JP7058431B2 - 巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤 - Google Patents
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Description
そこで、iPS細胞を含む多能性幹細胞から分化誘導される血小板を用いて調製された凍結乾燥製剤が、自己血漿由来のPRPおよび凍結乾燥PRPと同様、副作用や有害事象無く、所望の効果、例えば骨癒合促進効果を有するか否かが問題である。
<凍結乾燥製剤>
[1]
巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤。
[2]
巨核球および血小板が、インビトロで幹細胞から分化誘導される、[1]記載の凍結乾燥製剤。
[3]
幹細胞が多能性幹細胞または造血幹細胞である、[1]または[2]記載の凍結乾燥製剤。
[4]
多能性幹細胞がiPS細胞である、[2]または[3]記載の凍結乾燥製剤。
[5]
巨核球および/または血小板から放出される成長因子をさらに含有する、[1]から[4]のいずれか記載の凍結乾燥製剤。
[6]
成長因子が、骨形成タンパク質、血小板由来増殖因子、血小板由来血管形成因子、トランスフォーミング増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来内皮細胞増殖因子、インスリン様成長因子、および血小板因子IVからなる群から選ばれる少なくとも一つの因子である、[5]記載の凍結乾燥製剤。
<医薬組成物>
[7]
[1]から[6]のいずれか記載の凍結乾燥製剤を含む、骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための医薬組成物。
[8]
[1]から[6]のいずれか記載の凍結乾燥製剤を、骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するのに有効な量で含む、[7]記載の医薬組成物。
<医薬用途>
[9]
骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための方法であって、請求項1から6のいずれか記載の凍結乾燥製剤を、そのような処置等を必要としている対象に投与することを含む方法。
[10]
骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための方法であって、請求項1から6のいずれか記載の凍結乾燥製剤を、そのような処置等を必要としている対象に、その有効量を投与することを含む、[9]記載の方法。
[11]
骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための、[1]から[6]のいずれか記載の凍結乾燥製剤。
[12]
骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための医薬を製造するための、[1]から[6]のいずれか記載の凍結乾燥製剤の使用。
<凍結乾燥製剤の調製方法>
[13]
巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤を調製する方法であって、
(A)血小板および巨核球の細胞混合液を調製し、および
(B)血小板および巨核球の細胞混合液を凍結乾燥する、ことを特徴とする方法。
[14]
工程(A)において、巨核球が、幹細胞から分化誘導される不死化巨核球である、[13]記載の方法。
[15]
工程(A)にて調製する細胞混合液を活性化させる、[13]または[14]記載の方法。
本発明はひとつの態様として、巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤に関する。
本発明の凍結乾燥製剤は、組織修復能を有している。同様に、組織修復能を持つ、形成外科、歯科領域および整形外科領域において広くその効果が確認されている血液由来の多血小板血漿(PRP)および/またはそれを凍結乾燥した凍結乾燥PRP製剤が知られている(Kamoda H, et al., J Bone Joint Surg Am. 2013 Jun 19;95(12):1109-16, Shiga, et al. Sci Rep. 2016 Nov 11;6: 36715, , Shiga Y, Asian Spine J. 2017 Jun;11(3):329-336.)。これらPRP製剤には、「巨核球」が実質的に含まれないため、この点、本発明の凍結乾燥製剤とは構成を異にする。詳細には、本発明の凍結乾燥製剤は、従来のPRP製剤と比較し、巨核球を比較的多く含む点で相違している。また、本発明の凍結乾燥製剤は、従来のPRP製剤と比較し、特定の液性因子、例えばBMP2および/またはBMP4の含有量が高い点で、相違し得る。巨核球は生体内では造血幹細胞に由来し、骨髄の中で、巨核球系前駆細胞(CFU-Meg)、巨核芽球、前巨核球を経て巨核球へと成熟するが、細胞***せずに核のみ2Nから64Nまで***するため、大きな多形核を持つ大型細胞へと成熟した結果である。巨核球は骨髄内では一般に洞様血管付近に存在するが、骨髄から出ることは出来ず、末梢血中では観察できない。細胞***を伴わない胞体内核***を起こし多形核を持つ。1個の巨核球から数千個の血小板が作成される。血小板は、血栓の形成や止血に必須の細胞であるため、白血病、骨髄移植、血小板減少症、抗癌治療などにおいて、血小板の需要は極めて高い。
本発明において、多能性幹細胞は、個体は形成しないが、三胚葉(内胚葉、中胚葉、外胚葉)に属する細胞系列すべてに分化し得る能力を有する幹細胞を意味し、血小板に分化できる多能性幹細胞であれば何でもよい。多能性幹細胞の好ましい例としては、ES細胞、iPS細胞、始原生殖細胞に由来する胚性生殖幹細胞(EG細胞)、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、***幹細胞(GS細胞)、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞(Muse細胞)などが挙げられる。ES細胞は体細胞から核初期化されて生じたES細胞であってもよい。多能性幹細胞は、好ましくはES細胞またはiPS細胞である。多能性幹細胞は哺乳動物に由来するものであってもよく、好ましくはヒト由来の多能性幹細胞である。
ES細胞とは、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚に由来する多能性幹細胞である。ES細胞は、哺乳動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848;Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147;H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932; M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559; H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585;Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される(Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725)。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件(0.1%以上、15%以下の酸素濃度)によりiPS細胞を樹立しても良い(Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845)。
上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培地と培地交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ(100cm2)あたり約5 x 103~約5 x 106細胞の範囲である。
本発明は、さらなる態様として、巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤を調製する方法であって、
(A)血小板および巨核球の細胞混合液、具体的には血小板および、インビトロにおいて幹細胞から分化誘導された不死化巨核球の細胞混合液を調製し、好ましくは、得られた細胞混合液を活性化し、および
(B)血小板および巨核球の細胞混合液を凍結乾燥する、ことを特徴とする方法に関する。
(a)血小板と不死化巨核球の細胞混合液の活性化
105細胞/mlオーダーでの不死化巨核球の分化培養で得た培養後6~7日目の血小板と、不死化巨核球の細胞混合液を900rpm(170G)、15分の条件下で遠心分離した後、培養上清を廃棄する。次に、細胞濃度が培養時の10倍となるように、遠心沈渣に対して培養上清の1/10量の滅菌済み0.1%CaCl2 in Tyrode bufferを添加する。これをピペッティングにて、前記血小板と不死化巨核球の細胞混合液を緩くほぐし、そのままインキュベータ中で37℃で1時間反応させ、血小板と巨核球を無菌的に活性化させる。
(b)血小板と不死化巨核球の細胞混合液の凍結乾燥処理
前記活性化された血小板と不死化巨核球の細胞混合液をメンブレンフィルター付きの無菌培養容器に移し、これを凍結乾燥処理用サンプルとする。凍結乾燥処理用サンプルを、まず共晶点以下の-60℃にて、1昼夜以上かけて十分に予備凍結する。次に予め-45℃以下に設定した凍結乾燥機(EYELA FDU-1200)に供し、バキュームポンプによる減圧で1昼夜以上かけて凍結乾燥処理し製剤を作成する。
ア.本発明で使用される巨核球および/または血小板は、ヒト由来のES細胞あるいはiPS細胞を、C3H10T1/2細胞またはOP9細胞などのフィーダー細胞上に播き、例えば、VEGF存在下、14~17日間培養する造血前駆細胞の分化誘導に適した条件で培養して得られる、造血前駆細胞を内包するネット様構造物の産生能力の高いES細胞あるいはiPS細胞クローンを選択し、該ES細胞あるいはiPS細胞クローンが産生するネット様構造物の隔壁を形成する細胞と造血前駆細胞を分離し、得られた造血前駆細胞をフィーダー細胞上に播き、巨核球および/または血小板の分化誘導に適した条件で培養することで、調製することができる(WO2009/122747)。また、巨核球および/または血小板は、ヒト由来のES細胞あるいはiPS細胞を液体培養することで、胚様体の内部に造血前駆細胞を形成させ、該胚様体を、例えば5~7日間、TPOおよびSCFの存在下、さらに培養することで、調製することができる(同上)。
本発明はさらなる別の態様として、本発明の凍結乾燥製剤を含む、医薬組成物に関する。
本発明の凍結乾燥製剤は、血液から調製された多血小板血漿(PRP)やその凍結乾燥製剤と同様に、組織修復能を有している。従って、本発明の医薬組成物は、皮膚科、形成外科、歯科領域、そして整形外科領域において広くその効果が期待され、例えば、皮膚科の難治性皮膚潰瘍や褥瘡(床ずれ)、やけど、糖尿病の患者の壊疽、歯科の歯槽骨や歯肉の再生促進、および骨癒合促進という用途に使用できる。また、本発明の医薬組成物は、軟骨や筋肉の損傷部位に,外科手術の際に患部に、変形性関節症やリウマチ、半月板損傷、上腕骨外側上顆炎の患部に、また、顔や首などの皮膚のしわ改善や発毛促進のために投与することができる。本発明の凍結乾燥製剤は、BMP2および/またはBMP4を豊富に含むので、上述の用途のなかでも、とりわけ骨癒合を促進する用途、または皮膚疾患を処置もしくは予防する用途に好適に用いられる。好ましくは本発明の凍結乾燥製剤を、骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するのに有効な量で含む、本発明の医薬組成物に関する。
本発明における「骨癒合を促進」の「この自然な骨組織の再構成よりも、早期かつ適切に」とは、この治癒過程よりも早期かつ、確実な骨癒合を招来させる態様を意味する。
本発明では、典型的には、骨折患部に移植片として、本発明の医薬組成物または凍結乾燥製剤を投与するステップを含むことができる。特定の実施形態では、本発明は、生分解性ポリマー基材に分散した活性薬剤を含んでいる。生分解性ポリマーは、例えば、ポリ(乳酸-コ-グリコール)酸(PLGA)共重合体、生分解性ポリ(DL-乳酸‐コ‐グリコール酸)フィルム、またはPLLA/PLGAポリマー基質であってもよい。ポリマー中のグリコール酸モノマーの比率は、約25/75、40/60、50/50、60/40、75/25、より好ましくは約50/50重量パーセントである。PLGA共重合体は、生体内分解性移植片の約20、30、40、50、60、70、80~約90重量%であってもよい。PLGA共重合体は、生体内分解性移植片の約30~約50重量%、好ましくは約40重量%であってもよい。本発明の医薬組成物および凍結乾燥製剤は、ポリ乳酸、ポリ(乳酸‐コ‐グリコール酸)、50:50 PDLGA、85:15 PDLGA、およびINION GTR(登録商標)生分解性膜(生体適合性ポリマー混合物)などの生体適合性ポリマーと併せて移植してもよい。Lu,et al.(1998)J Biomater Sci Polym Ed 9:1187-205;およびTomita,et al.(2005)Stem Cells 23:1579-88も参照。
さらに、本発明は別の態様として、骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための本発明の巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤に関する。
本発明はさらなる別の態様として、骨癒合を促進する、または皮膚疾患を処置もしくは予防するための医薬を製造するための、本発明の巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤の使用に関する。
本明細書で使用する場合、用語「対象」または「患者」はヒトおよび非ヒト動物を意味し、非ヒト動物として、霊長類、イヌ、ネコ、小鳥等に代表される愛玩動物、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ウマ、ヒツジおよびウシが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、対象または患者はヒトおよび愛玩動物であり、より好ましくはヒトである。
不死化巨核球の樹立および血小板への分化誘導
Cell Stem Cell. 2014 Apr 3;14(4):535-48にて樹立された不死化巨核球株から血小板を分化誘導した。即ち、購入した胎児繊維芽細胞にセンダイウイルスにて山中4因子を導入して作製したiPS細胞株Sev2を既報(Takayama et al., Blood 111, 5298-5306 (2008);Takayama et al., J Exp Med 207, 2817-30, 2010)に従い、CH3T10T1/2細胞上でVEGF存在下11~14日間培養し、Sac法にて多能性造血前駆細胞を獲得した。この多能性造血前駆細胞に、c-MYCおよびBMI-1をレンチウイルスベクター由来ウイルス(2種類)を用いて感染させた。さらに増殖中の本細胞集団にBCL-xL遺伝子を導入し、1ヶ月以上にわたってCD41a/CD42b発現を維持したまま増殖する細胞集団を獲得した。これを不死化巨核球細胞株(imMKCL)と称する。imMKCL Clone 7を以下の試験に使用した。imMKCL Clone 7を、ドキシサイクリン存在下で(即ち、c-MYC/BMI-1/BCL-xLを発現させた状態で)培養することにより増殖させ、次にドキシサイクリンを除いた培地条件にて(即ち、c-MYC/BMI-1/BCL-xLの発現を停止した状態で)6~7日培養することにより、血小板への分化を誘導した。培養条件はCell Stem Cell. 2014 Apr 3;14(4):535-48に従った。
巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤の調製
実施例1-1:血小板および不死化巨核球の細胞混合液の活性化
2.0 x 105細胞/mlの不死化巨核球細胞株Clone 7 (別名称、Sev2クローン:Nakamura et al., Cell Stem Cell. 2014 Apr 3; 14 (4):535-48; Ito Y, Nakamura S, et al., Cell 174(3): 636-648, 2018)(25 ml x 5、125 ml三角フラスコ)をドキシサイクリン不在下での上記の分化培養方法(Ito Y, Nakamura S, et al., Cell 174(3):636-648, 2018))で得た液体培養後6~7日目の血小板と不死化巨核球の細胞混合液(120 ml)を900rpm(170G)、15分の条件下で遠心分離した後、培養上清を廃棄した。次に細胞濃度が培養時の10倍となるように、遠心沈渣に対して培養上清の1/10量の滅菌済み0.1%CaCl2 in Tyrode buffer(12 ml)を添加した。ピペッティングにて遠心沈査を緩くほぐし、血小板と不死化巨核球の細胞混合液を得、そのままインキュベータ中、37℃で1時間反応させ、血小板と巨核球を無菌的に活性化した。これにより、血小板および不死化巨核球の細胞混合液(無菌)を得た。
実施例1-1にて調製した、血小板および不死化巨核球の細胞混合液(無菌)を凍結乾燥用のチューブに分注し(1ml x 9本および750μl x 4本)、メンブレンフィルター付きの無菌培養容器に移し、これを凍結乾燥処理用サンプルとした。この凍結乾燥処理用サンプルを、まず共晶点以下の-60℃にて、1昼夜以上かけて十分に予備凍結した。次に、予め-45℃以下に設定した凍結乾燥機(EYELA FDU-1200)に供し、バキュームポンプによる減圧で1昼夜以上かけて凍結乾燥処理し、所望の凍結乾燥製剤を作製した。
巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤における骨癒合効果の確認
Shiga, et al. Sci Rep. 2016 Nov 11; 6: 36715に記載の方法に準じて、ラット腰椎固定術モデルを作成し、実施例1-2で調製したiPS細胞由来不死化巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤の骨癒合促進効果を確認した。即ち、SDラット(8週齢)を用いて、腰椎固定術モデルを作成した。第4-6腰椎棘突起レベルで皮膚を切開し、棘突起中央から1.5mm外側部で約2cm筋膜縦切開を加えた。背筋を鈍的に展開し第4-6腰椎横突起を露出させた。人工骨であるハイドロキシアパタイトコラーゲン複合体、Refit(Hoya Corporation, Tokyo, Japan)0.5mlを粉砕し、上記凍結乾燥製剤10μgと混合し、腰椎の両サイドに移植した。筋膜、皮膚を縫合し、モデル作成を終了した。術後2週、4週、6週において、レントゲン撮影で骨癒合評価を行った。
製剤中の成長因子濃度測定
実施例1-2の凍結乾燥製剤の調製過程において、巨核球/血小板活性化直後、および凍結乾燥後の製剤中の成長因子濃度をELISAにより測定した。使用したキットを[表2]に示す。活性化時の巨核球細胞濃度は1 x 106 細胞/mlであった。結果を[表3]に示す。[表3]において、活性化直後(FD前)の成長因子濃度は、1mlの細胞混合液中の濃度である。また、凍結乾燥後(FD後)の成長因子濃度は、各バイアルを精製水で1mlにフィルアップした時の濃度である。凍結乾燥後も、製剤中に含有される各サイトカインの量が良好に維持された。
BMP2およびBMP4濃度の測定
実施例1-2の凍結乾燥製剤の調製過程において、巨核球/血小板活性化直後(FD化前)における製剤中のBMP2およびBMP4濃度を測定した。また、同じ数の血小板を含むヒト末梢血から調製したPRPを用いて実施例1-2と同様に活性化し(2個体:ヒトPRP1およびヒトPRP2)、PRP中のBMP2およびBMP4濃度を測定した。対照として、分化培地(増殖培地からドキシサイクリンを除き、SR1 750uM、Y27632 10mMおよびKP457 15mMを添加)を使用した。
iPS細胞由来成熟巨核球および血小板から放出されるサイトカインの検出
参考例1にて調製したiPS細胞由来不死化巨核球株 imMKCLを分化培地(増殖培地からドキシサイクリンを除き、SR1 750uM、Y27632 10mMおよびKP457 15mMを添加)中で振とう培養することにより、成熟巨核球および血小板 (MMK-PLT)を得た。MMK-PLTがヒト末梢血由来PRPと同様に創傷治癒促進サイトカインを放出するか検証した。まず分化0、4、6日目のMMK-PLTからmRNAを回収し、RT-qPCR法を用いてTGF-β1、PDGF-BB、EGFの遺伝子発現を経時的に解析した。また各MMK-PLTにCaCl2およびトロンビンを添加して活性化し、遠心分離して上清を回収した。ELISA法でこの上清に含まれるTGFβ、PDGF-BB、EGF、bFGFタンパクの濃度を測定した。
各サイトカインの遺伝子発現は巨核球の成熟に伴い6日目まで著明に上昇していた。また、活性化により放出された各サイトカインのタンパク濃度も成熟により上昇していたが、4日目と6日目に有意差は認められなかった。これらの結果から、分化4日目以降のMMK-PLTに、各サイトカインが豊富に含まれていることが示唆された。
インビトロ創傷治癒アッセイ
創傷治癒の増殖期では、創部に存在する線維芽細胞によりコラーゲンなどの細胞外マトリックスが構築される。MMK-PLTがヒト初代培養線維芽細胞の増殖能に与える影響を解析した。
詳細には、ヒト初代培養線維芽細胞の培養液 (無血清) 中に、実施例5にて調製した活性化MMK-PLT(6日目)上清を添加し、3および5日目の細胞数を測定した。何も投与していない対照群およびポジティブ対照としてのFBS投与群との比較を行った (n=3)。
MMK/PLT投与群では対照群と比較し、有意に細胞数が増加した。また、5日間培養を続けると、FBS投与群では増殖能が低下したが、MMK/PLT投与群では増殖が継続し細胞数に有意差を認めた。
インビボ創傷治癒アッセイ
MMK-PLTが実際に創傷治癒を促進するか、動物モデルを用いて検証した。
詳細には、免疫不全マウス (NOD/SCID IL2R欠損) (日本クレアより入手)の左右背部に6mm大の皮膚全層欠損を作製した。分化5日目のMMK-PLT(実施例5に記載のようにして調製)を回収し、分化培養開始時の不死化巨核球株細胞数として8×105個の細胞を皮膚欠損周囲に皮下注射した。また、分化培養開始時の不死化巨核球株細胞数として2×105個を基底膜マトリックス製剤と混和して創面に塗布し、ポリウレタンフィルムでドレッシングした。1つの創部に対する合計投与量は、分化培養開始時の不死化巨核球株細胞数として1×106個であり、これは創部1cm2あたり分化培養開始時の不死化巨核球株細胞数として3×106個の投与量に相当する。実施例10の表5より、投与時(分化5日目)においては、1つの創部に対して約2.2×106個の巨核球および約1.5×107個の血小板(創部1cm2あたり約6.6×106個の巨核球及び約4.5×107個の血小板)が投与されたと見積もられる。創部の収縮を予防するため、シリコンゴム製リングを周囲に縫着した。創面の大きさを3日おきに10日間測定し、その縮小率を解析した。PBS投与群を対照として比較した (n=4)。
MMK/PLT投与群ではPBS群と比較し、創面積の縮小率が高い傾向にあり、7日目では有意差を認めた。この結果から、MMK/PLTが創傷治癒を促進する可能性が示唆された。
巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤の調製2
実施例1とは異なるiPS細胞株(MKCL21#)から分化誘導した不死化巨核球細胞株(NC13X)を用いた。2.3 x 107個のNC13X細胞を、実施例1と同様にドキシサイクリン不在下での分化培養(Ito Y, Nakamura S, et al., Cell 174(3):636-648, 2018))に付した。分化6日目の血小板と巨核球の細胞混合液を遠心分離に付して、培養上清を廃棄し、得られた血小板と巨核球の混合物に滅菌済み0.1%CaCl2 in Tyrode buffer(23 ml)を添加した。37℃で1時間インキュベートすることにより、血小板と巨核球を無菌的に活性化した。活性化した血小板と巨核球の混合液を実施例1-2と同様に凍結乾燥処理に付し、凍結乾燥製剤を得た。
巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤における骨癒合効果の確認2
実施例2と同様に、ラット腰椎固定術モデルを作成し、実施例8で調製したiPS細胞由来不死化巨核球株から作成した巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤の骨癒合促進効果を評価した。詳細には、SDラット(n=4)の腰椎横突起を露出させ、その右側へは人工骨であるハイドロキシアパタイトコラーゲン複合体、Refit(Hoya Corporation, Tokyo, Japan)のみを、左側へはRefitと実施例8の凍結乾燥製剤の混合物を、それぞれ移植し、移植5週間後に、左右の新規骨形成量をImageJで測定し比較した。その結果、iPS細胞由来不死化巨核球株から誘導した巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤を移植した側で、新規骨形成量が有意に増加した(図7)。
巨核球と血小板の混合比率の解析
実施例1と同様に、不死化巨核球細胞株Clone 7をドキシサイクリン不在下での分化培養(Ito Y, Nakamura S, et al., Cell 174(3):636-648, 2018))に付し、経時的に培養物中の成熟巨核球(CD41+)および血小板(CD41+CD42+)の数をフローサイトメーターで計測し、巨核球に対する血小板の割合を算出した。
Claims (18)
- (i)MYCファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子およびBCL-xL遺伝子;
(ii)MYCファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子およびBMI-1遺伝子;または
(iii)MYCファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子、BMI-1遺伝子およびBCL-xL遺伝子
のいずれかの遺伝子の組み合わせが導入されている不死化巨核球由来の巨核球および血小板を含む凍結乾燥製剤。 - MYCファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子がc-MYC遺伝子、n-MYC遺伝子およびL-MYC遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも一つの遺伝子である、請求項1記載の凍結乾燥製剤。
- MYCファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子がc-MYC遺伝子である、請求項2記載の凍結乾燥製剤。
- 不死化巨核球が、多能性造血前駆細胞由来である、請求項1から3のいずれか記載の凍結乾燥製剤。
- 多能性造血前駆細胞が、iPS細胞由来である、請求項4記載の凍結乾燥製剤。
- 請求項1から5のいずれかにおける巨核球および/または血小板から放出される成長因子をさらに含有する、請求項1から5のいずれか記載の凍結乾燥製剤。
- 請求項6における成長因子が、請求項1から5のいずれかにおける巨核球および/または血小板から、その活性化または破砕することにより放出される、請求項6記載の凍結乾燥製剤。
- 成長因子が、骨形成タンパク質、血小板由来増殖因子、血小板由来血管形成因子、トランスフォーミング増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来内皮細胞増殖因子、インスリン様成長因子、および血小板因子IVからなる群から選ばれる少なくとも一つの因子である、請求項6または7記載の凍結乾燥製剤。
- 骨癒合を促進するための、請求項1から8のいずれか記載の凍結乾燥製剤。
- 皮膚疾患を処置もしくは予防するための、請求項1から8のいずれか記載の凍結乾燥製剤。
- 請求項1から8のいずれか記載の凍結乾燥製剤を含む、骨癒合を促進するための医薬組成物。
- 請求項1から8のいずれか記載の凍結乾燥製剤を含む、皮膚疾患を処置もしくは予防するための医薬組成物。
- 請求項1から10のいずれか記載の凍結乾燥製剤を調製する方法であって、
(A)不死化巨核球から血小板および巨核球の細胞混合液を調製する工程、および
(B)血小板および巨核球の細胞混合液を凍結乾燥する工程、
を含み、
前記不死化巨核球が、
(i)MYCファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子およびBCL-xL遺伝子;
(ii)MYCファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子およびBMI-1遺伝子;または
(iii)MYCファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子、BMI-1遺伝子およびBCL-xL遺伝子
のいずれかの遺伝子の組み合わせが導入されているものである、
方法。 - 工程(A)にて調製する細胞混合液を活性化させる、請求項13記載の方法。
- MYCファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子がc-MYC遺伝子、n-MYC遺伝子およびL-MYC遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも一つの遺伝子である、請求項13または14記載の方法。
- MYCファミリー遺伝子から選択される癌遺伝子がc-MYC遺伝子である、請求項15記載の方法。
- 不死化巨核球が、多能性造血前駆細胞由来である、請求項13から16のいずれか記載の方法。
- 多能性造血前駆細胞が、iPS細胞由来である、請求項17記載の方法。
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浜松大学保健医療学部紀要, (2012), 3, [1], p.7-15 |
血栓止血誌, (1993), 4, [1], p.36-39 |
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