JP2010523123A - Ａｈａｓ変異体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、少なくとも2つの突然変異を含むアセトヒドロキシ酸合成酵素(AHAS)大サブユニットの変異体、例えば、二重および三重変異体をコードする核酸を提供し、この核酸はAHAS阻害性除草剤に対する耐性のレベルが改善されたトランスジェニックまたは非トランスジェニック植物を作製するために有用である。本発明はまた、AHAS大サブユニット二重および三重変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、細胞、植物、2以上のAHAS大サブユニット単一突然変異ポリペプチドを含む植物、ならびにそれらをそれらを作製および使用する方法も提供する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、一般的に、アセトヒドロキシ酸合成酵素阻害性除草剤に対する植物の耐性を増加する組成物および方法に関する。
アセトヒドロキシ酸合成酵素（AHAS; EC 4.1.3.18、アセト乳酸合成酵素すなわちALSとしても知られている）は、分岐鎖アミノ酸、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの生化学合成を触媒する最初の酵素である（Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine," in Plant Amino Acids, Singh, B.K., 編., Marcel Dekker Inc. New York, New York, pp. 227-247）。AHASは構造的に異なる４系統の除草剤の作用部位であり、その４系統とは、スルホニルウレア系（Tanら, (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57；Mallory-SmithおよびRetzinger (2003) Weed Technology 17:620-626；LaRossaおよびFalco (1984) Trends Biotechnol. 2:158-161）、イミダゾリノン系（Shaverら (1984) Plant Physiol. 76:545-546）、トリアゾロピリミジン系（SubramanianおよびGerwick (1989) "Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines," in Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J.R.およびSonnet, P.E., 編, ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., pp. 277-288）、およびピリミジニルオキシベンゾアート系（Subramanianら (1990) Plant Physiol. 94: 239-244）である。イミダゾリノン系およびスルホニルウレア系除草剤は非常に少ない散布量で有効でありかつ動物に比較的無毒であるため、近代農業において広く使用されている。前記系統の除草剤は、AHAS活性を阻害することによって、多くの雑草種を含む感受性植物の、さらなる生長および発達を妨げる。市販のイミダゾリノン系除草剤の例をいくつか挙げると、PURSUIT（登録商標）（イマゼタピル）、SCEPTER（登録商標）（イマザキン）、およびARSENAL（登録商標）（イマザピル）がある。スルホニルウレア系除草剤の例としては、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメツルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フラザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、およびハロスルフロンがある。
イミダゾリノン系除草剤は有効性が高く毒性が低いため、広範な植生域の上からの散布による施用が好まれる。広範な植生域の上から除草剤を散布することが可能であることは、農園の設立および維持に関わるコストを下げ、こうした薬品の使用に先だって敷地造成する必要性を減少させる。また、望ましい耐性種の上から散布すると、結果として、競合種がないことにより、望ましい種の最大生産力を達成することが可能となる。しかしながら、このような全面散布法を使用できるかどうかは、全面散布領域において所望の植物のイミダゾリノン抵抗性種が存在するかどうかにかかっている。
主要農作物の中で、大豆のような一部のマメ科植物は、イミダゾリノン系除草剤化合物を速やかに代謝することが可能であるため、本来イミダゾリノン系除草剤に対して抵抗性である（ShanerおよびRobson, 1985, Weed Sci. 33:469-471）。トウモロコシ（Newhouseら (1992) Plant Physiol. 100:882-886）およびイネ（Barretteら (1989) Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, New York, pp.195-220）などの他の作物は、イミダゾリノン系除草剤に対してやや感受性である。イミダゾリノン系除草剤に対する感受性の差異は、個別の除草剤の化学的性質、およびそれぞれの植物における有毒型から無毒型への化合物の代謝の相違に依存する（Shanerら (1984) Plant Physiol. 76:545-546；Brownら (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27:24-29）。吸収および転流などの他の植物生理学上の相違も、感受性に重要な役割を果たしている（ShanerおよびRobson, 1985, Weed Sci. 33:469-471）。
イミダゾリノン系、スルホニルウレア系、およびトリアゾロピリミジン系、およびピリミジニルオキシベンゾアート系に対して抵抗性の植物は、種子、小胞子、花粉、およびカルスの変異誘発を利用して、トウモロコシ（Zea mays）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）（すなわち、菜種油またはキャノーラ）、ダイズ（Glycine max）、タバコ（Nicotiana tabacum）、テンサイ（Beta vulgaris）およびイネ（Oryza sativa）において成功裏に作製されている（Sebastianら (1989) Crop Sci. 29:1403-1408；Swansonら (1989) Theor. Appl. Genet. 78:525-530；Newhouseら (1991) Theor. Appl. Genet. 83:65-70；Sathasivanら (1991) Plant Physiol. 97:1044-1050；Mourandら (1993) J. Heredity 84:91-96；WrightおよびPenner (1998) Theor. Appl. Genet. 96：612-620；米国特許第5,545,822号）。いずれの場合も、単一の半優性核遺伝子が抵抗性を与えた。4種のイミダゾリノン抵抗性コムギ植物も、以前に、パンコムギ（Triticum aestivum） cv. Fidelの種子変異誘発後に単離された（Newhouseら (1992) Plant Physiol. 100:882-886）。遺伝の研究から、単一の半優性遺伝子が抵抗性を付与することが確認された。対立遺伝子の研究に基づいて、著者らは、同定された４系統における変異が同一の遺伝子座にあると結論付けた。Fidel種の抵抗性遺伝子の１つが、FS-4と命名された（Newhouseら (1992) Plant Physiol. 100:882-886）。
AHAS-インヒビター複合体の三次元コンフォメーションの計算機に基づくモデル化によって、おそらく、提案されたインヒビター結合ポケットの数個のアミノ酸が変異誘発によってイミダゾリノンに対する選択的抵抗性を与えうる部位であると予測されている（Ottら (1996) J. Mol. Biol. 263：359-368）。提案されたAHAS酵素の結合部位に合理的に設計されたこれらの突然変異のいくつかを用いて作製したタバコ植物は、実際、除草剤の単一クラスに対する特異的耐性を示した（Ottら (1996) J. Mol. Biol. 263：359-368）。
イミダゾリノン系除草剤に対する植物の抵抗性は、数多くの特許でも報告されている。米国特許第4,761,373号、第5,331,107号、第5,304,732号、第6,211,438号、第6,211,439号および第6,222,100号は、一般的に植物における除草剤抵抗性を誘発する改変AHAS遺伝子の使用を記載し、具体的に、ある特定種のイミダゾリノン抵抗性トウモロコシ系統を開示している。米国特許第5,013,659号は、１以上の保存領域における少なくとも１つのアミノ酸の突然変異に因る除草剤抵抗性を示す植物を開示している。ここに記載された突然変異はイミダゾリノン系とスルホニルウレア系の交差抵抗性またはスルホニルウレア特異的抵抗性をコードするが、イミダゾリノン特異的抵抗性は記載していない。さらに、米国特許第5,731,180号および第5,767,361号は、野生型単子葉植物AHASアミノ酸配列中に単一のアミノ酸置換を有する単離された遺伝子がイミダゾリノン特異的抵抗性を生じることを考察している。さらに、AHASを妨害する除草剤に対して抵抗性のあるイネ植物が、突然変異育種ならびに組織培養物選択により開発されている（米国特許第5,545,822号、第5,736,629号、第5,773,703号、第5,773,704号、第5,952,553号および第6,274,796号を参照されたい）。
植物において、試験された全ての他の生物のように、AHAS酵素は２つのサブユニット、すなわち、大サブユニット（触媒の役割）および小サブユニット（調節の役割）からなる（DugglebyおよびPang, 2000, J. Biochem. Mol. Biol. 33:1-36）。AHAS大サブユニットタンパク質（本明細書ではAHASLとも呼ぶ）は、シロイヌナズナおよびサトウダイコンの場合のように単一の遺伝子によって、またはトウモロコシ、キャノーラ、およびワタの場合のように複数の遺伝子ファミリーメンバーによってコードされていてもよい。大サブユニットにおける特定の単一塩基置換は、１以上のクラスの除草剤に対するある程度の非感受性を酵素にもたらす（ChangおよびDuggleby, 1998, Biochem J. 333:765-777）。
例えば、パンコムギ（Triticum aestivum L.）は3つの同祖アセトヒドロキシ酸合成酵素大サブユニット遺伝子を含有する。遺伝子のそれぞれは、3つの遺伝子のそれぞれの変異体からの除草剤応答および生化学的データに基づいて有意な発現を示す（Ascenziら (2003) International Society of Plant Molecular Biologists Congress、Barcelona、Spain、Ref. No. S10-17）。全ての3つの遺伝子のコード配列はヌクレオチドレベルで広汎な相同性を共有する（WO 03/014357）。パンコムギ（Triticum aestivum）の数種の変異体からのAHASL遺伝子の配列決定を通して、ほとんどのIMI耐性（イミダゾリノン耐性）系統の除草剤抵抗性の分子的基礎は、突然変異S653(At)N［シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のアミノ酸653のセリンと等価の位置における、セリンのアスパラギンへの置換を示す］であることが見出された（WO03/014357）。この突然変異は、AHASLタンパク質をコードするDNA配列における一塩基多型（SNP）に因る。
複数のAHASL遺伝子が双子葉類植物種に存在することも知られている。最近、Kolkmanら(（2004) Theor. Appl. Genet. 109： 1147-1159）はヒマワリ(Helianthus annuus L.)の除草剤耐性および野生型の遺伝子型から得た3つのAHASL遺伝子（AHASL1、AHASL2、およびAHASL3）についての同定、クローニング、および配列決定を報じた。Kolkmanらは、除草剤耐性がAHASL1タンパク質におけるPro197Leu［シロイヌナズナAHASLアミノ酸位置命名法を用いて］置換またはAla205Val置換に因るものであり、これらの置換はそれぞれイミダゾリノンおよびスルホニルウレア系除草剤の両方に耐性を与えると報じた。
除草剤に対する耐性または抵抗性を与える、いくつものAHAS大サブユニットにおける単一突然変異が公知である（Dugglebyら (2000) Journal of Biochem and Mol. Bio. 33：1-36； Janderら (2003) Plant Physiology 131：139-146）。例えば、シロイヌナズナAHASLの122位におけるアラニンのバリンへの置換（またはオオモミ（キク科植物）AHASLの対応する100位におけるアラニンのトレオニンへの置換）はイミダゾリノンおよびスルホニルウレアに対する耐性を与える。シロイヌナズナAHASLの124位におけるメチオニンのグルタミン酸またはイソロイシンへの置換はイミダゾリノンおよびスルホニルウレアに対する耐性を与える。シロイヌナズナAHASLの197位におけるプロリンのセリンへの置換（または酵母AHASLの対応する192位におけるプロリンのアラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンへの置換）はイミダゾリノン、スルホニルウレア、およびトリアゾロピリミジンに対する耐性を与える。シロイヌナズナAHASLの199位におけるアルギニンのアラニンまたはグルタミン酸への置換はイミダゾリノン耐性を与える。シロイヌナズナAHASLの205位におけるアラニンのバリンへの置換（または酵母AHASLの対応する200位におけるアラニンのシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、トリプトファンまたはチロシンへの置換）はイミダゾリノンおよびスルホニルウレア耐性を与える。シロイヌナズナAHASLの574位、酵母AHASLの対応する586位におけるトリプトファンのほとんど任意のアミノ酸の置換はイミダゾリノン、スルホニルウレア、トリアゾロピリミジン、およびピリミジルオキシベンゾアート耐性を与える。シロイヌナズナAHASLの653位におけるセリンのフェニルアラニン、アスパラギン、またはトレオニンへの置換はイミダゾリノンおよびピリミジルオキシベンゾアート耐性を与える。
米国特許第5,853,973号；第5,928,937号；および第6,576,455号は、上記の位置とは異なる特定の位置におけるアミノ酸置換を含むAHAS変異体を作製するための、構造に基づくモデル化法を開示している。Mouradら (1992) Planta 188；491-497において、スルホニルウレアに耐性のある変異体系統はトリアゾロピリミジンに交差耐性のあること、およびイミダゾリノンに耐性のある変異体系統はピリミジルオキシベンゾアートに交差耐性のあることが示されている。
米国特許第5,859,348号は、アミノ酸113におけるアラニンのトレオニンへの置換およびアミノ酸188におけるプロリンのセリンへの置換を有する二重変異体サトウダイコンAHAS大サブユニットを開示している。二重変異体サトウダイコンAHASタンパク質を含有するサトウダイコン植物はイミダゾリノンおよびスルホニルウレアの両方の耐性を有すると記載されている。
Mouradら (1994) Mol. Gen. Genet. 242：178-184は、csr1-4と名付けられたシロイヌナズナAHAS二重変異体を開示している。csr1-4変異体AHASは、589位におけるCのTへのヌクレオチド置換（シロイヌナズナAHASLの対応するアミノ酸197におけるプロリンのセリンへの置換）、および1958位におけるGのAへのヌクレオチド置換（シロイヌナズナAHASLの対応するアミノ酸653におけるセリンのトレオニンへの置換）を含有した。
Leeら (1988) EMBO Journal 7：1241-1248は、S4-Hraと呼ばれるタバコAHAS二重変異体を開示しているが、これはアミノ酸196（シロイヌナズナAHASLの対応するアミノ酸197）におけるPro-Ala置換およびアミノ酸573（シロイヌナズナAHASLの対応するアミノ酸574）におけるTrp-Leu置換を含む。この二重変異体遺伝子を保持する遺伝子組換え系統はスルホニルウレア系除草剤に対する耐性を示す。
米国特許第7,119,256号は、アミノ酸548におけるトリプトファンのロイシンへの置換およびアミノ酸627におけるセリンのイソロイシンへの置換を有する二重変異体イネAHAS大サブユニットを開示している。この二重変異体AHASタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現する遺伝子組換えイネ植物はピリミジニルカルボキシ除草剤、ビスピリバックナトリウムに対する耐性が増強されることが報じられた。
効力が高くかつ毒性が低いので、イミダゾリノン系除草剤は農業用に適している。しかし特定の作物生産系においてイミダゾリノン系除草剤を使用できるかどうかは、目的の作物植物のイミダゾリノン耐性変種の利用可能性に依存する。かかるイミダゾリノン耐性変種を作製するためには、現存AHAS変異体をもつ作物植物と比較した場合、イミダゾリノンおよび／または他のAHAS阻害性除草剤に対して改善された耐性を示す変異体AHASポリペプチドを含む作物植物の必要性が残っている。
いくつかのAHAS変異体が特徴付けられてはいるが、目的の作物植物に発現された場合、作物植物中の現存のAHAS変異体と比較して、1以上のクラスのAHAS阻害性除草剤に対して実証された除草剤耐性の改善を与える変異体AHASポリペプチドの必要性が残っている。
米国特許第5,545,822号 米国特許第4,761,373号 米国特許第5,331,107号 米国特許第5,304,732号 米国特許第6,211,438号 米国特許第6,211,439号 米国特許第6,222,100号 米国特許第5,013,659号 米国特許第5,731,180号 米国特許第5,767,361号 米国特許第5,736,629号 米国特許第5,773,703号 米国特許第5,773,704号 米国特許第5,952,553号 米国特許第6,274,796号 WO 03/014357 米国特許第5,853,973号 米国特許第5,928,937号 米国特許第6,576,455号 米国特許第5,859,348号 米国特許第7,119,256号
Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine," in Plant Amino Acids, Singh, B.K., 編., Marcel Dekker Inc. New York, New York, pp. 227-247 Tanら, (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57 Mallory-SmithおよびRetzinger (2003) Weed Technology 17:620-626 LaRossaおよびFalco (1984) Trends Biotechnol. 2:158-161 Shaverら (1984) Plant Physiol. 76:545-546 SubramanianおよびGerwick (1989) "Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines," in Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J.R.およびSonnet, P.E., 編, ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., pp. 277-288 Subramanianら (1990) Plant Physiol. 94: 239-244 ShanerおよびRobson, 1985, Weed Sci. 33:469-471 Newhouseら (1992) Plant Physiol. 100:882-886 Barretteら (1989) Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, New York, pp.195-220 Brownら (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27:24-29 Sebastianら (1989) Crop Sci. 29:1403-1408 Swansonら (1989) Theor. Appl. Genet. 78:525-530 Newhouseら (1991) Theor. Appl. Genet. 83:65-70 Sathasivanら (1991) Plant Physiol. 97:1044-1050 Mourandら (1993) J. Heredity 84:91-96 WrightおよびPenner (1998) Theor. Appl. Genet. 96：612-620 Ottら (1996) J. Mol. Biol. 263：359-368 DugglebyおよびPang, 2000, J. Biochem. Mol. Biol. 33:1-36 ChangおよびDuggleby, 1998, Biochem J. 333:765-777 Ascenziら (2003) International Society of Plant Molecular Biologists Congress、Barcelona、Spain、Ref. No. S10-17 Kolkmanら、（2004) Theor. Appl. Genet. 109： 1147-1159 Janderら (2003) Plant Physiology 131：139-146 Mouradら (1992) Planta 188；491-497 Mouradら (1994) Mol. Gen. Genet. 242：178-184 Leeら (1988) EMBO Journal 7：1241-1248
本発明は、除草剤、特にイミダゾリノン系除草剤もしくはスルホニルウレア系除草剤またはそれらの混合物に対する耐性を示す、新しい変異体AHASポリペプチドに関する。好ましい実施形態において、本発明の変異体により与えられる除草剤耐性は、公知のAHAS変異体を用いて得られるものと比較して改善および／または増強されている。本発明の変異体は、AHAS大サブユニットポリペプチド中に少なくとも2つのアミノ酸置換を含む。
一実施形態において、本発明は、次のポリペプチドからなる群より選択されるAHAS大サブユニット二重変異体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する：
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の139位もしくは配列番号2の107位に対応する位置においてイソロイシンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の269位もしくは配列番号2の237位に対応する位置においてヒスチジンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の416位もしくは配列番号2の384位に対応する位置においてメチオニンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の426位もしくは配列番号2の394位に対応する位置においてイソロイシンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の430位もしくは配列番号2の398位に対応する位置においてバリンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の442位もしくは配列番号2の410位に対応する位置においてイソロイシンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の445位もしくは配列番号2の413位に対応する位置においてイソロイシンまたはアスパラギン酸を有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の580位もしくは配列番号2の548位に対応する位置においてグルタミン酸を有するポリペプチド；
配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンおよび配列番号1の375位もしくは配列番号2の343位に対応する位置においてアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
および配列番号1の205位もしくは配列番号2の173位に対応する位置においてバリン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、トリプトファンまたはチロシンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド。
他の実施形態において、本発明は、次のポリペプチドからなる群より選択されるAHAS大サブユニット三重変異体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する：
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギン、および配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、および配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、および配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の57位に対応する位置においてアルギニン、および配列番号1の398位もしくは配列番号2の366位に対応する位置においてロイシンを有するポリペプチド；
配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギン、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、および配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の95位もしくは配列番号2の63位に対応する位置においてロイシン、配列番号1の416位もしくは配列番号2の384位に対応する位置においてグルタミン酸、および配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；および
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギン、および配列番号1の574位もしくは配列番号2の542位に対応する位置において任意のアミノ酸を有するポリペプチド。
本発明はまた、前記二重および三重変異体を含むAHASLポリペプチド、前記AHASL二重および三重変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記AHASL二重および三重変異体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞、前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むトランスジェニック植物、および前記AHASL二重および三重変異体をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物を作製するおよび使用する方法に関する。
本発明はさらに、2以上の突然変異を含むポリヌクレオチドを1以上含むトランスジェニックおよび非トランスジェニック植物に関する。一実施形態において、本発明の植物は、第1のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドおよび第2のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド、または前記第1と第2のAHASL単一変異体ポリペプチドのアミノ酸突然変異をもたらす2つの突然変異を含むAHASLをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで前記第1と第2のAHASL単一変異体ポリペプチドは、次のポリペプチドからなる群より選択される：
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の139位もしくは配列番号2の107位に対応する位置においてイソロイシンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の269位もしくは配列番号2の237位に対応する位置においてヒスチジンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の416位もしくは配列番号2の384位に対応する位置においてメチオニンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の426位もしくは配列番号2の394位に対応する位置においてイソロイシンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の430位もしくは配列番号2の398位に対応する位置においてバリンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の442位もしくは配列番号2の410位に対応する位置においてイソロイシンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の445位もしくは配列番号2の413位に対応する位置においてイソロイシンまたはアスパラギン酸を有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の580位もしくは配列番号2の548位に対応する位置においてグルタミン酸を有する第2のポリペプチド；
配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の375位もしくは配列番号2の343位に対応する位置においてアスパラギンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第2のポリペプチド；
および配列番号1の205位もしくは配列番号2の173位に対応する位置においてバリン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、トリプトファンまたはチロシンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第2のポリペプチド。
他の実施形態において、本発明はトランスジェニックおよび非トランスジェニック植物であって、第1のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド、第2のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド、および第3のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第3のポリヌクレオチド；または3つの突然変異を含む1つのAHASLをコードするポリヌクレオチド（ここで3つのヌクレオチド突然変異は前記第1の、第2のおよび第3のAHASL単一変異体ポリペプチドに対応するアミノ酸突然変異をもたらす）；または単一の突然変異を含むAHASLをコードするポリヌクレオチドおよび二重の突然変異を含むAHASLをコードするポリヌクレオチド（ここで、このヌクレオチド突然変異は前記第1の、第2のおよび第3のAHASL単一変異体ポリペプチドのアミノ酸突然変異をもたらす）を含む前記トランスジェニックおよび非トランスジェニック植物を提供し、ここで前記第1、第2、および第3のAHASL単一変異体ポリペプチドは次のポリペプチドからなる群より選択される：
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチド、配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第2のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第3のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチド、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第2のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第3のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチド、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第2のポリペプチドおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第3のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチド、配列番号1の57位に対応する位置においてアルギニンを有する第2のポリペプチドおよび配列番号1の398位もしくは配列番号2の366位に対応する位置においてロイシンを有する第3のポリペプチド；
配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギンを有する第1のポリペプチド、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第2のポリペプチドおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第3のポリペプチド；
配列番号1の95位もしくは配列番号2の63位に対応する位置においてロイシンを有する第1のポリペプチド、配列番号1の416位もしくは配列番号2の384位に対応する位置においてグルタミン酸を有する第2のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第3のポリペプチド；および
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第1のポリペプチド、配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第2のポリペプチドおよび配列番号1の574位もしくは配列番号2の542位に対応する位置において任意のアミノ酸を有する第3のポリペプチド。
本発明は、本発明のトランスジェニックおよび非トランスジェニック植物の周辺の雑草を防除する方法を提供する。かかる植物は、野生型植物と比較して除草剤抵抗性の増加が認められる。本方法は、AHAS阻害性除草剤の有効量を雑草と本発明の植物に適用するステップを含む。
シロイヌナズナAHAS大サブユニットタンパク質（アミノ酸配列番号1；核酸配列番号31）の全長配列ならびに太字でおよび下線を引いて示した突然変異の位置を示す推定翻訳を示す。DNA番号は左にまたアミノ酸番号は右に示している。 （図１−１の続き） トウモロコシAHAS大サブユニットタンパク質(アミノ酸配列番号2；核酸配列番号32)の全長配列ならびに太字でおよび下線を引いて示した請求項に記載の突然変異の位置のアミノ酸を示す。DNA番号は左にまたアミノ酸番号は右に示している。 （図２−１の続き） シロイヌナズナ（Arabidopsis）AHAS大サブユニットタンパク質（AtAHASL、配列番号1）と本発明の二重および三重突然変異を行うことができる次の多数の種のAHAS大サブユニットタンパク質との対応位置のアラインメントであり、配列番号1の置換位置に対応する置換位置を示す：Amaranthus sp.（AsAHASL 配列番号9）、Brassica napus（BnAHASL1A 配列番号3、BnAHASL1C 配列番号10、BnAHASL2A 配列番号11）、Camelina microcarpa（CmAHASL1 配列番号12、CmAHASL2 配列番号13）、Solanum tuberosum（StAHASL1 配列番号16、StAHASL2 配列番号17）、Oryza sativa（OsAHASL 配列番号4）、Lolium multiflorum（LmAHASL 配列番号20）、Solanum ptychanthum（SpAHASL 配列番号14）、Sorghum bicolor（SbAHASL 配列番号15）、Glycine max（GmAHASL 配列番号18）、Helianthus annuus（HaAHASL1 配列番号5、HaAHASL2 配列番号6、HaAHASL3 配列番号7）、Triticum aestivum（TaAHASL1A 配列番号21、TaAHASL1B 配列番号22、TaAHASL1D 配列番号23）、Xanthium sp.（XsAHASL 配列番号19）、Zea mays（ZmAHASL1 配列番号8、ZmAHASL2 配列番号2）、Gossypium hirsutum（GhAHASA5 配列番号24、GhAHASA19 配列番号25）、およびE.coli（ilvB 配列番号26、ilvG 配列番号27、ilvI 配列番号28）。 （図３−１の続き） （図３−２の続き） （図３−３の続き） （図３−４の続き） （図３−５の続き） （図３−６の続き） 大腸菌におけるシロイヌナズナAHASL変異体AE2〜AE8の構築に用いたAEベースベクターのマップ、ならびに示したシロイヌナズナAHASLにおける突然変異の相対位置である。 ベクターAP2〜AP5を構築するのに用いた植物形質転換ベースベクターAPのマップであり、表1に示した突然変異だけが異なる。 示した突然変異の相対位置をもつ大腸菌におけるトウモロコシAHASL変異体ZE2、ZE5、ZE6、およびZE7を研究するために用いたベースベクターZEのマップである。 ベクターZP2〜ZP10を構築するためにベースベクターとして用いた植物形質転換ベクターZPのマップである。 色々な種から誘導したAHASL遺伝子の一致したアミノ酸位置を示す表である。 （図８−１の続き） （図８−２の続き） （図８−３の続き） 色々な種から誘導したAHASL遺伝子のタンパク質同一性パーセントを示す表である。分析はベクターNTIソフトウエアスーツ(ギャップオープニングペナルティ=10、ギャップエクステンションペナルティ=0.05、ギャップ分離ペナルティ=8、blosum 62MT2マトリックス)で実施した。 イマゼタピル37.5マイクロモルの培地にまいた数系統のシロイヌナズナからの種子の鉛直プレート成長アッセイの結果を示す。使用した種子は：1)野生型の生態型Columbia2；2)csr1-2変異体(AHAS大サブユニット遺伝子のゲノムコピーにおけるAtAHASL S653N突然変異、ホモ接合)；3)AP1で形質転換したColumbia2；4)AP7で形質転換したColumbia2；および5)AP2で形質転換したColumbia2。 ベクターAUP2およびAUPを構築するのに用いた植物形質転換ベースベクターAUPのマップであり、表3に示した突然変異だけが異なる。 植物形質転換ベースベクターBAP1のマップであり、S653N突然変異をもつAtAHASLをコードする配列を含む。
本発明は、除草剤、特に、イミダゾリノン系除草剤に対して、および、場合によっては、スルホニルウレア、トリアゾロピリミジンスルホアニリドおよび／またはピリミジルオキシベンゾアート系除草剤に対して耐性を示す、少なくとも2つの突然変異をもつAHASL変異体、例えば二重および三重変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のAHASL変異体を用いて、雑種交雑種の1つの親だけにまたは倍数体植物の1つのゲノムに存在すると、商業レベルの除草剤耐性を与えるために十分なレベルの除草剤抵抗性を示すトランスジェニック植物を作製することができる。本発明のポリヌクレオチドはまた、米国特許第6,025,541号に記載のように、他の形質をコードする連結された遺伝子の形質転換用の選択可能なマーカーとして利用することもできる。
様々な種のAHASLタンパク質は長さが数個のアミノ酸だけ異なるが、本発明による改変を行う残基の相対位置は保存されている（図8）。従って、本明細書に記載の突然変異は、シロイヌナズナAHASLポリペプチド(配列番号1、図1、図8)のアミノ酸残基番号に対応する位置を用いて、特に断わりなしに表現されるかまたは前後関係から明らかである。例えば、シロイヌナズナAHASLの残基122は、トウモロコシAHASLの残基90、Brassica napus AHASL 1Aの残基104、B. napus AHASL 1Cの残基107、O. sativa AHASLの残基96、Amaranthus AHASLの残基113、Escherichia coli ilvGの残基26、Saccharomyces cerevisiae AHASLの残基117、サトウダイコンの残基113、ワタの残基111、Camelina microcarpa AHASL1の残基120、Camelina microcarpa AHASL2の残基117、Solanum tuberosum AHASL1の残基109、Solanum tuberosum AHASL2の残基111、Lolium multiflorumの残基92、Solanum ptychanthumの残基27、Sorghum bicolorの残基93、Glycine maxの残基103、Helianthus annuus AHASL1の残基107、Helianthus annuus AHASL2の残基101、Helianthus annuus AHASL3の残基97、Triticum aestivumの残基59、およびXanthium属の残基100に対応する。これらの対応は当業者にとって周知である。かかる対応に基づいて、本明細書で具体的に開示してないAHAS 大サブユニット 配列における対応位置を、当業者は容易に確認することができよう。本発明に関する対応の具体的な例示領域を図3に示す。
ある好ましい実施形態において、本発明は次のポリペプチドからなる群より選択されるシロイヌナズナAHASL二重変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する：
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システイン、または メチオニンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリン、または トリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システイン、または メチオニンおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システイン、または アスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システイン、または メチオニンおよび配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシン、または イソロイシンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システイン、または メチオニンおよび配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、または アスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システイン、または メチオニンおよび配列番号1の139位もしくは配列番号2の107位に対応する位置においてイソロイシンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システイン、または メチオニンおよび配列番号1の269位もしくは配列番号2の237位に対応する位置においてヒスチジンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システイン、または メチオニンおよび配列番号1の416位もしくは配列番号2の384位に対応する位置においてメチオニンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システイン、または メチオニンおよび配列番号1の426位もしくは配列番号2の394位に対応する位置においてイソロイシンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システイン、または メチオニンおよび配列番号1の430位もしくは配列番号2の398位に対応する位置においてバリンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システイン、または メチオニンおよび配列番号1の442位もしくは配列番号2の410位に対応する位置においてイソロイシンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システイン、または メチオニンおよび配列番号1の445位もしくは配列番号2の413位に対応する位置においてイソロイシン または アスパラギン酸を有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システイン、または メチオニンおよび配列番号1の580位もしくは配列番号2の548位に対応する位置においてグルタミン酸を有するポリペプチド；
配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、または アスパラギンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリン、または トリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシン、または イソロイシンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリン、または トリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシン、または イソロイシンおよび配列番号1の375位もしくは配列番号2の343位に対応する位置においてアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシン、または イソロイシンおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システイン、または アスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システイン、または アスパラギンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリン、または トリプトファンを有するポリペプチド；
および 配列番号1の205位もしくは配列番号2の173位に対応する位置においてバリン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、トリプトファン、または チロシンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリン、または トリプトファンを有するポリペプチド。
他の好ましい実施形態において、本発明は、次のポリペプチドからなる群より選択されるシロイヌナズナAHAS大サブユニット三重変異体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する：
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギン、および配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、および配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、および配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の57位に対応する位置においてアルギニン、および配列番号1の398位もしくは配列番号2の366位に対応する位置においてロイシンを有するポリペプチド；
配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギン、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、および配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の95位もしくは配列番号2の63位に対応する位置においてロイシン、配列番号1の416位もしくは配列番号2の384位に対応する位置においてグルタミン酸、および配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；および
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギン、および配列番号1の574位もしくは配列番号2の542位に対応する位置において任意のアミノ酸を有するポリペプチド。
他の好ましい実施形態としては、二重および三重突然変異が先におよび図8の表に記載した具体的なシロイヌナズナおよびトウモロコシ変異体の位置に対応する位置で起こる、他の種からのAHASL二重および三重変異体が挙げられる。例えば、AHASLの二重および三重変異体であって、大腸菌、サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）、サルモネラ（Salmonell）、シネコシスチス（Synechocystis）などの微生物由来の、およびコムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、モロコシ、雑穀、サトウダイコン、サトウキビ、ダイズ、ピーナッツ、ワタ、アブラナ、キャノーラ、アブラナ属、トロアオイ、メロン、カボチャ、コショウ、ヒマワリ、マリーゴールド、ナス科植物、ジャガイモ、サツマイモ、タバコ、ナス、トマト、ソラマメ属、エンドウマメ、アルファルファ、コーヒー、カカオなどの植物由来の、対応するAHASLの二重および三重変異体も本発明の範囲に包含される。かかる二重および三重変異体は、公知の方法、例えば、in vitroで部位特異的変異誘発を用いて、またはin vivoで標的化変異原性または米国特許第5,565,350号；第5,731,181号；第5,756,325号；第5,760,012号；第5,795,972号および第5,871,984号に記載の類似の技法を用いて作製することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、目的の植物における発現用の発現カセットで提供される。カセットは本発明のAHASLポリヌクレオチド配列と機能しうる形で連結された調節配列を含みうる。本明細書で使用する用語「調節エレメント」は、機能しうる形で連結されたポリヌクレオチドの転写を調節できるポリヌクレオチドを意味する。それには、限定されるものでないが、プロモーター、エンハンサー、イントロン、5'UTR、および3'UTRが含まれる。「機能しうる形で連結された」は、プロモーターと第2の配列との機能的連結を意味することを意図し、ここでプロモーター配列は第2の配列に対応するDNA配列の転写を開始しかつ媒介する。一般的に、「機能しうる形で連結された」は、核酸配列が近接して連結されること、2つのタンパク質をコードする領域を接続する必要のある場合、近接しかつ同じ読み枠で接合することを意味する。カセットはさらに、生物中に共形質転換される少なくとも1つのさらなる遺伝子を含有してもよい。あるいは、さらなる遺伝子を多重発現カセットで提供してもよい。
かかる発現カセットには、調節領域の転写制御下にあるAHASLポリヌクレオチド配列を挿入するための複数個の制限酵素部位が備えられる。この発現カセットはさらに、選択可能なマーカーを含有してもよい。
発現カセットは、5'-3'転写方向に、植物で機能する転写および翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、本発明のAHASLポリヌクレオチド配列、ならびに転写および翻訳終結領域（すなわち、終結領域）を含みうる。プロモーターは、植物宿主および／または本発明のAHASLポリヌクレオチド配列に対して、生来もしくは類似であってよく、または外来もしくは異種であってもよい。さらに、プロモーターは、天然配列であっても、あるいはまた合成配列であってもよい。プロモーターが植物宿主にとって「外来」もしくは「異種」である場合、そのプロモーターは導入される生来の植物中に存在しないプロモーターであることを意図する。プロモーターが、本発明のAHASLポリヌクレオチド配列に対して「外来」もしくは「異種」である場合、そのプロモーターは、機能しうるように結合された本発明のAHASLポリヌクレオチド配列にとって、生来のプロモーターまたは天然のプロモーターでないことを意図する。本明細書で使用されるキメラ遺伝子は、コード配列に対して異種である転写開始領域と機能しうる形で連結されたコード配列を含む。
本発明のAHASLポリヌクレオチドを異種プロモーターを用いて発現させることが好ましい一方、生来のプロモーター配列を使用してもよい。かかる構築物は、植物もしくは植物細胞におけるAHASLタンパク質の発現レベルを変化させうる。したがって、植物もしくは植物細胞の表現型が改変される。
終結領域は、生来、転写開始領域に伴ってもよく、生来、機能しうる形で連結された目的のAHASL配列に伴ってもよく、生来、植物宿主に伴ってもよく、または他の起源に由来するもの（すなわち、プロモーター、当該AHASLポリヌクレオチド配列、植物宿主もしくはそれらの任意の組み合わせに対して外来もしくは異種）であってもよい。好都合な終結領域は、たとえばオクトピン合成酵素およびノパリン合成酵素終結領域のように、A. tumefaciensのTiプラスミドから得ることができる。また、Guerineauら (1991) Mol. Gen. Genet. 262：141-144；Proudfoot (1991) Cell 64：671-674；Sanfaconら (1991) Genes Dev. 5：141-149；Mogenら (1990) Plant Cell 2：1261-1272；Munroeら (1990) Gene 91：151-158；Ballasら (1989) Nucleic Acids Res. 17：7891-7903；およびJoshiら (1987) Nucleic Acid Res. 15：9627-9639も参照されたい。
適宜、遺伝子を、形質転換された植物内で発現が増加するように最適化することができる。すなわち、発現を改善するために植物優先コドンを用いて遺伝子を合成することができる。例えば、宿主優先コドン使用頻度の考察については、CampbellおよびGowri, 1990, Plant Physiol. 92:1-11を参照されたい。当技術分野においては、植物優先遺伝子を合成する方法を利用することができる。例えば、本明細書に参照により組み入れられる米国特許第5,380,831号および第5,436,391号、ならびにMurrayら (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498を参照されたい。
さらなる配列の改変が、細胞宿主における遺伝子発現を高めることが知られている。それには、不要なポリアデニル化シグナル、エクソン-イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様リピートをコードする配列、ならびに遺伝子発現に有害でありうる十分特徴付けられた他の配列の除去が含まれる。配列のG-C含量を、宿主細胞に発現した既知遺伝子と比較して計算した、所与の細胞性宿主に関するレベル平均値に調整することができる。可能であれば、予測されるmRNAのヘアピン二次構造を避けるように配列を改変する。
遺伝子発現を高めるヌクレオチド配列を、植物発現ベクター中に使用することもできる。これには、トウモロコシのイントロンAdhI、イントロン1遺伝子（Callisら, Genes and Development 1:1183-1200, 1987）、ならびにタバコモザイクウイルス（TMV）、トウモロコシクロロティックモトルウイルス、およびアルファルファモザイクウイルス由来のリーダー配列（W配列）（Gallieら, Nucleic Acid Res. 15:8693-8711, 1987ならびにSkuzeskiら, Plant Molec. Biol. 15:65-79, 1990）が含まれる。トウモロコシのshrunken-1遺伝子座由来の第１のイントロンは、キメラ遺伝子構築物において遺伝子の発現を増加させることが明らかになった。米国特許第5,424,412号および第5,593,874号は、遺伝子発現構築物における特定のイントロンの使用を明らかにし、Gallieら, Plant Physiol. 106:929-939, 1994は、遺伝子発現を組織特異的に制御するために、イントロンが有用であることも明らかにした。AHAS大サブユニット遺伝子発現をさらに高め、または最適化するために、本発明の植物発現ベクターはまた、マトリクス結合領域（MAR）を含むDNA配列を含有することができる。このように改変された発現系で形質転換した植物細胞は、その後、本発明のヌクレオチド配列の、過剰発現もしくは構成的発現を示す可能性がある。
発現カセットはさらに、発現カセット構築物中に5'リーダー配列を含有することができる。かかるリーダー配列は、翻訳を促進するよう作用することができる。翻訳リーダーは当技術分野で公知であり、次のようなものがある：ピコルナウイルスリーダー、例えば、EMCVリーダー（脳心筋炎ウイルス5'非コード領域）（Elroy Steinら, (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130）；ポティウイルスリーダー、例えば、TEVリーダー（タバコエッチウイルス）（Gallieら (1995) Gene 165(2):233-238）、MDMVリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）（Virology 154:9-20）、およびヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（BiP）（Macejakら (1991) Nature 353:90-94）；アルファルファモザイクウイルスのコートタンパク質mRNA由来の非翻訳リーダー（AMV RNA 4）（Joblingら (1987) Nature 325:622-625）；タバコモザイクウイルスリーダー（TMV）（Gallieら (1989) in Molecular Biology of RNA, Cech編、Liss, New York, pp. 237-256）；ならびにトウモロコシクロロティックモトルウイルスリーダー（MCMV）（Lommelら (1991) Virology 81:382 385）。Della-Cioppaら (1987) Plant Physiol. 84:965 968も参照されたい。翻訳を促進することが公知の他の方法、例えばイントロンなどを使用することもできる。
発現カセットの調製に際して、適正な方向、ならびに、必要に応じて適正な読み枠で、DNA配列を提供できるように、さまざまなDNA断片を操作することができる。この目的に向けて、アダプターもしくはリンカーを用いて、DNA断片を接合する、あるいは、他の操作も関わって、好都合な制限酵素部位を与え、不要なDNAを除去し、制限酵素部位の除去することなどができる。この目的のために、in vitro変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、塩基転移および塩基転換に関わることができる。
本発明の実施に際して、いくつものプロモーターを用いることができる。プロモーターは、所望の成果に基づいて選択することができる。核酸は、植物で発現するための構成的プロモーター、組織選択的プロモーター、または他のプロモーターと組み合わせることができる。
かかる構成的プロモーターとしては、例えば、WO 99/43838および米国特許第6,072,050号に開示された、Rsyn7プロモーターのコアプロモーター、および他の構成的プロモーター；コアCaMV 35Sプロモーター（Odellら (1985) Nature 313:810-812）；イネ・アクチン（McElroyら (1990) Plant Cell 2:163-171）；ユビキチン（Christensenら (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 およびChristensenら (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689）；pEMU（Lastら (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588）；MAS（Veltenら (1984) EMBO J. 3:2723-2730）；ALSプロモーター（米国特許第5,659,026号）などがある。他の構成的プロモーターには、例えば、米国特許第5,608,149号；第5,608,144号；第5,604,121号；第5,569,597号；第5,466,785号；第5,399,680号；第5,268,463号；第5,608,142号および第6,177,611号が挙げられる。
組織選択的プロモーターを使用して、特定の植物組織内で強化されたAHASL発現を目指すことができる。かかる組織選択的プロモーターには、限定されるものでないが、葉選択的プロモーター、根選択的プロモーター、種子選択的プロモーター、および茎選択的プロモーターがある。組織選択的プロモーターは、Yamamotoら (1997) Plant J. 12(2):255-265；Kawamataら (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803；Hansenら(1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343；Russellら (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168；Rinehartら (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341；Van Campら (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535；Canevasciniら (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524；Yamamotoら (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778；Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196；Orozcoら (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138；Matsuokaら (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590；ならびにGuevara-Garciaら (1993) Plant J. 4(3):495-505が含まれる。かかるプロモーターは、必要に応じて、発現を弱めるように改変することができる。
一実施形態において、目的の核酸を発現するために葉緑体を標的化する。このやり方で、目的の核酸を直接、葉緑体中に挿入しない場合、発現カセットは、さらに、目的の遺伝子産物を葉緑体に向けて送る葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む葉緑体標的化配列を含有しうる。かかる輸送ペプチドは当技術分野では公知である。葉緑体標的化配列について「機能しうる形で連結された」は、輸送ペプチドをコードする核酸配列（すなわち、葉緑体標的化配列）が本発明のAHASLポリヌクレオチドと、2つの配列が近接しかつ同じ読み枠内にあるように連結されていることを意味する。例えば、Von Heijneら (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126；Clarkら (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550；Della-Cioppaら (1987) Plant Physiol. 84:965-968；Romerら (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421；ならびにShahら (1986) Science 233:478-481を参照されたい。本発明のAHASLタンパク質が生来の葉緑体輸送ペプチドを包含する一方、葉緑体標的化配列を本発明の成熟AHASLタンパク質をコードするヌクレオチド配列の5'末端に機能しうるように連結することにより、当技術分野で公知の任意の葉緑体輸送ペプチドを、本発明の成熟AHASLタンパク質のアミノ酸配列と融合させることができる。
葉緑体標的化配列は当技術分野において公知であり、それには、リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ（Rubisco）の葉緑体小サブユニット（de Castro Silva Filhoら (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780；Schnellら (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342）；5-(エノールピルビル)シキミ酸-3-リン酸合成酵素（EPSPS）（Archerら (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810);トリプトファン合成酵素（Zhaoら (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087）；プラストシアニン （Lawrenceら (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363）；コリスミ酸合成酵素（Schmidtら (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457）；ならびに集光性クロロフィルa/b結合タンパク質（LHBP）（Lamppaら (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999）が含まれる。Von Heijneら (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126；Clarkら (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550；Della-Cioppaら (1987) Plant Physiol. 84:965-968；Romerら (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421；ならびにShahら (1986) Science 233:478-481も参照されたい。
葉緑体の形質転換法は、当技術分野では公知である。例えば、Svabら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530；SvabおよびMaliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917；SvabおよびMaliga (1993) EMBO J. 12:601-606を参照されたい。その方法は、選択可能なマーカーを含有するDNAの粒子銃送達、および、相同的組み換えを介するDNAのプラスチドゲノムへのターゲティングに依存するものである。さらにプラスチド形質転換は、核にコードされ、プラスチドに向けられたRNAポリメラーゼの組織選択的発現による、サイレントなプラスチド導入遺伝子のトランス活性化によって、達成することができる。かかる系は、McBrideら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305に報じられている。
葉緑体に向けて標的化される目的の核酸を、植物核とこの小器官との間のコドン使用頻度の差に応じて、葉緑体で発現するのに最適化する。このやり方で、葉緑体で優先されるコドンを用いて、目的の核酸を合成することができる。例えば、本明細書に参照により組み入れられる、米国特許第5,380,831号を参照されたい。
特に、本発明は少なくとも2つの突然変異を含むAHASL変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、除草剤耐性のある植物を作製することを記載する。この計画を、本明細書においては、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のArabidopsis AHASL変異体およびトウモロコシ（corn）のmaize AHASL2変異体を用いて実証したが、この応用はこれらの遺伝子にまたはこれらの植物に限定されるものでない。好ましい実施形態において、除草剤はイミダゾリノンおよび／またはスルホニルウレアである。他の好ましい実施形態において、除草剤耐性は野生型植物および公知のAHAS変異体と比較して改善および／または増強される。
本発明はまた、少なくとも2つの突然変異を含むAHASL変異体をコードする核酸を含有し、植物における該核酸の発現が野生型または公知のAHAS変異体型植物と比較して、除草剤耐性をもたらすトランスジェニック作物植物を作製する方法であって、(a)植物細胞中に、少なくとも2つの突然変異をもつAHASL変異体をコードする核酸を含む発現ベクターを導入するステップ、および(b)該植物細胞から除草剤耐性をもつトランスジェニック植物を作製するステップを含んでなる前記方法を提供する。植物細胞としては、限定されるものでないが、プロトプラスト、配偶子産生細胞、および再生して全植物になる細胞が挙げられる。本明細書で使用する用語「トランスジェニック」は、少なくとも1つの組換えポリヌクレオチドの全てまたは部分を含有する任意の植物、植物細胞、カルス、植物組織、または植物部分を意味する。多くの場合、組換えポリヌクレオチドの全てまたは部分を染色体または安定な染色体外エレメント中に安定して組込んで、連続世代に継代されるようにする。
他の実施形態において、本発明は本発明の変異体AHASLポリペプチドを選択可能なマーカーとして利用することに関する。本発明は、形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはそれらの部分を同定または選択する方法であって、(a)形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはそれらの部分を提供するステップであって、前記形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはそれらの部分は選択マーカーとして使われる先に記載した本発明のAHAS大サブユニット二重変異体ポリペプチドをコードする単離された核酸を含み、前記形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはそれらの部分は任意にさらなる単離された目的の核酸を含んでもよい前記ステップ；(b)形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはそれらの部分を少なくとも1種のAHASインヒビターまたはAHAS阻害性化合物と接触させるステップ；(c)その植物細胞、植物組織、植物またはそれらの部分がインヒビターまたは阻害性化合物により影響されるかどうかを確認するステップ；および(d)形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはそれらの部分を同定または選択するステップを含んでなる前記方法を提供する。
本発明の一実施形態はまた、本明細書に記載の二重および三重突然変異を含有する精製AHASLタンパク質であって、これは除草剤耐性のさらなる改善を設計する分子モデル研究に有用である。タンパク質を精製する方法は周知であり、市販の製品または、特別に設計された、例えば、Protein Biotechnology, WalshおよびHeadon (Wiley, 1994)に記載の方法を用いて容易に実施することができる。
本発明はさらに、AHASL二重変異体ポリペプチドをコードする1つのポリヌクレオチド、またはAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする2つのポリヌクレオチドを含む、非トランスジェニックおよびトランスジェニック除草剤耐性植物を提供する。それから作製される非トランスジェニック植物は、第1の植物を第2の植物と他家受粉し、花粉受容植物(第1のまたは第2の植物のいずれであってもよい)がこの他家受粉から種子を生じるようにすることにより、作製することができる。作製されるその種子および子孫植物は、1つの単一対立遺伝子または2つの対立遺伝子上に交雑した二重突然変異を有しうる。花粉受容植物は第1または第2の植物のいずれであってもよい。第1の植物は第1のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドを含む。第2の植物は第2のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含む。第1と第2のAHASL単一変異体ポリペプチドは、野生型AHASLポリペプチドと比較して、異なる単一のアミノ酸置換を含む。それから生じる種子または子孫植物はAHASL二重変異体ポリペプチドをコードする1つのポリヌクレオチドまたは2つのAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする2つのポリヌクレオチドを含むので、選択することができる。選択された子孫植物は、AHAS阻害性除草剤、例えばイミダゾリノン系除草剤またはスルホニルウレア系除草剤に対して、単一植物中の2つのAHASL単一変異体ポリペプチドの組合わせから予想されるより、意外に高いレベルの耐性を提示する。その子孫植物は、除草剤耐性に関して相乗作用を提示し、それにより、親植物由来の第1のおよび第2の突然変異を含む子孫植物の除草剤耐性のレベルは、第1のポリヌクレオチドの2コピーまたは第2のポリヌクレオチドの2コピーを含む植物の除草剤耐性より高い。
第1と第2の植物が第1と第2のポリヌクレオチドについてそれぞれホモ接合性である場合、得られる子孫植物のそれぞれは第1と第2のポリヌクレオチドのそれぞれの1コピーを含み、選択ステップを省略することができる。第1と第2の植物の1つがヘテロ接合性である場合、両方のポリヌクレオチドを含む子孫植物を、例えば、子孫植物のDNAを分析して第1と第2のポリヌクレオチドの両方を含む子孫植物を同定することによりまたは子孫植物を除草剤耐性について試験することにより選択することができる。第1と第2のポリヌクレオチドの両方を含む子孫植物は、第1のポリペプチドの2コピーまたは第2のポリペプチドの2コピーを含む植物の除草剤耐性より高い除草剤耐性のレベルを提示する。
一実施形態においては、本発明の植物は、第1のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドおよび第2のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド、または前記第1および前記第2のAHASL単一変異体ポリペプチドのアミノ酸突然変異に対応するアミノ酸突然変異をもたらす2つのヌクレオチド突然変異を含むものであるAHASLをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで、前記第1および前記第2のAHASL単一変異体ポリペプチドは次のポリペプチドからなる群より選択される：
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の139位もしくは配列番号2の107位に対応する位置においてイソロイシンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の269位もしくは配列番号2の237位に対応する位置においてヒスチジンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の416位もしくは配列番号2の384位に対応する位置においてメチオニンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の426位もしくは配列番号2の394位に対応する位置においてイソロイシンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の430位もしくは配列番号2の398位に対応する位置においてバリンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の442位もしくは配列番号2の410位に対応する位置においてイソロイシンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の445位もしくは配列番号2の413位に対応する位置においてイソロイシンまたはアスパラギン酸を有する第2のポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の580位もしくは配列番号2の548位に対応する位置においてグルタミン酸を有する第2のポリペプチド；
配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の375位もしくは配列番号2の343位に対応する位置においてアスパラギンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第2のポリペプチド；
配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第2のポリペプチド；
および配列番号1の205位もしくは配列番号2の173位に対応する位置においてバリン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、トリプトファンまたはチロシンを有する第1のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第2のポリペプチド。
AHASLポリヌクレオチドの二重突然変異を含むものである非トランスジェニック植物は、上記の他家受粉でない他の方法、例えば、限定されるものでないが、Kochevenkoら（PlantPhys.132:174-184,2003）に記載の標的化in vivo変異原性などにより作製することができる。二重突然変異は植物ゲノムの単一対立遺伝子、または2つの対立遺伝子に局在化させることができる。
本発明の他の実施形態は、単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換されたトランスジェニック植物であって、前記単離されたポリヌクレオチドが次のポリペプチドからなる群より選択されるアセトヒドロキシ酸合成酵素大サブユニット(AHASL)二重変異体ポリペプチドをコードすることを特徴とする前記トランスジェニック植物に関する：
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の139位もしくは配列番号2の107位に対応する位置においてイソロイシンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の269位もしくは配列番号2の237位に対応する位置においてヒスチジンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の416位もしくは配列番号2の384位に対応する位置においてメチオニンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の426位もしくは配列番号2の394位に対応する位置においてイソロイシンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の430位もしくは配列番号2の398位に対応する位置においてバリンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の442位もしくは配列番号2の410位に対応する位置においてイソロイシンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の445位もしくは配列番号2の413位に対応する位置においてイソロイシンまたはアスパラギン酸を有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の580位もしくは配列番号2の548位に対応する位置においてグルタミン酸を有するポリペプチド；
配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンおよび配列番号1の375位もしくは配列番号2の343位に対応する位置においてアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
および 配列番号1の205位もしくは配列番号2の173位に対応する位置においてバリン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、トリプトファンまたはチロシンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド。
本発明はさらに、AHASL三重変異体ポリペプチドをコードする1つのポリヌクレオチドまたは3つの突然変異を含む1以上のAHASLをコードするポリヌクレオチドを含むものである非トランスジェニックおよびトランスジェニック除草剤耐性植物を提供する。3つの突然変異を含む1以上のポリヌクレオチドをもつ非トランスジェニック植物を作製するには、先に記載した前記第1および前記第2の突然変異を含む1つもしくは2つのポリヌクレオチドを含むものである子孫植物を、第3のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第3のポリヌクレオチドを含むものである第3の植物と他家受粉させる。第3のAHASL単一変異体ポリペプチドは、野生型AHASLポリペプチドと比較して第1または第2のAHASL単一変異体ポリペプチドのいずれかとは異なる単一のアミノ酸置換を含む。3つの突然変異を含む1以上のポリヌクレオチドを含むものである種子または子孫植物を、先に記載したように選択する。選択された子孫植物は、単一植物中の3つのAHASL単一変異体ポリペプチドを組み合わせることの相加効果より大きい除草剤耐性のレベルを有する。AHASLポリヌクレオチドの三重または多重突然変異を含むものである非トランスジェニック植物は、先に記載した他家受粉でない他の方法、例えば、限定されるものでないが、先に記載した標的化in vivo変異原性などにより作製することができる。多重突然変異は、植物ゲノムの単一対立遺伝子、または複数の対立遺伝子に局在化させることができる。
一実施形態において、本発明の植物は、第1のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド、第2のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド、および第3のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第3のポリヌクレオチドを含む。他の実施形態において、本発明の植物は、3つの突然変異を含むAHASLをコードするポリヌクレオチドを含むものであり、ここで3つのヌクレオチド突然変異は前記第1、前記第2および前記第3のAHASL単一変異体ポリペプチドに対応するアミノ酸突然変異をもたらす。さらに他の実施形態において、本発明の植物は、単一の突然変異を含むAHASLをコードするポリヌクレオチドおよび二重突然変異を含むポリヌクレオチドを含むものであり、ここで、ヌクレオチド突然変異は、上記第1、第2および第3のAHASL単一変異体ポリペプチドの突然変異に対応するアミノ酸突然変異をもたらし、ここで、前記第1、第2および第3のAHASL単一変異体ポリペプチドは、次のポリペプチドからなる群より選択される：
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギン、および配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、および配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、および配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の57位に対応する位置においてアルギニン、および配列番号1の398位もしくは配列番号2の366位に対応する位置においてロイシンを有するポリペプチド；
配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギン、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、および配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の95位もしくは配列番号2の63位に対応する位置においてロイシン、配列番号1の416位もしくは配列番号2の384位に対応する位置においてグルタミン酸、および配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；および
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギン、および配列番号1の574位もしくは配列番号2の542位に対応する位置において任意のアミノ酸を有するポリペプチド。
あるいは、AHASL単一変異体ポリペプチドをコードする1以上のポリヌクレオチドを含む植物は、ある植物を2以上のかかるポリヌクレオチドで形質転換ことにより、または第1の植物を第1のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドで形質転換し、その第1の植物を第2のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含む第2の植物で他家受粉することにより作製する。第2の植物は、内因性であるかまたは形質転換を介して導入された第2のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含むものである。第1と第2のAHASL単一変異体ポリペプチドは、野生型AHASLポリペプチドと比較して異なる単一のアミノ酸置換を含む。必要であれば、第1と第2のポリヌクレオチドの両方を含む種子または子孫植物を先に記載のように選択する。
本発明のさらに他の実施形態は単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換されたトランスジェニック植物に関するものであり、ここで前記単離されたポリヌクレオチドは次のポリペプチドからなる群より選択されるアセトヒドロキシ酸合成酵素大サブユニット(AHASL)三重変異体ポリペプチドをコードする：
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギン、および配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、および配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、および配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の57位に対応する位置においてアルギニン、および配列番号1の398位もしくは配列番号2の366位に対応する位置においてロイシンを有するポリペプチド；
配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギン、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、および配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
配列番号1の95位もしくは配列番号2の63位に対応する位置においてロイシン、配列番号1の416位もしくは配列番号2の384位に対応する位置においてグルタミン酸、および配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；および
配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギン、および配列番号1の574位もしくは配列番号2の542位に対応する位置において任意のアミノ酸を有するポリペプチド。
本発明は、限定されるものでないが、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるAHASL単一変異体ポリペプチドおよびAHASL二重および三重変異体ポリペプチドを含む除草剤耐性もしくは除草剤抵抗性のAHASLタンパク質を含むものである除草剤耐性もしくは除草剤抵抗性の植物を提供する。「除草剤耐性」もしくは「除草剤抵抗性」の植物は、少なくとも１つの除草剤に対してその植物の普通の品種もしくは野生型品種を通常枯死させ、またはその生長を阻害しうるレベルにおいて、耐性または抵抗性がある植物を意図する。「除草剤耐性AHASLタンパク質」もしくは「除草剤抵抗性AHASLタンパク質」により、AHAS活性を妨害することが公知の少なくとも1種の除草剤の野生型AHASLタンパク質のAHAS活性を阻害することが知られる除草剤の濃度もしくはレベルのもとで、かかるAHASLタンパク質が野生型AHASLタンパク質のAHAS活性と比較してより高いAHAS活性を提示することを意図する。さらに、かかる除草剤耐性もしくは除草剤抵抗性AHASLタンパク質のAHAS活性は本明細書では「除草剤耐性」もしくは「除草剤抵抗性」AHAS活性を意図しうる。
本発明に対して、用語「除草剤耐性」と「除草剤抵抗性」は互換的に使用され、同じ意味および同じ範囲を有すると意図する。同様に、用語「除草剤耐性」と「除草剤抵抗性」は互換的に使用され、同等の意味および同等の範囲を有すると意図する。同様に、用語「イミダゾリノン抵抗性の」と「イミダゾリノン抵抗性」は互換的に使用され、「イミダゾリノン耐性の」と「イミダゾリノン耐性」とそれぞれ同等の意味および同等の範囲を有すると意図する。
本発明は、除草剤抵抗性AHASLポリヌクレオチドおよび除草剤抵抗性AHASLタンパク質を包含する。「除草剤抵抗性AHASLポリヌクレオチド」は、除草剤抵抗性AHAS活性を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを意図する。「除草剤抵抗性AHASLタンパク質」により、除草剤抵抗性のAHAS活性を含むタンパク質またはポリペプチドを意図する。
さらに、除草剤耐性もしくは除草剤抵抗性AHASLタンパク質をコードするヌクレオチド配列により植物またはその祖先を形質転換することによって、除草剤耐性もしくは除草剤抵抗性AHASLタンパク質を植物に導入できることが認識されている。かかる除草剤耐性もしくは除草剤抵抗性AHASLタンパク質は、除草剤耐性もしくは除草剤抵抗性AHASLポリヌクレオチドによってコードされる。あるいは、例えば、本明細書に開示したAHASL単一突然変異ポリペプチドなどの除草剤耐性もしくは除草剤抵抗性AHASLタンパク質は、植物またはその祖先のゲノムの内因性AHASL遺伝子における天然または誘導された突然変異の結果として、植物内に存在することもありうる。
本発明は、少なくとも１つの除草剤、特にイミダゾリノンまたはスルホニルウレア系除草剤に対する抵抗性もしくは耐性の増加を示す、植物、植物組織、植物細胞、および宿主細胞を提供する。除草剤の好ましい量または濃度が「有効な量」もしくは「有効な濃度」である。「有効な量」もしくは「有効な濃度」は、それぞれ、同様な、野生型の植物、植物組織、植物細胞、または宿主細胞を枯死させる、またはその生長（増殖）を阻害するのに十分であるが、その量は本発明の除草剤抵抗性の植物、植物細胞もしくは宿主細胞を枯死させるか、またはその生長（増殖）をひどく阻害することのない量もしくは濃度を意図する。典型的には、除草剤の有効量は、農業生産システムにおいて目的の雑草を枯死させるために通常使用される量である。かかる量は当業者にとって公知である。
「同様な、野生型の植物、植物組織、植物細胞または宿主細胞」により、それぞれ、除草剤抵抗性の特徴および／または本明細書に開示した本発明の特定のポリヌクレオチドを欠く植物、植物組織、植物細胞、または宿主細胞を意図する。用語「野生型」の使用は、従って、植物、植物組織、植物細胞、または他の宿主細胞がそのゲノム中に組換えDNAを欠くこと、および／または本明細書に開示された除草剤抵抗性の特徴と異なる除草剤抵抗性の特徴を持たないことを意図しない。
特に断らなければ、本明細書で使用する用語「植物」は、任意の発生段階における植物、ならびに全無傷の植物と結合していてもまたは分離していてもよい植物の任意の部分を意味することを意図する。植物のかかる部分には、限定されるものでないが、植物の器官、組織および細胞が含まれる。特別な植物部分の例には、幹、葉、根、花序、花、小花、果実、茎、花柄、雄蕊、葯、柱頭、花柱、卵巣、花弁、萼片、心皮、根端、根冠、根毛、葉毛、種子毛、花粉粒、小胞子、子葉、胚軸、上胚軸、木部、師部、柔組織、胚乳、伴細胞、孔辺細胞、および任意の他の公知の植物の器官、組織、および細胞が含まれる。さらに、種子が植物であることは認識されている。
本発明の植物には、非トランスジェニック植物およびトランスジェニック植物の両方が含まれる。「非トランスジェニック植物」により、そのゲノム中に組換えDNAを欠く植物を意味することを意図する。「トランスジェニック植物」により、そのゲノム中に組換えDNAを含む植物を意味することを意図する。かかるトランスジェニック植物は、組換えDNAを植物のゲノム中に導入することにより作製することができる。かかる組換えDNAをトランスジェニック植物のゲノム中に組み込むと、その植物の子孫もその組換えDNAを含みうる。少なくとも1つの祖先トランスジェニック植物の組換えDNAの少なくとも一部分を含む子孫植物もトランスジェニック植物である。
ある特定の実施形態において、本発明は、突然変異繁殖により作製された除草剤抵抗性の植物に関わる。かかる植物はAHAS大サブユニット単一の変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、そして1以上のAHAS阻害性除草剤に対して耐性がある。かかる方法は、例えば、植物または種子を、変異誘発物質、特に、例えば、メタンスルホン酸エチル（EMS）などの化学変異誘発物質に曝すステップ、および少なくとも1種のAHAS-阻害性除草剤、特にイミダゾリノン系除草剤またはスルホニルウレア系除草剤に対して強い耐性を有する植物を選択するステップに関わる。しかし、本発明は、化学変異誘発物質EMSに関わる変異誘発方法により作製される除草剤抵抗性の植物に限定されるものでない。当技術分野で公知のいずれの変異誘発方法を用いて本発明の除草剤抵抗性植物を作製してもよい。かかる変異誘発方法は、例えば、次の変異誘発物質のいずれかの1以上の使用が関わりうる：放射線、例えばX-線、γ線（例えば、コバルト60またはセシウム137）、中性子、（例えば、原子炉中のウラニウム235による核***生成物）、β放射線（例えば、リン32または炭素14などの放射性同位元素から放射される）、および紫外線照射（好ましくは2500〜2900nm）、および化学変異誘発物質、例えば、塩基類似体（例えば、5-ブロモ-ウラシル）、関係化合物（例えば、8-エトキシカフェイン）、抗生物質（例えば、ストレプトニグリン）、アルキル化剤（例えば、サルファーマスタード、ナイトロジェンマスタード、エポキシド、エチレンアミン、硫酸塩、スルホン酸塩、スルホン、ラクトン）、アジド、ヒドロキシルアミン、亜硝酸、またはアクリジン系。除草剤抵抗性植物はまた、組織培養方法を用いて除草剤抵抗性突然変異を含む植物細胞を選択し、次いでそれから除草剤抵抗性植物を再生することにより作製することもできる。例えば、米国特許第5,773,702号および第5,859,348号を参照されたく、これらの特許は共に本明細書にその全てが参照により組み入れられる。突然変異育種のさらなる詳細は“Principals of Cultivar Development” Fehr, 1993 Macmillan Publishing Companyに記載されており、その開示は本明細書に参照により組み入れられる。
本発明は、AHAS酵素活性を妨害する少なくとも１つの除草剤に対する、植物、植物組織、植物細胞もしくは他の宿主細胞の耐性もしくは抵抗性を高める方法を提供する。好ましくは、かかる除草剤は、イミダゾリノン系除草剤、スルホニルウレア系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、ピリミジニルオキシベンゾアート系除草剤、スルホニルアミノ-カルボニルトリアゾリノン系除草剤、またはそれらの混合物である。より好ましくは、かかる除草剤はイミダゾリノン系除草剤、スルホニルウレア系除草剤、またはそれらの混合物である。本発明に関して、イミダゾリノン系除草剤には、限定されるものでないが、PURSUIT（登録商標）（イマゼタピル）、CADRE（登録商標）（イマザピック）、RAPTOR（登録商標）（イマザモックス）、SCEPTER（登録商標）（イマザキン）、ASSERT（登録商標）（イマゼサベンツ）、ARSENAL（登録商標）（イマザピル）、前記除草剤のいずれかの誘導体、および前記除草剤の２つ以上からなる混合物、例えば、イマザピル／イマザモックス（ODYSSEY（登録商標））が含まれる。さらに具体的には、イミダゾリノン系除草剤は、限定されるものでないが、2-(4-イソプロピル-4-メチル-5-オキソ-2-イミジアゾリン-2-イル)-ニコチン酸、[2-(4-イソプロピル)-4-][メチル-5-オキソ-2-イミダゾリン-2-イル)-3-キノリンカルボン]酸、[5-エチル-2-(4-イソプロピル-]4-メチル-5-オキソ-2-イミダゾリン-2-イル)-ニコチン酸、2-(4-イソプロピル-4-メチル-5-オキソ-2-イミダゾリン-2-イル)-5-(メトキシメチル)-ニコチン酸、[2-(4-イソプロピル-4-メチル-5-オキソ-2-]イミダゾリン-2-イル)-5-メチルニコチン酸、ならびにメチル[6-(4-イソプロピル-4-]メチル-5-オキソ-2-イミダゾリン-2-イル)-m-トルアートとメチル[2-(4-イソプロピル-4-メチル-5-]オキソ-2-イミダゾリン-2-イル)-p-トルアートの混合物から選択することができる。5-エチル-2-(4-イソプロピル-4-メチル-5-オキソ-2-イミダゾリン-2-イル)-ニコチン酸、および[2-(4-イソプロピル-4-メチル-5-オキソ-2-イミダゾリン-2-]イル)-
5-(メトキシメチル)-ニコチン酸の使用が好ましい。[2-(4-イソプロピル-4-]メチル-5-オキソ-2-イミダゾリン-2-イル)-5-(メトキシメチル)-ニコチン酸の使用が特に好ましい。
本発明に関して、スルホニルウレア系除草剤には、限定されるものでないが、クロルスルフロン、メトスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメツルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フラザスルフロン、イマザスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、ハロスルフロン、アジムスルフロン、シクロスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロンメチル、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、オキサスルフロン、メソスルフロン、プロスルフロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、トリトスルフロン、上記除草剤のいずれかの誘導体、および上記除草剤の2以上の混合物が含まれる。本発明のトリアゾロピリミジン系除草剤には、限定されるものでないが、クロランスラム、ジクロスラム、フルオラスラム、フルメトスラム、メトスラム、およびペノクススラムが含まれる。本発明のピリミジニルオキシベンゾアート（またはピリミジニルカルボキシ）系除草剤には、限定されるものでないが、ビスピリバック、ピリチオバック、ピリミノバック、ピリベンゾキシムおよびピリフタリドが含まれる。スルホニルアミノ-カルボニルトリアゾリノン系除草剤には、限定されるものでないが、フルカルバゾンおよびプロポキシカルバゾンが含まれる。
ピリミジニルオキシベンゾアート系除草剤はピリミジニルチオベンゾアート系除草剤と密接に関係することが認識されていて、Weed Science Society of Americaにより、後者名の表題のもとでまとめられている。従って、本発明の除草剤はさらにピリミジニルチオベンゾアート系除草剤を含み、これには、限定されるものでないが、上記のピリミジニルオキシベンゾアート系除草剤が含まれる。
本発明は、植物においてAHAS活性を高める方法であって、本発明のAHASLヌクレオチドと機能しうる形で連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド構築物を用いて植物を形質転換するステップを含む前記方法を提供する。本方法は、本発明のポリヌクレオチド構築物を、少なくとも１つの植物細胞に導入するステップ、およびその細胞から、形質転換された植物体を再生するステップに関わる。本方法は、植物細胞における遺伝子発現を駆動することができるプロモーターの使用に関わる。好ましくは、かかるプロモーターは、構成的プロモーター、もしくは組織選択的プロモーターである。この方法は、AHAS酵素の触媒活性を阻害する、少なくとも１つの除草剤、特にイミダゾリノン系除草剤に対する植物の耐性を高めるかまたは強めるのに有用である。
本発明は、植物、植物組織、植物細胞もしくは他の宿主細胞において、本発明のポリヌクレオチドを発現させるための発現カセットを提供する。発現カセットは、全長（すなわち、葉緑体輸送ペプチドを含む）もしくは成熟（すなわち、葉緑体輸送ペプチドを含まない）AHASLタンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む本発明のポリヌクレオチドと機能しうる形で連結された、目的の植物、植物組織、植物細胞もしくは他の宿主細胞において発現可能なプロモーターを含む。植物もしくは植物細胞のプラスチドまたは 葉緑体で発現することが望ましいならば、発現カセットは、機能しうる形で連結された葉緑体輸送ペプチドをコードする葉緑体標的化配列を含むことができる。
本発明の発現カセットは、植物もしくは宿主細胞の除草剤耐性を高める方法に使用することができる。この方法は、植物もしくは宿主細胞を本発明の発現カセットで形質転換することに関わり、その発現カセットは目的の植物もしくは宿主細胞において発現可能なプロモーターを含み、そのプロモーターは本発明のイミダゾリノン耐性AHASLタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに機能しうる形で連結されている。
本明細書の用語「ポリヌクレオチド構築物」は、本発明をDNAを含むポリヌクレオチド構築物に限定することを意図するものでない。当業者は、リボヌクレオチドならびにリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの組み合わせからなるポリヌクレオチド構築物、特にポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドもまた、本明細書に記載の方法に使用できることを認識するであろう。したがって、本発明のポリヌクレオチド構築物は、植物を形質転換する本発明の方法に使用できる全てのポリヌクレオチド構築物を包含し、それには、限定されるものでないが、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる構築物が含まれる。かかるデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドには、天然の分子と合成類似体の両方が含まれる。本発明のポリヌクレオチド構築物はまた、全ての形のポリヌクレオチド構築物を包含し、それには、限定されるものでないが、一本鎖型、二本鎖型、ヘアピン型、ステム-ループ構造などが含まれる。さらに、当業者は、本明細書に記載の各ヌクレオチド配列が例示されたヌクレオチド配列の相補体も包含することを認識している。
さらに、目的の宿主細胞において本発明のポリヌクレオチドを発現するために、ポリヌクレオチドは、典型的には、目的の宿主細胞において遺伝子発現を駆動できるプロモーターに機能しうる形で連結されることが認識されている。宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させる本発明の方法は、特定のプロモーターに依存しない。その方法は、当技術分野で公知でありかつ目的の宿主細胞において遺伝子発現を駆動することができる任意のプロモーターの使用を包含する。
本発明は、AHASLポリヌクレオチド分子、ならびにその断片および変異体を包含する。これらのヌクレオチド配列の断片であるポリヌクレオチド分子も本発明に含まれる。用語「断片」は、本発明のAHASLタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部分を意図する。好ましくは、本発明のAHASLヌクレオチド配列の断片は、AHASLタンパク質の生物学的活性部分をコードする。AHASLタンパク質の生物学的活性部分は、本発明のAHASLヌクレオチド配列の１つの一部分を単離し、AHASLタンパク質のコードされた部分を発現させ（例えば、in vitro組換え発現によって）、そしてAHASLタンパク質のコードされた部分の活性を評価することにより調製することができる。AHASLヌクレオチド配列の断片であってAHASLタンパク質の生物学的活性部分をコードするポリヌクレオチド分子は、使用目的に応じて、少なくとも約500、750、1000、1250、1500、1600、1700、1800、1900、または2000個のヌクレオチド、または本明細書に記載の全長ヌクレオチド配列中に存在するヌクレオチドの数（例えば、配列番号30では2013個のヌクレオチド）まで含む。
本発明のAHASLタンパク質の生物学的活性部分をコードするAHASLヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約200、300、400、500、550、650、または650個の近接アミノ酸、または本発明の全長AHASLタンパク質中に存在するアミノ酸の総数（例えば、配列番号1では670個のアミノ酸）までをコードしうる。
本明細書に記載のヌクレオチド配列の変異体であるヌクレオチドを含むポリヌクレオチド分子も本発明に含まれる。本発明のAHASLヌクレオチド配列の「変異体」には、本明細書に記載の変異体AHASLポリペプチドをコードするが、遺伝暗号の縮重のために異なって保存された配列が含まれる。これらの天然の対立遺伝子変異体は、下記に概要を説明するように、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびハイブリダイゼーション法などの、周知の分子生物学の技法を用いて、同定することができる。変異型ヌクレオチド配列はまた、合成によって誘導されたヌクレオチド配列を包含し、これは例えば、部位特異的変異誘発によって作製されるが、依然として、以下に考察した本発明に記載のAHASLタンパク質をコードするものである。一般に、本発明のヌクレオチド配列変異体は、本明細書に記載の特定のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有しうる。変異型AHASLヌクレオチド配列は、それぞれAHASL変異体ポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、本明細書に記載のAHASLポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を有するものである。
さらに、当業者には当然のことながら、突然変異によって本発明のヌクレオチド配列内に変化を導入して、それによってAHASL二重および三重変異体ポリペプチドの生物学的活性を変化させることなく、コードされたAHASL二重および三重変異体ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらすことができる。したがって、図1および2に説明したAHASL二重および三重変異体ポリペプチドと異なる配列を有するAHASL二重および三重変異体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を、1以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を本明細書に記載の対応するヌクレオチド配列に導入することによって作製し、その結果、1以上のアミノ酸置換、付加、もしくは欠失を、コードされたタンパク質中に導入することができる。突然変異は、部位特異的変異誘発、およびPCRによる変異誘発などの標準的な技法によって導入することができる。かかる変異型ヌクレオチド配列もまた本発明に含まれる。
例えば、好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１以上の、予想される、好ましくは非必須アミノ酸残基にて行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変化させることなく、AHASLタンパク質の野生型配列（例えば、配列番号1の配列）から変更することができる残基であるが、それに対して、「必須」アミノ酸残基は生物学的活性にとって必要である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換える置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β-分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、ならびに芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。かかる置換は、保存されたアミノ酸残基、または保存されたモチーフ内のアミノ酸残基に対して行われることはない。
本発明のタンパク質は、アミノ酸置換、欠失、末端切断および挿入を含めた、さまざまな方法で改変することができる。このような操作の方法は、当技術分野では広く知られている。例えば、AHASLタンパク質のアミノ酸配列変異体は、DNAに突然変異を起こすことによって調製することができる。変異誘発、およびヌクレオチド配列変異の方法は、当技術分野において周知である。例えば、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492；Kunkelら (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382；米国特許第4,873,192号；WalkerおよびGaastra編, (1983) Techniques in Molecular Biology, MacMillan Publishing Company, New York、ならびにそれらに記載の参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない、適当なアミノ酸置換に関する指針は、Dayhoffら (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.のモデルに見出すことができ、これは本明細書に参照により組み入れられる。アミノ酸を、類似した特性を有する他のアミノ酸で交換するなどの、保存的置換が好ましいであろう。
本発明のポリヌクレオチド分子およびポリペプチドが、図1および2に記載の二重もしくは三重ヌクレオチド配列または図1および2に記載のアミノ酸配列と十分に同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸配列を含むものであるポリヌクレオチド分子およびポリペプチドを包含することは認識されている。本明細書で使用する用語「十分に同一な」は、第1と第2のアミノ酸もしくはヌクレオチド配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能的活性を有するようにするために、第2のアミノ酸もしくはヌクレオチド配列と同一または等価の（例えば、類似した側鎖を持つ）アミノ酸残基もしくはヌクレオチドの十分なまたは最小限の数を含有する第1のアミノ酸もしくはヌクレオチド配列を意味する。例えば、少なくとも約80%の同一性、好ましくは85%同一性、より好ましくは90%、95%、もしくは98%の同一性を有する共通の構造ドメインを含有するアミノ酸もしくはヌクレオチド配列を、本明細書で十分に同一であると定義する。
２つのアミノ酸配列もしくは２つの核酸の、同一性パーセントを決定するには、最適な比較を目的としてこれらの配列をアラインメントする。２つの配列間の％同一性は、それらの配列が共有する同一ポジションの数の関数である（すなわち％同一性 = 同一ポジションの数／ポジションの総数（例えば、重複ポジション） x 100）。一実施形態においては、２つの配列は同じ長さである。２つの配列間の％同一性は、ギャップを許容して、または許容せずに、下記と同様の手法を用いて決定することができる。％同一性を計算する際、典型的には正確なマッチを数える。
２つの配列間の％同一性の測定は、数学アルゴリズムを用いて行うことができる。２つの配列の比較のために使用される数学アルゴリズムの、好ましい、限定的でない例は、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムであって、これは、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877のように改良されている。かかるアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403の、NBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチドサーチは、NBLASTプログラムを用いてスコア＝100、ワード長＝12で実行し、本発明のポリヌクレオチド分子に対して相同的なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質サーチは、XBLASTプログラムを用いて、スコア＝50、ワード長＝3で実施し、本発明のタンパク質分子に対して相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップを入れたアラインメントを得るには、Altschulら (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389に記載のように、ギャップ入りBLASTを利用することができる。あるいはまた、PSI-Blastを使用して、分子間の遠い関係を検出する反復サーチを行うことができる。Altschulら(1997)を参照されたい。BLAST、ギャップ入りBLAST、およびPSI-Blastプログラムを使用するとき、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメーターを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。もう一つの好ましい、限定的でない例であって、配列比較のために使用される数学アルゴリズムの例は、MyersおよびMiller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれていて、このプログラムはGCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを使用する場合、PAM120重み残基表、ギャップ長のペナルティ12、およびギャップのペナルティ4を用いることができる。アラインメントはまた、検査によって手動で実施することもできる。
特に断らない限り、本明細書に記載の配列同一性／類似性値は、本発明の全長配列を用いてかつアルゴリズムClustal W (Nucleic Acid Research, 22(22)：4673-4680, 1994)の手法によるマルチプルアラインメントを用いて得た値を意味し、ソフトウエアパッケージVector NTI Suiteバージョン9 （Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad、CA 92008）に含まれたプログラムAlignXを使い、デフォルトパラメーターを使うか；またはそれらと同等のプログラムを使っている。用語「同等のプログラム」は任意の配列比較プログラムであって、問題の任意の２つの配列について、ソフトウエアパッケージVector NTI Suiteバージョン9のAlignXにより作製した対応するアラインメントと比較したとき、同一のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基マッチおよび同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを作製する配列比較プログラムを意図している。
本明細書に含まれるタンパク質配列の欠失、挿入および置換は、タンパク質の特徴の極端な変化を生じないと思われる。しかし、置換、欠失、または挿入の正確な影響を事前に予測することが困難である場合、その影響は通常のスクリーニングアッセイによって評価しうることを当業者は十分理解するであろう。すなわち、活性はAHAS活性アッセイによって評価することができる。例えば、Singhら (1988) Anal. Biochem. 171:173-179（本明細書に参照により組み入れられる）を参照されたい。
本明細書に開示したように、本発明のポリヌクレオチドは、そのゲノム中に除草剤抵抗性AHASLタンパク質をコードする遺伝子を含む植物の除草剤耐性を高める上での用途を見出す。かかる遺伝子は内因性遺伝子またはトランスジーンであってもよい。さらにある特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドを、所望の表現型をもつ植物を作製するために、目的のポリヌクレオチド配列と任意に組合わせてスタックすることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを、農薬および／または殺虫剤活性を有するポリペプチド、例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）菌毒素タンパク質などをコードする任意の他のポリヌクレオチド（米国特許第5,366,892号；第5,747,450号；第5,737,514号；第5,723,756号；第5,593,881号およびGeiserら (1986) Gene 48：109に記載）と共にスタックすることができる。得られる組合わせはまた、目的のポリヌクレオチドの任意の1つの複数コピーを含むこともできる。
本発明のポリヌクレオチドは植物形質転換用の選択可能なマーカーとしての用途を見出す一方、本発明の発現カセットは形質転換された細胞を選択するための他の選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。選択可能なマーカー遺伝子は、形質転換された細胞もしくは組織を選択するために使用される。マーカー遺伝子には、限定されるものでないが、抗生物質耐性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（NEO）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（HPT）をコードする遺伝子、ならびにグルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、および2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）などの除草剤化合物に対する抵抗性を付与するポリペプチドをコードする遺伝子がある。一般的には、下記を参照されたい：Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511；Christophersonら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318；Yaoら (1992) Cell 71:63-72；Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422；Barkleyら (1980) The Operonより、177-220頁；Huら (1987) Cell 48:555-566；Brownら (1987) Cell 49:603-612；Figgeら (1988) Cell 52:713-722；Deuschleら (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404；Fuerstら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553；Deuschleら (1990) Science 248:480-483；Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg；Reinesら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921；Labowら (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356；Zambrettiら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956；Baimら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076；Wyborskiら (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653；Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162；Degenkolbら (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595；Kleinschnidtら (1988) Biochemistry 27:1094-1104；Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg；Gossenら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551；Olivaら (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919；Hlavkaら (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol.78 (Springer-Verlag, Berlin)；Gillら (1988) Nature 334:721-724。かかる開示は本明細書に参照により組み入れられる。
選択可能なマーカー遺伝子の上記リストは、限定することを意味するものではない。いかなる選択可能なマーカー遺伝子も、本発明において使用することができる。
本発明のAHASLタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子をベクター中に使用して植物を形質転換し、作製される植物が除草剤、特にイミダゾリノン系除草剤またはスルホニルウレア系除草剤に対して高い耐性を持つようにすることができる。単離された本発明のAHASLポリヌクレオチドをベクター中に単独で用いてまたは植物で除草剤抵抗性を付与するAHAS酵素の小サブユニット（AHASS）をコードするヌクレオチド配列と組合わせて使用することができる。米国特許第6,348,643号を参照されたい；これは本明細書に参照により組み入れられる。
本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチド分子に機能しうる形で連結された、植物における発現を駆動するプロモーターを含む、植物発現ベクターにも関する。単離されたポリヌクレオチド分子は、本発明のAHASLタンパク質、またはその機能的断片および変異体をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の植物発現ベクターは特定のプロモーターに依存しない、ただ、プロモーターが植物細胞において遺伝子発現を駆動できればよい。好ましいプロモーターには構成的プロモーターおよび組織選択的プロモーターが含まれる。
本発明の形質転換ベクターを用いて、目的の遺伝子で形質転換された植物を作製することができる。形質転換ベクターは、本発明の選択可能なマーカー遺伝子、および導入されて典型的には形質転換される植物で発現される目的の遺伝子を含むであろう。かかる選択可能なマーカー遺伝子は、AHASL二重または三重変異体ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは宿主細胞における発現を駆動するプロモーターと機能しうる形で連結されている。植物および植物細胞で使用するために、形質転換ベクターは、植物細胞における発現を駆動するプロモーターと機能しうる形で連結されたAHASL二重または三重変異体ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを含む、選択可能なマーカー遺伝子を含む。
本発明の目的の遺伝子は所望する成果に応じて変わる。例えば、様々な表現型の変化が目的であってもよく、それには、植物中の脂肪酸組成物の改変、植物のアミノ酸含量の改変、植物の昆虫および／または病原体防御機構の改変などが含まれる。これらの結果は、植物における異種産物の発現または内因性産物の発現の増加を与えることにより達成することができる。あるいは、その結果は、植物における1以上の内因性産物、特に酵素または補因子の発現の低下を与えることにより達成することができる。これらの変化は形質転換された植物の表現型の変化をもたらす。
本発明の一実施形態において、目的の遺伝子には、例えば、バチルス・チューリンゲンシス菌（Bacillus thuringiensis）毒素タンパク質遺伝子などの昆虫耐性遺伝子が挙げられる（米国特許第5,366,892号；第5,747,450号；第5,736,514号；第5,723,756号；第5,593,881号；および Geiserら (1986) Gene 48：109）。
本発明のAHASLタンパク質またはポリペプチドは、例えば、ヒマワリ植物から精製することができ、それを組成物に使用することができる。また、本発明のAHASLタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド分子を用いて、本発明のAHASLタンパク質を大腸菌または酵母などの微生物に発現させることができる。発現されたAHASLタンパク質は、大腸菌の抽出物から当業者に公知の任意の方法によって精製することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、除草剤耐性植物の抵抗性を高める方法に使用することができる。本発明の一実施形態において、除草剤耐性植物はAHASL二重または三重変異体ポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを含む。本発明はさらに、2以上のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む除草剤耐性植物を提供する。除草剤耐性AHASLタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列および除草剤耐性AHASLタンパク質をコードする内因性遺伝子を含む除草剤耐性植物には、本発明のポリヌクレオチドおよび植物ならびに当技術分野で公知であるものが含まれる。例えば、米国特許第5,013,659号、第5,731,180号、第5,767,361号、第5,545,822号、第5,736,629号、第5,773,703号、第5,773,704号、第5,952,553号、および第6,274,796号を参照されたい。これらは全て本明細書に参照により組み入れられる。かかる除草剤耐性植物の抵抗を高める方法は、本発明のポリヌクレオチドと機能しうる形で連結された植物細胞における発現を駆動するプロモーターを含む少なくとも1つのポリヌクレオチド構築物を用いて、除草剤耐性植物を形質転換するステップを含む。
多数の植物形質転換ベクター、および植物を形質転換する方法が利用可能である。例えば、An, G.ら, (1986) Plant Physiol., 81:301-305；Fry, J.ら, (1987) Plant Cell Rep. 6:321-325；Block, M. (1988) Theor. Appl Genet.76:767-774；Hincheeら, (1990) Stadler. Genet. Symp.203212.203-212；Cousinsら, (1991) Aust. J. Plant Physiol. 18:481-494；Chee, P. P.およびSlightom, J. L. (1992) Gene.118:255-260；Christouら, (1992) Trends. Biotechnol. 10:239-246；D'Halluinら, (1992) Bio/Technol. 10:309-314；Dhirら, (1992) Plant Physiol. 99:81-88；Casasら, (1993) Proc. Nat. Acad Sci. USA 90:11212-11216；Christou, P. (1993) In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant；29P:119-124；Daviesら, (1993) Plant Cell Rep. 12:180-183；Dong, J. A.およびMchughen, A. (1993) Plant Sci. 91:139-148；Franklin, C. I.およびTrieu, T. N. (1993) Plant. Physiol. 102:167；Golovkinら, (1993) Plant Sci. 90:41-52；Guo, Chin Sci. Bull. 38:2072-2078；Asanoら, (1994) Plant Cell Rep. 13；Ayeres N. M.およびPark, W. D. (1994) Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239；Barceloら, (1994) Plant. J. 5:583-592；Beckerら, (1994) Plant. J. 5:299-307；Borkowskaら, (1994) Acta. Physiol Plant. 16:225-230；Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5: 17-27；Eapenら, (1994) Plant Cell Rep. 13:582-586；Hartmanら, (1994) Bio-Technology 12: 919923；Ritalaら, (1994) Plant. Mol. Biol. 24:317-325；ならびにWan, Y. C.およびLemaux, P. G. (1994) Plant Physiol. 104:3748を参照されたい。
本発明の方法は、ポリヌクレオチド構築物を植物に導入することに関わる。用語「導入」は、植物にポリヌクレオチド構築物を付与することであって、その構築物が植物の細胞内部にアクセスするように付与することを意図する。本発明の方法は、ポリヌクレオチド構築物を植物に導入する特定の方法に依存しないが、ただ、そのポリヌクレオチド構築物が植物の少なくとも１つの細胞の内部にアクセスできればよい。ポリヌクレオチド構築物を植物に導入する方法は、当技術分野で公知であり、限定されるものでないが、安定な形質転換法、一過性形質転換法、およびウイルスが介在する方法を包含する。
用語「安定な形質転換」は、植物に導入されたポリヌクレオチド構築物が植物のゲノムに組み込まれ、その子孫によって受け継がれうる形質転換法を意図する。用語「一過性形質転換」は、植物に導入されたポリヌクレオチド構築物が植物のゲノムに組み込まれない、形質転換法を表す。
植物および植物細胞の形質転換のために、本発明のヌクレオチド配列は、標準的技法によって、植物もしくは植物細胞におけるヌクレオチド配列の発現に好適である、当技術分野で公知の任意のベクターに挿入される。ベクターの選択は、好ましい形質転換技法、および形質転換されるべき標的植物の種類によって決まる。本発明のある実施形態において、AHASLヌクレオチド配列は、植物細胞における高レベル発現で知られる植物プロモーターに、機能しうる形で連結されており、この構築物は次いで、イミダゾリノンまたはスルホニルウレア系除草剤に感受性である植物に導入され、形質転換された植物が再生される。形質転換された植物は形質転換されてない植物を枯死させるかまたは有意な障害を与えうるイミダゾリノンまたはスルホニルウレア系除草剤のレベルに対する曝露に対して耐性がある。この方法はいずれの植物種にも適用することができる；しかし、作物植物に適用すると、もっとも有効である。
植物発現カセットを構築し、外来核酸を植物に導入する方法は、当技術分野で広く知られており、従来記載されている。例えば、外来DNAは、腫瘍誘発（Ti）プラスミドベクターを用いて植物に導入することができる。アグロバクテリアに基づく形質転換技法は当技術分野で周知である。アグロバクテリア菌株（例えば、Agrobacterium tumefaciensもしくはAgrobacterium rhizogenes）はプラスミド（TiもしくはRiプラスミド）およびアグロバクテリアによる感染後に植物に伝達されるT-DNAエレメントを含む。T-DNA（導入されるDNA）は植物細胞のゲノム中に組み込まれる。T-DNAをRiもしくはTiプラスミド上に局在化してもよく、またはいわゆるバイナリーベクター中に別々に含ませる。アグロバクテリアが介在する形質転換は、例えば、Horsch RBら (1985) Science 225：1229fに記載されている。アグロバクテリアが介在する形質転換は双子葉植物と単子葉植物の両方に利用することができる。アグロバクテリアによる植物の形質転換は、White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；Vol. 1, Engineering and Utilization, S.D. KungおよびR. Wu 編, Academic Press, 1993, pp. 15 - 38；Jenes Bら, (1993) Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, S.D. KungおよびR. Wu 編, Academic Press, pp. 128-143；Potrykus, (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225に記載されている。外来DNA送達に使用される他の方法は、PEG介在性プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、顕微注入ウィスカー、ならびにDNAの直接取り込みのための遺伝子銃（biolistics）もしくは微粒子銃（microprojectile）の使用に関わる。かかる方法は当技術分野で公知である。（Vasilらの米国特許第5,405,765号；Bilangら (1991) Gene 100: 247-250；Scheidら (1991) Mol. Gen. Genet., 228: 104-112；Guercheら (1987) Plant Science 52: 111-116；Neuhauseら (1987) Theor. Appl Genet. 75: 30-36；Kleinら (1987) Nature 327: 70-73；Howellら (1980) Science 208:1265；Horschら (1985) Science 227: 1229-1231；DeBlockら (1989) Plant Physiology 91: 694-701；Methods for Plant Molecular Biology (WeissbachおよびWeissbach編) Academic Press, Inc. (1988)；ならびにMethods in Plant Molecular Biology (SchulerおよびZielinski編) Academic Press, Inc. (1989)を参照されたい）。形質転換の方法は、形質転換すべき植物細胞、使用するベクターの安定性、遺伝子産物の発現レベルおよび他のパラメーターに依存する。
植物細胞にヌクレオチド配列を導入し、続いて植物ゲノムに挿入する、他の適当な方法としては、マイクロインジェクション（Crosswayら (1986) Biotechniques 4:320 334に記載）；エレクトロポレーション（Riggsら (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602 5606,に記載）；アグロバクテリウム介在性形質転換（Townsendら(米国特許第5,563,055号)およびZhaoら(米国特許第5,981,840号に記載）；遺伝子直接導入（Paszkowskiら (1984) EMBO J. 3:2717 2722に記載）；ならびに弾道粒子加速（例えば、Sanfordら(米国特許第4,945,050号)、Tomesら(米国特許第5,879,918号)、Tomesら(米国特許第5,886,244号)、Bidneyら(米国特許第5,932,782号)、Tomesら (1995) “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment,” in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, GamborgおよびPhillips編、Springer-Verlag, Berlin；McCabeら (1988) Biotechnology 6:923 926；およびLec1形質転換(国際公開第WO 00/28058号)に記載）が挙げられる。またWeissingerら (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 477；Sanfordら (1987) Particulate Science and Technology 5:27 37 (タマネギ)；Christouら (1988) Plant Physiol. 87:671 674 (ダイズ)；McCabeら (1988) Bio/Technology 6:923 926 (ダイズ)；FinerおよびMcMullen, 1991, In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (ダイズ)；Singhら (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (ダイズ)；Dattaら (1990) Biotechnology 8:736 740 (イネ)；Kleinら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305 4309 (トウモロコシ)；Kleinら (1988) Biotechnology 6:559 563 (トウモロコシ)；Tomes, 米国特許第5,240,855号；Buisingら、米国特許第5,322,783号および第5,324,646号；Tomesら (1995) “Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment,” in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, Gamborg編、Springer-Verlag, Berlin, (トウモロコシ)；Kleinら (1988) Plant Physiol. 91:440 444 (トウモロコシ)；Frommら (1990) Biotechnology 8:833 839 (トウモロコシ)；Hooykaas-Van Slogterenら (1984) Nature (London) 311:763-764；Bowenら、米国特許第 5,736,369号(穀物)；Bytebierら (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (ユリ科)；De Wetら (1985) The Experimental Manipulation of Ovule Tissuesより、Chapmanら編、Longman, NY, pp. 197-209 (花粉)；Kaepplerら (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 およびKaepplerら (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (ウィスカーによる形質転換)；D'Halluinら (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (エレクトロポレーション)；Liら (1993) Plant Cell Reports 12:250-255およびChristouおよびFord (1995) Annals of Botany 75:407-413 (イネ)；Osjodaら (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (トウモロコシ、Agrobacterium tumefaciensによる)も参照されたい；これらはすべて本明細書に参照により組み入れられる。
本発明のポリヌクレオチドは、植物をウイルスもしくはウイルス核酸と接触させることによって植物に導入してもよい。一般に、かかる方法は、本発明のポリヌクレオチド構築物をウイルスDNAもしくはRNA分子内に組み込むことに関わる。本発明のAHASLタンパク質を最初にウイルスポリタンパク質の一部として合成し、後に、in vivoもしくはin vitroでタンパク質加水分解により処理して所望の組換えタンパク質を作製することができるのは認識されている。さらに、本発明のプロモーターはまた、ウイルスRNAポリメラーゼによる転写に利用されるプロモーターも包含することは認識されている。ポリヌクレオチド構築物を植物に導入してそれにコードされたタンパク質を発現させる、ウイルスDNAもしくはRNA分子に関わる方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第5,889,191号、第5,889,190号、第5,866,785号、第5,589,367号および第5,316,931号を参照されたい；これらは本明細書に参照により組み入れられる。
形質転換された細胞を、従来の方法に従って、植物に生長させることができる。例えば、McCormickら、1986, Plant Cell Reports 5:81-84を参照されたい。次いでこれらの植物を生長させて、同じ形質転換株、もしくは異なる株で受粉させ、その結果得られる、所望される表現型の特徴の構成的発現を示す雑種を同定することができる。２世代以上生育させて、所望される表現型の特徴の発現が安定して維持されかつ受け継がれることを確実にし、次いで種子を収穫して、所望される表現型の特徴の発現が達成されていることを確実にすることができる。このようにして、本発明は、安定してそのゲノムに組み込まれた本発明のポリヌクレオチド構築物、例えば本発明の発現カセットを有する、形質転換された種子（「トランスジェニック種子」とも称される）を提供する。
本発明は、限定されるものでないが、単子葉植物および双子葉植物を含む、いかなる植物種の形質転換にも使用することができる。目的の植物種の例としては、限定されるものでないが、コーンもしくはトウモロコシ（Zea mays）、アブラナ属（Brassica sp）（例えば、セイヨウアブラナ（B. napus）、アブラナ（B. rapa）、カラシナ（B. juncea））、特に種子油の起源として有用なアブラナ属、アルファルファ（Medicago sativa）、イネ（Oryza sativa）、ライムギ（Secale cereale）、モロコシ（Sorghum bicolor, Sorghum vulgare）、雑穀（例えば、トウジンビエ（Pennisetum glaucum）、キビ（Panicum miliaceum）、アワ（Setaria italica）、シコクビエ（Eleusine coracana））、ヒマワリ（Helianthus annuus）、ベニバナ（Carthamus tinctorius）、コムギ（Triticum aestivum、T. turgidum ssp. durum）、ダイズ（Glycine max）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ラッカセイ（Arachis hypogaea）、ワタ（Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum）、サツマイモ（Ipomoea batatas）、キャッサバ（Manihot esculenta）、コーヒーノキ（Coffea spp.）、ココナツ（Cocos nucifera）、パイナップル（Ananas comosus）、柑橘類（Citrus spp.）、カカオノキ（Theobroma cacao）、チャノキ（Camellia sinensis）、バナナ（Musa spp.）、アボカド（Persea americana）、イチジク（Ficus casica）、バンジロウ（Psidium guajava）、マンゴー（Mangifera indica）、オリーブ（Olea europaea）、パパイヤ（Carica papaya）、カシュー（Anacardium occidentale）、マカダミア（Macadamia integrifolia）、アーモンド（Prunus amygdalus）、サトウダイコン（Beta vulgaris）、サトウキビ（Saccharum spp.）、オートムギ、オオムギ、野菜、観賞植物、および針葉樹が挙げられる。好ましくは、本発明の植物は、作物植物（例えば、ヒマワリ、アブラナ属、ワタ、サトウダイコン、ダイズ、ピーナッツ、アルファルファ、ベニバナ、タバコ、トウモロコシ、イネ、コムギ、ライムギ、オオムギライコムギ、モロコシ、雑穀など）である。
本発明の植物は除草剤抵抗性植物であり、従って、除草剤の施用に関わる雑草を防除する方法において用途が見出される。従って、本発明はさらに、本発明の除草剤抵抗性植物の周辺の雑草を防除する方法を提供する。本方法は、雑草と除草剤耐性植物に対して除草剤の有効量を施用するステップであって、前記植物が、野生型植物と比較すると、少なくとも1種のAHAS阻害性除草剤、特にイミダゾリノンまたはスルホニルウレア系除草剤に対して強められた抵抗性を有することを特徴とする前記ステップを含む。雑草を防除するかかる方法において、本発明の除草剤抵抗性植物は、好ましくは、作物植物であり、それには、限定されるものでないが、ヒマワリ、アルファルファ、アブラナ属、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ピーナッツ、タバコ、トマト、ジャガイモ、コムギ、イネ、トウモロコシ、モロコシ、オオムギ、ライムギ、雑穀、およびモロコシが含まれる。
除草剤、特にイミダゾリノンおよびスルホニルウレア系除草剤に対する強められた抵抗性を有する植物を提供することにより、植物を雑草から保護するために、様々な製剤を使用して植物生長を促進しかつ栄養分に対する競合を低減することができる。出芽前、出芽後、定植前またはおよび定植時の雑草を防除するために、除草剤それ自体、または他の添加剤を含有するイミダゾリノン系除草剤製剤を、本明細書に記載の植物周辺領域に用いることができる。除草剤はまた、種子処理として用いることもできる。イミダゾリノンまたはスルホニルウレア系除草剤製剤中に見出される添加剤には、他の除草剤、界面活性剤、アジュバント、延展剤、粘着剤、安定化剤などが含まれる。除草剤製剤は、湿性または乾性調製物であってもよく、限定されるものでないが、流動性粉末、乳濁化性濃縮物および液濃縮物を含んでもよい。除草剤および除草剤製剤は、通常の方法で、例えば、噴霧、灌水、散粉などにより施用することができる。
本発明は、少なくとも1種の除草剤、特にAHAS阻害性除草剤、さらに特にイミダゾリノンおよびスルホニルウレア系除草剤、最も特にイミダゾリノン系除草剤に対して強められた耐性をもつ非トランスジェニックおよびトランスジェニック植物および種子を提供する。本発明の好ましい実施形態において、本発明の植物および種子は、ただ1つのAHASL単一変異体ポリペプチドを含む類似した植物より高いレベルの除草剤耐性を提示する。かかる本発明の植物および種子は、雑草を防除する方法の改善に用途を見出し、ただ1つのAHASL単一変異体ポリペプチドを含む類似した植物で使用できるより高い除草剤濃度または施用率を含む有効量にて除草剤の雑草へおよび除草剤耐性植物への施用を可能にする。従って、かかる改良された方法は、ただ1つのAHASL単一変異体ポリペプチドを含む植物およびより低い除草剤濃度または施用率の施用に関わる現存の方法と比較すると、優れた雑草防除を提供する。
本発明は、AHASL二重または三重変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む除草剤抵抗性植物および2以上のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む除草剤抵抗性植物を提供する。これらの本発明の除草剤抵抗性植物は、有性生殖に関わる通常の植物繁殖を介して除草剤抵抗性植物を作製する方法に用途を見出す。本方法は、本発明の除草剤抵抗性植物である第1の植物を除草剤に対して抵抗性の無い第2の植物と交雑するステップを含む。第2の植物は、第1の植物と交雑したときに、生存可能な子孫植物（例えば、種子）を作製できるいずれの植物であってもよい。典型的には、必ずしもそうではないが、第1と第2の植物は同じ種である。その方法は、場合によっては、第1の植物の、AHASL変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは2以上のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む子孫植物を選択するステップに関わりうる。本発明の方法はさらに、第1の交雑の子孫植物と第1または第2の植物の同じ系統または遺伝形質の植物との、1以上の世代の戻し交雑（backcrossing）に関わりうる。あるいは、第1の交雑またはいずれかのその後の交雑の子孫を、第1または第2の植物とは異なる系統または遺伝形質である第3の植物と交雑することができる。
AHASL二重または三重変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む本発明の除草剤抵抗性植物および2以上のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む除草剤抵抗性植物はまた、有性生殖に関わる通常の植物繁殖を介して植物の除草剤抵抗性を強める方法にも用途を見出す。本方法は、本発明の除草剤抵抗性植物である第1の植物を、第1の植物と同じ除草剤に抵抗性が有っても無くてもよいまたは第1の植物と異なる除草剤に抵抗性が有りうる第2の植物と交雑するステップを含む。第2の植物は、第1の植物と交雑すると、生存可能な子孫植物（例えば、種子）を作製できるいずれの植物であってもよい。典型的には、必ずしもそうではないが、第1と第2の植物は同じ種である。その方法は、場合によっては、第1の植物のAHASL変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは2以上のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびに第2の植物の除草剤抵抗性の特徴を含む子孫植物を選択するステップに関わりうる。本発明のこの方法により作製された子孫植物は、第1または第2の植物のいずれかまたは両方と比較すると、除草剤に対して強められた抵抗性を有する。第1と第2の植物が異なる除草剤に対して抵抗性があると、その子孫植物は第1と第2の植物の組合わせられた除草剤耐性の特徴を有しうる。本発明の方法はさらに、第1の交雑の子孫植物と第1または第2の植物の同じ系統または遺伝形質の植物との、1以上の世代の戻し交雑（backcrossing）に関わりうる。あるいは、第1の交雑またはいずれかのその後の交雑の子孫を、第1または第2の植物とは異なる系統または遺伝形質である第3の植物と交雑することができる。
本発明はまた、少なくとも1つの本発明のポリヌクレオチド分子、発現カセット、または形質転換ベクターによって形質転換された植物、植物器官、植物組織、植物細胞、種子、および非ヒト宿主細胞も提供する。かかる形質転換された植物、植物器官、植物組織、植物細胞、種子、および非ヒト宿主細胞は、少なくとも1種の除草剤に対して、形質転換されてない植物、植物組織、植物細胞、種子、または非ヒト宿主細胞をそれぞれ枯死または阻害する除草剤のレベルで、強められた耐性もしくは抵抗性を有する。好ましくは、本発明の形質転換される植物、植物組織、植物細胞、および種子はシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）および作物植物である。
本発明は、イミダゾリノン系除草剤、スルホニルウレア系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、ピリミジニルオキシベンゾアート系除草剤、スルホニルアミノ-カルボニルトリアゾリノン系除草剤、およびそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも1種のAHAS阻害性除草剤の使用に関わる方法を提供する。これらの方法においては、AHAS阻害性除草剤を、限定されるものでないが、種子処理、土壌処理、および葉処理を含む、いずれかの当技術分野で公知の方法により施用することができる。
施用前に、AHAS阻害性除草剤を通例の製剤、例えば溶液、乳剤、懸濁液、ダスト、粉末、ペーストおよび顆粒に変換することができる。使用剤形は特定の意図する目的に依存し、どの場合にも、本発明による化合物の緻密かつ均等な分布を確実にするべきである。
製剤は公知の方法で調製されるのであって（例えば、総括についてUS 3,060,084、EP-A 707 445 （液濃縮物について）、Browning, ”Agglomeration”, Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48、Perry’s Chemical Engineer’s Handbook, 第4版, McGraw-Hill, New York, 1963, pp.8-57および下記参照、WO 91/13546、US 4,172,714、US 4,144,050、US 3,920,442、US 5,180,587、US 5,232,701、US 5,208,030、GB 2,095,558、US 3,299,566、Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961、Hanceら Weed Control Handbook, 第8版, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989、および Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim （Germany）, 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 （ISBN 0-7514-0443-8）を参照）、例えば、活性化合物を農芸化学品の製剤に好適な助剤、例えば、溶媒および／または担体を用いて伸展し、所望であれば、乳化剤、界面活性剤および分散化剤、保存剤、消泡剤、凍結防止剤、種子治療製剤については、場合によっては、着色剤および／または結合剤および／またはゲル化剤を加える。
好適な溶媒の例は水、芳香族溶媒（例えばSolvessoの製品であるキシレン）、パラフィン類（例えば石油留分）、アルコール類（例えばメタノール、ブタノール、ペンタノール、ベンジルアルコール）、ケトン類（例えば、シクロヘキサノン、γ-ブチロラクトン）、ピロリドン類（NMP、NOP）、酢酸エステル類（二酢酸グリコール）、グリコール類、脂肪酸ジメチルアミド類、脂肪酸類、および脂肪酸エステル類である。基本的には、溶媒混合物も使用することができる。
好適な担体の例は、粉砕天然鉱物（例えばカオリン、クレイ、タルク、チョーク）および粉砕合成鉱物（例えば高分散性シリカ、ケイ酸塩）である。
好適な乳化剤は、非イオン性および陰イオン性乳化剤（例えば、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、アルキルスルホネート、およびアリールスルホネート）である。
分散剤の例は、亜硫酸パルプ廃液およびメチルセルロースである。
使用される好適な界面活性剤は、リグノスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、フェノールスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、およびアンモニウム塩；アルキルアリールスルホネート、硫酸アルキル、スルホン酸アルキル、脂肪アルコール硫酸エステル；脂肪酸；および硫酸化脂肪アルコールグリコールエーテル；さらにはスルホン化ナフタレンおよびナフタレン誘導体とホルムアルデヒドの縮合物、ナフタレンまたはナフタレンスルホン酸とフェノールおよびホルムアルデヒドとの縮合物；ポリオキシエチレンオクチルフェノールエーテル；エトキシル化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール；アルキルフェノールポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、トリステアリルフェニルポリグリコールエーテル；アルキルアリールポリエーテルアルコール；アルコールと脂肪アルコール、エチレンオキシドの縮合物；エトキシル化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エトキシル化ポリオキシプロピレン、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセタール、ソルビトールエステル、リグニン亜硫酸廃液、およびメチルセルロースである。
直接散布可能な溶液、乳液、ペースト、またはオイル分散液を調製するのに適している材料は：中〜高沸点の石油留分、例えばケロシンおよびディーゼル油、さらにはコールタール油ならびに植物または動物由来の油；脂肪族、環式および芳香族炭化水素、例えばトルエン、キシレン、パラフィン、テトラヒドロナフタレン、アルキル化ナフタレンまたはそれらの誘導体；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、シクロヘキサノール、シクロヘキサノン、イソホロン、強極性溶剤、例えばジメチルスルホキシド、N-メチルピロリドン、または水である。
凍結防止剤、例えば、グリセリン、エチレン グリコール、プロピレングリコールおよび殺細菌剤も製剤に加えることができる。
好適な消泡剤は、例えば、ケイ素またはマグネシウムステアリン酸エステル系の消泡剤である。
好適な保存剤は、例えば、ジクロロフェノールおよびベンジルアルコールヘミホルムアルデヒドである。
種子処理製剤はさらに、結合剤および任意に着色剤を含んでもよい。
結合剤を加えて、処理後の種子への活性材料の接着を改善してもよい。好適な結合剤は、ブロックコポリマーEO/PO界面活性剤、またポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリブテン、ポリイソブチレン、ポリスチレン、ポリエチレンアミン、ポリエチレンアミド、ポリエチレンイミン（Lupasol(登録商標)、Polymin(登録商標)）、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、チローゼおよびこれらのポリマー由来のコポリマーである。
場合によっては、着色剤を製剤に含ませてもよい。種子処理製剤用の好適な着色剤または染料は、ローダミンB、C.I.ピグメントレッド112、C.I.ソルベントレッド1、ピグメントブルー15：4、ピグメントブルー15：3、ピグメントブルー15：2、ピグメントブルー15：1、ピグメントブルー80、ピグメントイェロー1、ピグメントイェロー13、ピグメントレッド112、ピグメントレッド48：2、ピグメントレッド48：1、ピグメントレッド57：1、ピグメントレッド53：1、ピグメントオレンジ43、ピグメントオレンジ34、ピグメントオレンジ5、ピグメントグリーン36、ピグメントグリーン7、ピグメントホワイト6、ピグメントブラウン25、ベーシックバイオレット10、ベーシックバイオレット49、アシッドレッド51、アシッドレッド52、アシッドレッド14、アシッドブルー9、アシッドイェロー23、ベーシックレッド10、ベーシックレッド108である。
好適なゲル化剤の一例はカラギナン（Satiagel(登録商標)）である。
粉末、散布用材料、および散粉可能製品は、活性物質を固体担体と一緒に同時に混合または粉砕することにより調製することができる。
粒剤、例えば被覆粒剤、含浸粒剤および均質粒剤は、本活性化合物を固体担体と結合することにより調製できる。固体担体の例は、鉱物質土類、例えば、シリカゲル、ケイ酸塩、タルク、カオリン、アタクレー（attaclay）、石灰石、石灰、チョーク、膠灰粘土、黄土、粘土、ドロマイト、ケイ藻土、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、粉砕した合成材料など、肥料、例えば、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素など、および植物由来の産物、例えば、穀粉、樹皮粉、木粉および堅果殻粉、セルロース粉末、ならびにその他の固体担体である。
一般的に、製剤は0.01〜95重量％、好ましくは0.1〜90重量％のAHAS阻害性除草剤を含む。この場合、AHAS阻害性除草剤は、90〜100重量％、好ましくは95〜100重量％の純度（NMRスペクトルによる）で使用される。種子処理用にはそれぞれの製剤を２〜10倍に希釈して、即使用可能製剤の濃度の0.01〜60重量％、好ましくは0.1〜40重量％活性化合物に調節することができる。
AHAS阻害性除草剤はそのままその製剤の剤形で、またはそれから調製した使用剤形で、例えば、直接噴霧可能な溶液、粉剤、懸濁剤もしくは分散剤、乳剤、油分散剤、ペースト、散粉可能製品、散布用物質、または粒剤の剤形で、噴霧、アトマイズ、散粉、散布または灌注の方法により使うことができる。使用剤形は、全く、意図する目的に応じるものであり；いずれの場合にも、本発明によるAHAS阻害性除草剤のできるだけ微細な分布を確実にすることを意図する。
水性使用剤形は、乳剤濃縮物、ペーストまたは水和性粉剤（噴霧可能な粉剤、油分散剤）から、水を加えることにより調製することができる。乳剤、ペーストまたは油分散剤を調製するためには、当該物質をそのまま、または油もしくは溶媒に溶解して、水中で湿潤剤、粘着付与剤、分散化剤または乳化剤を用いてホモジナイズしてもよい。しかし、活性物質、湿潤剤、粘着付与剤、分散化剤または乳化剤および、適宜、溶媒または油から構成される濃縮物を調製することも可能であり、かかる濃縮物は水を用いて希釈するのに好適である。
直ぐ使用できる調製物の活性成分濃度は、比較的広い範囲で変えることができる。一般的にそれらは、0.0001〜10重量％、好ましくは0.01〜1重量％である。
AHAS阻害性除草剤はまた、超微量散布法（ULV）で首尾よく使用することもでき、95重量％を超える活性化合物を含有する製剤、または無添加物の活性化合物製剤ですら施用することができる。
次は製剤の例である：
１ 水で希釈して葉に施用する用製品。種子処理の目的では、かかる製品を希釈してまたは無希釈で種子に施用することができる。
A) 水溶性濃縮物（SL、LS）
AHAS阻害性除草剤の10重量部を水または水溶性溶媒の90重量部を用いて溶解する。代わりの方法として、湿潤剤または他の助剤を加える。AHAS阻害性除草剤は水を用いて希釈すると溶解し、この場合、AHAS阻害性除草剤の10％(w/w)製剤を得る。
B) 分散性濃縮物（DC）
AHAS阻害性除草剤の20重量部をシクロヘキサノンの70重量部中に、分散化剤、例えばポリビニルピロリドンの10重量部を加えて溶解する。水を用いて希釈すると分散液を得て、この場合、AHAS阻害性除草剤20％(w/w)の製剤が得られる。
C) 乳濁性濃縮物（EC）
AHAS阻害性除草剤の15重量部をキシレンの7重量部中に、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウムおよびエトキシル化ヒマシ油（それぞれ5重量部）を加えて溶解する。水を用いて希釈すると乳剤を得て、この場合、AHAS阻害性除草剤15％(w/w)の製剤が得られる。
D) 乳剤（EW、EO、ES）
AHAS阻害性除草剤の25重量部をキシレンの35重量部中に、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウムおよびエトキシル化ヒマシ油（それぞれ5重量部）を加えて溶解する。この混合物を、乳濁化装置（例えば、Ultraturrax）を用いて水の30重量部中に加え、そして均質な乳剤を作る。水を用いて希釈すると乳剤を得て、この場合、AHAS阻害性除草剤25％(w/w)の製剤が得られる。
E) 懸濁液（SC、OD、FS）
攪拌式ボールミル中で、AHAS阻害性除草剤の20重量部を、分散化剤および湿潤剤の10重量部および水または有機溶媒の70重量部を加えて粉砕し、微細なAHAS阻害性除草剤を得る。水を用いて希釈するとAHAS阻害性除草剤の安定な懸濁液を得て、この場合、AHAS阻害性除草剤20％(w/w)の製剤が得られる。
F) 水分散性粒剤および水溶性粒剤（WG、SG）
AHAS阻害性除草の50重量部を、分散化剤および湿潤剤の50重量部を加えて微細に粉砕し、そして技術的装置（例えば、押出機、スプレー塔、流動床）を用いて水分散性または水溶性粒剤を作る。水を用いて希釈すると、AHAS阻害性除草剤の安定な分散液または溶液が得られ、この場合、AHAS阻害性除草剤50％(w/w)の製剤が得られる。
G) 水分散性粉剤および水溶性粉剤（WP、SP、SS、WS）
AHAS阻害性除草剤の75重量部を、分散化剤、湿潤剤およびシリカゲルの25重量部を加えてローター-ステーターミルで粉砕する。水を用いて希釈すると、AHAS阻害性除草剤の安定な分散液または溶液が得られ、この場合、AHAS阻害性除草剤75％(w/w)の製剤が得られる。
H) ゲル製剤（GF）
攪拌式ボールミル中で、AHAS阻害性除草剤の20重量部を、分散化剤の10重量部、ゲル化剤湿潤剤の1重量部および水または有機溶媒の70重量部を加えて粉砕し、微細なAHAS阻害性除草剤懸濁液を得る。水を用いて希釈するとAHAS阻害性除草剤の安定な懸濁液を得られ、この場合、AHAS阻害性除草剤20％(w/w)の製剤が得られる。
このゲル製剤は種子処理用に好適である。
２ 無希釈で葉に施用する製品。 種子処理の目的では、かかる製品を希釈して種子に施用することができる。
A) 散粉可能な粉剤（DP、DS）
AHAS阻害性除草剤の5重量部を微細に粉砕して、微細に粉砕したカオリン95重量部と密接に混合する。この場合、AHAS阻害性除草剤5％(w/w)を有する散粉可能な製品が得られる。
B 粒剤（GR、FG、GG、MG）
AHAS阻害性除草剤の0.5重量部を、微細に粉砕して担体の99.5重量部と配合し、この場合、AHAS阻害性除草剤0.5％(w/w)の製剤が得られる。現行の方法は押出、スプレー乾燥または流動床である。この場合、無希釈で葉に施用する粒剤が得られる。
慣用の種子処理製剤としては、例えば、流動性濃縮物FS、溶液LS、乾処理用の粉剤DS、スラリー処理用の水分散性粉剤WS、水溶性粉剤SSおよび乳剤ESおよびECおよびゲル製剤GFが挙げられる。これらの製剤は、希釈してまたは無希釈のまま、種子に施用することができる。種子への施用は、播種前にまたは直接種子に行うことができる。
ある好ましい実施形態においては、FS製剤を種子処理用に用いる。典型的には、FS製剤は、1〜800g/lの活性成分、1〜200g/lの界面活性剤、0〜200g/lの凍結防止剤、0〜400g/lの結合剤、0〜200g/lの顔料および1リットル以下の溶媒、好ましくは水を含む。種子処理については、本発明による除草剤耐性植物の種子は、除草剤、好ましくは、AHAS阻害性除草剤、例えば、アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、クロルスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメツルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロン、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、イマザスルフロン、ヨードスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロン、ニコスルフロン、オキサスルフロン、プリミスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフロキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリトスルフロン、イマザメタベンズ、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、クロランスラム、ジクロスラム、フルオラスラム、フルメトスラム、メトスラム、ペノキシスラム、ビスピリバック、ピリミノバック、プロポキシカルバゾン、フルカルバゾン、ピリベンゾキシム、ピリフタリド、ピリチオバック、およびそれらの混合物からなる群より選択される除草剤を用いて、またはAHAS阻害性除草剤を含む製剤を用いて処理する。
用語「種子処理」は当技術分野で公知の全ての好適な種子処理技法、例えば、種子包帯、種子被覆、種子散粉、種子浸漬および種子ペレット化を含む。
本発明の変異体による本発明のさらなる目的は、土壌を、特に種子穿孔中への施用：組成物／製剤（例えば、粒状製剤、場合によっては1以上の固体または液体の農学的に許容される担体を用いたおよび／または場合によっては1以上の農学的に許容される界面活性剤を用いた）としてのAHAS阻害性除草剤を含有粒状製剤のいずれかの施用によって処理する方法である。この方法は、例えば、禾穀、トウモロコシ、ワタ、およびヒマワリの苗床で使用すると有利である。
本発明はまた、次の除草剤からなる群より選択される、少なくとも1種のAHAS阻害性除草剤を含む種子処理製剤を用いて被覆したまたは含有する種子も含むものである：アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、クロルスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメツルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロン、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、イマザスルフロン、ヨードスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロン、ニコスルフロン、オキサスルフロン、プリミスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、リムスルフロン、スルホメツロン、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフロキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリトスルフロン、イマザメタベンズ、イマザモックス、イマザピック、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、クロランスラム、ジクロスラム、フルオラスラム、フルメトスラム、メトスラム、ペノキシスラム、ビスピリバック、ピリミノバック、プロポキシカルバゾン、フルカルバゾン、ピリベンゾキシム、ピリフタリドおよびピリチオバック。
用語「種子」は、種子および全ての種類の植物ムカゴを包含し、それには、限定されるものでないが、真の種子、種子片、地下ほふく枝、球茎、球根、果実、塊茎、子実、切片、切断枝などが含まれ、好ましい一実施形態では真の種子を意味する。
用語「被覆したおよび／または含有する」は一般的に、施用の時点において、活性成分の大部分が繁殖産物の表面上にあるが、当該成分の一部分は、施用の方法に応じて、多かれ少なかれ繁殖産物中に貫入しうることを意味する。前記繁殖産物は(再)植付けされると、その活性成分を吸収することができる。
AHAS阻害性除草剤またはAHAS阻害性除草剤を含む製剤による種子処理の施用は、植物の播種前および植物の発芽前に噴霧または散粉することにより行われる。
種子の処理においては、対応する製剤を、AHAS阻害性除草剤またはAHAS阻害性除草剤を含む製剤の有効量を用いて種子を処理することにより施用する。ここで、施用率は一般的に種子100kg当たりa.i.（AHAS阻害性除草剤の略称）（またはa.i.の混合物または製剤）0.1g〜10kg、好ましくは種子100kg当たり1g〜5kg、特に種子100kg当たり1g〜2.5kgである。レタスなどの特定の作物では、施用率がもっと高くてもよい。
本発明は、望ましくない植生を駆除するまたは雑草を防除する方法であって、本発明による抵抗性植物の種子を、播種前および／または出芽後に、AHAS阻害性除草剤と接触させるステップを含んでなる前記方法を提供する。本方法はさらに、種子を、例えば、圃場の土壌にまたは温室内の鉢植え土に播くステップを含む。本方法は、種子のすぐ周辺の望ましくない植生を駆除するかまたは雑草を防除する上での特別な用途を見出す。
望ましくない植生の防除は、雑草の枯死および／または別な見方では雑草の正常な生長を遅延または阻害することを意味すると解釈される。雑草は、最も広い意味で、望ましくない場所で生長する全ての植物と解釈される。
本発明の雑草には、例えば、双子葉類および単子葉類の雑草が含まれる。双子葉類の雑草には、限定されるものでないが、次の属の雑草が含まれる：シロガラシ属、マメグンバイナズナ属、ヤエムグラ属、ハコベ属、シカギク属、カミツレ属、ハキダメギク属、アカザ属、イラクサ属、キオン属、ヒユ属、スベリヒユ属、オナモミ属、セイヨウヒルガオ属、サツマイモ属、タデ属、ツノクサネム属、ブタクサ属、アザミ属、ヒレアザミ属、ハチジョウナ属、ナス属、イヌガラシ属、キカシグサ属、アゼナ属、オドリコソウ属、クワガタソウ属、イチビ属、イヌスイバ属、チョウセンアサガオ属、スミレ属、チシマオドリコソウ属、ケシ属、ヤグルマギク属、シャジクソウ属、キンポウゲ属、およびタンポポ属。単子葉類の雑草には、限定されるものでないが、次の属の雑草が含まれる：ヒエ属、エノコログサ属、キビ属、メヒシバ属、アワガエリ属、イチゴツナギ属、ウシノケグサ属、オヒシバ属、ニクキビ属、ドクムギ属、スズメノチャヒキ属、オートムギ属、カヤツリグサ属、モロコシ属、カモジグサ属、ギョウギシバ属、ミズアオイ属、テンツキ属、オモダカ属、ハリイ属、ホタルイ属、スズメノヒエ属、カモノハシ属、ナガボノウルシ属、タツノツメガヤ属、コヌカグサ属、スズメノテッポウ属、およびセイヨウヌカボ属。
さらに、本発明の雑草には、例えば、望ましくない位置に生長している作物植物が含まれうる。例えば、主にダイズ植物を栽培する圃場に存在する自生トウモロコシ植物は、もしトウモロコシ植物がダイズ植物の圃場内で望ましくなければ、雑草とみなされうる。
本明細書においては、冠詞「1つの（aまたはan）」を使って、その冠詞の文法上の対象の1以上を意味する。例えば、「1つのエレメント」は1以上のエレメントを意味する。
本明細書で使用する用語「含む（comprising）」またはその変化語、例えば「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などは、言及したエレメント、整数またはステップ、またはエレメント、整数またはステップのグループを包含することを意味するが、いずれの他のエレメント、整数またはステップ、またはエレメント、整数またはステップのグループを排除することを意味しないと解釈されうる。
以下の実施例は、説明として提供されるものであって、限定として提供されるものでない。当業者に起こる、例示した方法のいずれの変化も、本発明の範囲内に包含されると考えている。
（実施例１）
シロイヌナズナ（Arabidopsis）AHASL変異体遺伝子を含有するベクター
全AHAS大サブユニット遺伝子ならびにいくつかのさらなるDNAを含有する（5'および3'末端のXbaI部位を含む）Arabidopsis thalianaゲノムDNAの全XbaI断片を、配列番号34(AtAHASL)に示す。配列番号34の塩基2484〜4496は、Arabidopsis thaliana AHAS大サブユニット遺伝子セリン653トレオニン変異体対立遺伝子のコード配列（配列番号30に示した停止コドンを含む）を包含する。配列番号34の塩基2484〜5717に包含される、配列番号33に示したArabidopsis thaliana AHAS大サブユニット遺伝子セリン653トレオニン変異体対立遺伝子のより小さいゲノム断片は、コード配列および3'末端（3'末端XbalI部位を含めてそれまで）、ならびに明確にするために左に切り離されたAtAHASLの出発コドンに見出されるNcoI部位の最初の2塩基を含む。
全長シロイヌナズナAHASL単一の突然変異S653Nおよび3'非翻訳領域をコードする配列番号33のDNA断片を、pKK233-2中にクローニングして呼称AE1のベクターを得て、これを大腸菌で発現して試験した（pKK233-2は細菌発現ベクター、Pharmacia、GenBank Accession No. X70478である）。ベクターAE2〜AE9を、AE1から変異誘発および標準のクローニング手順により作製した。図4は、AE1ベースベクターのマップであり、突然変異の位置が示されている。
ベクターAP1（図5）は植物形質転換ベクターであり、単一S653N突然変異を伴うAtAHASL遺伝子（配列番号34）を含む。配列番号34に示したDNA断片をAP1中に逆相補配向でクローニングした。ベクターAP2〜AP7は、AP1とAEプラスミドから標準のクローニング手順を用いて作製し、表1に示した突然変異だけが異なる。クローニングの便宜のために、AP2〜AP5と比較して異なる断片を用いてAP6とAP7を作製した。従って、AP6とAP7はAP1〜AP5より47塩基対だけ短い。この相異はプラスミド骨格にあるのであって、Arabidopsis thalianaゲノム断片には存在しない。
ベクターAE10〜AE24は次の通り作製した。野生型Arabidopsis thalianaAHAS大サブユニット遺伝子を、変異誘発条件下で、Genemorph II無作為変異原性キット（Stratagene、La Jolla、California）を用いて増幅し、この遺伝子の無作為変異誘発され増幅されたDNA断片を得た。次いでこの変異体DNAをAE7中に戻しクローニングし、野生型A.thaliana大サブユニット遺伝子（AE7上のユニークなSacIIとAgeI部位の間）を変異誘発された型で置き換えた。このDNAを大腸菌株TOP10中に形質転換し、それぞれ、独立して変異誘発されたAHAS遺伝子をもつ多数のユニークな形質転換体を有するように、LB寒天培地上で選択した。これらのコロニーを一緒に掻きとり、プラスミドDNAをこの全一次ライブラリーから調製した。このDNAをAHASを含まない大腸菌中に形質転換し、カルベニシリンを含むLB寒天培地で再び選択した。このステップから得たプラスミドポジティブコロニーのレプリカを、ベッチン（velveteen）を用いて、分枝鎖アミノ酸を含まずかつ30μMイマゼタピルを含有する最小寒天培地上にプレーティングした。この選択培地で増殖するコロニーは、イミダゾリノン耐性でもある機能性のA. thaliana AHAS変異体遺伝子を保持した。
A. thaliana AHAS大サブユニット遺伝子のDNA配列を、それぞれの増殖ポジティブコロニーについて確認した。選択培地で増殖しないA. thaliana AHAS大サブユニット遺伝子の配列を確認することはしなかった。なぜなら、AHAS機能およびイミダゾリノン耐性スクリーニングを二次ライブラリーで行い、DNA配列分析により確認して前記突然変異のレプリカを見出したからである。それぞれ1つのクローンだけを増加するイミダゾリノン濃度における試験に進め、表1に含めた。
Figure 2010523123
*大腸菌におけるAtAHASL2発現用ベクター(AEプラスミド)および植物形質転換用プラスミド(APプラスミド)のリスト。それぞれのベクター中の突然変異を配列番号1と比較して示した。
**AHASインヒビターイマゼタピルの存在のもとでのAEプラスミドを含有するAHASマイナス大腸菌におけるシロイヌナズナAHAS機能の耐性のスコアを、コロニーサイズの増加に対してそれぞれ単純な1つ、2つまたは3つの+、すなわち、+、++、または+++を用いて可視的に表した。「-」は無増殖を示し、突然変異組合わせが不活性なタンパク質を生じるかまたは選択した施用率でイマゼタピルに対する耐性がなかったことを意味する。INは不活性タンパク質を意味する一方、NTはイミダゾリノン耐性でないことを意味する。NAは利用できるDNAがない（試験してない）ことを意味する。
† S653Nと比較てスクリーニングプロトコルにより確認した耐性の事実は試験されてない。
@ AP1ベクターを含むトランスジェニック植物について、18.75μMイマゼタピルが、マイクロタイタープレートフォーマットプレートにおける植物の良い生長を可能にする最高濃度であった。この濃度を、AP1を超えるX倍改善を決定するためのベースとして用いた。
（実施例２）
トウモロコシ（Zea mays）AHASL変異体遺伝子を含有するベクター
トウモロコシAHASL2遺伝子（配列番号29）を細菌発現ベクターpTrcHis A（Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA）中にクローニングし、ベクタータグおよび配列番号29の塩基160で始まる翻訳出発部位と融合した。変異誘発およびサブクローニング手順を用いて、ZE1をベースベクターとしてベクターZE2、ZE5、ZE6、およびZE7を作製した。サブクローニング手順を用いて、ZE3を、ベクタータグと配列番号29の塩基121で始まるpTrcHis Aの翻訳出発部位と融合したトウモロコシAHASL2遺伝子であるZE1から作製した。大腸菌において、ZE1とZE3の間に機能差が認められなかったので、標準の変異誘発およびサブクローニング手順を用いてZE3をベースベクターとして使用し、ベクターZE4およびZE8〜ZE22を作製した。
トウモロコシ・ユビキチンプロモーターをトウモロコシAHASL2 S653N変異体をコードするポリヌクレオチドと組合わせて含む発現カセットをもつ植物形質転換ベクターを、標準の方法を用いて調製してZP1と名付けた（図7）。他のAHAS変異体を発現するための植物形質転換 ベクターを作製するために、標準のクローニング技法を用いて、ZP1のポリヌクレオチドセグメントを、突然変異をコードするZEベクターのポリヌクレオチド断片で置き換えた。
ベクターZE23〜ZE38を次の通り作製した。ベクターZE3を、QuikChange(登録商標)マルチサイト部位特異的変異誘発キット(Stratagene、La Jolla、California)を使い、"General Guidelines for Creating Engineered Mutant Clone(登録商標) Collections"の添付プロトコルに従って、飽和部位特異的変異誘発で処理した。トウモロコシAHAS大サブユニットの重要部位における全ての可能なコドンを作製しうる変異誘発オリゴヌクレオチドを様々な組合わせで用いて、残基A90、M92、P165、R167、S621、およびG622にて置換された変異体のコレクションを作製した。変異体コレクションプラスミドをAHAS欠失大腸菌中に導入して形質転換し、100μg/lのカルベニシリンを補充したLB寒天培地上にプレーティングした。これから得たコロニーを拾って、マイクロタイタープレート内の1x濃度（等張性バッファーに対して）のM9塩中に移し、次いで分枝鎖アミノ酸を含まずかつ150μMイマゼタピルを含有する最小寒天培地上にレプリカをプレーティングした。この選択培地で増殖するコロニーは、イミダゾリノン耐性でもある機能性トウモロコシAHAS変異体遺伝子を所持した。
トウモロコシAHAS大サブユニット遺伝子のDNA配列を、増殖クローンポジティブコロニーのそれぞれについて決定した。選択培地で増殖しなかったトウモロコシAHAS大サブユニット遺伝子の配列は決定しなかった。
Figure 2010523123
Figure 2010523123
*大腸菌におけるZmAHASL2発現用ベクター(ZEプラスミド)および植物形質転換用プラスミド(ZPプラスミド)のリスト。それぞれのベクター中の突然変異を配列番号2と比較して示した。
**AHASインヒビターイマゼタピルの存在のもとでのZEプラスミドを含有するAHASマイナス大腸菌におけるトウモロコシAHAS機能の耐性のスコアを、コロニーサイズの増加に対してそれぞれ単純な1つ、2つまたは3つの+、すなわち、+、++、または+++を用いて可視的に表した。「-」は無増殖を示し、突然変異組合わせが不活性なタンパク質を生じるかまたは選択した施用率においてイマゼタピルに対する耐性がなかったことを意味する。INは不活性タンパク質を意味する一方、NTはイミダゾリノン耐性でないことを意味する。NAは利用できるDNAがないことを意味する（試験されてない）。
@トウモロコシ全植物耐性スコアは、温室内と複数圃場でいくつかの生長季節にわたって実施した試験から得た結果の組合わせに基づくものである。トウモロコシに対するスコアリングシステムは大腸菌イミダゾリン耐性について先に記載したのと同じであった。+++スコアをもつ全てのZP構築物は、最高の試験した噴霧率である1ヘクタール当たり3000gを超えるイマザモックスに対して耐性があることに注目されたい。
（実施例３）
大腸菌補完アッセイ（E. coli Complementation Assay）
大腸菌株JMC1（遺伝形質[ilvB1201 ilvHI2202 rbs-221 ara thi delta(pro-lac) recA56 srlC300::Tn10], DE(hsdR)::Cat)）を、生来の大腸菌AHASL遺伝子のilvGの全コピーをノックアウトした菌株である。この菌株は、もし外来のAHASL遺伝子を補完すれば、ロイシン、イソロイシン、およびバリンを欠く最小増殖培地だけで増殖することができる（Singhら (1992) Plant Physiol. 99, 812-816; Smithら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4179-4183を参照されたい）。この大腸菌補完アッセイを用いて、イミダゾリノン系除草剤Pursuit（登録商標）（イマゼタピル、BASF Corporation、Florham Park、NJ）の不在および存在のもとで、AEおよびZEベクターによりコードされたAHASL酵素活性および除草剤耐性をスクリーニングした。
（実施例４）
生化学的な特徴付け
補完試験または単純な活性試験に基づいて、ZEシリーズのベクターのいくつかを用いて、粗大腸菌ライセート中のAHAS生化学アッセイ阻害試験を行った。50μg/mlカルベニシリンを含有するLB（LB-carb）の2〜4ml培養物に、試験すべきZEベクタを用いて形質転換したJMC1の単一コロニーを接種し、一晩37℃にて振とうしながらインキュベートした。翌朝、0.5〜1mlの一晩培養物を用いて20mlのLB-carbに接種し、これを37℃にて振とうしながら600nmでの培養物光学密度（OD）が0.6〜0.8 ODユニットになるまでインキュベートした。イソプロピル-l-チオ-β-D-ガラクトピラノシド（IPTG）を加えて0.1mMの濃度とし、その培養物を振とうしながら1〜1.5時間インキュベートした。その培養物を遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄した。細胞ペレットを、10mg/mlリゾチームを補充したAHASアッセイバッファー（Singhら (1988) Anal. Biochem. 171:173-179に記載の通り）を用いて溶解し、そして簡単な超音波処理を行った。不溶画分を遠心分離によりペレット化し、その上清をAHAS活性のアッセイに使用した。使用したイマゼタピルインヒビターの各濃度において、その活性を同じZE変異体の無阻害対照と比較した。これによって「対照のパーセント」測定を行った。
（実施例５）
植物形質転換
APベクターをシロイヌナズナ（A. thaliana）生態型Col-2中に形質転換した。T1種子を、100nM Persuit(登録商標)を選択剤として用いてプレート上で形質転換について選択した。ほぼ20の独立した形質転換事象（系統）から得たT2種子を、増加するPersuit濃度のMS寒天上にプレーティングし、AP1と比較して耐性増加のスコアを求めた。可視検査により実生の無阻害生長を有するPursuit(登録商標)の最高濃度の比較により、ベクターのスコアを求めた。シロイヌナズナ形質転換実験の結果を表1に示した。
シロイヌナズナの数系統から得た種子を、鉛直プレート成長アッセイにより試験した。37.5マイクロモルPursuit(イマゼタピル)を含有する標準MurashigeおよびSkoog半固体培地によるプレートに、0.1％アガロース中の数個の種子をスポットした。そのプレートを鉛直に保持し、根が寒天表面に沿って生長しうるようにした。使用した種子は次の通りであった：1)野生型生態型Columbia2；2)csr1-2変異体（AHAS大サブユニット遺伝子のゲノムコピーにおけるAtAHASL S653N突然変異についてホモ接合）；3)AP1で形質転換したColumbia2；4)AP7で形質転換したColumbia2；5)AP2で形質転換したColumbia2。2番と3番は、AP1植物がcsr1-2（配列番号34）のゲノムXbaI断片のクローンにより形質転換されているので、予想される耐性で言えばほぼ同等であることに注目されたい。この濃度のイマゼタピルで、野生型実生は出芽できず、その単一変異体植物（csr1-2およびAP1形質転換体）が辛うじて出芽した。AP7とAP2は良い耐性のある生長を示したが、AP7植物は若干根生長が少なかった。イマゼタピルを含まない培地では、全ての系統が出芽しかつ良く生長したことに注目されたい。鉛直プレート成長アッセイの結果を図10に示した。
ZP構築物をトウモロコシ未成熟胚中にアグロバクテリウムが介在する形質転換を経由して導入した。形質転換された細胞を、0.75μM Pursuit(登録商標)を補充した選択培地で3〜4週間選択した。トランスジェニック小植物を、0.75μM Pursuit(登録商標)を補充した植物再生培地で再生した。トランスジェニック小植物は、0.5μM Pursuit(登録商標)の存在のもとで根付いた。トランスジェニック植物をトランスジーンの存在についてTaqMan 分析にかけた後に、鉢植え混合物に移植し、温室で成熟まで生長させた。トウモロコシ形質転換実験の結果を表2に示した。ZP構築物で形質転換したトウモロコシ植物に様々な施用率のイマザモックスを、いくつかの野外立地においておよび温室内でスプレーした。ZP構築物の全植物試験データの相対評価を表2に総括した。
（実施例６）
ダイズにおけるAtAHASL変異体遺伝子の発現
形質転換されたダイズ植物においてAtAHASL遺伝子を発現するベクターを調製した。ベクターAUP2およびAUP3は、パセリ・ユビキチンプロモーターのポリメラーゼ連鎖反応産物をクローニングし、増幅してAsp718およびNcoI制限酵素の部位に組み込み、消化し、そして標準のクローニング技法によりAP2およびAP3の前記部位中にライゲートしすることにより作製した（図11および12を参照）。AUP2は、AtAHASLタンパク質ならびにA122TとS653N突然変異をコードし、AUP3はAtAHASLタンパク質ならびにA122TとS653N突然変異をコードする。ベクターBAP1は、AP1の全プロモーター、コード配列および3'非翻訳領域配列を、BAR選択可能なマーカー発現カセットを含有する標準の双子葉形質転換骨格中に標準の平滑末端クローニング技法によりクローニングすることにより作製した。
構築物AP2、AUP2、およびAUP3を、ダイズの実生外植体の第1節の葉腋***組織細胞中に、アグロバクテリウム介在性形質転換を介して導入した。接種およびアグロバクテリアとの共培養の後に、外植体を、選択の無いシュート誘導培地に1週間移した。外植体をその後、5μMイマザピル(Arsenal)を含むシュート誘導培地へ3週間移して形質転換された細胞を選択した。健全なカルス/シュートパッドを第1節に持つ外植体を、次いで3μMイマザピルを含有するシュート伸長培地に、シュートが伸長するかまたは外植体が枯死するまで移した。トランスジェニック小植物を根付かせ、鉢植え混合物へ移植し、トランスジーンの存在についてTaqMan分析で試験し、次いで温室で成熟まで生長させた。構築物BAP1を用いて、選択剤がBASTAであることを除いて同様な方法で、形質転換されたダイズ植物を作製した。
形質転換されたダイズ植物を、温室および屋外研究の両方で試験した。屋外研究については、イマザピルをV3段階に300g a.i.（AHAS阻害性除草剤）/haの施用率で施用した。温室研究については、イマザピルをV2段階に施用した。これらの研究の結果を表3に総括した。
Figure 2010523123
*ダイズのS653N突然変異単独でのイマザピル選択は最適化されなかったので、BAP1(図12)はBAR遺伝子を選択に用いて形質転換した。
**AUP2と比較していくらかの損傷。
（実施例７）
形質転換体選択
本発明により作製したポリヌクレオチドは、植物形質転換用の選択可能なマーカーとして用いることができる。本発明によるポリヌクレオチドを選択可能なマーカーとして用いて、さらなる目的の遺伝子を含みうる形質転換された植物を同定しおよび／または選択することができる。AHAS大サブユニット遺伝子の多重変異体型を含有するベクターを用いて形質転換した植物または植物細胞を、非形質転換植物または植物細胞から、AHASインヒビターまたはイミダゾリノンなどのAHAS阻害性除草剤を組み込むMS培地などの最小培地にプレーティングすることによって選択することができる。形質転換された植物または組織は、これらのインヒビターの存在のもとで生長し続けることができる一方、非形質転換植物または組織は枯死するであろう。形質転換された組織の場合、非形質転換組織は形質転換された組織から分枝鎖アミノ酸を受けいれることができるので、活発に生長する組織は、より遅い生長または枯死組織から取り出され、選択的培地に再プレーティングされる。
全植物はまた、種子を植付け、出芽および実生生長を待って、実生にAHASインヒビターまたはイミダゾリノンなどのAHAS阻害性除草剤をスプレーすることによって選択することもできる。形質転換された植物は生存しうる一方、非形質転換植物は枯死しうる。
（実施例８）
形質転換されたトウモロコシによる圃場試験
屋外試験を実施し、AHASL二重および三重変異体を含むベクターの1つで形質転換されたトウモロコシ植物は、イマザモックス施用の有無によってなんらかの大まかな生理学的または生殖の影響を受けるかどうかを評価した。
材料および方法
試験材料の供給源
遺伝的に改変された生物をトウモロコシ近交系J553を形質転換することにより作製した。8つのベクター構築物由来のF1雑種種子はTR5753を近交系雄性テスターとして使用し、作製した。ベクター構築物を表4に記載した。試験用種子は、Kauai島（Hawaii,USA）の隔絶された交雑ブロックにおいて2006〜2007年の季節外れの時期に作製した。作製した各F1雑種のサブサンプルを、正しいベクター構築物の存在と他の外来性AHASL構築物の不在について分析した。
非形質転換市販雑種は、米国中西部地帯のトウモロコシ種子会社から購入して分析し、他の外来性AHASL構築物の不在を確認した。
Figure 2010523123
試験方法
試験設計は、無作為化完全ブロック設計（Randomized Complete Block Design）の分割プロットであり、除草剤処理用の主プロット、およびF1雑種エントリー用のサブプロットである。除草剤処理には、1)無処理および2)イマザモックス施用150g a.i./haが含まれる。F1雑種エントリーは、8種のベクター構築物および4種の非形質転換市販雑種（3395IR（PioneerHi-BredInternational、Inc、Johnston、IA、USA）；ならびに8342GLS/IT、8546ITおよび8590IT（GarstSeedCo.、Inc.、Slater、IA.USA））由来の29事象を含む。プロットサイズは2条；条巾2.5フィート；条長20フィートであった。それぞれの処理組合わせは4つの複製を有した。試験物を3つの場所に植え付けた。それらの場所は：Ames（IA、USA）；Estherville（IA、USA）；およびYork（NE、USA）であった。全ての試験物は2007年5月に植え付けた。
立地条件
Ames（IA）立地は、トウモロコシ後トウモロコシのローテーションであり、これは、かなりの量のトウモロコシ残留物が植付け時に存在したので、出芽および初期生長の均一性にいくらかの影響を有し得た。天候、病気または昆虫による作物に対する大きな影響は認められなかった。Estherville（IA）立地は、7月16日に、豪雨と70mphの突風に襲われ、ほぼ40mphの風が持続した。根の倒伏が本質的に全てのプロットで観察された。病気または昆虫による作物への大きな影響は認められなかった。York（NE）立地は、5月、7月および8月に通常を超える降雨があったものの、昆虫または病気による問題は認められなかった。
結果と考察
イマザモックス除草剤施用の有無について収率を比較すると、3立地にわたる組合わせたデータ分析によって、有意な収率低下（p<0.05）を伴う1つのベクター構築物を得た（表5）。1つのベクター構築物は、イマザモックス施用で処理すると有意な収率増加を有した。他の農学的特徴もこれらの3つの試験場所から採集したが、イマザモックスで処理したまたは処理しなかった時に、形質、植物高さ、耳高さ、柄倒伏および根倒伏について、構築物内で有意差は検出されなかった（データは示してない）。
試験の目的は、イマザモックスに対して除草剤耐性の改善を与えるように最適化したベクター構築物にイマザモックスの除草剤施用を適用すれば、大まかな、または明らかな生理学的または生殖の影響をもたらしうるかを確認することであった。ただ1つのベクター構築物（構築物1、単一の変異体、P197L）だけ、イマザモックスで処理した時に、穀粒収率について有意な（p<0.05）ネガティブな応答を有した。残りの7つのベクター構築物は、除草剤イマザモックスの存在または不在のもとで有害な生理学的または生殖の影響を示さなかった。これらの屋外試験の結果は、AHASL二重または三重変異体を含むベクターにより形質転換したトウモロコシ植物の優れた農学的能力を実証する。
Figure 2010523123
本明細書で言及された刊行物および特許出願はいずれも、本発明の属する技術分野の当業者の水準を示す。刊行物および特許出願はいずれも、個々の刊行物および特許出願が参考として含められることが具体的かつ個別的に示されたのと同程度に、参考として本明細書に含められるものとする。
上記発明は、明確な理解のために、説明および例示の目的である程度詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲内で一定の変更および変形を行うことができることは明白である。

Claims (48)

  1. 次のポリペプチドからなる群より選択されるアセトヒドロキシ酸合成酵素大サブユニット（AHAS）二重変異体ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド：
    a)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
    b)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
    c)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有するポリペプチド；
    d)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
    e)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の139位もしくは配列番号2の107位に対応する位置においてイソロイシンを有するポリペプチド；
    f)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の269位もしくは配列番号2の237位に対応する位置においてヒスチジンを有するポリペプチド；
    g)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の416位もしくは配列番号2の384位に対応する位置においてメチオニンを有するポリペプチド；
    h)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の426位もしくは配列番号2の394位に対応する位置においてイソロイシンを有するポリペプチド；
    i)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の430位もしくは配列番号2の398位に対応する位置においてバリンを有するポリペプチド；
    j)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の442位もしくは配列番号2の410位に対応する位置においてイソロイシンを有するポリペプチド；
    k)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の445位もしくは配列番号2の413位に対応する位置においてイソロイシンまたはアスパラギン酸を有するポリペプチド；
    l)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の580位もしくは配列番号2の548位に対応する位置においてグルタミン酸を有するポリペプチド；
    m)配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
    n)配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
    o)配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンおよび配列番号1の375位もしくは配列番号2の343位に対応する位置においてアスパラギンを有するポリペプチド；
    p)配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
    q)配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；および
    r)配列番号1の205位もしくは配列番号2の173位に対応する位置においてバリン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、トリプトファンまたはチロシンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド。
  2. コードされるAHASL二重変異体が植物由来である、請求項1の単離されたポリヌクレオチド。
  3. 植物がシロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、モロコシ、雑穀、サトウダイコン、サトウキビ、ダイズ、ピーナッツ、ワタ、アブラナ、キャノーラ、アブラナ属、トロアオイ、メロン、カボチャ、コショウ、ヒマワリ、マリーゴールド、ナス科植物、ジャガイモ、サツマイモ、タバコ、ナス、トマト、ソラマメ属、エンドウマメ、アルファルファ、コーヒー、カカオ、チャ、ヤナギ属、オイルパーム、ココナッツ、多年生イネ科植物、および飼料作物からなる群より選択される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  4. ポリヌクレオチドが、
    i)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；および
    ii)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド
    からなる群より選択される、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  5. 請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  6. ベクターがさらに1以上の調節配列を含む、請求項5に記載の発現ベクター。
  7. 請求項5に記載の発現ベクターを含むトランスジェニック植物。
  8. 植物が単子葉植物である、請求項7に記載のトランスジェニック植物。
  9. 植物が双子葉植物である、請求項７に記載のトランスジェニック植物。
  10. 植物がシロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、モロコシ、雑穀、サトウキビ、ダイズ、サトウダイコン、ピーナッツ、ワタ、アブラナ、キャノーラ、アブラナ属、トロアオイ、コショウ、ヒマワリ、マリーゴールド、ナス科植物、ジャガイモ、タバコ、ナス、トマト、ソラマメ属、エンドウマメ、アルファルファ、コーヒー、カカオ、チャ、ヤナギ属、オイルパーム、ココナッツ、多年生イネ科植物および飼料植物からなる群より選択される、請求項7に記載のトランスジェニック植物。
  11. 種子が前記単離されたポリヌクレオチドを含む、請求項7に記載のトランスジェニック植物により作製された植物種子。
  12. 植物におけるポリヌクレオチドの発現がイミダゾリノン、スルホニルウレア、トリアゾロピリミジン、およびピリミジニルオキシベンゾアートからなる群より選択される除草剤に対する耐性をもたらす、請求項7に記載のトランスジェニック植物。
  13. 請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされる、精製されたAHASLタンパク質。
  14. 第1のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドおよび第2のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド、または前記第1および前記第2のAHASL単一変異体ポリペプチドのアミノ酸突然変異に対応するアミノ酸突然変異をもたらす2つのヌクレオチド突然変異を含むAHASLをコードするポリヌクレオチドを含むものである植物であって、前記第1と前記第2のポリペプチドが次のポリペプチドからなる群より選択される前記植物：
    a)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第二のポリペプチド；
    b)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第二のポリペプチド；
    c)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第二のポリペプチド；
    d)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギンを有する第二のポリペプチド；
    e)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の139位もしくは配列番号2の107位に対応する位置においてイソロイシンを有する第二のポリペプチド；
    f)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の269位もしくは配列番号2の237位に対応する位置においてヒスチジンを有する第二のポリペプチド；
    g)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の416位もしくは配列番号2の384位に対応する位置においてメチオニンを有する第二のポリペプチド；
    h)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の426位もしくは配列番号2の394位に対応する位置においてイソロイシンを有する第二のポリペプチド；
    i)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の430位もしくは配列番号2の398位に対応する位置においてバリンを有する第二のポリペプチド；
    j)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の442位もしくは配列番号2の410位に対応する位置においてイソロイシンを有する第二のポリペプチド；
    k)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の445位もしくは配列番号2の413位に対応する位置においてイソロイシンまたはアスパラギン酸を有する第二のポリペプチド；
    l)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の580位もしくは配列番号2の548位に対応する位置においてグルタミン酸を有する第二のポリペプチド；
    m)配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第二のポリペプチド；
    n)配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第二のポリペプチド；
    o)配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の375位もしくは配列番号2の343位に対応する位置においてアスパラギンを有する第二のポリペプチド；
    p)配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第二のポリペプチド；
    q)配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第二のポリペプチド；および
    r)配列番号1の205位もしくは配列番号2の173位に対応する位置においてバリン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、トレオニン、トリプトファンまたはチロシンを有する第一のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第二のポリペプチド。
  15. 植物が単子葉植物である、請求項14に記載の植物。
  16. 植物が双子葉植物である、請求項14に記載の植物。
  17. 植物がシロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、モロコシ、雑穀、サトウキビ、ダイズ、サトウダイコン、ピーナッツ、ワタ、アブラナ、キャノーラ、アブラナ属、トロアオイ、コショウ、ヒマワリ、マリーゴールド、ナス科植物、ジャガイモ、タバコ、ナス、トマト、ソラマメ属、エンドウマメ、アルファルファ、コーヒー、カカオ、チャ、ヤナギ属、オイルパーム、ココナッツ、多年生イネ科植物および飼料植物からなる群より選択される、請求項14に記載の植物。
  18. 種子が前記AHASLをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項14に記載の植物により作製される植物種子。
  19. 植物がシロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、モロコシ、雑穀、サトウダイコン、サトウキビ、ダイズ、ピーナッツ、ワタ、アブラナ、キャノーラ、アブラナ属、トロアオイ、メロン、カボチャ、コショウ、ヒマワリ、マリーゴールド、ナス科植物、ジャガイモ、サツマイモ、タバコ、ナス、トマト、ソラマメ属、エンドウマメ、アルファルファ、コーヒー、カカオ、チャ、ヤナギ属、オイルパーム、ココナッツ、多年生イネ科植物、および飼料作物からなる群より選択される、請求項14に記載の植物。
  20. 次のポリペプチドからなる群より選択されるAHASL三重変異体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド：
    a)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
    b)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；
    c)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
    d)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニン、配列番号1の57位に対応する位置においてアルギニンおよび配列番号1の398位もしくは配列番号2の366位に対応する位置においてロイシンを有するポリペプチド；
    e)配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギン、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有するポリペプチド；
    f)配列番号1の95位もしくは配列番号2の63位に対応する位置においてロイシン、配列番号1の416位もしくは配列番号2の384位に対応する位置においてグルタミン酸および配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有するポリペプチド；および
    g)配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシン、配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンおよび配列番号1の574位もしくは配列番号2の542位に対応する位置において任意のアミノ酸を有するポリペプチド。
  21. コードされるAHASL三重変異体が植物由来である、請求項20に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  22. 植物がシロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、モロコシ、雑穀、サトウダイコン、サトウキビ、ダイズ、ピーナッツ、ワタ、アブラナ、キャノーラ、アブラナ属、トロアオイ、メロン、カボチャ、コショウ、ヒマワリ、マリーゴールド、ナス科植物、ジャガイモ、サツマイモ、タバコ、ナス、トマト、ソラマメ属、エンドウマメ、アルファルファ、コーヒー、カカオ、チャ、ヤナギ属、オイルパーム、ココナッツ、多年生イネ科植物、および飼料作物からなる群より選択される、請求項21に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  23. 請求項20に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  24. ベクターがさらに1以上の調節配列を含む、請求項23に記載の発現ベクター
  25. 請求項23に記載の発現ベクターを含むトランスジェニック植物。
  26. 植物が単子葉植物である、請求項25に記載のトランスジェニック植物。
  27. 植物が双子葉植物である、請求項25に記載のトランスジェニック植物。
  28. 植物がシロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、モロコシ、雑穀、サトウダイコン、サトウキビ、ダイズ、ピーナッツ、ワタ、アブラナ、キャノーラ、アブラナ属、トロアオイ、メロン、カボチャ、コショウ、ヒマワリ、マリーゴールド、ナス科植物、ジャガイモ、サツマイモ、タバコ、ナス、トマト、ソラマメ属、エンドウマメ、アルファルファ、コーヒー、カカオ、チャ、ヤナギ属、オイルパーム、ココナッツ、多年生イネ科植物、および飼料作物からなる群より選択される、請求項25に記載のトランスジェニック植物。
  29. 種子が前記AHASLをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項25に記載の植物から作製される植物種子。
  30. 請求項20に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされる、精製されたAHASLタンパク質。
  31. 第1のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチド、第2のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチド、および第3のAHASL単一変異体ポリペプチドをコードする第3のポリヌクレオチド；または3つのヌクレオチド突然変異が前記第1、第2および第3AHASL単一変異体ポリペプチドの突然変異に対応するアミノ酸突然変異をもたらす、3つの突然変異を含む1つのAHASLをコードするポリヌクレオチド；またはヌクレオチド突然変異が前記第1、第2および第3のAHASL単一変異体ポリペプチドのアミノ酸突然変異に対応するアミノ酸突然変異をもたらす、単一の突然変異を含むAHASLをコードするポリヌクレオチドおよび二重突然変異を含むAHASLをコードするポリヌクレオチドを含む植物であって、前記第1、第2、および第3のAHASL単一変異体ポリペプチドが次のポリペプチドからなる群より選択される前記植物：
    a)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第一のポリペプチド、配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第二のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第三のポリペプチド；
    b)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第一のポリペプチド、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第二のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第三のポリペプチド；
    c)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第一のポリペプチド、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第二のポリペプチドおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第三のポリペプチド；
    d)配列番号1の122位もしくは配列番号2の90位に対応する位置においてバリン、トレオニン、グルタミン、システインまたはメチオニンを有する第一のポリペプチド、配列番号1の57位に対応する位置においてアルギニンを有する第二のポリペプチドおよび配列番号1の398位もしくは配列番号2の366位に対応する位置においてロイシンを有する第三のポリペプチド；
    e)配列番号1の124位もしくは配列番号2の92位に対応する位置においてグルタミン酸、イソロイシン、ロイシンまたはアスパラギンを有する第一のポリペプチド、配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第二のポリペプチドおよび配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第三のポリペプチド；
    f)配列番号1の95位もしくは配列番号2の63位に対応する位置においてロイシンを有する第一のポリペプチド、配列番号1の416位もしくは配列番号2の384位に対応する位置においてグルタミン酸を有する第二のポリペプチドおよび配列番号1の653位もしくは配列番号2の621位に対応する位置においてフェニルアラニン、アスパラギン、トレオニン、グリシン、バリンまたはトリプトファンを有する第三のポリペプチド；および
    g)配列番号1の197位もしくは配列番号2の165位に対応する位置においてセリン、アラニン、グルタミン酸、ロイシン、グルタミン、アルギニン、バリン、トリプトファン、チロシンまたはイソロイシンを有する第一のポリペプチド、配列番号1の199位もしくは配列番号2の167位に対応する位置においてアラニン、グルタミン酸、セリン、フェニルアラニン、トレオニン、アスパラギン酸、システインまたはアスパラギンを有する第二のポリペプチドおよび配列番号1の574位もしくは配列番号2の542位に対応する位置において任意のアミノ酸を有する第三のポリペプチド。
  32. 植物が単子葉植物である、請求項31に記載の植物。
  33. 植物が双子葉植物である、請求項31に記載の植物。
  34. 植物がシロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オートムギ、ライコムギ、イネ、オオムギ、モロコシ、雑穀、サトウキビ、ダイズ、サトウダイコン、ピーナッツ、ワタ、アブラナ、キャノーラ、アブラナ属、トロアオイ、コショウ、ヒマワリ、マリーゴールド、ナス科植物、ジャガイモ、タバコ、ナス、トマト、ソラマメ属、エンドウマメ、アルファルファ、コーヒー、カカオ、チャ、ヤナギ属、オイルパーム、ココナッツ、多年生イネ科植物および飼料植物からなる群より選択される、請求項31に記載の植物。
  35. 種子が前記AHASLをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項31に記載の植物により作製される植物種子。
  36. 作物植物の周辺の雑草を防除する方法であって、
    i)請求項11、18、29、および35のいずれか1項の種子；または請求項7〜10、14〜17、19、25〜28、および31〜34のいずれか1項の植物により作製された種子を圃場に植え付けるステップ；および
    ii)イミダゾリノン系除草剤、スルホニルウレア系除草剤、またはそれらの混合物の有効量を、圃場の雑草および作物植物に施用して雑草を防除するステップを含んでなる前記方法。
  37. トランスジェニック植物を作製する方法であって、
    1)請求項5、6、23、および24のいずれか1項の発現ベクターを用いて植物細胞を形質転換するステップ；および
    ii)その植物細胞からAHASL変異体ポリペプチドを発現するトランスジェニック植物を再生するステップを含んでなる前記方法。
  38. 形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはそれらの部分を同定または選択する方法であって、
    i)形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはそれらの部分を提供するステップであって、前記形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはそれらの部分が請求項1〜4および20〜22のいずれか1項のポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドが選択マーカーとして使用されるAHASL変異体ポリペプチドをコードし、そして前記形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはそれらの部分がさらなる単離されたポリヌクレオチドを含んでもよい前記ステップ；
    ii)形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはそれらの部分を少なくとも1種のAHASインヒビターまたはAHAS阻害性化合物と接触させるステップ；
    iii)植物細胞、植物組織、植物またはそれらの部分がインヒビターまたは阻害性化合物による影響を受けるかどうかを確認するステップ；ならびに
    iv)形質転換された植物細胞、植物組織、植物またはそれらの部分を同定または選択するステップ
    を含む前記方法。
  39. 除草剤抵抗性植物を作製する方法であって、除草剤に抵抗性のある第1の植物と除草剤に対して抵抗性の無い第2の植物とを交雑するステップを含んでなり、ここで第1の植物は請求項7〜10、14〜17、19、25〜28、および31〜34のいずれか1項に記載の植物である前記方法。
  40. さらに、除草剤に抵抗性のある子孫植物を選択するステップを含んでなる、請求項39に記載の方法。
  41. 請求項39または40に記載の方法により作製される除草剤耐性植物。
  42. 前記種子が第1の植物の除草剤抵抗性の特徴を含むものである、請求項41に記載の植物の種子。
  43. 第1の植物が請求項7〜10、14〜17、19、25〜28、31〜34,および41のいずれか1項に記載の植物である、第1の植物と第2の植物とを交雑するステップを含んでなる、植物の除草剤抵抗性を高める方法。
  44. さらに、第2の植物の除草剤抵抗性と比較すると増加した除草剤抵抗性を有する子孫植物を選択するステップを含んでなる請求項43に記載の方法。
  45. 請求項43または44に記載の方法により作製した植物。
  46. 前記種子が強められた除草剤抵抗性を有する、請求項44に記載の植物の種子。
  47. 前記種子がAHAS阻害性除草剤により処理されている、請求項7〜10、14〜17、19、25〜28、31〜34、41、および45のいずれか1項に記載の植物の種子。
  48. 望ましくない植生を駆除する方法であって、請求項7〜10、14〜17、19、25〜28、31〜34、41、および45のいずれか1項に記載の植物の種子を、播種前および／または芽出し播き後に、AHAS阻害性除草剤と接触させるステップを含んでなる前記方法。
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