JP6173690B2 - 異種ポリペプチドの分泌のための方法及び組成物 - Google Patents

異種ポリペプチドの分泌のための方法及び組成物 Download PDF

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Description

関連出願とのクロスリファレンス
この出願は、２００９年１１月５日に出願された米国特許出願第６１／２５８５６５号の優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりここに援用する。
技術分野
本発明は、一般に、分子生物学及びタンパク質技術の分野に関する。より具体的には、本発明はバクテリアからの異種ポリペプチドの分泌のためのシグナル配列に関する。本発明はまた原核生物で産生された組換えポリペプチド及びその使用に関する。
異種ポリペプチドの大腸菌及び他の原核生物のペリプラスム領域又はその培養物への分泌は、種々のパラメーターに従う。典型的には、関心のあるポリペプチドの分泌のためのベクターは、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡを関心のあるポリペプチドをコードするＤＮＡの５’側に位置させるように改変される。
近年、様々な疾患及び疾病の診断及び治療薬として異種ポリペプチド、例えば、抗体の使用が益々有望視されている。多くの研究及び臨床への応用には多量の機能性抗体又は抗体断片が必要であり、抗体を生産するためのスケールアップされているが経済的な系が求められている。特に有用なものは、大腸菌又は枯草菌のような原核生物から酵母、植物、昆虫細胞及び哺乳動物細胞までの範囲にわたる様々な発現宿主を使用する抗体の組換え生産である。Kipriyanov及びLittle (1999) Mol. Biotech. 12:173-201。
他の抗体生産系と比較すると、細菌、特に大腸菌は多くの独特な利点を提供する。使用される原材料（つまり細菌細胞）が安価で成長させ易く、よって製品コストを低減させる。原核生物宿主は例えば哺乳動物細胞よりもかなり速く成長するので、遺伝子操作の迅速な解析が可能になる。生産時間が短くなりスケールアップが容易になると、細菌発酵が、多量のタンパク質を生産するための更に魅力的な手段になる。大腸菌を含む多くの細菌種のゲノム構造と生物学的活性は十分に研究されており、広範囲の適切なベクターが入手でき、所望の抗体の発現をより簡便に行わせることができる。真核生物と比較すると、組換え遺伝子の操作、複数コピーの宿主中への安定な形質転換、発現誘導及び産物の特徴付けを含み、製造プロセスに関与する工程は少ない。Pluckthun及びPack (1997) Immunotech 3:83-105。
細菌中で組換え抗体を作製するために様々なアプローチ法が使用されている。組換えタンパク質は、細胞質中に発現された封入体のリフォールディングによるか、発現後の細菌細胞膜周辺への分泌によって、細菌から得ることができる。分泌とリフォールディングの選択は一般に幾つかの点を考慮することによって導かれる。分泌は、通常、抗体を生産するためのより速くより一般的に使用されている方策である。上掲のKipriyanov及びLittle (1999)。
原核生物系中での抗体の発現は異なったスケールで実施することができる。振盪フラスコ培養（２−５リットルの範囲）は典型的には５ｍｇ／リットル未満の産物を生じる。Carter等 (1992) Bio/Technology 10:12-16は、抗体断片の高レベルの発現（２ｇ／リットルまで）が得られる高細胞密度発酵系を開発した。Carter等によって得られたＦａｂ'のリットル当たりのグラム力価は、主として、単純な振盪フラスコのものより正確に制御された環境の発酵槽から得られる高細胞密度による。その系は軽鎖及び重鎖断片を同時発現するように設計されたジシストロン性オペロンを含んでいる。ジシストロン性オペロンはホスフェート飢餓により誘導できる単一の大腸菌ｐｈｏＡプロモーターの調節下にある。各抗体鎖の前には細胞膜周辺腔への分泌を指令する大腸菌熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ｓｔＩＩ）シグナル配列がある。
大腸菌中での抗体の生産の総説については、Pluckthun及びPack (1997) Immunotech 3:83-105；Pluckthun等 (1996) ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH, pp203-252 (Oxford Press)；Pluckthun (1994) HANDBOOK OF EXP PHARMCOL VOL 3: THE PHARMCOL OF MONOCLONAL ANTIBODIES, pp269-315 (M. Rosenberg及びG.P. Moore; Springer-Verlag, Berlin)を参照のこと。
多くの生物学的アッセイ（例えばＸ線構造結晶解析）及び臨床への応用（例えばタンパク質療法）には多量の抗体を必要とする。従って、適切に組み合わされた可溶性で機能的な抗体のような異種ポリペプチドを製造するための高収量であるが単純な系に対する必要性が存在している。
ここに引用された、特許出願及び出版物を含む、全ての引用文献の全内容は、出典明示によりここに援用される。
本発明は、共翻訳分泌シグナルペプチド（共翻訳様式での転座を指示するシグナルペプチド）を含むＴＩＲ変異及び／又は翻訳後分泌シグナルペプチド（翻訳後様式での転座を指示するシグナルペプチド）を含むＴＩＲ変異を含む、新規の翻訳開始領域（ＴＩＲ）変異の使用を含む異種タンパク質の産生の増加のための新規の方法を提供する。更に、ここで示されるのは、ピーク発現のための、共翻訳又は翻訳後分泌シグナルペプチドを含むＴＩＲに作用可能に連結される抗体軽鎖と共翻訳分泌シグナルペプチドを含むＴＩＲに作用可能に連結される抗体重鎖を含むベクターを用いた増加された抗体の産生である。新規のＴＩＲ変異体がまたここで提供される。
一態様では、本発明は、翻訳開始領域を提供する。幾つかの実施態様では、変異体は変異翻訳開始領域（幾つかの実施態様では、原核生物翻訳後分泌シグナル配列又は原核生物共翻訳分泌シグナル配列）を含む。幾つかの実施態様では、変異体は、ＰｈｏＡ、ＭａｌＥ、ＤｓｂＡ又はＳＴＩＩのような分泌シグナル配列の核酸変異を含む。幾つかの実施態様では、変異体は更にＭｌａＩ、ＢｓｓＨＩＩ又はＸｂａＩ制限サイトを含む。幾つかの実施態様では、変異体は、表２に示す配列を含む翻訳開始領域変異を含む。
一態様では、本発明は変異分泌シグナル配列を提供する。幾つかの実施態様では、分泌シグナル配列は原核生物翻訳後分泌シグナル配列又は原核生物共翻訳分泌シグナル配列である。幾つかの実施態様では、変異体はＰｈｏＡ、ＭａｌＥ、ＤｓｂＡ又はＳＴＩＩ分泌シグナル配列の核酸変異体である。幾つかの実施態様では、変異体は表２に示す分泌シグナル配列を含む。本発明の変異分泌シグナル配列は、例えば、ここに開示する任意の方法における使用に適している。
別の態様では、本発明は本発明の翻訳開始領域を含むポリペプチドを提供する。幾つかの実施態様では、翻訳開始領域は、表２に示す配列（例えば、配列番号１から４２の一つ）を含む。幾つかの実施態様では、翻訳開始領域は、配列番号１から１４、１６から２４、２６から３９、４１から４２の一つを含む。ポリヌクレオチドは、例えば、ここに開示する任意の方法における使用に適している。
別の態様では、本発明は、本発明の分泌シグナル配列を含むポリヌクレオチドを提供する。幾つかの実施態様では、分泌シグナル配列は、表２に示す配列を含む。（例えば、配列番号１から４２の一つ）。幾つかの実施態様では、翻訳開始領域は、配列番号１から１４、１６から２４、２６から３９、４１から４２の一つを含む。ポリヌクレオチドは、例えば、ここに開示する任意の方法における使用に適している。
別の態様では、本発明は、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される本発明の翻訳開始領域を含むポリヌクレオチドであって、これによって、宿主（例えば、原核生物宿主細胞、例えば、大腸菌細胞）における異種ポリペプチドの発現において、異種ポリペプチドが折りたたまれ、集合して生物学的に活性な異種ポリペプチドを形成するポリヌクレオチドを提供する。異種ポリペプチドの例を更にここに開示する。幾つかの実施態様では、異種ポリペプチドは、抗体重鎖である。幾つかの実施態様では、異種ポリペプチドは、抗体軽鎖である。幾つかの実施態様では、異種ポリペプチドは、Ｆｃポリペプチドである。幾つかの実施態様では、異種ポリペプチドは、多量体ポリペプチドである。幾つかの実施態様では、異種ポリペプチドは、異種多量体である。幾つかの実施態様では、翻訳開始領域は、ここに開示する任意の翻訳開始領域、例えば、表２に示す配列を含む翻訳開始領域である。幾つかの実施態様では、翻訳開始領域は、配列番号１から４２の一つの配列を含む。幾つかの実施態様では、翻訳開始領域は、配列番号１から１４、３６から３９、４１から４２の一つの配列を含む。幾つかの実施態様では、翻訳開始領域は、変異ＳＴＩＩ、ＤｓｂＩ、ＰｈｏＡ、又はＭａｌＥシグナル配列を含む。
別の態様では、本発明は、（１）ＴＩＲが共翻訳原核生物シグナル配列を含む、第一の異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される第一の翻訳開始領域（ＴＩＲ）；及び、（２）第二のＴＩＲが共翻訳又は翻訳後原核生物分泌シグナル配列を含む、第二の異種をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される第二のＴＩＲを含むポリヌクレオチドであって、これによって、宿主細胞中の抗体の発現において、第一と第二の異種ポリペプチドが生物学的に活性な抗体を形成するように折りたたまれ集合するポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では、本発明は、（１）抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される本発明の第一の翻訳開始領域、及び、（２）抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される第二の翻訳開始領域を含むポリヌクレオチドであって、これによって、宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞、例えば、大腸菌宿主細胞）中の抗体の発現において、重鎖と軽鎖が生物学的に活性な抗体を形成するように折りたたまれ集合するポリヌクレオチドを提供する。
幾つかの実施態様では、第一の翻訳開始領域は、共翻訳原核生物分泌シグナル配列（例えば、シグナル認識ペプチドを介する翻訳を指示するシグナル配列）を含む。幾つかの実施態様では、第一の翻訳開始領域は、ＳＴＩＩ又はＤｓｂＡシグナル配列を含む。幾つかの実施態様では、第一の翻訳開始領域はＤｓｂＡシグナル配列を含む。幾つかの実施態様では、第一の翻訳開始領域は、ＰｈｏＡ又はＭａｌＥシグナル配列を含む。幾つかの実施態様では、第一の翻訳開始領域は、配列番号：１から１０及び３６から２９及び４１及び４２の一つの配列を含む。幾つかの実施態様では、第一の翻訳開始領域は、配列番号１から４２の一つの配列を含む。幾つかの実施態様では、第一の翻訳開始領域は、配列番号１から１４，１６から２４、２６から３９、４１から４２の一つの配列を含む。
幾つかの実施態様では、第二の翻訳開始領域は（ｉ）共翻訳原核生物分泌シグナル配列又は翻訳後原核生物分泌シグナル配列（例えば、ｓｅｃ経路を介する翻訳を指示するシグナル配列）を含む。幾つかの実施態様では、第二の翻訳開始領域は、ＳｔＩＩ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ又はＰｈｏＡシグナル配列を含む。幾つかの実施態様では、第二の翻訳開始領域は、ＰｈｏＡ又はＭａｌＥシグナル配列を含む。幾つかの実施態様では、第二の翻訳開始領域は、配列番号１から４２の一つの配列を含む。幾つかの実施態様では、第二の翻訳開始領域は、配列番号１から１４、１６から２４、２６から３９、４１から４２の一つの配列を含む。
幾つかの実施態様では、抗体をコードするポリヌクレオチドは、（３）Ｆｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される第三の翻訳開始領域を更に含む。幾つかの実施態様では、第三の翻訳開始領域は、ＳＴＩＩ、ＰｈｏＡ又はＤｓｂＡシグナル配列を含む。幾つかの実施態様では、第三の翻訳開始領域は、ＤｓｂＡシグナル配列を含む。幾つかの実施態様では、第三の翻訳開始領域は、ＰｈｏＡシグナル配列を含む。
別の態様では、本発明は、（１）ＴＩＲが共翻訳原核生物分泌シグナル配列を含み、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される第一の翻訳開始領域（ＴＩＲ）；及び（２）第二のＴＩＲが共翻訳又は翻訳後原核生物分泌シグナル配列を含み、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結された第二のＴＩＲを含み、これにより、宿主細胞中の抗体発現において、重鎖及び軽鎖が折りたたまれ、集合して生物学的に活性な抗体を形成する、ポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では、本発明は、抗体断片（例えば、一価抗体断片）をコードするポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは（１）抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される本発明の第一の翻訳開始領域；（２）抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される第二の翻訳開始領域；及び（３）Ｆｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される第三の翻訳開始領域を含み、これにより、宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞）中の抗体発現における、重鎖、軽鎖及びＦｃポリペプチドが折りたたまれ、集合して生物学的に活性な抗体（例えば、一アーム抗体）を形成する。幾つかの実施態様では、第三の翻訳開始領域は、共翻訳原核生物分泌シグナル配列又は翻訳後原核生物分泌シグナル配列を含む。幾つかの実施態様では、第三の翻訳開始領域はＳＴＩＩ、ＰｈｏＡ、ＭａｌＥ、又はＤｓｂＡシグナル配列を含む。幾つかの実施態様では、第三の翻訳開始領域は、ＤｓｂＡシグナル配列を含む。幾つかの実施態様では、第三の翻訳開始領域は、ＰｈｏＡシグナル配列を含む。幾つかの実施態様では、第三の翻訳開始領域は、配列番号１から４２の一つの配列を含む。幾つかの実施態様では、第三の翻訳開始領域は、配列番号１から１４、１６から２４、２６から３９、４１から４２の一つの配列を含む。
別の態様では、本発明は、抗体をコードするポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは（１）第一の翻訳開始領域がＳＴＩＩ又はＤｓｂＡシグナル配列を含み、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される本発明の第一の翻訳開始領域；（２）第二の翻訳開始領域がＳＴＩＩ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ又はＰｈｏＡシグナル配列を含み、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される第二の翻訳開始領域を含み、これにより、宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞）中の抗体発現における、軽鎖及び重鎖が折りたたまれ、集合して生物学的に活性な抗体を形成する。幾つかの実施態様では、第一の翻訳開始領域はＤｓｂＡシグナル配列を含み、第二のほんやくは、ＭａｌＥ又はＰｈｏＡシグナル配列を含む。幾つかの実施態様では、抗体をコードするポリヌクレオチドは更に（３）Ｆｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される第三の翻訳開始領域を含む。幾つかの実施態様では、第三の翻訳開始領域はＳＴＩＩ、ＰｈｏＡ又はＤｓｂＡシグナル配列を含む。幾つかの実施態様では、第三の翻訳開始領域は、ＰｈｏＡシグナル配列を含む。幾つかの実施態様では、第三の翻訳開始領域は、ＤｓｂＡシグナル配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記変異翻訳開始領域の翻訳強度は、野生型の翻訳開始領域の翻訳強度よりも小さい。幾つかの実施態様では、前記変異翻訳開始領域の翻訳強度は、野生型の翻訳開始領域の翻訳強度よりも大きい。幾つかの実施態様では、翻訳開始変異体のアミノ酸配列は、野生型のアミノ酸配列と比較して変化しない。幾つかの実施態様では、翻訳変異体のアミノ酸配列は、野生型のアミノ酸配列と比較して変化している。幾つかの実施態様では、翻訳開始領域は、原生生物分泌シグナル配列を含む。幾つかの実施態様では、第一及び第二の翻訳開始領域（及び幾つかの実施態様では、第三の翻訳開始領域）は、ほぼ等しい翻訳強度を示す。幾つかの実施態様では、相対翻訳強度は約１又は２である。幾つかの実施態様では、相対翻訳強度は、約２である。幾つかの実施態様では、相対翻訳強度は１及び／又は２である。幾つかの実施態様では、相対翻訳強度は約３又は４である。幾つかの実施態様では、相対翻訳強度は、１又は１、２、３、４、５、又はそれ以上から選択される（例えば、６又は７以上）。
幾つかの実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、異種ポリペプチドと作用可能に連結されるプロモーターを更に含む。幾つかの実施態様では、プロモーターはｐｈｏＡ、ｔａｃ、ｌｐｐ、ｌａｃ−ｌｐｐ、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｒｐ、及びＴ７プロモーターからなる群から選択される原核生物プロモーターである。幾つかの実施態様では、プロモーターはｐｈｏＡプロモーターである。抗体重鎖及び軽鎖の発現に関する幾つかの実施態様では、ポリヌクレオチドは更に（ａ）第一のプロモーターが軽鎖と作用可能に連結される、第一のプロモーター及び（ｂ）第二のプロモーターが重鎖と作用可能に連結される、第二のプロモーターを含む。幾つかの実施態様では、第一及び第二のプロモーターは双方共にｐｈｏＡプロモーターである。抗体重鎖及び軽鎖とＦｃポリペプチドの発現に関する幾つかの実施態様では、ポリヌクレオチドは（ｃ）第三のプロモーターがＦｃポリペプチドと作用可能に連結される第三のプロモーターを更に含む。幾つかの実施態様では、第三のプロモーターはＦｃポリペプチドである。
一以上のポリペプチド（例えば、重鎖と軽鎖を含む抗体）を含むポリペプチドを発現する際、ポリペプチドの発現のためのポリヌクレオチドは、ポリシストロン性のポリヌクレオチド（即ち、単一のプロモーターの調節制御下の複数のシストロンを含み発現する単一のポリヌクレオチド）であり得る。ポリシストロン性ベクターの一般的な例は、１個のプロモーターの制御下の２つの異なるポリペプチドを含み発現する「ジシストロン性」ベクターである。ジシストロン性又はポリシストロン性ベクターの発現において、複数コード領域（例えば、遺伝子）は最初に単一の転写ユニットとして転写され、次いで別々に翻訳される。シストロンは広義にはポリペプチド鎖と隣接する制御領域（例えば、ＴＩＲを含む）をコードするヌクレオチド配列を含む翻訳ユニットと同じ遺伝子要素である。他の実施態様では、ポリヌクレオチドは別個のシストロンを含み得、各シストロンがその固有のプロモーターの制御下にある、少なくとも２つの別個のプロモーター−シストロンペアを含む単一のポリヌクレオチドを意味する。別個のシストロン発現ベクターの発現において、異なる遺伝子の転写と翻訳過程は双方共に別個で独立している。更に別の実施態様では、ポリヌクレオチドはポリシストロン性の部位と別個のシストロン性部位を含み得る。
更に別の態様では、本発明は本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。幾つかの実施態様では、ベクターは発現ベクターである。
更に別の態様では、本発明は本発明の一以上のポリヌクレオチドと担体を含む組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬学的に許容可能である。
一態様では、本発明は本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。幾つかの実施態様では、宿主細胞は抗体（幾つかの実施態様では、二重特異的又は一アーム抗体）をコードする本発明のポリヌクレオチドを含む。宿主細胞は集合的に抗体をコードする一以上のポリヌクレオチドを含み得る。ベクターは任意の型、例えば、発現ベクターのような組換えベクターであり得る。種々の宿主細胞の任意のものを使用し得る。一実施態様では、宿主細胞は、原核生物細胞、例えば、大腸菌である。幾つかの実施態様では、大腸菌は内在性プロテアーゼ活性を欠損する株である。幾つかの実施態様では、大腸菌の遺伝子型はｄｅｇＰ及びｐｒｃ遺伝子を欠損し、変異ｓｐｒ遺伝子を有する。
幾つかの実施態様では、宿主細胞は更に原核生物シャペロンタンパク質（例えば、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、ＦｋｐＡ及び／又はＤｓｂＧ））をコードするポリヌクレオチドを含む。幾つかの実施態様では、シャペロンタンパク質は、宿主細胞中で過剰発現する。幾つかの実施態様では、シャペロンタンパク質はＤｓｂＡ及び／又はＤｓｂＣである。
一態様では、宿主細胞は、集合的に一アーム抗体をコードする一以上のポリヌクレオチドを含む。一実施態様では、単一のポリヌクレオチドは（ａ）一アーム抗体の軽鎖及び重鎖成分、及び（ｂ）Ｆｃポリペプチドをコードする。一実施態様では、単一のポリヌクレオチドは一アーム抗体の軽鎖及びＦｃポリペプチド成分をコードし、別個のポリヌクレオチドは重鎖ポリペプチドをコードする。一実施態様では、単一のポリヌクレオチドは一アーム抗体の重鎖及びＦｃポリペプチド成分をコードし、別個のポリヌクレオチドは一アーム抗体の軽鎖成分をコードする。一実施態様では、別個のポリヌクレオチドは、それぞれ、一アーム抗体の軽鎖成分、一アーム抗体の重鎖成分及びＦｃポリペプチドをコードする。
異種ポリペプチドをここに記載する。幾つかの実施態様では、異種ポリペプチドは抗体である。幾つかの実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。他の実施態様では、抗体はポリクローナル抗体である。幾つかの実施態様では、抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体からなる群から選択される。特定の実施態様では、抗体は二重特異的抗体である。特定の実施態様では、抗体は抗体断片である。幾つかの実施態様では、抗体は一価抗体である。幾つかの実施態様では、抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、又はｓｃＦｖである。幾つかの実施態様では、抗体はＦｃ領域を含む一アーム抗体（即ち、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは単一の抗原結合アームを形成する。）であり、Ｆｃ領域は第一及び第二のＦｃポリペプチドを含み、第一及び第二のＦｃポリペプチドは複合体中に存在し、前記抗原結合アームを含むＦａｂ分子と比較して前記抗体断片の安定性を増加させるＦｃ領域を形成する。
幾つかの実施態様では、抗体はｃ−ｍｅｔに結合する（幾つかの実施態様では、特異的に結合する）。幾つかの実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は（ａ）配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＬＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＭＩＤＰＳＮＳＤＴＲＦＮＰＮＦＫＤＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＹＲＳＹＶＴＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号：４３）
を有する重鎖可変ドメイン、ＣＨ１配列、及び第一のＦｃポリペプチドを含む第一のポリペプチド；（ｂ）配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＬＹＴＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲ ＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＡＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ
（配列番号：４４）
を有する軽鎖可変ドメイン、及びＣＬ配列を含む第二のポリペプチド；及び（ｃ）第二のＦｃポリペプチドを含む第三のポリペプチドを含み、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは複合体として存在し、単一抗原結合アームを形成し、第一及び第二のＦｃポリペプチドは複合体中に存在し、前記抗原結合アームを含むＦａｂ分子と比較して前記抗体断片の安定性を増加させるＦｃ領域を形成する。幾つかの実施態様では、第一のポリペプチドは、図７（配列番号：６８）中に記載されるＦｃ配列を含み、第二のポリペプチドは図８（配列番号：４７）に記載されるＦｃ配列を含む。幾つかの実施態様では、第一のポリペプチドは、図８（配列番号：４７）中に記載されるＦｃ配列を含み、第二のポリペプチドは図７（配列番号：６８）に記載されるＦｃ配列を含む。
幾つかの実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は（ａ）重鎖可変ドメインを含む第一のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＬＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＭＩＤＰＳＮＳＤＴＲＦＮＰＮＦＫＤＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＹＲＳＹＶＴＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号：４５）
を含むポリペプチド；（ｂ）軽鎖可変ドメインを含む第二のポリペプチドであって、ポリペプチドが配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＬＹＴＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＡＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号：４６）
を含むポリペプチド；及びＦｃポリペプチドを含む第三のポリペプチドであって、ポリペプチドが配列：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号：４７）を含むポリペプチドを含み、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインが複合体として存在し、前記抗原結合アームを含むＦａｂ分子と比較して前記抗体断片の安定性を増加させるＦｃ領域を形成する。
一実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、図７（配列番号：５２から５３及び６６）に記載の一以上のＣＤＲ１−ＨＣ、ＣＤＲ２−ＨＣ及びＣＤＲ３−ＨＣ配列を含む重鎖可変ドメインを含む。幾つかの実施態様では、抗体は、図７（配列番号：４９から５１）に記載の一以上のＣＤＲ１−ＬＣ、ＣＤＲ２−ＬＣ及びＣＤＲ３−ＬＣ配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。幾つかの実施態様では、重鎖可変ドメインは、図７（配列番号：６２から６５）に記載のＦＲ１−ＨＣ、ＦＲ２−ＨＣ、ＦＲ３−ＨＣ及びＦＲ４−ＨＣ配列を含む。幾つかの実施態様では、軽鎖可変ドメインは図７（配列番号５７から６０）に記載のＦＲ１−ＬＣ、ＦＲ２−ＬＣ、ＦＲ３−ＬＣ及びＦＲ４−ＬＣ配列を含む。
幾つかの実施態様では、抗体は、抗体断片中のＦｃ配列のホモ二量体化を最小化にする一方で、ヘテロ二量体化を促進する少なくとも１つの特性を含む。このような特性は、ここに記載の通り本発明の方法によって得られるイムノグロブリン集団の収量及び／又は純度及び／又は均一性を改善する。一実施態様では、第一のＦｃポリペプチド及び第二のＦｃポリペプチドはインターフェースで会合／相互作用する。第一及び第二のＦｃポリペプチドがインターフェースで会合する幾つかの実施態様では、第二のＦｃポリペプチド（配列）のインターフェースは、第一のＦｃポリペプチド（配列）のインターフェース中の孔（「ホール」とも呼ばれる）中に存在し得る突起（「ノブ」とも呼ばれる）を含む。一実施態様では、国際公開第２００５／０６３８１６号に記載される通り、抗体は「ノブ」と「ホール」を構成するＦｃ変異を含む。例えば、ホール変異はＦｃポリペプチド中の一以上のＴ３６６Ａ、Ｌ３６８Ａ及び／又はＹ４０７Ｖであり、ノブ変異はＴ３６６Ｗであり得る。
本発明はまた本発明の変異ＴＩＲ及びシグナル配列を用いた方法を提供する。ここに開示される変異ＴＩＲ、シグナル配列及びポリヌクレオチドは何れも、例えば、ここに開示される本発明の方法のような、方法における使用に適している。更なる態様では、本発明は本発明の異種ポリペプチドを作製する方法を提供する。例えば、本発明は異種ポリペプチド（例えば、ここに定義される通り、全長抗体及びその断片を含む抗体）を調製する方法を提供し、前記方法はポリヌクレオチドが発現するための、本発明のポリヌクレオチド（例えば、翻訳開始領域を含むポリヌクレオチド）を含む宿主細胞の培養を含み、これにより、宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞）中の前記ポリヌクレオチドの発現において、異種ポリペプチドが折りたたまれ、生物学的に活性な異種ポリペプチドを形成する。抗体の発現に関する実施態様では、宿主細胞中の前記ポリヌクレオチドの発現において、軽鎖及び重鎖が折りたたまれ、集合して生物学的に活性な抗体を形成する。幾つかの実施態様では、方法は更に宿主細胞培養からの異種ポリペプチド（例えば、抗体）の回収を含む。幾つかの実施態様では、異種ポリペプチドは宿主細胞培養から回収される。幾つかの実施態様では、発明は更に回収した異種ポリペプチド（例えば、抗体）と薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は異種ポリペプチド（例えば、抗体）を含む薬学的製剤を製造するための担体とを組み合わせることを含む。
一態様では、本発明は細胞から関心のある異種ポリペプチドを分泌する方法を提供し、前記方法は、ポリヌクレオチドを発現し、異種ポリペプチドを分泌するために、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することを含む。
一態様では、本発明は細胞から関心のある異種ポリペプチドを転座する方法を提供し、前記方法は、ポリヌクレオチドを発現し、異種ポリペプチドを転座するために、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することを含む。
別の態様では、本発明は、翻訳開始領域のポリヌクレオチド変異のセットの制御下のポリペプチドの発現レベルの比較を含む細胞中の関心のある異種ポリペプチドの分泌の最適化し、ここで、変異体のセットは翻訳強度の範囲を示し、成熟ポリペプチド産生の最適な翻訳強度を決定する方法を提供する。幾つかの実施態様では、最適な翻訳強度は、野生型の翻訳開始領域の翻訳強度よりも小さい。幾つかの実施態様では、最適な翻訳強度は、野生型の翻訳開始領域の翻訳強度よりも大きい。幾つかの実施態様では、変異体は分泌シグナル配列のポリヌクレオチド変異体を含む。幾つかの実施態様では、変異分泌シグナル配列は、ｓｅｃ経路シグナル配列及び／又はＳＰＲ経路シグナル配列である。幾つかの実施態様では、変異分泌シグナル配列は、ＰｈｏＡ、ＭａｌＥ、ＤｓｂＡ、又はＳＴＩＩ変異シグナル配列である。幾つかの実施態様では、変異は表３に示す一以上の変異である。幾つかの実施態様では、変異体は配列番号１から１４、３６から３９、４１から４２の一つの配列を含む。
一態様では、本発明はここに記載の通り本発明の方法によって得られる異種ポリペプチドを提供する。幾つかの実施態様では、異種ポリペプチドは抗体である。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性障害、及び／又は免疫（例えば、自己免疫）疾患のような疾患の治療及び／又は予防的治療のための医薬の調製における、本発明の方法を用いて得られた異種ポリペプチドの使用を提供する。異種ポリペプチドは、抗体、抗体断片、ポリペプチド（例えば、オリゴペプチド）、又はそれらの組み合わせを含む、ここに記載の任意の形態であり得る。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患及び／又は免疫（例えば、自己免疫）疾患のような、疾患の治療及び／又は予防的治療のための医薬の調製における本発明のポリヌクレオチドの使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患及び／又は免疫（例えば、自己免疫）疾患のような、疾患の治療及び／又は予防的治療のための医薬の調製における本発明の発現ベクターの使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患及び／又は免疫（例えば、自己免疫）疾患のような、疾患の治療及び／又は予防的治療のための医薬の調製における本発明の宿主細胞の使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患及び／又は免疫（例えば、自己免疫）疾患のような、疾患の治療及び／又は予防的治療のための医薬の調製における本発明の製品の使用を提供する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖性疾患及び／又は免疫（例えば、自己免疫）疾患のような、疾患の治療及び／又は予防的治療のための医薬の調製における本発明のキットの使用を提供する。
大腸菌の内膜を透過する指示シグナルペプチドの転座。マルトース結合ペリプラズムタンパク質（ＭａｌＥ）とアルカリフォスファターゼ（ＰｈｏＡ）シグナルペプチドは、分子モーターＳｅｃＡを用いて翻訳後様式で細胞質からペリプラズムへの転座を指示する。熱耐性エンテロトキシンＩＩ（ＳｔＩＩ）とチオール：ジスルフィド交換タンパク質（ＤｓｂＡ）シグナルペプチドは、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）を用いた共翻訳様式で転座を指示する。 シグナルペプチド変異体の相対転座開始領域強度。ＳＴＩＩ、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡ、又はＤｓｂＡシグナルペプチドの何れかと大腸菌アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）遺伝子の成熟ドメインとの融合を用いたベクターを有する２７Ｃ７細胞の規格化基底アルカリフォスファターゼ活性。各バーは発色基質ＰＮＰＰと共にインキュベートした個々の培養を示し、酵素活性を空ベクター（ｐＢＲ３２２）を有する培養物の吸収よりも小さい４１０ｎｍの吸光度として決定した。活性は、プラスミドｐＰｈｏ４１を有する２７Ｃ７細胞の基底活性まで規格化した。白バーは、開始コドンの第一塩基対と比較して−９の位置にあるＢｓｓＨＩＩ制限サイトを有するシグナルペプチド変異体を示す。灰色又は縞のバーは、それぞれ−９位におけるＭｌｕＩ又はＸｂａＩサイトを示す。全ての活性は、７から１０回の反復実験の平均である。エラーバーは、９５％信頼限界の平均の不確かさとして報告されている。隣接バー間の相対ＴＩＲ強度の差異は、全て統計的に有意である（Ｐ＜＜０．００１）。バーは、クローンＳＨ１．２、ＳＨ２．４１、ＳＨ３．３８、ＳＨ４．６０、ＳＨ５．３４、ＳＨ６．５２、ＳＨ８．３６、ＳＬ１．２、ＳＬ２．７４、ＳＬ３．７２、ＭＨ１．９２、ＭＨ２．１００、ＭＬ１．９７、ＭＬ２．１２３、ＭＸ１．ｗｔ、ＭＸ２．１５、ＭＸ３．１２、ＭＸ５．３７、ＭＸ６．４、ＭＸ７．２５、ＭＸ８．１３、ＭＸ１１．３４、ＰＨ１．７０、ＰＨ２．６４、ＰＨ３．ｗｔ、ＰＨ４．６７、ＰＨ５．７１、ＰＨ６．７７、ＰＬ１．１０４、ＰＸ２．４１、ＰＸ３．ｗｔ、ＰＸ５．５３、ＰＸ６．１５、ＰＸ８．２４、ＰＸ１０．２３、ＤＨ１．４８、ＤＨ２．ｗｔ、ＤＨ３．７９、ＤＨ７．７２、ＤＬ１．ｗｔ、ＤＬ２．３、ＤＬ３．３７を示す（左から右の順）。 重鎖シグナルペプチド操作を用いた抗体種の会合の観察。６４Ｂ４細胞を２５ｍＬのＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ．リン酸制限培地で２４時間培養し、可溶画分並びに光学密度（ＯＤ）で規格化した全タンパク質ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のために調製した。（Ａ）プラスミドｐＢＲ−ＳＳ−５Ｄ５−１．１（ＳＳ１．１）、ｐＢＢＲ−ＭＳ−５Ｄ５−１．１（ＭＳ１．１）、ｐＢＲ−ＤＳ−５Ｄ５−１．１（ＤＳ１．１）又はｐＢＲ−ＰＳ−５Ｄ５−１．１（ＰＳ１．１）を有する細胞からのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動（左側にｋＤａで示す重量）で分離し、ニトロセルロースに移し、α−Ｆｃ特異抗体を用いて重鎖を含む種の存在を調べた。可溶サンプル（一番上のブロット）は、（一番上から一番下の順で）：全長抗体、重−重−軽（ＨＨＬ）、重−軽（ＨＬ）又は遊離重鎖（重鎖モノマー）に相当する推定的に同定されたバンドからなる。規格化した、全タンパク質サンプル（一番上のブロット）は、０．０２ＭのＤＴＴで還元して、ジスルフィド結合構造を壊し、各個別のレーンは、約４９Ｄａの見かけの重量を有する単一のバンドまで移動した。（Ｂ）（Ａ）からのサンプルは、別個のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（右側のｋＤａで示す重量）で泳動し、ニトロセルロースに移し、α−κＬｃ特的抗体を用いて軽鎖を含む複合体を調べた。可溶サンプル（一番上のブロット）は、（一番上から一番下の順で）：全長抗体、ＨＬ、軽−軽（ＬＬ）ダイマー又は遊離軽鎖（軽鎖モノマー）に相当する推定的に同定されたバンドからなる。規格化した、全タンパク質サンプル（一番上のブロット）は、０．２ＭのＤＴＴで還元し、各個別のレーンは、約２５ｋＤａの見かけの重量を有する単一のバンドまで移動した。略語：Ｓ＝シグナル配列ＳＴＩＩ Ｍ＝シグナル配列ＭａｌＥ Ｄ＝シグナル配列ＤｓｂＡ Ｐ＝シグナル配列ＰｈｏＡ。ＸＸ＃．＃（例えば、ＤＳ１．１）は、実験で使用される重鎖シグナル配列、軽鎖シグナル配列、重鎖ＴＩＲ、軽鎖ＴＩＲを意味する。 軽鎖シグナルペプチド操作を用いた抗体種の会合の観察。６４Ｂ４細胞を２５ｍＬのＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ．リン酸制限培地で２４時間培養し、可溶画分並びに光学密度（ＯＤ）で規格化した全タンパク質ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のために調製した。プラスミドｐＢＲ−ＤＳ−５Ｄ５−１．１（ＤＳ１．１）、ｐＢＲ−ＤＳ−５Ｄ５−１．２（ＤＳ１．２）、ｐＢＲ−ＤＭ−５Ｄ５−１．１（ＤＭ１．１）、ｐＢＲ−ＤＭ−５Ｄ５−１．２（ＤＭ１．２）、ｐＢＲ−ＤＤ−５Ｄ５−１．１（ＤＤ１．１）、ｐＢＲ−ＤＤ−５Ｄ５−１．２（ＤＤ１．２）、ｐＢＲ−ＤＰ−５Ｄ５−１．１（ＤＰ１．１）、又はｐＢＲ−ＤＰ−５Ｄ５−１．２を有する細胞からのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動（左側にｋＤａで示す重量）で分離し、ニトロセルロースに移し、画像の右側に添って示す通り、それぞれ、α−Ｆｃ又はα−κＬｃ特異抗体を用いて重鎖又は軽鎖を含む種の存在を調べた。可溶サンプル（一番上のブロット）は、（一番上から一番下の順で）：全長抗体、重−重−軽（ＨＨＬ）、重−軽（ＨＬ）又は遊離重鎖（重鎖モノマー）に相当する推定的に同定されたバンドからなる。規格化した、全タンパク質サンプル（中間のブロット、一番下）は、０．２ＭのＤＴＴで還元して、ジスルフィド結合構造を壊し、各個別のレーンは、α−Ｆｃ抗体で調べた場合に、約４９Ｄａの見かけの重量を有する単一のバンドまで移動した。α−κＬｃ特異抗体で調べた場合、約２５ｋＤａ又は約２７ｋＤａ及び約２５ｋＤａの見かけの重量を有する単一又は二重のバンドまで移動した。略語：Ｓ＝シグナル配列ＳＴＩＩ Ｍ＝シグナル配列ＭａｌＥ Ｄ＝シグナル配列ＤｓｂＡ Ｐ＝シグナル配列ＰｈｏＡ。 ＸＸ＃．＃（例えば、ＤＳ１．１）は、実験で使用される重鎖シグナル配列、軽鎖シグナル配列、重鎖ＴＩＲ、軽鎖ＴＩＲを意味する。 １０Ｌ発酵からの時間をかけた抗体種の会合の観察。そこから可溶画分並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析のための光学密度（ＯＤ）で規格化した全タンパク質ペレットが調製されるサンプルを規定時間間隔で採りながら（播種後数時間の上記の各レーンから採った時間サンプル）、６４Ｂ４細胞を、３日間、１０Ｌの発酵で高細胞密度まで培養した。シャペロン含有プラスミドｐＪＪ２４７を共発現するｐＢＲ−ＳＳ−５Ｄ５−１．１（ＳＳ１．１＋シャペロン）、ｐＪＪ２４７を伴うｐＢＲ−ＤＤ−５Ｄ５−１．１（ＤＤ１．１＋シャペロン）、ｐＪＪ２４７を伴うｐＢＲ−ＤＳ−５Ｄ５−１．１（ＤＭ１．１＋シャペロン）、又はｐＪＪ２４７を伴うｐＢＲ−ＤＰ−５Ｄ５−１．１（ＤＰ１．１＋シャペロン）を有する細胞からのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動（左側にｋＤａで示す重量）で分離し、ニトロセルロースに移し、画像の右側に添って示す通り、それぞれ、α−Ｆｃ又はα−κＬｃ特異抗体を用いて重鎖又は軽鎖を含む種の存在を調べた。可溶サンプル（一番上のブロット）は、（一番上から一番下の順で）：全長抗体、重−重−軽（ＨＨＬ）、重−軽（ＨＬ）又は遊離重鎖（重鎖モノマー）に相当する推定的に同定されたバンドからなる。規格化した、全タンパク質サンプル（中間のブロット、一番下）は、０．２ｍＭのＤＴＴで還元して、ジスルフィド結合構造を壊し、各個別のレーンは、α−Ｆｃ抗体で調べた場合に、約４９Ｄａの見かけの重量を有する単一のバンドまで移動した。α−κＬｃ特異抗体で調べた場合、全てのレーンが約２５ｋＤａの見かけの重量を有する単一のバンドまで移動した。略語：Ｓ＝シグナル配列ＳＴＩＩ Ｍ＝シグナル配列ＭａｌＥ Ｄ＝シグナル配列ＤｓｂＡ Ｐ＝シグナル配列ＰｈｏＡ。ＸＸ＃．＃（例えば、ＤＳ１．１）は、実験で使用される重鎖シグナル配列、軽鎖シグナル配列、重鎖ＴＩＲ、軽鎖ＴＩＲを意味する。 誘導条件における成熟ＰｈｏＡの蓄積。２７Ｃ７細胞を２５ｍＬのＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ．リン酸制限培地で２４時間培養し、可溶画分を光学強度（ＯＤ）で規格化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析で調製した。大腸菌ｐｈｏＡ遺伝子の成熟ドメインを、指定のＤｓｂＡ又はＳＴＩＩ（一番下）ＴＩＲ変異体（一番上）に融合した。ゲルをタンパク質の存在についてクマシーブルーで可視化した。ＰｈｏＡ（右）の成熟ドメインに相当する推定的に同定したバンドは、約４７ｋＤａ（左側に示す重量）において出現した。 ＭｅｔＭＡｂ(ＯＡ５Ｄ５ｖ２)のフレームワーク(ＦＲ)、ＣＤＲ、第１の定常ドメイン(ＣＬ又はＣＨ１)及びＦｃ領域(Ｆｃ)のアミノ酸配列を示す。図は出現する順で、それぞれ、配列番号５７から６０、４９から５１及び６１としての軽鎖配列と、出現する順で、それぞれ、配列番号６２から６５、５２から５３及び６６から６８としての重鎖配列を開示する。示されたＦｃ配列は、国際公開第２００５／０６３８１６号に記載されているような、「ホール」(キャビティ)変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。 国際公開第２００５／０６３８１６号に記載されているような、「ノブ」(***)変異Ｔ３６６Ｗを有するＦｃポリペプチドの配列（配列番号：４７）を示す。一実施態様では、この配列を含むＦｃポリペプチドは、図７のＦｃ配列を含むＦｃポリペプチドと複合体を形成し、Ｆｃ領域を産生する。
一般技術
ここに記載され又は参照される技術及び手順は、一般によく理解され、例えばSambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel 等編集 (2003))；シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames 及び G. R. Taylor 編集 (1995))、Harlow及びLane編 (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, 及びANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney編 (1987))に記載される広く利用されている方法のように、当業者によって常套的な方法を使用して一般的に用いられる。
定義
ここで使用されているように、「ベクター」という用語は、その他の核酸を、それが連結している場所へ輸送することのできる核酸分子を指す。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、付加的なＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状二重鎖ＤＮＡループを指す。他のタイプのベクターはファージベクターである。その他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへライゲーションすることができる。所定のベクターは、それらが導入された宿主内において自己複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入によって宿主細胞のゲノムと一体化し、宿主ゲノムと共に複製する。さらに、所定のベクターは、それらが作用可能に連結している遺伝子の発現を方向づける。このようなベクターは、ここでは、「組換え発現ベクター」（あるいは単に「組換えベクター」）と呼ばれている。一般的に、組み換えＤＮＡ技術での用途の発現ベクターは、しばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」及び「ベクター」は相互交換可能に使用することができる。
ここで使用される「シストロン」という用語は、概してポリペプチド鎖及び隣接コントロール領域をコードしているヌクレオチド配列を含む翻訳単位に相当する遺伝子要素を指すことを意図する。「隣接コントロール領域」は例えば、翻訳開始領域（ＴＩＲ；下記に定義されるようなもの）及び末端領域を含む。
「ポリシストロン性」発現ベクターは、１つの単一プロモーターの調節コントロールのもとで多くのシストロンを含む及び発現する単一のベクターを指す。ポリシストロン性ベクターの一般的な例は、１つのプロモーターのコントロール条件で２つの異なるポリペプチドを含み、発現する「２シストロン性」ベクターである。２シストロン性又はポリシストロン性ベクターの発現において、多数の遺伝子がまず単一の転写単位として転写され、次いで別々に翻訳される。
本発明に係る「個別シストロン性」発現ベクターとは、各シストロンがそれぞれのプロモーターの支配下にある、少なくとも２つの別々のプロモーター-シストロンの対を有する単一のベクターを意図する。個別シストロン性発現ベクターの発現では、別々の遺伝子の転写と翻訳の両段階が分離し、独立している。
ここで使用される、「翻訳開始領域」又はＴＩＲとは、関心のある遺伝子の翻訳開始の効力を提供する核酸領域を意図する。一般的に、特定のシストロン内にあるＴＩＲは、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と５'及び３'からＲＢＳの配列を包含する。ＲＢＳは、最小で、シャイン-ダルガーノ領域及び開始コドン（ＡＵＧ）を含むと定義される。従って、ＴＩＲはまた、翻訳される核酸配列の少なくとも一部を含む。好ましくは、本発明のＴＩＲは、シストロン内の軽鎖又は重鎖をコードする配列の前にくるシグナルペプチドをコードする分泌シグナル配列を含む。ＴＩＲ変異体は、ＴＩＲの特性、例えば以下に定義されるようなその翻訳強度等を変えるＴＩＲ領域内配列変異（特に置換）を含んでなる。好ましくは、本発明のＴＩＲ変異体は、シストロン内の軽鎖及び重鎖をコードする配列の前にくる分泌シグナル配列の初めの２〜約１４、好ましくは約４〜１２、より好ましくは約６のコドン内での配列置換を含んでなる。
ここで使用される用語「翻訳強度」とは、ＴＩＲの一以上の変異体がポリペプチドの直接分泌に使用され、その結果を同じ培地及びアッセイ条件下で野生型ＴＩＲ又は幾つかの他のコントロールに比較して得た、コントロールシステムにおける分泌ポリペプチドの測定を意図する。いずれかの見解に限定する訳ではないが、ここで使用される「翻訳強度」は、例えば、ｍＲＮＡ安定性、リボソーム結合部位に結合するリボソームの能力、及び膜を超える転位座の機序の測定を含みうる。
「分泌シグナル配列」又は「シグナル配列」とは、細胞膜、通常は内側の膜又は原核生物の内側と外側の膜を通して、対象となる新しく合成されたタンパク質の方向付けに使用することのできる短いシグナルペプチドをコードする核酸配列を意図する。このようにして、対象となるタンパク質、例えば免疫グロブリン軽鎖又は重鎖ポリペプチドは、原核宿主細胞の周辺に、あるいは培地中に分泌される。分泌シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドは、宿主細胞に内在しても、あるいはそれらは外因性でもよく、発現されるポリペプチドに本来あるシグナルペプチドを含む。分泌シグナル配列は、典型的には発現されるポリペプチドのアミノ末端に存在し、典型的にはポリペプチドの生合成と分泌の間に細胞質から酵素的に取り除かれる。従って、シグナルペプチドは、通常、成熟タンパク質産物には存在しない。
「作用可能に連結される」とは、そのように記載された成分が意図された様式で機能することを許容する関係にある、２以上の成分の並置を指す。例えば、連結された配列の翻訳制御又は調整のためにそれがシスで機能する場合、プロモーターはコーディング配列に作用可能に連結される。一般的に、必ずしもそうではないが、「作用可能に連結される」ＤＮＡ配列は連続しており、２個のタンパク質コード配列を連結する必要があるか又は分泌リーダーの場合、連続的で且つ読取り枠内にある。しかしながら、作用可能なプロモーターは一般的にコード配列の上流に位置しているが、必ずしも連続しているというわけではない。作用可能なエンハンサーは、コード配列の上流の中及びプロモーターからかなりの距離の上流に位置し得る。連結は、当該分野で知られている組換え方法、例えば、ＰＣＲ法を用いるか、アニーリングによるか、又は都合の良い制限サイトにおけるライゲーションによって達成される。都合の良い制限サイトが存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプタまたはリンカーが、慣用法に従って使用される。
ここで使用される場合、「調節エレメント」は異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリペプチドへの転写と翻訳に必要なシスで存在するヌクレオチド配列を指す。転写調節エレメントは通常、発現される遺伝子配列の５’のプロモーター、転写開始及び停止部位、及びポリアデニル化シグナル配列を含む。「転写開始部位」なる用語は、転写第一産物、即ち、ｍＲＮＡ前駆体に組み込まれる第一の核酸に対応するコンストラクト中の核酸を意味する；転写開始部位は、プロモーター配列に重なり得る。
「プロモーター」は、それが作用可能に連結した遺伝子又は配列の転写を制御するポリヌクレオチド配列を意味する。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合及び転写開始のシグナルを含む。使用されるプロモーターは、選択された配列の発現が考えられる宿主細胞の細胞型において機能し得る。様々な異なった供給源からの構成的、誘導性及び抑制性プロモーターを含む多数のプロモーターが当該分野においてよく知られており（またＧｅｎＢａｎｋのようなデータベースにおいて同定され）、クローン化ポリヌクレオチドとして（例えばＡＴＣＣのような寄託期間並びに他の商業的又は個人の供給源から）入手できる。誘導プロモーターでは、プロモーターの活性は、例えば誘導剤のようなシグナルに応答して増加又は減少する。
ここで使用される「宿主細胞」（又は「組換え宿主細胞」）という用語は、遺伝的に変化した、又は外因性ポリヌクレオチド、例えば組換えプラスミド又はベクター等の挿入によって遺伝的に変化された細胞を呼ぶことを目的とする。この用語は、特定の対象細胞だけではなく、これらの細胞の子孫をも意味すると理解される。突然変異又は環境による影響のどちらかによって、ある種の修飾が次の世代で生じるため、実際は、このような子孫は親細胞と同一ではない可能性があるが、やはりここで使用されるような「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。
「単離された」ポリペプチドは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、ポリペプチドの診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、ポリペプチドは、(１)ローリー(Lowry)法により定量して、９５重量％のポリペプチドより多くなるほど、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なまで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分なまで精製される。ポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも一の精製工程により調製される。
「単離された」核酸分子は、同定され、ポリペプチド核酸の天然供給源に通常付随している少なくとも一つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子には、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色***置にある核酸を通常発現する細胞に含まれる核酸分子が含まれる。
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分とのコンジュゲートによって合成後にさらに修飾されてよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ-Ｌ-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。更に、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体又は半固体担体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有する有機キャップ基部分又はアミンで置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。またポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み得、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。 これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(--Ｏ--)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
本明細書中で用いられる「オリゴヌクレオチド」は一般に、必須ではないが一般におよそ２００ヌクレオチド未満である、短い、一般に一本鎖の、一般に合成のポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」なる用語は互いに矛盾しない。ポリヌクレオチドについての先の記載は等しく、オリゴヌクレオチドにも完全に適用できる。
ここで用いられる場合、一般に、「ポリペプチド」は約１０より多いアミノ酸を有する任意の細胞源由来のペプチド及びタンパク質を指す。「異種の」ポリペプチドは、大腸菌によって産生されるヒトタンパク質のような、利用される宿主細胞にとって外来のポリペプチドである。異種ポリペプチドは原核生物のものでも真核生物のものでもよいが、好ましくは真核生物のものであり、より好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトのものである。好ましくは、それは、組換えにより産生されるか、組換えポリペプチドである。
哺乳類ポリペプチドの例は、例えば、レニン、ヒト成長ホルモンを含む成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク；１−アンチトリプシン；インスリンＡ−鎖；インスリンＢ−鎖；プロインスリン；トロンボポエチン；濾胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子−アルファ及びベータ；エンケファリナーゼ；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミューラー阻害物質；リラキシンＡ−鎖；リラキシンＢ−鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；DNase；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子のレセプター；インテグリン；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）などの栄養因子、又はＮＧＦ等の神経成長因子；カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）等のカルジオトロフィン（心臓肥大因子）；血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の線維芽細胞成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、ＴＧＦ−４、又はＴＧＦ−５を含むＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ(１−３)−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、及びＣＤ−１９などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−ガンマ等のインターフェロン；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清アルブミン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＳＣＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０；抗−ＨＥＲ−２抗体；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス性抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部等；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；抗体；及び上に列挙した任意のポリペプチドの断片などの分子を含む。
本発明に好ましいポリペプチドには、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、２Ｃ４、組織因子、抗組織因子、抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ−２、へレグリン、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、ＶＥＧＦ及び、それらのレセプター及び抗体、例えばｒｈｕＦａｂ Ｖ２及びＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、成長ホルモンとその変異体、例えばｈＧＨ、成長ホルモンレセプター、成長ホルモン放出タンパク質（ＧＨＲＰ）、ＬＩＶ−１（EP1,263,780）、ＴＲＡＩＬ、腫瘍懐死因子（ＴＮＦ）及びそれに対する抗体、ＴＮＦレセプター及びその抗体、ＴＮＦレセプターＩｇＧ、ＴＮＦレセプター関連因子（ＴＲＡＦｓ）及びそのインヒビター、因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩＩ Ｂドメイン、インターフェロンγ等のインターフェロン、ＴＧＦ−β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、抗ＴＧＦ−β等の抗ＴＧＦ、アクチビン、インヒビン、抗アクチビン、抗インヒビン、組織プラスミノーゲン活性化因子及びｔ−ＰＡ、ＲＥＴＥＰＬＡＳＥ（登録商法）、及びＴＮＫａｓｅ等のそれらの変異体、抗Ｆａｓ抗体、Ａｐｏ−２リガンド；Ａｐｏ−２リガンドインヒビター；Ａｐｏ−２レセプター、Ａｐｏ−３、アポトーシス因子、Ｃｅｄ−４、ＤｃＲ３、細胞死受容体及びアゴニスト抗体（ＤＲ４、ＤＲ５）、リンホトキシン（ＬＴ）、プロラクチン、プロラクチンレセプター、ＳＯＢタンパク質、ＷＩＳＰ（ｗｎｔ誘発性分泌タンパク質）、神経毒−３（ＮＴ−３）、神経成長因子（ＮＧＦ）及び抗ＮＧＦ、ＤＮａｓｅ、肝炎抗原、単純疱疹抗原、レプチン、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２等のインスリン様成長因子（ＩＧＦ）、及びそれらの結合タンパク質及びＩＧＦＢＰ−１−ＩＧＦＢＰ−６等のレセプター、インスリン、ＦＧＦ−１７等の繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、Ｔｏｌｌタンパク質、ＴＩＥリガンド、ＣＤ４０及び抗ＣＤ４０、イムノアドヘシン、サブチリシン、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＬ−８、ＩＬ−９等のインターロイキン、及びそれらに対する抗体、及び前立腺特異性癌抗原（ＰＳＣＡ）が含まれる。
特に好ましいポリペプチドは組換えポリペプチドであり、さらに好ましくはモノクローナル抗体及びヒト化抗体を含む抗体である。そのような抗体は完全長抗体又は抗体断片でもよい。より好ましくは、これらの抗体はヒト又はヒト化抗体である。更により好ましくは、抗体は、抗ｃｍｅｔ、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１８、抗ＶＥＧＦ、抗組織因子、２Ｃ４、抗Ｈｅｒ−２、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ４０、又は抗ＣＤ１１ａ抗体である。ポリペプチドの定義に含まれる抗体断片は軽鎖を有することが好ましく、さらに好ましくはκ軽鎖を有する。そのような好ましい断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２−ロイシンジッパー（ＬＺ）融合物、及び一腕抗体が含まれる。
タンパク質「発現」は、遺伝子においてコード化された情報をメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)、ついでタンパク質に転換することを意味する。
「イムノコンジュゲート」(「抗体-薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と交換可能に称される)は、一又は複数の細胞傷害剤、例えば化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物由来の酵素的に活性な毒素、その断片)、又は放射性同位元素(すなわち、放射性コンジュゲート)にコンジュゲートした抗体を意味する。
「ブロッキング」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性度を阻害又は減少させるものである。幾つかの実施態様では、ブロッキング抗体又は、アンタゴニスト抗体は、完全に抗原の生物学的活性を阻害する。
ここで使用される場合、「アゴニスト抗体」は、関心あるポリペプチドの少なくとも一の機能的活性を模倣する抗体である(例えば、ＨＧＦ)。
一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数(Ｋｄ)として表される。望ましくは、Ｋｄは１×１０−７、１×１０−８、５×１０−８、１×１０−９、３×１０−９、５×１０−９、又はさらに１×１０−１０以上の強さである。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。以下に具体的な例示的実施態様を記載する。
一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、段階的な力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する以下のアッセイで示されるような(Chen,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881)、所望の抗体のＦａｂ型(バージョン)とその抗原を用いて実行される放射性標識した抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)で測定される。アッセイの条件を決めるために、ミクロタイタープレート(Dynex)を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)にて一晩コートして、その後２％(w/v)のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温(およそ２３℃)で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc#269620)に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは確実に平衡状態に達するまでに長時間(例えば６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20; Packard)を加え、プレートをTopcountγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。他の実施態様によると、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcore（商標）2000又はBIAcore（商標）-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流量で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。いくつかの実施態様では、表面プラスモン共鳴アッセイ法に以下の変更が用いられる：およそ４００ＲＵを達成するように抗体をＣＭ５バイオセンサーチップに固定し、動態学的測定のために、標的タンパク質の２倍段階希釈物をおよそ３０ｕｌ／分の流速で２５℃のＰＢＳＴバッファに注入する。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(Ｋｏｎ)と解離速度(Ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
また、本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcore（商標）2000又はBIAcore（商標）3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。その後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流量で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。いくつかの実施態様では、表面プラスモン共鳴アッセイ法に以下の変更が用いられる：およそ４００ＲＵを達成するように抗体をＣＭ５バイオセンサーチップに固定し、動態学的測定のために、標的タンパク質の２倍段階希釈物をおよそ３０ｕｌ／分の流速で２５℃のＰＢＳＴバッファに注入する。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(Ｋｏｎ)と解離速度(Ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。しかし、上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定するのが好ましい。
「ネイキッド抗体」は、異種性分子（例えば細胞障害性部分又は放射標識）にコンジュゲートしていない抗体である。
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体は同じ抗原に結合する他の抗体とは区別されるその抗体の生物学的特性の一又は複数を保有するものである。
対象の抗体が結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載のものなどの常套的な交差遮断(cross-blocking)アッセイを行ってもよい。
本発明のアミノ酸配列を含む抗体又はポリペプチドの半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープ接着させることができる。例えば、サルベージレセプター結合エピトープをコードする核酸分子は、操作した核酸分子によって発現される融合タンパク質が本発明のポリペプチド配列とサルベージレセプター結合エピトープを含むように、本発明のポリペプチド配列をコードする核酸のフレーム内に連結させることができる。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する(例えば、Ghetie, V等, (2000) Ann. Rev. Immunol. 18:739-766, 表１)。Ｆｃ領域内に置換を有する抗体および血清半減期が増大した抗体については、国際公開００／４２０７２、国際公開０２／０６０９１９； Shields, R.L., ら, (2001) JBC 276(9):6591-6604；Hinton, P.R., (2004) JBC 279(8):6213-6216)にも記載されている。他の実施態様では、例えば他のポリペプチド配列に接着させることによっても血清半減期が増大しうる。例えば、血清アルブミンが抗体又はポリペプチドに結合するように、抗体又は本発明の方法に有用な他のポリペプチドをＦｃＲｎレセプター又は血清アルブミン結合ペプチドに結合する血清アルブミン又は血清アルブミンの一部に接着させることができ、例としてこのようなポリペプチド配列は国際公開０１／４５７４６に開示されている。好適な実施態様では、接着した血清アルブミンペプチドはアミノ酸配列DICLPRWGCLW(配列番号：１８３)を含む。他の実施態様では、Ｆａｂの半減期はこれらの方法によって増大する。血清アルブミン結合ペプチド配列については、Dennis, M.S., ら., (2002) JBC 277(38):35035-35043も参照のこと。
「断片」とは、好ましくは、参照核酸分子又はポリペプチドの全体の長さの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上を含むポリペプチド又は核酸分子の一部を意味する。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００、２００、３００、４００、５００、６００又はそれ以上のヌクレオチド、ないしは１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、１９０、２００アミノ酸又はそれ以上を含みうる。
「抗体」及び「イムノグロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われ、モノクローナル抗体(例えば完全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、単価抗体、多価抗体、多特異性抗体(例えば所望の生物学的活性を示す限りの二重特異性抗体)を含み、（本明細書で更に詳細に記載される）特定の抗体断片をまた含み得る。抗体はヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟したものであり得る。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域(ＣＤＲ)又は高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞性細胞毒性への抗体の関与を示す。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。二本鎖のＦｖ種において、この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ種において、一つの重鎖及び一つの軽鎖の可変ドメインはフレキシブルなペプチドリンカーによって共有結合されて、軽鎖及び重鎖が「二量体」構造類似体内で二本鎖Ｆｖ種内のものに結合しうる。この配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
イムノグロブリンの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、イムノグロブリンは異なるクラスが割り当てられる。イムノグロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。イムノグロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。「抗体断片」は完全な抗体の一部のみを含んでなるものであり、その一部は、完全な(インタクトな)抗体に存在する場合のその一部に通常関連する機能の少なくとも一、好ましくはその機能のほとんどないしはすべてを保持することが好ましい。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子；及び、抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。一実施態様では、抗体断片は完全な抗体の抗原結合部位を含んでなるために、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片は、例えばＦｃ領域を含んでなるものは、完全な抗体に存在する場合のＦｃ領域に通常関連する生物学的な機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期の調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合の少なくとも一を保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全な抗体と実質的に類似したインビボ半減期を有する一価性抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるＦｃ配列に結合した抗原結合アームを含んでもよい。
本願明細書において、用いられる「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列中の高頻度に可変している及び／又は構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。通常、抗体は、ＶＨ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)の３つと、ＶＬ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)の３つの計６つの高頻度可変領域を含んでなる。多くの高頻度可変領域が描写されており、本願明細書において、包含される。Kabat相補性決定領域(ＣＤＲ)は、配列多様性に基づいており、最も一般的に用いられるものである(Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置を指す(Chothia 及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ高頻度可変領域は、KabatＣＤＲとChothia構造ループとが組み合わさったものであり、Oxford Molecular's AbM抗体モデリングソフトウェアにより使用されている。「接触」高頻度可変領域は、利用できる複雑な結晶構造の分析に基づくものである。これら高頻度可変領域の残基を以下に示す。
カバットループ ＡｂＭ Chothia 接触
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(カバット番号付け)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Chothia番号付け)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
高頻度可変領域は、次のような「拡大高頻度可変領域」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら各々を規定するために、上掲のKabat等に従って番号を付した。
本願明細書において、定められるように、「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は高頻度可変領域残基以外のその可変ドメイン残基である。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。また、以下の概説文献及びここに挙げる引用文献も参照のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
「キメラ」抗体(免疫グロブリン)は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を有する(アメリカ特許番号4,816,567、及び、Morrison 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。本明細書中で用いられるヒト化抗体は、キメラ抗体のサブセットである。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「抗原」は、抗体が選択的に結合しうる予め決められた抗原である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン又は他の天然に生じる化合物ないしは合成化合物であってもよい。標的抗原はポリペプチドであることが望ましい。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、及び／又は本明細書中に開示したヒト抗体をつくるためのいずれかの技術を使用して、つくられたものである。この定義におけるヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特別に除く。
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のCDRに1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送を担い(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。国際公開公報００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。この特許公開の内容はここに出典明記により具体的に組み込まれる。Shields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie 1997, Hinton 2004を参照)。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又はＦｃ変異形ポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。
Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更してＣ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、米特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開公報９９／５１６４２に記述される。それらの特許文献の内容は、出典明記によって、特別に本願明細書に組み込まれるものとする。またIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
本明細書で使用される「Ｆｃ領域」なる用語は、概して、Ｃ末端ポリペプチド配列がインタクト抗体のパパイン消化によって取得されうる免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含んでなる二量体複合体を指す。Ｆｃ領域は、天然Ｆｃ配列又は変異Ｆｃ配列を含むことができる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ配列の境界は変化しうるが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ配列はおよそＣｙｓ２２６の位置又はおよそＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基からＦｃ配列のカルボキシル末端まで伸びると定義される。免疫グロブリンのＦｃ配列は、通常、二つの定常ドメイン、即ちＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含み、場合によってはＣＨ４ドメインを含む。ここでの「Ｆｃポリペプチド」は、Ｆｃ領域を形成するポリペプチドの一つを意味する。Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の好適な免疫グロブリンから得ることができる。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドは、野生型のヒンジ配列の一部又はすべてを（一般的にはそのＮ末端に）含有してなる。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドは、機能的ヒンジ配列又は野生型ヒンジ配列を含有していない。
ここで用いる「抗体変異体」又は「抗体変異」は、抗体のアミノ酸配列変異体であってその種依存的抗体の一又は複数のアミノ酸残基が変更しているものを指す。このような変異体は、必然的に種依存的抗体と１００％未満の配列同一性又は類似性がある。ある実施態様では、抗体変異体は、種依存性抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性があるアミノ酸配列を有するであろう。この配列に対する同一性又は類似性は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入し最大の配列同一性パーセントを達成した後に種依存的抗体残基と同一(つまり同じ残基)又は類似(つまり共通の側鎖特性に基づく同じグループのアミノ酸残基、下を参照)である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとしてここで定義される。可変ドメインの外側の抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸展、欠失、又は挿入は何れも配列同一性又は類似性に影響を及ぼすものとはみなされない。
「疾病」又は「疾患」は、本発明の物質／分子又は方法を用いた治療によって利益を得る任意の症状である。これには、問題とする疾患に哺乳動物がかかりやすくなる病理学的症状を含む慢性及び急性の疾病又は疾患を含む。限定的なものではなく、ここで治療する疾患の例には、悪性及び良性の腫瘍；癌腫、芽腫及び肉腫が含まれる。
「治療」は、治療的処置および予防又は防止的な手段の両方を指す。治療を必要とするものには、良性、前癌性又は非転移性の腫瘍を既に有しているもの、並びに癌の発生又は再発が予防されるべきものも含まれる。
「治療上の有効量」なる用語は、哺乳動物の疾患又は疾病を治療又は予防するための治療薬の量を指す。癌の場合、薬剤の治療上の有効量は、癌細胞の数を減少；原発性腫瘍サイズを低減；周辺臓器への癌細胞浸潤の阻害(すなわち、ある程度の遅延及び好ましくは停止)；腫瘍転移の阻害(すなわち、ある程度の遅延及び好ましくは停止)；ある程度の腫瘍増殖の阻害；及び／又は疾患が関与する一又は複数の症状のある程度の軽減をしうる。ある程度、薬剤は、増殖を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺し得、細胞***停止性及び／又は細胞障害性である。癌治療に対しては、インビボにおける効力は、例えば生存期間、病状の進行時間(ＴＴＰ)、応答速度(ＲＲ)、応答期間、及び／又は生活の質の評価により測定される。
ここで言う「自己免疫性疾患」は個体自身の組織に由来する又はその組織に対して生じる非悪性疾患又は疾病である。ここでは、自己免疫性疾患は、特にＢ細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病及び慢性骨髄芽球性白血病を除く悪性腫瘍又は癌性疾患ないし症状を明確に除く。自己免疫性疾患ないし疾病の例には、限定するものではないが、炎症反応、例えば乾癬および皮膚炎（例えば過敏性皮膚炎）を含む炎症性皮膚病；全身強皮症及び硬化症；炎症性腸疾患関連の反応（例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎）；呼吸窮迫症候群（成人呼吸窮迫症候群；ＡＲＤＳを含む）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；アレルギー性症状、例えばＴ細胞の浸潤ないし慢性炎症反応を伴う湿疹及び喘息及び他の症状；アテローム性動脈硬化；白血球癒着不全；慢性関節リウマチ；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；真正糖尿病（例えばＩ型糖尿病又はインシュリン依存性糖尿病）；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年型糖尿病；及び、一般的に結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症及び脈管炎でみられるサイトカイン及びＴリンパ球に媒介される急性及び遅発性過敏症と関連する免疫応答；悪性貧血（アジソン病）；白血球血管外遊出を伴う疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性疾患；多器官損傷症候群；溶血性貧血（限定するものではなく、クリオグロブリン血症又はクームズ陽性貧血症を含む）；重症筋無力症；抗原-抗体複合体媒介性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート-イートン筋無力症症候群；水疱性類天ぽうそう；ペンフィグス；自己免疫多腺性内分泌障害；ライター症候群；全身強直性症候群；ベーチェット疾患；巨細胞動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡネフロパシ；ＩｇＭ多発性神経炎；免疫血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）又は自己免疫血小板減少などが含まれる。
「癌」及び「癌性」なる用語は、一般的に制御不能な細胞増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は記述する。良性及び悪性の癌はこの定義に含まれる。「初期癌」又は「初期腫瘍」とは、侵襲性あるいは転移性でないか、又はステージ０、Ｉ、又はＩＩの癌として分類される癌を意味する。癌の例には、カルチノーマ、リンパ腫、芽細胞腫(髄芽細胞腫および網膜芽細胞腫を含む)、肉腫(脂肪肉腫および滑液細胞肉腫を含む)、神経内分泌腫瘍(カルチノイド腫瘍、ガストリノーマおよび膵島細胞癌を含む)、中皮腫、シュワン細胞腫(聴神経腫瘍を含む)、髄膜腫、腺癌、メラノーマおよび白血病又はリンパ性悪性腫瘍を含むが、これらに限定されるものではない。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌(例えば上皮扁平細胞癌)、小細胞肺癌(ＳＣＬＣ)、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、消化系癌を含む胃(gastric、stomach)癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌(転移性乳癌を含む)、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮カルチノーマ、唾液腺カルチノーマ、腎臓又は腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門部のカルチノーマ、陰茎カルチノーマ、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、並びに頭頸部癌、及び多発性骨髄腫が含まれる。
「前癌性」なる用語は、典型的に癌に進行する又は癌に発達する症状ないし成長を指す。「前癌性の」成長は、細胞周期調節、細胞性増殖又は分化のマーカーによって測定されうる、異常な細胞周期調節、増殖又は分化によって特徴が示される細胞を有する。
「形成異常」は、組織、臓器又は細胞の任意の異常な成長ないしは発達を意味する。好ましくは、形成異常は高いグレードであるか、前癌性である。
「転移」とは、その原発性部位から体の他の場所への癌の蔓延を意味する。癌細胞は、原発性腫瘍から切り離れ、リンパ管および血管へ浸透し、血流を循環し、身体の至る所の正常組織の離れた病巣で成長しうる(転移)。転移は局所又は遠位でありうる。転移は経時的な過程であり、原発性腫瘍から切り離れ、血流を駆けめぐり、遠位部位に止まる腫瘍細胞に付随するものである。新たな部位で、細胞は、血液供給を確立し、成長して生命を脅かす体積を形成しうる。
腫瘍細胞内の刺激性分子および阻害性分子の経路はこの作用を制御するものであり、腫瘍細胞と遠位部位の宿主細胞との間の相互作用も有意である。
「非転移性」とは、良性である癌、又は原発部位に止まり、リンパ管や血管系ないしは原発部位以外の組織に浸透しない癌を意味する。一般的に、非転移性癌は、ステージ０、Ｉ又はＩＩの癌、場合によってステージＩＩＩの癌のいずれかの癌である。
「原発性腫瘍」又は「原発性癌」は元の癌を意味し、被検体の身体の他の組織、臓器又は部位に位置する転移性病巣を意味しない。
「良性腫瘍」又は「良性癌」は、元の部位に限局したままである腫瘍を意味し、遠位の部位への浸潤、侵入又は転移の能力を有さない。
「腫瘍量」は、体内の癌細胞の数、腫瘍のサイズ、又は癌の量を意味する。また、腫瘍量(tumor burden)は腫瘍負荷(tumor load)とも称される。
「腫瘍数」は腫瘍の数を意味する。
「被検体」は、哺乳類、例えば限定するものではないが、ヒト又はヒト以外の哺乳動物、例としてウシ、ウマ科、イヌ、ヒツジ又はネコを意味する。被検体はヒトであることが望ましい。
「抗癌療法」なる用語は、癌を治療する際に有用な療法を指す。抗癌治療剤の例には、限定するものではないが、例えば、手術、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害剤、放射線療法に用いる薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン薬剤、および癌を治療するための他の薬剤、抗ＣＤ２０抗体、血小板由来増殖因子インヒビター(例えばＧｌｅｅｖｅｃＴＭ(メシル酸イマチニブ))、ＣＯＸ-２インヒビター(例えばセレコキシブ)、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ又はＶＥＧＦレセプター(一又は複数)、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２および他の生理活性かつ有機化学的薬剤などの一又は複数に結合するアンタゴニスト(例えば中和抗体)が含まれる。また、その組合せが本発明に包含される。
ここで用いられる「細胞障害性剤」は、細胞の機能を阻害又は抑制し、および／又は細胞破壊を起こす物質を意味する。この用語は、放射性同位元素(例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６)、化学治療薬、および細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素又はその断片を意味する。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、癌の治療に有用な化学的化合物が含まれる。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、およびウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)およびトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類およびメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)およびブラタシノン(bullatacinone))；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)を含む)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)およびバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８)；ドラスタチン(dolastatin)；デュオカルマイシン(duocarmycin )(合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢＩ−ＴＭ１を含む)； エレトロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン(pancratistatin)；サルコディクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン(spongistatin)；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Agnew Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ)を含むダイネミシン(dynemicin)；クロドロネート(clodronate)などのビスホスホネート(bisphosphonates)；エスペラマイシン(esperamicin)； 同様にネオカルチノスタチン発光団および関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団)、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセートおよび５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)およびアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)およびアングイデン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)およびタキソテア(登録商標)ドキセタキセル、(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；ミトキサントン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標)ビノレルビン；ナベルビン(Navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；イリノテカン(カンプトサル(Camptosar)、ＣＰＴ-１１)(５−ＦＵおよびリューコボリンとのイリノテカンの治療処方を含む)；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)；コンブレタスタチン(combretastatin)；ＶＥＬＣＡＤＥ ボルテゾミブ；ＲＥＶＬＩＭＩＤ レナリドミド；リューコボリン(leucovorin)(ＬＶ)；オキサリプラチン(oxaliplatin)、オキサリプラチン治療処方(FOLFOX)を含む；ＰＫＣ−αのインヒビター、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ(例として、エルロチニブ(erlotinib)(ＴａｒｃｅｖａＴＭ))および細胞増殖を減少させるＶＥＧＦ−Ａ、並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲンレセプターモジュレーター(ＳＥＲＭ)など、例えばタモキシフェン(ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ・トレミフェン(Fareston)；アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、それらは副腎でのエストロゲン産生を調節するものであり、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ(登録商標)メゲストロールアセテート、ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標)エキセメスタン、ホルメスタイン(formestanie)、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標)ゾロゾール(vorozole)、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)レトロゾールおよびＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標)アナストロゾール；；および抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に不粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ−ａｌｐｈａ、ラルフおよびＨ−Ｒａｓ；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現インヒビター(例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ(登録商標)リボザイム)およびＨＥＲ２発現インヒビター；遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチンおよびＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン)などのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ(登録商標)ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標)rmRH；ビノレルビン(Vinorelbine)およびエスペラミシン(Esperamicins)(米国特許第４６７５１８７号を参照)並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, :375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、およびStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), 247-267項, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシンおよび他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
「放射線療法」とは、正常に機能する能力を制限するため又は全く細胞を破壊するために、細胞に十分な損傷を誘導する有向性のγ線又はβ線の使用を意味する。治療の用量および治継続期間を決定するためには公知の多くの方法があることは明らかであろう。典型的な治療は、１回の投与として、１日当たり１０〜２００単位(グレイ)の典型的な用量として施される。
「生物学的に活性な」又は「機能性の」ポリペプチド（異種ポリペプチドのような）とは、構造的な、制御性の、生化学的な又は生物物理学的な現象において一以上のその本来の活性を発揮する能力のあるものである。
「生物学的に活性な」又は「機能性の」抗体とは、構造的な、制御性の、生化学的な又は生物物理学的な現象において一以上のその本来の活性を発揮する能力のあるものである。例えば、生物学的に活性な抗体は、抗原に特異的に結合する能力を有し、その結合は、言い換えると、シグナル伝達又は酵素活性のような細胞の又は分子の現象を誘発あるいは変化させうる。また、生物学的に活性な抗体は、レセプターのリガンド活性化を阻害したり、あるいはアゴニスト抗体として働いたりすることもある。一以上のその本質的な活性を発揮する全長抗体の能力は、ポリペプチド鎖の適切な折り畳みと構造化を含む、幾つかの要素に依存する。ここで使用されるように、開示される方法によって作成された生物学的に活性な免疫グロブリンは、典型的に、複数のジスルフィド結合によってつながり、適切に折り畳まれた、２つの同一のＬ鎖と２つの同一のＨ鎖を有するヘテロ四量体である。
本発明の組成物とそれを用いた方法
一態様では、本発明はＴＩＲ変異体を提供する。したがって、所定のＴＩＲについて、一連のアミノ酸又は核酸配列誘導体を、翻訳強度の範囲で製造し得、それによって、多数の異なるポリペプチドの最適な分泌のためのこの因子を調節するための簡便な方法を提供する。ＰｈｏＡのようなこれらの変異体の制御下において発現するレポーター遺伝子の使用は、異なる翻訳開始領域の相対翻訳強度を定量するための方法を提供する。ＴＩＲの変異体又はミュータントは、プラスミドのバックグラウンドで提供され得、それにより、成熟ポリペプチドの最大発現の翻訳強度の最適範囲を確立するために、所望の遺伝子が挿入され得、その発現が測定され得るプラスミドのセットが提供される。
ヌクレオチド配列のサイレント変化が好ましいが、ＴＩＲの変異導入はアミノ酸配列を改変することができるコドン変化を生じる一般的な技術によってなされる。ＴＩＲの変異には、例えばシグナル配列の変更と共に、シャイン-ダルガーノ配列の数又は間隔の変更が含まれうる。変異体シグナル配列を作成するためのある方法はシグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（つまり変化がサイレントである）コード配列の最初での「コドンバンク」の産生である。これは、各コドンの第三のヌクレオチド位置を変化させることによって、達成できる；加えて、幾つかのアミノ酸、例えばロイシン、セリン、及びアルギニンはバンクの作製に複雑さを付加し得る複数の第一及び第二の位置を有している。この変異導入の方法はYansura等(1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158に詳細に記載されている。基本的に、シグナル配列と成熟ポリペプチドの始まりをコードするＤＮＡ断片は、最初の６から１２のコドンのそれぞれの第三（及び、場合により、上に記載の通り、第一及び第二）の一が変化するように合成される。これらのコドンの下流の追加のヌクレオチドは、ボトム鎖を形成する際に使用する相補的なプライマーの結合サイトを提供する。ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー）を用いたトップコーディング鎖とボトム鎖プライマーの処理は、ランダム化したコドンを含む二本鎖ＤＮＡ断片のセットを生じるであろう。プライマーは、次いで適切なベクター中にＤＮＡ断片を挿入し、それによって、コドンバンクの増幅を可能とするために使用され得る有用なクローニングサイトを含むように設計される。代替の方法は、例えば、ランダム化したヌクレオチド（Wilson等, BioTechniques17:944-952 (1994)）、及びファージディスプレイライブラリー（例えば、Barbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89:4457-4461 (1992); Garrard等, Gene128:103-109 (1993)を参照されたい）を伴う全ｒｂｓの交換を含む。
細菌性のＳｅｃトランスロカーゼは、原核生物におけるタンパク質輸送を容易にする。分泌タンパク質は、２つの異なる機構、即ち、共翻訳及び翻訳後標的化によってＳｅｃトランスロカーゼに対して標的化され得る。後者において、分泌タンパク質を含むシグナル配列は、その合成時にリボソームから完了した状態で放出され、Ｓｅｃトランスロカーゼに向けられる。種々のグラム陰性菌において、分泌タンパク質は、転移能を有し、折りたたまれていない状態のこれらのタンパク質を維持する分泌特異的シャペロンＳｅｃＢによってＳｅｃ−トランスロカーゼに誘導される。共翻訳標的化の間、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）は、それがリボソームから出現し、ＳＲＰ／リボソーム／新生の分泌タンパク質鎖の全三元複合体が、Ｓｅｃ−トランスロカーゼに標的化される一方で、分泌タンパク質のシグナル配列に結合する。
例えば、マルトース結合ペリプラズムタンパク質（ＭａｌＥ）及びアルカリフォスファターゼ（ＰｈｏＡ）シグナルペプチドは、分子モーターＳｅｃＡを用いて翻訳後様式で、細胞質からペリプラズムへの転座を指示する。翻訳後様式での転座を指示する他の例示的なシグナルペプチドは、ｄｓｂＣ、ｌｏｌＡ、ｏｍｐＡ、ｌａｍｂ、及びｌｐｐである。耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ｓｔＩＩ）とチオール：ジスルフィド交換タンパク質（ｄｓｂＡ）シグナルペプチドは、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）からの援助で共翻訳様式で転座を指示する。共翻訳様式での転座を指示する他の例示的なシグナルペプチドは、ｙｒａＩ、ｔｏｒｔ、ｔｏｌＢ、ｓｆｍＣ、ｎｉｋＡ、及びｓｆｍＣである。細菌細胞質膜を横断するＳｅｃ及びＴａｔ媒介タンパク質発現の総説については、Ｎａｔａｌｅ等を参照されたい。（Natale等(2008) Biochemica et Biophysica Acta 1778:1735-56。）
我々は、大腸菌中の内膜透過の主要な分泌経路の２つを代表するシグナルペプチド（即ち、ｓｅｃ（ＰｈｏＡ、ＭａｌＥ）及びＳＲＰ（ＤｓｂＡ、ＳＴＩＩ）についての新規な変異翻訳開始領域（ＴＩＲ）シグナルペプチドライブラリー（図２、表２）を開発した。各ライブラリーは異なる翻訳強度の変異ＴＩＲを含むベクターのパネルを含み、関心のある所定のタンパク質の翻訳レベルを即座に調節する手段を提供する。
典型的には、ＴＩＲ変異体は、関心のある遺伝子発現のための適切な要素を有するプラスミドベクター中で提供されるであろう。例えば、典型的なコンストラクトは、シグナル配列の５’のプロモーター、関心のある遺伝子又はレポーター遺伝子挿入のための、シグナル配列の３’の制限酵素認識サイト、及び得られたプラスミドで形質転換した細菌の選択及び／又は維持のための、薬剤耐性マーカーのような選択可能なマーカーを含むであろう。プラスミドベクターを更にここに記載し例示する。原核生物宿主と共に使用するための適切なプロモーターは、当該分野で知られており、幾つかをここに例示し記載する。
使用し得る任意のレポーター遺伝子は、幾つかの様式で定量し得る。したがって、例えば、アルカリフォスファターゼ産生は、ｐｈｏＡ遺伝子産物の分泌レベルの測定として定量化し得る。他の例は、例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子を含む。
一般的に、１セットのベクターは、その中の各シストロンについて様々なＴＩＲ強度で作製し得る。この限定セットにより各鎖の発現レベル、ならびに、種々のＴＩＲ強度組み合わせの下での全長産物の産生量の比較が提供される。シモンズ(Simmons)ら米国特許第５８４０５２３号に詳細に記載されるように、ＴＩＲ強度はレポーター遺伝子の発現レベルを定量化することで決定すればよい。本発明の目的のために、ベクター内のＴＩＲの特定の対についての翻訳強度の組み合わせは（Ｎ−軽、Ｍ−重）（ここで、Ｎは軽鎖の相対ＴＩＲ強度であり、Ｍは重鎖の相対ＴＩＲ強度である）で表される。例えば、（３−軽、７−重）はベクターが軽鎖発現について約３の相対ＴＩＲ強度を提供し、かつ、重鎖発現について約７の相対ＴＩＲ強度を提供することを意味する。翻訳強度比較を基に、本発明の発現ベクター構築物で組み合わせる所望の個々のＴＩＲを選択する。ベクターは適切な宿主を形質転換するために使用し得る。好ましくは、宿主は原核生物の宿主である。より好ましくは、宿主は大腸菌である。
ポリペプチドの分泌レベルは、例えば、関心のあるポリペプチドについて機能アッセイ、利用可能であれば、放射免疫測定（ＲＩＡ）、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるか、又はＰＡＧＥと関心のあるポリペプチドの正しい分子量の可視化によって決定し得る。分泌ポリペプチドのレベルの決定方法は、当該分野でよく知られており、幾つかをここに例示する。
抗体
本発明の抗体は好ましくはモノクローナルである。ここに提供される抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ及びＦ（ａｂ’）２断片また本発明の範囲に含まれる。これらの抗体断片は、酵素切断のような伝統的な方法によって作製し得るか、又は組換え技術によって生成し得る。このような抗体断片は、キメラであるか、又はヒト化し得る。これらの断片は、診断及び後述する治療目的に有用である。
従って、幾つかの態様では、抗ｃ-ｍｅｔ抗体は、Ｆｃ領域を含む一アーム抗体(すなわち、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインが単一の抗原結合アームを形成)であり、ここでＦｃ領域は、第１及び第２のＦｃポリペプチドを含有し、第１及び第２のＦｃポリペプチドは複合体に存在し、該抗原結合アームを有するＦａｂ分子に対して、該抗体断片の安定性を増加させるＦｃ領域を形成する。アンタゴニスト機能を必要とし、抗体が二価であることで、所望しないアゴニスト効果を生じる病理状態を治療するために、一アーム抗体(すなわち、単一の抗原結合アームを有する抗体）の一価特性により、標的分子に対する抗体の結合時に、アンタゴニスト機能が生じ及び／又は確実となる。更に、Ｆｃ領域を含む一アーム抗体は、類似した／実質的に同一の抗原結合特徴を有するＦａｂ形態と比較して、優れた薬物動態性状(例えば、インビボにおける半減期の向上及び／又はクリアランス速度の低減)により特徴付けられ、よって従来の一価のＦａｂ抗体の使用における主たる欠点が克服される。一アーム抗体は、例えば国際公開第2005/063816号；Martensら, Clin Cancer Res(2006), 12: 6144に開示されている。幾つかの実施態様では、一アーム抗体は一価の抗体断片であり、抗体断片は軽鎖可変ドメインを含む第一のポリペプチド、重鎖可変ドメイン及び前記第一のＦｃポリペプチドを含む第二のポリペプチド、及び前記第二のＦｃポリペプチドを含む第三のポリペプチドを含み、これにより、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインは単一の抗原結合アームを形成し、これにより、第一及び第二のＦｃポリペプチドが、複合体中に存在し、前記抗原結合アームを含むＦａｂ分子と比較して前記抗体断片の安定性を増加させるＦｃ領域を形成する。
幾つかの実施態様では、抗体はｃ−ｍｅｔに結合する（幾つかの実施態様では、特異的に結合する）。幾つかの実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は（ａ）配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＬＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＭＩＤＰＳＮＳＤＴＲＦＮＰＮＦＫＤＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＹＲＳＹＶＴＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（配列番号：４３）
を有する重鎖可変ドメイン、ＣＨ１配列、及び第一のＦｃポリペプチドを含む第一のポリペプチド；（ｂ）配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＬＹＴＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＡＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ
（配列番号：４４）
を有する軽鎖可変ドメイン、及びＣＬ１配列を含む第二のポリペプチド；及び（ｃ）第二のＦｃポリペプチドを含む第三のポリペプチドを含み、重鎖可変ドメインと軽坂片ドメインは複合体として存在し、単一の抗原結合アームを形成し、第一及び第二のＦｃポリペプチドは複合体中に存在し、前記抗原結合アームを含むＦａｂ分子に対して前記抗体断片の安定性を増加させるＦｃ領域を形成する。幾つかの実施態様では、第一のポリペプチドは図７（配列番号：６８）に記載のＦｃ配列を含み、第二のポリペプチドは図８（配列番号：４７）に記載のＦｃ配列を含む。幾つかの実施態様では、第一のポリペプチドは図８（配列番号：４７）に記載のＦｃ配列を含み、第二のポリペプチドは図７（配列番号：６８）に記載のＦｃ配列を含む。
幾つかの実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、（ａ）重鎖可変ドメインを含む第一のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＬＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＭＩＤＰＳＮＳＤＴＲＦＮＰＮＦＫＤＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＹＲＳＹＶＴＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ （配列番号：４５）を含むポリペプチド；
（ｂ）軽鎖可変ドメインを含む第二のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＬＹＴＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＡＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号：４６）を含むポリペプチド；及びＦｃ配列を含む第三のポリペプチドであって、ポリペプチドが、配列：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号：４７）を含むポリペプチドを含み、ここで、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインが複合体として存在し、単一抗原結合アームを形成し、第一及び第二のＦｃポリペプチドが複合体として存在し、前記抗原結合アームを含むＦａｂ分子と比較して前記抗体断片の安定性を増加させるＦｃ領域を形成する。
一態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は
（ｉ）Ａ１−Ａ１７がＫＳＳＱＳＬＬＹＴＳＳＱＫＮＹＬＡ（配列番号：４９）である、配列Ａ１−Ａ１７を含むＣＤＲ−Ｌ１
（ｉｉ）Ｂ１−Ｂ１７がＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号：５０）である、配列Ｂ１−Ｂ７を含むＣＤＲ−Ｌ２
（ｉｉｉ）Ｃ１−Ｃ９がＱＱＹＹＡＹＰＷＴ（配列番号：５１）である、配列Ｃ１−Ｃ９を含むＣＤＲ−Ｌ３
（ｉｖ）Ｄ１−Ｄ１０が ＧＹＴＦＴＳＹＷＬＨ（配列番号：５２）である、配列Ｄ１−Ｄ１０を含むＣＤＲ−Ｈ１
（ｖ）Ｅ１−Ｅ１８がＧＭＩＤＰＳＮＳＤＴＲＦＮＰＮＦＫＤ（配列番号：５３）である、配列Ｅ１−Ｅ１８を含むＣＤＲ−Ｈ２
（ｖｉ）Ｆ１−Ｆ１１がＴ／ＳＹＧＳＹＶＳＰＬＤＹ（配列番号：５４）である、配列Ｆ１−Ｆ１１を含むＣＤＲ−Ｈ３；
からなる群から選択される（ａ）少なくとも１、２、３、４、又は５個の高度可変領域（ＣＤＲ）配列
及び（ｂ）変異ＣＤＲ配列が、（ｉ）−（ｖｉ）に記載される配列の少なくとも１個の残基の修飾を含む、少なくとも１個の変異ＣＤＲを含む。一実施態様では、ＣＤＲ−Ｈ３はＴＹＧＳＹＶＳＰＬＤＹ（配列番号：５５）を含む。一実施態様では、ＣＤＲ−Ｈ３はＳＹＧＳＹＶＳＰＬＤＹ（配列番号：５６）を含む。一実施態様では、これらの配列（ここに記載の通りの組み合わせの）を含む本発明の抗体は、ヒト化されるかヒトである。
一実施態様では、抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、図７（配列番号：５２から５３及び６６）に記載の一以上のＣＤＲ１−ＨＣ、ＣＤＲ２−ＨＣ及びＣＤＲ３−ＨＣ配列を含む重鎖可変ドメインを含む。 幾つかの実施態様では、抗体は図７（配列番号：４９から５１）に記載の一以上のＣＤＲ１−ＬＣ、ＣＤＲ２−ＬＣ及びＣＤＲ３−ＬＣ配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。 幾つかの実施態様では、重鎖可変ドメインは、図７（配列番号：６２から６５）に記載のＦＲ１−ＨＣ、ＦＲ２−ＨＣ、ＦＲ３−ＨＣ及びＦＲ４−ＨＣ配列を含む。幾つかの実施態様では、軽鎖可変ドメインは、図７（配列番号：５７から６０）に記載のＦＲ１−ＬＬＣ、ＦＲ２−ＬＣ、ＦＲ３−ＬＣ及びＦＲ４−ＬＣ配列を含む。
本発明の抗ｃ−ｍｅｔ抗体の変異体ＨＶＲは、ＨＶＲ内に一又は複数の残基の修飾を含有しうる。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｌ２変異体が、以下の位置：Ｂ１(Ｍ又はＬ)、Ｂ２(Ｐ、Ｔ、Ｇ又はＳ)、Ｂ３(Ｎ、Ｇ、Ｒ又はＴ)、Ｂ４(Ｉ、Ｎ又はＦ)、Ｂ５(Ｐ、Ｉ、Ｌ又はＧ)、Ｂ６(Ａ、Ｄ、Ｔ又はＶ)及びＢ７(Ｒ、Ｉ、Ｍ又はＧ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ１変異体が、以下の位置：Ｄ３(Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｓ、Ａ、Ｉ)、Ｄ５(Ｉ、Ｓ又はＹ)、Ｄ６(Ｇ、Ｄ、Ｔ、Ｋ、Ｒ)、Ｄ７(Ｆ、Ｈ、Ｒ、Ｓ、Ｔ又はＶ)及びＤ９(Ｍ又はＶ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ２変異体が、以下の位置：Ｅ７(Ｙ)、Ｅ９(Ｉ)、Ｅ１０(Ｉ)、Ｅ１４(Ｔ又はＱ)、Ｅ１５(Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｔ又はＶ)、Ｅ１６( Ｌ)、Ｅ１７(Ｅ、Ｈ、Ｎ又はＤ)およびＥ１８(Ｙ、Ｅ又はＨ)の何れかの組合せにおいて１ないし４(１、２、３又は４)の置換を含有する。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３変異体が、以下の位置：Ｆ１(Ｔ、Ｓ)、Ｆ３(Ｒ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ａ、Ｋ)、Ｆ４(Ｇ)、Ｆ６(Ｒ、Ｆ、Ｍ、Ｔ、Ｅ、Ｋ、Ａ、Ｌ、Ｗ)、Ｆ７(Ｌ、Ｉ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、Ｖ)、Ｆ８(Ｓ、Ａ)、Ｆ１０(Ｙ、Ｎ)及びＦ１１(Ｑ、Ｓ、Ｈ、Ｆ)の何れかの組合せにおいて１ないし５(１、２、３、４又は５)の置換を含有する。それぞれの位置の後の括弧内の文字は例示的置換(すなわち置き換え)のアミノ酸を示すものであり、当分野の技術者に明らかなように、本明細書中の置換アミノ酸としての他のアミノ酸の適合性は、当分野で公知の技術及び／又は本明細書中に記載の技術を用いて慣例的に評価することができる。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｌ１は配列番号４９の配列を含有する。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ１はＴである。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ１はＳである。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ３はＲである。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ３はＳである。一実施態様では、変異体ＨＶＲ-Ｈ３のＦ７はＴである。一実施態様では、本発明の抗体は変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含有してなり、Ｆ１がＴ又はＳであり、Ｆ３がＲ又はＳであり、そしてＦ７はＴである。
一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＴであり、Ｆ３がＲであり、Ｆ７がＴである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＳである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＴであり、Ｆ３がＲである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＳであり、Ｆ３がＲであり、Ｆ７がＴである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＴであり、Ｆ３がＳであり、Ｆ７がＴであり、Ｆ８がＳである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｆ１がＴであり、Ｆ３がＳであり、Ｆ７がＴであり、Ｆ８がＡである変異体ＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｈ３抗体が、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１及びＨＶＲ-Ｈ２をさらに含んでなり、各々は順に配列番号：４９、５０、５１、５２及び５３を含有する。いくつかの実施態様では、これらの抗体は、ヒトサブグループIII重鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施態様では、位置７１はＡであり、７３はＴであり、及び／又は７８はＡである。これらの抗体の一実施態様では、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。
一実施態様では、本発明の抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、Ｂ６がＶである変異体ＨＶＲ-Ｌ２を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｌ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：４９、５１、５２、５３、５４に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｌ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：４９、５１、５２、５３、５６に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、これらの抗体は、ヒトサブグループIII重鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施態様では、位置７１がＡであり、７３がＴであり、及び／又は７８がＡである。これらの抗体の一実施態様では、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。
一実施態様では、本発明の抗体は、Ｅ１４がＴであり、Ｅ１５がＫであり、Ｅ１７がＥである変異体ＨＶＲ-Ｈ２を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、Ｅ１７がＥである変異体ＨＶＲ-Ｈ２を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｈ３抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：４９、５０、５１、５２、５４に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｈ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：４９、５０、５１、５２、５５に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、前記変異体ＨＶＲ-Ｈ２抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１及びＨＶＲ-Ｈ３を更に含んでなり、各々、順に、配列番号：４９、５０、５１、５２、５５に示す配列を含んでなる。いくつかの実施態様では、これらの抗体は、ヒトサブグループIII重鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施態様では、位置７１がＡであり、７３がＴであり、及び／又は７８がＡである。これらの抗体の一実施態様では、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。
本発明の方法における使用に適切な他の抗ｃ−ｍｅｔ抗体は、当該分野で知られている。
一態様では、抗ｃ-ｍｅｔ抗体は、抗体断片内のＦｃ配列の、ホモ二量体化を最小にしながらの、ヘテロ二量体化を促進させる少なくとも一の特性を含む。このような特性は、免疫グロブリン集団の収率及び／又は純度及び／又は均一性を改善する。一実施態様では、抗体は、国際公開第２００５／０６３８１６号に記載されるような、「ノブ」及び「ホール」を構成するＦｃ変異を含む。例えば、ホール変異は、ＦｃポリペプチドにＴ３６６Ａ、Ｌ３６８Ａ及び／又はＹ４０７Ｖの一又は複数であり得、ノブ変異はＴ３６６Ｗでありうる。ノブとホールＦｃ変異をここで更に記載する。
モノクローナル抗体は実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、わずかながら存在しうる天然に生じる突然変異体を除いて同一のものである。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。
本明細書中に記載の抗原に対するモノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを免疫化し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を誘導する。抗原への抗体は、抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)に注射することにより動物内に生じる。抗原は当分野で公知の方法を用いて調製されうる。その方法のいくつかは本明細書中でさらに記載される。例えば、ヒト及びマウス抗原の組み換え産生は以下に記載される。一実施態様では、動物を、免疫グロブリン重鎖のＦｃ部位に融合した抗原で免疫化する。好適な実施態様では、動物を、抗原-ＩｇＧ１融合タンパク質で免疫化する。通常、動物は、一リン酸化リピドＡ(ＭＰＬ)／トレハロースジクリノミコレート(trehalose dicrynomycolate)(ＴＤＭ) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT)により免疫コンジュゲート又は抗原誘導体に対して免疫化され、該溶液は複数の部位の皮下に注射される。２週後に、動物を追加免役する。７〜１４日後、動物から採血して、血清を抗体力価について検定する。力価がプラトーになるまで動物を追加免役する。
別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、San Diego, California USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカ培養細胞系統保存機関、Rockville, Maryland USAから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、ＥＧＦＬ７に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA-SEPHAROSE、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
本発明の抗体は、所望される活性を有する合成抗体クローンをスクリーニングするために、コンビナトリアルライブラリを用いて同定することができる。原則として、合成抗体クローンを、ファージコートタンパク質と融合した抗体可変領域(Ｆｖ)の種々の断片を表示するファージを有するファージライブラリをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリは、所望される抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによって選別される。所望される抗原と結合することができるFv断片を発現するクローンは抗原へ吸収され、それによって、ライブラリの非結合クローンから分離される。次いで、この結合クローンは、抗原から溶出させることが可能であり、抗原吸収／溶出の付加的サイクルによってさらに濃縮することができる。本発明のいくつかの抗体は、興味の対象であるファージクローンを選択するために適切な抗原スクリーニング手法を設計し、続いて、興味の対象であるファージクローンからのＦｖ配列、及びKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3に記載の適切な定常領域(Ｆｃ)配列を用いての抗体クローンの構築によって得ることができる。抗体を生成するための例示的な方法を実施例に記載する。
抗体の抗原結合ドメインは、約１１０アミノ酸の２つの可変(Ｖ)領域である軽(ＶＬ)及び重(ＶＨ)鎖で形成され、その双方には、３つの超可変ループ又は相補鎖決定領域(ＣＤＲ)が存在する。可変ドメインは、Winter等，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように、ＶＨ及びＶＬが短くて柔軟なペプチドを介して共有結合している一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)断片として、又は定常ドメインと融合して非共有的に相互作用しているＦａｂ断片のいずれかとしてファージ上に機能的に表示することができる。ここで用いられているように、ｓｃＦｖコード化ファージクローン、及びＦａｂコード化ファージクローンは、総称して「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」と呼ぶ。
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって分離してクローンし、ファージライブラリにおいてランダムに組み換えられることが可能であり、それは、Winter等，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように抗原結合クローンについて探索することが可能である。免疫化したソースからのライブラリは、ハイブリドーマを構成する必要がなく、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、天然レパートリーをクローニングして、Griffiths等，EMBO J, 12: 725-734(1993)に記載のようにどんな免疫化もせずに、幅広い非自己及びまた自己抗原に対するヒト抗体の単一のソースを提供することが可能である。最終的には、天然ライブラリは、また、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、幹細胞からの再配列されていないV遺伝子セグメントをクローニングし、及びランダム配列を有するＰＣＲプライマーを利用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配列を完成させることによって合成的に作製することができる。
繊維状ファージは、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合によって、抗体断片を表示するのに用いられる。この抗体断片は、一本鎖Ｆｖ断片として表示することが可能であり、そのＶＨ及びＶＬドメインは、例えば、Marks等，J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載のような、又は、例えば、Hoogenboom等，Nucl. Acids. Res., 19: 4133-4137(1991)に記載のような、１つの鎖はｐＩＩＩと融合し、もう一方の鎖は、幾つかの野生型コートタンパク質を置換することによってファージ表面上に表示されるようになるＦａｂコートタンパク質構造のアセンブリがある細菌宿主細胞のペリプラズムへ分泌されるＦａｂ断片のように、柔軟なポリペプチドスペーサーによって同じポリペプチド鎖上に連結されている。
一般的に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒト又は動物から収集した免疫細胞から得られる。特定の抗原を標的化するクローンに有利になるように偏ったライブラリが望ましい場合には、個体を抗原で免疫化して抗体応答を生成させ、そして、脾臓細胞及び／又は他の末梢血リンパ球(ＰＢＬ)である循環Ｂ細胞を、ライブラリ構築のために回収する。好ましい実施態様では、抗原免疫化により、抗原に対するヒト抗体を産生するＢ細胞が生じるように、抗原反応性クローンに有利になるように偏ったヒト抗体遺伝子断片ライブラリは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを有する(及び、機能的な内因性抗体産生系を欠く)トランスジェニックマウスにおける抗体応答を生成することによって得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製は以下に記載する。
抗原反応性細胞集団のさらなる濃縮は、適切なスクリーニング手法を利用して抗原特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞を単離すること、例えば、抗原アフィニティクロマトグラフィーによる細胞分離、又は蛍光色素標識抗原への細胞の吸着とその後の蛍光標示式細胞分取器(ＦＡＣＳ)によって得ることができる。
あるいは、非免疫化供与体からの脾臓細胞及び／又はＢ細胞又は他のＰＢＬの利用によって可能性のある抗体レパートリーのより良い表示が提供され、また、抗原が免疫原ではない任意の動物(ヒト又は非ヒト)種を利用した抗体ライブラリの構築が可能となる。インビトロの抗体遺伝子コンストラクトを取り込むライブラリに関しては、幹細胞を個体から収集して非再配列の抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。対象の免疫細胞は、種々の動物種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ目、オオカミ、犬科、ネコ科、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種等から得ることができる。
抗体可変遺伝子セグメント(ＶＨ及びＶＬセグメントを含む)をコードする核酸を、興味の対象の細胞から回収して増幅した。再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリの場合では、その所望するＤＮＡは、Orlandiら，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)に記載されているように、リンパ球からのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子の５'及び３'末端と一致するプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行うことによって得ることが可能であり、よって発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することができる。このＶ遺伝子は、Orlandi等, (1989)及びWardら，Nature, 341: 544-546(1989)に記載のように、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５'末端のバックプライマーとＪセグメントに基づいた前方向プライマーにより、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅することが可能である。しかしながら、ｃＤＮＡからの増幅のためには、バックプライマーは、また、Jonesら，Biotechnol., 9:88-89(1991)に記載のようにリーダーエクソンに、前方向プライマーは、Sastryら，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:5728-5732(1989)に記載のように定常領域内に基づくことが可能である。相補性を最大にするために、Orlandiら(1989)又はSastryら(1989)に記載のように、縮重をプライマーへ取り込むことが可能である。好ましくは、例えば、Marksら，J. Mol. Biol., 222: 581-597(1991)の方法に記載のように、又はOrumら，Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498(1993)の方法に記載のように、免疫細胞の核酸試料に存在するすべての入手可能なＶＨ及びＶＬ配列を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーを標的にしたＰＣＲプライマーを用いて、そのライブラリの多様性を最大にする。発現ベクターへの増幅ＤＮＡのクローニングに関しては、希な制限部位を、Orlandiら(1989)に記載のように、又はClacksonら，Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにタグ付加したプライマーによるさらなるＰＣＲ増幅によって、ＰＣＲプライマー内の１つの末端へタグとして導入することができる。
合成的に再配列したＶ遺伝子のレパートリーは、Ｖ遺伝子セグメントからインビボで誘導することができる。殆どのヒトＶＨ遺伝子セグメントはクローニング及び配列決定(Tomlinson等, J. Mol. Biol. 227: 776-798(1992)に報告されている)、そしてマッピングがされている(Matsudaら，Nature Genet., 3: 88-94(1993))；これらクローニングされたセグメント(Ｈ１及びＨ２ループのすべての主要なコンホメーションを含む)は、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、多様な配列と長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーによる多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作製するのに用いられる。ＶＨレパートリーは、また、Barbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461(1992)に記載されているように、単一の長さの長いＨ３ループに焦点を合わせたすべての配列多様性をともなって作製することができる。ヒトＶκ及びＶλセグメントはクローニング及び配列決定がなされ(Williams及びWinter， Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461(1993))、合成軽鎖レパートリーを作製するのに利用することができる。ＶＨ及びＶＬフォールドの範囲及びＬ３及びＨ３の長さに基づく合成的Ｖ遺伝子レパートリーは、相当に構造的多様性を有する抗体をコードする。ＤＮＡをコードするＶ遺伝子の増幅に続いて、生殖系のＶ遺伝子セグメントは、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)の方法に従ってインビトロで再配列することができる。
抗体断片のレパートリーは、幾つかの方法でＶＨ及びＶＬ遺伝子レパートリーを共に組み合わせることによって構築することができる。各レパートリーを異なるベクターで作製し、そのベクターを、例えばHogrefe等, Gene, 128: 119-126(1993)に記載のようにインビトロで、又はコンビナトリアル・インフェクション、例えばWaterhouse等, Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266(1993)に記載のloxP系によってインビボで作製することが可能である。このインビボの組み換え手法では、大腸菌の形質転換効率によって強いられるライブラリの大きさの限界を克服するために、二本鎖種のＦａｂフラグメントが利用される。ナイーブのＶＨ及びＶＬレパートリーは、１つはファージミドへ、そして他はファージベクターへと個別にクローニングされる。この２つのライブラリは、その後、各細胞が異なる組み合わせを有し、そのライブラリの大きさが、存在する細胞の数(約１０１２クローン)によってのみ限定されるように、ファージミド含有細菌のファージ感染によって組み合わせられる。双方のベクターは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一のレプリコンへ組み換えられ、ファージビリオンへ共にパッケージされるように、インビボの組み換えシグナルを有する。これら巨大なライブラリは、良好な親和性(約１０-8MのKｄ-1)の多くの多様な抗体を提供する。
別法として、このレパートリーは、例えばBarbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982(1991)に記載のように同じベクターへ連続してクローニング、又は、Clakson等, Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにＰＣＲ後に、クローニングすることでアセンブリすることができる。ＰＣＲアセンブリは、また、柔軟なペプチドスペーサーをコードしているＤＮＡとＶＨ及びＶＬ ＤＮＡを連結させて、単鎖のＦｖ(ｓｃＦｖ)レパートリーを形成することに利用することができる。さらに他の技術では、「細胞内でのＰＣＲアセンブリ」は、Embleton等, Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837(1992)に記載のように、ＰＣＲによってリンパ球内のＶＨ及びＶＬ遺伝子を組み合わせて、その後、連結した遺伝子のレパートリーをクローニングするのに利用される。
ナイーブのライブラリ(天然又は合成のいずれか)によって産生された抗体は中度の親和性(約１０６〜１０７M-1のKd-1)である可能性があるが、Winterら(1994), 上掲に記載のように第二番目のライブラリから構築して遊離することによって、親和性成熟をもインビトロで模倣することが可能である。例えば、Hawkins等, J. Mol. Biol. 226: 889-896(1992)の方法、又はGram等, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580(1992)の方法においてエラー・プローンポリメラーゼ(Leung等, Technique, 1:11-15(1989)で報告されている)を利用することによって、突然変異をインビトロでランダムに導入することができる。さらには、１つ又はそれより多いＣＤＲをランダムに変異させることによって、例えば、選択した個々のＦｖクローンにおいて、対象のＣＤＲまで及ぶランダム配列を有するプライマーによるＰＣＲを利用して、そしてより高い親和性クローンをスクリーニングすることで親和性成熟をおこなうことが可能である。国際公開第９６／０７７５４号(１９９６年３月１４日に公開)は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域へ突然変異生成を誘導して軽鎖遺伝子のライブラリを作製する方法を記載している。その他の有効な手法は、Marks等, Biotechnol. 10: 779-783(1992)に記載のように、非免疫化供与体から得られた天然で発生するＶドメイン変異体のレパートリーによるファージディスプレイによって選択されたＶＨ又はＶＬドメインを組み換えること、及び数回のチェーン・シャッフリングにおいてより高い親和性についてスクリーニングすることである。この技術は、１０-9Mの範囲の親和性の抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
所望の標的抗原をコードする核酸配列は、抗原の所望の領域のアミノ酸配列を使用して設計されうる。
抗原をコードする核酸は、当分野で公知の様々な方法によって調製できる。これらの方法には、Engels 等, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989)に記載の何れかの方法、例えばトリエステル、亜リン酸エステル、ホスホラミダイト及びＨ-ホスホン酸塩方法による化学的な合成法が含まれるがこれに限定されるものではない。一実施態様では、発現宿主細胞に好ましいコドンが、抗原をコードするＤＮＡの設計に用いられる。その代わりに、抗原をコードするＤＮＡは、ゲノムないしｃＤＮＡのライブラリから単離できる。
抗原をコードするＤＮＡ分子の構築に続いて、そのＤＮＡ分子は、プラスミド等の発現ベクターの発現コントロール配列と作用可能に連結し、このコントロール配列は、そのベクターで形質転換した宿主細胞によって認識される。一般的に、プラスミドベクターは、その宿主細胞と適合する種から誘導された複製及びコントロール配列を有する。このベクターは、通常は、形質転換細胞で表現型の選択を提供することが可能なタンパク質をコードする配列だけでなく複製部位を有する。原核宿主細胞及び真核宿主細胞での発現に好適なベクターは当分野で公知であり、さらにそのいくつかを本明細書に記載する。酵母菌などの真核生物、又は哺乳動物などの多細胞生物由来の細胞が用いられうる。
場合によっては、抗原をコードするＤＮＡは宿主細胞によって培地中への発現産物の分泌を生じさせる分泌リーダー配列に作用可能に連結される。分泌リーダー配列の例には、stII、エコチン(ecotin)、lamB、ヘルペスGD、lpp、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、及びアルファ因子が含まれる。ここでの使用にまた適しているのはプロテインＡの３６アミノ酸リーダー配列である(Abrahmsen等, EMBO J., 4:3901(1985))。
宿主細胞はこの発明の上述の発現又はクローニングベクターでトランスフェクトされ、好ましくは形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように変性された一般的な培養液中で培養される。
トランスフェクションとは、実際に任意のコード化配列が発現するかどうか分からない宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。トランスフェクションの多くの方法は、通常の技能を有する技術者に知られており、例えば、ＣａＰＯ４沈降法及び電気穿孔法がある。一般に成功したトランスフェクションは、宿主細胞内で該ベクターの働きの兆候が現れた時に認識される。トランスフェクション法は、当該分野でよく知られており、幾つかについてはここに更に記載する。
形質転換とは、ＤＮＡが染色体外成分として又は染色体組み込みによってのいずれかで複製可能となるように、生物にＤＮＡを導入することを意味する。用いる宿主細胞によって、その細胞に適した基本的な技術を用いて形質転換は行われる。形質転換法は当分野で公知であり、そのいくつかをさらに本明細書中に記載する。
抗原を産生するために用いる原核生物宿主細胞は、一般的に、上掲のSambrook等に記載のように培養することが可能である。
抗原を産生するために使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地で培養することができ、その培地は当分野で周知であり、そのいくつかを本明細書中に記載する。
この開示で言及している宿主細胞には、宿主動物内の細胞だけでなくインビトロ培養物の細胞が含まれる。
抗原の精製は、当分野で認識される方法を用いて実施され、そのいくつかを本明細書中に記載する。
ファージディスプレイクローンのアフィニティークロマトグラフィー分離での利用のために、例えば、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、種々のアクリルコポリマー、ヒドロキシルメタクリルゲル、ポリアクリル及びポリメタクリルコポリマー、ナイロン、中性及びイオン性担体等の適切な基質へ精製した抗原を付着させることが可能である。基質へのタンパク質の付着は、Methods in Enzymology, ４４巻(1976)に記載されている方法によって完遂することができる。アガロース、デキストラン又はセルロース等の多糖類基質へタンパク質リガンドを付着させるために広く用いられている技術には、ハロゲン化シアンによる担体の活性化、それに続く、活性化基質へのペプチドリガンドの第１級脂肪族又は芳香族アミンのカップリングが含まれる。
あるいは、抗原は、吸収プレートのウェルをコーティングするために利用すること、吸収プレートへ付着させた宿主細胞上で発現させるか又はセルソーティングで利用すること、又はストレプトアビジンでコーティングしたビーズによる捕獲のためにビオチンとコンジュゲートすること、又はファージディスプレイライブラリをパニングするためのあらゆる他の当該分野の方法において利用することが可能である。
吸着剤との少なくともファージ粒子の一部分の結合に適した条件下で、ファージライブラリの試料を固定化抗原と接触させる。通常は、ｐＨ、イオン強度、温度等を含む条件を選択して、生理学的条件を模倣する。固相と結合したファージを洗浄し、その後、例えばBarbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982(1991)に記載されているように酸で、又は例えばMarks等, J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載にされているようにアルカリで、又は例えばClackson等, Nature, 352: 624-628(1991)の抗原競合法に類似の手法である抗原競合によって溶出する。ファージは、１回目の選択で２０〜１，０００倍に濃縮することが可能である。さらには、この濃縮したファージを細菌培養液で生育させ、さらなる回の選択に供することが可能である。
選択の効率は多くの要因に依存し、それには、洗浄の間の解離の動力学、そして単一のファージ上の複数の抗体断片が同時に抗原と関われるかどうかということが含まれる。一次解離定数(及び弱い結合親和性)を有する抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ及び固相の抗原の高いコーティング密度の利用によって保持することが可能である。高い密度は、多価相互作用を介してファージを安定化するだけでなく、解離したファージの再結合に有利に作用する。遅い解離動力学(及び良好な結合親和性)を有する抗体の選択は、Bass等, Proteins, 8: 309-314(1990)及び国際公開第９２／０９６９０号に記載されているような長い洗浄と単価ファージディスプレイの利用、そしてMarks等, Biotechnol., 10: 779-783(1992)に記載されているような抗原の低度のコーティング密度によって促進することが可能である。
親和性に僅かな違いがあったとしても、抗体に対する異なる親和性のファージ抗体の中で選択することは可能である。しかしながら、選択した抗体のランダム変異(例えば、上記の幾つかの親和性成熟の技術で行われているような)は、多くの変異を生じやすく、その殆どが抗原と結合し、僅かがより高い親和性である。抗体を限定すると、希な高い親和性のファージが競合して除かれることが可能である。すべてのより高い親和性の変異を保持するために、ファージは、過度のビオチン化抗体とインキュベートすることが可能であるが、抗体に対する標的モル濃度親和定数よりも低いモル濃度のビオチン化抗体とインキュベートできる。次いで、高親和性結合ファージをストレプトアビジンでコーティングした常磁性体ビーズによって捕獲することが可能である。そのような「平衡捕獲」は、結合の親和性に従い、親和性の低い過度のファージから、僅かに２倍高い親和性の変異体クローンの単離を可能にする感度で抗体を選択することを可能にする。固相と結合したファージを洗浄するのに用いる条件を操作して、解離定数を基礎として識別することも可能である。
抗体クローンは活性選択されうる。このような抗体に対応するＦｖクローンは、(1) 上記のようなファージライブラリから抗体クローンを単離して、場合によって、好適な宿主細胞で個体集団を成長させることによって、ファージクローンの単離した母集団を増幅する、(2) 望ましいブロック活性及び非ブロック活性のそれぞれについて第二タンパク質と抗体を選択する、(3) 固定された抗体に抗抗体ファージクローンを吸着する、(4) 過剰量の第二タンパク質を用いて、第二タンパク質の結合決定基と共有するかオーバーラップする抗体−結合決定基を認識する任意の望ましくないクローンを溶出する、そして、(5) 工程(4)の後に吸着されたまま残ったクローンを溶出する、ことによって選別できる。場合によって、所望のブロック／非ブロック特性を有するクローンを、本明細書に記載の選別手順を一又は複数回繰り返すことによって、さらに濃縮できる。
ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ又は本発明のファージディスプレイＦｖクローンは、常法を用いて(例えば、ハイブリドーマの対象の領域をコードする重鎖及び軽鎖又はファージＤＮＡ鋳型を特異的に増幅するように設定したオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組み換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする公知のＤＮＡ配列(例えば好適なＤＮＡ配列は上掲のカバット等から得ることができる)と組み合わせて、完全長ないし一部の重鎖及び／又は軽鎖をコードするクローンを形成できる。このために、何れかのアイソタイプの定常領域、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を用いることができることが理解されるであろう。このような定常領域は任意のヒト又は動物種から得ることができる。ある動物(例えばヒト)種の可変ドメインＤＮＡから得て、次いで「ハイブリッド」である完全長重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成するために他の動物種の定常領域ＤＮＡに融合したＦｖクローンは、本明細書で用いられる「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。好適な実施態様では、ヒト可変ＤＮＡから得たＦｖクローンをヒト定常領域ＤＮＡに融合して、すべてのヒト、完全長ないし一部の重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成する。
また、本発明のハイブリドーマ由来の抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ハイブリドーマクローン由来の相同的マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を置換すること(例えばMorrison等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851(1984)の方法)によって修飾することができる。ハイブリドーマ又はＦｖクローン由来の抗体ないし抗体断片をコードするＤＮＡは、免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全て又は一部を共有結合させることによってさらに修飾することができる。そのように、「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体は、本発明のＦｖクローン又はハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有するように調製される。
抗原特異性
本発明は任意の適切な抗原結合特異性を有する抗体に適用できる。好ましくは、本発明の方法に用いる抗体は、生物学的に重要なポリペプチドである抗原に特異的である。より好ましくは、本発明の抗体は哺乳動物の疾病又は疾患の治療又は診断に有用である。本発明の抗体は、限定するものではないが、遮断用抗体、アゴニスト抗体、中和用抗体又は抗体コンジュゲート（抱合体）が含まれる。治療用抗体の非限定的な例には、抗ｃ-ｍｅｔ、抗ＶＥＧＦ、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１、抗ＣＤ１８、抗ＣＤ４０、抗組織因子（ＴＦ）、抗ＨＥＲ２及び抗ＴｒｋＣ抗体が含まれる。非ポリペプチド抗原（例えば腫瘍関連糖脂質抗原）に対する抗体もまた考えられる。
抗原がポリペプチドである場合、抗原は膜貫通分子(例えばレセプター)あるいはリガンド、例えば成長因子でありうる。抗原の例には、例えば、レニン；ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α-１-アンチトリプシン；インシュリンＡ-鎖；インシュリンＢ-鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；ＶＩＩＩＣ因子、ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、及びフォン・ウィルブランド因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性物質；ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子-α及び-β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症タンパク質(ＭＩＰ-１-α)；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミューラー阻害物質；リラキシンＡ-鎖；リラキシンＢ-鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；β-ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ-４のような細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原(ＣＴＬＡ)；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子のレセプター；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３、-４、-５又は-６（ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-５、又はＮＴ-６）、又はＮＧＦ-β等の神経成長因子等の神経栄養因子；血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の線維芽細胞成長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４、又はＴＧＦ-β５を含む、ＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インシュリン様成長因子-Ｉ及び-ＩＩ（ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩ）；ｄｅｓ(１-３)-ＩＧＦ-Ｉ（脳ＩＧＦ-Ｉ）、インシュリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ４０等のＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばＭ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、及びＧ-ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ-１からＩＬ-１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス性抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部等；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ-４及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター；及び上に列挙したポリペプチドの何れかの断片が含まれる。
本発明の一実施態様に包含される抗体に対する抗原には、ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４及びＣＤ４６；ＥｒｂＢレセプターファミリーのメンバー、例えばＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター；細胞接着分子、例えばＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０.９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ、α４／β７インテグリン及びそのα又はβサブユニット（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）を何れか含むαｖ／β３インテグリン；成長因子、例えばＶＥＧＦ；組織因子（ＴＦ）、及びＴＧＦ-βアルファインターフェロン（α-ＩＦＮ）；インターロイキン、例えばＩＬ-８；ＩｇＥ；血液型抗原Ａｐｏ２、デスレセプター；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満(ＯＢ)レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ等々が含まれる。一実施態様では、本発明の抗体はｃ−ｍｅｔに（幾つかの実施態様では、特異的に）結合する。
抗体断片
本発明は抗体断片を包含する。特定の場合では、全抗体よりも抗体断片の利用に利点がある。より小さいサイズの断片によりクリアランスが速くなり、固形腫瘍へのアクセスが改善されうる。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌で発現され、分泌されるため、この断片の大規模産生が容易となる。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有する、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片は米国特許第５８６９０４６号に記載される。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開９３/１６１８５；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域が欠けている完全な結合部を有する唯一の種である；したがって、それらは、インビボでの使用の間の非特異的結合を減らすために適する。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端の何れかで、エフェクタータンパク質の融合物を得るために構築されうる。上掲のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直線状の断片は単特異的又は二重特異的であってもよい。
従って、幾つかの実施態様では、抗ｃ-ｍｅｔ抗体は、Ｆｃ領域を含む一アーム抗体(すなわち、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインが単一の結合アームを形成)であり、ここでＦｃ領域は第１及び第２のＦｃポリペプチドを含み、第１及び第２のＦｃポリペプチドは複合体に存在し、抗原結合アームを含むＦａｂ分子と比較して、上記抗体断片の安定性を増加させるＦｃ領域を形成する。一アーム抗体を更にここに記載する。
ヒト化抗体
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は従来からよく知られている。例えば、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、ある方法によって、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト抗体
本発明のヒト抗ＦＧＦＲ３抗体は、上記のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択したＦｖクローン可変ドメイン配列を公知のヒト定常ドメイン配列と結合することによって構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗ＦＧＦＲ３抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は，例えば，Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner 等, J. Immunol., 147: 86 (1991)によって記載されている。
免疫化することで、内因性免疫グロブリンの生産なしに、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を生産することが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体の生産の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスでのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の転移は、抗原の挑戦によってヒト抗体の生産を引き起こす。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255(1993)；Jakobovits等, Nature 362, 255-258(1993)を参照のこと。
また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が開始非ヒト、例えば齧歯類の抗体と類似した親和性及び特性を有している場合、非ヒト、例えば齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法により、上記のファージディスプレイ技術により得られた非ヒト抗体断片の重鎖可変領域遺伝子又は軽鎖可変領域遺伝子の何れかをヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖないしＦａｂキメラの集団を作成する。抗原を選択することにより、ヒト鎖が初めのファージディスプレイクローンにおいて一致した非ヒト鎖の除去により破壊された抗原結合部位を回復する、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖないしＦａｂが単離される、つまり、エピトープがヒト鎖のパートナーの選択をつかさどる(インプリントする)。残りの非ヒト鎖を置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる(１９９３年４月１日公開のＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０６２１３を参照)。伝統的なＣＤＲ移植による非ヒト抗体のヒト化と異なり、この技術により、非ヒト起源のＦＲ又はＣＤＲ残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒト抗体ないしヒト化抗体である。この場合、結合特異性の一つはＦＧＦＲ３に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。例示的な二重特異性抗体は、ＦＧＦＲ３の２つの異なるエピトープに結合しうる。また、二重特異性抗体はＦＧＦＲ３を発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＦＧＦＲ３結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において既知である。二重特異性抗体の伝統的な組み換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの重鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が１９９３年５月１３日に公開の国際公報９３／０８８２９及びTraunecker等、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったより好適なアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公報９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公報９１/００３６０、国際公報９２/００３７３及び欧州特許第０３０８９号)等の用途が提案されている。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号などに記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
最近の進歩により大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片を直接回収することが容易となっており、これにより化学的にカップリングされて二重特異性抗体にを形成する。Shalaby 等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は、完全なヒト化二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の産生について記述している。各々のＦａｂ'断片は大腸菌から別々に分泌されて、インビトロで化学的にカップリングされて、二重特異性抗体を形成する。したがって、形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞及び正常ヒトT細胞に結合するだけでなく、ヒト胸部腫瘍の標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を引き起こすことができた。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等, J.Immunol. 147:60(1991)。
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
抗体変異体
いくつかの実施態様では、ここに開示する抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は生物学的特性を向上することができれば望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入して、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、又は挿入或いは置換を含む。最終構成物が所望する特徴を有していれば、欠失、挿入又は置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、配列ができるときに被検体の抗体アミノ酸配列に導入されうる。
突然変異誘発に好ましい位置である抗体の特定の残基又は領域の同定に有益な方法は、Cunningham及びWellsによりScience, 244:1081-1085 (1989年)に開示されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的となる残基又は残基の組が同定され(例えば、arg、asp、his、lys、及びgluなどの荷電した残基)、中性の、又は負に荷電したアミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリアラニン)で置換され、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を与える。次いで、置換に対する機能的感受性を示しているそれらアミノ酸位置を、置換の部位において、又は置換の部位のために、さらなる、又は他の変異体を導入することにより精製する。このように、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定する必要は無い。例えば、任意の部位における突然変異の機能を分析するために、標的コドン又は領域においてａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を実行し、発現した免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を有するポリペプチドまでの長さに亘るアミノ−末端融合及び／又はカルボキシ−末端融合、ならびに、単一又は多重アミノ酸残基の配列内挿入を含む。端末挿入の例には、Ｎ−末端メチオニル残基を持つ抗体、又は細胞障害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチド又は(例えばＡＤＥＰＴのための)酵素の抗体のＮ−末端又はＣ−末端への融合が含まれる。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
抗体がＦｃ領域を含有する場合、それに接着する炭水化物を変更してもよい。例えば、抗体のＦｃ領域に接着するフコースを欠損する成熟炭水化物構造の抗体は、米国公開特許第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)に記載される。米国公開特許第２００４／００９３６２１号(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)も参照のこと。抗体のＦｃ領域に接着した炭水化物内のＮ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)を二分する抗体は、国際公報第０３／０１１８７８号、Jean-Mairet 等、及び米国特許第６６０２６８４号、Umana 等に参照されている。抗体のＦｃ領域に接着するオリゴサッカライド内の少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、国際公報第９７／３００８７号、Patel 等に報告される。また、抗体のＦｃ領域に接着する変更された炭水化物を有する抗体については、国際公報第９８／５８９６４号(Raju, S.)及び国際公報第９９／２２７６４号(Raju, S.)も参照のこと。また、修飾されたグリコシル化を有する抗原結合分子については、米国公開特許第２００５／０１２３５４６号(Umana 等)を参照。
本明細書中の好適なグリコシル化変異形はＦｃ領域を含有し、Ｆｃ領域に接着される炭水化物構造はフコースを欠いている。このような変異形は改善されたＡＤＣＣ機能を有する。場合によって、Ｆｃ領域は、更にＡＤＣＣを改善する一つ以上のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の位置２９８、３３３及び／又は３３４の置換(Ｅｕ残基番号付け)を更に含む。「脱フコース化」又は「フコース欠失」抗体に関する文献の例には以下のものを含む：米国公開番号２００３／０１５７１０８；国際公報２０００／６１７３９；国際公報２００１／２９２４６；米国公開番号２００３／０１１５６１４；米国公開番号２００２／０１６４３２８；米国公開番号２００４／００９３６２１；米国公開番号２００４／０１３２１４０；米国公開番号２００４／０１１０７０４；米国公開番号２００４／０１１０２８２；米国公開番号２００４／０１０９８６５；国際公報２００３／０８５１１９；国際公報２００３／０８４５７０；国際公報２００５／０３５５８６；国際公報２００５／０３５７７８；；国際公報２００５／０５３７４２；Okazaki 等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；及びYamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)。脱フコース化抗体を産生する細胞株の例として、タンパク質フコース化欠失Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞 (Ripka 等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国公開番号２００３／０１５７１０８, Presta, L；及び国際公報２００４／０５６３１２, Adams 等, 特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、例としてα-１,６-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８,-ノックアウトＣＨＯ細胞 (Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004))などがある。
一態様では、本発明は、抗体断片内のＦｃ配列のホモ二量体化を最小化する一方、ヘテロ二量体化を促進する少なくとも１つの特徴を具備する抗体断片を提供する。本願明細書において記載されるように、このような特徴は本発明の方法によって入手できるイムノグロブリン集団の効率及び／又は精製度及び／又は均質性を改良する。一実施態様では、第一Ｆｃポリペプチドと第二Ｆｃポリペプチドは作用領域で会合／相互作用する。第一及び第二のＦｃポリペプチドが作用領域で会合するいくつかの実施態様において、第二Ｆｃポリペプチド（配列）の作用領域は、第一Ｆｃポリペプチド（配列）の作用領域内のキャビティ（「ホール」とも呼ばれる）に位置しうる***（「ノブ」とも呼ばれる）を具備する。一実施態様では、第一Ｆｃポリペプチドはキャビティをコードするために鋳型／元のポリペプチドから変更されているか、あるいは、第二Ｆｃポリペプチドは***をコードする鋳型／元のポリペプチドから変更されているか、あるいはその両方である。一実施態様では、第一Ｆｃポリペプチドはキャビティをコードするために鋳型／元のポリペプチドから変更されており、第二Ｆｃポリペプチドは***をコードするために鋳型／元のポリペプチドから変更されている。一実施態様では、第二Ｆｃポリペプチドの作用領域は第一Ｆｃポリペプチドの作用領域内のキャビティに位置しうる***を具備し、キャビティ又は***又はその両方がそれぞれ第一及び第二のＦｃポリペプチドの作用領域に導入されている。第一Ｆｃポリペプチドと第二Ｆｃポリペプチドが作用領域で会合するいくつかの実施態様において、第一Ｆｃポリペプチド（配列）の作用領域は、第二Ｆｃポリペプチド（配列）の作用領域内のキャビティに位置しうる***を具備する。一実施態様では、第二Ｆｃポリペプチドはキャビティをコードするために鋳型／元のポリペプチドから変更されているか、あるいは、第一Ｆｃポリペプチドは***をコードするために鋳型／元のポリペプチドから変更されているか、あるいはその両方である。一実施態様では、第二Ｆｃポリペプチドはキャビティをコードするために鋳型／元のポリペプチドから変更されており、第一Ｆｃポリペプチドは***をコードするために鋳型／元のポリペプチドから変更されている。一実施態様では、第一Ｆｃポリペプチドの作用領域は第二Ｆｃポリペプチドの作用領域内のキャビティに位置しうる***を具備し、***又はキャビティ又はその両方がそれぞれ第一及び第二のＦｃポリペプチドの作用領域に導入されている。
一実施態様では、***及びキャビティは、それぞれ天然に生じるアミノ酸残基を具備する。一実施態様では、***を具備するＦｃポリペプチドは、鋳型／元のポリペプチドの作用領域の元の残基を元の残基より大きな側鎖容量を有する移入残基に置換することによって生成される。一実施態様では、***を具備するＦｃポリペプチドは、該ポリペプチドの作用領域の元の残基をコードする核酸が元のものより大きな側鎖容量を有する移入残基をコードする核酸に置換される工程を含んでなる方法によって生成される。一実施態様では、元の残基はスレオニンである。一実施態様では、元の残基はＴ３６６である。一実施態様では、移入残基はアルギニン(Ｒ)である。一実施態様では、移入残基はフェニルアラニン(Ｆ)である。一実施態様では、移入残基はチロシン(Ｙ)である。一実施態様では、移入残基はトリプトファン(Ｗ)である。一実施態様では、移入残基はＲ、Ｆ、Ｙ又はＷである。一実施態様では、***は鋳型／元のポリペプチド内の２以上の残基を置換することによって生成される。一実施態様では、***を具備するＦｃポリペプチドはカバット等のＥＵ番号付けスキームによるアミノ酸番号３６６位のスレオニンのトリプトファンへの置換を具備する（Sequences of proteins of immunological interest, 第５版, １号の688-696頁 (1991; NIH, Bethesda, MD)）。
いくつかの実施態様では、キャビティを具備するＦｃポリペプチドは、鋳型／元のポリペプチドの作用領域内の元の残基を元の残基より小さな側鎖容量を有する移入残基に置換することによって生成される。例えば、キャビティを具備するＦｃポリペプチドは、該ポリペプチドの作用領域の元の残基をコードする核酸が元のものより小さな側鎖容量を有する移入残基をコードする核酸に置換される工程を含んでなる方法によって生成されてもよい。一実施態様では、元の残基はスレオニンである。一実施態様では、元の残基はロイシンである。一実施態様では、元の残基はチロシンである。一実施態様では、移入残基はシステイン(Ｃ)でない。一実施態様では、移入残基はアラニン(Ａ)である。一実施態様では、移入残基はセリン(Ｓ)である。一実施態様では、移入残基はスレオニン(Ｔ)である。一実施態様では、移入残基はバリン(Ｖ)である。キャビティは、鋳型／元のポリペプチドの一つ以上の元の残基を置換することによって生成することができる。例えば、一実施態様では、キャビティを具備するＦｃポリペプチドは、スレオニン、ロイシン及びチロシンからなる群から選択される２以上の元のアミノ酸の置換を具備する。一実施態様では、キャビティを具備するＦｃポリペプチドは、アラニン、セリン、スレオニン及びバリンからなる群から選択される２以上の移入残基を具備する。いくつかの実施態様では、キャビティを具備するＦｃポリペプチドはスレオニン、ロイシン及びチロシンからなる群から選択される２以上の元のアミノ酸の置換を具備し、該元のアミノ酸はアラニン、セリン、スレオニン及びバリンからなる群から選択される移入残基に置換されたものである。いくつかの実施態様では、置換される元のアミノ酸は、Ｔ３６６、Ｌ３６８及び／又はＹ４０７である。一実施態様では、キャビティを具備するＦｃポリペプチドは、上掲のカバット等のＥＵ番号付けスキームによるアミノ酸番号３６６位のスレオニンのセリンへの置換を具備する。一実施態様では、キャビティを具備するＦｃポリペプチドは、上掲のカバット等のＥＵ番号付けスキームによるアミノ酸番号３６８位のロイシンのアラニンへの置換を具備する。一実施態様では、キャビティを具備するＦｃポリペプチドは、上掲のカバット等のＥＵ番号付けスキームによるアミノ酸番号４０７位のチロシンのバリンへの置換を具備する。一実施態様では、キャビティを具備するＦｃポリペプチドは、上掲のカバット等のＥＵ番号付けスキームによるアミノ酸番号Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖからなる群から選択される２以上のアミノ酸置換を具備する。これらの抗体断片のいくつかの実施態様では、***を具備するＦｃポリペプチドは、上掲のカバット等のＥＵ番号付けスキームによるアミノ酸番号３６６位のスレオニンのトリプトファンへの置換を具備する。
一実施態様では、抗体は国際公開第２００５／０６３８１６号に記載される通り、「ノブ」と「ホール」を構成するＦｃ変異を含む。例えば、ホール変異は、Ｆｃポリペプチド中の一以上のＴ３６６Ａ、Ｌ３６８Ａ及び／又はＹ４０７Ｖであり得、ノブ変異はＴ３６６Ｗであり得る。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置換された抗体分子に少なくとも一つのアミノ酸残基（少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ又はそれより多い）を有する。置換突然変異について最も対象となる部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表Ａに示す。これらの置換により生物学的活性に変化が生じる場合、表Ａに「例示的置換」と称した又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
Figure 0006173690
抗体の生物学的性質の更により実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋コンホメーション、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持して、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
(２)中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
(３)酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
(４)塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
(５)鎖配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
(６)芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスに交換することを必要とするであろう。
置換変異体の一種は、親抗体(例えばヒト化抗体又はヒト抗体)の一以上の高頻度可変領域残基を置換することを含む。一般に、更なる開発用に選択される得られた変異体は、それらが生産された親抗体に対して改善された生物学的特性を有しているであろう。このような置換変異体を生成する簡便な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性変異を含む。簡単に述べると、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６〜７の部位)を変異させることにより、各部位に可能な全てのアミノ酸置換を生じさせる。このようにして生成された抗体は、各粒子内にパッケージされたファージコートタンパク質(例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物)の少なくとも一部への融合物として、糸状のファージ粒子から表示される。ついで、ファージディスプレイされた変異体は、ここに記載される通り、その生物的活性(例えば結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補高頻度可変領域部位を同定するために、系統的変異導入法(例えばアラニンスキャニング)を行って、抗原結合に有意に貢献する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又は付加的に、抗原抗体複合体の結晶構造を分析することにより、抗体と抗原との接触点を同定することが有効である。このような接触残基及び隣接残基は、ここに説明する技術による置換の候補である。そのような変異体がひとたび生成されたら、ここに記載されるように変異体パネルのスクリーニングを行い、更なる開発のために一又は複数の関連アッセイで優れた特性を有する抗体を選択することができる。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又はオリゴヌクレオチド媒介性(又は部位特異的)突然変異による調製、ＰＣＲ突然変異誘発、及び前もって調製された変異体又は抗体の非変異型のカセット変異導入法を含むが、これらに限定されない。
本発明のイムノグロブリンポリペプチドのＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入することにより、Ｆｃ領域変異体を生成することが望ましい場合がある。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステインのアミノ酸位置を含む一以上のアミノ酸位置に一のアミノ酸修飾(例えば置換)を含むヒトＦｃ領域配列(例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域)を含みうる。
本明細書及び従来技術の教示によれば、ある実施態様では、本発明の抗体は、対応する野生型の抗体と比較した場合、例えばＦｃ領域内に、一又は複数の変更を有すると考えられる。それでも、これらの抗体は、その野生型の同等物と比較した場合、治療的有効性に必要なほぼ同一の特性を保持している。例えば、国際公開第９９／５１６４２号等に記載されているように、Ｆｃ領域に、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)に変化(つまり効果の改善又は低減)をもたらす特定の変更を実施することが考慮される。Ｆｃ領域の変異体の他の例に関し、Ducan及びWinter, Nature 322:738-40 (1998)；米国特許第５６４８２６０号；同第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。国際公開第００／４２０７２号(Presta)及び国際公開第ＷＯ ２００４／０５６３１２号(Lowman)はFcRへの結合が改善された又は低減された抗体変異体を記載している。これらの特許文献の内容は出典明示により特にここに援用される。またShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照のこと。増加した半減期と新生児型Fcレセプター(FcRn)への結合が改善された抗体は、母体IgGsの胎児への移動の原因であるが(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim等, J. Immunol. 24:249 (1994))、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号(Hinton等)に記載されている。これらの抗体はＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。変更されたＦｃ領域アミノ酸と増加又は減少したＣ１ｑ結合能を有するポリペプチド変異体は、米国特許第６１９４５５１Ｂ１号、国際公開第９９／５１６４２号に記載されている。この特許文献の内容を出典明示により特にここに援用する。またIdusogie等, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照のこと。
抗体誘導体
本発明の抗体は、さらに、当該技術分野で既知であり、容易に入手可能である付加的非タンパク質様部分を含有するよう修飾され得る。好ましくは、抗体の誘導体化のために適した部分は、水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダムコポリマー)、およびデキストランまたはポリ(ｎ−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド・コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、ならびにその混合物。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造における利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量を有し得るし、分枝鎖または非分枝鎖であり得る。抗体に結合されるポリマーの数は変わり得るし、もし２つより多くのポリマーが結合される場合、それらは同一または異なる分子であり得る。概して、誘導体化のために用いられるポリマーの数および／または種類は、抗体誘導体が限定条件下で治療に用いられるか等にかかわらず、改良されるべき抗体の特定の特性または機能（これらに限定されない）を含めた考察に基づいて確定される。
所望の性質を有する抗体のスクリーニング
本発明の抗体は当該分野で知られている様々なアッセイによってその物理的／化学的特性及び生物学的機能について特徴付けることができる（幾つかをここに開示する）。例えば、抗体は、限定されるものではないが、Ｎ末端シークエンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィ、及びパパイン消化を含む一連のアッセイによってさらに特徴付けることができる。
本発明の特定の実施態様では、本明細書で生産された免疫グロブリンは、その生物学的活性について分析される。いくつかの実施態様では、本発明の免疫グロブリンは、その抗原結合活性について試験される。当該分野で知られ、ここで使用することができる抗原結合アッセイには、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイのような技術を用いた任意の直接的又は競合的結合アッセイが制限なく含まれる。実例となる抗原結合アッセイが下記の実施例セクションに提供されている。
ベクター、宿主細胞及び組換え方法
異種ポリペプチド（例えば、抗体）の組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製ベクターに挿入する。ポリペプチド（抗体）をコードするＤＮＡは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物由来の細胞である。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を含め、任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使われてもよく、このような定常領域はヒト又は動物種の何れかから得られうることは理解されるであろう。
ａ．原核生物の宿主細胞を用いた抗体生成
ｉ． ベクターの構築
本発明のポリペプチド（例えば、抗体）のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はＰＣＲ法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能(異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方)及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位(ＲＢＳ)、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
一般には、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種に由来するコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、宿主細胞と関連して使用される。そのベクターは、通常、複製開始点並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、一般的に大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリン(Ａｍｐ)及びテトラサイクリン(Ｔｅｔ)耐性のコード遺伝子を含んでいるため、形質転換細胞を容易に同定することができる。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージも外来性タンパク質を発現する微生物によって使用可能なプロモータを含むか、含むように変更される。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例はCarter等の米国特許第５６４８２３７号に詳細に記載されている。
また、レプリコン及び宿主微生物と適合性のあるコントロール配列を含んでいるファージベクターを、これらの宿主との関連でトランスフォーミングベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ.ＴＭ.-１１のようなバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２のような感受性の宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターを作製する際に利用することができる。
本発明の発現ベクターは各ポリペプチド成分をコードする２又はそれ以上のプロモータ−シストロン(翻訳単位)対を含みうる。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流(５')に位置している非翻訳配列である。原核生物のプロモーターは典型的には誘導性と構成的との二つのクラスのものがある。誘導性プロモーターは、例えば栄養分の有無又は温度の変化のような、培養条件の変化に応答してその調節下でシストロンの転写レベルを増大させるように誘導するプロモーターである。
様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータが非常にたくさん公知となっている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモータを除去し、本発明のベクター内に単離したプロモータを挿入することによって軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を生じさせるために使用することができる。ある実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、βガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターが含まれる。しかし、細菌中で機能性である他のプロモーター(例えば他の既知の細菌又はファージプロモーター)も好適である。そのヌクレオチド配列は発表されており、よって当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するリンカー又はアダプターを使用して標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを結合させることができる(Siebenlist等 (1980) Cell 20:269)。
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を貫通して発現されるポリペプチドの転写を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるか、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部でありうる。この発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる(つまりシグナルペプチダーゼにより切断される)ものでなければならない。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識せずプロセシングする原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えば、本発明のシグナルポリペプチドから選択される原核生物シグナル配列によって置換される。更に、ベクターは、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩ(ＳＴＩＩ)リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。
本発明の一態様では、一以上のポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）は、集合的に一アーム抗体ををコードする。一実施態様では、単一ポリヌクレオチドは（ａ）一アーム抗体の軽鎖と重鎖成分、及び（ｂ）Ｆｃポリペプチドをコードする。一実施態様では、単一のポリヌクレオチドは、一アーム抗体の軽鎖及び重鎖成分をコードし、別のポリヌクレオチドはＦｃポリペプチドをコードする。一実施態様では、別のポリヌクレオチドは、それぞれ、一アーム抗体の軽鎖成分、一アーム抗体の重鎖成分及びＦｃポリペプチドをコードする。一アーム抗体の産生は、例えば、国際公開第２００５０６３８１６号に記載される。
本発明の抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属(例えば大腸菌)、バシラス属(例えば枯草菌)、エンテロバクター属、シュードモナス種(例えば緑膿菌)、ネズミチフス菌、霊菌(Serratia marcescans)、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ(Vitreoscilla)又はパラコッカス(Paracoccus)が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR を有する３３Ｄ３株(米国特許第5,639,635号)を含むW3110株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁；ATCC寄託番号27,325)及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌294 (ATCC 31,446), 大腸菌B, 大腸菌λ1776 (ATCC 31,537)及び大腸菌RV308(ATCC 31,608) など、他の株及びその誘導体も好適である。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義した遺伝子型を有する上記の何れかの細菌の誘導体の構築方法は当業者に公知であり、例として, Bass等, Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。
ｉｉ．抗体産生
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、そのＤＮＡを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地(ＬＢ)プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
炭素、窒素及び無機リン酸源の他に任意の必要なサプリメントを、単独で、又は複合窒素源のような他のサプリメント又は培地との混合物として導入される適切な濃度で含有させられうる。場合によっては、培養培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール及びジチオトレイトールからなる群から選択される一又は複数の還元剤を含みうる。
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、好適な温度は約２０℃から約３９℃、より好ましくは約２５℃から約３７℃の範囲、更により好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５から約９の範囲の任意のｐＨでありうる。大腸菌に対しては、ｐＨは好ましくは約６．８から約７．４、より好ましくは約７．０である。
本発明の発現ベクターに誘導性プロモータが用いられる場合、プロモータの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにＰｈｏＡプロモータが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。好ましくは、リン酸限定培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である(例として、Simmons等, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照)。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。
一実施態様では、発現された本発明のポリペプチドは宿主細胞の細胞膜周辺中に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、一般的には浸透圧ショック、超音波処理又は溶解のような手段によって典型的には微生物を破壊することを含む。ひとたび細胞が破壊されると、細胞片又は全細胞を遠心分離又は濾過によって除去することができる。タンパク質は、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製することができる。あるいは、タンパク質は培養培地に輸送しそこで分離することができる。細胞を培養物から除去することができ、培養上清は濾過され、生成したタンパク質の更なる精製のために濃縮される。発現されたポリペプチドを更に単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(ＰＡＧＥ)及びウェスタンブロットアッセイ法のような一般的に知られている方法を使用して同定することができる。
本発明の一態様では、抗体産生は発酵法によって多量に受け継がれる。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１０００から１０００００リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース(好ましい炭素／エネルギー源)を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ１００リットル以下の容積で、約１リットルから約１００リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約１８０−２２０のＯＤ５５０まで増殖したところで開始される。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約１２−５０時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
本発明のポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの正しい組み立てとフォールディングを改善するために、例えばＤｓｂタンパク質(ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ)又はＦｋｐＡ(シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ)のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999) J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等, 米国特許第６０８３７１５号；Georgiou等, 米国特許第６０２７８８８号；Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。幾つかの実施態様では、ＤｓｂＡとＣは、大腸菌宿主細胞で発現する。
発現された異種タンパク質(特にタンパク分解を受けやすいもの)のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、原核生物宿主細胞株を改変して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2773-2777；Georgiou等, 米国特許第５２６４３６５号；Georgiou等, 米国特許第５５０８１９２号；Hara等 (1996) Microbial Drug Resistance 2:63-72に記載されている。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
ｉｉｉ．抗体精製
当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽***換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばSephadex G-75を用いたゲル濾過法。
一態様では、固形層に固定したプロテインＡを本発明の完全長抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Lindmark等 (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。プロテインＡを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面、より好ましくは孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムが好ましい。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインＡ固定固形層に適応し、プロテインＡに対象とする抗体を特異的に結合させる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
イムノコンジュゲート
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤にコンジュゲートした本明細書中に記載の何れかの抗体を含む、イムノコンジュゲート(「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と交換可能に称される)を提供する。
細胞障害性又は細胞***停止性の薬剤、すなわち癌治療において腫瘍細胞を殺すか又は阻害するための薬剤の局所デリバリーに抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）、つまり免疫複合体を用いると（Payne (2003) Cancer Cell 3:207-212；Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz及びSpringer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第４９７５２７８号）、腫瘍への薬剤成分の標的とするデリバリーとそこでの細胞内集積が可能となり、これら非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる（Baldwin等, (1986) Lancet (Mar. 15, 1986):pp603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」 MONOCLONAL ANTIBODIES ‘84: BIOLOGICAL AND CLINICAL APPLICATIONS, Pinchera等(編), pp. 475-506）。これによって、最小限の毒性で最大限の効果が求められる。ＡＤＣを設定して精密化するために、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の選択性並びに薬剤結合特性及び薬剤放出特性に注目した。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は共にこれらの方策に有用であると報告されている（Rowland等, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87）。これらの方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキセート及びビンデジンが含まれる（Rowland等, (1986) 上掲）。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシン(Mandler等(2000) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandler等(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandler等(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791）、メイタンシノイド（EP1391213；Liu等、(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623）、及びカリケアマイシン（Lode等 (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等 (1993) Cancer Res. 53:3336-3342）などの小分子毒素が含まれる。毒素はチューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機構による細胞毒性及び細胞静止効果に影響を及ぼし得る。幾つかの細胞毒性薬は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした際に、不活性となるか又は活性が弱くなる傾向がある。
ゼバリン(ZEVALIN)(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec)は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と111In又は90Y放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体−放射性同位体コンジュゲートである(Wiseman等, (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman等, (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球(ＮＨＬ)に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)(登録商標)(ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals)は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として2000年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第4970198号；同第5079233号；同第5585089号；同第5606040号；同第5693762号；同第5739116号；同第5767285号；同第5773001号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)は、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃などの治療用に第ＩＩ相試験へと進んでいる。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療の開発段階にある。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ(ＡＥ)及びモノメチルアウリスタチン(ＭＭＡＥ)、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６(癌細胞上のルイスＹに特異的)及びｃＡＣ１０(血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的)(Doronina等, (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
免疫複合体(イムノコンジュゲート)の生成に有用な化学治療薬を本明細書中(例えば、上記)に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。例として1993年10月28日に公開の国際公開公報93/21232を参照のこと。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開94/11026参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
ｉ．メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している本発明の抗体(完全長又は断片)を含んでなる。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する***阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブＭａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａから単離されたものである（米国特許第３８９６１１１号）。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ−３メイタンシノールエステルを生成することが発見された（米国特許第４１５１０４２号）。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４，１３７，２３０号；同４，２４８，８７０号；同４，２５６，７４６号；同４，２６０，６０８号；同４，２６５，８１４号；同４，２９４，７５７号；同４，３０７，０１６号；同４，３０８，２６８号；同４，３０８，２６９号；同４，３０９，４２８号；同４，３１３，９４６号；同４，３１５，９２９号；同４，３１７，８２１号；同４，３２２，３４８号；同４，３３１，５９８号；同４，３６１，６５０号；同４，３６４，８６６号；同４，４２４，２１９号；同４，４５０，２５４号；同４，３６２，６６３号；及び同４，３７１，５３３号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤成分は、（ｉ）発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である（ｉｉ）抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、（ｉｉｉ）血漿中で安定、そして（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、同５，４１６，０６４号、欧州特許第０４２５２３５ Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合しているイムノコンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号（この開示内容は出典明記により特別に組み込まれる）を参照。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５，２０８，０２０号又は欧州特許第０４２５２３５ Ｂ１号、Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)、及び２００４年１０月８日に出願の米国特許出願番号１０／９６０，６０２（これらの開示内容は出典明記により特別に組み込まれる）に開示されているもの等を含め、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含んでなる抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、２００４年１０月８日に出願の米国特許出願番号１０／９６０，６０２に開示されるように調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる結合基を本願明細書中に記載し、例示する。
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施形態において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
ｉｉ．アウリスタチン類及びドラスタチン類
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）（米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号）にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性（米国特許第５６６３１４９号）及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる（国際公開第０２／０８８１７２号）。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、Ｎ末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分ＤＥ及びＤＦを含み、２００４年１１月５日に出願の米国特許出願番号１０／９８３，３４０号の"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"に開示され、この開示内容は出典明記によってその全体が明示的に組み込まれる。
典型的に、ペプチドベースの薬剤成分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる(E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照)。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤成分は、米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号；Pettit等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465；Pettit 等 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G.R., 等 Synthesis, 1996, 719-725；及びPettit 等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863の方法に従って調製されうる。また、Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、２００４年１１月５日に出願の米国特許出願番号第１０／９８３，３４０号も参照のこと。これらは出典明記によってその全体が本願明細書中に組み込まれる(例えば、リンカー及びモノメチルバリン化合物、例えばＭＭＡＥ及びリンカーにコンジュゲートしたＭＭＡＦの調整方法を開示している)。
ｉｉｉ．カリケアマイシン
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した本発明の抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１ Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ １(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
ｉｖ．他の細胞障害剤
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン（esperamicine）（米国特許第５８７７２９６号）が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成されるイムノコンジュゲートをさらに考察する。
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。<BR>
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ）が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号）。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ （スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸塩）にて調製したＡＤＣが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの４６７−４９８頁を参照。
ｖ．抗体薬剤コンジュゲートの調製
本発明の抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）において、抗体（Ａｂ）を、リンカー（Ｌ）を介して、一つ以上の薬剤部分（Ｄ）、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式ＩのＡＤＣはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態及び試薬を用いて調製されうる：（１）共有結合の後に薬剤部分Ｄと反応してＡｂ−Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応；及び（２）共有結合の後に抗体の求核基と反応してＤ−Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。ＡＤＣを調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。
Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐ Ｉ
リンカーは、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン(「val-cit」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(「ＰＡＢ」)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「ＳＩＡＢ」)を含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において、記述される。また、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、２００４年１１月５日に出願した米出願番号１０／９８３，３４０を参照。その内容は出典明記により本願明細書に組み込まれる。
いくつかの実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドなどがある。例示的なジペプチドは、バリン-シトルリン(vc又はval-cit)、アラニン-フェニルアラニン(af又はala-phe)を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン-バリン-シトルリン(gly-val-cit)及びグリシン-グリシン-グリシン(gly-gly-gly)を含む。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設定され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化できる。
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオール及び水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群及びリンカー試薬により共有結合を形成することができる：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ（ジチオトレイトール）による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン(トラウトの試薬)を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する(例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する)ことによって抗体に導入されてもよい。
また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する(リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応させることができる)ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル(アルデヒド及びケトン)基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan &amp; Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；米国特許第５３６２８５２号)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基：(i) 活性エステル(例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物)；(ii) アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基、が含まれる。
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを個体に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
薬剤的製剤
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000))、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又はTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
ここでの製剤は、治療される特定の徴候のために必要ならば一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を持つものも含んでよい。そのような分子は、好適には、意図する目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、本発明の免疫グロブリンを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT（商標）(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、３７℃の水分に暴露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。
ＩＩＩ．用途
本発明の抗体は、例えば、それが認識する特定ポリペプチドを精製、検出、及び標識するのに使用され、インビトロ及びインビボの診断及び治療方法を含む。
一態様では、本発明の抗体は、生物学的試料の特定抗原を質的及び量的に測定する免疫測定法に使用することができる。抗原-抗体結合を検出するための通常の方法には、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）又は組織免疫組織化学を含む。多くの方法では、検出の目的で抗体に結合する標識を使用する。抗体とともに使用される標識は、抗体への結合を妨害しないあらゆる検出可能な機能性を有する。多くの標識が知られ、放射性同位体である32P, 32S, 14C, 125I, 3H及び131I、希土類キレートなどのフルオロフォアー、又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、アンベリフェロン（umbelliferone）、例えばホタルルシフェラーゼ及びバクテリアルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）などのルシフェラーゼ、ルシフェリン、２,３-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼなどのサッカライドオキシダーゼ、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなどのヘテロサイクリックオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル、放射性核種の画像（例えばTechnocium）などである。
これらの標識を共有結合的に異種ポリペプチドと結合させるためには、従来の方法が利用できる。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス-イミデート、ビス-ジアゾ化ベンジジン、及びその類似物質などのカップリング剤が、上述の蛍光性、化学発光性、及び酵素的な標識で抗体をタグ化するのに用いられる。例えば、米国特許３，９４０，４７５号（蛍光定量法）及び３，６４５，０９０号（酵素法）；Hunter等, Nature 144:945 (1962)；David等, Biochemistry 13:1014-1021 (1974)；Pain等, J. Immunol. Methods 40:219-230 (1981)；及びNygren Histochem. and Cytochem. 30:407-412 (1982)を参照のこと。ここでの好ましい標識は、西洋わさびペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼ等の酵素である。酵素を含むこのような標識の抗体ポリペプチドへの結合は、イムノアッセイ技術分野における当業者にとって、標準的な操作可能な方法である。例えば、O'Sullivan等, &quot;Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay&quot;, in Methods in Enzymology, ed. J.J.Langone 及びH. Van Vunakis, Vol.73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp147-166を参照のこと。このような結合方法は、本発明の異種ポリペプチドとの使用に適している。
抗体を標識する代わりに、抗原を生物学的流体において検出可能な物質を含む競合標識抗原標準と非標識抗体とを利用する競合イムノアッセイによってアッセイしてもよい。このアッセイでは、生物学的サンプル、標識抗原標準および抗体を結合させ、非標識抗体と結合した標識抗原標準の量を求める。生物的サンプル中の試験した抗原の量は抗体と結合した標識抗原標準の量と反比例する。
一態様では、本発明の異種ポリペプチド（抗体のような）はインビトロまたはインビボで特定の表面抗原発現を検出およびプロファイルするのに特に有用である。前記で論じたように、非グリコシル化された全長抗体はエフェクター機能（すなわち、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性）を発揮しない。従って、抗体が細胞表面抗原と結合する場合に、望ましくない細胞障害性現象を惹起しない。表面抗原は特定の細胞または組織種に特異的である場合があり、従って、細胞または組織種のマーカーとなる。表面抗原マーカーは特定の細胞または組織種の種々の分化ステージで異なって発現されるのが好ましい。従って、かかる表面抗原に対して向けられる全長抗体をマーカーを発現する細胞または組織集団のスクリーニングのために用いてもよい。例えば、本発明の抗体を用いて胚幹細胞、造血幹細胞および間葉幹細胞などの幹細胞をスクリーニングおよび単離してもよい。また、本発明の抗体を用いてＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体などの腫瘍関連表面抗原を発現する腫瘍細胞を検出してもよい。
本発明の全長抗体をアフィニティー精製剤として用いてもよい。このプロセスでは、当技術分野で十分に知られている方法を用いて全長抗体をセファデックス樹脂またはフィルターペーパーなどの固相に固定化する。固定化抗体を精製される抗原を含有するサンプルと接触させ、その後支持体を、固定化全長抗体と結合している精製される抗原を除いてサンプル中の実質的にすべての物質を除去する好適な溶媒で洗浄する。最後に、支持体を抗原をポリペプチドから放出するグリシン緩衝液、ｐＨ５．０などの別の好適な溶媒で洗浄する。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、細胞増殖障害、及び／又は免疫（自己免疫のような）障害のような、疾患の治療のための医薬の調製及び／又は予防治療における本発明の方法を用いて得る異種ポリペプチドの使用を提供する。異種ポリペプチドは、抗体、抗体断片、ポリペプチド（例えば、オリゴペプチド）、又はそれらの組み合わせを含む、ここに記載の任意の形態であり得る。幾つかの実施態様では、抗原はヒトタンパク質分子であり、検体はヒト検体である。
本発明の異種ポリペプチドを、一又は複数の抗原分子の異常な発現及び／又は活性に関連する疾患、障害ないし症状、限定されるものではないが、悪性及び良性腫瘍；非白血病及びリンパ性腫瘍；神経、グリア、アストロサイト、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮、間質及び胚障害；及び炎症性、血管性及び免疫性障害を診断、治療、阻害又は予防するために用いることができる。
特定の実施態様では、抗体を含むイムノコンジュゲートが患者に投与される。好ましくは、それが結合するイムノコンジュゲート及び／又は抗原が細胞によって内在化する。
本発明の異種ポリペプチドは、単独で、又は、他の組成物と組み合わせて治療に用いることができる。例えば、異種ポリペプチドは、化学療法剤(一又は複数)(化学療法剤の混合を含む)、他の細胞障害性剤(一又は複数)、抗血管形成剤(一又は複数)、サイトカイン及び／又は増殖阻害剤(一又は複数)と同時に投与してもよい。その代わりに、又は加えて、患者は組み合わせの放射線治療を受けてもよい（例えば、外部ビーム照射又は放射性標識剤、例えば抗体）。上記の併用治療には、併用投与(２以上の作用剤が同じか又は別の製剤に包含される)及び別々の投与が含まれ、別々の投与の場合には、本発明の抗体は補助治療(一又は複数)の前及び／又はその後に投与することができる。
異種ポリペプチド（及び場合によっては、補助治療薬）は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与する。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下的な投与を含む。加えて、抗体を、特に抗体の用量を減少して、パルス注入によって好適に投与する。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって、好適な任意の方法投与することができる。
本発明の異種ポリペプチド組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与する。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、および医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するかまたは治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の本発明の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。一般的に、以前用いたのと同じ用量及び投与経路で、又は前回用いた用量の１〜９９％で用いる。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の好適な用量は（単独で用いる場合、又は化学療法剤などの他の作用剤と組み合わせて用いる場合）、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量である。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体の用量の例は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。初期のより高い負荷投与量の後、一以上のより低い用量を投与してもよい。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の治療に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器の又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、それのみによって又は他の組成物と組み合わせて症状を治療、予防及び／又は診断するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる）。組成物中の少なくとも１個の活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択した症状、例えば癌の治療に使用されることを示す。また、製造品は、（ａ）組成物を中に収容し、その組成物が本発明の抗体を含む第一の容器と；（ｂ）組成物を中に収容し、その組成物が更なる細胞傷害性薬物を含む第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における該製造品は、第一及び第二の抗体組成物が癌の治療に使用できることを示しているパッケージ挿入物を更に含みうる。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の（又は第三の）容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
以下の実施例は、本発明の実施を例証することだけを意図しており、限定を意図するものではない。ここで引用した全ての特許と科学文献を、その全体について出典明示によりここに援用する。
材料と方法
細菌株と培地
本研究で使用する株とプラスミドを表１に記載する。振等フラスコ培養について、特に記載のない限り、全ての株をルリア−ベルタ−二（ＬＢ）又はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐリン酸制限培地（１）中で３０又は３７℃で培養した。発酵培地は原則的に引用文献１に記載の通りである。抗生物質は、以下の濃度：５０μｇ／ｍＬカルベニシリン、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、１２．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、又は２０μｇ／ｍＬテトラサイクイリンで添加した。
相対ＴＩＲライブラリーの構築と評価
熱耐性エンテロトキシンＩＩ（ｓｔＩＩ）、マルトース結合ペリプラズムタンパク質（ｍａｌＥ）、アルカリフォスファターゼ（ｐｈｏＡ）、又はチオール：ジスルフィド交換タンパク質（ｄｓｂＡ）シグナルペプチドをＰＣＲ増幅し、開始コドンの９塩基対（ｂｐｓ）上流のＢｓｓＨＩＩ、ＭｌｕＩ、又はＸｂａＩ制限サイトを伴う親遺伝子の開始後の最初の６アミノ酸中のワブル塩基サイレントコドン変異（２）を導入した縮重プライマーを用いてｐｈｏＡの成熟ドメインに融合した（表２を参照されたい）。各シグナル配列の野生型コドンをコードするＤＮＡをまた得た。これらのインサートは、次いで、ｐＰｈｏ４１（３）プラスミドのＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ（New England Biolabs）に通常通りクローニングし、コンピテントＪＭ１０９細胞（プロメガ）に形質転換し、１時間かけて回収し、１６時間３７℃でカベニシリンと共に２００ｍＬのＬＢ中で継代培養し、次いでマキシプレップした（キアゲン）。各ライブラリーから回収した細胞のアリコートを、ライブラリーサイズを決定するために選択ＬＢアガープレート上に播いた；全てのライブラリーは理論的なライブラリーのサイズの約１０から１００倍の範囲を生成した。精製したＤＮＡを次いでコンピテントの２７Ｃ７細胞に形質転換し、次いで以前に記載した通りそれらの基底ＰｈｏＡ活性を試験した。簡潔には、コロニーを選択ＬＢ中で３０℃で１６時間培養し、新鮮な培地で１：１００に希釈し、更に４時間３０℃で培養した。培養を次いで光学密度（ＯＤ５５０）に基づいて規格化し、絶対ＡＰ培地で再懸濁し（３）、次いで−２０℃で終夜保存した。細胞を次いで融解し、トルエン（シグマ）処理（５）により部分的に透過し、３７℃で１時間通気した。各培養の４０マイクロリットルを次いで１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）中の１ｍＭの４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物（ＰＮＰＰ；プロメガ）を含む溶液に添加した。反応を１００μＬのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）を添加して停止し、４１０ｎｍ（Ａ４１０）の吸光度を２０分以内に読んだ。相対ＴＩＲ強度を最初にサンプルのＡ４１０から空ベクター（ｐＢＲ３２２）を含む培養からのバックグラウンドの吸収を引き、次いでｐＰｈｏ４１プラスミドを有する培養からの校正した吸収によって割ることにより計算した。全ての報告されたＴＩＲ値は、少なくとも７回の反復実験の結果である。
抗体発現ベクターの構築
シグナルペプチドを通常通り、前述した２シストロン系（１）にクローニングした。重鎖シグナルペプチドは、関心のあるシグナルペプチドをスプライシングオーバーラップ伸長（ＳＯＥ）ＰＣＲを介して関心のある重鎖に融合し、ＢｓｓＨＩＩ／ＨｐａＩ（New England Biolabs）サイトにクローニングした。軽鎖シグナルペプチド誘導体はＳＯＥ−ＰＣＲを用いて同様に作製され、個々のＴＩＲ誘導体ヌクレオチド配列（表２）によって特定される通り、ＭｌｕＩ／ＰａｃＩ（New England Biolabs）又はＸｂａＩ／ＰａｃＩ（New England Biolabs）サイトにクローニングされた。全てのコンストラクト配列は、ＳＲＳ解析（ジェネンテック社）によって確認された。
小スケール誘導と解析
細胞を５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を追加した選択ＬＢ５ｍＬ中、３０℃で１６時間培養した。細胞の５００μＬのアリコートを次いで２５ｍＬの選択Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．リン酸限定培地の２５ｍＬ中で播種するために用い、２４時間３０℃で培養した。特に記載が無い限り、プラスミドｐＪＪ２４７を有する細胞をイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導し、細胞がＯＤ６００が約２００に達した際、最終濃度を１．０ｍＭとした。全ブロスサンプルを終点で回収し、溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ６．８、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（シグマ）、５ｍＭのヨード酢酸（シグマ））中でＯＤ６００が約３．０まで希釈し、氷上で１０分間インキュベートした。サンプルを超音波にかけ、遠心して細胞のデブリスを除き、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析（１０％ビスＴｒｉｓ、インビトロジェン）を用いて解析した。全てのレーンにサンプルを同体積搭載し、１：２００，０００希釈のヒト抗Ｆｃ（Southern Biotech）抗体又は１：２００，０００希釈のマウス抗κＬｃ（Southern Biotech）抗体を用いて調べた。全ての抗体はＨＲＰコンジュゲートであり、イムノブロットは、Western Lightning-ECL（パーキンエルマー）を用いて可視化され、膜をBiomax XARフィルム（コダック）に曝露した。タンパク質サンプルをまたクマシーブルー染色次いで標準の技術によって解析した。
大スケール誘導
発酵は前述の通り実施した（１）。簡潔には、５ｍＬの選択ＬＢ培養からの５０μＬの凍結保存した細胞を用いて５００ｍＬの選択ＬＢに播種し、３０℃で１６時間培養した。１０Ｌの発酵を次いで播種し（原則的には引用文献１に記載の通り）、細胞をコンピュータベースのアルゴリズムを用いて、発酵要求に基づき濃縮グルコースを与え、高密度まで培養した。特に記載の無い限り、プラスミドｐＪＪ２４７を有する細胞をイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導し、細胞がＯＤ５５０が約２００に達する際に最終濃度を１．０Ｍとした。全てのブロスと規格化したＯＤ５５０サンプルを一定の間隔で採り、全ての発酵を、２から３日間後に停止した。培養の適合性を通常通りオンラインとオフラインの測定パラメーターを用いて観察した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を用いて上記の通り解析した。
サンプルのＨＰＬＣ解析
小又は大スケール誘導実験から得たサンプルを以前に開発した逆相ＨＰＬＣ解析技術（Lisa Wong、私信）を用いて全（不溶及び可溶）重鎖又は軽鎖濃度を解析した。サンプルを二重カラム、プロテイン−Ｌ逆相ベースＨＰＬＣアッセイ（Analytical Operations、ジェネンテック社）によって抗体種を含む軽鎖を解析した。抗体力価をクロマトグラムのピーク面積を関心のある分子の既知量を用いたブランクサンプルのスパイクにより得た標準曲線と比較することにより得た。
表１：本研究で用いた株とプラスミド
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Ｈｃ＝重鎖
Ｌｃ＝軽鎖
５Ｄ５＝抗ｃ−ｍｅｔモノクローナル抗体クローン５Ｄ５．ｖ２。５Ｄ５．ｖ２重鎖と軽鎖配列を図７に示し、例えば、国際公開第２００６／０１５３７１号；Jin等、Cancer Res (2008) 68:4360にも記載する。
表２：シグナル配列誘導体
太斜体＝変異した配列（即ち、開始コドン後の最初の６個のアミノ酸）
斜体＝ＢｓｓＨＩＩ、ＭｌｕＩ、又はＸｂａＩ制限サイト
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説明文：クローン命名規則は以下の通りである：ＸＹ．＃＝Ｘはシグナル配列を指す（Ｓ＝ＳＴＩＩ、Ｐ＝ＰｈｏＡ等）；Ｙは制限配列（ＨはＢｓｓｈ１１制限サイトを意味し、ＸはＸｂａＩサイトを指し、ＬはＭｌｕＩ制限サイトを指す）を指し、＃はＴＩＲ強度（例えば、１＝１のＴＩＲ、７．７２＝７．７２のＴＩＲ）を指す。ｗｔ＝野生型ＴＩＲ配列。
表３：終点発酵力価
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＊ＳＴＩＩ（１）／ＳＴＩＩ（１）サンプルの価数まで規格化された全てのサンプル、シャペロンＤｓｂＡ及びＤｓｂＣの非存在下で発現する全長抗体を含んでいた。
結果／考察
我々は大腸菌中の内膜透過輸送の２つの主要な分泌経路を代表するシグナルペプチドの新規な変異翻訳開始領域（ＴＩＲ）シグナルペプチドライブラリー（図２、表２）を開発した：ｓｅｃ（ＰｈｏＡ、ＭａｌＥ）及びＳＲＰ（ＤｓｂＡ、ＳＴＩＩ）。各ライブラリーは、それにより関心のある所与のタンパク質の翻訳レベルを即時調節する手段を供給する、異なる翻訳強度の変異ＴＩＲを有するベクターのパネルを含む。マルトース結合ペリプラズムタンパク質（ＭａｌＥ）及びアルカリフォスファターゼ（ＰｈｏＡ）シグナルペプチドは、分子モーターＳｅｃＡを用いた翻訳後様式で細胞質からペリプラズムへの転座を指示する。熱耐性エンテロトキシンＩＩ（ｓｔＩＩ）及びチオール：ジスルフィド交換タンパク質は、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）を用いて共翻訳の様式で転座を指示する（図１）。
ライブラリーの構築の間、ＢｓｓＨＩＩ、ＭｌｕＩ、又はＸｂａＩ制限サイトは、親遺伝子の開始コドンの９塩基対（ｂｐｓ）上流に挿入された。存在する制限サイトの型に依存して、異なる範囲のＴＩＲ強度が観察された（図２）。概して、ＢｓｓＨＩＩサイト上流は、ＭｌｕＩサイトを有する配列は、適度のＴＩＲ強度（約１から８）であり、ＸｂａＩサイトは最高の範囲（約１から１１）であるのに対し、ＭｌｕＩサイトを有する配列は最小のＴＩＲ強度（約１から３）の範囲を示した。最高のＴＩＲ変異体は、調べたシグナルペプチド／制限サイトの組み合わせの任意について存在し得ることを除外できない一方で、これらの結果は、調べた各シグナルペプチドライブラリーの平均ＴＩＲ強度の代表的なものであろう。
翻訳レベルと分泌におけるシグナルペプチドの効果を示すために一連のプラスミドを構築した。それぞれの場合、関心のある遺伝子をｐｈｏＡプロモーター、ｔｒｐ Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｎｏ及び異なる相対ＴＩＲ強度を有するシグナル配列の下流に挿入した。振とうフラスコスケールでのｐｈｏＡプロモーターの形質転換と誘導の後に、異種タンパク質を発現する全細胞の溶解物、抗ｃ−ｍｅｔ抗体クローン５Ｄ５．ｖ２をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。これらの実験において、各重鎖又は軽鎖ＴＩＲを、それぞれ対応する軽鎖又は重鎖と変えるか、不変のまま維持した。
図３は重鎖シグナルペプチド操作の結果を示す。α−Ｆｃ特異抗体を用いて調べた際、他のシグナルペプチド変異体（図３Ａ、一番上のブロット）よりも、ｓｓＤｓｂＡ重鎖ＴＩＲ一変異体は、全長抗体（ＦＬ−Ａｂ）、並びに重鎖（ＨＬ）二量体及び重−重−軽（ＨＨＬ）種の明確な増加を示した。これらのサンプルの全重鎖の試験により、調べた全てのシグナルペプチド間で比較的類似のレベルであることが明らかとなった（図３Ａ、一番下のブロット）。軽鎖をα−κＬｃ抗体で可視化した際、ｓｓＤｓｂＡ重鎖ＴＩＲ一変異体を用いて、類似の結果が得られ、再度最高のＦＬ−Ａｂレベルを示した（図３Ｂ、一番上のブロット）。驚くべきことには、ＤｓｂＡ ＴＩＲ一重鎖融合サンプルは、他のサンプルで観察されるより小さな種−予想される軽−軽（ＬＬ）二量体及び遊離軽鎖を欠いていた。概して、翻訳後シグナル（ＭａｌＥ、ＰｈｏＡ）が重鎖に融合している場合、共翻訳（ＳＴＩＩ、ＤｓｂＡ）シグナルペプチド融合（図３Ｂ、一番下のブロット）の場合よりも全軽鎖の発現が多いようである。概して、以下の階層が重鎖と融合したシグナルペプチドと全長抗体産生に関して観察された：ＤｓｂＡ＞ＳＴＩＩ＞ＭａｌＥ＞ＰｈｏＡ。注目すべきことには、ＤｓｂＡ変異ＴＩＲは、相対ＴＩＲ強度が変化しなかった場合でも（すなわち、双方のＴＩＲが強度１であった）、ＳＴＩＩ変異ＴＩＲと比較して（例えば、全長抗体の）発現が増加していた。
図４は軽鎖シグナルペプチド操作の結果を示す。ＳＴＩＩ ＴＩＲ一変異からＰｈｏＡ ＴＩＲ一又は二変異への軽鎖シグナルペプチドの変更によりＦＬ−Ａｂ力価の注目に値する増加が得られた（図４、一番上のブロット）。軽鎖に融合したシグナルペプチドの改変は、発現する重鎖の全量に影響を与えなかったようであるが（図４、中段のブロット）、存在する軽鎖の総量を著しく変え、軽鎖に融合した２つのＳＴＩＩ又はＤｓｂＡ ＴＩＲ変異を伴うサンプル中に出現した、処理した軽鎖が最も蓄積していた（図４、一番下のブロット）。翻訳後シグナルペプチドに融合した場合、２つのバンドが全軽鎖サンプル中で観察され、未処理の軽鎖を示した。概して、以下の階層が軽鎖に融合したシグナルペプチドと全長抗体産生に関して観察された：ＰｈｏＡ≧ＭａｌＥ＞ＳＴＩＩ＞ＤｓｂＡ。
１０Ｌ発酵から時間をかけた抗体種の会合の観察は、図３及び４に示す振とうフラスコの実験と類似の結果を示した。ＦＬ−Ａｂの最大量が、重鎖に融合したＤｓｂＡ由来のＴＩＲ変異及び軽鎖に融合したＤｓｂＡ又はＰｈｏＡ由来のシグナルペプチドを有するサンプルで観察された（図５、一番上のブロット）。これらのサンプルはまたＳＴＩＩ ＴＩＲ一重鎖融合より多いＨＨＬ及びＨＬ二量体種を示した。更に、ＬＬ二量体と遊離軽鎖は、軽差に融合したＰｈｏＡ ＴＩＲ一シグナルペプチドを伴うサンプル中で即時可視化された。減少した総タンパクサンプルの試験は、発酵の発現誘導条件下のＳＴＩＩ融合体よりも多い総重鎖を得た（図５、中段のブロット）。軽鎖ペプチド融合体と類似して、ＳＴＩＩ ＴＩＲ一よりもＤｓｂＡ ＴＩＲ一シグナルペプチド融合体において、軽鎖のより大きな蓄積が観察された（図５、一番下のブロット）。しかし、軽鎖の最大の蓄積はＰｈｏＡ ＴＩＲ一シグナルペプチド融合体において観察された。振とうフラスコから得た総軽鎖サンプルにおいて観察される２つのバンドは、発酵サンプルにおいて唯一のバンドとして出現し、１０Ｌ発酵においてより効率的に処理される軽鎖を示す。
ＳＴＩＩ又はＤｓｂＡ由来のＴＩＲ変異を融合し、誘導条件で振とうフラスコ培養中で発現させた際の軽鎖又は重鎖発現レベルの際を更に調べるために、我々は異なるシグナルペプチドを大腸菌ｐｈｏＡ遺伝子（ｍＰｈｏＡ）の成熟ドメインに融合した（図６）。タンパク質発現が誘導された際、ｍＰｈｏＡの発現は、７のＴＩＲ強度（本研究で使用される最大のＴＩＲ強度）まで、ＤｓｂＡシグナルペプチド融合体の増加したＴＩＲ強度と同時増加を示した。６又は８のＴＩＲ強度に達するまで、ＴＩＲ強度増加を伴うｍＰｈｏＡ発現の類似増加がＳＴＩＩシグナルペプチド融合体について観察され、これによりＳＴＩＩ ＴＩＲ三サンプルに存在するｍＰｈｏＡと比較してｍＰｈｏＡの量が減少しているようである。驚くべきことには、ＳＴＩＩ強度１ＴＩＲを用いた場合よりも多くの重鎖及び軽鎖がＤｓｂＡ強度１ＴＩＲを用いて産生され、ＰｈｏＡのＳＴＩＩ駆動転座は、ＰｈｏＡのＤｂａ駆動転座よりも低い総タンパク濃度で最大量に達した。また、ＳＴＩＩからＤｓｂＡへのＴＩＲ配列の変化は、ＴＩＲ効果のダイナミックレンジを増加した。
１０Ｌ発酵のサンプルは、タンパク−Ｌ−ベースＨＰＬＣアッセイを用いた抗体価を解析した（表３）。ＨＰＬＣデータはウェスタンブロット解析によって定性的な力価レベルとよく一致した（図３、４）。重鎖シグナル配列をＳＴＩＩ由来ＴＩＲ変異からＤｓｂ由来ＴＩＲ変異した場合、ＦＬ−Ａｂ力価は約４０から９０％まで増加した。ＤｓｂＡ一重鎖融合体が、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、又はＰｈｏＡ ＴＩＲ一シグナルペプチドと融合した軽鎖と対になった場合、最大の力価は得られる。最大の力価は軽鎖がＭａｌＥ又はＰｈｏＡ ＴＩＲシグナルペプチドと融合した場合に得られる。
対照的に、各々７０％及び６０％の下落を示すＰｈｏＡ ＴＩＲ一及びＭａｌＥ ＴＩＲ一シグナルペプチド融合体を伴い、翻訳後シグナルペプチドが重鎖に融合した場合、ＦＬ−Ａｂ力価は下落した。我々は、共翻訳シグナル（例えば、ＤｓｂＡ）を翻訳を駆動するために使用した場合に、重鎖発現が最適化されると結論付けた。
我々はシャペロン過剰発現の効果を試験した。シャペロンＤｓｂＡとＤｓｂＣ（ここで場合によりＤｓｂＡ／Ｃと呼ぶ）の過剰発現は、重鎖に融合したＤｓｂＡシグナルペプチド及び軽鎖に融合したＤｓｂＡ、ＰｈｏＡ、又はＭａｌＥシグナルの利益を増加した。重鎖及び軽鎖（ＳＳ１．１ ＋ シャペロン）に融合したＳＴＩＩ ＴＩＲ一シグナルによってＦＬ−Ａｂの発現を比較した場合、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡ、又はＤｓｂＡ ＴＩＲ一軽鎖融合体と一体になったＤｓｂＡ ＴＩＲ一重鎖融合体において、ＦＬ−ＡＢ力価における約２から２．５倍の増加が観察された。
我々は抗体の軽里重鎖に融合したシグナルペプチドと最終的な抗体力価の関係を調べた。完全会合抗体（ＦＬ−Ａｂ）力価は、共翻訳（例えば、ＤｓｂＡ又はＳＴＩＩ）シグナルペプチドが重鎖のＮ末端に融合した場合に最高となり、ＤｓｂＡ由来ＴＩＲ変異が最大の観察されたＦＬ−Ａｂ収量の結果となった。このように、ＤｓｂＡ ＴＩＲ変異は誘導条件下においてＳＴＩＩ ＴＩＲ変異よりも高いパッセンジャータンパク質の翻訳レベルを可能にし得、これにより、処理したパッセンジャータンパク質のより高い発現レベルの結果となった。対照的に、翻訳後シグナルペプチド（即ち、ＭａｌＥ又はＰｈｏＡ）が重鎖に融合した場合に、抗体力価が劇的に下落した。この効果は、タンパク質分解を原因とし得るか又は重鎖によって続く異なるフォールディング経路を原因とし得る（６）。重鎖に融合したＰｈｏＡ又はＭａｌＥ ＴＩＲ一シグナルペプチドを発現するサンプルからの総重鎖レベルの試験は、潜在的には処理されない重鎖の存在によって、見かけ上の重量のわずかなシフトを示した（図３Ａ、一番下のブロット）。
軽鎖への翻訳後シグナルペプチドＭａｌＥ由来又はＰｈｏＡ由来ＴＩＲ変異体の融合は、１０Ｌ発酵の間のＳＴＩＩ媒介転座を超える、処理した軽鎖の大きな蓄積及び抗体力価の増加の結果となった（図５、一番下のブロット）。軽鎖並びにＦＬ−ＡＢの収量の増加は、ＳＴＩＩ ＴＩＲ変異体による軽鎖転座と比較して、ＤｓｂＡ ＴＩＲ変異体によって軽差が転座する場合にまた観察された。しかし、ＤｓｂＡ ＴＩＲ一変異体から発現される全軽鎖の量は、ＰｈｏＡ又はＭａｌＥ ＴＩＲ一変異体から発現されるものより大きくなかった。興味深いことには、１０Ｌの発酵から時間をかけて得たサンプルの解析は、ＭａｌＥ、ＤｓｂＡ、又はＰｈｏＡ ＴＩＲ変異体に融合した軽鎖を用いた試行からのＦＬ−Ａｂ力価は、ＳＴＩＩ ＴＩＲ変異への融合体がより低い最大力価に達するだけでなく、より早い時間点でその力価レベルに達成する一方で、時間をかけて上昇し続けた。このように、重鎖が最大発現のために共翻訳を必要とする一方で、共又は翻訳後様式で、効率的に転座し得ることを示唆する。
一アーム抗ｃ−ｍｅｔ抗体：我々は一アーム抗体の軽鎖、重鎖及びＦｃに融合したシグナルペプチドと最終抗体力価の間の関係を評価した。プラスミドは、軽鎖、重鎖、及びＦｃポリペプチドについて１のＴＩＲを有するＳＴＩＩを用いて、軽鎖について１のＴＩＲ（配列番号：２９）を有するＰｈｏＡシグナル配列を、重鎖とＦｃ断片について１のＴＩＲ（配列番号：４０）を有するＤｓｂシグナル配列を用いて；軽鎖とＦｃ断片について１のＴＩＲを有するＰｈｏシグナルを、ＨＣについて１のＴＩＲを有するＤｓｂＡシグナル配列を用いて構築した。相対力価番号は試行サンプルの終点から得られ、上述のタンパク質Ｌ逆相ＨＰＬＣアッセイで測定された。相対力価値は、ＤｓｂＡ／Ｃの共発現なしで、表４−ＳＴＩＩシグナル配列及びＬＣ、ＨＣ、及びＦＣについてＴＩＲ＝１の第一列の場合の力価まで規格化した。
結果を表４に示す。一アーム抗体関連力価は、共翻訳（例えば、ＤｓｂＡ）シグナルペプチドが重鎖のＮ末端に融合した場合、翻訳後（例えば、ＰｈｏＡ）シグナルペプチドが軽鎖のＮ末端に融合した場合、及び翻訳後（例えば、ＰｈｏＡ）シグナルペプチドがＦｃ領域に融合した場合、及び発現がＤｓｂＡ／Ｃの存在下の場合、最高であった。概して、軽鎖、重鎖及びＦｃ断片に融合したシグナルに関し、以下の階層が観察された。Ｐ．Ｄ．Ｄ＞Ｐ．Ｄ．Ｐ＞Ｓ．Ｓ．Ｓ。ＤｓｂＡ／Ｃの非存在下の発現レベルは、全ての試験したサンプルで類似であり、ペリプラズムに分泌された抗体の殆どが凝集していた。ジスルフィド結合シャペロンの共発現は、フォールドした抗体の産生を増加させ、従って、ＴＩＲ最適化によって認識される抗体発現の増加を明らかにした。
表４：一価一アーム抗ｃ−ｍｅｔ抗体ＭｅｔＭＡｂ
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略号：Ｄ＝シグナル配列ＤｓｂＡ Ｐ＝シグナル配列ＰｈｏＡ。ＸＸＸ＃．＃．＃（例えば、ＰＤＰ．１１１）は、実験で使用される軽鎖シグナル配列、重鎖シグナル配列、Ｆｃシグナル配列、軽鎖ＴＩＲ、重鎖ＴＩＲ、ＦｃＴＩＲ。
概して、本技術は、ＴＩＲ変異体の新規配列からの選択を介した軽鎖及び重鎖発現の操作を介し、更に軽鎖の共翻訳又は翻訳後シグナル配列及び重鎖の共翻訳シグナル配列の使用による、例えば、大腸菌における折りたたまれた抗体の収率を増加させるための新規の方法を提供する。重鎖、軽鎖及びＦｃ領域を含む一アーム抗体の改善された発現はまたここに開示した新規のＴＩＲ変異体を用いるか、更に軽鎖の共翻訳又は翻訳後シグナル配列、重鎖の共翻訳配列、及び得られたＦｃポリペプチドの共翻訳又は翻訳後シグナル配列の使用によって達成された。この方法の効用は、全体として、広範囲の抗体（例えば、ｋｎｏｂ及びホール変異を含む二重特異的抗体）、抗体誘導体、及び細菌ベースの組換えタンパク質産生に広く適用できるであろう。
一部の参考文献リスト
1. Simmons, L. C., Reilly, D., Klimowski, L., Raju, T. S., Meng, G., Sims, P., Hong, K., Shields, R. L., Damico, L. A., Rancatore, P., and Yansura, D. G. (2002) Journal of immunological methods 263(1-2), 133-147
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上記では特定の実施態様に言及したが、本発明はそのようには限定されないことは理解されるであろう。当業者であれば、本発明の全体の概念を変えることなく開示された実施態様に様々な変更をなすことができるであろう。そのような変更は全て本発明の範囲内であることを意図する。

Claims (70)

  1. 抗体の製造方法であって、前記方法が、（１）ＴＩＲがＤｓｂＡ共翻訳原核生物分泌シグナル配列を含む、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される第一の翻訳開始領域（ＴＩＲ）；及び、（２）第二のＴＩＲが共翻訳又は翻訳後原核生物分泌シグナル配列を含む、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される第二のＴＩＲを含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞の培養を含み、これによって、宿主細胞中の発現において、重鎖と軽鎖が分泌され、分泌された重鎖と軽鎖が生物学的に活性な抗体を形成するように折りたたまれ集合する方法。
  2. 第一の翻訳開始領域が配列番号３６から４２の一つの配列を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 第二の翻訳開始領域がＳＴＩＩ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ又はＰｈｏＡシグナル配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 第二の翻訳開始領域がＰｈｏＡ又はＭａｌＥシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 第二の翻訳開始領域が配列番号１から４２の一つの配列を含む、請求項３に記載の方法。
  6. 宿主細胞が更に（３）Ｆｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される第三の翻訳開始領域を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
  7. 第三の翻訳開始領域がＳＴＩＩ、ＰｈоＡ、ＭａｌＥ又はＤｓｂＡシグナル配列を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 第三の翻訳開始領域がＰｈоＡ又はＤｓｂＡシグナル配列を含む、請求項６に記載の方法。
  9. 第三の翻訳開始領域が配列番号１から４２の一つの配列を含む、請求項６に記載の方法。
  10. 第三の翻訳開始領域が配列番号２３、２４、２６から３９、４１及び４２の一つの配列を含む、請求項６に記載の方法。
  11. 第一と第二の翻訳開始領域がほぼ同じ翻訳強度を示す、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
  12. 相対翻訳強度が約１又は２である、請求項１１に記載の方法。
  13. 第一、第二及び第三の翻訳開始領域がほぼ同じ翻訳強度を示す、請求項６から１０の何れか一項に記載の方法。
  14. 相対翻訳強度が約１又は２である、請求項１３に記載の方法。
  15. 宿主細胞中のポリヌクレオチドが更にプロモーターを含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の方法。
  16. プロモーターがｐｈｏＡ、ｔａｃ、ｌｐｐ、ｌａｃ−ｌｐｐ、ｌａｃ、ａｒａ、及びＴ７プロモーターからなる群から選択される原核生物プロモーターである、請求項１５に記載の方法。
  17. 宿主細胞が原核細胞である、請求項１から１６の何れか一項に記載の方法。
  18. 原核細胞が大腸菌である、請求項１７に記載の方法。
  19. 大腸菌が内在性プロテアーゼ活性の欠損株である、請求項１８に記載の方法。
  20. 大腸菌の遺伝子型が、ｄｅｇＰ及びｐｒｃ遺伝子を欠損し、変異ｓｐｒ遺伝子を有する、請求項１８又は１９に記載の方法。
  21. 宿主細胞がＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＧ及びＦｋｐＡからなる群から選択される原核生物ポリペプチドの少なくとも一つをコードするポリヌクレオチドを更に含む、請求項１から２０の何れか一項に記載の方法。
  22. ポリヌクレオチドがＤｓｂＡとＤｓｂＣの双方をコードする、請求項２１に記載の方法。
  23. 宿主細胞が抗体を共同でコードする一又は複数のポリヌクレオチドを含む、請求項１から２２の何れか一項に記載の方法。
  24. 方法が宿主細胞培養物から抗体を回収することを更に含む、請求項１から２３の何れか一項に記載の方法。
  25. 抗体が宿主細胞培養培地から回収される、請求項２４に記載の方法。
  26. 方法が回収された抗体と薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は抗体を含む薬学的製剤を調製するための担体とを混合することを更に含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
  27. 形成されるイムノグロブリンポリペプチド複合体の少なくとも５０％が抗体である、請求項２４又は２５に記載の方法。
  28. 形成されるイムノグロブリンポリペプチド複合体の少なくとも７０％が抗体である、請求項２７に記載の方法。
  29. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から２８の何れか一項に記載の方法。
  30. 抗体がキメラ抗体、親和性成熟抗体、二重特異的抗体、ヒト化抗体、抗体断片又はヒト抗体である、請求項２９に記載の方法。
  31. 抗体断片が、一アーム抗体である、請求項３０に記載の方法。
  32. 抗体がｃ−ｍｅｔに結合する、請求項３１に記載の方法。
  33. 抗体が二重特異的抗体である、請求項２９に記載の方法。
  34. （１）ＤｓｂＡ共翻訳原核生物分泌シグナル配列を含み、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される第一のＴＩＲ；及び（２）共翻訳又は翻訳後原核生物分泌シグナル配列を含み、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される第二のＴＩＲを含み、これによって、宿主細胞中の発現において、重鎖と軽鎖が分泌され、分泌された重鎖と軽鎖が折りたたまれ、集合して生物学的に活性な抗体を形成する、ポリヌクレオチド。
  35. 第一の翻訳開始領域（ＴＩＲ）が配列番号３６から４２の一つの配列を含む、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
  36. 第二の翻訳開始領域（ＴＩＲ）がＳＴＩＩ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ又はＰｈｏＡシグナル配列を含む、請求項３４又は３５に記載のポリヌクレオチド。
  37. 第二の翻訳開始領域（ＴＩＲ）がＰｈоＡ又はＭａｌＥシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
  38. 第二の翻訳開始領域（ＴＩＲ）が配列番号１から４２の一つの配列を含む、請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
  39. 第二のＴＩＲが配列番号１、２、８、９、１１、１３、２９、３６、３７及び４０の一つの配列を含む、請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
  40. 前記宿主細胞が、（３）Ｆｃポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に連結される第三のＴＩＲを更に含む、請求項３４から３９の何れか一項に記載のポリヌクレオチド。
  41. 前記第三の翻訳開始領域（ＴＩＲ）がＳＴＩＩ、ＰｈоＡ、ＭａｌＥ又はＤｓｂＡシグナル配列を含む、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
  42. 前記第三の翻訳開始領域（ＴＩＲ）がＰｈоＡ又はＤｓｂＡシグナル配列を含む、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
  43. 前記第三の翻訳開始領域（ＴＩＲ）が配列番号１から４２の一つの配列を含む、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
  44. 前記第一及び第二の翻訳開始領域（ＴＩＲ）がほぼ同じ翻訳強度を示す、請求項３４から４３の何れか一項に記載のポリヌクレオチド。
  45. 相対翻訳強度が約１又は２である、請求項４４に記載のポリヌクレオチド。
  46. 前記第一、第二及び第三の翻訳開始領域がほぼ同じ翻訳強度を示す、請求項４０から４３の何れか一項に記載のポリヌクレオチド。
  47. 相対翻訳強度が約１又は２である、請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  48. 前記宿主細胞中のポリヌクレオチドがプロモーターを更に含む、請求項３４から４７の何れか一項に記載のポリヌクレオチド。
  49. プロモーターが、ｐｈｏＡ、ｔａｃ、ｌｐｐ、ｌａｃ−ｌｐｐ、ｌａｃ、ａｒａ、及びＴ７プロモーターからなる群から選択される原核生物プロモーターである、請求項４８に記載のポリヌクレオチド。
  50. 前記宿主細胞が原核細胞である、請求項３４から４９の何れか一項に記載のポリヌクレオチド。
  51. 前記原核細胞が大腸菌である、請求項５０に記載のポリヌクレオチド。
  52. 前記大腸菌が内在性プロテアーゼ活性の欠損株である、請求項５１に記載のポリヌクレオチド。
  53. 前記大腸菌の遺伝子型がｄｅｇＰ及びｐｒｃ遺伝子を欠損し、変異ｓｐｒ遺伝子を有する、請求項５１又は５２に記載のポリヌクレオチド。
  54. 宿主細胞がＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＧ及びＦｋｐＡからなる群から選択される原核生物ポリペプチドの少なくとも一つをコードするポリヌクレオチドを更に含む、請求項３４から５３の何れか一項に記載のポリヌクレオチド。
  55. 前記ポリヌクレオチドがＤｓｂＡとＤｓｂＣの双方をコードする、請求項５４に記載のポリヌクレオチド。
  56. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項３４から５５の何れか一項に記載のポリヌクレオチド。
  57. 抗体がキメラ抗体、親和性成熟抗体、二重特異的抗体、ヒト化抗体、抗体断片又はヒト抗体である、請求項３４から５５の何れか一項に記載のポリヌクレオチド。
  58. 抗体断片が一アーム抗体である、請求項５７に記載のポリヌクレオチド。
  59. 抗体がｃ−ｍｅｔに結合する、請求項５８に記載のポリヌクレオチド。
  60. 抗体が二重特異的抗体である、請求項５７に記載のポリヌクレオチド。
  61. 抗体重鎖が一又は複数の変異Ｔ３６６Ａ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び／又はＴ３６６Ｗを含む、請求項５８又は６０に記載のポリヌクレオチド。
  62. Ｆｃポリペプチドが一又は複数の変異Ｔ３６６Ａ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び／又はＴ３６６Ｗを含む、請求項５８に記載のポリヌクレオチド。
  63. 請求項１から３３の何れか一項に記載の抗体の製造方法を含む、抗体を含む医薬を製造するための方法。
  64. 請求項３４から６２の何れか一項に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  65. 前記宿主細胞が原核細胞である、請求項６４に記載の宿主細胞。
  66. 前記原核細胞が大腸菌である、請求項６５に記載の宿主細胞。
  67. 前記大腸菌が内在性プロテアーゼ活性の欠損株である、請求項６６に記載の宿主細胞。
  68. 前記大腸菌の遺伝子型がｄｅｇＰ及びｐｒｃ遺伝子を欠損し、変異ｓｐｒ遺伝子を有する、請求項６６又は６７に記載の宿主細胞。
  69. 前記宿主細胞が原核生物シャペロンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを更に含む、請求項６４から６８の何れか一項に記載の宿主細胞。
  70. 前記原核生物シャペロンタンパク質がＤｓｂＡ及び／又はＤｓｂＣである、請求項６９に記載の宿主細胞。
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