la invención son capaces de unir específicamente a una molécula involucrada en la vasculogénesis . En otra modalidad, los anticuerpos de la invención son capaces de unir específicamente a una molécula involucrada en la angiogénesis . Los antígenos solubles o fragmentos de los mismos, opcionalmente conjugados hacia otras moléculas, pueden utilizarse como inmunógenos para la generación de anticuerpos. Para las moléculas de transmembrana, tales como los receptores, fragmentos de estas moléculas (e.g., el dominio extracelular de un receptor) pueden utilizarse como el inmunógeno. Alternativamente, las células que expresan la molécula de transmembrana pueden utilizarse como el inmunógeno. Tales células pueden derivarse a partir de una fuente natural (e.g., líneas celulares cancerígenas) o pueden ser células que se han transformado mediante técnicas recombinantes para expresar la molécula de transmembrana. Otros antígenos y formas de los mismos útiles para preparar anticuerpos serán aparentes para aquellos en la materia. Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas que comprenden un anticuerpoo de la invención se preparan para almacenamiento al mezclar el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores opcionales fisiológicamente aceptables {Remington s Pharmaceutical Sciences 16ava edición, Osol, A.Ed. (1980) ) , en la forma de soluciones acuosas, for, ilaciones lifolizadas u otras secas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los recipientes en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; los antioxidantes incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro debenzalconio; cloruro de bencetonio; alcohol de fenol, butilo o bencilo; parabenos de alquilo tales como paraben metil o propil; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos9; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, aspargina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes de quelación tales como EDTA; azúcares tales como sucrosa, manitol, trealosa o sorbitol; iones contadores que forman sal tales como sodio; complejos metálicos (e.g., complejos de proteína Zn) ; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilen glicol (PEG) . La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular a tratarse, preferentemente aquella con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Tales moléculas se encuentran adecuadamente presentes en combinación con las cantidades que son efectivaspara el propósito intentado. Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcásulas preparadas por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplohidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsula de poli- (metilmetacilato) respectivamente, en sistemas de liberación de droga coloidal (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano- partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington '' s Pharmaceutical Sciences 16 ava edición, Osol. A. Ed. (1980) . Las formulaciones a utilizarse para administración in vivo deben ser estériles . Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles . Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la inmunoglobulina de la invención, cuyas matrices se encuentran en la forma de artículos formados, e.g., películas o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (vinilalcohol) ) , polilactidas (Pat. De E.U. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, etilen-vinil acetato no degradable, polímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y leuprolida acetato) y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Mientras los polímeros tales como etilen-vinil acetato y ácido láctico-ácido glicólico facilitan la liberación de moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por periodos de tiempo más cortos . Cuando las inmunoglobulinas encapsuladas permanecen en el cuerpo por un largo tiempo, pueden desnaturalizar o agregar como un resultado de la exposición a la mezcla a 37 °C, resultando en un pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Las estrategias racionales pueden idearse para la estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre para ser la formación de unión S-S intermolecular a través del intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse al modificar los residuos de sulfidrilo, lofilizando a partir de soluciones acídicas, controlando en contenido de la mezcla, utilizando ditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz de polímero específico. Usos Una inmunoglobulina de la presente invención puede utilizarse en por ejemplo, métodos terapéuticos in vitro, ex vivo e in vivo . La invención proporciona varios métodos en base a utilizar fragmentos de anticuerpo monovalentes que tienen propiedades superiores comparadas con los anticuerpos monovalentes convencionales. En ciertas condiciones patológicas, es necesario y/o deseable utilizar anticuerpos monovalentes. También, en algunas instancias, un anticuerpo terapéutico puede efectuar su acción terapéutica sin involucrar actividades mediadas por el sistema inmune, tal como las funciones efectoras ADCC, fagocitosis y CDC. En tales situaciones, es deseable generar formas de anticuerpos en los cuales tales actividades se reducen o eliminan sustancialmente. También es ventajoso si el anticuerpo es de una forma que pueda hacerse eficientemente y con alta producción. La presente invención proporciona estos anticuerpos, que pueden utilizarse para una variedad de propósitos, por ejemplo como terapéuticos, profilácticos y diagnósticos. Por ejemplo, la invención proporciona métodos para tratar una enfermedad, comprendiendo dichos métodos administrar a un sujeto en necesidad de tratamiento un fragmento de anticuerpo altamente estable que comprende un brazo de unión a antígeno sencillo, por medio de lo cual se trata la enfermedad. Cualquiera de los fragmentos de anticuerpo de la invención descrito en la presente puede utilizarse en métodos terapéuticos descritos en la presente (o profilácticos o de diagnóstico) . Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse como un antagonista para bloquear parcial o completamente la actividad de antígeno específica in vitro, ex vivo y/o in vivo . Además, al menos algunos de los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para inhibir una actividad de antígeno específica, e.g., en un cultivo celular que contiene el antígeno, en sujetos humanos o en otros sujetos mamíferos que tienen el antígeno con el cual un anticuerpo de la invención reacciona en cruce (e.g., chimpancé, mandril, tití, cynomolgus y rhesus, puerco o ratón) . En una modalidad, el anticuerpo de la invención puede utilizarse para inhibir actividades de antígeno al contactar el anticuerpo con el antígeno por lo que se inhibe esta actividad de antígeno. En una modalidad, un anticuerpo de la invención puede utilizarse en un método para inhibir un antígeno en un sujeto que sufre de un desorden en el cual la actividad de antígeno es perjudicial, comprendiendo administrar al sujeto un anticuerpo de la invención tal que se inhibe la actividad de antígeno en el sujeto. Alternativamente, el sujeto puede ser un mamífero que expresa el antígeno con el cual se une un anticuerpo de la invención. Aún además, el sujeto puede ser un mamífero en el cual se ha introducido el antígeno (e.g., mediante la administración del antíegno o mediante la expresión de una transgen de antígeno) . Un anticuerpo de la invención puede administrarse a un sujeto humano para propósitos terapéuticos. Además, un anticuerpo de la invención puede administrarse a una mamífero no humano que expresa un antígeno con el cual reacciona en cruce la inmunoglobulina (e.g., un primate, puerco o ratón) para propósitos veterinarios o como un modelo animal de la enfermedad humana. Con respecto a lo último, tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar las eficacia terapéutica de anticuerpos de la invención (e.g., probar dosis y cursos de tiempo de administración) . Los anticuerpos de bloqueo de la invención que son terapéuticamente útiles incluyen por ejemplo pero no se limitan a anticuerpos de anti-c-met, anti-VEGF, anti-IgE, anti-CDll, factor de anti-interferón y de anti-tejido. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para tratar, inhibir, retardar la progresión de prevenir/retardar la recurrencia de, mejorar o prevenir enfermedades, trastornos o condiciones asociadas con la expresión y/o actividad anormal de una o más moléculas de antígeno, incluyendo pero sin limitarse a tumores malignos y benignos; non-leucemias y malignidades linfoides; trastornos neuronales, gliales, astrocitales, hipotalá icos y otros glandulares, macrófagos, epiteliales, estromales y blastocoélicos; y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos . En un aspecto, un anticuerpo de bloqueo de la invención es específico a un antígeno de ligando e inhibe la actividad de antígeno al bloquear o interferir con la interacción del ligando-receptor que involucra el antígeno de ligando, inhibiendo por lo tanto la trayectoria de la señal correspondiente y otros eventos moleculares o celulares. La invención también caracteriza los anticuerpos específicos del receptor que no necesariamente evitan la unión de ligando pero interfieren con la activación del receptor, inhibiendo por lo tanto cualquier respuesta que pueda iniciarse normalmente mediante la unión al ligando. La invención también abarca anticuerpos que ya sea preferente o exclusivamente unen a complejos de ligando-receptor. Un anticuerpo de la invención también puede actuar como un agonista de un receptor a antígeno particular, potenciando por lo tanto, mejorando o activando ya sea todas o parte de las actividades de la activación del receptor mediado por el ligando. En ciertas modalidades, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico que se administra a un paciente. En algunas modalidades, el inmunoconjugado y/o antígeno al cual este se une es/se internalizan por la célula, resultando en la eficacia terapéutica incrementada del inmunocon ugado en eliminar la célula objetivo a la cual se une. En una modalidad, el agente citotóxico objetiva o interfiere con el ácido nucleico en la célula objetivo. Ejemplos de tales agentes citotóxicos incluyen cualquiera de los agentes quimioterapéuticos anotados en la presente (tal como maitansinoide o una caliqueamicina) , un isótopo radioactivo o una ribonucleasa o endonucleasa de ADN. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse ya sea solos o en combinación con otras composiciones en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede co-administrarse con otro anticuerpo, los agentes quimioterapeúticos (incluyendo cocteles de agentes quimioterapéuticos), otros agentes citotóxicos, agentes anti-angiogénicos, citocinas y/o agentes inhibidores del crecimiento. En donde un anticuerpo de la invención inhibe el crecimiento del tumor, este puede ser particularmente deseable para combinarlo con uno o más agentes terapéuticos que también inhiben el crecimiento del tumor. Por ejemplo, los anticuerpos anti-VEGF que bloquean las actividades VEGF pueden combinarse con anticuerpos anti-ErbB (e.g., anticuerpo HERCEPTIN® anti~HER2) en un tratamiento de cáncer de seno metastático. Alternativa o adicionalmente, el paciente puede recibir terapia de radiación combinada (e.g., irradiación de haz externa o terapia con agente etiquetado radioactivo, tal como un anticuerpo) . Tales terapias combinadas anotadas arriba incluyen la administración combinada (en donde los dos o más agentes se incluyen en la misma o formulaciones separadas)) y la administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención puede ocurrir antes de y/o después de la administración de la terapia o terapias adjuntas. El anticuerpo de la invención (y agente terapéutico adjunto) es/se administra por cualquier medio adcecuado, incluyendo la administración parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal y si se desea tratamiento local, intralesional . Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, el anticuerpo se administra adecuadamente mediante infusión por impulso, particularmente con dosis del anticuerpo que disminuyen. La dosificación puede ser mediante cualquier ruta adecuada, e.g., mediante inyecciones tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de ya sea la administración en breve o crónica . La composición del anticuerpo de la invención se formulará dosificada y administrada enana forma consistente con la buena práctica médica. Los factores para consideración en este contexto incluyen el trastorno particular a tratarse, el mamífero particular a tratarse, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el programa de administración y otros factores conocidos para los médicos. El anticuerpo no necesita ser pero se formula opcionalmente con uno o más agentes utilizados actualmente para evitar o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpos de la invención presentes en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores tratados arriba. Estos generalmente se utilizan en las mismas dosis y con las rutas de administración como se utilizan de aquí en adelante o aproximadamente desde 1 hasta 99% de las dosis empleadas de aquí en adelante. Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de un anticuerpo de la invención (cuando se utiliza solo o en combinación con otros agentes tales como agentes quimioterapeuticos) dependerá del tipo de enfermedad a tratarse, el tipo de anticuerpo, la severidad y curso de la enfermedad, ya sea el anticuerpo se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, previo a la terapia, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo y la discreción del médico. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aprox 1 µg/kg hasta 15 mg/kg (e.g., 0.1 mg/kg-10 mg/kg) del anticuerpo es una dosis candidato inicial para la administración a un paciente, ya sea por ejemplo mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica puede variar desde aproximadamente 1 µg/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores antes mencionados . Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosis ejemplificativa del anticuerpo puede estar en el rango desde aproximadamente 0.05 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg. Así, una o más dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) pueden administrarse al paciente. Tales dosis pueden administrarse intermitentemente, e.g., cada semana o cada tres semanas (e.g., tal que el paciente recibe desde aproximadamente dos hasta aproximadamente veinte, e.g., aproximadamente seis dosis del anticuerpo) . Puede administrarse una dosis de carga mayor inicial, seguida por una o más dosis inferiores. Un régimen de dosis ejemplificativo comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg seguido por una dosis mantenida a la semana de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. Artículos de manufactura En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de manufactura contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos antes descritos. El artículo de manufactura comprende un contenedor y una etiqueta o inserto de empaque sobre o asociado con el contenedor. Los contendores adecuados incluyen por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los contenedores pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. Los contenedores sostienen una composición que por sí misma o cuando se combina con otras composiciones efectivas para tratar, prevenir y/o diagnosticar la condición y pueden tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o inserto de empaque indica que la composición se utiliza para tratar la condición de selección tal como cáncer. Además, el artículo de manufactura puede comprender (a) un primer contenedor con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo contenedor con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un agente citotóxico adicional. El artículo de manufactura en esta modalidad de la invención puede comprender además un inserto de empaque indicando que pueden utilizarse la primera y segunda composiciones del anticuerpo para tratar una condición particular, e.g., cáncer. Alternativa o adicionalmente el artículo de manufactura puede comprender además un segundo (o tercer) contenedor que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , salina amortiguada de fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede también incluir otros materiales deseables a partir de un punto de inicio comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. Lo siguiente son ejemplos de los métodos y composiciones de la invención. Se entiende que puede practicarse varias otras modalidades, dada la descripción general antes proporcionada. EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Generación y caracterización de un fragmento de anticuerpo de la invención (también referido abajo como "anticuerpo de un solo brazo" o "anticuerpo Fab/c") Construcción de Vectores de Expresión Todos los plásmidos para la expresión de anticuerpos de longitud completa o Fab/c anti-c-met se basan en un sistema de cistrón separado (Simmons et al . , J. Immunol Methods, 263:133-147 (2002)) que dependen en separar promotores phoA (AP) (Kikuchi et al., Nucleic Acid Res . , 9:5671-5678 (1981)) para la transcripción de las cadenas pesada y ligera y el fragmento Fc seguido por la secuencia trp Shine-Dalgarno para la iniciación de la traslación (Yanofsky et al., Nucleic Acid Res . , 9:6647-6668 (1981) y Chang et al., Gene, 55:189-196 (1987)). Adicionalmente, la secuencia de señal de enterotoxina II termoestable (STII) (Picken et al., Infect . Immun . , 42:269-275 (1983) y Lee et al., Infect . Immun . , 42:264-268 81983)) se utilizan para la secreción periplásmica de las cadenas pesada y ligera y el fragmento Fc. El fino control de la traslación para ambas cadenas y el fragmento Fc se logró con las variantes de la secuencia de señal STII previamente descritas de longitudes trasnacionales relativamente medidas que contienen cambios de codón silencioso en la región de iniciación de la traslación (TIR) (Simmons and Yansura, Nature Biotechnol, 14:629-634 (1996) y Simmons et al., J. Immunol Methods, 263: 133-147 (2002)). Finalmente, el terminador de transcripción ?to (Schlosstissek and Grosse, Nucleic Acids Res . , 15: 3185 (1987) se colocó corriente debajo de las secuencias de codificación para ambas cadenas y el fragmento Fc . Todos los plásmidos utilizan la estructura de un sistema de vector en base a pBR322 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol . , 43: 77-90 (1978)). La fuente de anticuerpo anti-c-met fupe el anticuerpo 5D5 descrito en las Patentes de E.U. Nos. 5,686,292; 5,646,036; 6,207,152; 6,214,344 y 6,468,529. La línea celular de hibridoma para el anticuerpo fuente 5D5 se depositó previamente con la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md., USA como ATCC No. HB-11895 (Hybridoma 5D5.11.6) (Fecha de Depósito: Mayo 23 de 1995) . Plásmido pxcMllC Se requirieron dos plásmidos intermedios para generar el plásmido pxcMHC deseado que codifica un anticuerpo 5D5 anti-c-met quimperico. Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de 5D5 se transfirieron primero por separado sobre los plásmidos en base a pBR322 para la expresión de cada cadena. Lo siguiente describe la preparación de estos plásmidos intermedios pxcMLC y pxcMHC seguido por la construcción de pxcMUC. pxcMLC Este plásmido se construyó a fin de transferir el dominio variable ligero murino del anticuerpo 5D5 hacia una estructura de cadena ligera humana compatible para generar el anticuerpo de longitud total. La construcción de este plásmido involucra la ligación de tres fragmentos de ADN. El primero fue el vector pPho51 (Si mons y Mansura, Nature Biotechnol, 14:629-634 (1996), variante 1) en el cual se ha removido el fragmento MluI-BamHI pequeño. La segunda parte de la ligación fue un fragmento AlwNI-BamHI de aproximadamente 516 pares base a partir de pST7LC que codifica los últimos 15 aminoácidos de la cadena ligera, el terminador ?t0 y el iniciador del gen tet . El plásmido pST7LC es un derivado de la variante 6 (ver la referencia de arriba) con una cadena ligera kappa humana corriente debajo de la secuencia de señal STII. La tercera parte de la ligación fue un fragmento PCR MluI-AlwNI de aproximadamente 623 pares base generado a partir de un plásmido que contiene secuencias Fab 5D5 (descritas en el Ejemplo 2 de abajo bajo la "Expresión de Clonación y recombinante de Fab 5D5") utilizando los siguientes iniciadores: ' -TAAATTTAACGCGTACGCTGACATTATGATGTCCCAGTCTCCATCC (SEQ ID NO: 9) 5' - GGGCGAGCTCAGGCCCTGATGGGTGACTTCGCAGGC (SEQ ID NO:10) pxcMHC Este plásmido se construyó para introducir el dominio variable pesado murino del anticuerpo 5D5 en una estructura de cadena pesada humana compatible para generar el anticuerpo de longitud total. La construcción de pxcMHC involucra la ligación de dos fragmentos de ADN. La primera fue el vector pST2HC en el cual se ha removido el fragmento MluI-BstEII pequeño. El plásmido pST2HC es un derivado de 1 avariante 3 (ver la referencia de arriba) en el cual una cadena pesada IgGl humana se fusionó corriente debajo de la secuencia de señal STII. La segunda parte de la ligación fue un fragmento MluI-BstEII de aproximadamente 346 pares base generado a partir de un plásmido que contiene secuencias Fab 5D5 (descritas en el Ejemplo 2 de abajo bajo "Expresión de Clonación y recombinante de Fab 5D5") utilizando los siguientes iniciadores: ' -GCTACAAACGCGTACGCTCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGG SEQ ID NO: 11) ' - AAGAGACGGTGACCGAGGTTCCTTGACC (SEQ ID No. 12) pxcMH C El plásmido pxcMllC se construyó para expresar un anticuerpo quimérico 5D5 de longitud total. La construcción del plásmido involucró la ligación de cuatro fragmentos de ADN. El primero fue el vector paTF20 (Simmons et al., J. Immunol . Methods, 263: 133-147 (2002), paTF20 es el vector policistrónico con TIR' s de cadena ligera 1 y pesada 1) en el cual se ha retirado el fragmento MluI-BstEII pequeño. La segunda parte de la ligación fue un fragmento MluI-AlwNI de aproximadamente 623 pares base a partir de pxcMLC. La tercera parte fue un fragmento AlwNI-BsiWI de aproximadamente 547 pares base a partir de paTF50 (ver la referencia de arriba; paTF50 que es un vector separado con TIR' s de cadena ligera 1 y pesada 1) . La parte final de la ligación fue el fragmento BsiWI-BstEII de aproximadamente 349 pares base a partir de pxcMHC. Plásmido pxcMU C-Fc Para la construcción de pxcMUC-Fc, el cásete que codifica para la expresión del fragmento Fc con todos los elementos de control antes descritos incluyendo el promotor AP, la secuencia de señal STII y el terminador transcripcional ?to se agregó al plásmido pxcMUC. Dos plásmidos, pBR322.VNERK.HC y pBR322.Fc, conducen a la construcción del pxcMUC-Fc necesario para describirse primero . pBR322. VNERK. HC El plásmido pBR322.VNERK.HC es un derivado de la variante 1 (Simmons and Yansura, Nature Biotechnol, 14:629-634 (1996) ) con una cadena pesada humana corriente debajo de la secuencia de señal STII. Este plásmido se construyó mediante ligación junto con dos fragmentos de ADN. El primero fue el vector pBR322 en el cual se removió el fragmentoEcoRI-Clal pequeño. La segunda parte en la ligación fue un fragmento PCR EcoRI-Clal de aproximadamente 1885 pares base generado a partir de pVGll.VNERK que codifica el promotor AP, la secuencia de señal STII, la cadena pesada, el terminador ?to y el iniciador del gen tet utilizando los siguientes iniciadores: , _ TTTCCCTTTGAATTCTTGGTTGTTAACGTTGCCGACGCGCATC (SEQ ID NO:13) 5' - TTTCCCTTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGTAAACAATAAAAAACG CC (SEQ ID N0:14) El plásmido pVGll.VNERK es un derivado del vector de cistrón separado con TIR' s de cadena ligera 1 y pesada 1 (Simmons et al., J. Immunol . Methods, 263:133-147 (2002)) en el cual los dominios ligero y pesado se han cambiado a un anticuerpo anti-VEGF (NVERK) . pBR322. Fc El plásmido pBR322.Fc es un derivado del plásmido pBR322.VNERK.HC que codifica para la expresión del fragmento Fc con todos los elementos de control antes descritos. El plásmido pBR322.Fc se construyó mediante ligación junto con dos fragmentos de ADN. El primero fue el vector pBR322.VNERK.HC en el cual se retiró el fragmento Mlul-Nsil pequeño. La segunda parte en la ligación fue un fragmento Mlul-Nsil de aproximadamente 1319 pares base a partir de pJAL226 que codifica los aminoácidos SGTT seguido por los aminoácidos 221 hasta 429 de IgGl humano. pJAL226 es un derivado d ela variante 3 (Simmons and Yansura , Nature Biotechnol, 14: 629-634 (1996)) con un fragmento Fc humano corriente debajo de la secuencia de señal STII. pxcMUC-Fc pxcMllC-Fc se construyó mediante ligación junto con dos fragmentos de ADN. El primero fue el vector pxcMllC en el cual se retiró el fragmento Hpal-Clal pequeño. La segunda parte en la ligación fue un fragmento Hpal-Clal de aproximadamente 1198 pares base a partir de pBR322.Fc. Esta ligación resultó en el plásmido deseado designado pxcMllC-Fc. Plásmido pxcMUC. H-Fc-K El plásmido pxcMUC.H-Fc-K es un derivado de pxcMllC.Fc en el cual el dominio CH3 de la cadena pesada de pxcMllC se reemplazó con un dominio CH3 con las mutaciones "huecas" (también referido en la presente como "cavidad") (T366S, L368A, Y407V) (Merc ant et al., Nature Biotechnology, 16:677-681 (1998)). Además, el dominio CH3 del fragmento Fc se reemplazó con un dominio CH3 con la mutación "knob" (también referida para la presente como "protuberancia") (T366W) (ver la referencia de arriba) . pxcMUC. H El plásmido se construyó en dos etapas. En la primera etapa, las mutaciones "huecas" se introdujeron mediante -ligación junto con dos fragmentos de ADN. El primero fue el vector pxcMllC en el cual se retiró el fragmento SacII-Nsil pequeño. La segunda parte en la ligación fue un fragmento SacII-Nsil de aproximadamente 411 pares base a partir de pBR322.VNERK. HC.H. pBR322.VNERK. HC.H es un derivado del plásmido pBR322.VNERK.HC (ver arriba) en el cual se introdujeron las mutaciones "huecas" (T366S, L368A, Y407V) (Merchant et al., Nature Biotechnology, 16:677- 681 (1998)). Este plásmido intermedio se diseña como pxcMUC.H. pxcMUC. H. Fc. K La segunda etapa introduce la mutación "knob" en el fragmento Fc e involucra la ligación de dos fragmentos de ADN. El primero fue el vector pxcMUC.H en el cual se retiró el fragmento CLAI-Hpal pequeño. La segunda parte de la ligación fue un fragmento CLAI-Hpal de aproximadamente 1198 pares base a partir de pBR322.Fc.K que codifica el cásete de expresión para el fragmento Fc con la mutación "knob". pBR322.Fc.K es un derivado del plásmido pBR322.Fc (ver arriba) que codifica para la expresión del fragmento Fc con la mutación "knob" (T366W) (Merchant et al., Nature Biotechnology, 16:677-681 (1998)) y todos los elementos de control antes descritos. Esta ligación resultó en el plásmido deseado designado pxcMUC.H-Fc.K. Expresión y caracterización del anticuerpo Fab/c de un Brazo Anti-c-met Las inducciones a pequeña escala de los anticuerpos se llevaron a cabo utilizando la construcción principal (pxcMllC para 5D5 anti-c-met) y la construcción del anticuerpo Fab/c de un solo brazo (pxcMllC. Fc) . Para la expresión a pequeña escala de cada construcción, la cepa 33D3 de E . coli (W3110 ?fhuA (?tonA) ptr3 lac Iq lacL8 ?ompT ?(nmpc-fepE) degP41 kanR) se utilizaron como células huésped. Después de la transformación, los picks transformantes seleccionados se incubaron en 5 ml de medio Luria-Bertini complementado concarbenicilina (50 µg/ml) y se desarrollaron a 30 °C en una rueda de cultivo dutante la noche. Cada cultivo entonces se diluyó (1:100) en medio C.R.A.P. limitado por fosfato (Simmons et al . , J. Immunol . Methods 263:133-147 (2002)) . Se agregó entonces carbencilina al cultivo de inducción a una concentración de 50 µg/ml y el cultivo se desarrolló durante aproximadamente 24 horas a 30 °C en una rueda de cultivo. A menos que se anote de otra manera, todas las inducciones en el matraz de agitación se realizaron en volumen de 5 ml . Los lisados de células completas no reducidos de cultivos inducidos se prepararon como sigue: (1) las muestras de inducción de 1 OD6oo-ml se centrifugaron en un tubo de microcentrífuga; (2) cada pellet se resuspendión en 90 µl TE (Tris 10 mM pH 7.6, EDTA 1 mM) ; (3) 10 µl de ácido yodoacético 100 mM (Sigma 1-2512) se agregó a cada muestra para bloquear cualquier cisteína libre y evitar la redistribución del sulfuro; (4) 20 µl de SDS al 10% se agregó a cada muestra. Las muestras se agitaron, se calentaron a aproximadamente 90°C durante 3 minutos y después se agitaron nuevamente. Después las muestras se enfriaron a temperatura ambiente, se agregaron 750 µl de acetona para precipitar la proteína. Las muestras se agitaron y se dejaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos. Después de la centrifugación durante 5 minutos en una microcentrífuga, el sobrenadante de cada muestra se aspiró y cada pellet de proteína se resuspendió en 50 µl de amortiguador de muestra dH20+ 50 µl 2X NOVEX SDS. Las muestras se calentaron entonces durante 4 minutos a aproximadamente 90°C, se agitaron bien y se dejaron enfriar a temperatura ambiente. Se hizo entonces una centrifugación final de 5 minutos y el sobrenadante se transfirió a tubos limpios . Los lisados de células completas reducidos de cultivos inducidos se prepararon como sigue: (1) las muestras de inducción de 1 OD60o-ml se centrifugaron en un tubo de microcentrífuga; (2) cada pellet se resuspendión en 90 µl TE (Tris 10 mM pH 7.6, EDTA 1 mM) ; (3) 10 µl de ditiotretiol 1 mM (Sigma D-5545) se agregó a cada muestra para reducir los enlaces de disulfuro; (4) 20 µl de SDS al 10% se agregó a cada muestra. Las muestras se agitaron, se calentaron a aproximadamente 90°C durante 3 minutos y después se agitaron nuevamente. Después que las muestras se enfriaron a temperatura ambiente, se agregaron 750 µl de acetona para precipitar la proteína. Las muestras se agitaron y se dejaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos . Después de la centrifugación durante 5 minutos en una microcentrífuga, el sobrenadante de cada muestra se aspiró y cada pellet de proteína se resuspendió en 10 µl de amortiguador de muestra ditiotretio + 40 µl dH20+ 50 µl 2X NOVEX SDS. Las muestras se calentaron entonces durante 4 minutos a aproximadamente 90 °C, se agitaron bien y se dejaron enfriar a temperatura ambiente. Se hizo entonces una centrifugación final de 5 minutos y el sobrenadante se transfirió a tubos limpios. Después de la preparación, 5-8 µl de cada muestra se cargaron en un NOVEX de 10 pozos de 1.0 mm fabricado Tris-Glicina SDS-PAGE al 12% y se electroforó a -120 voltios durante 1.5-2 horas. Los geles resultantes se tiñeron co Azul Coomassie o se utilizaron para inmunoanálisis Western. Para el inmunoanálisis Western, los geles de SDS-PAGE se electro-inmunoanalizaron en una membrana de nitrocelulosa (NOVEX) en amortiguador CAPS 10 mM, pH 11 + metanol al 10%. La membrana se bloqueó entonces utilizando una solución de IX NET (NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Tris 50 mM pH 7.4, Tritón X-100 0.05%) + gelatina al 0.5% duarnte aproximadamente 30 min. -1 hora girando a temperatura ambiente. Después de la etapa de bloqueo, la membrana se colocó en solución de IX NET + gelatina al 0.5% + anticuerpo anti Fab (fracción de IgG de cabra conjugada con peroxidasa a Fab de IgG humana; CAPPEL #55223) para un inmunoanálisis Western anti-Fab. La dilución del anticuerpo anti-Fab varió de 1:50,000 a 1:1,000,000 dependiendo del lote de anticuerpos. Alternativamente, la membrana se colocó en una solución de IX NET + gelatina al 0.5% + anticuerpo anti-Fc (fracción de IgG de cabra conjugada con peroxidasa a fragmento Fc humano; BETHYL #A80-104P-41) para un inmunoanálisis Western anti-Fc. La dilución del anticuerpo anti-Fc varió de 1:50,000 a 1:250,000 dependiendo del lote de anticuerpos. La membrana en cada caso se dejó en la solución de anticuerpo durante la noche a temperatura ambiente con agitación. A la mañana siguiente, la membrana se lavó un mínimo de 3 x 10 minutos en IX NET + gelatina al 0.5% y después 1 x 15 minutos en TBS (Tris 20 mM pH 7.5, NaCl 500 mM) . Las bandas de proteína unidas por al anticuerpo anti-Fab y el anticuerpo anti-FC se visualizaron utilizando la detección ECL de Amersham Pharmacia Biotech y exponiendo la membrana a película de rayos X. Los resultados del inmunoanálisis Western anti-Fab para la expresión del anticuerpo anti-c-Met Fab/c se muestra en la Figura 1. Ellos revelan laexpresión del desdoblamiento total y ensamble del anticuerpo de longitud total en la línea 1 y el anticuerpo Fab/c armado en la línea 2. Obsérvese que el anticuerpo anti-Fab no es capaz de unirse al fragmento Fab, y por lo tanto no se detecta. Para las muestras no reducidas, la co-expresión del fragmento Fc con el anticuerpo anti-c-Met de longitud total da como resultado una desviación sustancial del anticuerpo de longitud total desdoblado y ensamblado para desdoblar y ensamblar completamente un anticuerpo Fab/c armado. Para las muestras reducidas, existen cantidades similares de cadenas pesadas y ligeras detectadas por el anticuerpo anti-c-Met de longitud total y el anticuerpo anti-c-Met Fab/c armado. Existe un incremento ligero en la cantidad de precursor de cadena ligera con la construcción anti-c-Met Fab/c armado, posiblemente debido a un respaldo ligero en la trayectoria secretora. De manera similar, los datos del inmunoanálisis Western se muestran en la Figura 2 y también revelan la expresión del desdoblamiento total y ensamblado de un anticuerpo Fab/c armado en la línea 2. El anticuerpo anti-Fc no es capaz de unirse a la cadena ligera, y por lo tanto no se detecta. Para las muestras no reducidas, la expresión de la región Fc con el anticuerpo anti-c-Met de longitud total la desviación del desdoblamiento y ensamblado total del anticuerpo de longitud total para desdoblar y ensamblar totalmente un anticuerpo Fab/c armado. Además, el monómero y dímero del polipéptido Fc también se detectan sobre el inmunoanálisis Western. Para las muestras reducidas, existen cantidades similares de cadena pesada detectada para el anticuerpo anti-c-Met de longitud total y la expresión del anticuerpo anti-c-Met Fab/c armado. También existe una pequeña cantidad del fragmento Fc precursor, posiblemente debido a algún respaldo en la trayectoria secretora con la construcción del anticuerpo' Fab/c armado. Como evidencia de los datos descritos arriba, es posible generar una población de inmunoglobulinas en donde las especies de anticuerpos primarios es un anticuerpo Fab/c armado deseado. Sin embargo, la forma intacta del anticuerpo (i.e. el anticuerpo de longitud total anti-c-Met totalmente desdoblado y ensamblado) se detectó aún tanto por el inmunoanálisis anti-Fab como anti-Fc Western. Ya que la forma intacta del anticuerpo anti-c-met 5D5 es un agonista del receptor c-met, que es indeseable en el esquema terapéutico que requiere un efecto antagonista, es generalmente deseable minimizar la cantidad de la forma intacta del anticuerpo que se genera. Expresión y caracterización de un anticuerpo Fab/c anti-c-Met armado que comprende la protuberancia y cavidad (también referido a continuación como "Knobs into Holes" (Protuberancia en Orificio) ) Para minimizar adicionalmente la formación del anticuerpo anti-c-Met de longitud total en la preparación del anticuerpo anti-c-Met Fab/c, las mutaciones de "protuberancia en orificio" se hicieron en el dominio CH3 del Fc esencialmente como se describe por Merchant et al . , {Nature Biotechnology, 16:677-681 (1998)). Se preparó una construcción para el anticuerpo anti-c-Met Fab/c (pxcMUC.H- Fc.K) al introducir las mutaciones de "orificio" (T366S, L368A, Y407V) en la cadena pesada de longitud total, y la mutación "protuberancia" (T366W) en el fragmento Fc. Las construcciones anticuerpo anti-c-Met de longitud total (pxcMllC) , un anticuerpo anti-c-Met Fab/c armado (pxcMllC-Fc) , y un anticuerpo anti-c-Met de "protuberancias en orificio" armado (pxcMUC.H. Fc.K) se expresaron entonces de la misma manera como se describió arriba. Se prepararon lisados de células completas, se separaron por SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se detectaron con el anticuerpo conjugado Fab humano de cabra anti-humano y el anticuerpo conjugado FC de cabra anti humano . Los resultados del inmunoanálisis Westwrn anti-Fab se muestran en la Tabla 3, y ellos muestran mejora significativa en el desdoblamiento y ensamblado del anti-c-Met de "protuberancias en orificio" Fab/c armado. Además, los resultados del inmunoanálisis Western anti-Fab muestran la reducción del anticuerpo anti-c-Met de longitud total a niveles no detectables. De nuevo, es importante notar que el anticuerpo anti-Fab no es capaz de unirse al fragmento FC. Para las muestras no reducidas, la expresión de un anti-c-Met de "protuberancias en orificio" armado da como resultado una desviación del desdoblamiento y ensamblado total del anticuerpo de longitud total para desdoblar y ensamblar un anticuerpo Fab/a armado. También existe una mejora significativa en el desdoblado y ensamblado de un anticuerpo Fab/c que se mueve del Fc tipo silvestre hacia el Fc de "protuberancias en orificio". Para las muestras reducidas, existen cantidades similares de cadena pesada detectadas para Fab/c armado y los anticuerpos anti-c-Met de "protuberancias en orificio" Fab/c armados. Esto también parece ser un incremento en la cantidad de cadena ligera procesada y una disminución en el precursor de cadena ligera con la construcción anti-c-Met de "protuberancias en orificio" Fab/c armado . De manera similar, en inmunoanálisis Western anti-Fc en la Figura 4 muestra una mejora significativa en el desdoblado y ensamblado de unas "protuberancias en orificio" Fab/c armadas sobre un anticuerpo Fab/c anti-c-Met armado tipo silvestre. De nuevo, los resultados del inmunoanálisis Western de anti-Fc muestran la reducción del anticuerpo anti-c-Met de de longitud total a niveles no detectables. El anticuerpo anti-Fc no es capaz de unirse a la cadena ligera, y por lo tanto no se detecta. Para las muestras reducidas, existen cantidades similares de cadena pesada detectadas para los anticuerpos Fab/c armado tipo silvestre y el anti-c-Met de "protuberancias en orificio" Fab/c armado de longitud total. EJEMPLO 2 : Características farmacocinéticas y eficiencia terapéutica de los anticuerpos de la invención Material y Métodos Materiales - HGF y c-Met se produjeron en Genetech, como se describió previamente (8:14). Las placas de microtitulación Maxisorb se adquirieron de NUNC (Rosklide, Dinamarca) . El anti-hFc se adquirió de Jackson Immunochemical (West Grove, PA) . HRP-Estraptavidina se adquirió de Zymed (South San Francisco, CA) . 3H-timidina se adquirió de Amersham, Inc. (Arlington Heights, IL) . Las células MDA-MB-435 se obtuvieron de ATCC (Rockville, CA) .

NHS-X se adquirió de Research Organics (Cleveland, OH) .

Immobilon-PSQ PVDF se adquirió de Millipore (Marlborough, MA) . Superscript II RNase H-Reverse Transcriptase (Transcriptasa inversa-H RNasa de índice II) fue de Gibco-BRL (Gaithersburg, MD) . Polimerasa Taq fue de Perkinn Elmer-Cetus (Foster City, CA) , Bakerbond ABX, tamaño de partícula 40 µ fue de J.T. Baker (Phillipsburg, NJ) y resina SP-Sepharose High Performance fue de Pharmacia Biotech, Inc. (Piscataway, NJ) . Biotin-anti-P-Tyr fue de Upstate Biotech (Lake Placid, NY) , el sustrato de peroxidasa TMB se adquirió de KPL (Gaitherburg, MD) . Generación de anticuerpos y fragmentos Fab Producción de Anticuerpos Monoclonales Anti-c-Met Se ha descrito la producción de los anticuerpos monoclonales anti-c-met, incluyendo el anticuerpo 5D5. Ver, e . g. , las Pats. de E.U. Nos. 5,686,292; 5,646,036; 6207,152; 6,214,344 y 6,468,529. Se inmunizaron ratones BALB/c en cada almohadilla plantar posterior con 2.5 µg de c-Met-IgG soluble (Mark et al . , J. Biol . . Chem. (1992), 267:26166-26171) suspendido en adyuvante MPL/TDM en el día 0, 7, 14, 21, 28, 266, 273 y 279. Cuatro días después de la última inmunización se cosecharon las células de nodo linfático y se fusionaron con células de mieloma P3/X63-Ag8UI (Yelton et al . , Current . Top . Microbio . Immunol . (1978) utilizando 35% de polietilenglicol como se describe (Laskov et al . , Cell . Immunol . (1980), 55:251). Las líneas celulares de hibridoma que secretan el anticuerpo específico para c-Met se seleccionaron inicialmente mediante un ELISA de captura, después subsecuentemente se detectó analíticamente mediante citometría de flujo utilizando las células transfectadas BAF3 que expresan c-Met. Los hibridomas seleccionados se probaron adicionalemnet para su capacidad de inhibir la biotina-HGF que se une a c-Met-IgG. como se describió arriba. Los hibridomas se clonaron dos veces al limitar la dilición y después se caracterizaron adicionalmente para sus capacidades antagonística y agonística. Se produjo ascitis en los ratones balb/c y los anticuerpos monoclonales se purificaron utilizando una columna de afinidad de proteína G. La concentración de proteína se determinó mediante la absorbencia a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción de 14. Generación y purificación de Fab Nativo El anticuerpo 5D5 se dializó durante la noche en amortiguador de Fosfato 20 mM, EDTA 10 mM y se cincentró a 7 mg/ml en un Centricon 30. Medio ml de papaína inmovilizada (Pierce, Rockford, II) se lavó con amortiguador de digestión, después se agregaron 10 mg de 5D5 y se incubó durante la noche a 37 °C con agitación a 200 rpm. Se agregaron a la mezcla uno y medio ml de amortiguador de unión, después el sobrenadante se separó de las perlas y se pasó a través de una columna que se equilibró previamente con amortiguador de unión. Se pasó amortiguador de unión adicional sobre la columna y eluido se recolectó en fracciones de 1 ml .. La absorbencia de cada fracción se leyó a 280 nm y se agruparon los eluídos que contenían los fragmentos de Fab. La proteína se dializó durante la noche en PBS y la concentración de proteína se determinó por su absorbencia a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción de 1.53. El fragmento Fab se purificó adicionalmente mediante filtración de gel para retirar el F(ab')2 residual. Secuenciación N-terminal de 5D5 Fab Una alícuota de Fab de 5D5 se resolvió sobre un gel SDS de 4-20% de gradiente se electroinmunoanalizó sobre membrana PVDF (Immobilon-PSQ) durante 1 hr a corriente constante de 250 mA en una célula de transferencia BioRad Trans-Blot (Matsudaira, J. Biol.. Chem. (1987), 262:10035- 10038. La membrana se tiñó con Azul Coomassie R-250 al 0.1% en metanol al 50%, 0.5 minutos y se decoloró durante 2-3 minutos con ácido acético al 10% en metanol al 50%. La membrana fue totalmente lavada con agua y se le dejó secar antes de la secuenciación en un secuenciador automatizado de proteína modelo 473A, utilizando un cartucho Blott® (Applied Biosystem) . Los picos se integraron con el software Justice Innovation utilizando interfaces Nelson Analytical 760. La interpretación de la secuencia se realizó en un DEC alpha (Henzel et al . , J. Chromatog. (1996), 404:41-52). Obtener la secuencia de la cadena pesada de 5D5 requiere desbloquear, lo cual se realizó como sigue. El fragmento Fab se redujo co DTT 7 mM a 45CC durante 1 hora y se alquílate con isopropilacetamida 180 mM a 25 °C durante 20 minutos (Krutzsch & Imman, Anal . Biochem. (1993), 209: 109-116) . El fragmento de Fab alquilado se intercambió entonces 3X en unMicrocon-10 con fosfato de sodio 0.1M conteniendo DTT 10 mM (amortiguador de digestión) y se digirió con 1 mü de piroglutamato aminopeptidasa a 45 °C durante 3 horas en 20 µl amortiguador de digestión. El Fab desbloqueado se transfirió entonces a PVDF y se secuenció como se describe arriba. Clonación y Expresión Recombinante de Fab 5D5 Los datos de secuencia N-terminal se utilizaron para diseñar iniciadores PCR específicos para los extremos 5' de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada, aunque los iniciadores 3' se diseñaron para hibridarse a las 4 estructuras de consenso de cada cadena (Kabat et al . , Sequences of proteins of immunological interest (Secuencias de proteínas de interés inmunológico) (1991), Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) . Los iniciadores se diseñaron entonces para agregar sitios de enzimas de restricción para la clonación. El ARN total, extraído de 108 células del hibridoma 5D5 con un equipo de aislamiento de ARN Stratagene, se utilizó como sustrato para RT-PCR. La trnscripción inversa se realizó bajo condiciones estándar (Kawasaki, Amplification of RNA (Amplificación de ARN) . En PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, ( Protocolos de PCR : Una Guía para Métodos y Aplicaciones) , pp 21-27 (M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, y T.J. White, editores) ( Academic Press, Inc. San Diego; 1990) utilizando los iniciadores específicos de 4 estructuras y Superscript II RNase H-Reverse Transcriptase . La amplificación de PCR empleó polimerasa Taq, como se describió (Kawasaki, Amplification of RNA (Amplificación de ARN) . En PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, ( Protocolos de PCR : Una Guía para Métodos y Aplicaciones) , pp 21-27 (M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, y T.J. White, editores) ( Academic Press, Inc. San Diego; 1990) excepto que se incluyó DMSO al 2% en la mezcla de reacción. Los fragmentos de ADN amplificados se digirieron con enzimas de restricción Sfi I y Rsr II (cadena ligera) o Mlu I y Apa I (cadena pesada) , se purificó el gel, y se clonó en un derivado del plásmido de expresión pAK19 (Cárter et al . , Bio/Technol . (1992), 10:163- 167) . Este vector, pXCA730, se modificó mediante mutagénesis dirigida al sitio (Kunkel, Proc. Nati . Acad. Sci . USA (1985), 82:488) para contener los sitios de restricción únicos entre las secuencias de señal ST II y los dominios variables, y en la unión de los dominios variable y constante de cada cadena. Los ADNcs de los dominios variable de las cadenas ligera y pesada se insertaron corriente arriba y en la estructura para dominios C? y CH1 humanos. La cisteína de la C-terminal de la cadena pesada en pAK19, que podría formar un puente de disulfuro para dar moléculas F(ab')2, se retiró para permitir la expresión de sólo la forma Fab del anticuerpo. El Fab de 5D5 se expresó en E. coli K12 cepa 33B6 (W3110 tor¡A phoA E15 eoC KanR ilvGR degPD) argF-lac) 169) (Rodríguez et al . , Cáncer Res . (1995), 55:63-70), como se describió por Cárter et al . , (Cárter et al . , Bio/Technol . (1992), 10:163-167. El pellet de células de una fermentación 10-L se cosechó mediante centrifugación de alimentación continua, congelación y almacenamiento a -70 °C. Una porción del pellet se suspendió en amortiguador de extracción, lo cual consistió de MES 120 mM, pH 6, y EDTA 5 mM (5ml/gramo de pasta) . La suspensión se mezcló completamente utilizando ultraturrax (Janke y Kunkel) durante aproximadamente 15 minutos a 4°C. Las células intactas se fracturaron utilizando 2 pases a través de un homogenizador celular (Microfluidizador, por Microfluidics Corporation, Newton, MA) adaptado con bobina de enfriamiento. La suspensión se ajustó a polietilenimina al 0.1% (v/v) utilizando un material de existencias al 5% (v/v) que se había ajustado a pH 6. Las células intactas y los restos floculados por PEÍ se separaron de la fracción soluble mediante centrifugación a 25,400 x g durante 30 minutos. El sobrenadante se ajustó a una conductividad menor de 4 mS mediante la adición de agua purificada y se cargó en una columna (1 x 10 cm) de Bakerbond ABX, tamaño de partícula 40µ. La columna se había equilibrado en MES 50 mM, EDTA 5 mM, pH 6. Todas las etapas se hicieron a una velocidad de flujo lineal de 100 cm/h. Después de cargar el sobrenadante condicionado, la columna se lavó con amortiguador de equilibrio hasta que la absorbencia del efluente de columna fue equivalente a la línea basal. La elusión se realizó utilizando gradiente lineal, de volumen de 16 columnas de sulfato de amonio de 0 a 100 mM en amortiguador de equilibrio. Se analizaron las fracciones de columna mediante electroforesis de gel SDS-poliacrilamida y se agruparon las fracciones que contenían el Fab. La conductividad del grupo de la columna ABX se disminuyó a menos de 4 mS y se cargó en una columna (1 x 10 cm) de resina SP-Sepharose High Performance (Sefarosa SP de Alto Desempeño) que se había equilibrado en amortiguador MOPS 25 mM, pH 9. Toddas las etapas se realizaron a una velocidad de flujo lineal de 100 cm/h. Después de la carga, la columna se lavó con un volumen de columna de amortiguador de equilibrio. El Fab 5D5 se eluyó entonces a partir de la columna utilizando un gradiente lineal de volumen de 16 columnas de acetato de sodio de 0 a 200 mM en amortiguador de equilibrio. Se analizaron las fracciones de columna mediante electroforesis de gel SDS-poliacrilamida y se agruparon las fracciones que contenían el Fab. Producción a Pequeña Escala de Proteína 5D5 Armada en Uno El plásmido de expresión pxcMllC. H-Fc.K (como se describió arriba) se utilizó para transformar la cepa de E . coli 33D3 (W3110 kanR ?fhuA (?tonA) ptr3 laclq lacLd ompT? (nmpc-fepE) degP) y transformantes crecieron entonces durante la noche a 30 grados C en el medio LB con carbenicilina agregada (50 µg/ml) . El cultivo LB se diluyó 100 veces en el medio C.R.A.P. (1) que contiene carbenicilina (50 µg/ml) y creció por aproximadamente 24 horas con agitación a 30 grados C. Las alícuotas pequeñas se retiraron para verificar la expresión del anticuerpo mediante SDS-PAGE y análisis Western utilizando ya sea un anticuerpo anti-Fab (fracción IgG de cabra conjugado con peroxidasa para Fab IgG humano; CAPPEL #55223) o un anticuerpo anti-Fc (fracción IgG de carbra conjugado con peroxidasa hacia el fragmento Fc; Bethyl #A08- 104P-41) . El cultivo remanente se centrífugo entonces y la pasta celular se congeló a -70 grados C hasta el inicio de la etapa de purificación del anticuerpo. Purificación de 5D5 de un grupo. La pasta celular congelada se derritió y suspendió en 10 volúmenes (p/v) de amortiguador de lisis (25 mM tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7.5), después se centrífugo. La pildora insoluble se resuspendió en amortiguador de lisis utilizando un homogenizador Polytron (Kinematica A.G., Suiza) y las células rotas mediante el pasaje a través de un Microfluidizador (Microfluidics, Newton, Mass) . Se agregó polietilenimina (Sigma) 0.1% (v/v) al lisado, seguido por agitación a 4°C durante una hora, después la centrifugación a 15,000 xg. El sobrenadante resultante se mezcló con una proteína de afinidad A y se agitó durante la noche a 4°C. La resina se dejó reposar, el sobrenadante se vació y la resina se vació en una columna unida a un sistema líquido de cromatografía (Varian Inc. Palo Alto, CA) . La columna se lavó con tris-HCL 10 mM, amortiguador EDTA 1 mM, pH 7.5, seguido por NaCl 0.5M en el mismo amortiguador, después se eluyó con un gradiente de pH6 a pH 2 en citrato de sodio 50 mM, amortiguador NaCl 0.1M. Las fracciones eludías se ajustaron inmediatamente a una concentración final de urea 2M y pH 5.4, y se analizaron las mediante electroforesis de gel SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) .

Las fracciones conteniendo anti-cMet armado en uno se vaciaron se sometieron a cromatografía d eintercambio catiónico en una columna SP Sefarosa (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) equilibradas con MES 25 mM, urea 2M pH5.4. La columna se eluyó con un gradiente de 0 - 1M NaCl en MES 25 mM, pH 5.4. Después del análisis SDS-PAGE, el eluido agrupado se ajustó a sulfato de sodio 1.4M, pH6, y se cargó en una columna Hi-Propyl (J.T. Baker, Phillipburg, NJ) equilibrada con sulfato de sodio 0.4M, MES 25 mM pH6. La columna se eluyó con un gradiente de sulfato de sodio 0.4M - OM en MES 25 mM, pH6. El eluido resultante, después del análisis SDS-PAGE, se concentró utilizando CentriPrep 10 (Millipore Corp, Bedford, MA) después se sometió a cromatografía de exclusión de tamaño en una columna Superdex 200 (Amersham Biosciences) equilibrado con succinato de sodio mM, NaCl 0.15M, pH 5.0. La concentración de proteína se determinó por análisis cuantitativo de aminoácidos. Los niveles de endotoxina se determinaron mediante el ensayo LAL. Estas preparaciones de anticuerpo se utilizaron para el análisis subsecuente . Ensayos Cultivo Celular Las células de carcinoma de pulmón se cultivaron en MEM complementado con FBS al 10%. Las células BaF3-cMet, que se transíectaron con cMet humano como se describió previamente (Schwall et al . , . J. Cell Biol. (1996), 133:709- 718) y células BaF3-neo, que se transíectaron con el vector, se cultivaron en RPMl 1640 complementado con FCS al 10%, medio condicional de cultivo celular WEHI al 5% (conteniendo IL-3) , glutamina 2 mM, ß-mercaptoetanol (2µl/l) , 0.5 mg/ml de células de glioblastoma G418.U87 y U118, células de carcinoma renal 786-0 se cultivaron en RPMl 1640 conteniendo FCS al 10%. Enlace HGF-cMet Los estudios de unión HGF se condujeron utilizando biotina-HGF en un sistema de fase sólida en el cual se capturó c-Met-IgG a través del dominio de IgG en placas de microtitulación. HGF se biotiniló mediante incubación con NHS-X-Biotina 20 veces el exceso molar en NaHC03 0.1M, pH 8.5. La NHS-X-biotina se diluyó en 4 cuatro incrementos que se agregaron a intervalos de 15 minutos, con agitación a temperatura ambiente. La biotina no conjugada se retiró mediante diálisis y el material etiquetado se almacenado a 4°C. Las placas de microtitulación se cubrieron con IgG humana anti-conejo Affini Puré, Fc (Jackson ImmunoResearch) para recubrir el amortiguador (0.05 M carbonato/bicarbonato, PH 9.6) durante la noche a 4°C. Las placas se bloquearon mediante PBS conteniendo 0.5% de BSA, pH de 7.4 a temperatura ambiente (RT) durante una hora, seguido por 2 horas de incubación con 2 µg/ml cMet-IgG. Después se agregaron 53 ng/ml de biotina etiquetada HGF con o sin 0.01-1,000 nM competidores de HGF frío, anti-cMet 5D5 mAb, Fab o un anticuerpo armado a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se agregaron con peroxidasa de rábano picante (HRP)-estreptavidina (dilución a 1:10,000, Amersham) a RT durante 1 hora, seguido por sustrato de fosfatasa CP-nitrofenil fosfato (Kirkegaard & Perry Laboratories) y la absorbancia se midió a 405 nm. Los resultados se muestran en la Figura 5. Un anticuerpo anti-c-met 5D5 armado se desempeñó similar a anti-c-met-Fab en el ensayo de unión competitiva. Fosforilación por Tirosina de c-Met mediante KIRA Se midió la fosforilación por tirosina de c-Met mediante un ELISA intercalado, en base a los métodos de Sadick et al . , en el cual el receptor solubilizado se capturó sobre una placa recubierta con un anticuerpo anti-receptor y se detectó con anti-P-Yyr (Sadick et al . , Anal . Biochem. (1996), 235:207-214). Las células U87 se colocaron en placas a 106/ml en una placa de 96 pozos a 37°C durante la noche. El medio se cambió después a MEM, 0.1% FBS, con HGF y /o anticuerpos durante 10 min. Las células se extrajeron entonces en 100 µl de amortiguador de lisis celular (20mM Tris, PH 7.5, 150mM NaCl, 1 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, InM EGTA, 1% Tritón, Ix de cóctel inhibidor de proteasa (Sigma) , Ix de cóctel II inhibidor de fosfatasa (Sigma) ) durante 30 min a TR sobre un agitador de placa y se almacenó sobre hielo o -70°C. Los lisados se agregaron a las placas que se habían recubierto con anti-cMet mAb 1949 (Genentech) durante la noche. Se detectó fosfo-tirosina cMet con 1:4000 de anti-fosfotirosina biotinilada diluida (4G10, Upstate) seguido por HRP- estreptavidina y desarrollo de color con TMB. Se midió de manera similar cMet Total utilizando 1:10,000 de anticuerpo anti-cMet. Los resultados se muestran en la Figura 6. Ensayos de Proliferación Celular, Migración BaF3 es una célula linfoide dependiente de IL-3 murino que normalmente no expresa c-Met y no responde a HGF. Sin embargo en BAF3-hMet, derivado mediante la transfección con un ADNc de longitud total normal para c-Met humano (Schwall et al . , J. Cell Biol . (1996), 133:709-718), HGF estimula la proliferación y supervivencia en la ausencia de IL-3. Las células BaF3-hMet y BaF3-neo se pasaron rutinariamente en RPMl 1640, 5% de suero bovino fetal, 4µl/L ß-ME, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina y 5% de medio acondicionado con WEHI como una fuente de IL-3. Para medir la proliferación dependiente de HGF se cuantificó el número de células después de 3 días de tratamiento al agregar 25 µl de Alarma Blue (Trek Diagnostic System) y midiendo la intensidad de fluorescencia 4 horas después. Como un control para la especificidad, también se probó un 5D5 armado en células BaF3-hMet estimuladas con IL-3. Los resultados se muestran en la Figura 7. Se evaluó la migración de las células MDAMB-435-PGL y células U87 utilizando un ensayo de cámara de Boyden modificado. Las células se colocaron en placas (2x10 4/pozo) sobre la cámara superior con un filtro de policarbonato con poros de 5 µm recubierto con 10 µg/ml de fibronectina . Se agregó 100 ng/ml de HGF con o sin el anticuerpo 5D5 Fab o de un grupo en las cantidades indicadas hacia el medio en la cámara inferior. Las células se cultivaron durante la noche. Las células se quitaron del lado superior de la membrana de filtro utilizando un limpiador de esponja especial y las células que migraron a la superficie inferior del filtro se fijaron y tiñeron con yoduro YO-PRO-3 (Pruebas Moleculares) , después se contaron mediante microscopía fluorescente. Los resultados se muestran en la Figura 8. Farmacocinéticos Se inyectaron intravenosamente en un ratón desnudo OA-5D5 o 5D5 Fab (5 mg/kg) . En los puntos de tiempo indicados, se recolectaron las muestras de suero a partir de 4 ratones y se ensayaron mediante ELISA de sandwich en el cual se capturó sobre una placa cubierta con cMet-IgG y después se detactaron con un anticuerpo secundario específico de la cadena ligera. Los resultados se muestran en la Figura 9A. La media vida del anticuerpo 5D5 se un solo grupo se incrementó significativamente comparado con su contraparte Fab. Para determinar ya sea OA-5D5 se degradó in vivo, un volumen de suero correspondiente a 40 ng de OA-5D5 mediante ELISA a partir del día 7 las muestras PK se corrieron sobre un gel SDS-PAGE bajo condición de reducción o no reducción. El gel se transfirió sobre nitrocelulosa y inmunotransfirió mediante Fc anti-humano HRP conjugado (1:5,000, específico humano, Jackson Labs.). Un volumen igual de suero a partir del ratón nativo se corrió en paralelo como control . Los resultados se muestran en la Figura 9B. El anticuerpo de suero 5D5 de un solo grupo fue intacto en el día 7 después de la administración. Estudios de Eficacia del Tumor In Vivo Se llevaron a cabo los estudios de eficacia utilizando ratones desnudos atímicos hembra a la edad de 4-6 semanas inoculados subcutáneamente con 2.5 millones de células A549 (carcinoma de pulmón humano) o U87 MG (glioblastoma humano que secreta HGF autócrino y expresa cMet) . El tratamiento con el anticuerpo 5D5 de un solo grupo, el anticuerpo Fab 5D5 o un anticuerpo de control (anti-gpl20) se inició ya sea a la hora de la inoculación de la célula de tumor (i.e., tratamiento adyuvante) o después de que los tumores se dejaron crecer a ~150 mm3. Todos los anticuerpos se administraron intraperitonealmente una vea por semana durante 4 semanas. Nótese que solo se probó el anticuerpo 5D5 de un solo grupo en el régimen de tratamiento adyuvante (con el control anti-gpl20) . La Figura 10 muestra los resultados para los tumores generados mediante inoculación con células U87 MG. Como se muestra en la Figura 10A (tratamiento adyuvante) y la Figura 10B (tratamiento después del establecimiento de los tumores), un anticuerpo 5D5 de un solo grupo es capaz de inhibir o provocar la regresión de los tumores. Como se muestra en la Figura 10B, un anticuerpo 5D5 de un solo grupo tiene eficacia terapéutica superior comparada con su contraparte Fab. (De manera interesante, un anticuerpo 5D5 de un solo grupo a 100 nM exhibió efectos mínimos en el número de células U87 in vitro) . Los resultados para el tratamiento de tumores generados para la inoculación con las células A549 fueron negativos, lo cual proporciona un control de especificidad que confirma que los efectos del anticuerpo anti-c-met 5D5 de un solo grupo contra los tumores U87 no fueron adecuados para la toxicidad no específica. El anticuerpo anti-c-met 5D5 de un solo grupo también se probó para la capacidad para modular el desarrollo del tumor utilizando otras técnicas establecidas en modelos de tumor in vivo, por ejemplo el modelo Oncotest descrito en la Patente de E.U. No. 6,271,342. El crecimiento de las células de tumor de BxPC-3 (pancreático) (ATCC No. CRL-1687) coinoculadas con fibroblastos MRC-5 (ATCC CCL-171) mostró un 50% de inhibición cuando se administró un anticuerpo 5D5 de un solo grupo a 30 mg/kg, 2x/semana. Otros datos ilustrativos se listan abajo: • ~30% de inhibición del crecimiento del tumor en Oncotest RXF1220 /renal) con 10 mg/kg, q7d (i.e., cada 7 días) de un anticuerpo 5D5 de un solo grupo; • <20% de inhibición del crecimiento del tumor en (i) Oncotest PAXF736 (pancreático) con 10 mg/kg, q7d; (ii) Oncotest GXF97 (gástrico) con 10 mg/kg, q7d; (iii) Oncotest LXFA526 (pulmón) con 30 mg/kg, q7d; (iv) Oncotest LSFA297 (pulmón) con 30 mg/kg, q7d; • No se observó actividad en xenoinjertos A549 con 10 mg/kg, q7d del anticuerpo 5D5 de un solo grupo; • No se observó actividad en Oncotest LXFA650 (pulmón) con 30 mg/kg, q7d.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un fragmento de anticuerpo que comprende un solo grupo de unióna antígeno y una región Fc que incrementa la estabilidad de dicho fragmento de anticuerpo comparado con la molécula Fab que comprende dicho grupo de unión a antígeno, en donde la región Fc comprende un complejo de un primero y un segundo polipéptido Fc, en donde uno pero no ambos polipéptidos Fc es una cadena pesada N-terminalmente trucada .
2. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 en donde el fragmento de anticuerpo se aglicosila.
3. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 o 2 en donde el fragmento de anticuerpo tiene pocas o no tiene propiedades inmunosupresivas .
4. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 3 en donde dichas propiedades inmunosupresivas comprenden la capacidad para efectuar la disminución de la célula T.
5. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que no posee la función efectora sustancial diferente a la unión FcRn.
6. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 5 en donde dicha función efectora es lisis de complemento
7. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en donde el fragmento de anticuerpo une FcRn.
8. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 que no se une específicamente a un antígeno de superficie de la célula T.
9. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 8 en donde dicho antígeno de superficie de la célula T es CD3 o CD4.
10. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 9 en donde dicho antígeno de superficie de la célula T es CD3.
11. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de Isa reivindicaciones 1-10 que se une específicamente a un antígeno de tumor.
12. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 que se une específicamente al receptor de superficie celular que se activa en la dimerización del receptor.
13. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 en donde el fragmento de anticuerpo comprende un pirmer polipéptido que comprende un dominio variable de cadena ligera, un segundo polipéptido que comprende un dominio variable de cadena pesada y dicho primer polipéptido Fc y un tercer polipéptido comprende dicho segundo polipéptido Fc.
14. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 13 en donde el primer polipéptido comprende un dominio variable de cadena ligera no humano fusionado con un dominio constante de cadena ligera humano.
15. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 13 en donde el primer polipéptido comprende un CDR a partir de especies no humanas fusionadas a una secuencia de estructura humanizada o humana.
16. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 13 en donde el segundo polipéptido comprende un dominio variable de cadena pesada no humano fusionada a un dominio constante de cadena pesada humano.
17. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 13 en donde el segundo polipéptido comprende un CDR a partir de especies no humanas fusionado a una secuencia de estructura humanizada o humana.
18. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 13 en donde el tercer polipéptido comprende una cadena pesada N-terminalmente truncada que comprende al menos una porción de la secuencia de articulación en la N terminal .
19. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-18 en donde los dos polipéptidos Fc se enlazan covalentemente.
20. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-19 en donde los dos polipéptidos Fc se enlazan a través de uniones de disulfuro intermoleculares en la región de articulación.
21. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 en donde el fragmento de anticuerpo cuando se une a una molécula objetivo inhibe la multimerización de la molécula objetivo.
22. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-21 en donde el fragmento de anticuerpo cuando se une a una molécula objetivo inhibe la unión de una pareja de unión de cognado a la molécula objetivo.
23. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-22 en donde el primer poliéptido Fc y el segundo polipéptido Fc se encuentran a una interfaz y la interfaz del segundo polipéptido Fc comprende una protuberancia que es posicionable en una cavidad en la interfaz del primer polipéptido Fc.
24. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-23 en donde el segundo polipéptido Fc se ha alterado a partir de un polipéptido templado/original para codificar la protuberancia o el primer polipéptido Fc se ha alterado para formar un polipéptido templado/original para codificar la cavidad o ambos.
25. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-24 en donde el segundo polipéptido Fc se ha alterado a partir de un polipéptido templado/original para codificar la protuberancia y el primer polipéptido Fc se ha alterado a partir del polipéptido templado/original para codificar la cavidad o ambos.
26. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-25 en donde el primer polipéptido Fc y el segundo polipéptido Fc se encuentran a una interfaz, en donde la interfaz del segundo polipéptido Fc comprende una protuberancia que es posicionable en una cavidad en la interfaz del primer polipéptido Fc en donde la cavidad o protuberancia o ambas se han introducido en la interfaz del primero y segundo polipéptidos Fc respectivamente.
27. El f agmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 24-26 en donde la protuberancia y la cavidad se han introducido en la interfaz de los polipéptidos Fc respectivos.
28. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 24-27 en donde la protuberancia y la Cavidad cada una comprende un residuo de aminoácido que ocurre de forma natural .
29. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 24-28 en donde el polipéptido Fc comprende la protuberancia que se genera al reemplazar un residuo original a partir de la interfaz de un polipéptido templado/original con un residuo de importación que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el del residuo original .
30. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 24-29 en donde el polipéptido Fc comprende la protuberancia que se genera por un método que comprende una etapa en donde el ácido nucleico que codifica un residuo original a partir de la interfaz de dicho polipéptido se reemplaza con el ácido nucleico que codifica un residuo de importación que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el del original.
31. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicación 29 o 30 en donde el residuo original es treonina.
32. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 29-31 en donde el residuo de importación es arginina (R) .
33. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 29-31 en donde el residuo de importación es fenilalanina (F) .
34. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 29-31 en donde el residuo de importación es tirosina (Y) .
35. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 29-31 en donde el residuo de importación es triptofano (W) .
36. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 23-28 en donde el polipéptido Fc comprende la cavidad que se genera al reemplazar un residuo original en la interfaz de un polipéptido templado/original con un residuo de importación que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el del residuo original.
37. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 23-28 en donde el polipéptido Fc comprende la cavidad que se genera por un método que comprende una etapa en donde el ácido nucleico que codifica un residuo original a partir de la interfaz de dicho polipéptido se reeplaza con el ácido nucleico que codifica un residuo de importación que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el del original.
38. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 36 o 37 en donde el residuo original es treonina.
39. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 36 o 37 en donde el residuo original es leucina .
40. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 36 o 37 en donde el residuo original es tirosina.
41. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 36-40 en donde el residuo de importación no es cisteína (C) .
42. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 36-40 en donde el residuo de importación es alanina (A) .
43. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 36-40 en donde el residuo de importación es serina (S) .
44. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 36-40 en donde el residuo de importación es treonina (T) .
45. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 36-40 en donde el residuo de importación es valina (V) .
46. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 36-45 en donde el polipéptido Fc comprende la cavidad que comprende el reemplazo de dos o más aminoácidos originales seleccionados del grupo que consiste de treonina, leucina y tirosina.
47. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 36-46 en donde el polipéptido Fc comprende la cavidad que comprende dos o más residuos de importación seleccionados del grupo que consiste de alanina, serina, treonina y valina.
48. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 36-47 en donde el polipéptido Fc comprende la cavidad que comprende el reemplazo de dos o más aminoácidos originales seleccionados del grupo que consiste de treonina, leucina y tirosina y en donde dicho aminoácido original se reemplaza con residuos de importación seleccionados del grupo que consiste de alanina, serina, treonina y valina.
49. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 23-48 en donde el polipéptido Fc comprende la cavidad que comprende el reemplazo de treonina en una posición 366 con serina, aminoácido numerado de acuerdo con el esquema de numeración de E.U. de Kabat.
50. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 23-48 en donde el polipéptido Fc comprende la cavidad que comprende el reemplazo de leucina en una posición 368 con alanina, aminoácido numerado de acuerdo con el esquema de numeración de E.U. de Kabat.
51. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 23-50 en donde el polipéptido Fc comprende la cavidad que comprende el reemplazo de tirosina con valina.
52. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 23-51 en donde el polipéptido Fc comprende la cavidad que comprende dos o más reemplazos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste de T366S, L368A y Y407V.
53. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 23-52 en donde el polipéptido Fc comprende la protuberancia que comprende el reemplazo de treonina en una posición 366 con triptofano, aminoácido numerado de acuerdo con el esquema de numeración de E.U. de Kabat .
54. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-53 en donde el primero y segundo polipéptidos Fc cada uno comprende un dominio constante de anticuerpo.
55. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 54 en donde el dominio constante de anticuerpo es un dominio CH2 y/o CH3.
56. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 54 o 55 en donde el dominio constante de anticuerpo es desde un IgG.
57. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 56 en donde IgG es IgGi humano.
58. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-57 que es monoespecífico.
59. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-58 que es una inmunoadhesina monoespecífica .
60. El fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-59 que es una quimera de anticuerpo-inmunoadhesina .
61. Una composición que comprende una población de inmunoglobulinas en donde al menos 75% de las inmunoglobulinas es el fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-60.
62. Un método para preparar el fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-60, que comprende las etapas de: (a) cultivar una célula huésped que comprende el pacido nucleico que codifica al fragmento de anticuerpo; y (b) recuperar el fragmento de anticuerpo a partir del cultivo celular huésped.
63. El método de la reivindicación 62, en donde los polipéptido que comprenden el fragmento de anticuerpo se expresan en proporciones que resultan en una población de inmunoglobulinas en donde el menos el 50% de las inmunoglobulinas son el fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-60.
64. El método de la reivindicación 63, en donde se expresan aproximadamente las cantidades equimolares de dichos polipéptidos .
65. El método de la reivindicación 64, en donde los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos se enlazan operablemente a las regiones de iniciación translacionales (TIR's) de aproximadamente una resistencia igual .
66. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62-65 en donde dicha célula huésped es procariótica,
67. El método de la reivindicación 66, en donde la célula huésped es E. coli.
68. El método de la reivindicación 67, en donde E. coli es de una cepa deficiente en las actividades de proteasa endógena.
69. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62-65, en donde dicha célula huésped es eucariótica.
70. El método de la reivindicación 69, en donde la célula huésped es CHO.
71. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62-70, en donde el fragmento de anticuerpo se recupera a partir del medio de cultivo.
72. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62-70, en donde el fragmento de anticuerpo se recupera a partir del lisado celular.
73. Un método de preparar eñ fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 23-60, comprendiendo las etapas de: (a) cultivar una célula huésped que comprende el ácido nucleico que codifica el fragmento de anticuerpo, en donde el ácido nucleico que codifica la interfaz del segundo polipéptido Fc se ha alterado a partir del ácido nucleico que codifica la interfaz original del segundo polipéptido Fc para codificar la protuberancia o el ácido nucleico que codifica la interfaz del primer polipéptido Fc que se ha alterado a partir del ácido nucleico que codifica la interfaz original del primer polipéptido Fc para codificar la cavidad o ambos; y (b) recuperar el fragmento de anticuerpo a partir del cultivo celular huésped.
74. El método déla reivindicación 73, en donde el ácido nucleico que codifica el segundo polipéptido Fc se ha alterado a partir del ácido nucleico original que codifica la protuberancia y el ácido nucleico que codifica el primer polipéptido se ha alterado a partir del ácido nucleico original para codificar la cavidad.
75. El método de la reivindicación 73, en donde la etapa (a) se precede por una etapa en donde el ácido nucleico que codifica un aminoácido original a partir de la interace del segundo polipéptido Fc se reemplaza con el ácido nucleico que codifica un residuo de aminoácido de importación que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el delresiduo de aminoácido original, en donde el residuo de importación con el volumen de cadena lateral más grande comprende la protuberancia.
76. El método de la reivindicación 73, en donde la etapa (a) se precede por una etapa en donde el ácido nucleico que codifica un residuo de aminoácido original en la interfaz ddel primer polipéptido Fc se reemplaza con el ácido nucleico que codifica un residuo de aminoácido de importación que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el del residuo de aminoácido original a fin de formar la cavidad.
77. El método de la reivindicación 73, en donde la etapa (a) se precede por una etapa en donde el ácido nucleico que codifica el primero y segundo polipéptido Fc se introduce en la célula huésped.
78. Un método para preparar el fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-60 que comprende las etapas de: (a) preparar los polipéptidos que forman el fragmento de anticuerpo; y (b) permitir que ocurra la heteromultimerización; por medio de lo cual se forma el fragmento de anticuerpo.
79. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62-78 en donde al menos el 50% de los complejos del polipéptido de inmunoglobulina que se forman son el fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-60.
80. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62-78 en donde al menos el 50% de los complejos del polipéptido de inmunoglobulina que se forman son heterotrímeros .
81. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62-78 en donde la etapa (b) comprende acoplar in vitro el primer polipéptido Fc y el segundo polipéptido Fc.
82. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62-78 en donde la secuencia de aminoácido de la interfaz original se ha alterado a fin de generar la protuberancia y la cavidad en la interfaz hecha.
83. El ácido nucleico aislado que codifica el fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-60.
84. Una composición que comprende dos o más ácidos nucleicos recombinantes que codifican colectivamente el fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-60.
85. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 83 u 84.
86. La célula huésped de la reivindicación 85 en donde el ácido nucleico que codifica el grupo de unión a antígeno se encuentra presente en un solo vector.
87. La célula huésped de la reivindicación 85 en donde el ácido nucleico que codifica el grupo de unión a antígeno se encuentra presente en vectores separados.
88. La célula huésped de la reivindicación 85 en donde el ácido nucleico que codifica el grupo de unión a antígeno y la cadena pesada truncada N-terminalmente se encuentra presente en un solo vector.
89. Un método para hacer el fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-60 que comprende cultivar una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 83 u 84 por lo que los polipéptidos se expresan y recuperar el fragmento de anticuerpo a partir del cultivo celular.
90. El método de la reivindicación 89 en donde el fragmento de anticuerpo se recupera a partir del medio de lisado celular.
91. El método de la reivindicación 89 en donde el fragmento de anticuerpo se recupera a partir del medio de cultivo celular.
92. El método de la reivindicación 89 en donde la célula huésped es una célula procariótica.
93. El método de la reivindicación 90 en donde la célula huésped es E. coli.
94. El método de la reivindicación 89 en donde la célula huésped es mamífera.
95. Una composición que comprende el fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-60 y un vehículo.
96. Un método de generar un fragmento de anticuerpo que comprende un solo grupo de unión a antígeno y una región Fc que incrementa la estabilidad del fragmento de anticuerpo comparada con una molécula Fab que comprende dicho grupo de unión a antígeno, comprendiendo dicho método expresar en un nucleico de célula huésped adecuado que codifica el grupo de unión a antígeno y un primero y segundo polipéptido Fc bajo condiciones que le permiten la formación del grupo de unión a antígeno y la dimerización del primero y segundo polipéptidos para formar dicha región Fc, en donde uno pero no los dos de los polipéptidos Fc es una cadena pesada truncada N-terminalmente.
97. El método de la reivindicación 96 en donde dicho método genera una población heterogénea de inmunoglobulinas y en donde al menos 50% de las inmunoglobulinas comprende un solo grupo de unión a antígeno y una región Fc que incrementa la estabilidad del fragmento de anticuerpo comparada con una molécula Fab que comprende dicho grupo de unión a antígeno.