CN104017817B - Ahas突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了编码包含至少两个突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)大亚基的突变体例如双重和三重突变体的核酸，用于产生对AHAS抑制型除草剂具有提高的耐受性水平的转基因植物或非转基因植物。本发明也提供了包含编码AHAS大亚基双重和三重突变体的多核苷酸的表达载体、细胞、植物；包含二种或多种AHAS大亚基单一突变多肽的植物；以及用于制备和使用它们的方法。

Description

AHAS突变体
本申请是中国专利申请200880011500.8的分案申请，原申请的申请日是2008年4月3日，发明名称是“AHAS突变体”。
发明领域
本发明总体上涉及用于提高植物对乙酰羟酸合酶抑制型除草剂的耐受性的组合物和方法。
发明背景
乙酰羟酸合酶(AHAS；EC4.1.3.18，又称作乙酰乳酸合酶或ALS)是催化支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物化学合成的第一个酶(Singh(1999)“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成(Biosynthesis of valine,leucine and isoleucine),”在PlantAmino Acids,Singh B.K.编辑,Marcel Dekker Inc.New York,New York,第227-247页)。AHAS是结构不同的四种除草剂家族的作用位点，所述除草剂家族包括磺酰脲类(Tan等人(2005)Pest Manag.Sci.61:246-57；Mallory-Smith和Retzinger(2003)WeedTechnology17:620–626；LaRossa和Falco(1984)Trends Biotechnol.2:158-161)、咪唑啉酮类(Shaver等人(1984),Plant Physiol.76:545-546)、***并嘧啶类(Subramanian和Gerwick(1989)“通过***并嘧啶类抑制乙酰乳酸合酶(Inhibition of acetolactatesynthase by triazolopyrimidines),”于Biocatalysis in AgriculturalBiotechnology一书中,Whitaker,J.R.和Sonnet,P.E.编著,ACS Symposium Series,American Chemical Society,Washington,D.C.,第277-288页)和嘧啶基氧基苯甲酸酯类(pyrimidyloxybenzoates)(Subramanian等人(1990)Plant Physiol.94:239-244)。咪唑啉酮和磺酰脲除草剂在现代农业中广泛使用，原因是它们在极低应用率下的效力和在动物中相对无毒。通过抑制AHAS活性，这些除草剂家族还阻止包括许多杂草物种在内的易感植物的生长和发育。可商购的咪唑啉酮除草剂的一些实例是(咪草烟)、(灭草喹)和(灭草烟)。磺酰脲除草剂的实例是绿黄隆、甲黄隆、嘧黄隆、氯嘧黄隆、噻黄隆、苯黄隆、禾草苄混剂、烟嘧黄隆、胺苯黄隆、玉嘧黄隆、氟胺黄隆、醚苯黄隆、氟嘧黄隆、醚黄隆、磺氨黄隆(amidosulfiuon)、fluzasulfuron、啶咪黄隆、吡嘧黄隆和吡氯黄隆。
由于咪唑啉酮类除草剂的高效力和低毒性，可以通过喷洒在植被顶部广泛区域来促进它们的应用。能够将除草剂喷洒到植被顶部广泛区域降低了与植物建立和维持相关的成本，并且减少了在此类化学剂使用前现场准备的需要。在目的耐受物种顶部喷洒也导致能够因竞争物种不存在而实现所需物种最大产量的潜力。然而，使用此类顶部喷洒技术的能力取决于喷洒区域中存在所需植被的咪唑啉酮抗性物种。
在主要的农业作物中，一些豆科物种如大豆天然地抵抗咪唑啉酮除草剂，原因是它们能够迅速代谢所述除草剂化合物(Shaner和Robson(1985)Weed Sci.33:469-471)。其它作物如谷物(Newhouse等人(1992)Plant Physiol.100:882－886)和稻(Barrette等人(1989)Crop Safeners for Herbicides,Academic Press,New York,第195-220页)某种程度地对咪唑啉酮除草剂易感。对咪唑啉酮除草剂的差异敏感性取决于特定除草剂的化学性质和在每种植物中该化合物从有毒到无毒形式的差异性代谢(Shaner 等人(1984)PlantPhysiol.76:545-546；Brown等人(1987)Pestic.Biochem.Physiol.27:24-29)。其它的植物生理学差异如吸收和运输也在敏感性中起到重要作用(Shaner和Robson(1985)WeedSci.33:469-471)。
抵抗咪唑啉酮类、磺酰脲类和***并嘧啶类的植物已经通过使用种子、小孢子、花粉和愈伤组织诱变法在玉米(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、欧洲油菜(Brassica napus)(即卡诺拉油菜)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、甜菜(Beta vulgaris)和稻(Oryza sativa)中成功地产生(Sebastian等人(1989)Crop Sci.29:1403-1408；Swanson等人,1989Theor.Appl.Genet.78:525-530；Newhouse等人(1991)Theor.Appl.Genet.83:65-70；Sathasivan等人(1991)Plant Physiol.97:1044-1050；Mourand等人(1993)J.Heredity84:91-96；Wright和Penner(1998)Theor.Appl.Genet.96:612-620；美国专利号5,545,822)。在全部情况下，单一的、部分显性的核基因赋予抗性。在普通小麦(Triticum aestivum L.cv.Fidel)的种子诱变后，先前也分离了4种抗咪唑啉酮的小麦植物(Newhouse等人(1992)Plant Physiol.100:882-886)。遗传研究证实单一的、部分显性的基因赋予抗性。基于等位研究，作者得出结论：在4个所鉴定品系中的突变位于相同的基因座。Fidel栽培品种抗性基因之一被称作FS-4(Newhouse等人(1992)PlantPhysiol.100:882-886)。
基于计算机的AHAS-抑制剂复合体三维构象建模法预测了在所提出的抑制剂结合袋中的几个氨基酸作为诱导突变有可能赋予选择性咪唑啉酮类抗性的位点(Ott等人(1996)J.Mol.Biol.263:359-368)。使用在所提出的AHAS酶结合位点中这些合理设计的突变中的一些突变产生的烟草植物事实上已经表现出针对单一类别除草剂的特异抗性(Ott等人(1996)J.Mol.Biol.263:359-368)。
抵抗咪唑啉酮除草剂的植物也已经在众多专利中报道。美国专利号4,761,373、5,331,107、5,304,732、6,211,438、6,211,439和6,222,100总体上描述了改变的AHAS基因在植物中引起除草剂抗性的用途，并且具体公开了某些抗咪唑啉酮的玉米品系。美国专利号5,013,659公开了由于在一个或多个保守性区域中在至少一个氨基酸中的突变而表现除草剂抗性的植物。在那些文献中描述的突变编码针对咪唑啉酮和磺酰脲的交叉抗性或磺酰脲特异抗性，但是没有描述咪唑啉酮特异抗性。美国专利号5,731,180和美国专利号5,767,361讨论了在野生型单子叶植物AHAS氨基酸序列中具有单氨基酸替换(产生咪唑啉酮特异抗性)的分离的基因。另外，已经通过突变育种和组织培养选择法开发了对干扰AHAS的除草剂抵抗的稻植物。见美国专利号5,545,822、5,736,629、5,773,703、5,773,704、5,952,553和6,274,796。
如在所有其他生物中所检测到的那样，在植物中AHAS酶由两个亚基组成：大亚基(催化作用)和小亚基(调节作用)(Duggleby和Pang(2000)J.Biochem.Mol.Biol.33:1-36)。AHAS大亚基(本文中又称作AHASL)在拟南芥属(Arabidopsis)和甜菜中可以由一个单基因编码，或在玉米、卡诺拉油菜和棉花中由多基因家族成员编码。在所述大亚基中的特定单核苷酸替换赋予这种酶对一类或多类除草剂的一定程度的不敏感性(Chang和Duggleby(1998)Biochem J.333:765-777)。
例如，面包小麦(Triticum aestivum L.)含有三个同源的乙酰羟酸合酶大亚基基因。基于来自全部这三种基因中突变体的除草剂应答和生物化学数据，这些基因均表现明显的表达(Ascenzi等人(2003)International Society of Plant Molecular BiologistsCongress,Barcelona,Spain,Ref.No.S10-17)。三种基因的编码序列在核苷酸水平上均共有广泛的同源性(WO03/014357)。通过对几个普通小麦品种来源的AHASL基因的测序，发现大部分IMI-耐受(咪唑啉酮耐受)品系中除草剂耐受性的分子基础是S653(At)N突变，显示在等同于拟南芥中第653位氨基酸丝氨酸的位置处丝氨酸至天冬酰胺的替换(WO03/014357)。该突变因编码AHASL蛋白的DNA序列中的单核苷酸多态性(SNP)所致。
还已知在双子叶植物物种中存在多个AHASL基因。最近，Kolkman等人(2004)Theor.Appl.Genet.109:1147–1159)报道了来自除草剂抗性和野生型基因型向日葵(Helianthus annuus L.)的三个AHASL基因(AHASL1、AHASL2和AHASL3)的鉴定、克隆和测序。Kolkman等人报道该除草剂抗性是因AHASL1蛋白中的Pro197Leu(使用拟南芥属AHASL氨基酸位置命名)替换或Ala205Val替换所致并且这些替换的每一个替换均产生对咪唑啉酮和磺酰脲除草剂这两者的抗性。
已知AHAS大亚基中导致除草剂耐受性或抗性的众多单一突变(Duggleby等人(2000)Journal of Biochem and Mol.Bio.33:1-36；Jander等人(2003)PlantPhysiology131:139-146)。例如在拟南芥属AHASL第122位置处的丙氨酸至缬氨酸替换(或在苍耳属(Cocklebur)AHASL的相应第100位置处的丙氨酸至苏氨酸替换)赋予针对咪唑啉酮和磺酰脲的抗性。在拟南芥属AHASL第124位置处的甲硫氨酸至谷氨酸或异亮氨酸替换赋予针对咪唑啉酮和磺酰脲的抗性。在拟南芥属AHASL第197位置处的脯氨酸至丝氨酸替换(或在酵母AHASL的相应第192位置处的脯氨酸至丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸替换)赋予针对咪唑啉酮类和磺酰脲类的抗性。在拟南芥属AHASL第199位置处的精氨酸至丙氨酸或谷氨酸替换赋予咪唑啉酮抗性。在拟南芥属AHASL第205位置处的丙氨酸至缬氨酸替换(或在酵母AHASL的相应第200位置处的丙氨酸至半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、色氨酸或酪氨酸替换)赋予针对咪唑啉酮类和磺酰脲类的抗性。几乎任意氨基酸对拟南芥属AHASL第574位置(对应于酵母AHASL第586位置)处色氨酸的替换赋予针对咪唑啉酮类、磺酰脲类、***并嘧啶和嘧啶基氧基苯甲酸酯的抗性。在拟南芥属AHASL第653位置处的丝氨酸至苯丙氨酸、天冬酰胺或苏氨酸替换赋予针对咪唑啉酮类和嘧啶基氧基苯甲酸酯的抗性。
美国专利号5,853,973；5,928,937；和6,576,455公开了用于产生AHAS变体的基于结构的建模方法，其中所述的变体在不同于上文所述位置的特定位置处包括氨基酸替换。在Mourad等人(1992)Planta188；491-497中，已经证实抵抗磺酰脲类的突变系交叉抵抗***并嘧啶类，并且抵抗咪唑啉酮的突变系交叉抵抗嘧啶基氧基苯甲酸酯类。
美国专利号5,859,348公开了双重突变的甜菜AHAS大亚基，其具有在第113位氨基酸处的丙氨酸至苏氨酸替换和第188位氨基酸处的脯氨酸至丝氨酸替换。含有该双重突变AHAS蛋白的甜菜植物被描述为具有咪唑啉酮抗性和磺酰脲类抗性。
Mourad等人(1994)Mol.Gen.Genet.242:178-184公开了名为csr1-4的拟南芥属AHAS双重突变体。此csr1-4突变AHAS含有在第589位置处的C至T核苷酸替换(对应于拟南芥属AHASL第197位氨基酸处的脯氨酸至丝氨酸替换)和在第1958位置处的G至A核苷酸替换(对应于拟南芥属AHASL第653位氨基酸处的丝氨酸至苏氨酸替换)。
Lee等人(1988)EMBO Journal7:1241-1248公开了名为S4-Hra的烟草AHAS双重突变体，所述双重突变体包含在第196位氨基酸处的Pro-Ala替换(对应于拟南芥属AHASL的第197位氨基酸)和在第573位氨基酸处的Trp-Leu替换(对应于拟南芥属AHASL的第574位氨基酸)。携带所述双重突变基因的转基因品系显示磺酰脲除草剂抗性。
美国专利号7,119,256公开了双重突变的稻AHAS大亚基，其具有在第548位氨基酸处的色氨酸至亮氨酸替换和第627位氨基酸处的丝氨酸至异亮氨酸替换。据报道表达编码这种双重突变AHAS蛋白的多核苷酸的转基因稻植物具有提高的嘧啶基羧酸除草剂双草醚抗性。
由于咪唑啉酮类除草剂的高效力和低毒性，它们对于农业应用是有利的。然而，在特定作物生产***中使用咪唑啉酮除草剂的能力取决于目的作物植物的咪唑啉酮抗性品种的可获得性。为产生此类咪唑啉酮抗性品种，仍需要包含突变AHAS多肽的作物植物，其中与具备现有AHAS突变体的作物植物相比时，所述的突变AHAS多肽赋予经证实的针对咪唑啉酮类和/或其他AHAS抑制型除草剂的提高的耐受性。
虽然已经表征了一些AHAS突变体，仍需要这样的突变AHAS多肽，其中与作物植物中的现有AHAS突变体相比，所述突变AHAS多肽在目的作物植物中表达时赋予经证实的针对一类或多类AHAS抑制型除草剂的提高的除草剂耐受性。
发明概述
本发明涉及新的突变AHAS多肽，其显示针对除草剂、尤其咪唑啉酮除草剂或磺酰脲除草剂或其混合物的耐受性。在优选的实施方案中，相对于使用已知AHAS突变体所获得的除草剂耐受性，由本发明突变体赋予的除草剂耐受性得以改善和/或增强。本发明的突变体包含在AHAS大亚基多肽中的至少两个氨基酸替换。
在一个实施方案中，本发明提供了编码AHAS大亚基双重突变多肽的分离的多核苷酸，其中所述的双重突变多肽选自由以下多肽组成的组：在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ IDNO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸的多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO:2第92位置的位置处具有谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺的多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第139位置或SEQ ID NO:2第107位置的位置处具有异亮氨酸的多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第269位置或SEQ ID NO:2第237位置的位置处具有组氨酸的多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ ID NO:2第384位置的位置处具有甲硫氨酸的多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第426位置或SEQ ID NO:2第394位置的位置处具有异亮氨酸的多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第430位置或SEQ ID NO:2第398位置的位置处具有缬氨酸的多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第442位置或SEQ ID NO:2第410位置的位置处具有异亮氨酸的多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第445位置或SEQ ID NO:2第413位置的位置处具有异亮氨酸或天冬氨酸的多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第580位置或SEQID NO:2第548位置的位置处具有谷氨酸的多肽；在对应于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ IDNO:2第92位置的位置处具有谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的多肽；在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的多肽；在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第375位置或SEQ ID NO:2第343位置的位置处具有天冬酰胺的多肽；在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的多肽；在对应于SEQ IDNO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的多肽；和在对应于SEQ ID NO:1第205位置或SEQ ID NO:2第173位置的位置处具有缬氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、色氨酸或酪氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码AHAS大亚基三重突变多肽的分离的多核苷酸，其中所述的三重突变多肽选自由以下多肽组成的组：多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸、在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在对应于SEQ ID NO:1第57位置的位置处具有精氨酸且在对应于SEQID NO:1第398位置或SEQ ID NO:2第366位置的位置处具有亮氨酸；多肽，其在对应于SEQID NO:1第124位置或SEQ ID NO:2第92位置的位置处具有谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第95位置或SEQ ID NO:2第63位置的位置处具有亮氨酸、在对应于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ IDNO:2第384位置的位置处具有谷氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；和多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸，在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺并且在对应于SEQ ID NO:1第574位置或SEQ ID NO:2第542位置的位置处具有任意氨基酸。
本发明还涉及包含上文所述双重和三重突变体的AHASL多肽、包含编码上文所述AHASL双重和三重突变体的多核苷酸的表达载体、包含编码上文所述AHASL双重和三重突变体的多核苷酸的细胞、包含上文所述多核苷酸和多肽的转基因植物、以及产生和使用转基因植物的方法，其中所述的转基因植物包含编码上文所述AHASL双重和三重突变体的多核苷酸。
本发明还涉及包含一种或多种多核苷酸的转基因植物和非转基因植物，其中所述的多核苷酸包含两个或多个突变。在一个实施方案中，本发明的植物包含编码第一AHASL单一突变多肽的第一多核苷酸和编码第二AHASL单一突变多肽的第二多核苷酸，或包含两个核苷酸突变的编码AHASL的多核苷酸，所述核苷酸突变产生所述的第一和第二AHASL单一突变多肽的氨基酸突变，其中所述的第一和第二AHASL单一突变多肽选自由以下多肽组成的组：在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸的第二多肽；在对应于SEQ IDNO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO:2第92位置的位置处具有谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第139位置或SEQ ID NO:2第107位置的位置处具有异亮氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第269位置或SEQ ID NO:2第237位置的位置处具有组氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ ID NO:2第384位置的位置处具有甲硫氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第426位置或SEQ ID NO:2第394位置的位置处具有异亮氨酸的第二多肽；在对应于SEQ IDNO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第430位置或SEQ ID NO:2第398位置的位置处具有缬氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ IDNO:1第442位置或SEQ ID NO:2第410位置的位置处具有异亮氨酸的第二多肽；在对应于SEQID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第445位置或SEQ ID NO:2第413位置的位置处具有异亮氨酸或天冬氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ IDNO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第580位置或SEQ ID NO:2第548位置的位置处具有谷氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO:2第92位置的位置处具有谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸的第一多肽和在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸的第一多肽和在对应于SEQ ID NO:1第375位置或SEQ ID NO:2第343位置的位置处具有天冬酰胺的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸的第一多肽和在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的第二多肽；和在对应于SEQ ID NO:1第205位置或SEQ IDNO:2第173位置的位置处具有缬氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、色氨酸或酪氨酸的第一多肽和在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的第二多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了转基因和非转基因植物，其中所述植物包含编码第一AHASL单一突变多肽的第一多核苷酸、编码第二AHASL单一突变多肽的第二多核苷酸，和编码第三AHASL单一突变多肽的第三多核苷酸；或包含三个突变的编码AHASL的多核苷酸，其中所述的三个核苷酸突变导致与所述第一、第二和第三AHASL单一突变多肽的氨基酸突变相对应的氨基酸突变；或包含单一突变的编码AHASL的多核苷酸和包含双重突变的编码AHASL的多核苷酸，其中所述的核苷酸突变导致与所述第一、第二和第三AHASL单一突变多肽的氨基酸突变相对应的氨基酸突变，其中所述第一、第二和第三AHASL单一突变多肽选自由以下多肽组成的组：在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽、在对应于SEQ IDNO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第二多肽且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的第三多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽,在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸的第二多肽且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的第三多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽,在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸的第二多肽且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第三多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽，在对应于SEQ ID NO:1第57位置的位置处具有精氨酸的第二多肽且在对应于SEQ ID NO:1第398位置或SEQ ID NO:2第366位置的位置处具有亮氨酸的第三多肽；在对应于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO:2第92位置的位置处具有谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺的第一多肽,在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸的第二多肽且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第三多肽；在对应于SEQ ID NO:1第95位置或SEQ ID NO:2第63位置的位置处具有亮氨酸的第一多肽、在对应于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ ID NO:2第384位置的位置处具有谷氨酸的第二多肽且在对应于SEQ IDNO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的第三多肽；和在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸的第一多肽、在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第二多肽且在对应于SEQ ID NO:1第574位置或SEQ ID NO:2第542位置的位置处具有任意氨基酸的第三多肽。
本发明提供了控制本发明转基因和非转基因植物附近的杂草的方法。此类植物具有相对于野生型植物的提高的除草剂抗性。所述方法包括施加有效量的AHAS抑制型除草剂至所述杂草和至本发明的植物。
附图简述
图1描述拟南芥属(Arabidopsis)AHAS大亚基蛋白的全长序列(氨基酸序列SEQ IDNO:1；核酸序列SEQ ID NO:31)，推定的翻译显示以粗体字和下划线指示的突变位置。DNA编号在左边而氨基酸编号在右边。
图2描述玉米AHAS大亚基蛋白的全长序列(氨基酸序列SEQ ID NO:2；核酸序列SEQID NO:32)，在要求专利保护的突变的位置处的氨基酸以粗体字和下划线显示。DNA编号在左边而氨基酸编号在右边。
图3是拟南芥属AHAS大亚基蛋白(AtAHASL，SEQ ID NO:1)与众多物种AHAS大亚基蛋白的可以产生本发明双重和三重突变体的相应位置的比对结果，所述的比对结果显示了与SEQ ID NO:1中替换位置相对应的替换位置，所述物种是：苋(Amaranthus sp.)(AsAHASLSEQ ID NO:9)、欧洲油菜(Brassica napus)(BnAHASL1A SEQ ID NO:3、BnAHASL1C SEQ IDNO:10、BnAHASL2A SEQ ID NO:11)、小果亚麻荠(Camelina microcarpa)(CmAHASL1SEQ IDNO:12、CmAHASL2SEQ ID NO:13)、马铃薯(Solanum tuberosum)(StAHASL1SEQ ID NO:16、StAHASL2SEQ ID NO:17)、稻(Oryza sativa)(OsAHASL SEQ ID NO:4)、多花黑麦草(Loliummultiflorum)(LmAHASL SEQ ID NO:20)、东方龙葵(Solanum ptychanthum)(SpAHASL SEQID NO:14)、双色蜀黍(Sorghum bicolor)(SbAHASL SEQ ID NO:15)、大豆(Glycine max)(GmAHASL SEQ ID NO:18)、向日葵(Helianthus annuus)(HaAHASL1SEQ ID NO:5、HaAHASL2SEQ ID NO:6、HaAHASL3SEQ ID NO:7)、普通小麦(Triticum aestivum)(TaAHASL1A SEQ ID NO:21、TaAHASL1B SEQ ID NO:22、TaAHASL1D SEQ ID NO:23)、苍耳(Xanthium sp.)(XsAHASL SEQ ID NO:19)、玉米(Zea mays)(ZmAHASL1SEQ ID NO:8、ZmAHASL2SEQ ID NO:2)、陆地棉(Gossypium hirsutum)(GhAHASA5SEQ ID NO:24、GhAHASA19SEQ ID NO:25)和大肠杆菌(E.coli)(ilvB SEQ ID NO:26、ilvG SEQ ID NO:27、ilvI SEQ ID NO:28)。
图4是用于在大肠杆菌中构建拟南芥属AHASL突变体AE2-AE8的AE基础载体的图谱，标出突变在拟南芥属AHASL中的相对位置。
图5是用于载体AP2-AP5构建的植物转化基础载体AP的载体图，所述载体AP2-AP5仅因表1中所示的突变而不同。
图6是用来在大肠杆菌中研究玉米AHASL突变体ZE2、ZE5、ZE6和ZE7的基础载体ZE的图谱，标出了突变的相关位置。
图7是植物转化载体ZP的图谱，其中所述的植物转化载体ZP用作构建ZP2-ZP10载体的基础载体。
图8是源自不同物种的AHASL基因的一致氨基酸位置的表格。
图9是源自不同物种的AHASL基因的蛋白质同一性百分数的表格。在Vector NTI软件包中开展分析(空位开口罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位隔开罚分＝8，blosum62MT2矩阵)。
图10给出了种子的立式平板生长测试法的结果，其中所述的种子来自撒播在含有37.5微摩尔咪草烟(imazethapyr)的培养基上的几个拟南芥属品系。所用种子是：1)野生型生态型Columbia2；2)csr1-2突变体(对于AHAS大亚基基因的基因组拷贝中的AtAHASLS653N突变是纯合的)；3)用AP1转化的Columbia2；4)用AP7转化的Columbia2；和5)用AP2转化的Columbia2。
图11是用于载体AUP2和AUP构建的植物转化基础载体AUP的载体图，所述载体AUP2和AUP仅因表3中所示的突变而不同。
图12是植物转化载体BAP1的载体图，所述的植物转化载体包含带S653N突变的AtAHASL的编码序列。
发明详述
本发明提供编码具有至少2个突变的AHASL(例如双重或三重突变体)的多核苷酸，所述的具有至少2个突变的AHASL显示针对除草剂、尤其咪唑啉酮除草剂，并且任选地针对磺酰脲类、***并嘧啶磺酰苯胺和/或嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂的耐受性。当仅在杂交种的一个亲代中或在多倍体植物的一个基因组上存在时，本发明的AHASL突变体可以用来产生转基因植物，其显示足够赋予商业水平除草剂耐受性的除草剂抗性水平。本发明的多核苷酸也可以用作选择性标记以转化编码其他性状的连锁基因，如美国专利号6,025,541中所描述。
虽然多个物种的AHASL蛋白在长度上因几个氨基酸而不同，不过根据本发明进行修饰的残基的相对位置是保守的(图8)。因此，除非另外说明或从上下文显而易见，本文中所述的突变就与拟南芥属AHASL多肽(SEQ ID NO:1，图1，图8)的氨基酸残基编号相对应的位置进行表述。例如，拟南芥属AHASL的第122位残基对应于玉米AHASL的第90位残基、欧洲油菜AHASL1A的第104位残基、欧洲油菜AHASL1C的第107位残基、稻AHASL的第96位残基、苋AHASL的第113位残基、大肠杆菌ilvG的第26位残基、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AHASL的第117位残基、甜菜的第113位残基、棉花的第111位残基、小果亚麻荠AHASL1的第120位残基、小果亚麻荠AHASL2的第117位残基、马铃薯AHASL1的第109位残基、马铃薯AHASL2的第111位残基、多花黑麦草的第92位残基、东方龙葵的第27位残基、双色蜀黍的第93位残基、大豆的第103位残基、向日葵AHASL1的第107位残基、向日葵AHASL2的第101位残基、向日葵AHASL3的第97位残基、普通小麦的第59位残基和苍耳的第100位残基。这些对应是本领域技术人员熟知的。基于这种对应性，AHAS大亚基序列中没有在本文具体公开的相应位置可以由技术人员容易地确定。在图3中描述与本发明有关的对应性的具体示例性区域。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了编码拟南芥属AHASL双重突变体的分离的多核苷酸，所述的双重突变体选自由以下多肽组成的组：多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO:2第92位置的位置处具有谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第139位置或SEQ ID NO:2第107位置的位置处具有异亮氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第269位置或SEQ ID NO:2第237位置的位置处具有组氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ IDNO:1第416位置或SEQ ID NO:2第384位置的位置处具有甲硫氨酸；多肽，其在对应于SEQ IDNO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第426位置或SEQ ID NO:2第394位置的位置处具有异亮氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第430位置或SEQ IDNO:2第398位置的位置处具有缬氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ IDNO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第442位置或SEQ ID NO:2第410位置的位置处具有异亮氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第445位置或SEQ ID NO:2第413位置的位置处具有异亮氨酸或天冬氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ IDNO:1第580位置或SEQ ID NO:2第548位置的位置处具有谷氨酸；多肽，其在对应于SEQ IDNO:1第124位置或SEQ ID NO:2第92位置的位置处具有谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第375位置或SEQ ID NO:2第343位置的位置处具有天冬酰胺；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；和在对应于SEQ ID NO:1第205位置或SEQ ID NO:2第173位置的位置处具有缬氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、色氨酸或酪氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的多肽。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了编码拟南芥属AHAS大亚基三重突变多肽的分离的多核苷酸，所述的三重突变多肽选自由以下多肽组成的组：多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸、在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在对应于SEQ IDNO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ IDNO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在对应于SEQ ID NO:1第57位置的位置处具有精氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第398位置或SEQ ID NO:2第366位置的位置处具有亮氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO:2第92位置的位置处具有谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在对应于SEQ IDNO:1第95位置或SEQ ID NO:2第63位置的位置处具有亮氨酸、在对应于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ ID NO:2第384位置的位置处具有谷氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；和多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸，在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺并且在对应于SEQ ID NO:1第574位置或SEQ ID NO:2第542位置的位置处具有任意氨基酸。
其他的优选实施方案包括来自其他物种的AHASL双重或三重突变体，其中所述双重或三重突变在对应于上文和图8所示表中描述的具体拟南芥属和玉米突变体的那些突变相对应的位置处存在。例如，来自微生物如大肠杆菌、酿酒酵母、沙门氏菌属(Salmonella)、集胞藻属(Synichocystis)；和来自植物如小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、高粱、谷子、甜菜、甘蔗、大豆、落花生、棉属、油菜籽、卡诺拉油菜、芸苔属(Brassica)物种、木薯、甜瓜、南瓜、辣椒、向日葵、万寿菊、茄科植物、马铃薯、甘薯、烟草、茄子、番茄、蚕豆属(Vicia)物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可的相应AHASL双重或三重突变体也处在本发明的范围内。如美国专利号5,565,350；5,731,181；5756,325；5,760,012；5,795,972和5,871,984中所描述，此类双重或三重突变体可以使用已知方法，例如，体外使用位点定向诱变法或体内使用定向诱变法或相似技术产生。
在用于目的植物中表达的表达盒中提供本发明的多核苷酸。该表达盒包含与本发明的AHASL多核苷酸序列有效连接的调节序列。如本文中所用的术语“调节元件”指能够调节有效连接的多核苷酸转录的多核苷酸。它包括但不限于启动子、增强子、内含子、5’UTR和3’UTR。“有效连接”意指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中所述启动子序列启动并介导对应于所述第二序列的DNA序列转录。通常，有效连接意思是连接的核酸序列是紧接的并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，是紧接的且在相同的可读框中。该表达盒可以额外地含有待共转化至生物内的至少一个额外基因。备选地，可以在多个表达盒上提供所述额外基因。
此种表达盒提供有多个限制性位点，所述限制性位点用于***待受到调节区转录调控的AHASL多核苷酸。该表达盒可以额外地含有选择性标记基因。
此表达盒在5’-3’转录方向上包含在植物中有功能的转录和翻译起始区(即启动子)、本发明的AHASL多核苷酸序列以及转录和翻译终止区(即终止区)。所述启动子可以是天然的或类似的，或对于植物宿主和/或对于本发明的AHASL多核苷酸序列是外来或异源的。另外，该启动子可以是天然序列或备选地是合成序列。在启动子对于植物宿主是“外来的”或“异源的”的情况下，意指该启动子在导入此启动子的天然植物中不存在。在启动子对于本发明的AHASL多核苷酸序列是“外来的”或“异源的”的情况下，意指该启动子对于本发明有效连接的AHASL多核苷酸序列而言不是本来的或天然存在的启动子。如本文中所用，嵌合基因包含编码序列，其中所述的编码序列有效连接到对该编码序列为异源的转录起始区。
尽管使用异源启动子表达本发明的AHASL多核苷酸可以是优选的，也可以使用天然启动子序列。此类构建体将改变植物或植物细胞中AHASL蛋白的表达水平。因此，改变了植物或植物细胞的表型。
所述终止区可以是与转录起始区天然联系的，可以是与有效连接的目的AHASL序列天然联系的，可以是与植物宿主天然联系的，或可以从另外的来源(即，对启动子、目的AHASL多核苷酸序列、植物宿主或其任意组合为外来或异源的)衍生。常规终止区可以从根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒得到，如章鱼碱合酶和胭脂氨酸合酶终止区。也见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell64:671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5:141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell2:1261-1272；Munroe等人(1990)Gene91:151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903；和Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.15:9627-9639。
根据需要，基因可以进行优化用于在转化植物中增加表达。也即是可以使用植物优选密码子来合成所述基因用于改进表达。见，例如Campbell和Gowri(1990)PlantPhysiol.92:1-11对宿主优选密码子选择的讨论。本领域中可获得用于合成植物优选基因的方法。见，例如美国专利号5,380,831和5,436,391,以及Murray等人(1989)NucleicAcids Res.17:477-498，所述文献在本文通过引用的方式并入。
已知额外的序列修饰来增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除编码假多腺苷酸化信号的序列、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列的序列和可能有损于基因表达的其它此类充分表征的序列。可以调整序列的G-C含量至给定细胞宿主的平均水平，其中所述的平均水平如通过参考该宿主细胞中表达的已知基因加以计算。当可能时，修饰所述序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。
用于增强基因表达的核苷酸序列也可以用在植物表达载体中。这些核苷酸序列包括玉米AdhI的内含子，内含子1基因(Callis等人(1987)Genes and Development1:1183-1200)，以及来自烟草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿矮缩病毒和苜蓿花叶病毒的前导序列(W-序列)(Gallie等人(1987)Nucleic Acid Res.15:8693-8711和Skuzeski等人(1990)PlantMolec.Biol.15:65-79)。已显示来自玉米皱缩蛋白-1(shrunken-1)基因座的第一内含子提高了嵌合基因构建体中的基因表达。美国专利号5,424,412和5,593,874公开了特定内含子在基因表达构建体中的用途，并且Gallie等人,1994,Plant Physiol.106:929-939也证明内含子可用于在组织特异性基础上调节基因表达。为进一步增强或优化AHAS大亚基基因表达，本发明的植物表达载体还可以包含含有基质附着区(MAR)的DNA序列。之后，用此类修饰的表达***经转化的植物细胞可以表现出本发明核苷酸序列的过量表达或组成型表达。
表达盒可以额外地在表达盒构建体中含有5’前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5'非编码区)(Elroy-Stein等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6126-6130)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀斑病毒)(Gallie等人(1995)Gene165(2):233-238)、MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)(Virology154:9-20)，和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature 353:90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外被蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻译前导序列(Jobling等人(1987)Nature325:622-625)；烟草花叶病毒(TMV)前导序列(Gallie等人(1989),于Molecular Biology of RNA一书中,Cech编著(Liss,New York),第237-256页)；玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人(1991),Virology81:382-385)。也见Della-Cioppa等人(1987),Plant Physiol.84:965-968。也可以使用已知增强翻译的其它方法，例如内含子等。
在制备表达盒时，可以操作多种DNA片段，从而使得DNA序列处于合适的方向并且根据需要处于恰当的阅读框中。为此目的，可以使用衔接头或接头来连接DNA片段或可以包括其它操作来提供方便的限制性位点、移除多余DNA、移除限制性位点等。为此目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制、复性和再替换，例如转换和颠换。
可以在本发明的实践中使用众多启动子。可以基于所需要的结果选择启动子。核酸可以与组成型、组织优选的或其它启动子组合用于在植物中表达。
例如，此类组成型启动子包括Rsyn7启动子的核心启动子和在WO99/43838和美国专利号6,072,050中公开的其它组成型启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等人(1985)Nature313:810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人(1990)Plant Cell2:163-171)；遍在蛋白启动子(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten等人,(1984)EMBO J.3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其它组成型启动子包括例如美国专利号5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611。
组织优选的启动子可以用来在特定的植物组织中达到增强的AHASL表达。此类组织优选的启动子包括但不限于，叶优选的启动子、根优选的启动子、种子优选的启动子和茎优选的启动子。组织优选的启动子包括Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata等人(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen等人(1997)Mol.GenGenet.254(3):337-343；Russell等人(1997)Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart 等人(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341；Van Camp等人(1996)Plant Physiol.112(2):525-535；Canevascini等人(1996)Plant Physiol.112(2):513-524；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196；Orozco等人(1993)Plant Mol Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka等人(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590和Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.4(3):495-505所公开的启动子。如果需要，可以修饰此类启动子用于弱表达。
在一个实施方案中，将目的核酸靶向到叶绿体用于表达。以这种方式，在目的核酸不直接被***叶绿体时，表达盒额外地包含叶绿体靶向序列，该靶向序列包含编码指引目的基因产物到叶绿体中的叶绿体转运肽的核苷酸序列。此类转运肽是本领域已知的。就叶绿体靶向序列而言，“有效连接”意指编码转运肽(即叶绿体靶向序列)的核酸序列与本发明的AHASL多核苷酸连接，从而这两个序列是紧接的且在相同的可读框中。见，例如，VonHeijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84:965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421；和Shah等人(1986)Science233:478-481。尽管本发明的AHASL蛋白包括天然的叶绿体转运肽，可以通过将叶绿体靶向序列有效连接到编码本发明成熟AHASL蛋白的核苷酸序列的5’端，将本领域已知的任何叶绿体转运肽融合到本发明的成熟AHASL蛋白的氨基酸序列上。
叶绿体靶向序列是本领域已知的并且包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho等人(1996)Plant Mol.Biol.30:769-780；Schnell等人(1991)J.Biol.Chem.266(5):3335-3342)；5-(烯醇式丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等人(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6):789-810)；色氨酸合酶(Zhao等人(1995)J.Biol.Chem.270(11):6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等人(1997)J.Biol.Chem.272(33):20357-20363)；分支酸合酶(Schmidt等人(1993)J.Biol.Chem.268(36):27447-27457)；和捕获光的叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等人(1988)J.Biol.Chem.263:14996-14999)。也参见Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84:965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421；和Shah等人(1986)Science233:478-481。
用于转化叶绿体的方法是本领域已知的(见，例如，Svab等人(1990),Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12:601-606)。所述方法依赖于粒子枪递送含有选择性标记的DNA和通过同源重组靶将该DNA向到质体基因组。另外，可以通过核编码的和质体导向的RNA聚合酶的组织优选的表达，通过沉默质体产生转基因的反式激活作用来实现质体转化。此类***已经在McBride等人(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7301-7305中报道。
可以优化待靶向到叶绿体的目的核酸用于在叶绿体中表达，因为在植物细胞核和此细胞器之间的密码子选择存在不同。以这种方式，可以使用叶绿体优选的密码子合成目的核酸。见，例如，美国专利号5,380,831，在本文引用作为参考。
特别地，本发明描述了使用编码AHASL突变多肽的多核苷酸来设计耐受除草剂的植物，其中所述AHASL突变多肽包含至少2个突变。这种策略在本文已经使用拟南芥属AHASL突变体在拟南芥中，和使用玉米AHASL2突变体在谷物中进行了证实，不过其应用不限于这些基因或不限于这些植物。在优选的实施方案中，除草剂是咪唑啉酮和/或磺酰脲。在其他的优选实施方案中，与野生型植物和与已知的AHAS突变体相比，改善和/或增强了除草剂耐受性。
本发明也提供产生转基因作物植物的方法，所述的转基因作物植物含有包含至少2个突变的AHASL突变体编码核酸，其中与野生型植物或与已知的AHAS突变型植物相比时，所述多核苷酸在该植物中的表达导致除草剂耐受性，所述方法包括：(a)将包含核酸的表达载体导入植物细胞，所述核酸编码具有至少2个突变的AHASL突变体，和(b)从该植物细胞产生耐受除草剂的转基因植物。该植物细胞包括但不限于原生质体、配子生产细胞、和再生为完整植物的细胞。如本文中所用，术语“转基因的”指含有至少一种重组多核苷酸的全部或部分的任意植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。在多种情况下，重组多核苷酸的全部或部分稳定地整合至染色体或整合至稳定的染色体外元件，从而它被传递到后续世代中。
在另一个实施方案中，本发明涉及使用本发明的突变AHASL多肽作为选择性标记。本发明提供了鉴定或选择经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分的方法，所述方法包括a)提供经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分，其中所述经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分包含编码如上文所述的本发明AHAS大亚基双重突变多肽的分离核酸，其中使用该多肽作为选择性标记，并且其中所述经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分可以任选地包含其他的目的分离核酸；b)使所述经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分与至少一种AHAS抑制剂或AHAS抑制性化合物接触；c)确定所述植物细胞、植物组织、植物或其部分是否受所述抑制剂或抑制性化合物影响；和d)鉴定或选择经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分。
本发明也体现在本文中所述的含有双重和三重突变的纯化AHASL蛋白，所述的纯化AHASL蛋白用于分子建模研究以设计进一步改善除草剂耐受性。蛋白质纯化的方法是熟知的，并且可以使用市售产品或专门设计的方法轻易完成，例如在ProteinBiotechnology,Walsh和Headon(Wiley,1994)中描述。
本发明还提供了非转基因的和转基因的耐受除草剂的植物，所述耐受除草剂的植物包含编码AHASL双重突变多肽的一种多核苷酸或编码AHASL单一突变多肽的两种多核苷酸。从其中产生的非转基因植物可以通过这种方式产生，即第一植物与第二植物交叉授粉并使花粉接受植物(可以是所述第一或第二植物)从这种交叉授粉中产生种子。所产生的种子和后代植物可以具有杂交到一个单一等位基因或两个等位基因上的双重突变。该花粉接受植物可以是第一或第二植物。所述第一植物包含编码第一AHASL单一突变多肽的第一多核苷酸。所述第二植物包含编码第二AHASL单一突变多肽的第二多核苷酸。所述第一和第二AHASL单一突变多肽包含相对于野生型AHASL多肽的不同单一氨基酸替换。可以选择源自其中的种子或后代植物，所述的种子或后代植物包含编码AHASL双重突变多肽的一种多核苷酸或编码所述两种AHASL单一突变多肽的两种多核苷酸。所选择的后代植物表现了出人意料的较高水平的AHAS抑制型除草剂(例如咪唑啉酮除草剂或磺酰脲除草剂)耐受性，所述水平高于从两种AHASL单一突变多肽在单个植物中组合所预测的水平。后代植物表现表现了除草剂耐受性方面的协同作用，其中在包含来自亲代植物的第一和第二突变的后代植物中的除草剂耐受性水平高于包含两拷贝的第一多核苷酸或两拷贝的第二多核苷酸的植物的除草剂耐受性水平。
当所述第一和第二植物分别对所述第一和第二多核苷酸是纯合时，所得后代植物的每一株包含所述第一和第二多核苷酸的每种多核苷酸的一个拷贝，并且可以省略选择步骤。当第一和第二植物至少之一是杂合时，可以选出包含两种多核苷酸的后代植物，例如通过分析后代植物的DNA以鉴定包含所述第一和第二多核苷酸的后代植物，或通过测试后代植物提高的除草剂耐受性。包含所述第一和第二多核苷酸这两者的后代植物表现出比包含两个拷贝的第一多肽或两个拷贝的第二多肽的植物的除草剂耐受性水平更高的除草剂耐受性水平。
在一个实施方案中，本发明的植物包含编码第一AHASL单一突变多肽的第一多核苷酸和编码第二AHASL单一突变多肽的第二多核苷酸，或包含两个核苷酸突变的编码AHASL的多核苷酸，所述两个核苷酸突变导致与所述第一和所述第二AHASL单一突变多肽的氨基酸突变相对应的氨基酸突变，其中所述的第一和第二AHASL单一突变多肽选自由以下多肽组成的组：在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸的第二多肽；在对应于SEQID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO:2第92位置的位置处具有谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第139位置或SEQ ID NO:2第107位置的位置处具有异亮氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第269位置或SEQ ID NO:2第237位置的位置处具有组氨酸的第二多肽；在对应于SEQ IDNO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ ID NO:2第384位置的位置处具有甲硫氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQID NO:1第426位置或SEQ ID NO:2第394位置的位置处具有异亮氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第430位置或SEQ ID NO:2第398位置的位置处具有缬氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第442位置或SEQ ID NO:2第410位置的位置处具有异亮氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第445位置或SEQ ID NO:2第413位置的位置处具有异亮氨酸或天冬氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第580位置或SEQ ID NO:2第548位置的位置处具有谷氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO:2第92位置的位置处具有谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸的第一多肽和在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸的第一多肽和在对应于SEQ ID NO:1第375位置或SEQ ID NO:2第343位置的位置处具有天冬酰胺的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸的第一多肽和在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ IDNO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第二多肽；在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺的第一多肽且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的第二多肽；和在对应于SEQ ID NO:1第205位置或SEQ ID NO:2第173位置的位置处具有缬氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、色氨酸或酪氨酸的第一多肽和在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的第二多肽。可以通过除上文所述交叉授粉法之外的方法产生包含AHASL多核苷酸的双重突变的非转基因植物，所述的方法例如是，但不限于如Kochevenko等人(Plant Phys.132:174-184,2003)中所述的定向体内诱变。所述双重突变可以位于植物基因组的单个等位基因或两个等位基因上。
本发明的另一个实施方案涉及用包含分离的多核苷酸的表达载体所转化的转基因植物，其中所述的分离的多核苷酸编码选自由以下多肽组成的组的乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)双重突变多肽：多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO:2第92位置的位置处具有谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第139位置或SEQ ID NO:2第107位置的位置处具有异亮氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第269位置或SEQ ID NO:2第237位置的位置处具有组氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ ID NO:2第384位置的位置处具有甲硫氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ IDNO:1第426位置或SEQ ID NO:2第394位置的位置处具有异亮氨酸；多肽，其在对应于SEQ IDNO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第430位置或SEQ ID NO:2第398位置的位置处具有缬氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第442位置或SEQ IDNO:2第410位置的位置处具有异亮氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ IDNO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第445位置或SEQ ID NO:2第413位置的位置处具有异亮氨酸或天冬氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第580位置或SEQ ID NO:2第548位置的位置处具有谷氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO:2第92位置的位置处具有谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ IDNO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第375位置或SEQ ID NO:2第343位置的位置处具有天冬酰胺；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在对应于SEQ IDNO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；和在对应于SEQ ID NO:1第205位置或SEQ ID NO:2第173位置的位置处具有缬氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、苏氨酸、色氨酸或酪氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸的多肽。
本发明还提供了非转基因的和转基因的耐受除草剂的植物，所述耐受除草剂的植物包含编码AHASL三重突变多肽的一种多核苷酸或一种或多种编码AHASL的多核苷酸，其中所述的编码AHASL的多核苷酸包含三个突变。为了使用包含三个突变的一种或多种多核苷酸产生非转基因植物，包含一种或两种多核苷酸(其包含上文所述的第一和第二突变)的后代植物与包含编码第三AHASL单一突变多肽的第三多核苷酸的第三植物交叉授粉。相对于野生型AHASL多肽，第三AHASL单一突变多肽包含与所述第一或第二AHASL单一突变多肽不同的单个氨基酸替换。如上文所述选择包含一种或多种多核苷酸的种子或后代植物，所述的多核苷酸包含所述三个突变。选择的后代植物包含这样的除草剂耐受水平，其大于组合三种在单个植物中的AHASL单一突变多肽的加合作用。可以通过除上文所述交叉授粉法之外的方法产生包含AHASL多核苷酸的三重或多重突变的非转基因植物，所述的方法例如是，但不限于如上文所述的定向体内诱变。所述多重突变可以位于植物基因组的单个等位基因或多个等位基因上。
在一个实施方案中，本发明的植物包含编码第一AHASL单一突变多肽的第一多核苷酸、编码第二AHASL单一突变多肽的第二多核苷酸和编码第三AHASL单一突变多肽的第三多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的植物包含了含有3个突变的编码AHASL的多核苷酸，其中所述三个核苷酸突变导致与所述第一、所述第二和所述第三AHASL单一突变多肽的突变相对应的氨基酸突变。在又一个实施方案中，本发明的植物包含了含有单一突变的编码AHASL的多核苷酸和含有双重突变的多核苷酸，其中所述的核苷酸突变导致与前述第一、第二和第三AHASL单一突变多肽的突变相对应的氨基酸突变，其中所述的第一、第二和第三AHASL单一突变多肽选自由以下多肽组成的组：多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸、在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ IDNO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；多肽，其在对应于SEQID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在对应于SEQ ID NO:1第57位置的位置处具有精氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第398位置或SEQ ID NO:2第366位置的位置处具有亮氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ ID NO:2第92位置的位置处具有谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第95位置或SEQ ID NO:2第63位置的位置处具有亮氨酸、在对应于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ ID NO:2第384位置的位置处具有谷氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；和多肽，其在对应于SEQID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸，在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺并且在对应于SEQ ID NO:1第574位置或SEQ ID NO:2第542位置的位置处具有任意氨基酸。
备选地，如下产生包含编码AHASL单一突变多肽的一种或多种多核苷酸的植物，通过用两种或多种此类多核苷酸转化植物或用编码第一AHASL单一突变多肽的第一多核苷酸转化第一植物并且所述第一植物与包含编码第二AHASL单一突变多肽的第二多核苷酸的第二植物交叉授粉。所述第二植物包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸包含内源性或通过转化作用导入的第二AHASL单一突变多肽。所述第一和第二AHASL单一突变多肽包含相对于野生型AHASL多肽为不同的单一氨基酸替换。根据需要，如上文所述选择包含所述第一和第二多核苷酸的种子或后代植物。
本发明的又一个实施方案涉及用包含分离的多核苷酸的表达载体所转化的转基因植物，其中所述的分离的多核苷酸编码选自由以下多肽组成的组的乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)三重突变多肽：多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸、在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQ ID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ IDNO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第122位置或SEQID NO:2第90位置的位置处具有缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸，在对应于SEQ ID NO:1第57位置的位置处具有精氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第398位置或SEQ IDNO:2第366位置的位置处具有亮氨酸；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第124位置或SEQ IDNO:2第92位置的位置处具有谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或天冬酰胺，在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺；多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第95位置或SEQ ID NO:2第63位置的位置处具有亮氨酸、在对应于SEQ ID NO:1第416位置或SEQ ID NO:2第384位置的位置处具有谷氨酸且在对应于SEQ ID NO:1第653位置或SEQ ID NO:2第621位置的位置处具有苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或色氨酸；和多肽，其在对应于SEQ ID NO:1第197位置或SEQ ID NO:2第165位置的位置处具有丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或异亮氨酸，在对应于SEQ ID NO:1第199位置或SEQ ID NO:2第167位置的位置处具有丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺并且在对应于SEQ ID NO:1第574位置或SEQ ID NO:2第542位置的位置处具有任意氨基酸。
本发明提供了除草剂耐受性或除草剂抗性植物，所述植物包含除草剂耐受性或除草剂抗性AHASL蛋白，所述除草剂耐受性或除草剂抗性AHASL蛋白包括但不限于由本发明多核苷酸编码的AHASL单一突变多肽和AHASL二重和三重突变多肽。“除草剂耐受性”或“除草剂抗性”植物意指耐受或抵抗在通常会杀死正常或野生型植物或抑制其生长的水平的至少一种除草剂的植物。“除草剂耐受性AHASL蛋白”或“除草剂抗性AHASL蛋白”意指当存在已知干扰AHAS活性的至少一种除草剂并处于该除草剂的已知抑制野生型AHASL蛋白AHAS活性的浓度或水平时，相对于野生型AHASL蛋白的AHAS活性，此种AHASL蛋白表现较高的AHAS活性。进一步地，这种除草剂耐受性或除草剂抗性AHASL蛋白的AHAS活性可以在本文中称作“除草剂耐受性”或“除草剂抗性”AHAS活性。
对于本发明，术语“除草剂耐受的”和“除草剂抵抗的”可互换使用并且意图具有等同的意义和等同的范围。类似地，术语“除草剂耐受性”和“除草剂抗性”可互换使用并且意图具有等同的意义和等同的范围。同样地，术语“咪唑啉酮抵抗的”和“咪唑啉酮抗性”可互换使用并且意图分别具有如术语“咪唑啉酮耐受的”和“咪唑啉酮耐受性”那样的等同意义和等同范围。
本发明包括除草剂抗性AHASL多核苷酸和除草剂抗性AHASL蛋白。“除草剂抗性AHASL多核苷酸”意指编码包含除草剂抗性AHAS活性的蛋白质的多核苷酸。“除草剂抗性AHASL蛋白”意指编码包含除草剂抗性AHAS活性的蛋白质或多肽。
另外，认识到除草剂耐受性或除草剂抗性AHASL蛋白可以通过用编码除草剂耐受性或除草剂抗性AHASL蛋白的核苷酸序列转化植物或其祖先来导入植物。此类除草剂耐受性或除草剂抗性AHASL蛋白由除草剂耐受性或除草剂抗性AHASL多核苷酸编码。备选地，除草剂耐受性或除草剂抗性AHASL蛋白，例如本文中所公开的AHASL单一突变多肽，可以在植物中因植物或其先祖的基因组中内源性AHASL基因中天然存在的突变或诱导的突变而存在。
本发明提供了植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞，它们具有提高的针对至少一种除草剂、尤其咪唑啉酮或磺酰脲除草剂的抗性或耐受性。除草剂的优选量或浓度是“有效量”或“有效浓度”。术语“有效量”或“有效浓度”分别意指这种量或浓度，即它足够杀死相似的、野生型植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞或抑制其生长，但是该量并不杀死本发明的除草剂抗性植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞或严重地抑制其生长。一般地，除草剂的有效量是农业生产***中例行用来杀死目的杂草的量。这种量是本领域普通技术人员已知的。
术语“相似的、野生型植物、植物细胞或宿主细胞”分别意指缺少本文中所公开的本发明的除草剂抗性特征和/或具体多核苷酸的植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞。使用术语“野生型”因此不意图暗示植物、植物组织、植物细胞或其它宿主细胞在其基因组中缺少重组DNA，和/或不拥有与本文中所公开那些除草剂抗性特征不同的除草剂抗性特征。
如本文中所用，除非另外清楚地说明，术语“植物”意指处于任意发育期的植物，以及可以与完整无缺的植物相联系或分离的任意植物部分或诸部分。此类植物部分包括但不限于植物的器官、组织和细胞。具体植物部分的实例包括茎、叶、根、花序、花、小花、果实、花梗、花序梗、雄蕊、花药、柱头、花柱、子房、花瓣、萼片、心皮、根尖、根冠、根毛、叶毛、种毛、花粉粒、微孢子、子叶、下胚轴、上胚轴、木质部、韧皮部、薄壁组织、胚乳、伴细胞、保卫细胞和植物的任意其他已知器官、组织和细胞。另外，认识到种子是植物。
本发明的植物包括非转基因植物和转基因植物。“非转基因植物”意指其基因阻中缺少重组DNA的植物。“转基因植物”意指其基因阻中包含重组DNA的植物。这种转基因植物可以通过将重组DNA导入植物基因组产生。当这种重组DNA并入转基因植物的基因组时，该植物的后代植物也可以包含该重组DNA。包含至少一种先祖转基因植物的重组DNA的至少一部分的后代植物也是转基因植物。
在某些实施方案中，本发明涉及通过突变育种法产生的除草剂抗性植物。此类植物包含编码AHAS大亚基单一突变多肽的多核苷酸并且耐受一种或多种AHAS抑制型除草剂。此类方法可以包括例如使植物或种子暴露于致变物、尤其化学致变物例如甲磺酸乙酯(EMS)，并且选择具有针对至少一种AHAS抑制型除草剂、尤其咪唑啉酮除草剂或磺酰脲除草剂的增强耐受性的植物。然而，本发明不限于通过包括化学致变物EMS在内的诱变方法产生的耐受除草剂的植物。本领域已知的任意诱变方法可以用来产生本发明的除草剂抗性植物。此类诱变方法可以包括例如使用任意一种或多种以下致变物：辐射，如X-射线、γ射线(例如，钴60或铯137)、中子(例如，原子反应堆中铀235的核裂变产物)、β辐射(例如，从放射性同位素如磷32或碳14发射)和紫外辐射(优选地2500至2900nm)和化学致变物如碱基类似物(例如，5-溴-尿嘧啶)、相关化合物(例如8-乙氧咖啡因)、抗生素(例如链黑霉素)、烷化剂(例如硫芥子气、氮芥子气、环氧化物、乙烯亚胺、硫酸酯、磺酸酯、砜、内酯)、氮化物、羟胺、亚硝酸或吖啶。除草剂抗性植物也可以使用选择植物细胞的组织培养方法产生，所述的组织培养方法包括产生除草剂抗性突变并随后从中再生除草剂抗性植物。例如，参见美国专利号5,773,702和5,859,348，两者均通过引用方式完整地并入本文。突变育种法的进一步细节可以在“Principals of Cultivar Development”Fehr,1993Macmillan PublishingCompany中找到，其中所述文献的公开内容通过引用的方式并入本文。
本发明提供用于增强植物、植物组织、植物细胞或其他宿主细胞针对干扰AHAS酶活性的至少一种除草剂的耐受性或抗性的方法。优选地，这种除草剂是咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、***并嘧啶除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂、磺酰氨基-羰基***啉酮除草剂或它们的混合物。更优选地，这种除草剂是咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂或它们的混合物。对于本发明，咪唑啉酮除草剂包括但不限于(咪草烟)、(甲灭草烟)、(甲氧咪草烟)、(灭草喹)、(imazethabenz)、(灭草烟)、任意前述除草剂的衍生物，或两种或多种前述除草剂的混合物，例如灭草烟/甲氧咪草烟。更具体地，咪唑啉酮除草剂可以选自但不限于2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、[2-(4-异丙基)-4-][甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-3-喹啉羧]酸、[5-乙基-2-(4-异丙基-]4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧甲基)-烟酸、[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-]咪唑啉-2-基)-5-甲基烟酸和甲基[6-(4-异丙基-4-]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-间-甲苯甲酸酯和甲基[2-(4-异丙基-4-甲基-5-]氧代-2-咪唑啉-2-基)–对-甲苯甲酸酯的混合物。优选使用5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸和[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-]基)-5-(甲氧甲基)-烟酸。特别优选使用[2-(4-异丙基-4-]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧甲基)-烟酸。
对于本发明，磺酰脲除草剂包括但不限于绿黄隆、甲磺隆、嘧黄隆、氯嘧黄隆、噻黄隆、苯黄隆、禾草苄混剂、烟嘧黄隆、胺苯黄隆、玉嘧黄隆、氟胺黄隆、醚苯黄隆、氟嘧黄隆、醚黄隆、磺氨黄隆(amidosulfiuon)、fluzasulfuron、啶咪黄隆、吡氯黄隆、氯吡氯黄隆、四唑嘧磺隆、环丙嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰氨磺隆、碘磺隆(iodosulfuron)、环氧嘧磺隆、甲基二磺隆(mesosulfuron)、氟磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、三氟甲磺隆、任意前述除草剂的衍生物、和两种或多种前述除草剂的混合物。本发明的***并嘧啶除草剂包括但不限于氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺和五氟磺草胺。本发明的嘧啶基氧基苯甲酸酯(或嘧啶羧酸)除草剂包括但不限于双草醚、嘧硫草醚、嘧草醚、嘧啶肟草醚和环酯草醚。磺酰氨基-羰基***啉酮除草剂包括但不限于氟酮磺隆和丙苯黄隆。
认识到嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂与嘧啶基硫代苯甲酸酯(pyrimidinylthiobenzoate)除草剂密切相关并且由美国杂草科学学会(Weed ScienceSociety of America)在后一名称下概述。因此，本发明的除草剂还包括嘧啶基硫代苯甲酸酯除草剂，其包括但不限于上文所述的嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂。
本发明提供用于增强植物中AHAS活性的方法，所述方法包括用包含有效连接到本发明AHASL核苷酸序列的启动子的多核苷酸构建体转化植物。所述方法包括将本发明的多核苷酸构建体导入至少一个植物细胞并从中再生转化的植物。所述方法包括使用能够驱动植物细胞中基因表达的启动子。优选地，这种启动子是组成型启动子或组织优选的启动子。所述方法用于增强或提高植物针对干扰AHAS酶催化活性的至少一种除草剂、尤其咪唑啉酮除草剂的抗性。
本发明提供用于在植物、植物组织、植物细胞和其它宿主细胞中表达本发明多核苷酸的表达盒。所述表达盒包含在目的植物、植物组织、植物细胞或其它宿主细胞中可表达的启动子，其有效连接至包含编码全长(即包括叶绿体转运肽)或成熟(即无叶绿体转运肽)AHASL蛋白的核苷酸序列的本发明多核苷酸上。若需要在植物或植物细胞的质体或叶绿体中表达，该表达盒也可以包含有效连接的编码叶绿体转运肽的叶绿体靶向序列。
本发明的表达盒用在增强植物或宿主细胞的除草剂耐受性的方法中。所述方法包括用本发明的表达盒转化该植物或宿主细胞，其中所述的表达盒包含在目的植物或宿主细胞中可表达的启动子，并且该启动子有效连接至本发明的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含编码本发明的咪唑啉酮抗性AHASL蛋白的核苷酸序列。
本文中术语“多核苷酸构建体”的使用不意图将本发明限于包含DNA的多核苷酸构建体。本领域的普通技术人员将认识到，包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合的多核苷酸构建体，尤其多核苷酸和寡核苷酸，也可以用在本文公开的方法中。因此，本发明的多核苷酸构建体包括可以用在本发明方法中用于转化植物的全部多核苷酸构建体，包括但不限于包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和其组合的那些多核苷酸构建体。此类脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。本发明的多核苷酸构建体还包括全部形式的多核苷酸构建体，它们包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎环结构等。另外，本领域的普通技术人员理解在本文公开的每种核苷酸序列还包括所例示的核苷酸序列的互补物。
另外，认识到为了在目的宿主细胞中表达本发明的多核苷酸，该多核苷酸一般有效连接至能够驱动目的宿主细胞中基因表达的启动子。用于在宿主细胞中表达多核苷酸的本发明方法不依赖于特定的启动子。所述方法包括使用本领域已知的并且能够驱动目的宿主细胞中基因表达的任意启动子。
本发明包括AHASL多核苷酸分子以及其片段和变体。作为这些核苷酸序列的片段的多核苷酸分子也由本发明包括。“片段”意指编码本发明AHASL蛋白的核苷酸序列的部分。优选地，本发明的AHASL核苷酸序列的片段编码AHASL蛋白的生物学活性部分。AHASL蛋白的生物学活性部分可以通过下列方式制备：分离一种本发明AHASL核苷酸序列的一部分，表达该AHASL蛋白的编码部分(例如通过体外重组表达)，并且评估该AHASL蛋白的编码部分的活性。作为AHASL核苷酸序列的片段并编码AHASL蛋白的生物学活性部分的多核苷酸分子至少包含大约500、750、1000、1250、1500、1600、1700、1800、1900或2000个核苷酸，或者多达在本文公开的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数目(例如，对于SEQ ID NO:30为2013个核苷酸)，这取决于预期用途。
编码本发明AHASL蛋白的生物学活性部分的AHASL多核苷酸序列片段编码至少约200,300,400,500,550,650,或650个连续氨基酸，或多达在本发明的全长AHASL蛋白中存在的氨基酸总数(例如，对于SEQ ID NO:1为670个氨基酸)。
本发明也包含这样的多核苷酸分子，其中所述的多核苷酸分子包含本文中所公开的核苷酸序列的变体的核苷酸序列。本发明的AHASL核苷酸序列的“变体”包括编码本文公开的突变AHASL多肽但是由于遗传密码简并性而保守性不同的那些序列。这些天然存在的等位基因变体可以使用熟知的分子生物学技术鉴定，如下文说明的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。变体核苷酸序列也包括合成方式衍生的核苷酸序列，例如，它们通过使用位点定向诱变产生，但如下文所讨论仍编码本发明中所公开的AHASL蛋白。通常，本发明的多核苷酸序列变体与本文公开的特定核苷酸序列具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。变体AHASL多核苷酸序列分别编码这样的AHASL突变多肽，所述AHASL突变多肽具有与本文公开的AHASL多肽的氨基酸序列具备至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
另外，技术人员还了解，可以通过突变将改变引入本发明的多核苷酸序列，从而导致所编码的AHASL双重和三重突变多肽的氨基酸序列改变而不改变所述双重和三重突变多肽的生物学活性。因此，可以通过将一个或多个核苷酸替换、添加或缺失引入本文公开的相应核苷酸序列，从而将一个或多个氨基酸替换、添加或缺失引入所编码的蛋白质中，来产生编码AHASL双重和三重突变多肽的分离的多核苷酸分子，其中所述的AHASL双重和三重突变多肽具有与图1和2中所述双重和三重突变序列不同的序列。可以通过标准技术如位点定向诱变和PCR介导的诱变来导入突变。此类变体核苷酸序列也由本发明包括。
例如，优选地，可以在一个或多个预测的、优选地非必需氨基酸残基处产生保守性氨基酸替换。“非必需”氨基酸残基是可以从AHASL蛋白的野生型序列(例如SEQ ID NO:1的序列)改变但是不改变生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物学活性所需要的。“保守性氨基酸替换”是其中氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基的氨基酸残基替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支的侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。不对保守氨基酸残基或不对存在于保守基序中的氨基酸残基进行此类替换。
本发明的蛋白质可以以多种方式进行改变，包括氨基酸替换、缺失、截短和***。用于此类操作的方法通常是本领域已知的。例如，可以通过DNA中的突变来制备AHASL蛋白的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列变更的方法是本领域熟知的。见，例如，Kunkel,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492；Kunkel等人(1987)Methods inEnzymol.154:367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra编著(1983),Techniquesin Molecular Biology(MacMillan Publishing Company,New York)，以及其中引用的参考文献。关于不影响目的蛋白质生物学活性的适当氨基酸替换的指导可以在Dayhoff等人(1978),Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型中找到，所述文献在本文中引用作为参考。保守性替换，如将一个氨基酸替换为具有相似特性的另一个氨基酸，可以是优选的。
认识到本发明的多核苷酸分子和多肽包括这样的多核苷酸分子和多肽，它们包含与图1和2中所示的双重突变或三重突变核苷酸序列或与图1和2中所示的氨基酸序列充分同一的核苷酸序列或氨基酸序列。术语“充分同一的”在本文中用来指含有足够或最小数目的与第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同(例如具有相似侧链的)氨基酸残基或核苷酸的第一氨基酸或核苷酸序列，从而所述的第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构性结构域和/或共同的功能活性。例如，包含具有至少约80％同一性、优选85％同一性、更优选90％、95％或98％同一性的共同结构性结构域的氨基酸或核苷酸序列在本文中定义为充分同一的。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸的百分同一性，所述序列为最佳比较目的进行比对。这两个序列之间的百分同一性是所述序列共有的相同位置的函数(即百分同一性＝相同位置数/位置总数(例如，重叠位置)x100)。在一个实施方案中，两个序列具有相同长度。可以使用与下文所述那些技术相似的技术，在容许或不容许空位的情况下确定两个序列之间的百分同一性。在计算百分同一性中，一般计数精确匹配。
可以使用数学算法完成两个序列之间百分同一性的确定。用于比较两个序列的数学算法的优选的非限制性实例是Karlin和Altschul,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264的算法，该算法如在Karlin和Altschul,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中改良。此种算法并入至Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序。可以用NBLAST程序、分值＝100、字长＝12进行BLAST核苷酸搜索以获得与本发明多核苷酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序、分值＝50、字长＝3进行BLAST蛋白质搜索以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了出于比较目的获得空位比对结果，可以如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389中所述使用空位BLAST。备选地，PSI-Blast可以用来开展检测分子间远缘关系的重复搜索。见上文Altschul等人,1997。当使用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。另一个用于序列比较的优选的非限制性数学算法实例是Myers和Miller(1988)CABIOS4:11-17的算法。此种算法并入至ALIGN程序(版本2.0)，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序以比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。可以通过目测法手动开展比对。
除非另外说明，本文中提供的序列同一性/相似性值指通过算法Clustal W(Nucleic Acid Research,22(22):4673-4680,1994)，使用在软件包Vector NTI Suite第9版(Invitrogen,1600Faraday Ave.,Carlsbad,CA92008)中包括的程序AlignX，使用默认参数；或其任意等同程序，使用本发明的全长序列并使用多重比对结果获得的值。“等同程序”意指任意的序列比较程序，对于讨论的任意两个序列而言，与软件包Vector NTI Suite第9版中的AlignX所产生的相应比对结果比较时，所述序列比较程序产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配和相同百分序列同一性的比对结果。
不希望缺失、***和替换本文所包括的蛋白质序列会引起蛋白质特征的根本变化。但是，当如此操作之前难以预测替换、缺失或***的确切作用时，本领域技术人员了解可以通过常规筛选测定法评估这种作用。那就是说，可以通过AHAS活性测定法评估此活性。见，例如Singh等人(1988)Anal.Biochem.171:173-179，在本文引用作为参考。
如本文中公开，本发明的多核苷酸用来增强在其基因组中包含编码除草剂耐受性AHASL蛋白的基因的植物的除草剂耐受性。此种AHASL基因可以是内源基因或转基因。另外，在某些实施方案中，可以将本发明的多核苷酸序列与目的多核苷酸序列的任何组合堆积在一起以产生具有所需表型的植物。例如，本发明的多核苷酸可以与编码具有杀虫和/或杀昆虫(insecticidal)活性的多肽(例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒蛋白)的任何其它多核苷酸堆积在一起(在美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene48:109中描述)。生成的组合还可以包括任何一种目的多核苷酸的多个拷贝。
尽管本发明的表达盒作为选择性标记基因用于植物选择，不过本发明的表达盒可以包括另一个选择性标记基因以选择经转化的细胞。选择性标记基因(包括本发明的那些选择性标记基因)用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括但不限于编码抗生素耐药性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予针对除草剂化合物(如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸酯(2,4-D))抗性的基因。总体上参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511；Christopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6314-6318；Yao等人(1992)Cell71:63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422；Barkley等人(1980)The Operon,第177-220页；Hu等人(1987)Cell48:555-566；Brown等人(1987)Cell49:603-612；Figge等人(1988)Cell52:713-722；Deuschle等人(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86:5400-5404；Fuerst等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2549-2553；Deuschle等人(1990)Science248:480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis,海德堡大学；Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:1917-1921；Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3952-3956；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5072-5076；Wyborski等人(1991)Nucleic Acids Res.19:4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10:143-162；Degenkolb等人(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35:1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry27:1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis,University of Heidelberg；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551；Oliva等人(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36:913-919；Hlavka等人(1985)Handbook ofExperimental Pharmacology,Vol.78(Springer-Verlag,Berlin)；Gill等人(1988)Nature334:721-724。此类公开在本文引用作为参考。
选择性标记基因的上述列表不意图是限制的。在本发明中可以使用任何选择性标记基因。
包含编码本发明AHASL蛋白的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子可以在载体中用来转化植物，从而所产生的植物具有针对除草剂、尤其咪唑啉酮除草剂或磺酰脲除草剂的增强耐受性。本发明的分离的AHASL多核苷酸分子可以在载体中单独或与下述核苷酸序列组合使用，其中所述的核苷酸序列编码在植物中赋予除草剂抗性的酶AHAS的小亚基(AHASS)。见美国专利号6,348,643，其在本文中引用作为参考。
本发明也涉及植物表达载体，其包含这样的启动子，所述启动子驱动植物中与其有效连接的本发明的分离的多核苷酸分子表达。所述的分离的多核苷酸分子包含编码本发明AHASL蛋白或其功能性片段或变体的核苷酸序列。本发明的植物表达载体不依赖于特定的启动子，只要这种启动子能够驱动植物细胞中的基因表达即可。优选的启动子包括组成型启动子和组织优选的启动子。
本发明的转化载体可以用来产生以目的基因转化的植物。该转化载体包含待导入的并一般在经转化植物中表达的本发明选择性标记基因和目的基因。此种选择性标记基因包含编码AHASL双重或三重突变多肽的本发明多核苷酸，其中所述多核苷酸与驱动在宿主细胞中表达的启动子有效连接。为用于植物和植物细胞中，该转化载体包含选择性标记基因，所述的选择性标记基因包含与驱动在植物细胞中表达的启动子有效连接的编码AHASL双重或三重突变多肽的本发明多核苷酸。
本发明的目的基因根据所需结果而变化。例如，表型的多种改变可以是令人感兴趣的，这包括调节植物中的脂防酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的昆虫和/或病原体防御机制等。可以通过使得植物中异源产物表达或内源性产物表达提高实现这些结果。备选地，可以通过使得植物中一种或多种内源性产物尤其是酶或辅因子的表达降低实现所述结果。这些变化导致经转化植物的表型改变。
在本发明的一个实施方案中，目的基因包括昆虫抗性基因，例如，苏云金芽孢杆菌毒素蛋白基因(美国专利号5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene48:109)。
本发明的AHASL蛋白或多肽可以纯化自例如向日葵植物，并且可以用在组合物中。另外，编码本发明的AHASL蛋白的分离的多核苷酸分子可以用来在微生物(如大肠杆菌或酵母)中表达本发明的AHASL蛋白。表达的AHASL蛋白可以通过本领域普通技术人员已知的任意方法从大肠杆菌或酵母的提取物中纯化。
本发明的多核苷酸用于增强耐受除草剂的植物的抗性的方法中。在本发明的一个实施方案中，所述耐受除草剂的植物包含编码AHASL双重或三重突变多肽的本发明多核苷酸。本发明还提供了包含编码AHASL单一突变多肽的两个或多个多核苷酸的耐受除草剂的植物。编码除草剂耐受性AHASL蛋白的多核苷酸和包含编码除草剂耐受性AHASL蛋白的内源性基因的耐受除草剂的植物包括本发明的多核苷酸和植物以及本领域已知的那些多核苷酸和植物。见，例如美国专利号5,013,659、5,731,180、5,767,361、5,545,822、5,736,629、5,773,703、5,773,704、5,952,553和6,274,796，全部所述文献在本文通过引用的方式并入。用于增强耐受除草剂的植物的抗性的此类方法包括用至少一种多核苷酸构建体转化耐受除草剂的植物，所述的多核苷酸构建体包含驱动植物细胞中基因表达的启动子和与其有效连接的本发明多核苷酸。
用于转化植物的众多植物转化载体和方法是可用的。见，例如，An,G.等人(1986)Plant Physiol.,81:301-305；Fry,J.等人(1987)Plant Cell Rep.6:321-325；Block,M.(1988)Theor.Appl Genet.76:767-774；Hinchee等人(1990)Stadler.Genet.Symp.203212.203-212；Cousins等人(1991)Aust.J.Plant Physiol.18:481-494；Chee,P.P.和Slightom,J.L.(1992)Gene.118:255-260；Christou等人(1992)Trends.Biotechnol.10:239-246；D'Halluin等人(1992)Bio/Technol.10:309-314；Dhir等人(1992)Plant Physiol.99:81-88；Casas等人(1993)Proc.Nat.Acad Sci.USA90:11212-11216；Christou,P.(1993)In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant；29P:119-124；Davies等人(1993)Plant Cell Rep.12:180-183；Dong,J.A.和Mchughen,A.(1993)Plant Sci.91:139-148；Franklin,C.I.和Trieu,T.N.(1993)Plant.Physiol.102:167；Golovkin等人(1993)Plant Sci.90:41-52；Guo Chin Sci.Bull.38:2072-2078；Asano等人(1994)Plant CellRep.13；Ayeres N.M.和Park,W.D.(1994)Crit.Rev.Plant.Sci.13:219-239；Barcelo等人(1994)Plant.J.5:583-592；Becker等人(1994)Plant.J.5:299-307；Borkowska等人(1994)Acta.Physiol Plant.16:225-230；Christou,P.(1994)Agro.Food.Ind.Hi Tech.5:17-27；Eapen等人(1994)Plant Cell Rep.13:582-586；Hartman等人(1994)Bio-Technology12:919923；Ritala等人(1994)Plant.Mol.Biol.24:317-325；和Wan,Y.C.和Lemaux,P.G.(1994)Plant Physiol.104:3748。
本发明的某些方法包括将多核苷酸构建体导入植物中。术语“导入”意指将多核苷酸构建体以这样的方式呈递至植物中，从而该构建体进入植物细胞的内部。本发明的方法不依赖于将多核苷酸构建体导入植物中的特定方法，只要该多核苷酸构建体进入植物的至少一个细胞的内部即可。用于将多核苷酸构建体导入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定的转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
术语“稳定的转化”意指导入植物的多核苷酸构建体整合到该植物的基因组中并且能够由其后代继承。术语“瞬时转染”意指导入植物的多核苷酸构建体没有整合到该植物的基因组中。
为转化植物和植物细胞，使用标准技术将本发明的核苷酸序列***本领域已知的适于在植物或植物细胞中表达该核苷酸序列的任何载体。载体的选择取决于优选的转化技术和待转化的靶标植物物种。在本发明的一个实施方案中，AHASL核苷酸序列与已知用于植物细胞中高水平表达的植物启动子有效连接，并且随后将该构建体导入易感于咪唑啉酮或磺酰脲除草剂的植物，并再生出转化的植物。经转化的植物耐受对咪唑啉酮或磺酰脲除草剂下述水平的暴露，所述的咪唑啉酮或磺酰脲除草剂水平会杀死或严重伤害非转化的植物。这种方法可以应用于任意植物物种；然而，当应用于作物植物时，它是最有益处的。
用于构建植物表达盒和将外来核酸导入植物的方法学通常是本领域已知的并且已经在之前描述过。例如，外源DNA可以使用瘤诱导(Ti)质粒载体导入植物中。基于农杆菌的转化技术是本领域熟知的。农杆菌菌株(例如，根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes))包含在用农杆菌感染后转移至植物的质粒(Ti或Ri质粒)和T-DNA元件。T-DNA(转移的DNA)整合至植物细胞的基因组中。该T-DNA可以位于Ri-或Ti-质粒上或分别包含在所谓二元载体中。用于农杆菌介导转化的方法例如在Horsch RB等人(1985)Science225:1229f中描述。农杆菌介导的转化可以在双子叶植物和单子叶植物中使用。在White FF,Vectors for Gene Transfer in HigherPlants；第1卷,Engineering and Utilization,S.D.Kung和R.Wu编著,Academic Press,1993,第15-38页；Jenes B等人(1993)Techniques for Gene Transfer,在:TransgenicPlants,第1卷,Engineering and Utilization,S.D.Kung和R.Wu编著,Academic Press,第128-143页；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol42:205-225中描述了通过农杆菌转化植物。用于外源DNA递送的其它方法包括使用PEG介导的原生质体转化法、电穿孔法、显微注射须法(whisker)和用于直接DNA摄取的生物射弹法或微粒轰击法。此类方法是本领域已知的。(授予Vasil等人的美国专利号5,405,765；Bilang等人(1991)Gene100:247-250；Scheid等人(1991)Mol.Gen.Genet.,228:104-112；Guerche等人(1987)Plant Science52:111-116；Neuhause等人(1987)Theor.Appl Genet.75:30-36；Klein等人(1987)Nature327:70-73；Howell等人(1980)Science208:1265；Horsch等人(1985)Science227:1229-1231；DeBlock等人(1989)Plant Physiology91:694-701；Methods forPlant Molecular Biology(Weissbach和Weissbach编著)Academic Press,Inc.(1988)以及Methods in Plant Molecular Biology(Schuler和Zielinski编著)Academic Press,Inc.(1989))。转化方法取决于待转化的植物细胞、所用载体的稳定性、基因产物的表达水平和其它参数。
将核苷酸序列导入植物细胞并且随后***植物基因组中的其它合适方法包括如Crossway等人(1986),Biotechniques4:320-334所描述的显微注射法、如Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606所描述的电穿孔法、如Townsend等人(美国专利号5,563,055)和Zhao等人(美国专利号5,981,840)所描述的农杆菌介导的转化法、如Paszkowski等人(1984)EMBO J.3:2717-2722所描述的直接基因转移法和在例如Sanford等人(美国专利号4,945,050)、Tomes等人(美国专利号5,879,918)、Tomes等人(美国专利号5,886,244)、Bidney等人(美国专利号5,932,782)、在Plant Cell,Tissue,and OrganCulture:Fundamental Methods,Gamborg和Phillips编著(Springer-Verlag,Berlin)中Tomes等人(1995)“通过微粒轰击法将DNA直接转移至完整植物细胞中(Direct DNATransfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment)”；McCabe等人(1988)Biotechnology6:923-926)中所描述的射弹粒子加速法；以及Lec1转化法(WO00/28058)。也见，Weissinger等人(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology5:27-37(洋葱)；Christou等人(1988)PlantPhysiol.87:671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology6:923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology8:736-740(稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology6:559-563(玉米)；Tomes,美国专利号5,240,855；Buising等人,美国专利号5,322,783和5,324,646；在Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:FundamentalMethods,Gamborg编著(Springer-Verlag,Berlin)中Tomes等人(1995)“通过微粒轰击法将DNA直接转移至完整植物细胞中(Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells viaMicroprojectile Bombardment)”(玉米)；Klein等(1988)Plant Physiol.91:440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology8:833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984),Nature(London)311:763-764；Bowen等人,美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet等人(1985)在The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,编者Chapman等人,Longman,NY,第197-209页中(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports9:415-418和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(须(whisker)介导的转化)；D'Halluin等(1992)Plant Cell4:1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant CellReports12:250-255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany75:407-413(稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology14:745-750(通过根癌农杆菌转化的玉米)；全部文献在本文中引用作为参考。
本发明的多核苷酸可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触而导入植物中。通常，此类方法包括将本发明的多核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子中。认识到本发明的AHASL蛋白最初可以作为病毒多蛋白的一部分被合成，随后可通过体内或体外的蛋白水解进行加工以产生所需的重组蛋白。另外，认识到本发明的启动子还包括用于通过病毒RNA聚合酶转录的启动子。用于将多核苷酸构建体(包括病毒DNA或RNA分子)导入植物中并且在其中表达所编码蛋白质的方法是本领域已知的。见，例如，美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931，所述文献在本文引用作为参考。
已经被转化的细胞可以根据常规方法培育成植物。见，例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports5:81-84。这些植物随后可以加以培育，并且与相同的转化株系或不同株系授粉，并且鉴定具有所需表型特征组成型表达的所得杂交种。可以培育两个或多个世代以确保所需表型特征的表达是稳定维持和遗传的，并且随后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。以这种方式，本发明提供了具有本发明的多核苷酸构建体(例如本发明的表达盒)稳定掺入其基因组的经转化种子(也称作“转基因种子”)。
本发明可以用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物物种的实例包括但不限于谷物或玉米(Zea mays)、芸苔属物种(Brassica sp.)(例如欧洲油菜(B.napus)、芜青(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，尤其是可作为种子油来源的芸苔属物种，苜蓿(Medicago sativa)、稻、黑麦(Secale cereale)、高粱(双色蜀黍(Sorghumbicolor)、高粱(Sorghum vulgare))、粟(例如御谷(Pennisetum glaucum)、稷(Panicummiliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthusannuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(T.Turgidum ssp.durum))、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡属物种(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、凤梨(Ananas comosus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、可可树(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、芭蕉属物种(Musaspp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、油橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、全缘叶澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、扁桃(Prunusamygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和松柏类植物。优选地，本发明的植物是作物植物(例如，向日葵、芸苔属物种、棉属植物、甜菜、大豆、落花生、苜蓿、红花、烟草、谷物、稻、小麦、黑麦、大麦、黑小麦、高粱、谷子等)。
本发明的植物是除草剂抗性植物并且因此用于涉及应用除草剂的杂草控制的方法中。因此，本发明还提供控制本发明除草剂抗性植物附近的杂草的方法。该方法包括施加有效量的除草剂至杂草和除草剂抗性植物，其中与野生型植物相比，所述植物具有针对至少一种AHAS抑制型除草剂、尤其咪唑啉酮或磺酰脲除草剂的提高抗性。在控制杂草的此种方法中，本发明的除草剂抗性植物优选地是作物植物，包括但不限于向日葵、苜蓿、芸苔属物种、大豆、棉属植物、红花、落花生、烟草、番茄、马铃薯、小麦、稻、玉米、高粱、大麦、黑麦、谷子和高粱。
通过提供具有针对除草剂、尤其咪唑啉酮或磺酰脲除草剂的提高抗性的植物，类型众多的制剂可以用于保护植物免受杂草影响，从而增强植物生长并且降低对营养的竞争。除草剂本身可以用于本文中所述植物周围的区域内出苗前、出苗后、播种前和播种时控制杂草或可以使用含有其他添加剂的咪唑啉酮除草剂制剂。除草剂也可以用作种子处理。咪唑啉酮或磺酰脲除草制剂中存在的添加剂包括其他除草剂、去污剂、佐药、铺展剂、粘合剂、稳定剂或其他等。除草剂制剂可以是湿式或干式制品并且可以包括但不限于悬浮散剂(flowable powder)、乳油(emulsifiable concentrate)和液态母液(liquidconcentrate)。可以根据常规方法施加除草剂和除草剂制剂，例如通过喷洒、灌溉、洒粉等。
本发明提供非转基因和转基因植物和种子，其具有针对至少一种除草剂、特别是AHAS抑制型除草剂、更特别地是针对咪唑啉酮和磺酰脲除草剂、最特别地是针对咪唑啉酮除草剂的提高耐受性。在本发明的优选实施方案中，本发明的植物和种子显示比仅包含一种AHASL单一突变多肽的相似植物更高的除草剂耐受水平。本发明的此类植物和种子用在控制杂草的改良方法中，所述的改良方法允许以有效量施加除草剂至杂草和除草剂抗性植物，其中所述的有效量包含比可以与仅包含一种AHASL单一突变多肽的相似植物一起使用的更高浓度或比率。因此，与现有方法相比时，所述改良方法提供优异的杂草控制，其中所述的现有方法涉及仅包含一种AHASL单一突变多肽和应用较低的除草剂浓度或比率。
本发明提供了包含编码AHASL双重或三重突变多肽的多核苷酸的除草剂抗性植物和包含编码AHASL单一突变多肽的两种或多种多核苷酸的除草剂抗性植物。本发明的这些除草剂抗性植物在通过包括有性繁殖在内的常规植物育种法产生除草剂抗性植物的方法中使用。所述方法包括将作为本发明除草剂抗性植物的第一植物与不抵抗该除草剂的第二植物杂交。第二植物可以是与所述第一植物杂交时，能够产生有活力的后代植物(即种子)的任意植物。通常，但非必需地，第一植物和第二植物属于相同的物种。所述方法可以任选地包括选择这样的后代植物，其包含编码AHASL突变多肽的多核苷酸或编码所述第一植物的AHASL单一突变多肽的两种或多种多核苷酸。本发明的方法还可以包括第一次杂交的后代植物与下述植物回交的一个或多个世代，所述的植物具有与第一或第二植物相同的品系或基因型。备选地，第一次杂交或任意后续杂交的子代可以与第三植物杂交，其中所述的第三植物具有不同于第一或第二植物的不同品系或基因型。
包含编码AHASL双重或三重突变多肽的多核苷酸的本发明除草剂抗性植物和包含编码AHASL单一突变多肽的两种或多种多核苷酸的除草剂抗性植物也在通过包括有性繁殖在内的常规植物育种法提高植物的除草剂抗性的方法中使用。所述方法包括将作为本发明除草剂抗性植物的第一植物与第二植物杂交，其中所述的第二植物可以抵抗或可以不抵抗与第一植物相同的除草剂，或可以抵抗与第一植物不同的除草剂。第二植物可以是与所述第一植物杂交时，能够产生有活力的后代植物(即种子)的任意植物。通常，但非必需地，第一植物和第二植物属于相同的物种。所述方法可以任选地包括选择这样的后代植物，其包含编码所述第一植物的AHASL突变多肽的多核苷酸或编码AHASL单一突变多肽的两种或多种多核苷酸和所述第二植物的除草剂抗性。与第一或第二植物或这两种植物比较时，由本发明的这种方法产生的后代植物具有提高的除草剂抗性。当第一和第二植物抵抗不同的除草剂时，所述后代植物会具有所述第一和第二植物的联合除草剂耐受特征。本发明的方法还可以包括第一次杂交的后代植物与下述植物回交的一个或多个世代，所述的植物具有与第一或第二植物相同的品系或基因型。备选地，第一次杂交或任意后续杂交的子代可以与第三植物杂交，其中所述的第三植物具有不同于第一或第二植物的不同品系或基因型。
本发明也提供用本发明的至少一种多核苷酸分子、表达盒或转化载体所转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子和非人宿主细胞。此类转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子和非人宿主细胞针对在这样的除草剂水平上的至少一种除草剂具有增强的耐受性或抗性，所述的除草剂水平分别杀死非转化的植物、植物组织、植物细胞或非人宿主细胞或抑制其生长。优选地，本发明的经转化植物、植物组织、植物细胞和种子是拟南芥和作物植物。
本发明提供了包括使用至少一种AHAS抑制型除草剂的方法，所述的AHAS抑制型除草剂选自由咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、***并嘧啶除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂、磺酰氨基-羰基***啉酮除草剂、和它们的混合物组成的组。在这些方法中，所述AHAS抑制型除草剂可以通过本领域已知的任意方法施加，所述方法包括但不限于种子处理、土壤处理和叶处理。
在施加之前，可以将AHAS抑制型除草剂转化成常用制剂，例如溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、散剂、糊剂和颗粒剂。使用形式取决于具体的预期目的；在每种情况下，应当确保本发明化合物的精细和均匀分布。
按照已知方式制备制剂(综述，见例如US3,060,084、EP-A707 445(液态浓缩物)、Browning,”Agglomeration”,Chemical Engineering,Dec.4,1967,147-48、Perry’sChemical Engineer’s Handbook,4版.,McGraw-Hill,New York,1963,第8-57页以及下列文献，WO91/13546,US4,172,714,US4,144,050,US3,920,442,US5,180,587,US5,232,701,US5,208,030,GB2,095,558,US3,299,566,Klingman,Weed Control as a Science,JohnWiley and Sons,Inc.,New York,1961,Hance等Weed Control Handbook,第8版,Blackwell Scientific Publications,Oxford,1989和Mollet,H.,Grubemann,A.,Formulation technology,Wiley VCH Verlag GmbH,Weinheim(Germany),2001,2.D.A.Knowles,Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations,KluwerAcademic Publishers,Dordrecht,1998(ISBN0-7514-0443-8)，例如通过用适于配制农用化学品的助剂填充活性化合物，如溶剂和/或载体，(根据需要)乳化剂、表面活性剂和分散剂、防腐剂、消泡剂、防冻剂，对于种子处理制剂，还任选地是色料和/或粘合剂和/或胶凝剂。
合适溶剂的实例是水、芳香族溶剂(例如Solvesso产品、二甲苯)、石蜡(例如矿物油级分)、醇(例如甲醇、丁醇、戊醇、苄醇)、酮(例如环己酮、γ-丁内酯)、吡咯烷酮(NMP、NOP)、乙酸酯(乙二醇二乙酸酯)、二元醇、脂防酸二甲酰胺、脂防酸和脂防酸酯。原则上，也可以使用溶剂混合物。
合适载体的实例是研磨的天然矿物(例如高岭土、粘土、滑石、白垩)和研磨的人工矿物(例如高度分散的硅石、硅酸盐)。
合适的乳化剂是非离子和阴离子乳化剂(例如聚氧乙烯脂肪醇醚、烷基磺酸酯和芳基磺酸酯)。
分散剂的实例是亚硫酸化木素废液和甲基纤维素。
所用的适宜表面活性剂是木素磺酸、萘磺酸、苯酚磺酸、二丁基萘磺酸的碱金属盐、碱土金属盐和铵盐、烷基芳基磺酸盐、烷基硫酸酯、烷基磺酸酯、脂肪醇硫酸酯、脂防酸和硫酸化脂肪醇乙二醇醚，还是磺酸化萘和萘衍生物与甲醛的缩合物、萘和萘磺酸与酚和甲醛的缩合物、聚氧乙烯辛基酚醚、乙氧基化异辛基酚、辛基酚、壬基酚、烷基酚聚乙二醇醚、三丁基苯基聚乙二醇醚、三硬脂基苯基聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、醇和脂肪醇环氧乙烷缩合物、乙氧基化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、乙氧基化聚氧丙烯、月桂醇聚乙二醇醚缩醛、山梨醇酯、亚硫酸化木素废液和甲基纤维素。
适于制备可直接喷洒的溶液剂、乳剂、糊剂或油分散剂的物质是中等至高沸点的矿物油级分，如煤油或柴油，还是煤焦油和植物或动物来源的油、脂族、环状和芳香烃，例如甲苯、二甲苯、石蜡、四氢萘、烷基化萘或它们的衍生物、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、环己醇、环己酮、异佛尔酮、高极性溶剂，例如，二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮或水。
还可以向制剂添加防冻剂(如甘油、乙二醇、丙二醇)和杀菌剂。
合适的消泡剂是例如基于硅或硬脂酸镁的消泡剂。
合适的防腐剂是例如二氯酚和苄醇半甲醛(benzylalcoholhemiformaldehyde)。
种子处理制剂可以额外地包含粘合剂和任选地包含色料。
可以添加粘合剂以改善处理后活性物质对种子的黏附。合适的粘合剂是嵌段共聚物EO/PO表面活性剂，也可以是聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丁烯、聚异丁烯、聚苯乙烯、聚乙烯胺、聚乙烯酰胺、聚乙烯亚胺()、聚醚、聚氨基甲酸酯、聚乙烯乙酸酯、纤基乙酸钠(tylose)和从这些聚合物衍生的共聚物。
任选地，可以在制剂中还包含色料。对于种子处理制剂的合适色料或染料是罗丹明B、C.I.颜料红112、C.I.溶剂红1、颜料蓝15:4、颜料蓝15:3、颜料蓝15:2、颜料蓝15:1、颜料蓝80、颜料黄1、颜料黄13、颜料红112、颜料红48:2、颜料红48:1、颜料红57:1、颜料红53:1、颜料橙43、颜料橙34、颜料橙5、颜料绿36、颜料绿7、颜料白6、颜料棕25、碱性紫10、碱性紫49、酸性红51、酸性红52、酸性红14、酸性蓝9、酸性黄23、碱性红10、碱性红108。
合适胶凝剂的实例是鹿角菜
散剂、铺展材料和可洒粉产品可以通过混合或同时研磨活性物质与固体载体进行制备。
颗粒剂，例如包衣颗粒剂、浸渍颗粒剂和均匀颗粒剂，可以通过将活性化合物黏合至固体载体上制备。固体载体的实例是矿物土(mineral earth)如硅胶、硅酸盐、滑石、高岭土、镁质粘土、石灰岩、石灰、白垩、红玄武土(bole)、黄土、粘土、白云石、硅藻土、硫酸钙、硫酸镁、氧化镁、研磨的合成材料、肥料例如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素，和植物源产物如谷物粗粉、树皮碎屑(tree bark meal)、木粉填料(wood meal)和坚果壳屑(nutshell meal)、纤维素粉以及其他固体载体。
一般而言，制剂包含0.01至95％重量、优选0.1至90％重量的AHAS抑制型除草剂。在这种情况下，以90％至100％重量、优选95％至100％重量的纯度(根据NMR谱)使用所述AHAS抑制型除草剂。为了处理种子，可以将相应制剂稀释2-10倍，产生即用型制品中0.01至60％重量、优选0.1至40％重量活性化合物的浓度。
AHAS抑制型除草剂可以以其制剂形式或从制剂形式制备的使用形式使用，例如以可直接喷洒的溶液剂、散剂、混悬剂或分散剂、乳剂、油分散剂、糊剂、可洒粉产品、铺展材料或颗粒剂形式，通过喷洒、喷雾、喷粉、铺展或倾倒方式使用。使用形式完全取决于预期目的；它们意图确保在每种情况下，本发明的AHAS抑制型除草剂物最可能地精细分布。
含水的使用形式可以通过添加水从乳剂浓缩物、糊剂或可湿性散剂(喷洒散剂、油分散剂)制备。为制备乳剂、糊剂或油分散剂，原态或溶解在油或溶剂中的物质可以借助湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂在水中均化。然而，也可以制备包含活性物质、湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂和(根据需要)溶剂或油的浓缩物，并且此类浓缩物适合用水稀释。
即用型制品中的活性化合物浓度可以在相对宽的范围内变动。通常，它们是从0.0001至10％重量、优选从0.01至1％重量。
也可以在超低容积方法(ULV)中成功地使用AHAS抑制型除草剂，可以施加包含超过95％重量活性化合物的制剂或甚至在无添加剂的情况下施加该活性化合物。
以下是制剂的实例：
1.以水稀释用于叶施用的产品。为了种子处理目的，此类产品可以在稀释或不稀释的情况下施加至种子。
A)水溶性浓缩物(SL，LS)
在90重量份的水或水溶性溶剂中溶解10重量份的AHAS抑制型除草剂。作为备选，添加湿润剂或其他助剂。在用水稀释后，AHAS抑制型除草剂溶解，因而获得含10％(w/w)AHAS抑制型除草剂的制剂。
B)可分散性浓缩物(DC)
在70重量份的环己酮中溶解20重量份的AHAS抑制型除草剂，添加10重量份的分散剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)。用水稀释产生分散剂，因而获得含20％(w/w)AHAS抑制型除草剂的制剂。
C)可乳化浓缩物(EC)
在7重量份的二甲苯中溶解15重量份的AHAS抑制型除草剂，添加十二烷基苯磺酸钙和乙氧基化蓖麻油(在每种情况下5重量份)。用水稀释产生乳剂，因而获得含15％(w/w)AHAS抑制型除草剂的制剂。
D)乳剂(EW、EO、ES)
在35重量份的二甲苯中溶解25重量份的AHAS抑制型除草剂，添加十二烷基苯磺酸钙和乙氧基化蓖麻油(在每种情况下5重量份)。借助乳化器(例如Ultraturrax)将这种混合物导入30重量份的水中并制成均质乳液。用水稀释产生乳剂，因而获得含25％(w/w)AHAS抑制型除草剂的制剂。
E)混悬剂(SC、OD、FS)
在搅拌式球磨机中磨碎20重量份的AHAS抑制型除草剂，添加10重量份的分散剂、湿润剂和70重量份的水或有机溶剂以产生精细AHAS抑制型除草剂混悬液。用水稀释产生AHAS抑制型除草剂的稳定混悬剂，因而获得含20％(w/w)AHAS抑制型除草剂的制剂。
F)水可分散性颗粒剂和水溶性颗粒剂(WG，SG)
细致研磨50重量份的AHAS抑制型除草剂，添加50重量份的分散剂和湿润剂并且借助技术设备(例如挤出机、喷粉塔、流化床)制成水可分散性颗粒剂或水溶性颗粒剂。用水稀释产生AHAS抑制型除草剂的稳定分散剂或溶液剂，因而获得含50％(w/w)AHAS抑制型除草剂的制剂。
G)水可分散性散剂和水溶性散剂(WP、SP、SS、WS)
在转子-定子磨机中研磨75重量份的AHAS抑制型除草剂，添加25重量份的分散剂、湿润剂和硅胶。用水稀释产生AHAS抑制型除草剂的稳定分散剂或溶液剂，因而获得含75％(w/w)AHAS抑制型除草剂的制剂。
H)凝胶制剂(GF)
在搅拌式球磨机中磨碎20重量份的AHAS抑制型除草剂，添加10重量份的分散剂、1重量份的胶凝剂、湿润剂和70重量份的水或有机溶剂以产生精细AHAS抑制型除草剂混悬液。用水稀释产生AHAS抑制型除草剂的稳定混悬剂，因而获得含20％(w/w)AHAS抑制型除草剂的制剂。这种凝胶制剂适合用作种子处理剂。
2.不作稀释而用于叶施用的产品。为了种子处理目的，此类产品可以在稀释的情况下施加至种子。
A)可洒粉的散剂(DP，DS)
细致研磨5重量份的AHAS抑制型除草剂并密切与95重量份精细分散的高岭土混合。这产生含有5％(w/w)AHAS抑制型除草剂的可洒粉产品。
B)颗粒剂(GR、FG、GG、MG)
细致研磨0.5重量份的AHAS抑制型除草剂并与95.5重量份载体混合，因而获得含0.5％(w/w)AHAS抑制型除草剂的制剂。现有方法是挤出法、喷雾干燥法或流化床法。这产生不稀释的情况用于叶用途的颗粒剂。
常规的种子处理制剂包括例如可流动的浓缩剂FS、溶液剂LS，用于干式处理的散剂DS、用于淤浆处理的水可分散性散剂WS、水溶性散剂SS和乳剂ES和EC以及凝胶制剂GF。这些制剂可以在稀释或不稀释的情况下施加至种子。在播种前进行对种子的施加，或直接施加在种子上。
在一个优选的实施方案中，FS制剂用于种子处理。一般，FS制剂可以包含1-800g/l有效成分、1-200g/l表面活性剂、0至200g/l防冻剂、0至400g/l粘合剂、0至200g/l颜料和至多到1升溶剂，优选水。对于种子处理，用除草剂、优选用选自由AHAS抑制型除草剂如酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、绿黄隆、醚黄隆、环丙嘧磺隆、氨苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆(flupyrsulfuron)、甲酰氨磺隆、氯吡氯黄隆、啶咪黄隆、碘磺隆、甲基二磺隆、甲磺隆、烟嘧黄隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧磺隆、玉嘧黄隆、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、噻黄隆、醚苯黄隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酸、甲氧咪草烟、甲灭草烟、灭草烟、灭草喹、咪草烟、氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、双草醚、嘧草醚、丙苯黄隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、环酯草醚、嘧硫草醚和它们的混合物组成的组的除草剂或用包含AHAS抑制型除草剂的制剂处理本发明除草剂抗性植物的种子。
术语“种子处理”包括本领域已知的全部合适的种子处理技术，如拌种、种子包衣、药粉拌种、浸种和种子丸化。
根据本发明的一个变例，本发明的又一个主题是通过施加以下制剂、尤其施加至播种沟来处理土壤的方法：作为组合物/制剂的含有AHAS抑制型除草剂的颗粒制剂(例如，任选具有一种或多种可农业用的固体或液体载体和/或任选具有一种或多种可农用表面活性剂的颗粒制剂)。该方法有利地用在例如谷物、玉米、棉和向日葵的播种床中。
本发明也包括用种子处理制剂包衣或随该种子处理制剂一起包含的种子，所述的种子处理制剂包含选自由酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、绿黄隆、醚黄隆、环丙嘧磺隆、氨苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰氨磺隆、氯吡氯黄隆、啶咪黄隆、碘磺隆、甲基二磺隆、甲磺隆、烟嘧黄隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧磺隆、玉嘧黄隆、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、噻黄隆、醚苯黄隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酸、甲氧咪草烟、甲灭草烟、灭草烟、灭草喹、咪草烟、氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、双草醚、嘧草醚、丙苯黄隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、环酯草醚和嘧硫草醚组成的组中的至少一种AHAS抑制型除草剂。
术语“种子”包括种子和全部类型的植物繁殖体，它们包括但不限于有性种子、种子片、吸根、球茎、鳞茎、果实、块茎、颖果、插条、插条芽(cut shoot)等并且在一个优选的实施方案中意指有性种子。
术语“用包衣和/或含有”通常指有效成分在施加时绝大部分位于繁殖产物的表面上，尽管更多或更少的有效成分可以渗透到该繁殖产物中，这取决于施加的方法。当(再)栽种所述的繁殖产物时，它可以吸收此有效成分。
在植物播种前和植物出苗前通过喷洒或洒粉于种子实施用AHAS抑制型除草剂或用包含AHAS抑制型除草剂的制剂处理种子的应用。
在种子的处理中，通过用有效量的AHAS抑制型除草剂或包含该AHAS抑制型除草剂的制剂处理种子而施加相应的制剂。此处，施加率一般是每100kg种子0.1g至10kg有效成分(或有效成分的混合物或所述制剂),优选每100kg种子1g至5kg、尤其每100kg种子1g至2.5kg。对于具体作物如莴苣，该比率可以更高。
本发明提供用于对付不希望的营养体(vegetation)和控制杂草的方法，所述方法包括使本发明抗性植物的种子在播种前和/或出苗后与AHAS抑制型除草剂接触。该方法还可以包括播种所述种子，例如在大田的土壤中或在温室的盆栽介质中。该方法特别用于在紧邻所述种子周围对付不希望的营养体或控制杂草。
控制不希望的营养体理解为杀死和/或迟滞或抑制杂草的正常生长。在最广泛的意义上，将杂草理解为在不受欢迎的地点生长的所有那些植物。
本发明的杂草包括例如双子叶和单子叶杂草。双子叶杂草包括但不限于以下杂草属：白芥属(Sinapis)、独行菜属(Lepidium)、拉拉藤(Galium)、繁缕属(Stellaria)、母菊属(Matricaria)、春黄菊属(Anthemis)、牛膝菊属(Galinsoga)、藜属(Chenopodium)、荨麻属(Urtica)、千里光属(Senecio)、苋属(Amaranthus)、马齿苋属(Portulaca)、苍耳属(Xanthium)、旋花属(Convolvulus)、番薯属(Ipomoea)、蓼属(Polygonum)、田菁属(Sesbania)、豚草属(Ambrosia)、蓟属(Cirsium)、飞廉属(Carduus)、苦苣菜属(Sonchus)、茄属(Solanum)、蔊菜属(Rorippa)、节节菜属(Rotala)、母草属(Lindernia)、野芝麻属(Lamium)、婆婆纳属(Veronica)、苘麻属(Abutilon)、三棘果属(Emex)、曼陀罗属(Datura)、堇菜属(Viola)、鼬瓣花属(Galeopsis)、罂粟属(Papaver)、矢车菊属(Centaurea)、车轴草属(Trifolium)、毛莨属(Ranunculus)和蒲公英属(Taraxacum)。单子叶杂草包括但不限于以下杂草属：稗属(Echinochloa)、狗尾草属(Setaria)、黍属(Panicum)、马唐属(Digitaria)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、穇属(Eleusine)、臂形草属(Brachiaria)、黑麦草属(Lolium)、雀麦属(Bromus)、燕麦属(Avena)、莎草属(Cyperus)、高粱属(Sorghum)、冰草属(Agropyron)、狗牙根属(Cynodon)、雨久花属(Monochoria)、飘拂草属(Fimbristyslis)、慈姑属(Sagittaria)、荸荠属(Eleocharis)、藨草属(Scirpus)、雀稗属(Paspalum)、鸭嘴草属(Ischaemum)、尖瓣花属(Sphenoclea)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)和阿披拉草属(Apera)。
另外，本发明的杂草可以包括例如在不希望的位置生长的作物植物。例如，如果大豆植物田中不希望有玉米植物的话，在主要包含大豆植物的大田中存在的自生玉米植物可以视为一种杂草。
冠词“一个”和“一种”在本文中用来指该冠词的一个或多于一个(即至少一个)的语法对象。例如，“一种要素”意指一种或多种要素。
如本文中所用，字“包含”或变体如“包含了”或“包含着”将理解为暗示包括所述的要素、整数或步骤，或成组的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤或成组的要素、整数或步骤。
以说明方式且不以限制方式提供以下实施例。呈现给技术人员的所例举方法的任意变体意图处在本发明的范围内。
实施例1：
含有拟南芥属AHASL突变体基因的载体
在SEQ ID NO:34(AtAHASL)中描述了拟南芥基因组DNA的完整XbaI片段，所述的完整XbaI片段含有附带一些额外DNA的完整AHAS大亚基基因，其中所述额外DNA包括在5'和3'末端处的XbaI位点。SEQ ID NO:34的第2484至4496位碱基包括拟南芥属AHAS大亚基基因第653位丝氨酸至苏氨酸突变等位基因的编码序列，包括SEQ ID NO:30中所示的终止密码子。在SEQ ID NO:34第2484至5717位碱基中包括的于SEQ ID NO:33中所示的拟南芥属AHAS大亚基基因第653位丝氨酸至苏氨酸突变等位基因的较小基因组片段包括所述编码序列和3'末端，直至并且包括3'末端XbaI位点，其中为清晰起见，去掉了在AtAHASL的起始密码子处存在的NcoI位点的头两个碱基。
编码全长拟南芥属AHASL单一突变体S653N和3'非翻译区的DNA片段SEQ ID NO:33克隆到pKK233-2中，旨在产生名为AE1的载体以在大肠杆菌中表达和测试(pKK233-2，细菌表达载体，Pharmacia,GenBank登录号X70478)。通过诱变和标准克隆方法从AE1产生载体AE2至AE9。图4显示AE1基础载体的图谱，标出了突变位置。
载体AP1(图5)是包括拟南芥DNA的基因组片段(SEQ ID NO:34)的植物转化载体，所述的基因组片段包括带有单一S653N突变的AtAHASL基因。如SEQ ID NO:34中所示的DNA片段以反向互补方向克隆到AP1中。使用标准克隆方法从AP1和AE质粒产生载体AP2-AP7并且它们仅因图1中所示的突变而不同。为便于克隆，与AP2-AP5相比，使用不同的片段来产生AP6和AP7。因而，AP6和AP7比AP1-AP5短47个碱基对。这种不同位于质粒主链中而非所述拟南芥基因组片段内。
如下产生载体AE10至AE24。使用Genemorph II随机诱变试剂盒(Stratagene,LaJolla,California)在诱变性条件下扩增野生型拟南芥AHAS大亚基基因，从而产生该基因的随机诱变的扩增DNA片段。随后将这种突变DNA克隆回到AE7中，从而将野生型拟南芥大亚基基因(位于AE7的SacII和AgeI单一位点之间)替换为诱变形式。将这种DNA转化到大肠杆菌菌株TOP10中并在LB琼脂培养基上以获得大量独特转化体的方式选择，每个转化体具有独立的诱变AHAS基因。将这些菌落刮在一起并从这个完整初级文库中制备质粒DNA。将这种DNA转化到AHAS阴性大肠杆菌中并在含有羧苄青霉素的LB琼脂培养基上再次选择。使用棉绒，将源自这个步骤的质粒阳性菌落复制铺板到不含支链氨基酸且含有30-微摩尔咪草烟的基本琼脂培养基上。那些在这种选择性培养基上生长的菌落拥有也耐受咪唑啉酮的功能性拟南芥AHAS突变基因。
对每一个生长阳性菌落测定拟南芥AHAS大亚基基因的DNA序列。不测定在选择性培养基上不赋予生长的拟南芥AHAS大亚基基因的序列。因为对次级文库进行AHAS功能和咪唑啉酮耐受性筛选，故而找到了重复的相同突变体，如DNA序列分析所确定的那样。仅对每个菌落的一个克隆继续在增加的咪唑啉酮浓度上测试并归纳入表1中。
表1
*用于在大肠杆菌中表达AtAHASL2的载体(AE质粒)和用于植物转化质粒(AP质粒)的载体的列表。相对于SEQ ID NO:1标出每个载体中的突变。
**使用分别针对增加的菌落大小的简单的单个、两个或三个加号***+、++或+++对AHAS抑制剂咪草烟存在时，在含有AE质粒的AHAS阴性大肠杆菌中进行拟南芥属AHAS功能的耐受性目视评分。"-"表示没有生长，意指突变组合导致失活的蛋白质或在所选的比例上没有咪草烟耐受性。IN意指失活的蛋白质，而NT意指不耐受咪唑啉酮。NA意指没有可用数据(未测试)。
与由筛选方法确定的耐受性实体S653N相比，未测试。
@对于包含AP1载体的转基因植物，18.75μM咪草烟是使得植物在微量滴定板中生长良好的最高浓度。使用该浓度作为基础确定相对于AP1的X倍改善。
实施例2：玉米AHASL突变体基因的载体
玉米AHASL2基因(SEQ ID NO:29)克隆到细菌表达载体pTrcHis A(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)，与该载体标签和翻译起始位点融合，始于SEQ ID NO:29第160位碱基。使用ZE1作为基础载体，利用诱变和亚克隆方法来产生载体ZE2、ZE5、ZE6和ZE7。使用亚克隆方法来从ZE1产生ZE3，其是玉米AHASL2基因融合至pTrcHis A的载体标签和翻译起始位点，始于SEQ ID NO:29第121位碱基。由于在大肠杆菌中没有显示ZE1或ZE3之间的功能性差异，故而使用ZE3作为基础载体，利用标准诱变和亚克隆方法来产生载体ZE4和ZE8。
使用标准方法制备具有表达盒的植物转化载体并命名为ZP1(图7)，其中所述的表达盒包含与编码玉米AHASL2S653N突变体的多核苷酸组合的玉米遍在蛋白启动子。为产生植物转化载体以表达其它AHASL突变体，使用标准克隆技术来将ZP1的多核苷酸节段替换为编码所述突变的ZE载体的多核苷酸片段。
如下制备载体ZE23至ZE38。使用多位点定向诱变试剂盒(Stratagene,La Jolla,California)，按照“产生工程化突变克隆TM集合的通用指南”所附方法，对载体ZE3进行饱和位点定向诱变。以多种组合方式使用将在玉米AHAS大亚基关键位点处产生全部可能密码子的诱变寡核苷酸，旨在产生在残基A90、M92、P165、R167、S621和G622处具有替换的突变体的集合。将突变集合质粒转化到AHAS缺陷型大肠杆菌中并涂布在补充有每升100μg羧苄青霉素的LB琼脂培养基上。挑取来自该培养基的菌落至微量滴定板内的1x浓度M9盐(用于等张缓冲液)中并随后复制铺板在不含支链氨基酸且含有150微摩尔咪草烟的基本琼脂培养基上。那些在这种选择性培养基上生长的菌落拥有也耐受咪唑啉酮的功能性玉米AHAS突变基因。
对每一个生长阳性菌落测定玉米AHAS大亚基基因的DNA序列。不测定在选择性培养基上不赋予生长的玉米AHAS大亚基基因的序列。
表2
*用于在大肠杆菌中表达ZmAHASL2(ZE质粒)和用于植物转化质粒(ZP质粒)的载体的列表。相对于SEQ ID NO:2标出每个载体中的突变。
**使用分别针对增加的菌落大小的简单的单个、两个或三个加号***+、++或+++对AHAS抑制剂咪草烟存在时，在含有ZE质粒的AHAS阴性大肠杆菌中进行玉米AHAS功能的耐受性目视评分。"-"表示没有生长，意指突变组合导致失活的蛋白质或在所选的比例上没有咪草烟耐受性。IN意指失活的蛋白质，而NT意指不耐受咪唑啉酮。NA意指没有可用数据(未测试)。
@玉米完整植物耐受性评分以综合结果为基础，其中所述的综合结果来自温室中和在多个田间位置上经过几个生长季节所进行的试验。玉米完整植物耐受性的评分***与上文所述的大肠杆菌咪唑啉酮耐受性的评分***相同。注意，具有+++评分的全部ZP构建体耐受超过每公顷3000克甲氧咪草烟(imazamox)，这代表测试的最高喷洒率。
实施例3：大肠杆菌互补测试法
大肠杆菌菌株JMC1(基因型[ilvB1201ilvHI2202rbs-221ara thi delta(pro-lac)recA56srlC300::Tn10],DE(hsdR)::Cat)敲除了天然大肠杆菌AHASL基因的全部ilvG拷贝。如果该菌株的AHASL被外源AHASL基因互补，则该菌株仅可以在缺少亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的基本生长培养基上生长(见Singh等人(1992)Plant Physiol.99,812-816；Smith等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,4179-4183)。使用这种大肠杆菌互补测试法来在咪唑啉酮除草剂(咪草烟,BASF Corporation,Florham Park,NJ)不存在和存在的情况下筛选由AE和ZE载体编码的AHASL酶活性和除草剂耐受性。
实施例4：生物化学表征
基于互补测试或简单的活性测试期间的生长，将ZE系列载体中的某些载体用于大肠杆菌粗制裂解物中的AHAS生物化学测试抑制试验。应用通过使用待测试的ZE载体转化的JMC1单菌落接种2-4ml的含有50μg/ml羧苄青霉素的LB培养物(LB-carb)，并在37℃温育过夜，伴以振摇。次日早晨，使用0.5-1ml过夜培养物来接种20ml LB-carb，在37℃温育，伴以振摇，直至培养物在600nm的光密度(OD)是大约0.6至0.8OD单位。添加异丙基-1–硫代-βD-半乳吡喃糖苷(IPTG)至0.1mM浓度并且将该培养物温育1-1.5小时，伴以振摇。将培养物离心以沉淀细胞并弃去上清液。细胞沉淀用补充有10mg/ml溶菌酶的AHAS测试缓冲液(如Singh等人(1988)Anal.Biochem.171:173-179中所述)裂解并进行短暂超声处理。通过离心使不溶性部分沉淀并且上清液用于AHAS活性的测定法中。在所用的每个咪草烟抑制剂浓度上，所述活性与相同ZE突变体的未抑制对照比较。这产生“对照百分比”测定值。
实施例5：植物转化
将AP载体转化转化到拟南芥生态型Col-2中。对T1种子，在含有100nM 作为选择剂的平板上选择转化的T1种子。来自大约20个独立转化事件(品系)的T2种子铺板在含有增加的浓度的MS琼脂上，旨在与AP1比较，对耐受性提高评分。载体通过目视检验法比较不抑制籽苗生长的最高浓度进行评分。拟南芥属植物转化实验的结果示于表1。
在立式平板生长测试法中测试来自拟南芥属几个品系的种子。将0.1％琼脂糖中的若干种子点样在含有37.5微摩尔Pursuit(咪草烟)的标准Murashige和Skoog半固体培养基平板上。将平板直立固定，从而根将沿着琼脂表面生长。所用种子是：1)野生型生态型Columbia2；2)csr1-2突变体(对于AHAS大亚基基因的基因组拷贝中的AtAHASL S653N突变是纯合的)；3)用AP1转化的Columbia2；4)用AP7转化的Columbia2；5)用AP2转化的Columbia2。注意2和3的数目就可能的耐受性而言是大致相等的，因为AP1植物用csr1-2的基因组XbaI片段(SEQ ID NO:34)的克隆进行转化。在咪草烟的这个浓度上，野生型籽苗不能萌发，单一突变植物(csr1-2和AP1转化体)几乎不萌发。AP7和AP2产生良好的耐受生长，尽管AP7植物似乎具有略微较少的根生长。要指出的是，全部品系在不含咪草烟的培养基上良好地萌发和生长。在图10中给出了立式平板生长测试法的结果。
通过农杆菌介导的转化法将ZP构建体导入玉米的不成熟胚。经转化的细胞在补充有0.75μM 的选择培养基上选择3-4周。在补充有0.75μM 的植物再生培养基上再生转基因小植物。转基因小植物在0.5μM 存在下生根。转基因植物就转基因的存在进行TaqMan分析，随后移植至盆栽混合物并在温室中生长至成熟。玉米转化实验的结果示于表2。在几个田间位置并在温室中用可变比率的甲氧咪草烟喷洒经ZP构建体转化的玉米植物。表2中汇总了ZP构建体的完整植物试验数据的相对比率。
实施例6：AtAHASL突变基因在大豆中的表达
制备了用于在转化的大豆植物中表达AtAHASL基因的载体。如下制备载体AUP2和AUP3，即通过标准克隆技术克隆欧芹(parsley)遍在蛋白启动子的聚合酶链反应产物，进行扩增以掺入Asp718和NcoI限制性酶的位点，消化并连接到AP2和AP3的相同位点(见图11和12)。AUP2编码带有A122T和S653N突变的AtAHASL蛋白，而AUP3编码带有A122T和S653N突变的AtAHASL蛋白。通过标准平末端克隆技术将AP1的完整启动子、编码序列和3'非翻译区序列克隆到含有BAR选择性标记表达盒的标准双子叶植物转化主链中，产生载体BAP1。
通过农杆菌介导的转化，将构建体AP2、AUP2和AUP3在籽苗外植体主要结节处导入大豆的腋生分生组织细胞。在用农杆菌接种和与之共培养后，将外植体转移至幼苗诱导培养基，不进行选择，持续1周。所述外植体随后转移至含有5μM灭草烟(imazapyr)(Arsenal)的幼苗诱导培养基，持续3周，以选择转化的细胞。在主要结节处具有健康愈伤组织/枝条垫的外植体随后转移到含有3μM灭草烟的幼苗伸长培养基，直至幼苗伸长或外植体死亡。转基因小植物生根、被移植到盆栽混合物中，就转基因的存在进行TaqMan分析，并且然后在温室中培育至成熟。使用构建体BAP1来按照相似方式产生转化的大豆植物，除了选择剂是BASTA之外。
在温室和田间研究中测试经转化大豆植物的除草剂耐受性。对于田间研究，在V3期以比率300g ai/ha施加灭草烟。对于温室研究，在大约V2期施加灭草烟。在表3中汇总这些研究的结果。
表3
*将BAP1(图12)进行转化，其中使用BAR基因用于选择，因为在仅具有S653N突变的大豆中的灭草烟选择尚没有优化
**与AUP2相比的一些损伤
实施例7：转化体选择
可以使用本发明所产生的多核苷酸作为植物转化的选择性标记。可以使用本发明所产生的多核苷酸作为选择性标记以鉴定和/或选择可能包含额外目的基因的经转化植物。可以通过铺板在掺入AHAS抑制剂或AHAS抑制性除草剂(如咪唑啉酮)的基本培养基(如MS培养基)上，从非转化的植物或植物细胞中选出用含有多个突变形式的AHAS大亚基基因的载体所转化的植物或植物细胞。转化的植物或组织将能够在这些抑制剂存在下继续生长，而未转化的植物或组织将死亡。在转化的组织中，由于未转化的组织可以接受来自转化组织的支链氨基酸，将活跃生长的组织与生长较慢或垂死的组织移开并再次铺种在选择性培养基上。
也可以通过如下方式选择出完整植物，即播种种子并等待萌发和籽苗生长，随后用AHAS抑制剂或AHAS抑制型除草剂如咪唑啉酮喷洒籽苗。转化的植物将存活而未转化的植物将被杀死。
实施例8：用经转化的玉米进行的田间试验
实施田间试验以评估用包含AHASL双重和三重突变体的载体之一转化的玉米植物在应用和不应用甲氧咪草烟的情况下是否表现任何重大的生理或繁殖影响。
材料和方法
试验材料来源
通过转化玉米近交种J553产生经遗传修饰的生物。使用TR5753作为近交雄性试验者产生来自8种载体构建体的F1杂交种子。所述载体构建体在表4中描述。该试验的种子在美国夏威夷Kauai岛的隔离杂交试验区中于2006年-2007年反季节期间产生。对所产生的每个F1杂交种的次级样品分析正确载体构建体的存在和偶然出现其他AHASL构建体的不存在。
从Midwest USA谷物种子公司购买非转化的商业杂交种并进行分析以证实不存在其他AHASL构建体的任何偶然出现。
表4
试验方法
试验设计是随机化完全区块设计中的列区设计，主要试验区是除草剂处理，而次级试验区是F1杂交项。除草剂处理包括1)未处理和2)以150gai/ha施加甲氧咪草烟。F1杂交项包括来自8个载体构建体的29个事件和4个未转化的商业杂交种(来自Pioneer Hi-BredInternational,Inc,Johnston,IA,USA的3395IR；和来自Garst Seed Co.,Inc.,Slater,IA.USA的8342GLS/IT,8546IT和8590IT)。试验区大小是2个播行；播行宽度2.5英尺；播行长度20英尺。每个处理组合具有4个重复。试验设置在三个地点。这些地点是：美国爱荷华州Ames；美国爱荷华州Estherville和美国新泽西州York。全部试验设置在2007年5月期间。
地点条件
爱荷华州Ames地点位于可能对出苗和早期生长均匀性有一些影响的玉米连续轮作区，因为显著量的玉米残留物在播种时存在。没有记录作物因天气、疾病或昆虫受到的主要影响。爱荷华州Estherville地点在7月16日遭受每小时70英里的狂风推动的大雨和约每小时约40英里的持续大风。在几乎每个试验区中观察到根倒伏。没有记录作物因疾病或昆虫受到的明显影响。新泽西州York地点在5月、7月和8月遭受超常降雨并且没有记录重大昆虫或疾病事件。
结果和讨论
当比较伴有或不伴有甲氧咪草烟应用的产量时，遍及三个地点联合的数据分析产生了具有显著产量下降(p≤0.05)的一种载体构建体(表5)。当以应用甲氧咪草烟处理时，一种载体构建体具有显著的产量提高。还从这三个试验地点收集其他农艺性状，并且当用甲氧咪草烟处理或不处理时，在一个构建体内部没有检测到性状如植物高度、穗高度、秆倒伏和根倒伏的显著差异。
试验的目的是确定向载体构建体施加的甲氧咪草烟这种除草剂是否将导致严重或明显的生理或繁殖影响，主要是产量，其中所述的载体构建体已经优化以提供针对甲氧咪草烟的提高的耐受性。当用甲氧咪草烟处理时，仅一种载体构建体(构建体1，单一突变体，P197L)具有籽粒产量的显著(p≤0.05)阴性应答。其余7种载体构建体在甲氧咪草烟除草剂存在或不存在下没有表现出不利的生理或繁殖影响。这些田间试验的结果证实了用包含AHASL双重或三重突变体的载体所转化的玉米植物的优异农艺潜能。
表5
本说明书中提到的全部出版物及专利申请说明了本发明所属领域的技术人员的水平。全部出版物及专利申请通过引用的方式以如同每份单独的出版物或专利申请被专门且个别地说明的相同程度通过引用方式并入本文。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过阐述和举例方式相当详细地描述了前述发明，不过显而易见地是可以进行某些变化和修改，这些在后附权利要求书的范围之内。

Claims (18)

1.核酸或者核酸组合，其中所述核酸组合是两种编码重组的或诱变的乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)的核酸的组合，其中每种核酸包含一个替换，其中编码第一AHASL的核酸编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸发生替换的AHASL多肽，所述氨基酸发生替换的AHASL多肽是在对应于SEQ ID NO:2第621位置处的天冬酰胺替换；和编码第二AHASL的核酸编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸发生替换的AHASL多肽，所述氨基酸发生替换的AHASL多肽是在对应于SEQ ID NO:2第542位置处的亮氨酸替换；
其中所述核酸是一种编码包含两个替换的、重组的或诱变的乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)的核酸，其中所述编码AHASL的核酸编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸发生两个替换的AHASL多肽，所述氨基酸发生两个替换的AHASL多肽是在对应于SEQ ID NO:2第621位置处的天冬酰胺替换和在对应于SEQ ID NO:2第542位置处的亮氨酸替换。
2.表达载体，其包含权利要求1所述的核酸或者核酸组合。
3.纯化的AHASL蛋白，其由权利要求1所述的核酸或者核酸组合编码。
4.控制作物植物附近的杂草的方法，包括：
i)在田间种植包含并表达权利要求1所述核酸或者核酸组合的植物或所述植物的种子，并生长来自其的作物植物；和
ii)施加所述植物耐受的、有效量的咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、或它们的混合物至田间杂草和至田间作物植物；或者至种植种子的田间，
由此控制所述杂草。
5.根据权利要求4的所述方法，其中所述咪唑啉酮除草剂选自咪草烟、甲灭草烟、甲氧咪草烟、灭草烟中的一种或多种。
6.产生转基因植物的方法，包括步骤：
a)用包含权利要求1所述的核酸或者核酸组合的表达载体转化植物细胞；和
b)从该植物细胞再生出表达所述核酸或者核酸组合编码的AHASL多肽的转基因植物。
7.鉴定或选择植物细胞、植物组织、植物或其部分的方法，包括：
a)提供包含并表达权利要求1所述的核酸或者核酸组合的植物细胞、植物组织、植物或其部分；
b)使所述植物细胞、植物组织、植物或其部分与至少一种AHAS抑制性化合物接触；和
c)确定所述植物细胞、植物组织、植物或其部分的生长是否受所述AHAS抑制性化合物抑制；
由此鉴定或选择植物细胞、植物组织、植物或其部分，
其中所述AHAS抑制性化合物选自咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、***并嘧啶除草剂、和嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述AHAS抑制性化合物是咪唑啉酮除草剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述咪唑啉酮除草剂选自咪草烟、甲灭草烟、甲氧咪草烟、灭草烟中的一种或多种。
10.用于产生除草剂抗性植物的方法，包括将抵抗除草剂的第一植物与不抵抗除草剂的第二植物杂交，并选择抵抗所述除草剂的后代植物，其中所述第一植物包含权利要求1所述的核酸或者核酸组合。
11.用于处理植物种子的方法，包括将种子处理制剂应用至种子，其中所述种子包含并表达权利要求1所述的核酸或者核酸组合，所述种子处理制剂选自咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、***并嘧啶除草剂、和嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂中的一种或多种。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述种子处理制剂是咪唑啉酮除草剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述咪唑啉酮除草剂选自咪草烟、甲灭草烟、甲氧咪草烟、灭草烟中的一种或多种。
14.根据权利要求11所述的方法，用于控制杂草，包括使植物的种子在播种之前和/或在种子催芽之后与AHAS抑制性化合物接触，其中所述植物包含权利要求1所述的核酸或者核酸组合，所述AHAS抑制性化合物选自咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、***并嘧啶除草剂、和嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂中的一种或多种。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述AHAS抑制性化合物是咪唑啉酮除草剂。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述咪唑啉酮选自咪草烟、甲灭草烟、甲氧咪草烟、灭草烟中的一种或多种。
17.用于鉴定包含权利要求1所述的核酸或者核酸组合的植物的方法，所述方法包括：
(A)提供来自植物的生物材料，
(B)实施PCR或杂交测试所述生物材料中的AHASL基因，以确定所述生物材料是否包含权利要求1所述的核酸或者核酸组合，和
(C)基于步骤(B)的结果，鉴定步骤(A)的植物是包含权利要求1所述的核酸或者核酸组合的植物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述生物材料是植物种子。
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