BRPI0608264A2 - planta, semente da planta, método para controlar ervas daninhas na vizinhança de uma planta, molécula de polinucleotìdeo isolada, cassete de expressão, célula hospedeira não humana, vetor de transformação, semente transformada, célula vegetal transformada, métodos para aumentar atividade de ahas resistente a herbicida em uma planta, para produzir uma planta resistente a herbicida, para aumentar toleráncia a herbicida em uma planta, e para selecionar para uma célula vegetal transformada, polipeptìdeo isolado, e, métodos para aumentar a resistência a herbicida de uma planta, e para combater vegetação indesejada - Google Patents

Abstract

PLANTA, SEMENTE DA PLANTA, METODO PARA CONTROLAR ERVAS DANINHAS NA VIZINHANçA DE UMA PLANTA, MOLéCULA DE POLINUCLEOTìDEO ISOLADA, CASSETE DE EXPRESSãO, CéLULA HOSPEDEIRA NãO HUMANA, VETOR DE TRANSFORMAçãO, SEMENTE TRANSFORMADA, CéLULA VEGETAL TRANSFORMADA, METODOS PARA AUMENTAR ATIVIDADE DE AFIAS RESISTENTE A HiERBICIDA EM UMA PLANTA, PARA PRODUZIR UMA PLANTA RESISTENTE A HERBICIDA, PARA AUMENTAR TOLERANCIA A HERBICIDA EM UMA PLANTA, E PARA SELECIONAR PARA UMA CELULA VEGETAL TRANSFORMADA, POLIPEPTìDEO ISOLADO, E, METODOS PARA AUMENTAR A RESISTêNCIA A HERBICIDA DE UMA PLANTA, E PARA COMBATER VEGETAçãO INDESEJADA. Plantas de arroz resistentes a herbicida, polinucleotídeos isolados que codificam polipeptídeos de subunidade grande 1 de acetohidroxiácido sintase (AHASL1), e as seqúêneias de aminoácidos destes polipeptídeos, são descritos. Cassetes de expressão e vetores de transformação compreendendo os polinucleotídeos da invenção, assim como plantas e células hospedeiras transformadas com os polinucleotídeos, são descritas. Métodos de usar os polinucleotídeo para aumentar a resistência de plantas a herbicidas de imidazolinona, e métodos para controlar ervas daninhas na vizinhança de plantas resistentes a herbicida também são descritos.

Description

"PLANTA, SEMENTE DA PLANTA, MÉTODO PARA CONTROLARERVAS DANINHAS NA VIZINHANÇA DE UMA PLANTA,MOLÉCULA DE POLINUCLEOTÍDEO ISOLADA, CASSETE DEEXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA NÃO HUMANA, VETOR DETRANSFORMAÇÃO, SEMENTE TRANSFORMADA, CÉLULAVEGETAL TRANSFORMADA, MÉTODOS PARA AUMENTARATIVIDADE DE AHAS RESISTENTE A HERBICIDA EM UMAPLANTA, PARA PRODUZIR UMA PLANTA RESISTENTE AHERBICIDA, PARA AUMENTAR TOLERÂNCIA A HERBICIDA EMUMA PLANTA, E PARA SELECIONAR PARA UMA CÉLULAVEGETAL TRANSFORMADA, POLIPEPTÍDEO ISOLADO, E,MÉTODOS PARA AUMENTAR A RESISTÊNCIA A HERBICIDA DEUMA PLANTA, E PARA COMBATER VEGETAÇÃO INDESEJADA"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção se refere ao campo de biotecnologia agrícola,particularmente a plantas de arroz resistentes a herbicida e a novas seqüênciasde polinucleotídeos que codificam proteínas de subunidade grande deacetohidroxiácido sintase resistentes a herbicida.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Ervas daninhas são umas das principais limitações paraprodução de arroz. Semeadura direta reduziu os problemas laborais detransplantação; entretanto, esta tecnologia ajudou a aumentar o problema deervas daninhas. Uso de herbicida em arroz é uma prática comum na maioriadas regiões de arroz sob cultivo de semeadura direta e/ou paísesdesenvolvidos que crescem arroz sob sistemas ou de transplantação ousemeadura direta. Normalmente um herbicida de gramínea e um dedicotiledônea são aplicados uma ou mais vezes a fim de controlar ervasdaninhas em cultivos de arroz.

Gramíneas, ciperáceas e arroz daninho (arroz vermelho) foramos principais grupos de espécies que possuem alta aptidão para os mesmosambientes onde arroz é crescido. Elas se tornaram globalmente distribuídas esão difíceis para controlar ervas daninhas em cultivos de arroz. Emboraexistam diversas práticas culturais que auxiliam em controle de sementes esão convenientes para melhor cuidado ambiental, estas práticas impõemrestrições e aumentam custos de produção. Preparação de terra, nivelamentode terra, barragens e profundidade de água, rotação de terra, sementecertificada, sistemas vegetais apropriados e datas de plantio podem seralgumas das práticas culturais que podem ajudar a reduzir o banco desementes de ervas daninhas e o desenvolvimento de ervas daninhas tolerantesa herbicida.

Apesar das muitas recomendações para melhores práticasculturais os fazendeiros ainda recorrem ao uso de herbicidas como a principalferramenta para controlar ervas daninhas. O uso e abuso de alguns destesquímicos resultou no desenvolvimento de ervas daninhas tolerantes tipocapim-arroz (Eclzinochloa crus galli) resistente a propanil e resistente abutaclor. Nestes casos, seria conveniente ter outros herbicidas com diferentesmodos de ação com a capacidade de controlar a maioria destas espécies deervas daninhas. A disponibilidade de tais herbicidas permitiria uma rotação deherbicidas com um modo de ação diferente do que aqueles herbicidas que sãocomumente usados em produção de arroz.

Imidazolinonas são um grupo de herbicidas com um modo deação diferente do que os herbicidas de arroz usados comumente. Estesherbicidas são conhecidos por inibirem acetohidroxiácido sintase (AHAS; EC4.1.3.18, também conhecida como acetolactato sintase ou ALS), uma enzimachave para a biossíntese de aminoácidos de cadeia ramificada. Em particular,acetohidroxiácido sintase (AHAS; EC 4.1.3.18, também conhecida comoacetolactato sintase ou ALS), é a primeira enzima que catalisa a síntesebioquímica dos aminoácidos de cadeia ramificada valina, leucina e isoleucina(Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine," in PlantAmino Acid, Singh, B.K., ed., Mareei Dekker Inc. Nova Iorque, Nova Iorque,pp. 227-247). AHAS é o sítio de ação de quatro famílias estruturalmentediversas de herbicidas incluindo as sulfoniluréias (LaRossa and Falco (1984)Trends Biotechnol. 2:158-161), as imidazolinonas (Shaner et al. (1984) PlantPhysiol. 76:545-546), as triazolopirimidinas (Subramanian and Gerwick(1989) "Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines," inBioeatalysis in Agrieultural Bioteehnology, Whitaker, J.R. and Sonnet, P.E..eds., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington,D.C., pp. 277-288), e os pirimidiloxibenzoatos (Subramanian et al. (1990)Plant Physiol. 94: 239-244.). Herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia sãoamplamente usados em agricultura moderna devido a sua efetividade em taxasde aplicação muito baixas e não toxicidade relativa em animais. Inibindoatividade de AHAS, estas famílias de herbicidas previnem crescimentoadicional e desenvolvimento de plantas susceptíveis incluindo muitas espéciesde ervas daninhas. Diversos exemplos de herbicidas de imidazolinonadisponíveis comercialmente são PURSUIT® (imazetapir), SCEPTERS(imazaquin) e ARSENAL® (imazapir). Exemplos de herbicidas desulfoniluréia são clorsulfuron, metsulfuron metil, sulfometuron metil,clorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulfuron metil,nicosulíuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, triflusulfuron metil,triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron,imazosulfuron, pirazosulfuron etil e halosulfuron.

Devido a sua alta efetividade e baixa toxicidade, herbicidas deimidazolinona são favorecidos para aplicação pulverizando sobre o topo deuma ampla área de vegetação. A capacidade de pulverizar um herbicida sobreo topo de uma ampla extensão de vegetação diminui os custos associados comestabelecimento e manutenção de plantação, e diminui a necessidade depreparação de sítio antes de uso de tais químicos. Pulverizar sobre o topo deuma espécie tolerante desejada também resulta na capacidade de atingirpotencial de rendimento máximo da espécie desejada devido à ausência deespécies competitivas. Entretanto, a capacidade de usar tais técnicas depulverização é dependente da presença de espécies resistentes aimidazolinona da vegetação desejada na área de pulverização.

Dentre os principais cultivos agrícolas, algumas espécies deleguminosas tal como soja são naturalmente resistentes a herbicidas deimidazolinona devido a sua capacidade de metabolizar rapidamente oscompostos de herbicida (Shaner and Robinson (1985) Weed Sei. 33:469-471).

Outros cultivos tal como milho (Newhouse et ai. (1992) Plant Physiol.100:882-886) e arroz (Barrett et ai. (1989) Crop Safeners for Herbicides,Academic Press, Nova Iorque, pp. 195-220) são de alguma maneirasusceptíveis a herbicidas de imidazolinona. A sensibilidade diferencial para osherbicidas de imidazolinona é dependente da natureza química do herbicidaparticular e metabolismo diferencial do composto de uma forma tóxica parauma não tóxica em cada planta (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76:545-546; Brown et al., (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27:24-29). Outrasdiferenças fisiológicas de planta tal como absorção e translocação tambémdesempenham um papel importante em sensibilidade (Shaner and Robinson(1985) WeedSei. 33:469-471).

Plantas resistentes a imidazolinonas, sulfoniluréias etriazolopirimidinas foram produzidas com sucesso usando mutagênese desemente, micrósporo, pólen, e calo em Zea mays, Arabidopsis thaliana,Brassica napus (i.e., canola) Glicina max, Nicotiana tabaeum, e Oryza sativa(Sebastian et al. (1989) Crop Sei. 29:1403-1408; Swanson et al., 1989 Theor.Appl. Genet. 78:525-530; Newhouse et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 83:65-70; Sathasivan et al. (1991) Plant Physiol 97:1044-1050; Mourand et al.(1993)1 Heredity 84:91-96; Patente Norte-Americana No. 5.545.822). Emtodos os casos, um único, gene nuclear parcialmente dominante conferiuresistência. Quatro plantas de trigo resistentes a imidazolinona também forampreviamente isoladas seguindo mutagênese de semente de Triticum aestivunzL. cv. Fidel (Newhouse et al. (1992) Plant Plzysiol. 100:882-886). Estudos deherança confirmaram que um único, gene parcialmente dominante conferiuresistência. Baseado em estudos alélicos, os autores concluíram que asmutações nas quatro linhagens identificadas foram localizadas no mesmolocus. Um dos genes de resistência de cultivar Fidel foi designado FS-4(Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882-886).

Modelagem baseada em computador da conformaçãotridimensional do complexo AHAS-inibidor prediz diversos aminoácidos naárea de ligação de inibidor proposta como sítios onde mutações induzidasiriam provavelmente conferir resistência seletiva para imidazolinonas (Ott etal. (1996) J. Mol. Biol 263:359-368). Plantas de trigo produzidas comalgumas destas mutações projetadas racionalmente nos sítios de ligaçãopropostos da enzima AHAS exibiram de fato resistência específica para umaúnica classe de herbicidas (Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:359-368).

Resistência vegetal a herbicidas de imidazolinona também foirelatada em diversas patentes. Patente Norte-Americana Nos. 4.761.373,5.331.107, 5.304.732, 6.211.438, 6.211.439 e 6.222.100 geralmentedescrevem o uso de um gene de AHAS alterado para obter resistência aherbicida em plantas, e especificamente descrevem certas linhagens de milhoresistentes a imidazolinona. Patente Norte-Americana No. 5.013.659 descreveplantas exibindo resistência a herbicida devido a mutações em pelo menos umaminoácido em uma ou mais regiões conservadas. As mutações descritasnessa codificam ou resistência cruzada para imidazolinonas e sulfoniluréiasou resistência específica para sulfoniluréia, mas resistência específica paraimidazolinona não é descrita. Patente Norte-Americana No. 5.731.180 ePatente Norte-Americana No. 5.767.361 discutem um gene isolado tendo umaúnica substituição de aminoácido em uma seqüência de aminoácidos deAHAS de monocotiledônea tipo selvagem que resulta em resistênciaespecífica para imidazolinona. Em adição, plantas de arroz que são resistentesa herbicidas que interferem com AHAS foram desenvolvidas por criação demutação e também pela seleção de plantas resistentes a herbicida a partir deum conjunto de plantas de arroz produzidas por outra cultura. Veja, PatenteNorte-Americana Nos. 5.545.822, 5.736.629, 5.773.703, 5.773.704, 5.952.553e 6.274.796.

Em plantas, como em todos os outros organismos examinados,a enzima AHAS é compreendida de duas subunidades: uma subunidadegrande (papel catalítico) e uma subunidade pequena (papel regulador)(Duggleby and Pang (2000) J. Biochem. Mol. Biol. 33:1-36). A subunidadegrande de AHAS (também referida neste lugar como AHASL) pode sercodificada por um único gene como no caso de Arabidopsis e arroz ou pormúltiplos membros de família de gene como em milho, canola, e algodão.

Substituições específicas de único nucleotídeo na subunidade grandeconferem na enzima um grau de insensibilidade para uma ou mais classes deherbicidas (Chang and Duggleby (1998) Biochenz J. 333:765-777).

Por exemplo, trigo, Triticum aestivum L., contém três geneshomólogos de subunidade grande de acetohidroxiácido sintase. Cada um dosgenes exibe expressão significante baseada em resposta de herbicida e dadosbioquímicos de mutantes em cada um dos três genes (Ascenzi et al (2003)International Society of Plant Molecular Biologists Congress, Barcelona,Spain, Ref. No. S10-17). As seqüências de codificação de todos os três genescompartilham extensiva homologia no nível de nucleotídeo (WO 03/014357).

Através de seqüenciamento dos genes de AHASL de diversas variedades deTritieum aestivum, a base molecular de tolerância a herbicida nas linhagensmais IMI-tolerantes (imidazolinona-tolerantes) foi encontrada ser a mutaçãoS653(At)N, indicando uma substituição de serina para asparagina em umaposição equivalente a serina em aminoácido 653 em Arabidopsis thaliazza(WO 03/01436; WO 03/014357). Esta mutação é devida a um únicopolimorfismo de nucleotídeo (SNP) na seqüência de DNA codificando aproteína AHASL.

Dado sua alta efetividade e baixa toxicidade, herbicidas deimidazolinona são favorecidos para uso agrícola. Entretanto, a capacidade deusar herbicidas de imidazolinona em um sistema de produção de safraparticular depende da disponibilidade de variedades resistentes aimidazolinona da planta cultivada de interesse.

Para produzir tais variedadesresistentes a imidazolinona, melhoristas de plantas necessitam desenvolverlinhagens com a característica de resistência a imidazolinona. Assim,linhagens resistentes a imidazolinona adicionais e variedades de plantascultivadas, assim como métodos e composições para a produção e uso delinhagens e variedades resistentes a imidazolinona, são necessários.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece plantas de arroz tendo resistênciaaumentada para herbicidas quando comparado a uma planta de arroz tiposelvagem. Em particular, as plantas de arroz da invenção têm resistênciaaumentada para herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia, quandocomparado a uma planta de arroz tipo selvagem. As plantas resistentes aherbicida de arroz da invenção compreendem pelo menos uma cópia de umgene ou polinucleotídeo que codificam uma subunidade grande 1 deacetohidroxiácido sintase (AHASLl) resistente a herbicida que compreendeuma substituição de aminoácido em relação à seqüência de aminoácidos deuma proteína AHASLl de arroz tipo selvagem. Em uma forma de realizaçãoda invenção, as plantas de arroz resistentes a herbicida compreendem umaproteína AHASLl resistente a herbicida que compreende uma valina ouaspartato em posição de aminoácido 179 ou posição equivalente. A planta dearroz resistente a herbicida da invenção pode conter uma, duas, três, quatro,ou mais cópias de um gene ou polinucleotídeo codificando uma proteínaAHASLl resistente a herbicida da invenção. As plantas de arroz da invençãotambém incluem sementes e plantas de progenia que compreendem pelomenos uma cópia de um gene ou polinucleotídeo codificando uma AHASLlresistente a herbicida da invenção.

A presente invenção fornece plantas de arroz resistentes aherbicida que são da linhagem de arroz que foi designada como IMINTA 16.Uma amostra de sementes da linhagem IMINTA 16 foi depositada com odepósito de patente em NCIMB Ltd. e designado Número de Acesso deNCIMB, NCIMB 41262. As plantas de arroz IMINTA 16 compreendem emseus genomas um gene de AHASLl que compreende as seqüências denucleotídeos estabelecidas na SEQ ID NOS: 1 e 3, ou que codificam aproteína AHASLl compreendendo, a seqüência de aminoácidos estabelecidana SEQ ID NO:2. Quando comparada à seqüência de aminoácidos da proteínaAHASLl que é codificada por um gene de AHASLl de uma planta de arroztipo selvagem (No. de Acesso de GenBank AB049822), a seqüência deaminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2 possui uma única diferença deaminoácido da seqüência de aminoácidos de tipo selvagem. Na seqüência deaminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2, existe uma valina em posição deaminoácido 179. Na seqüência de aminoácidos da proteína AHASLl de arroztipo selvagem, esta mesma posição de aminoácido tem uma alanina.

A presente invenção fornece adicionalmente polinucleotídeosisolados e polipeptídeos isolados para proteínas AHASLl de arroz (Oryzasativa). Os polinucleotídeos da invenção abrangem seqüências denucleotídeos que codificam proteínas AHASLl resistentes a herbicida. Asproteínas AHASLl resistentes a herbicida da invenção são proteínasAHASLl resistentes a imidazolinona que compreendem uma substituição dealanina por valina em posição 179 nas suas seqüências de aminoácidosrespectivas, quando comparado à seqüência de aminoácidos tipo selvagemcorrespondente. Os polinucleotídeos da invenção abrangem as seqüências denucleotídeos estabelecidas na SEQ ID NOS: 1 e 3, seqüências de nucleotídeoscodificando a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2, efragmentos e variantes de ditas seqüências de nucleotídeos que codificamproteínas compreendendo atividade de AHAS, particularmente atividade deAHAS resistente a herbicida.

A presente invenção fornece cassetes de expressão paraexpressar os polinucleotídeos da invenção em plantas, células vegetais, eoutras células hospedeiras não humanas. Os cassetes de expressãocompreendem um promotor expressável na planta, célula vegetal, ou outrascélulas hospedeiras de interesse operavelmente ligado a um polinucleotídeoda invenção que codifica uma proteína AHASLl resistente a herbicida. Senecessário para direcionar expressão para o cloroplasto, o cassete deexpressão também pode compreender uma seqüência tendo como alvocloroplasto operavelmente ligada que codifica de um peptídeo de trânsito decloroplasto para direcionar uma proteína AHASLl expressa para ocloroplasto. Os cassetes de expressão da invenção encontram uso em ummétodo para reforçar a tolerância a herbicida de uma planta e uma célulahospedeira.

O método envolve transformar a planta ou célula hospedeira comum cassete de expressão da invenção, em que o cassete de expressãocompreende um promotor que é expressável na planta ou célula hospedeira deinteresse e o promotor é operavelmente ligado a um polinucleotídeo dainvenção que codificam uma proteína AHASLl resistente a herbicida dainvenção. O método compreende adicionalmente regenerar uma plantatransformada a partir da célula vegetal transformada.

A presente invenção fornece um método para aumentaratividade de AHAS em uma planta compreendendo transformar uma célulavegetal com um construto de polinucleotídeo compreendendo uma seqüênciade nucleotídeos operavelmente ligada a um promotor que aciona expressãoem uma célula vegetal e regenerar uma planta transformada a partir da célulavegetal transformada. A seqüência de nucleotídeos é selecionada a partirdaquelas seqüências de nucleotídeos que codificam as proteínas AHASLlresistentes a herbicida da invenção, particularmente as seqüências denucleotídeos estabelecidas na SEQ ID NOS: 1 e 3, seqüências de nucleotídeoscodificando a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2, efragmentos e variantes destas. Uma planta produzida por este métodocompreende atividade de AHAS aumentada, quando comparada a uma plantanão transformada.

A presente invenção fornece um método para produzir umaplanta resistente a herbicida compreendendo transformar uma célula vegetalcom um construto de polinucleotídeo compreendendo uma seqüência denucleotídeos operavelmente ligada a um promotor que aciona expressão emuma célula vegetal e regenerar uma planta transformada a partir de dita célulavegetal transformada. A seqüência de nucleotídeos é selecionada a partirdaquelas seqüências de nucleotídeos que codificam as proteínas AHASLlresistentes a herbicida da invenção, particularmente as seqüências denucleotídeos estabelecidas na SEQ ID NOS: 1 e 3, seqüências de nucleotídeoscodificando a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ IlD NO:2, efragmentos e variantes destas, incluindo, mas não limitadas a, as formasmaduras das proteínas AHASLl resistentes a herbicida da invenção. Umaplanta resistente a herbicida produzida por este método compreenderesistência aumentada para pelo menos um herbicida, particularmente umherbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia, quando comparado a uma plantanão transformada.

A presente invenção fornece um método para reforçartolerância a herbicida em uma planta resistente a herbicida. O métodoencontra uso em aumentar a resistência de uma planta que já é resistente paraum nível de um herbicida que iria matar ou prejudicar significantemente umaplanta tipo selvagem. Uma tal planta tolerante a herbicida pode ser uma plantatolerante a herbicida que foi modificada geneticamente para tolerância aherbicida ou uma planta tolerante a herbicida que foi desenvolvida por meiosque não envolvem DNA recombinante tal como, por exemplo, as plantas dearroz IMINTA 16 da presente invenção. O método compreende transformaruma planta tolerante a herbicida com um construto de polinucleotídeocompreendendo uma seqüência de nucleotídeos operavelmente ligada a umpromotor que aciona expressão em uma célula vegetal e regenerar uma plantatransformada a partir da célula vegetal transformada. A seqüência denucleotídeos é selecionada a partir daquelas seqüências de nucleotídeos quecodificam as proteínas AHASLl resistentes a herbicida da invenção,particularmente as seqüências de nucleotídeos estabelecidas na SEQ ID NO: 1e 3, seqüências de nucleotídeos codificando a seqüência de aminoácidosestabelecida na SEQ ID NO:2, e fragmentos e variantes destas.

A presente invenção fornece vetores de transformaçãocompreendendo um gene marcador selecionável da invenção. O genemarcador selecionável compreende um promotor que aciona expressão emuma célula hospedeira operavelmente ligada a um polinucleotídeocompreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteínaAHASLl resistente a herbicida da invenção. O vetor de transformação podeadicionalmente compreender um gene de interesse para ser expresso na célulahospedeira e também pode, se desejado, incluir uma seqüência tendo comoalvo cloroplasto que é operavelmente ligada ao polinucleotídeo da invenção.

A presente invenção fornece adicionalmente métodos para usaros vetores de transformação da invenção para selecionar por célulastransformadas com o gene de interesse. Tais métodos envolvem atransformação de uma célula hospedeira com o vetor de transformação,expondo a célula a um nível de um herbicida de imidazolinona ousulfoniluréia que iria matar ou inibir o crescimento de uma célula hospedeiranão transformada, e identificar a célula hospedeira transformada por suacapacidade de crescer na presença do herbicida. Em uma forma de realizaçãoda invenção, a célula hospedeira é uma célula vegetal e o gene marcadorselecionável compreende um promotor que aciona expressão em uma célulavegetal.

A presente invenção fornece um método para controlar ervasdaninhas na vizinhança das plantas resistentes a herbicida da invenção,incluindo as plantas de arroz resistentes a herbicida descritas acima e plantastransformadas com os polinucleotídeos AHASLl resistentes a herbicida dainvenção. Tais plantas transformadas compreendem em seus genomas pelomenos um cassete de expressão compreendendo um promotor que acionaexpressão de gene em uma célula vegetal, em que o promotor éoperavelmente ligado a um polinucleotídeo AHASLl da invenção. O métodocompreende aplicar uma quantidade efetiva de um herbicida para as ervasdaninhas e para a planta resistente a herbicida, em que a planta resistente aherbicida, planta tem resistência aumentada para pelo menos um herbicida,particularmente um herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia, quandocomparada a uma planta tipo selvagem ou não transformada.

As plantas da presente invenção podem ser transgênicas ounão transgênicas. Um exemplo de uma planta de arroz não transgênica tendoresistência aumentada para imidazolinona e/ou herbicidas de sulfoniluréiainclui uma planta de arroz tendo Número de Acesso de NCIMB, NCIMB41262, ou mutante, recombinante, ou um derivado geneticamente modificadoda planta tendo Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262; ou dequalquer progenia da planta tendo Número de Acesso de NCIMB, NCIMB41262; ou uma planta que é uma progenia de qualquer destas plantas; ou umaplanta que compreende as características de resistência a herbicida da plantatendo Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262.

A presente invenção também fornece plantas, órgãos vegetais,tecidos vegetais, células vegetais, sementes, e células hospedeiras nãohumanas que são transformadas com o pelo menos um polinucleotídeo,cassete de expressão, ou vetor de transformação da invenção. Tais plantastransformadas, órgãos vegetais, tecidos vegetais, células vegetais, sementes, ecélulas hospedeiras não humanas têm tolerância ou resistência aumentadapara pelo menos um herbicida, em níveis do herbicida que matam ou inibem ocrescimento de uma planta não transformada, tecido vegetal, célula vegetal,ou célula hospedeira não humana, respectivamente. Preferivelmente, asplantas transformadas, tecidos vegetais, células vegetais, e sementes dainvenção são Arabidopsis thaliana e plantas cultivadas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS ILUSTRAÇÕES

Figura 1 é um alinhamento de seqüência de nucleotídeos dogene de AHASLl de arroz resistente a herbicida da presente invenção (SEQID NO: 1) com algumas seqüências de nucleotídeos de AHASL de plantasconhecidas. A transição de C para T (em relação a tipo selvagem) emnucleotídeo 542 na SEQ ID NO: 1 é indicada por fonte branca dentro de umacaixa preta. Os códons de início e término são representados em fonte emnegrito. Os nomes das outras seqüências de AHASL na figura são definidoscomo segue: "OsAHASLl.l" é uma seqüência de nucleotídeos AHASLl tiposelvagem de constituição de arroz El Paso; "OsAHASL1.2" é uma seqüênciade nucleotídeos AHASLl tipo selvagem de constituição de arroz IRGA;

"OsAHASL1.4" é uma seqüência de nucleotídeos de AHASLlde arroz (No. de Acesso AB049822); "OsAHASLl.6" é uma seqüência denucleotídeos de AHASLl de arroz (No. de Acesso AB049823);"ZmAHASLl" é uma seqüência de nucleotídeos de AHASLl de milho (No.de Acesso X63554); "ZmAHASL2" é uma seqüência de nucleotídeos deAHASL2 de milho (No. de Acesso X63553); "OsAHASL2" é uma seqüênciade nucleotídeos de AHASL2 de arroz (No. de Acesso AL731599);"AtAHASL" é uma seqüência de nucleotídeos de AHASL de Arabidopsisthaliana (No. de Acesso AYl24092).Figura 2 é um alinhamento de seqüência de aminoácidos daproteína AHASLl de arroz resistente a herbicida da presente invenção (SEQID NO:2) com algumas seqüências de nucleotídeos de AHASL de plantasconhecidas. A substituição de Ala por Val (em relação a tipo selvagem) emposição 179 na SEQ ID NO:2 é indicada por fonte branca dentro de uma caixapreta. A metionina inicial (M) é representada em fonte em negrito. Os outrosnomes usados na figura se referem às seqüências de aminoácidos codificadaspelas seqüências de nucleotídeos indicadas na descrição de Figura 1 acima.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

As seqüências de nucleotídeo e de aminoácidos listadas nalistagem de seqüências acompanhante são mostradas usando abreviações deletra padrão para bases de nucleotídeos, e código de três letras paraaminoácidos. As seqüências de nucleotídeos seguem a convenção padrão decomeçar na extremidade 5' da seqüência e prosseguir adiante (i.e., deesquerda para direita em cada linha) para a extremidade 3'. Apenas uma fitade cada seqüência de ácidos nucleicos é mostrada, mas a fita complementar éentendida ser inclusa por qualquer referência à fita apresentada. Asseqüências de aminoácidos seguem a convenção padrão de começar notérmino amino da seqüência e prosseguir adiante (i.e., de esquerda para direitaem cada linha) para o término carboxil.

SEQ ID NO:l expõe a seqüência de nucleotídeos codificandouma proteína AHASLl resistente a imidazolinona de arroz com a substituiçãode Alai79 por Vai. A região de codificação de SEQ ID NO: 1 corresponde anucleotídeos 7 a 1938.

SEQ ID NO:2 expõe a seqüência de aminoácidos de umaproteína AHASLl resistente a imidazolinona de arroz com a substituição deAlaj79 por Val que é codificada pela seqüência de nucleotídeos estabelecidana SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 3 expõe a seqüência de nucleotídeos da região decodificação de SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NOS: 4-18 expõe as seqüências de nucleotídeos deiniciadores usados para a amplificação por PCR e seqüenciamento de DNAdo gene de AHASLl da invenção como descrito em Exemplo 2 abaixo (veja,Tabela 1),

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a plantas de arroz tendoresistência aumentada para herbicidas quando comparado a uma planta dearroz tipo selvagem. As plantas resistentes a herbicida de arroz da invençãoforam produzidas como descrito a seguir expondo sementes de arroz tiposelvagem (com respeito à resistência a herbicida) a um mutagênico, semeandoas sementes, permitindo que as plantas amadureçam e reproduzam, eselecionando plantas de progenia que apresentaram resistência aumentadapara herbicidas de imidazolinona, em relação à resistência de uma planta dearroz tipo selvagem. A invenção fornece a linhagem de arroz resistente aherbicida e plantas destas que são referidas neste lugar como IMINTA 16.

Tais plantas resistentes a herbicida de arroz encontram uso em métodos paracontrolar ervas daninhas, particularmente arroz vermelho e outras ervasdaninhas que são sensíveis a herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia.

A partir das plantas de arroz resistentes a herbicida IMINTA16, a região de codificação de um gene de subunidade grande 1 deacetohidroxiácido sintase (AHASLl) foi isolado por amplificação por reaçãoem cadeia da polimerase (PCR) e seqüenciado. Comparando as seqüências depolinucleotídeos das plantas resistentes a herbicida de arroz da invenção comum cDNA de AHASLl de arroz de uma planta de arroz tipo selvagem (No. deAcesso de GenBank AB049822), foi descoberto que a região de codificaçãoda seqüência de polinucleotídeos de AHASLl de IMINTA 16 diferiu daseqüência de cDNA de AHASLl de arroz tipo selvagem por um úniconucleotídeo. Para a seqüência de polinucleotídeos de AHASLl de IMINTA16, houve uma transição de C para T em nucleotídeo 542 (SEQ ID NO: 1,Figura 1). Esta transição de C para T na seqüência de polinucleotídeos deAHASLl resulta em uma substituição de Ala por Val em aminoácido 179 emuma região conservada da seqüência de aminoácidos da proteína AHASLlprevista, em relação à seqüência de aminoácidos da proteína AHASLl tiposelvagem (Figura 2).

A invenção se refere adicionalmente a moléculas isoladas depolinucleotídeo compreendendo seqüências de nucleotídeos que codificam asproteínas AHASLl resistentes a herbicida de plantas de arroz IMINTA 16 e atais proteínas AHASL1. A invenção descreve o isolamento e seqüência denucleotídeos de um polinucleotídeo codificando uma proteína AHASLl dearroz resistente a herbicida de planta de arroz resistente a herbicida que foiproduzido por mutagênese química de plantas de arroz tipo selvagem. Asproteínas AHASLl resistentes a herbicida da invenção compreendem umasubstituição de alanina por valina em posição 179 em suas respectivasseqüências de aminoácidos, quando comparado à seqüência de aminoácidosde AHASLl de tipo selvagem correspondente.

A presente invenção fornece moléculas isoladas depolinucleotídeo que codificam proteínas AHASLl resistentes a herbicida dearroz (Oryza sativa L.). Especificamente, a invenção fornece moléculasisoladas de polinucleotídeo compreendendo: as seqüências de nucleotídeosestabelecidas na SEQ ID NOS: 1 e 3, seqüências de nucleotídeos codificandoproteínas AHASLl compreendendo a seqüência de aminoácidos estabelecidana SEQ ID NO:2, e fragmentos e variantes de tais seqüências de nucleotídeosque codificam proteínas AHASLl funcionais que compreendem atividade deAHAS resistente a herbicida.

As moléculas isoladas de polinucleotídeo de AHASLlpolinucleotídeo resistentes a herbicida da invenção compreendem seqüênciasde nucleotídeos que codificam proteínas AHASLl resistentes a herbicida.Tais moléculas de polinucleotídeo podem ser usadas em construtos depolinucleotídeo para a transformação de plantas, particularmente plantascultivadas, para estimular a resistência das plantas para herbicidas,particularmente herbicidas que são conhecidos por inibirem atividade deAHAS, mais particularmente herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia. Taisconstrutos de polinucleotídeo podem ser usados cassetes de expressão, vetoresde expressão, vetores de transformação, plasmídeos e os semelhantes. Asplantas transgênicas obtidas seguindo transformação com tais construtos depolinucleotídeo mostram resistência aumentada para herbicidas inibindoAHAS tal como, por exemplo, herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia.

Composições da invenção incluem moléculas depolinucleotídeo compreendendo seqüências de nucleotídeos que codificamproteínas AHASL1. Em particular, a presente invenção sustenta moléculasisoladas de polinucleotídeo compreendendo seqüências de nucleotídeoscodificando a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:2, efragmentos e variantes destas que codificam polipeptídeos compreendendoatividade de AHAS. Adicionalmente são fornecidos polipeptídeos tendo umaseqüência de aminoácidos codificada por uma molécula de polinucleotídeodescrita neste lugar, por exemplo aquelas estabelecidas na SEQ ID NOS: 1 e3, e fragmentos e variantes destas que codificam polipeptídeoscompreendendo atividade de AHAS, particularmente atividade de AHASLresistente a herbicida. As moléculas de polinucleotídeos da invençãoabrangem adicionalmente seqüências de nucleotídeos que codificam formasmaduras das proteínas AHASLl descritas acima. Tais formas maduras deproteínas AHASLl compreendem atividade de AHAS, particularmenteatividade de AHAS resistente a herbicida, mas carecem do peptídeo detrânsito de cloroplasto que é parte de proteínas AHASLl de comprimentocompleto.

A invenção abrange composições de ácidos nucleicos ouproteínas isoladas ou substancialmente purificadas. Uma molécula depolinucleotídeo ou proteína "isolada" ou "purificada", ou porçãobiologicamente ativa desta, é substancialmente ou essencialmente livre decomponentes que normalmente acompanham ou interagem com a molécula depolinucleotídeo ou proteína como encontrado em seu ambiente naturalmenteocorrente. Assim, uma molécula de polinucleotídeo ou proteína isolada oupurificada é substancialmente livre de outro material celular, ou meio decultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmentelivre de precursores químicos ou outros químicos quando sintetizadaquimicamente. Preferivelmente, um ácido nucleico "isolado" é livre deseqüências (preferivelmente seqüências codificando proteína) quenaturalmente flanqueiam o ácido nucleico (i.e., seqüências localizadas nasextremidades 5' e 3' do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo doqual o ácido nucleico é derivado. Por exemplo, em várias formas derealização, a molécula isolada de polinucleotídeo pode conter menos do quecerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de seqüências denucleotídeos que naturalmente flanqueiam a molécula de polinucleotídeo emDNA genômico da célula da qual o ácido nucleico é derivado. Uma proteínaque é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteínatendo menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% (em peso seco) deproteína contaminante. Quando a proteína da invenção ou porçãobiologicamente ativa desta é produzida recombinantemente, preferivelmentemeio de cultura representa menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou1% (em peso seco) de precursores químicos ou químicos de não proteína deinteresse.

A presente invenção fornece polipeptídeos isoladoscompreendendo proteínas AHASL1. Os polipeptídeos isolados compreendemuma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo daseqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2, as seqüências deaminoácidos codificadas por seqüências de nucleotídeos estabelecidas na SEQID NOS: 1 e 3, e fragmentos funcionais e variantes de ditas seqüências deaminoácidos que codificam um polipeptídeo AHWlSLI compreendendoatividade de AHAS. Por "fragmentos e variantes funcionais" é pretendidofragmentos e variantes dos polipeptídeos exemplificados que compreendematividade de AHAS.

Adicionalmente são fornecidos polipeptídeos isoladoscompreendendo as formas maduras das proteínas AHASLl da invenção. Taisformas maduras de proteínas AHASLl compreendem atividade de AHAS5particularmente atividade de AHAS resistente a herbicida, mas carecem dopeptídeo de trânsito de cloroplasto que é parte de proteínas AHASLl decomprimento completo.

Em certas formas de realização da invenção, os métodosenvolvem o uso de plantas tolerantes a herbicida ou resistentes a herbicida.Por uma planta "tolerante a herbicida" ou "resistente a herbicida", épretendido que uma planta seja tolerante ou resistente à pelo menos umherbicida em um nível que iria normalmente matar, ou inibir o crescimentode, uma planta normal ou tipo selvagem. Em uma forma de realização dainvenção, as plantas tolerantes a herbicida da invenção compreendem umaproteína AHASLl tolerante a herbicida ou resistente a herbicida. Por"proteína AHASLl tolerante a herbicida" ou "proteína AHASLl resistente aherbicida", é pretendido que uma tal proteína AHASLl apresente maioratividade de AHAS, em relação à atividade de AHAS de uma proteínaAHASLl tipo selvagem, quando na presença de pelo menos um herbicida queé conhecido por interferir na atividade de AHAS e em uma concentração ounível do herbicida que é conhecido por inibir a atividade de AHAS daproteína AHASLl tipo selvagem. Além disso, a atividade de AHAS de umatal proteína AHASLl tolerante a herbicida ou resistente a herbicida pode serreferida neste lugar como atividade de AHAS "tolerante a herbicida" ou"resistente a herbicida".

Para a presente invenção, os termos "tolerante a herbicida" e"resistente a herbicida" são usados permutavelmente e são pretendidos paraterem um significado equivalente e um escopo equivalente. Similarmente, ostermos "tolerância a herbicida" e "resistência a herbicida" são usadospermutavelmente e são pretendidos para terem um significado equivalente eum escopo equivalente. Da mesma maneira, os termos "resistente aimidazolinona" e "resistência a imidazolinona" são usados permutavelmente esão pretendidos serem de um significado equivalente e um escopo equivalenteque os termos "tolerante a imidazolinona" e "tolerância a imidazolinona",respectivamente.

A invenção abrange polinucleotídeos AHASLl resistentes aherbicida e proteínas AHASLl resistentes a herbicida. Por "polinucleotídeoAHASLl resistentes a herbicida" é pretendido um polinucleotídeo quecodifica uma proteína compreendendo atividade de AHAS resistente aherbicida. Por "proteína AHASLl resistente a herbicida" é pretendido umaproteína ou polipeptídeo que compreende atividade de AHAS resistente aherbicida.

Ademais, é reconhecido que uma proteína AHASLl tolerantea herbicida ou resistente a herbicida pode ser introduzida em uma plantatransformando uma planta ou ancestral desta com uma seqüência denucleotídeos codificando uma proteína AHASLl tolerante a herbicida ouresistente a herbicida. Tais proteínas AHASLl tolerantes a herbicida ouresistentes a herbicida são codificadas pelos polinucleotídeos AHASLltolerantes a herbicida ou resistentes a herbicida. Alternativamente, umaproteína AHASLl tolerante a herbicida ou resistente a herbicida pode ocorrerem uma planta como um resultado de uma mutação naturalmente ocorrente ouinduzida em um gene de AHASLl endógeno no genoma de uma planta ouprogenitor desta.A presente invenção fornece plantas, tecidos vegetais, célulasvegetais, e células hospedeiras com resistência ou tolerância aumentada parapelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona ousulfoniluréia. A quantidade ou concentração preferida do herbicida é uma"quantidade efetiva" ou "concentração efetiva". Por "quantidade efetiva" e"concentração efetiva" é pretendido uma quantidade e concentração,respectivamente, que é suficiente para matar ou inibir o crescimento de umaplanta, tecido vegetal, célula vegetal, ou célula hospedeira tipo selvagemsimilar, mas esta dita quantidade não mata ou inibe tão severamente ocrescimento das plantas, tecidos vegetais, células vegetais, e célulashospedeiras resistentes a herbicida da presente invenção. Tipicamente, aquantidade efetiva de um herbicida é uma quantidade que é rotineiramenteusada em sistemas de produção agrícola para matar ervas daninhas deinteresse. Uma tal quantidade é conhecido por aqueles de habitual verso naarte.

Por "planta, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeiratipo selvagem similar" é pretendido uma planta, tecido vegetal, célula vegetal,ou célula hospedeira, respectivamente, que carece das características deresistência a herbicida e/ou polinucleotídeo particular da invenção que sãodescritos neste lugar. O uso do termo "tipo selvagem" não é, portanto,pretendido para implicar que uma planta, tecido vegetal, célula vegetal, ououtra célula hospedeira careça de DNA recombinante em seu genoma, e/ounão possua características de resistência a herbicida que são diferentesdaquelas descritas neste lugar.

Como usado neste lugar a menos que claramente indicado deoutra maneira, o termo "planta" pretendeu significar uma planta em qualquerestágio de desenvolvimento, assim como qualquer parte ou partes de umaplanta que pode ser acoplada a ou separada de uma planta intacta inteira. Taispartes de uma planta incluem, mas não são limitadas a, órgãos, tecidos, ecélulas de uma planta. Exemplos de partes vegetais particulares incluem umcaule, uma folha, uma raiz, uma inflorescência, uma flor, uma flor pequena,uma fruta, um pedículo, a pedúnculo, um estame, uma antera, um estigma, umestilo, um ovário, uma pétala, uma sépala, um carpelo, uma ponta de raiz,uma coifa, um pêlo radicular, um pêlo foliar, um pêlo de semente, um grão depólen, a micrósporo, um cotilédone, um hipocótilo, um epicótilo, xilema,floema, parênquima, endosperma, uma célula companheira, uma célulaguarda, e quaisquer outros órgãos, tecidos, e células conhecidos de umaplanta. Além disso, é reconhecido que uma semente é uma planta.

As plantas da presente invenção incluem tanto plantas nãotransgênicas e plantas transgênicas. Por "planta não transgênica" é pretendidosignificar uma planta carecendo de DNA recombinante em seu genoma. Por"planta transgênica" é pretendido significar uma planta compreendendo DNArecombinante em seu genoma. Uma tal planta transgênica pode ser produzidaintroduzindo DNA recombinante no genoma da planta. Quando tal DNArecombinante é incorporado no genoma da planta transgênica, progenia daplanta também pode compreender o DNA recombinante. Uma planta deprogenia que compreende pelo menos uma porção do DNA recombinante depelo menos uma planta transgênica progenitora também é uma plantatransgênica.

A presente invenção fornece a linhagem de arroz resistente aherbicida e plantas desta conhecidas como IMINTA 16. Um depósito de pelomenos 250 sementes de IMINTA 16 foi feito para o depósito de patente deNCIMB Ltd., Ferguson Building, Craibstone Estate Bucksburn, Aberdeen,AB21 9YA, Scotland, UK em 5 de Janeiro de 2005 e concedido Número deAcesso de NCIMB, NCIMB 41262. Devido a uma escassez de sementes dalinhagem IMINTA 16 no momento de depósito, menos do que 2500 sementesda linhagem IMINTA 16 foram submetidas a NCIMB Ltd. antes de depósito.

Requerentes irão fornecer sementes adicionais da linhagem IMINTA 16 paraatingir um total de pelo menos 2500 sementes à medida que as sementes setornem disponíveis. Estes depósitos serão mantidos sob os termos do Tratadode Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito deMicroorganismos para os Propósitos de Procedimento de Patente. O depósitodas sementes de IMINTA 16 foi feito por um termo de pelo menos 30 anos epelo menos 5 anos depois do requerimento mais recente para o fornecimentode uma amostra daquele depósito ser recebido por NCIMB Ltd.

Adicionalmente, Requerentes satisfizeram todos os requerimentos de 37C.F.R. §§ 1.801-1.809, incluindo fornecer uma indicação da viabilidade daamostra.

A presente invenção fornece plantas de arroz resistentes aherbicida da linhagem IMINTA 16 que foram produzidas por uma indução demutação. Plantas de arroz tipo selvagem foram mutagenizadas expondo asplantas a um mutagênico, particularmente um mutagênico químico, maisparticularmente azida de sódio. Entretanto, a presente invenção não é limitadaa plantas de arroz resistentes a herbicida que são produzidas por um métodode mutagênese envolvendo o mutagênico químico azida de sódio. Qualquermétodo de mutagênese conhecido na arte pode ser usado para produzir asplantas de arroz resistentes a herbicida da presente invenção.

Tais métodos de mutagênese podem envolver, por exemplo, ouso de qualquer um ou mais dos seguintes mutagênicos: radiação, tal comoraios-X, raios Gamma (e.g., cobalto 60 ou césio 137), nêutrons, (e.g., produtode fissão nuclear por urânio 235 em um reator atômico), radiação Beta (e.g.,emitida de radioisótopos tal como fósforo 32 ou carbono 14), e radiaçãoultravioleta (preferivelmente de 2500 a 2900 nm), e mutagênicos químicos talcomo análogos de base (e.g., 5-bromo-uracil), compostos relacionados (e.g.,8-etoxi cafeína), antibióticos (e.g., estreptonigrina), agentes alquilantes (e.g.,mostardas de enxofre, mostardas de nitrogênio, epóxidos, etilenoaminas,sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida, hidroxilamina, ácido nitroso,etil metanosulfonato (EMS), ou acridinas. Plantas resistentes a herbicidatambém podem ser produzidas usando métodos de cultura de tecido paraselecionar células vegetais compreendendo mutações de resistência aherbicida e então regenerando plantas resistentes a herbicida a partir destas.

Veja, por exemplo, Patente Norte-Americana Nos. 5.773.702 e 5.859.348,ambas as quais são neste lugar incorporadas em sua totalidade por referência.Detalhes adicionais de indução de mutação podem ser encontrados em"Principais of Cultivar Development" Fehr, 1993 Macmillan PublishingCompany a descrição da qual é incorporada neste lugar por referência.

Análise do gene AHASLl das plantas de arroz de linhagemIMINTA 16 revelou uma mutação pontual. No gene AHASLl de IMINTA16, a mutação pontual resulta na substituição de uma valina pela alanina que éencontrada em posição de aminoácido 179 na seqüência de aminoácidos deAHASLl tipo selvagem No. de Acesso de GenBank AB049822. Assim, apresente invenção descreve que substituir outro aminoácido pela alanina emposição de aminoácido 179 da proteína AELASL1 de arroz pode causar umaplanta de arroz ter resistência aumentada a um herbicida, particularmente umherbicida de imidazolinona e/ou sulfoniluréia. Como descrito em Exemplo 3abaixo, alanina 179 é encontrada em uma região conservada de proteínasAHASL e foram descritas outras substituições de aminoácidos pela alaninaem 179 que são conhecidas por conferirem resistência a herbicida em umaplanta que compreende uma tal proteína AHASL. Por conseguinte, as plantasde arroz resistentes a herbicida da invenção incluem, mas não são limitadasàquelas plantas de arroz que compreendem em seus genomas pelo menos umacópia de um polinucleotídeo AHASLl que codifica uma proteína AHASLlresistente a herbicida que compreende um aspartato ou valina em posição deaminoácido 179 ou posição equivalente.

As plantas de arroz da invenção adicionalmente incluemplantas que compreendem, em relação à proteína AHASLl tipo selvagem, umaspartato ou valina em posição de aminoácido 179 ou posição equivalente euma ou mais substituições de aminoácidos adicionais na proteína AHASLlem relação à proteína AHASLl tipo selvagem, em que uma tal planta de arroztem resistência aumentada para pelo menos um herbicida quando comparadoa uma planta de arroz tipo selvagem. Tais substituições de aminoácidosadicionais incluem, mas não são limitadas a: uma treonina em posição deaminoácido 96 ou posição equivalente; uma alanina, treonina, histidina,leucina, arginina, isoleucina, glutamina, ou serina em posição de aminoácido171 ou posição equivalente; uma leucina em posição de aminoácido 548 ouposição equivalente; e uma asparagina, treonina, ou fenilalanina em posiçãode aminoácido 627 ou posição equivalente.

A presente invenção fornece proteínas AHASLl comsubstituições de aminoácidos em particular posições de aminoácidos dentrode regiões conservadas das proteínas AHASLl de arroz descritas neste lugar.A menos que de outra maneira indicado neste lugar, posições de aminoácidosparticulares se referem à posição daquele aminoácido nas seqüências deaminoácidos de AHASLl de arroz de comprimento completo estabelecidas naSEQ ID NO:2. Além disso, aqueles de habitual verso na arte irão reconhecerque tais posições de aminoácidos podem variar dependendo se osaminoácidos são adicionados ou removidos de, por exemplo, a extremidadeN-terminal de uma seqüência de aminoácidos. Assim, a invenção abrange assubstituições amino na posição referida ou posição equivalente (e.g., "posiçãode aminoácido 17 9 ou posição equivalente"). Por "posição equivalente" épretendido significar uma posição que está dentro da mesma regiãoconservada que a posição de aminoácido exemplificada. Exemplos de taisregiões conservadas são fornecidos em Tabela 2 abaixo.

Em adição, a presente invenção fornece polipeptídeosAHASLl de arroz compreendendo um aspartato ou valina em posição deaminoácido 17 9 ou posição equivalente e uma ou mais substituições deaminoácidos adicionais na proteína AHASL1, em relação à proteína AHASLltipo selvagem, em que polipeptídeo AHASLl compreende atividade deAHAS tolerante a herbicida, quando comparado à atividade de AHAS de umAHASLl tipo selvagem. Estas substituições de aminoácidos incluem, masnão são limitadas, àquelas que são conhecidas por conferir resistência em umaplanta para pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida deimidazolinona e/ou um herbicida de sulfoniluréia. Tais substituições deaminoácidos adicionais incluem, mas não são limitadas a: uma treonina emposição de aminoácido 9 6 ou posição equivalente; uma alanina, treonina,histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina, ou serina em posição deaminoácido 171 ou posição equivalente; uma leucina em posição deaminoácido 548 ou posição equivalente; e uma asparagina, treonina, oufenilalanina em posição de aminoácido 627 ou posição equivalente. Ainvenção fornece adicionalmente polinucleotídeos isolados codificando taispolipeptídeos AHASL1, assim como cassetes de expressão, vetores detransformação, células hospedeiras transformadas, plantas transformadas, emétodos compreendendo tais polinucleotídeos.

A presente invenção fornece métodos para estimular atolerância ou resistência de uma planta, tecido vegetal, célula vegetal, ououtra célula hospedeira para pelo menos um herbicida que interfere naatividade da enzima AHAS. Preferivelmente, um tal herbicida inibindoAHAS é um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia, umherbicida de triazolopirimidina, um herbicida de pirimidiniloxibenzoato, umherbicida de sulfonilaminocarboniltriazolino, ou mistura destes. Maispreferivelmente, um tal herbicida é um herbicida de imidazolinona, umherbicida de sulfoniluréia, ou mistura destes. Para a presente invenção, osherbicidas de imidazolinona incluem, mas não são limitados a, PURSUIT®(imazetapir), CADRE® (imazapic), RAPTOR® (imazamox), SCEPTER®(imazaquin), ASSERT® (imazetabenz), ARSENAL® (imazapir), umderivado de qualquer dos herbicidas acima mencionados, e uma mistura dedois ou mais dos herbicidas acima mencionados, por exemplo,imazapir/imazamox (OD YS SE YS).

Mais especificamente, o herbicida de imidazolinona pode serselecionado a partir de, mas não é limitado a, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidiazolin-2-i 1 )-nicotínico, ácido [2-(4-isopropil)-4-[metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3-quinolinacarboxílico], ácido [5etil-2-(4-isopropil-] 4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-i 1 )-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)- nicotínico, ácido [2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-] imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico, e uma mistura de metil [6-(4-isopropil-4]-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato e metil [2-(4-isopropil-4-metil-5-] oxo-2-imidazolin-2-il)-p-toluato. O uso de ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo- 2-imidazolin-2-il)-nicotínico e ácido [2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-] il)-5-(metoximetil)- nicotínico é preferido. Ouso de ácido [2-(4-isopropil-4]-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico é particularmente preferido.

Para a presente invenção, os herbicidas de sulfoniluréiaincluem, mas não são limitados a, clorsulfuron, metsulfuron metil,sulfometuron metil, clorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil,bensulfuron metil, nicosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron,triflusulfuron metil, triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron,amidosulfuron, fluzasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etil,halosulfuron, azimsulfuron, ciclosulfuron, etoxisulfuron, flazasulfuron,flupirsulfuron metil, foramsulfuron, iodosulfuron, oxasulfuron, mesosulfuron,prosulfuron, sulfosulfuron, trifloxisulfuron, trítosulfuron, um derivado dequalquer dos herbicidas acima mencionados, e uma mistura dois ou mais dosherbicidas acima mencionados. Os herbicidas de triazolopirimidina dainvenção incluem, mas não são limitados a, cloransulam, diclosulam,florasulam, flumetsulam, metosulam, e penoxsulam. Os herbicidas depirimidiniloxibenzoato da invenção incluem, mas não são limitados a,bispiribac, piritiobac, piriminobac, piribenzoxim e piriftalid. Os herbicidas desulfonilamino-carboniltriazolinona incluem, mas não são limitados a,flucarbazona e propoxicarbazona.

E reconhecido que herbicidas de pirimidiniloxibenzoato sãointimamente relacionados aos herbicidas de pirimidiniltiobenzoato e sãogeneralizados sob o título do último nome pela Weed Science Society ofAmerica. Por conseguinte, os herbicidas da presente invenção incluemadicionalmente herbicidas de pirimidiniltiobenzoato, incluindo, mas nãolimitados a, os herbicidas de pirimidiniloxibenzoato descritos acima.

A presente invenção fornece métodos para estimular atividadede AHAS em uma planta compreendendo transformar uma planta com umconstruto de polinucleotídeo compreendendo um promotor operavelmenteligado a uma seqüência de nucleotídeos de AHASLl da invenção. Osmétodos envolvem introduzir um construto de polinucleotídeo da invençãoem pelo menos uma célula vegetal e regenerar uma planta transformada apartir desta. Os métodos envolvem o uso de um promotor que é capaz deacionar expressão de gene em uma célula vegetal. Preferivelmente, um talpromotor é um promotor constitutivo ou um promotor tecido-específico. Osmétodos encontram uso em estimular ou aumentar a resistência de uma plantapara pelo menos um herbicida que interfere na atividade catalítica da enzimaAHAS, particularmente um herbicida de imidazolinona ou sulfoniluréia.

A presente invenção fornece cassetes de expressão paraexpressar os polinucleotídeos da invenção em plantas, tecidos vegetais,células vegetais, e outras células hospedeiras. Os cassetes de expressãocompreendem um promotor expressável na planta, tecido vegetal, célulavegetal, ou outras células hospedeiras de interesse operavelmente ligado a umpolinucleotídeo da invenção que compreende uma seqüência de nucleotídeoscodificando ou uma proteína AHASLl de comprimento completo (i.e.incluindo o peptídeo de trânsito de cloroplasto) ou madura (i.e. sem opeptídeo de trânsito de cloroplasto). Se expressão é desejada nos plastídeos oucloroplastos de plantas ou células vegetais, o cassete de expressão tambémpode compreender uma seqüência tendo como alvo cloroplasto operavelmenteligada que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto.

Os cassetes de expressão da invenção encontram uso em ummétodo para reforçara tolerância a herbicida de uma planta ou uma célulahospedeira. O método envolve transformar a planta ou célula hospedeira comum cassete de expressão da invenção, em que o cassete de expressãocompreende um promotor que é expressável na planta ou célula hospedeira deinteresse e o promotor é operavelmente ligado a um polinucleotídeo dainvenção que compreende uma seqüência de nucleotídeos codificando umaproteína AHASLl resistente a imidazolinona da invenção.

O uso do termo "construtos de polinucleotídeos" neste lugarnão é pretendido para limitar a presente invenção a construtos depolinucleotídeos compreendendo DNA. Aqueles de habitual verso na arte irãoreconhecer que construtos de polinucleotídeos, particularmentepolinucleotídeos e oligonucleotídeos, compreendidos de ribonucleotídeos ecombinações de ribonucleotídeos e desoxiribonucleotídeos também podemser empregadas nos métodos descritos neste lugar. Assim, os construtos depolinucleotídeos da presente invenção abrangem todos os construtos depolinucleotídeos que podem ser empregados nos métodos da presenteinvenção para transformar plantas incluindo, mas não limitados a, aquelescompreendidos de desoxiribonucleotídeos, ribonucleotídeos, e combinaçõesdestes. Tais desoxiribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem tantomoléculas naturalmente ocorrentes como análogos sintéticos. Os construtosde polinucleotídeos da invenção também abrangem todas as formas deconstrutos de polinucleotídeos incluindo, mas não limitadas a, formas de fitasimples, formas de dupla fita, formas de grampo de cabelo, estruturas dehastes e alças, e os semelhantes. Além disso, é entendido por aqueles dehabitual verso na arte que cada seqüência de nucleotídeos descrita neste lugartambém abrange o complemento daquela seqüência de nucleotídeosexemplificada.

Além disso, é reconhecido que os métodos da invenção podemempregar um construto de polinucleotídeo que é capaz de direcionar, em umaplanta transformada, a expressão de pelo menos uma proteína, ou pelo menosum RNA, tal como, por exemplo, um RNA antisentido que é complementar apelo menos uma porção de um mRNA. Tipicamente um tal construto depolinucleotídeo é compreendido de uma seqüência de codificação para umaproteína ou RNA operavelmente ligado a regiões reguladoras transcricionais5' e 3'. Alternativamente, também é reconhecido que os métodos da invençãopodem empregar um construto de polinucleotídeo que não é capaz dedirecionar, em uma planta transformada, a expressão de uma proteína ou RNA.

Ademais, é reconhecido que, para expressão de umpolinucleotídeo da invenção em uma célula hospedeira de interesse, opolinucleotídeo é tipicamente operavelmente ligado a um promotor que écapaz de acionar expressão de gene na célula hospedeira de interesse. Osmétodos da invenção para expressar os polinucleotídeos em célulashospedeiras não dependem de promotor particular. Os métodos abrangem ouso de qualquer promotor que é conhecido na arte e que é capaz de acionarexpressão de gene na célula hospedeira de interesse.

A presente invenção abrange moléculas de polinucleotídeoAHASLl e fragmentos e variantes destas. Moléculas de polinucleotídeo quesão fragmentos destas seqüências de nucleotídeos também são abrangidaspela presente invenção. Por "fragmento" é pretendido uma porção daseqüência de nucleotídeos codificando uma proteína AHASLl da invenção.

Um fragmento de uma seqüência de nucleotídeos de AHASLl da invençãopode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína AHASL1,ou ele pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda dehibridização ou iniciador de PCR usando métodos descritos abaixo. Umaporção biologicamente ativa de uma proteína AHASLl pode ser preparadaisolando uma porção de uma das seqüências de nucleotídeos de AHASLl dainvenção, expressando a porção codificada da proteína AHASLl (e.g., porexpressão recombinante in vitro), e verificando a atividade da porçãocodificada da proteína AHASL1. Moléculas de polinucleotídeo que sãofragmentos de uma seqüência de nucleotídeos de AHASLl compreendempelo menos cerca de 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550,600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250,1300, 1350, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, ou 1950 nucleotídeos, ouaté o número de nucleotídeos presentes em uma seqüência de nucleotídeos decomprimento completo descrita neste lugar (por exemplo, 1961 e 1932nucleotídeos para SEQ ID NOS: 1 e 3, respectivamente) dependendo do usopretendido.

Um fragmento de uma seqüência de nucleotídeos de AHASLlque codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína AHASLl dainvenção irá codificar pelo menos cerca de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150,175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, ou 625 aminoácidoscontíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em uma proteínaAHASLl de comprimento completo da invenção (por exemplo, 644aminoácidos para SEQ ID NO:2). Fragmentos de uma seqüência denucleotídeos de AHASLl que são úteis como sondas de hibridização parainiciadores de PCR geralmente não necessitam codificar uma porçãobiologicamente ativa de uma proteína AHASLl.

Moléculas de polinucleotídeo que são variantes das seqüênciasde nucleotídeos descritas neste lugar também são abrangidas pela presenteinvenção. "Variantes" das seqüências de nucleotídeos de AHASLl dainvenção incluem aquelas seqüências que codificam as proteínas AHASLldescritas neste lugar mas que diferem conservativamente por causa dadegenerescência do código genético. Estas variantes alélicas naturalmenteocorrentes podem ser identificadas com o uso de técnicas de biologiamolecular bem conhecidas, tal como reação em cadeia da polimerase (PCR) etécnicas de hibridização como esboçado abaixo. Seqüências de nucleotídeosvariantes também incluem seqüências de nucleotídeos derivadassinteticamente que foram geradas, por exemplo, usando mutagênese sítioacionada mas que ainda codificam a proteína AHASLl descrita na presenteinvenção como discutido abaixo. Geralmente, variantes de seqüência denucleotídeos da invenção terão pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com uma seqüência denucleotídeos particular descrita neste lugar. Uma seqüência de nucleotídeosde AHASLl variante irá codificar uma proteína AHASL1, respectivamente,que tem uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com aseqüência de aminoácidos de uma proteína AHASLl descrita neste lugar.

Em adição, o artesão versado irá adicionalmente perceber quemudanças podem ser introduzidas por mutação nas seqüências denucleotídeos da invenção levando com isso a mudanças na seqüência deaminoácidos das proteínas AHASLl codificadas sem alterar a atividadebiológica da proteína AHASL ls. Assim, uma molécula isolada depolinucleotídeo codificando uma proteína AHASLl tendo uma seqüência quedifere daquela de SEQ ID NOS: 1 ou 3, respectivamente, pode ser criadaintroduzindo uma ou mais substituições, adições, ou deleções de nucleotídeona seqüência de nucleotídeos correspondente descrita neste lugar, de formaque uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos sãointroduzidas na proteína codificada. Mutações podem ser introduzidas portécnicas padrão, tal como mutagênese sítio acionada e mutagênese mediadapor PCR. Tais seqüências de nucleotídeos variantes também são abrangidaspela presente invenção.

Por exemplo, preferivelmente, substituições de aminoácidosconservativas podem ser feitas em um ou mais previstos, preferivelmenteresíduos de aminoácidos não essenciais. Um resíduo de aminoácido "nãoessencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir da seqüência tiposelvagem de uma proteína AHASLl (e.g., a seqüência de SEQ LD NO:2) semalterar a atividade biológica, ao passo que um resíduo de aminoácido"essencial" é requerido para atividade biológica. Uma "substituição deaminoácido conservativa" é uma na qual o resíduo de aminoácido ésubstituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar.Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foramdefinidas na arte. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias lateraisbásicas (e.g., lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (e.g., ácidoaspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (e.g.,glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeiaslaterais não polares (e.g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina,fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (e.g.,treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (e.g., tirosina,fenilalanina, triptofano, histidina). Tais substituições não seriam feitas pararesíduos de aminoácidos conservados, ou para resíduos de aminoácidosresidindo dentro de um motivo conservado.

As proteínas da invenção podem ser alteradas de váriasmaneiras incluindo substituições, deleções, truncamentos, e inserções deaminoácidos. Métodos para tais manipulações geralmente são conhecidos naarte. Por exemplo, variantes de seqüência de aminoácidos das proteínasAHASLl podem ser preparadas por mutações no DNA. Métodos paramutagênese e alterações de seqüência de nucleotídeos são bem conhecidos naarte. Veja, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; Patente Norte-Americana No. 4.873.192; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques inMolecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nova Iorque) e asreferências citadas nestes. Orientação como para substituições de aminoácidosapropriadas que não afetam atividade biológica da proteína de interesse podeser encontrada no modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequenceand Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), neste lugarincorporado por referência. Substituições conservativas, tal como trocar umaminoácido por outro tendo propriedades similares, pode ser preferível.

Alternativamente, seqüências de nucleotídeos de AHASLlvariantes podem ser feitas introduzindo mutações aleatoriamente ao longo detoda ou parte de uma seqüência de codificação de AHASL1, tal como pormutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser monitoradospara atividade de AHAS para identificar mutantes que retêm atividade deAHAS, incluindo atividade de AHAS resistente a herbicida. Seguindomutagênese, a proteína codificada pode ser expressa recombinantemente, e aatividade da proteína pode ser determinada usando técnicas de ensaio padrão.

Assim, as seqüências de nucleotídeos da invenção incluem asseqüências descritas neste lugar assim como fragmentos e variantes destas. Asseqüências de nucleotídeos de AHASLl da invenção, e fragmentos evariantes destas, podem ser usadas como sondas e/ou iniciadores paraidentificar e/ou clonar homólogos de AHASL em outras plantas. Tais sondaspodem ser usadas para detectar transcritos ou seqüências genômicascodificando as mesmas proteínas ou idênticas.

Desta maneira, métodos tal como PCR, hibridização, e ossemelhantes podem ser usados para identificar tais seqüências tendoidentidade substancial com as seqüências da invenção. Veja, por exemplo,Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Laboratory Manual (2d ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) e Innis, et al. (1990) PCRProtocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).Seqüências de nucleotídeos de AHASL isoladas baseado na sua identidade deseqüência com as seqüências de nucleotídeos de AHASLl estabelecidas nestelugar ou com fragmentos e variantes destas são abrangidas pela presenteinvenção.

Em um método de hibridização, toda ou parte de umaseqüência de nucleotídeos de AHASLl conhecida pode ser usada paramonitorar cDNA ou bibliotecas genômicas. Métodos para construção de talcDNA e bibliotecas genômicas são geralmente conhecido na arte e sãodescritos em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A LaboratoryManual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY). Asassim chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNAgenômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA, ou outrosoligonucleotídeos, e podem ser marcadas com um grupo detectável tal comoP, ou qualquer outro marcador detectável, tal como outros radioisótopos, umcomposto fluorescente, uma enzima, ou um co-fator de enzima. Sondas parahibridização podem ser feitas marcando oligonucleotídeos sintéticos baseadona seqüência de nucleotídeos de AHASLl conhecida descrita neste lugar.

Iniciadores degenerados projetados com base em nucleotídeos conservados ouresíduos de aminoácidos em uma seqüência de nucleotídeos de AHASLlconhecida ou seqüência de aminoácidos codificada podem adicionalmente serusadas. A sonda tipicamente compreende uma região de seqüência denucleotídeos que hibridiza em condições estringentes com pelo menos cercade 12, preferivelmente cerca de 25, mais preferivelmente cerca de 50, 75, 100,125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200,1400, 1600, ou 1800 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência denucleotídeos de AHASLl da invenção ou um fragmento ou variante desta.

Preparação de sondas para hibridização é geralmente conhecida na arte e édescrita em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque), nestelugar incorporado por referência.

Por exemplo, a seqüência inteira de AHASLl descrita nestelugar, ou uma ou mais porções desta, pode ser usada como uma sonda capazde especificamente hibridizar com seqüências de AHASLl correspondentes eRNAs mensageiros. Técnicas de hibridização incluem triagem porhibridização de bibliotecas de DNA emplacadas (ou placas ou colônias; veja,por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A LaboratoryManual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NovaIorque)).

Hibridização de tais seqüências pode ser realizada emcondições estringentes. Por "condições estringentes" ou "condições dehibridização estringentes" é pretendido condições nas quais uma sonda iráhibridizar com sua seqüência alvo para um grau detectavelmente maior doque para outras seqüências (e.g., pelo menos 2-vezes sobre base). Condiçõesestringentes são dependentes de seqüência e serão diferentes emcircunstâncias diferentes.

Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nas quais aconcentração de sal émenos do que cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamenteconcentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de íon Na (ou outros sais) em pH 7,0 a8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (e.g., IOa50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (e.g., maiordo que 50 nucleotídeos). Condições estringentes também podem ser atingidascom a adição de agentes desestabilizantes tal como formamida. Condições debaixa estringência exemplares incluem hibridização com uma solução tampãode 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS (dodecil sulfato desódio) a 37°C, e uma lavagem em IX a 2X SSC (20X SSC = 3,0 M deNaCl/0,3 M de citrato trissódico) a 50 a 55°C. Condições de moderadaestringência exemplares incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, 1,0M de NaC 1, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,5X a IX SSC a 55 a60°C. Condições de alta estringência exemplares incluem hibridização em50% de formamida, 1 M de NaC 1, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem emO5IX SSC a 60 a 65°C. Opcionalmente, tampões de lavagem podemcompreender cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS. A duração de hibridizaçãoé geralmente menos do que cerca de 24 horas, normalmente cerca de 4 a cercade 12 horas.

Especificidade é tipicamente a função de lavagens pós-hibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e temperatura da soluçãode lavagem final. Para híbridos de DNA-DNA, a T., pode ser aproximada apartir da equação de Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284:Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) -0,61 (% de forma)-500/L; ondeM é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem denucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % de forma é a porcentagem deformamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido empares de bases. A T., é a temperatura (em força iônica e pH definidos) na qual50% de uma seqüência alvo complementar hibridiza com uma sondaperfeitamente compatível. T., é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% dedesigualdade; assim, Tm, condições de hibridização, e/ou lavagem podem serajustadas para hibridizar com seqüências da identidade desejada. Porexemplo, se seqüências com >90% de identidade são procuradas, a Tm podeser diminuída IO0C. Geralmente, condições estringentes são selecionadas paraser cerca de 5 0C menor do que o ponto térmico de fusão (Tm) para a seqüênciaespecífica e seu complemento em uma força iônica e pH definidos.

Entretanto, condições severamente estringentes podem utilizar umahibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4°C menor do que o ponto de fusãotérmica (Tm); condições moderadamente estringentes podem utilizar umahibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9, ou 10°C menor do que o ponto defusão térmica (T.); condições de baixa estringência podem utilizar umahibridização e/ou lavagem ali, 12, 13, 14, 15, ou 20°C menor do que o pontode fusão térmica (T.). Usando a equação, composições de hibridização elavagem, e Tm desejada, aqueles de habitual verso irão entender que variaçõesna estringência de soluções de hibridização e/ou lavagem são inerentementedescritas. Se o grau desejado de desigualdade resulta em uma T. de menos doque 450C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), é preferidoaumentar a concentração de SSC para que uma temperatura maior possa serusada. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos éencontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology—Hybridization with Nueleie Aeid Probes, Part I, Chapter2 (Elsevier, Nova Iorque); e Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols inMolecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience,Nova Iorque). Veja Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A LaboratoryManual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NovaIorque).

E reconhecido que as moléculas de polinucleotídeo e proteínasda invenção abrangem moléculas de polinucleotídeo e proteínascompreendendo uma seqüência de nucleotídeos ou de aminoácidos que ésuficientemente idêntica à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 1, 3, 4,e/ou 6, ou à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2 e/ou 5. O termo"suficientemente idêntica" é usado neste lugar para se referir a uma primeiraseqüência de aminoácidos ou de nucleotídeos que contém um númerosuficiente ou mínimo de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos idênticosou equivalentes (e.g., com uma cadeia lateral similar) a uma segundaseqüência de aminoácidos ou de nucleotídeos de forma que a primeira esegunda seqüências de aminoácidos ou de nucleotídeos têm um domínioestrutural comum e/ou atividade funcional comum. Por exemplo, seqüênciasde aminoácidos ou de nucleotídeos que contêm um domínio estrutural comumtendo pelo menos cerca de 45%, 55%, ou 65% de identidade, preferivelmente75% de identidade, mais preferivelmente 85%, 95%, ou 98% de identidadesão definidas neste lugar como suficientemente idênticas.

Para determinar a identidade percentual de duas seqüências deaminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as seqüências são alinhadas parapropósitos de comparação ótima. A identidade percentual entre as duasseqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadopelas seqüências (i.e., identidade percentual = número de posiçõesidênticas/número total de posições (e.g., posições sobrepostas) χ 100). Emuma forma de realização, as duas seqüências são do mesmo comprimento. Aidentidade percentual entre duas seqüências pode ser determinada usandotécnicas similares àquelas descritas abaixo, com ou sem permitir lacunas. Aocalcular identidade percentual, compatibilidade tipicamente exatas sãocontadas.

A determinação de identidade percentual entre duas seqüênciaspode ser realizada usando um algoritmo matemático. Um exemplo nãolimitante preferido de um algoritmo matemático utilizado para a comparaçãode duas seqüências é o algoritmo de Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 87:2264, modificado como em Karlin and Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877. Um tal algoritmo é incorporadonos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et ai (1990) J. Mol. Biol.215:403. Buscas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com oprograma NBLAST, escore = 100, extensão de palavra = 12, para obterseqüências de nucleotídeos homólogas às moléculas de polinucleotídeo dainvenção. Buscas de proteínas BLAST podem ser realizadas com o programaXBLAST, escore = 50, extensão de palavra = 3, para obter seqüências deaminoácidos homólogas às moléculas de proteínas da invenção. Para obteralinhamentos com lacunas para propósitos de comparação, Gapped BLASTpode ser utilizado como descrito em Altschul et al (1997) Nueleie Aeids Res.25:3389. Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para realizar uma buscarepetida que detecta relações distantes entre moléculas. Veja Altschul et al.(1997) supra. Quando utilizando programas BLAST, Gapped BLAST, e PSI-Blast, os parâmetros padrão dos programas respectivos (e.g., XBLAST eNBLAST) podem ser usados. Veja http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Outroexemplo não limitante preferido de um algoritmo matemático utilizado para acomparação de seqüências é o algoritmo de Myers and Miller (1988) CABIOS4:11-17. m tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), queé parte do pacote de aplicativo computacional de alinhamento de seqüênciaGCG. Quando utilizando o programa ALIGN para comparar seqüências deaminoácidos, uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade decomprimento de lacuna de 12, e uma penalidade de lacuna de 4 podem serusadas. Alinhamento também pode ser realizado manualmente por inspeção.

A menos que de outra forma determinado, valores deidentidade/similaridade de seqüência fornecidos neste lugar se referem aovalor obtido usando as seqüências de comprimento completo da invenção eusando alinhamento múltiplo por meio do algoritmo Clustal W (Nucleic AcidResearch, 22(22):4673-4680, 1994) usando o programa AlignX incluído nopacote de aplicativo computacional Vector NTI Suite Versão 7 (InforMax,Inc., Bethesda, MD, USA) usando os parâmetros padrão; ou qualquerprograma equivalente deste. Por "programa equivalente" é pretendidoqualquer programa de comparação de seqüências que, para quaisquer duasseqüências em questão, fornece um alinhamento tendo compatibilidadesidênticas de nucleotídeo ou resíduo de aminoácido e uma identidade deseqüência percentual idêntica quando comparado ao alinhamentocorrespondente gerado por AlignX no pacote de aplicativo computacionalVector NTI Suite Versão 7.

As seqüências de nucleotídeos de AHASLl da invençãoincluem tanto as seqüências naturalmente ocorrentes assim como formasmutantes, particularmente formas mutantes que codificam proteínas AHASLlcompreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida. Da mesmamaneira, as proteínas da invenção abrangem tanto proteínas naturalmenteocorrentes assim como variações e formas modificadas destas. Tais variantescontinuarão a possuir a atividade de AHAS desejada. Obviamente, asmutações que serão feitas no DNA codificando a variante não devem colocara seqüência fora de quadro de leitura e preferivelmente não criarão regiõescomplementares que poderiam produzir estrutura secundária de mRNA. Veja,Publicação de Pedido de Patente Européia No. 75.444.

As deleções, inserções, e substituições das seqüências deproteínas abrangidas neste lugar não são esperadas produzirem mudançasradicais nas características da proteína. Entretanto, quando é difícil prever oefeito exato da substituição, deleção, ou inserção antecipadamente a fazê-lo,alguém versado na arte irá perceber que o efeito será avaliado por ensaios detriagem de rotina. Isto é, a atividade pode ser avaliada por ensaios deatividade de AHAS. Veja, por exemplo, Singh et al. (1988) Anal. Biocheni.171:173-179, neste lugar incorporado por referência.

Seqüências de nucleotídeos e proteínas variantes tambémabrangem seqüências e proteínas derivadas de um procedimento mutagênico erecombinogênico tal como embaralhamento de DNA. Com um talprocedimento, uma ou mais diferentes seqüências de codificação de AHASLpodem ser manipuladas para criar uma nova proteína AHASL possuindo aspropriedades desejadas.

Desta maneira, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantessão geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de seqüênciarelacionada compreendendo regiões de seqüência que têm identidade deseqüência substancial e podem ser homologamente recombinadas in vitro ouin vivo. Por exemplo, usando esta abordagem, motivos de seqüênciascodificando um domínio de interesse podem ser recombinados entre o geneAHASLl da invenção e outros genes AHASL conhecidos para obter um novogene codificando para uma proteína com uma propriedade melhorada deinteresse, tal como um Km aumentado no caso de uma enzima. Estratégiaspara tal embaralhamento de DNA são conhecidas na arte. Veja, por exemplo,Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747-10751; Stemmer(1994) Nature 370:389-391; Crameri et ai. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; e Patente Norte-Americana Nos. 5.605.793 e 5.837.458.

As seqüências de nucleotídeos da invenção podem ser usadaspara isolar seqüências correspondentes de outros organismos, particularmenteoutras plantas, mais particularmente outras dicotiledôneas. Desta maneira,métodos tal como PCR5 hibridização, e os semelhantes podem ser usados paraidentificar tais seqüências com base na sua homologia de seqüência com asseqüências expostas neste lugar. Seqüências isoladas baseado na suaidentidade de seqüência com as seqüências inteiras de AHASLl expostasneste lugar ou com fragmentos destas são abrangidas pela presente invenção.

Assim, seqüências isoladas que codificam para uma proteína AHASL e quehibridizam em condições estringentes com a seqüência descrita neste lugar,ou com fragmentos desta, são abrangidas pela presente invenção.

Em uma abordagem de PCR, iniciadores de oligonucleotídeospodem ser projetados para uso em reações de PCR para amplificar seqüênciasde DNA correspondentes de cDNA ou DNA genômico extraído de qualquerplanta de interesse. Métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem porPCR são geralmente conhecidos na arte e são descritos em Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque). Veja também Innis et al,eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (AcademicPress, Nova Iorque); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies(Academic Press, Nova Iorque); e Innis and Gelfand, eds. (1999) PCRMethods Manual (Academic Press, Nova Iorque). Métodos conhecidos dePCR incluem, mas não são limitados a, métodos usando iniciadores pareados,pares de iniciadores, iniciadores específicos únicos, iniciadores degenerados,iniciadores gene-específicos, iniciadores vetor-específicos, iniciadoresparcialmente incompatíveis, e os semelhantes.

As seqüências de polinucleotídeos de AHASLl da invençãosão fornecidos em cassetes de expressão para expressão na planta de interesse.O cassete irá incluir seqüências reguladoras 5' e 3' operavelmente ligadas auma seqüência de polinucleotídeos de AHASLl da invenção. Por"operavelmente ligada" é pretendida uma ligação funcional entre umpromotor e uma segunda seqüência, em que a seqüência de promotor inicia emedia transcrição da seqüência de DNA correspondente à segunda seqüência.

Geralmente, operavelmente ligadas significa que as seqüências de ácidosnucleicos sendo ligadas são contíguas e, onde necessário para unir duasregiões de codificação de proteína, contíguas e no mesmo quadro de leitura. Ocassete pode adicionalmente conter pelo menos um gene adicional para serco-transformado no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(is)pode ser fornecido em múltiplos cassetes de expressão.

Um tal cassete de expressão é fornecido com uma pluralidadede sítios de restrição para inserção da seqüência de polinucleotídeos deAHASLl estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. Ocassete de expressão pode adicionalmente conter genes marcadoresselecionáveis.

O cassete de expressão irá incluir na direção 5'-3' detranscrição, uma região de iniciação transcricional e traducional (i.e., umpromotor), uma seqüência de polinucleotídeos de AHASLl da invenção, euma região de terminação transcricional e traducional (i.e., região determinação) funcional em plantas. O promotor pode ser nativo ou análogo, ouexógeno ou heterólogo, para o hospedeiro vegetal e/ou para a seqüência depolinucleotídeos de AHASLl da invenção. Adicionalmente, o promotor podeser a seqüência natural ou alternativamente uma seqüência sintética. Onde opromotor é "exógeno" ou "heterólogo" para o hospedeiro vegetal, épretendido que o promotor não seja encontrado na planta nativa na qual opromotor é introduzido. Onde o promotor é "exógeno" ou "heterólogo" para aseqüência de polinucleotídeos de AHASLl da invenção, é pretendido que opromotor não seja o promotor nativo ou naturalmente ocorrente para aseqüência de polinucleotídeos de AHASLl operavelmente ligada dainvenção. Como usado neste lugar, um gene quimérico compreende umaseqüência de codificação operavelmente ligada a uma região de iniciação detranscrição que é heteróloga para a seqüência de codificação.

Embora possa ser preferível expressar os polinucleotídeosAHASLl da invenção usando promotores heterólogos, as seqüências depromotor nativo podem ser usadas. Tais construtos mudariam níveis deexpressão da proteína AHASLl na planta ou célula vegetal. Assim, o fenótipoda planta ou célula vegetal é alterado.

A região de terminação pode ser nativa com a região deiniciação transcricional, pode ser nativa com a seqüência AHASLloperavelmente ligada de interesse, pode ser nativa com o hospedeiro vegetal,ou pode ser derivada de outra fonte (i.e., exógena ou heteróloga para opromotor, a seqüência de polinucleotídeos de AHASLl de interesse, ohospedeiro vegetal, ou qualquer combinação destes). Regiões de terminaçãoconvenientes estão disponíveis do plasmídeo-Ti de A. tuinefaciens, tal comoas regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Veja tambémGuerineau et al. (1991) Mol Gen. Genet. 262:141 -144; Proudfoot (1991) Cell64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al.(1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158;Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987)NucleicAcidRes. 15:9627-9639.Onde apropriado, o(s) gene(s) pode(m) ser otimizado(s) paraexpressão aumentada na planta transformada. Isto é, os genes podem sersintetizados usando códons preferidos de plantas para expressão melhorada.Veja, por exemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 parauma discussão de uso de códon preferido de hospedeiro. Métodos estãodisponíveis na arte para sintetizar genes preferidos de plantas. Veja, porexemplo, Patente Norte-Americana Nos. 5.380.831, e 5.436.391, e Murray etal. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, neste lugar incorporados porreferência.

Modificações adicionais de seqüência são conhecidas porestimular expressão de gene em um hospedeiro celular. Estas incluemeliminação de seqüências codificando sinais de poliadenilação artificiais,sinais de sítio de corte de éxon-íntron, repetições tipo transposon, e outras taisseqüências bem caracterizadas que podem ser deletérias para expressão degene. O teor de G-C da seqüência pode ser ajustado para média de para umdado hospedeiro celular, quando calculado por referência a genes conhecidosexpressos na célula hospedeira. Quando possível, a seqüência é modificadapara evitar estruturas secundárias de mRNA de grampo de cabelo previstas.

Seqüências de nucleotídeos para estimular expressão de genetambém podem ser usadas nos vetores de expressão de plantas. Estas incluemos íntrons do Adhl de milho, gene intronl (Callis et al. Genes andDevelopment 1:1183-1200, 1987), e seqüências líder, (seqüência W) do Vírusdo Mosaico de Tabaco (TMV), Vírus da Mancha Clorótica de Milho e Vírusdo Mosaico de Alfafa (Gallie et al. Nueleic AcidRes. 15:8693-8711, 1987 eSkuzeski et al. Plant Mol. Biol. 15:65-79, 1990). O primeiro íntron do locusshrunken-1 de milho, foi mostrado aumentar expressão de genes emconstrutos de gene quimérico. Patente Norte-Americana Nos. 5.424.412 e5.593.874 descreve o uso de íntrons específicos em construtos de expressãode gene, e Gallie et al. (Plant Physiol. 106:929-939, 1994) também mostrouque íntrons são úteis para regular expressão de gene em uma base específicapara tecido. Para estimular adicionalmente ou para otimizar expressão de genede subunidade pequena de AHAS, os vetores de expressão de plantas dainvenção também podem conter seqüências de DNA contendo regiões deinteração com a matriz (MARs). Células vegetais transformadas com taissistemas de expressão modificados, então, podem exibir superexpressão ouexpressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeos da invenção.

Os cassetes de expressão podem adicionalmente conterseqüências líder 5' no construto de cassete de expressão. Tais seqüências líderpodem atuar para estimular tradução. Líderes de tradução são conhecidos naarte e incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, líder de EMCV (regiãonão codificante 5' de Encefalomiocardite) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 86:6126-6130); líderes de potivírus, por exemplo, líderde TEV (Vírus Etch do Tabaco) (Gallie et dl. (1995) Gene 165(2):233-238),líder de MDMV (Vírus do Mosaico do Nanismo de Milho) (Virology 154:9-20), e proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP)(Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido do mRNA deproteína de revestimento de vírus do mosaico de alfafa (AMV RNA 4)(Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); líder de vírus do mosaico detabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech(Liss, Nova Iorque), pp. 237-256); e líder de vírus da mancha clorótica demilho (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Veja também,Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Outros métodosconhecidos por estimularem tradução também podem ser utilizados, porexemplo, íntrons, e os semelhantes.

Ao preparar o cassete de expressão, os vários fragmentos deDNA podem ser manipulados, de forma a sustentar as seqüências de DNA naorientação apropriada e, se apropriado, no quadro de leitura apropriado. Paraeste fim, adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir osfragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas parasustentar sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo,remoção de sítios de restrição, ou os semelhantes. Para este propósito,mutagênese in vitro, reparo de iniciador, restrição, anelamento, re-substituições, e.g., transições e transversões, podem estar envolvidos.

Diversos promotores podem ser usados na prática da invenção.Os promotores podem ser selecionados baseado no resultado desejado. Osácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos,tecido-preferidos, ou outros para expressão em plantas.

Tais promotores constitutivos incluem, por exemplo, opromotor do core do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivosdescritos em WO 99/43838 e Patente Norte-Americana No. 6.072.050; opromotor do core CaMV 35S (Odell et al (1985) Nature 313:810-812); actinade arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina(Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al.(1992) PlantMol Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al (1991) Theor. AppLGenet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730);promotor ALS (Patente Norte-Americana No. 5.659.026), e os semelhantes.Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, Patente Norte-Americana Nos. 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785;5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; e 6.177.611.

Promotores tecido-específicos podem ser utilizados paradirecionar expressão de AHASLl estimulada dentro de um tecido vegetalparticular. Tais promotores tecido-específicos incluem, mas não são limitadosa, promotores preferidos por folha, promotores preferidos por raiz,promotores preferidos por semente, e promotores preferidos por caule.Promotores tecido-específicos incluem Yamamoto et al. (1997) Plant J.12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803;Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997)Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart et al (1996) Plant Physiol112(3): 1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol 112(2):525-535;Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al.(1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results ProbL CellDiffer. 20:181196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6): 1129-1138;Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sei. USA 90(20):9586-9590; eGuevara-Gareia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Tais promotores podemser modificados, se necessário, para expressão fraca.

Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos de interessesão direcionados para o cloroplasto para expressão. Desta maneira, onde oácido nucleico de interesse não é diretamente inserido no cloroplasto, ocassete de expressão irá adicionalmente conter uma seqüência tendo comoalvo cloroplasto compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codificaum peptídeo de trânsito de cloroplasto para direcionar o produto de gene deinteresse para os cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos naarte. Com respeito a seqüências tendo como alvo cloroplastos,"operavelmente ligadas" significa que a seqüência de ácidos nucleicoscodificando um peptídeo de trânsito (i.e., a seqüência tendo como alvocloroplasto) é ligada ao polinucleotídeo AHASLl da invenção de forma queas duas seqüências são contíguas e no mesmo quadro de leitura. Veja, porexemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark etal. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) PlantPhysiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Comnzun.196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Embora asproteínas AHASLl da invenção incluam um peptídeo de trânsito decloroplasto nativo, qualquer peptídeo de trânsito de cloroplasto conhecido naarte pode ser fusionado à seqüência de aminoácidos de uma proteínaAHASLl madura da invenção operavelmente ligando uma seqüência tendocomo alvo cloroplasto à extremidade 5' de uma seqüência de nucleotídeoscodificando uma proteína AHASLl madura da invenção.

Seqüências tendo como alvo cloroplasto são conhecidas naarte e incluem a subunidade pequena de cloroplasto de ribulose-l,5-bisfosfatocarboxilase (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant MoL Biol.30:769-780; Schnell et ai. (1991)1 Biol. Chem. 266(5):3335-3342); 5-(enolpimvil)shikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) (Archer et ai. (1990) J.Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); triptofano sintase (Zhao et al. (1995)1Biol. Chem. 270(11):6081-6087); plastocianina (Lawrence et al. (1997) Biol.Chem. 272(33):20357-20363); corismato sintase (Schmidt et al. (1993) J.Biol. Chem. 268(36):27447-27457); e a proteína de ligação de clorofilacoletora de luz a/b (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999). Veja também Von Heijne et al. (1991) Plant MoL Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al.(1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys.Res. COMMUll. 196:1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

Métodos para transformação de cloroplastos são conhecidos naarte. Veja, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. O método se pauta emliberação por canhão de partículas de DNA contendo um marcadorselecionável e direcionando o DNA para o genoma de plastídeo através derecombinação homóloga. Adicionalmente, transformação de plastídeo podeser realizada por transativação de um transgene silencioso gerado emplastídeo por expressão tecido-preferida de uma RNA polimerase nuclear-codificada e direcionada por plastídeo. Um tal sistema foi relatado emMcBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:7301-7305.

Os ácidos nucleicos de interesse a serem direcionados para ocloroplasto podem ser otimizados para expressão no cloroplasto paraconsiderar diferenças em uso de códon entre o núcleo vegetal e esta organela.Desta maneira, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados usandocódons preferidos de cloroplasto. Veja, por exemplo, Patente Norte-Americana No. 5.380.831, neste lugar incorporada por referência.

Como descrito neste lugar, as seqüências de nucleotídeos deAHASLl da invenção encontram uso em estimular a tolerância a herbicida deplantas que compreendem em seus genomas um gene codificando umaproteína AHASLl tolerante a herbicida. Um tal gene pode ser um geneendógeno ou um transgene. Adicionalmente, em certas formas de realização,as seqüências de ácidos nucleicos da presente invenção podem ser sobrepostascom qualquer combinação de seqüências de polinucleotídeos de interesse afim de criar plantas com um fenótipo desejado. Por exemplo, ospolinucleotídeos da presente invenção podem ser sobrepostos com quaisqueroutros polinucleotídeos codificando polipeptídeos tendo atividade de pesticidae/ou inseticida, tal como, por exemplo, as proteínas de toxina de Bacillusthuringiensis (descritas em Patente Norte-Americana Nos. 5.366.892;5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al. (1986) Gene48:109). As combinações geradas também podem incluir múltiplas cópias dequalquer um dos polinucleotídeos de interesse.

E reconhecido que com estas seqüências de nucleotídeos,construções antisentido, complementares a pelo menos uma porção do RNAmensageiro (mRNA) para as seqüências de polinucleotídeos de AHASLlpodem ser construídas. Nucleotídeos antisentido são construídos parahibridizar com o mRNA correspondente. Modificações das seqüênciasantisentido podem ser feitas contanto que as seqüências hibridizem com einterfiram em expressão do mRNA correspondente. Desta maneira,construções antisentido tendo 70%, preferivelmente 80%, maispreferivelmente 85% de identidade de seqüência com as seqüênciasantisentido correspondentes podem ser usadas. Além disso, porções dosnucleotídeos antisentido podem ser usadas para interromper a expressão dogene alvo. Geralmente, seqüências de pelo menos 50 nucleotídeos, 100nucleotídeos, 200 nucleotídeos, ou mais podem ser usadas.

As seqüências de nucleotídeos da presente invenção tambémpodem ser usadas na orientação sentido para suprimir a expressão de genesendógenos em plantas. Métodos para suprimir expressão de gene em plantasusando seqüências de nucleotídeos na orientação sentido são conhecidos naarte. Os métodos geralmente envolvem transformar plantas com um construtode DNA compreendendo um promotor que aciona expressão em uma plantaoperavelmente ligada à pelo menos uma porção de uma seqüência denucleotídeos que corresponde ao transcrito do gene endógeno. Tipicamente,uma tal seqüência de nucleotídeos tem identidade de seqüência substancialcom a seqüência do transcrito do gene endógeno, preferivelmente maior doque cerca de 65% de identidade de seqüência, mais preferivelmente maior doque cerca de 85% de identidade de seqüência, o mais preferivelmente maiordo que cerca de 95% de identidade de seqüência. Veja, Patente Norte-Americana Nos. 5.283.184 e 5.034.323; neste lugar incorporadas porreferência.

Embora os polinucleotídeos AHASLl resistentes a herbicidada invenção encontrem uso como genes marcadores selecionáveis paratransformação vegetal, os cassetes de expressão da invenção podem incluiroutro gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas.

Genes marcadores selecionáveis, incluindo aqueles da presente invenção, sãoutilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Genesmarcadores incluem, mas não são limitados a, genes codificando resistência aantibiótico, tal como aqueles codificando neomicina fosfotransferase II(NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como genes conferindoresistência a compostos de herbicida, tal como glufosinato de amônio,bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Vejageralmente, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511;Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6314-6318; Yao etal (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol Microbiol. 6:2419-2422;Barkley et al. (1980) in The Operon, pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404;Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:2549-2553; Deuschle et al(1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis5 University ofHeidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:1917-1921;Labow et al. (1990) Mol. Cell Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res.19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595;Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D.Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother.36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology,Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Taisdescrições são neste lugar incorporadas por referência.

A lista acima de genes marcadores selecionáveis não épretendida para ser limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode serusado na presente invenção.

As moléculas isoladas de polinucleotídeo compreendendoseqüência de nucleotídeos que codificam as proteínas AHASLl da invençãopodem ser usadas em vetores para transformar plantas de forma que as plantascriadas têm resistência estimulada para herbicidas, particularmente herbicidasde imidazolinona. As moléculas isoladas de polinucleotídeo AHASLl dainvenção podem ser usadas em vetores apenas ou em combinação com umaseqüência de nucleotídeos codificando a subunidade pequena da enzimaAHAS (AHASS) para conferir resistência a herbicida em plantas. Veja,Patente Norte-Americana No. 6.348.643; que é neste lugar incorporada porreferência.

A invenção também se refere a um vetor de expressão deplanta compreendendo um promotor que aciona expressão em uma plantaoperavelmente ligada a uma molécula isolada de polinucleotídeo da invenção.A molécula isolada de polinucleotídeo compreende uma seqüência denucleotídeos codificando uma proteína AHASL1, particularmente umaproteína AHASLl compreendendo uma seqüência amino que é estabelecidana SEQ ID NO:2, ou um fragmento funcional e variante desta. O vetor deexpressão de planta da invenção não depende de um promotor particular,apenas que um tal promotor seja capaz de acionar expressão de gene em umacélula vegetal. Promotores preferidos incluem promotores constitutivos epromotores tecido-específicos.

Os vetores de transformação da invenção podem ser usadospara produzir plantas transformadas com um gene de interesse. O vetor detransformação irá compreender um gene marcador selecionável da invenção eum gene de interesse a ser introduzido e tipicamente expresso na plantatransformada. Um tal gene marcador selecionável compreende umpolinucleotídeo AHASLl resistente a herbicida da invenção operavelmenteligado a um promotor que aciona expressão em uma célula hospedeira. Parauso em plantas e células vegetais, o vetor de transformação compreende umgene marcador selecionável compreendendo um polinucleotídeo AHASLlresistente a herbicida da invenção operavelmente ligado a um promotor queaciona expressão em uma célula vegetal.

Os genes de interesse da invenção variam dependendo doresultado desejado. Por exemplo, várias mudanças em fenótipo podem ser deinteresse incluindo modificar a composição de ácidos graxos em uma planta,alterar o teor de aminoácidos de uma planta, alterar mecanismos de defesacontra inseto e/ou patógeno de uma planta, e os semelhantes. Estes resultadospodem ser atingidos fornecendo expressão de produtos heterólogos ouexpressão aumentada de produtos endógenos em plantas. Alternativamente, osresultados podem ser atingidos sustentando uma redução de expressão de umou mais produtos endógenos, particularmente enzimas ou cofatores na planta.Estas mudanças resultam em uma mudança em fenótipo da plantatransformada.

Em uma forma de realização da invenção, os genes deinteresse incluem genes de resistência a inseto tal como, por exemplo, genesde proteína de toxina de Bacillus thuringiensis (Patente Norte-AmericanaNos. 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et ai.(1986) Gene 48:109).

As proteínas ou polipeptídeos AHASLl da invenção podemser purificadas a partir de, por exemplo, plantas de arroz e podem ser usadasem composições. Também, uma molécula isolada de polinucleotídeocodificando uma proteína AHASLl da invenção pode ser usada paraexpressar uma proteína AHASLl da invenção em um micróbio tal como E.coli ou uma levedura. A proteína AHASLl expressa pode ser purificada apartir de extratos de E. coli ou levedura por qualquer método conhecido poraqueles de habitual verso na arte.

A invenção também se refere a um método para criar umaplanta transgênica que é resistente a herbicidas, compreendendo transformaruma planta com um vetor de expressão de planta compreendendo umpromotor que aciona expressão em uma planta operavelmente ligada a umamolécula isolada de polinucleotídeo da invenção. A molécula isolada depolinucleotídeo compreende uma seqüência de nucleotídeos codificando umaproteína AHASLl da invenção, particularmente uma proteína AHASLlcompreendendo: uma seqüência amino que é estabelecida na SEQ ID NO:2,uma seqüência de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 1 ou 3, ou umfragmento funcional e variante de ditas seqüências de aminoácidos.

A invenção também se refere às plantas não transgênicas dearroz, plantas transgênicasproduzidas pelos métodos da invenção, e progeniae outros descendentes de tais plantas não transgênicas e transgênicas, cujasplantas exibem resistência estimulada ou aumentada para herbicidas queinterferem na enzima AHAS, particularmente herbicidas de imidazolinona esulfoniluréia.

Os polinucleotídeos AHASLl da invenção, particularmenteaqueles codificando proteínas AHASLl resistentes a herbicida, encontramuso em métodos para estimular a resistência de plantas tolerantes a herbicida.

Em uma forma de realização da invenção, as plantas tolerantes a herbicidacompreendem uma proteína AHASLl tolerante a herbicida ou resistente aherbicida. As plantas tolerantes a herbicida incluem tanto plantastransformadas com uma seqüência de nucleotídeos de AHASLl tolerante aherbicida como plantas que compreendem em seus genomas um geneendógeno que codifica uma proteína AHASLl tolerante a herbicida.

Seqüências de nucleotídeos codificando proteínas AHASLl tolerantes aherbicida e plantas tolerantes a herbicida compreendendo um gene endógenoque codifica uma proteína AHASLl tolerante a herbicida incluem ospolinucleotídeos e plantas da presente invenção e aqueles que são conhecidosna arte. Veja, por exemplo, Patente Norte-Americana Nos. 5.013.659,5.731.180, 5.767.361, 5.545.822, 5.736.629, 5.773.703, 5.773.704, 5.952.553e 6.274.796; todas as quais são neste lugar incorporadas por referência. Taismétodos para estimular a resistência de plantas tolerantes a herbicidacompreendem transformar uma planta tolerante a herbicida com pelo menosuma construção de polinucleotídeo compreendendo um promotor que acionaexpressão em uma célula vegetal que é operavelmente ligado a umpolinucleotídeo AHASLl resistente a herbicida da invenção, particularmenteo polinucleotídeo codificando uma proteína AHASLl resistente a herbicidaestabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 3 polinucleotídeos codificando a seqüênciade aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2, e fragmentos e variantes ditospolinucleotídeos que codificam polipeptídeos compreendendo atividade deAHAS resistente a herbicida.

Numerosos vetores de transformação vegetal e métodos paratransformar plantas estão disponíveis. Veja, por exemplo, An5 G. et al. (1986)Plant Pysiol., 81:301-305; Fry3 J., et al. (1987) Plant Cell Rep. 6:321-325;Block, M. (1988) Theor. Appl Genet.76:767-774; Hinchee, et al. (1990)Stadler. Genet. Symp. 203212.203-212; Cousins, et al. (1991) Aust. J. PlantPhysiol. 18:481-494; Chee, Ρ. P. and Slightom, J. L. (1992) Gene.l 18:255-260; Christou, et al. (1992) Trends. Biotechnol. 10:239-246; D'Halluin, et al.(1992) Bio/Technol. 10:309-314; Dhir, et al. (1992) PlantPhysiol 99:81-88;Casas et al. (1993) Proc. Nat. Acad Sei. USA 90:11212-11216; Christou, P.(1993) In Vitro Cell Dev. Biol.-Plant; 29P:119-124; Davies, et al. (1993)Plant Cell Rep. 12:180-183; Dong, J. A. and Mchughen, A. (1993) Plant Sei.91:139-148; Franklin, C. I. and Trieu, Τ. N. (1993) Plant. Physiol. 102:167;Golovkin, et al. (1993) Plant Sei. 90:41-52; Guo Chin Sei. Buli 38:2072-2078; Asano, et al. (1994) Plant Cell Rep. 13; Ayeres Ν. M. and Park, W. D.(1994) Crit. Rev. Plant. Sei. 13:219-239; Barcelo, et al. (1994) Plant. J.5:583-592; Becker, et al. (1994) Plant. J. 5:299-307; Borkowska et al. (1994)Acta. Physiol Plant. 16:225-230; Christou, P. (1994) Agro. Food. Ind. HiTech. 5: 17-27; Eapen et al. (1994) Plant Cell Rep. 13:582-586; Hartman, etal. (1994) Bio-Technology 12: 919923; Ritala, et al. (1994) Plant. Mol. Biol24:317-325; e Wan, Y. C. and Lemaux, P. G. (1994) PlantPhysiol 104:3748.

Os métodos da invenção envolvem introduzir um construto depolinucleotídeo em uma planta. Por "introduzir" é pretendido apresentar àplanta o construto de polinucleotídeo de uma maneira tal que o construtoganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção nãodependem de um método particular para introduzir um construto depolinucleotídeo para uma planta, apenas que o construto de polinucleotídeoganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Métodos paraintroduzir construtos de polinucleotídeos em plantas são conhecidos na arteincluindo, mas não limitados a, métodos de transformação estável, métodosde transformação transitória, e métodos mediados por vírus.

Por "transformação estável" é pretendido que o construto depolinucleotídeo introduzido em uma planta se integre no genoma da planta eseja capaz de ser herdado por progenia desta. Por "transformação transitória"é pretendido que um construto de polinucleotídeo introduzido em uma plantanão se integre no genoma da planta.

Para a transformação de plantas e células vegetais, asseqüências de nucleotídeos da invenção são inseridas usando técnicas padrãoem qualquer vetor conhecido na arte que é adequado para expressão dasseqüências de nucleotídeos em uma planta ou célula vegetal. A seleção dovetor depende da técnica de transformação preferida e da espécie de plantaalvo a ser transformada. Em uma forma de realização da invenção, umaseqüência de nucleotídeos de AHASLl é operavelmente ligada a umpromotor vegetal que é conhecido por expressão de alto nível em uma célulavegetal, e este construto é então introduzido em uma planta que é susceptívela um herbicida de imidazolinona e uma planta transformada é regenerada. Aplanta transformada é tolerante a exposição a um nível de um herbicida deimidazolinona que iria matar ou significantemente prejudicar uma planta nãotransformada. Este método pode ser aplicado a qualquer espécie de planta;entretanto, ele é mais benéfico quando aplicado a plantas cultivadas,particularmente plantas cultivadas que tipicamente são crescidas na presençade pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida de imidazolinona.

Metodologias para construir cassetes de expressão de plantas eintroduzir ácidos nucleicos exógenos em plantas são geralmente conhecidasna arte e foram previamente descritas. Por exemplo, DNA exógeno pode serintroduzido em plantas, usando plasmídeos vetores indutores de tumor (Ti).

Outros métodos utilizados para liberação de DNA exógeno envolvem o usode transformação de protoplasto mediada por PEG, eletroporação, filmes demicroinjeção, e biolísticas ou bombardeamento de microprojétil para absorçãodireta de DNA. Tais métodos são conhecidos na arte. (Patente Norte-Americana No. 5.405.765 para Vasil et al.; Bilang et al. (1991) Gene 100:247-250; Scheid et al, (1991) Mol. Gen. Genet., 228: 104-112; Guerche etal, (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al, (1987) Theor. AppLGenet. 75: 30-36; Klein et al, (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al,(1980) Science 208:1265; Horsch et al, (1985) Science 227: 1229-1231;DeBlock et al, (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for PlantMolecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press, Inc.(1988) e Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.)Academic Press, Inc. (1989). O método de transformação depende da célulavegetal a ser transformada, estabilidade de vetores usados, nível de expressãode produtos de gene e outros parâmetros.

Outros métodos adequados de introduzir seqüências denucleotídeos em células vegetais e subseqüente inserção no genoma vegetalincluem microinjeção como Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334,eletroporação como descrito por Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 83:5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium como descritopor Townsend et al., Patente Norte-Americana No. 5.563.055, Zhao et al,Patente Norte-Americana No. 5.981.840, transferência de gene direta comodescrito por Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722, e aceleração departícula balística como descrito em, por exemplo, Sanford et al, PatenteNorte-Americana No. 4.945.050; Tomes et al, Patente Norte-Americana No.5,879,918; Tomes et al, Patente Norte-Americana No. 5.886.244; Bidney etal, Patente Norte-Americana No. 5.932.782; Tomes et al. (1995) "DirectDNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," inPlant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborgand Phillips (Springer-Verlag, Berlin); Mccabe et ai. (1988) Biotechnology6:923-926); e transformação de Leel (WO 00/28058). Também veja,Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987)Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou et al. (1988)Plant Physiol. 87:671-674 (soja); Mccabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer and MeMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182(soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al.(1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 85:4305-4309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563(milho); Tomes, Patente Norte-Americana No. 5.240.855; Buising et al.,Patente Norte-Amerieana Nos. 5.322.783 e 5.324.646; Tomes et al. (1995)'Direct DNA Transfer into Intaet Plant Cells via Mieroproj ectileBombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: FundamentalMethods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (milho); Klein et al. (1988)PlantPhysiol 91:440-444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; Bowen et al, Patente Norte-Amerieana No. 5.736.369 (cereais);Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:5345-5349 (Liliaceae);De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed.Chapman et al. (Longman, Nova Iorque), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al.(1990) Plant Cell Reports 9:415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl.Genet. 84:560-566 (transformação mediada por filme); D1Halluin et al. (1992)Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports12:250-255 e Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407 -413 (arroz);Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (milho através deAgrobacterium tumefaciens); todos os quais são neste lugar incorporados porreferência.

Os polinucleotídeos da invenção podem ser introduzidos emplantas colocando em contato plantas com um vírus ou ácidos nucleicosvirais. Geralmente, tais métodos envolvem incorporar um construto depolinucleotídeo da invenção dentro de uma molécula de DNA ou RNA viral.É reconhecido que a proteína AHASLl da invenção pode ser inicialmentesintetizada como parte de uma poliproteína viral, que pode ser depoisprocessada por proteólise in vivo ou in vitro para produzir a proteínarecombinante desejada. Ademais, é reconhecido que promotores da invençãotambém abrangem promotores utilizados para transcrição por RNApolimerases virais. Métodos para introduzir construtos de polinucleotídeos emplantas e expressar uma proteína codificada nesse, envolvendo moléculas deDNA ou RNA viral, são conhecidos na arte. Veja, por exemplo, PatenteNorte-Americana Nos. 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 e5.316.931; neste lugar incorporadas por referência.

As células que foram transformadas podem ser crescidas emplantas em conformidade com meios convencionais. Veja, por exemplo,Mccormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podementão ser crescidas, e ou polinizadas com a mesma linhagem transformada oulinhagens diferentes, e o híbrido resultante tendo expressão constitutiva dacaracterística fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podemser crescidas para assegurar que expressão da característica fenotípicadesejada seja estavelmente mantida e herdada e então sementes coletadas paraassegurar expressão da característica fenotípica desejada tenha sido atingida.Desta maneira, a presente invenção fornece semente transformada (tambémreferida como "semente transgênica") tendo um construto de polinucleotídeoda invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmenteincorporado no seu genoma.

A presente invenção pode ser usada para transformação dequalquer espécie de planta, incluindo, mas não limitada a, monocotiledôneas edicotiledôneas. Exemplos de espécies de planta de interesse incluem, mas nãosão limitados a, cereal ou milho (Zea mays), Brassica sp. (e.g., B. napus, B.rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis comofontes de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativaj,centeio (Secale cereale), sorgo (Sorgo bicolor, Sorgo vulgare), milheto (e.g.,milheto pérola (Pennisetum glaucum), milheto miúdo (Panicum miliaceum),painço português (Setaria italica), capim pé-de-galinha (Eleusine coracana)),girassol (Helianthus annuus), açafrão (Carthamus tinctorius), trigo (Triticumaestivuin, T Turgidum ssp. durum), soja (Glicina max), tabaco (Nicotianatabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea),algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoeabatatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocosnucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau(Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate(Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga(Mangifera indica), oliva (Olea europaea), mamão (Carica papaya), castanha(Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa(Prunus amygdalus), beterrabas açucareiras (Beta vulgaris), cana-de-açúcar(Saccharum spp.), aveias, cevada, hortaliças, ornamentais, e coníferas.

Preferivelmente, plantas da presente invenção são plantas cultivadas (porexemplo, girassol, Brassica sp., algodão, açúcar, beterraba, soja, amendoim,alfafa, açafrão, tabaco, milho, arroz, trigo, centeio, cevada triticale, sorgo,milheto, etc.).

As plantas resistentes a herbicida da invenção encontram usoem métodos para controlar ervas daninhas. Assim, a presente invençãofornece adicionalmente um método para controlar ervas daninhas navizinhança de uma planta resistente a herbicida da invenção. O métodocompreende aplicar uma quantidade efetiva de um herbicida às ervas daninhase à planta resistente a herbicida, em que a planta tem resistência aumentadapara pelo menos um herbicida, particularmente um herbicida deimidazolinona ou sulfoniluréia, quando comparado a uma planta tiposelvagem. Em um tal método para controlar ervas daninhas, as plantasresistentes a herbicida da invenção são preferivelmente plantas cultivadas,incluindo, mas não limitadas a, arroz, girassol, alfafa, Brassica sp., soja,algodão, açafrão, amendoim, tabaco, tomate, batata, trigo, milho, sorgo,cevada, centeio, milheto, e sorgo.

Fornecendo plantas tendo resistência aumentada paraherbicidas, particularmente herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia, umaampla variedade de formulações pode ser empregada para proteger plantas deervas daninhas, assim como para estimular crescimento vegetal e reduzircompetição por nutrientes. Um herbicida pode ser usado por si só para pré-emergência, pós-emergência, controle pré-plantio e em plantio de ervasdaninhas em áreas circundando as plantas descritas neste lugar ou pode serusada uma formulação de herbicida de imidazolinona que contém outrosaditivos. O herbicida também pode ser usado como um tratamento desemente. Aditivos encontrados em uma formulação de herbicida deimidazolinona ou sulfoniluréia incluem outros herbicidas, detergentes,adjuvantes, agentes de espalhamento, agentes de adesão, agentesestabilizantes, ou os semelhantes. A formulação de herbicida pode ser umapreparação úmida ou seca e pode incluir, mas não é limitada a, pósdispersáveis, concentrados emulsionáveis e concentrados líquidos. Oherbicida e formulações de herbicida podem ser aplicados em conformidadecom métodos convencionais, por exemplo, pulverizando, irrigando,polvilhando, ou os semelhantes.

A presente invenção fornece sementes não transgênicas e transgênicas comtolerância aumentada para pelo menos um herbicida, particularmente umherbicida inibindo AHAS, mais particularmente um herbicida deimidazolinona. Tais sementes incluem, por exemplo, sementes de arroz nãotransgênicas compreendendo as características de tolerância a herbicida daplanta com Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262, e sementestransgênicas compreendendo uma molécula de ácido nucleico IMI dainvenção que codifica uma proteína IMI.

A presente invenção fornece métodos para produzir umaplanta resistente a herbicida, particularmente uma planta de arroz resistente aherbicida, através de melhoramento vegetal convencional envolvendoreprodução sexual. Os métodos compreendem cruzar uma primeira planta queé resistente a um herbicida com uma segunda planta que não é resistente aoherbicida. A primeira planta pode ser qualquer das plantas resistentes aherbicida da presente invenção incluindo, por exemplo, plantas transgênicascompreendendo pelo menos um dos polinucleotídeos da presente invençãoque codificam uma proteína IMI resistente a herbicida e plantas nãotransgênicas de arroz que compreendem as características de tolerância aherbicida da planta de arroz com Número de Acesso de NCIMB, NCIMB41262. A segunda planta pode ser qualquer planta que é capaz de produzirplantas de progenia viáveis (i.e., sementes) quando cruzada com a primeiraplanta. Tipicamente, mas não necessariamente, a primeira e segunda plantasão da mesma espécie. Os métodos da invenção podem envolveradicionalmente uma ou mais gerações de retrocruzamento das plantas deprogenia do primeiro cruzamento com uma planta da mesma linhagem ougenótipo que ou a primeira ou segunda planta. Alternativamente, a progeniado primeiro cruzamento ou qualquer cruzamento subseqüente pode sercruzada com uma terceira planta que é de uma linhagem ou genótipo diferentedo que ou a primeira ou segunda planta. Os métodos da invenção podemadicionalmente envolver selecionar plantas que compreendem ascaracterísticas de tolerância a herbicida da primeira planta.

A presente invenção fornece adicionalmente métodos paraaumentar a resistência a herbicida de uma planta, particularmente uma plantade arroz resistente a herbicida, através de melhoramento vegetal convencionalenvolvendo reprodução sexual. Os métodos compreendem cruzar umaprimeira planta que é resistente a um herbicida com uma segunda planta quepode ou não ser resistente ao herbicida ou pode ser resistente a herbicida ouherbicidas diferentes do que a primeira planta. A primeira planta pode serqualquer das plantas resistentes a herbicida da presente invenção incluindo,por exemplo, plantas transgênicas compreendendo pelo menos um dos ácidosnucleicos IMI da presente invenção que codificam proteína IMI e plantas nãotransgênicas de arroz que compreendem as características de tolerância aherbicida da planta de arroz com Número de Acesso de NCIMB, NCIMB41262. A segunda planta pode ser qualquer planta que é capaz de produzirplantas de progenia viáveis (i.e., sementes) quando cruzada com a primeiraplanta. Tipicamente, mas não necessariamente, a primeira e segunda plantasão da mesma espécie. As plantas de progenia produzidas por este método dapresente invenção têm resistência aumentada para um herbicida quandocomparado a ou a primeira ou segunda planta ou ambas. Quando a primeira esegunda planta são resistentes a herbicidas diferentes, as plantas de progeniaterão as características de tolerância a herbicidas da primeira e segunda plantacombinadas. Os métodos da invenção podem envolver adicionalmente uma oumais gerações de retrocruzamento das plantas de progenia do primeirocruzamento com uma planta da mesma linhagem ou genótipo que ou aprimeira ou segunda planta. Alternativamente, a progenia do primeirocruzamento ou qualquer cruzamento subseqüente pode ser cruzada com umaterceira planta que é de uma linhagem ou genótipo diferente do que ou aprimeira ou segunda planta. Os métodos da invenção podem adicionalmenteenvolver selecionar plantas que compreendem as características de tolerânciaa herbicida da primeira planta, da segunda planta, ou ambas a primeira e asegunda planta.

As plantas da presente invenção podem ser transgênicas ounão transgênicas. Um exemplo de uma planta de arroz não transgênica tendoresistência aumentada para imidazolinona é a planta de arroz (IMINTA 16)tendo Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262; ou mutante,recombinante, ou um derivado geneticamente modificado da planta tendoNúmero de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262; ou de qualquer progenia daplanta tendo Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262; ou uma plantaque é uma progenia de qualquer destas plantas; ou uma planta quecompreende as características de tolerância a herbicida da planta tendoNúmero de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262.

A presente invenção também fornece plantas, órgãos vegetais,tecidos vegetais, células vegetais, sementes, e células hospedeiras nãohumanas que são transformadas com a pelo menos uma molécula depolinucleotídeo, cassete de expressão, ou vetor de transformação da invenção.Tais plantas transformadas, órgãos vegetais, tecidos vegetais, células vegetais,sementes, e células hospedeiras não humanas têm tolerância ou resistênciaestimulada para pelo menos um herbicida, em níveis do herbicida que matamou inibem o crescimento de uma planta não transformada, tecido vegetal,célula vegetal, ou célula hospedeira não humana, respectivamente.Preferivelmente, as plantas transformadas, tecidos vegetais, células vegetais, esementes da invenção são Arabidopsis thaliana e plantas cultivadas.

A presente invenção fornece métodos que envolvem o uso depelo menos um herbicida inibindo AHAS selecionado a partir do grupoconsistindo de herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfoniluréia,herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de pirimidiniloxibenzoato,herbicidas de sulfomlamino-carboniltriazolinona, e misturas dos mesmos.Nestes métodos, o herbicida inibindo AHAS pode ser aplicado por qualquermétodo conhecido na arte incluindo, mas não limitado a, tratamento desemente, tratamento de solo, e tratamento foliar.

Antes de aplicação, o herbicida inibindo AHAS -pode serconvertido nas formulações habituais, por exemplo soluções, emulsões,suspensões, polvilhos, pós, pastas e grânulos. A forma de uso depende dopropósito pretendido particular; em cada caso, ela deve assegurar uma fina eigual distribuição do composto de acordo com a invenção.

As formulações são preparadas de uma maneira conhecida(veja e.g. para revisão Patente Norte-Americana 3.060.084, Patente Européia-A 707 445 (para concentrados líquidos), Browning, "Agglomeration",Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48, Perry1S Chemical Engineer'sHandbook, 4th Ed., McGraw-Hill, Nova Iorque, 1963, pages 8-57 e et seq.WO 91/13546, Patente Norte-Americana 4.172.714, Patente Norte-Americana4.144.050, Patente Norte-Americana 3.920.442, Patente Norte-Americana5.180.587, Patente Norte-Americana 5.232.701, Patente Norte-Americana5.208.030, Patente Britânica 2.095.558, Patente Norte-Americana 3.299.566,Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., NovaIorque, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., BlackwellScientific Publications, Oxford, 1989 e Mollet, H., Grubemann, A.,Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Germany),2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry and Technology of AgrochemicalFormulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8), por exemplo estendendo o composto ativo com auxiliares adequadospara a formulação de agroquímicos, tal como solventes e/ou carreadores, sedesejado emulsificantes, tensoativos e dispersantes, conservantes, agentesantiespumantes, agentes anticongelantes, para formulação de tratamento desemente também opcionalmente corantes e/ou ligantes e/ou agentesgeleificantes.

Exemplos de solventes adequados são água, solventesaromáticos (por exemplo produtos de Solvesso, xileno), parafinas (porexemplo frações de óleo mineral), álcoois (por exemplo metanol, butanol,pentanol, benzil álcool), cetonas (por exemplo ciclohexanona, gama-butirolactona), pirrolidonas (NMP, NOP), acetatos (glicol diacetato), glicóis,dimetilamidas de ácido graxo, ácidos graxos e ésteres de ácido graxo. Emprincípio, misturas de solventes também podem ser usadas.

Exemplos de carreadores adequados são minerais naturais dosolo (por exemplo caolims, argilas, talco, giz) e minerais sintéticos do solo(por exemplo sílica altamente dispersa, silicatos).

Emulsificantes adequados são emulsificantes não iônicos eaniônicos (por exemplo éteres de álcool graxo de polioxietileno,alquilsulfonatos e arilsulfonatos).

Exemplos de dispersantes são licores residuais de lignina-sulfito e metilcelulose.

Tensoativos adequados são metal alcalino, metal alcalinoterroso e sais de amônio de ácido lignosulfônico, ácido naftalenosulfônico,ácido fenolsulfônico, ácido dibutilnaftalenosulfônico, alquilarilsulfonatos,alquil sulfatos, alquilsulfonatos, sulfatos de álcool graxo, ácidos graxos eglicol éteres de álcool graxo sulfatado, além disso condensados de naftalenosulfonado e derivados de naftaleno com formaldeído, condensados denaftaleno ou de ácido naftalenosulfônico com fenol e formaldeído,polioxietileno octilfenol éter, isooctilfenol etoxilado, octilfenol, nonilfenol,alquilfenol poliglicol éteres, tributilfenil poliglicol éter, tristearilfenilpoliglicol éter, alquilaril poliéter álcoois, condensados de óxido de etileno deálcool e álcool graxo, óleo de ricínio etoxilado, polioxietileno alquil éteres,polioxipropileno etoxilado, lauril álcool poliglicol éter acetal, sorbitol ésteres,licores residuais de lignosulfito e metilcelulose.

Substâncias que são adequadas para a preparação de soluções,emulsões, pastas ou dispersões oleosas pulverizáveis diretamente são fraçõesde óleo mineral de ponto de ebulição médio a alto, tal como querosene ouóleo diesel, além disso óleos de piche de carvão e óleos de origem vegetal ouanimal, hidrocarbonos alifáticos, cíclicos e aromáticos, por exemplo tolueno,xileno, parafina, tetrahidronaftaleno, naftalenos alquilados ou seus derivados,metanol, etanol, propanol, butanol, ciclohexanol, ciclohexanona, isoforona,solventes altamente polares, por exemplo dimetil sulfóxido, N-metilpirrolidona ou água.

Também agentes anticongelantes tal como glicerina,etilenoglicol, propilenoglicol e bactericidas tal como podem ser adicionados àformulação.

Agentes antiespumantes adequados são por exemplo agentesantiespumantes baseados em silicone ou estearato de magnésio.

Conservantes adequados são por exemplo Diclorofeno eenzilalcoolhemiformal.

Formulações de tratamento de semente podem adicionalmentecompreender ligantes e opcionalmente corantes.

Ligantes podem ser adicionados para melhorar a adesão dosmateriais ativos nas sementes depois de tratamento. Ligantes adequados sãocopolímeros de bloqueio EO/PO tensoativos mas também álcoois de polivinil,polivinilpirrolidonas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polibutenos,poliisobutilenos, poliestireno, polietilenoaminas, polietilenoaminas,polietilenoiminas (Lupasol®, Polymin®), poliéteres, poliuretanos,polivinilacetato, tilose e copolímeros derivados destes polímeros.

Opcionalmente, também corantes podem ser incluídos naformulação. Corantes ou tinturas adequadas para formulações de tratamentode semente são Rodamina B, C.I. Pigmento Vermelho 112, C.I. SolventeVermelho 1, pigmento azul 15:4, pigmento azul 15:3, pigmento azul 15:2,pigmento azul 15:1, pigmento azul 80, pigmento amarelo 1, pigmentoamarelo 13, pigmento vermelho 112, pigmento vermelho 48:2, pigmentovermelho 48:1, pigmento vermelho 57:1, pigmento vermelho 53:1, pigmentolaranja 43, pigmento laranja 34, pigmento laranja 5, pigmento verde 36,pigmento verde 7, pigmento branco 6, pigmento marrom 25, violeta básico10, violeta básico 49, vermelho ácido 51, vermelho ácido 52, vermelho ácido14, azul ácido 9, amarelo ácido 23, vermelho básico 10, vermelho básico 108.

Um exemplo de um agente geleificante adequado écarragenano (Satiagel).

Pós, materiais para espalhamento, e produtos polvilháveispodem ser preparados misturando ou concomitantemente moendo assubstâncias ativas com um carreador sólido.

Grânulos, por exemplo grânulos revestidos, grânulosimpregnados e grânulos homogêneos, podem ser preparados ligando oscompostos ativos a carreadores sólidos. Exemplos de carreadores sólidos sãoterras minerais mineral tal como géis de sílica, silicatos, talco, caolim,"attaclay", pedra calcária, cal, giz, fuste, loess, argila, dolomita, terradiatomácea, sulfato de cálcio, sulfato de magnésio, óxido de magnésio,materiais sintéticos do solo, fertilizantes, tal como, por exemplo, sulfato deamônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, uréias, e produtos de origemvegetal, tal como farelo de cereal, farelo de casca de árvore, farelo de madeirae farelo de casca de noz, pós de celulose e outros carreadores sólidos.

Em geral, as formulações compreendem de 0,01 a 95% empeso, preferivelmente de 0,1 a 90% em peso, do herbicida inibindo AHAS.

Neste caso, os herbicidas inibindo AHAS são empregados em uma pureza dea partir de 90% a 100% em peso, preferivelmente 95% a 100% em peso (deacordo com espectro de NMR). Para propósitos de tratamento de semente,respectivas formulações podem ser diluídas 2-10 vezes levando aconcentrações nas preparações prontas para uso de 0,01 a 60% em peso decomposto ativo em peso, preferivelmente 0,1a 40% em peso.

O herbicida inibindo AHAS pode ser usado como tal, na formade suas formulações ou as formas de uso preparadas a partir destas, porexemplo na forma de soluções, pós, suspensões ou dispersões diretamentepulverizáveis, emulsões, dispersões oleosas, pastas, produtos polvilháveis,materiais para espalhamento, ou grânulos, por meio de pulverização,atomização, polvilhamento, espalhamento ou derramamento. As formas deuso dependem inteiramente dos propósitos pretendidos; elas são pretendidaspara assegurar em cada caso a melhor distribuição possível do herbicidainibindo AHAS de acordo com a invenção.

Formas de uso aquosas podem ser preparadas a partir deconcentrados de emulsão, pastas ou pós molháveis (pós pulverizáveis,dispersões oleosas) adicionando água. Para preparar emulsões, pastas oudispersões oleosas, as substâncias, como tal ou dissolvidas em um óleo ousolvente, podem ser homogeneizadas em água por meio de um umectante,taquificante, dispersante ou emulsificante. Entretanto, também é possívelpreparar concentrados compostos de substância ativa, umectante, taquificante,dispersante ou emulsificante e, se apropriado, solvente ou óleo, e taisconcentrados são adequados para diluição com água.

As concentrações do composto ativo nas preparações prontaspara uso podem ser variadas dentro de extensões relativamente amplas. Emgeral, elas são de 0,0001 a 10%, preferivelmente de 0,01 a 1% em peso.

O herbicida inibindo AHAS também pode ser usado comsucesso no processo de volume ultra baixo (ULV), sendo possível aplicarformulações compreendendo mais de 95% em peso de composto ativo, oumesmo aplicar o composto ativo sem aditivos.

Os seguintes são exemplos de formulações:

1. Produtos para diluição com água para aplicações foliares.

Para propósitos de tratamento de semente, tais produtos podem ser aplicados àsemente diluídos ou não diluídos.

A) Concentrados solúveis em água (SL, LS)

Dez partes em peso do herbicida inibindo AHAS sãodissolvidas em 90 partes em peso de água ou um solvente solúvel em água.

Como uma alternativa, umectantes ou outros auxiliares são adicionados. Oherbicida inibindo AHAS dissolve com diluição com água, por meio do queuma formulação com 10 % (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida.

B) Concentrados dispersáveis (DC)

Vinte partes em peso do herbicida inibindo AHAS sãodissolvidas em 70 partes em peso de ciclohexanona com adição de 10 partesem peso de um dispersante, por exemplo polivinilpirrolidona. Diluição comágua fornece uma dispersão, por meio do que uma formulação com 20%(w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida.

C) Concentrados emulsionáveis (EC)

Quinze partes em peso do herbicida inibindo AHAS sãodissolvidas em 7 partes em peso de xileno com adição dedodecilbenzenosulfonato de cálcio e óleo de ricínio etoxilado (em cada caso 5partes em peso). Diluição com água fornece uma emulsão, por meio do queuma formulação com 15% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida.

D) Emulsões (EW, BO, ES)

Vinte e cinco partes em peso do herbicida inibindo AHAS sãodissolvidas em 35 partes em peso de xileno com adição dedodecilbenzenosulfonato de cálcio e óleo de ricínio etoxilado (em cada caso 5partes em peso). Esta mistura é introduzida em 30 partes em peso de água pormeio de uma máquina emulsificante (e.g. Ultraturrax) e feita em uma emulsãohomogênea. Diluição com água fornece uma emulsão, por meio do que umaformulação com 25% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida.

E) Suspensões (SC, OD, FS)

Em um moinho de bolas agitado, 20 partes em peso doherbicida inibindo AHAS são fracionadas com adição de 10 partes em peso dedispersantes, umectantes e 70 partes em peso de água ou de um solventeorgânico para gerar uma suspensão fina do herbicida inibindo AHAS.Diluição com água fornece uma suspensão estável do herbicida inibindoAHAS, por meio do que uma formulação com 20% (w/w) de herbicidainibindo AHAS é obtida.F) Grânulos dispersáveis em água e grânulos solúveis emágua (WG, SG)

Cinqüenta partes em peso do herbicida inibindo AHAS sãofinamente moídas com adição de 50 partes em peso de dispersantes eumectantes e feitas como grânulos dispersáveis em água ou solúveis em águapor meio de ferramentas técnicas (por exemplo extrusão, torre depulverização, cama fluidizada). Diluição com água fornece uma dispersão ousolução estável do herbicida inibindo AHAS, por meio do que umaformulação com 50% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida.

G) Pós dispersáveis em água e pós solúveis em água (WP, SP,SS, WS)

Setenta e cinco partes em peso do herbicida inibindo AHASsão moídas em um moinho de rotor-estator com adição de 25 partes em pesode dispersantes, umectantes e gel de sílica. Diluição com água fornece umadispersão ou solução estável do herbicida inibindo AHAS, por meio do queuma formulação com 75% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida.

I) Formulação de Gel (GF)

Em um moinho de bolas agitado, 20 partes em peso doherbicida inibindo AHAS são fracionadas com adição de 10 partes em peso dedispersantes, 1 pare em peso de umectantes de um agente geleificante e 70partes em peso de água ou de um solvente orgânico para gerar uma suspensãofina do herbicida inibindo AHAS. Diluição com água fornece uma suspensãoestável do herbicida inibindo AHAS, por meio do que uma formulação com20% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida. Esta formilação de gel éadequada para uso como um tratamento de semente.

2. Produtos para serem aplicados não diluídos para aplicaçõesfoliares. Para propósitos de tratamento de semente, tais produtos podem seraplicados à semente diluídos.

A) Pós polvilháveis (DP, DS)Cinco partes em peso do herbicida inibindo AHAS sãofinamente moídas e misturadas intimamente com 95 partes em peso de caolimfinamente dividida. Isto fornece um produto polvilhável tendo 5% (w/w) deherbicida inibindo AHAS.

B) Grânulos (GR, FG, GG, MG)

Meia parte em peso do herbicida inibindo AHAS é finamentemoída e associada com 95,5 partes em peso de carreadores, por meio do queuma formulação com 0,5% (w/w) de herbicida inibindo AHAS é obtida.Métodos atuais são extrusão, secagem por pulverizador ou a cama fluidizada.Isto fornece grânulos para serem aplicados não diluídos para uso foliar.

Formulações convencionais de tratamento de semente incluempor exemplo concentrados dispersáveis FS, soluções LS, pós para tratamentoseco DS, pós dispersáveis em água para tratamento pastoso WS, pós solúveisem água SS e emulsão ES e EC e formulação de gel GF. Estas formulaçõespodem ser aplicadas à semente diluídas ou não diluídas. Aplicação àssementes é realizada antes de semear, ou diretamente nas sementes.

Em uma forma de realização preferida uma formulação FS éusada para tratamento de semente. Tipicamente, uma formulação FS podecompreender 1-800 g/l de ingrediente ativo, 1-200 g/l de Tensoativo, 0 a 200g/l de agente anticongelante, 0 a 400 g/l de ligante, 0 a 200 g/l de umpigmento e até 1 litro de um solvente, preferivelmente água.

As sementes não transgênicas e transgênicas da presenteinvenção das plantas resistentes a herbicida da presente invenção. Taissementes incluem, por exemplo, sementes de arroz não transgênicascompreendendo as características de tolerância a herbicida da planta comNúmero de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262, e sementes transgênicascompreendendo uma molécula de polinucleotídeo da invenção que codificauma proteína IML

Para tratamento de semente, sementes das plantas resistentes aherbicida de acordo com a presente invenção são tratadas com herbicidas,preferivelmente herbicidas selecionados a partir do grupo consistindo deherbicidas inibindo AHAS tal como amidosulfuron, azimsulfuron,bensulfuron, clorimuron, clorsulfuron, cinosulfuron, ciclosulfamuron,etametsulfuron, etoxisulfuron, flazasulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron,halosulfuron, imazosulfuron, iodosulfuron, mesosulfliron, metsulfuron,nicosulfuron, oxasulfuron, primisulfuron, prosulfuron, pirazosulfuron,rimsulfuron, sulfometuron, sulfosulfiiron, tifensulfuron, triasulfuron,tribenuron, trifloxisulfuron, triflusulfuron, tritosulfuron, imazametabenz,imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam,diclosulam, florasulam, flumetsulam, metosulam,penoxsulam, bispiribac,piriminobac, propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxim, piriftalid,piritiobac, e misturas dos mesmos, ou com uma formulação compreendendoum herbicida inibindo AHAS.

O termo tratamento de semente compreende todas as técnicasadequadas de tratamento de semente conhecidas na arte, tal como tratamentode sementes, recobrimento de sementes, polvilhamento de sementes,embebição de sementes, e peletização de sementes.

Em conformidade com uma variante da presente invenção, umassunto adicional da invenção é um método de tratar solo pela aplicação, emparticular na semeadora: ou de uma formulação granular contendo o herbicidainibindo AHAS como uma composição/formulação (e.g.uma formulaçãogranular, com opcionalmente um ou mais carreadores sólidos ou líquidos,agricolamente aceitáveis e/ou opcionalmente com um ou mais tensoativosagricolamente aceitáveis). Este método é vantajosamente empregado, porexemplo, em canteiros de cereais, milho, algodão, e girassol.

A presente invenção também compreende sementes revestidascom ou contendo com uma formulação de tratamento de sementecompreendendo pelo menos um herbicida inibindo AHAS selecionado a partirdo grupo consistindo de amidosulfuron, azimsulfuron, bensulfuron,clorimuron, clorsulfuron, cinosulfuron, ciclosulfamuron, etametsulfuron,etoxisulfuron, flazasulfuron, flupirsulfuron, foramsulfuron, halosulfuron,imazosulfuron, iodosulfuron, mesosulfuron, metsulfuron, nicosulfuron,oxasulfuron, primisulfuron, prosulfuron, pirazosulfuron, rimsulfuron,sulfometuron, sulfosulfuron, tifensulfuron, triasulfuron, tribenuron,trifloxisulfuron, triflusulfuron, tritosulfuron, imazametabenz, imazamox,imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, cloransulam, diclosulam,florasulam, flumetsulam, metosulam, penoxsulam, bispiribac, piriminobac,propoxicarbazona, flucarbazona, piribenzoxim, piriftalid e piritiobac.

O termo semente inclui sementes e propágulos vegetais detodos os tipos incluindo mas não limitados a sementes verdadeiras, pedaçosde semente, brotos secundários, cormos, bulbos, fruto, tubérculos, grãos,estacas, ramos cortados e os semelhantes e significa em uma forma derealização preferida sementes verdadeiras.

O termo "revestida com e/ou contendo" geralmente significaque o ingrediente ativo está para a maior parte na superfície do produto depropagação no momento de aplicação, embora uma parte maior ou menor doingrediente possa penetrar no produto de propagação, dependendo do métodode aplicação. Quando o dito produto de propagação é (re)plantado, ele podeabsorver o ingrediente ativo.

A aplicação de tratamento de semente com o herbicidainibindo AHAS ou com uma formulação compreendendo o herbicida inibindoAHAS é realizada pulverizando ou polvilhando as sementes antes desemeadura das plantas e depois de emergência das plantas.

No tratamento de sementes, as formulações correspondentessão aplicadas tratando as sementes com uma quantidade efetiva do herbicidainibindo AHAS ou uma formulação compreendendo o herbicida inibindoAHAS. Neste lugar, as taxas de aplicação são geralmente de 0,1 g a 10 kg doa.i. (ou da mistura de a.i. ou da formulação) por 100 kg de semente,preferivelmente de 1 g a 5 kg por 100 kg de semente, em particular de 1 g a2,5 kg por 100 kg de semente. Para cultivos específicas tal como alface a taxapode ser maior.

A presente invenção fornece um método para combatervegetação indesejada ou controlar ervas daninhas compreendendo colocar emcontato as sementes das plantas resistentes de acordo com a presente invençãoantes de semeadura e/ou depois de pré-germinação com um herbicida inibindoAHAS. O método pode compreender adicionalmente semear as sementes, porexemplo, em solo em um campo ou em um substrato em casa de vegetação. Ométodo encontra uso particular para combater vegetação indesejada oucontrolar ervas daninhas na vizinhança imediata da semente.

O controle de vegetação indesejada é entendido comosignificando o assassinato de ervas daninhas e/ou de outra maneira retardandoou inibindo o crescimento normal das ervas daninhas. Ervas daninhas, nosentido mais amplo, são entendidas como significando todas as plantas quecrescem em localizações onde elas são indesejadas.

As ervas daninhas da presente invenção incluem, por exemplo,ervas daninhas dicotiledôneas e monocotiledôneas. Ervas daninhasdicotiledôneas incluem, mas não são limitadas a, ervas daninhas dos gêneros:Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga,Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium,Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus,Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Verônica, Abutilon,Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus,e Taraxacum. Ervas daninhas monocotiledôneas incluem, mas não sãolimitadas a, ervas daninhas dos gêneros: Echinochloa, Setaria, Panicum,Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus,Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis,Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea,Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, e Apera.

Em adição, as ervas daninhas da presente invenção podemincluir, por exemplo, plantas cultivadas que estão crescendo na localizaçãoindesejada. Por exemplo, uma planta voluntária de milho que está em umcampo que compreende predominantemente plantas de soja pode serconsiderada uma erva daninha, se a planta de milho é indesejada no campo deplantas de soja.

Os artigos "um" e "uma" são usados neste lugar para se referira um ou mais do que um (i.e., a pelo menos um) dos objetos gramaticais doartigo. Como forma de exemplo, "um elemento" significa um ou maiselementos.

Como usado neste lugar, a palavra "compreendendo," ouvariações tal como "compreende" ou "compreendendo," serão entendidas paraimplicar a inclusão de um determinado elemento, número inteiro ou etapa, ougrupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não a exclusão dequalquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos,,números inteiros ou etapas.

Os exemplos seguintes são oferecidos como forma deilustração e não como forma de limitação.

EXEMPLO 1: Produção de uma Linhagem de Arroz

Resistente a Imidazolinona

AHASL é uma enzima codificada no núcleo e seu gene, emdiferentes espécies, foi seqüenciado em sua forma selvagem e outras formasmostrando sítios de mutação que conferem resistência a herbicidas desulfoniluréia e de imidazolinona. A fim de produzir plantas de arroz comenzimas AHAS resistentes a herbicida, sementes de arroz foram tratadas comum mutagênico químico em uma tentativa de induzir pequenas mudanças nosítio ativo de interação com o herbicida a fim de prevenir inibição. Variedadesdominantes de arroz e linhagens elite de arroz foram selecionadas a fim degerar uma nova mutação que é resistente as imidazolinonas mais ativas emgermoplasma excelente. Pressão de seleção foi baseada em exposição deplantas em estágio de quatro folhas para dois dos mais ativos herbicidas deimidazolinona aplicados em uma aplicação durante diversas gerações até quelinhagens homozigotas altamente resistentes fossem obtidas. As linhagens dearroz com resistência a imidazolinona foram produzidas como descritoabaixo.

Na primavera tardia da estação de crescimento número 1, duasamostras de sementes (600 g cada) da cultivar IRGA 417 de arroz foramtratadas com uma solução aquosa de azida de sódio 0,001 M em pH 3(tampão fosfato 0,067M). Este tratamento foi aplicado embebendo cadasemente-amostra em um Erlenmeyer de dois litros contendo um litro dasolução de azida de sódio, em agitação constante, por 18 horas, emtemperatura ambiente. Depois de tratamento, as sementes foram enxaguadasem água de torneira e, mais tarde, elas foram parcialmente seco-aerado emfolhas de papel mata-borrão a fim de extrair a umidade da superfície desementes. Depois disso, sementes tratadas foram semeadas diretamente noviveiro em Concepcion dei Uruguay, E.R., Argentina.

Sementes tratadas (Mi) e não tratadas controle da cultivarIRGA 417 de arroz foram plantas no viveiro em uma taxa de 50 plantas pormetro quadrado. As plantas foram crescidas em condições inundadas atématuridade (26 % de umidade do grão) e volume coletado. Sementes (M2) dasplantas foram coletadas e secas em um secador por convecção por 14 h a45°C. Elas foram mantidas em armazenamento fechado até próxima estaçãode crescimento.

Na primavera tardia da estação de crescimento número 2,sementes M2 foram plantadas com uma semeadeira experimental paragrandes áreas em uma taxa de 50 kg/ha no viveiro em Concepcion deiUruguay, E.R., Argentina. Uma área de 3 ha foi estabelecida compreendendouma população de aproximadamente 6 χ IO6 plantas M2. IRGA 417 (tiposelvagem) também foi plantado como um controle. A área inteira foi sujeita auma pressão de seleção com uma mistura de dois herbicidas deimidazolinona. Três aplicações separadas foram feitas com um pulverizadorcomercial in diferentes direções para prevenir qualquer fuga e resultando emum tratamento de 3X. Um volume total de 222 L/ha foi pulverizado a 50 psi(344,7 kPa), com bocais Teejets 8002, em cada aplicação. A taxa dotratamento de Ix foi uma mistura de Arsenal® (Imazapir 75 cm a.i/ha) eCadre® (Imazapic 24,85 cm a.i/ha) em uma solução aquosa com umtensoativo não iônico (Citowett) na taxa de 0,25%. As aplicações foram feitasno estágio de quatro folhas das plantas de arroz. Nenhuma chuva foiregistrada durante os 7 dias depois de tratamentos.

Observações em tempos regulares foram feitas para avaliar aárea inteira tratada com herbicida. Em 90 dias depois do tratamento comherbicida, os indivíduos sobreviventes foram marcados e transplantados paraa casa de vegetação para multiplicação assexual e produção de semente. Umtotal de 10 plantas individuais foram crescidas, e a semente foi coletada e secaem um incubador de semente por 7 dias a 50 °C. Como esperado, nenhumadas plantas de controle (IRGA 417) sobreviveu ao tratamento com herbicida.

Sementes (M3) de plantas M2 selecionadas foram plantadasem potes individuais em condições de casa de vegetação em Concepcion deiUruguay, E.R., Argentina durante o inverno imediatamente seguindo asegunda estação. Um tratamento de 2X foi aplicado com um pulverizadorcostal dividido em duas aplicações de uma taxa de IX de Arsenal® (Imazapir75 cm a.i/ha) e Cadre® (Imazapic 24,85 cm a.i/ha) em uma solução aquosacom um tensoativo não iônico (Citowet) na taxa de 0,25%.

Perfilhos das plantas tolerantes a herbicida (e.g., plantas quesobreviveram a tratamentos com herbicida) foram crescidos até maturidade(26% de umidade de grão) e coletados manualmente. A semente coletada(M4) foi sujeita a um tratamento de quebra de dormência de 7 dias a 50°C epreparada para o plantio de próxima estação de crescimento. Sementes deduas plantas tolerantes a herbicida foram mantidas separadamente. Assementes de foram preparadas para um plantio de estação tardia externo emConcepcion dei Uruguay5 E.R., Argentina.

No verão de estação de crescimento número 3, sementes M4de uma planta M3 tolerante a herbicida que foi designado como IMINTA 16foram plantadas com a taxa de 50 kg/ha.

Um tratamento de 2X de herbicidas de imidazolinona foiaplicado no estádio de quatro a cinco folhas das plantas de arroz como duasaplicações de uma taxa de IX de Arsenal® (Imazapir 75 cm a.i/ha) e Cadre®(Imazapic 24,85 cm a.i/ha) em uma solução aquosa com um tensoativo nãoiônico (Citowet) na taxa de 0,25%. Nenhum sintoma fitotóxico foi observadopara plantas da linhagem IMINTA 16. Nenhum segregante tipo selvagem(i.e., não tolerante ao tratamento com herbicida) foi observado, e umapopulação altamente homogênea em características agronômicas e detolerância foi produzida. Plantas IMINTA 16 individuais foram transplantadaspara a casa de vegetação para produção de semente, e sementes (M5) foramcoletadas mais tarde naquele ano.

EXEMPLO 2: Uma Linhagem de Arroz Resistente aImidazolina com uma Mutação no Gene AHASLl

DNA genômico foi separadamente extraído de folhas deplântulas crescidas na casa de vegetação da linhagem IMINTA 16 descrita emExemplo 1 acima e o gene AHASLl foi amplificado por um método dereação em cadeia da polimerase (PCR) usando os iniciadores descritos abaixo.Os produtos resultantes das amplificações de PCR individuais foramseqüenciados usando métodos padrão.

Os iniciadores usados para PCR e seqüenciamento sãofornecidos em Tabela 1. Os iniciadores foram selecionados manualmente porinspeção visual das seqüências de arroz conhecidas publicamente para Oryzasativa 'Kinmaze', Oryza sativa japonica e Oryza sativa indica. Os iniciadoresforam pareados aproximadamente a cada 400-500 bp ao longo dosaproximadamente 2000 bp do gene AHAS. Diversos iniciadores foramprojetados para cada trecho de 500 bp para maximizar a probabilidade desucesso de amplificação. Nenhum peso foi dado para regiões conservadasquando escolhendo iniciadores. As seqüências de iniciadores foramverificadas para formas de grampo de cabelo e dímeros através do sítio darede mundial de computadores www.mature.comioligonucleotide.html. Pelofato de não haver íntrons presentes no gene AHASL1, o gene inteirorepresenta seqüência de codificação, e é portanto conservado. Iniciadoresforam projetados para ter um teor de GC perto, de 50% e temperaturas defusão similares, aproximadamente 54-58°C. Os nomes de iniciadores emTabela 1 refletem a exata posição de base de começo de acordo comseqüências de nucleotídeos de AHASLl públicas para arroz (e.g., No. deAcesso de GenBank AB049822). U136851 se refere a uma região antes docódon de início no gene AHAS e foi projetado a partir de um clone BAC(OSJNBa0053B21), No. de Acesso AL731599.

Tabela 1 Iniciadores para Amplificação por PCR e Seqüenciamento de DNAdo Gene AHASLl de Arroz em IMINTA 16

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Também usou U642 e L2155 como um par de PCR

Quando o DNA genômico amplificado por PCR das plântulasIMINTA 16 foi examinado, uma mudança de base única (i.e., transição, Cpara T) foi identificada na região de codificação do gene que causou umasubstituição de aminoácido na proteína AHASLl em posição de aminoácido179 de Ala na linhagem tipo selvagem para Val na linhagem IMINTA 16. Osítio desta substituição corresponde à posição 205 na proteína AHASL deArabidopsis thaliana (veja, Tabela 2 abaixo). A substituição de Ala205 porVal na proteína AHASL de Arabidopsis thaliana é conhecida por conferir emplantas que expressam esta proteína tolerância a herbicidas de imidazolinona.

EXEMPLO 3: Proteínas AHASLl de Arroz Resistentes a Herbicida

A presente invenção descreve tanto seqüências de nucleotídeoscomo de aminoácidos para polipeptídeos AHASLl de arroz resistentes aherbicida. Plantas compreendendo polipeptídeos AHASLl resistentes aherbicida foram previamente identificadas, e diversas regiões conservadas depolipeptídeos AHASLl que são os sítios de substituições de aminoácidos queconferem resistência a herbicida foram descritas. Veja, Devine and Eberlein(1997) "Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicideresistance based on altered target sites". In: Herbicide Activity: Toxicology,Biochemistry and Molecular Biology, Roe et al. (eds.), pp. 159-185, IOSPress, Amsterdam; e Devine and Shukla, (2000) Crop Protection 19:881-889.

Usando as moléculas de polinucleotídeo AHASL1 da invençãoe métodos conhecidos por aqueles de habitual verso na arte, alguém podeproduzir moléculas de polinucleotídeo adicionais codificando polipeptídeosAHASLl resistentes a herbicida tendo uma, duas, três, ou mais substituiçõesde aminoácidos nos sítios identificados nestas regiões conservadas. Tabela 2fornece as regiões conservadas de proteínas AHASL1, as substituições deaminoácidos conhecidas por conferir resistência a herbicida dentro destasregiões conservadas, e os aminoácidos correspondentes na proteína AHASLlde arroz estabelecida na SEQ ID NO:2.

Tabela 2

Substituições de aminoácidos em Regiões conservadas de PolipeptídeosAHASL que são conhecidos por Conferir Resistência a herbicida e suaPosição equivalente em Polipeptídeos AHASLl de Arroz

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1Regioes conservadas de Devine and Eberlein (1997)"Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide resistancebased on altered target sites". In: Herbicide Activity: Toxicology,Bioehemistry and Molecular Biology, Roe et al. (eds.), pp. 159-185, IOSPress, Amsterdam e Devine and Shukla, (2000) Crop Protection 19:881-889.2Numeração de aminoácido corresponde à seqüência deaminoácidos do polipeptídeo AHASL de Arabidopsis thaliana.

3A proteína AHASL de arroz AHASLl da invenção (SEQ IDNO:2) tem as mesmas regiões conservadas.

4Bernasconi et al. (1995) J. Biol Chem. 270(29):17381-17385.

5Boutsalis et al. (1999) Pestic. Sei. 55:507-516. 6Guttieri et al.(1995) Weed Sei. 43:143-178.

7Guttieri et al. (1992) Weed Sei. 40:670-678.Hartnett et al. (1990) "Herbicide-resistant plants carryingmutated

acetolactate synthase genes," In: Managing Resistance toAgrochemicals: Fundamental Research to Practieal Strategies, Green et al.(eds.),

American Chemical Soe. Symp., Series No. 421, Washington,DC5USA

9Simpson (1998) Down to Earth 53(l):26-35.

10Bruniard (2001) Inheritance of imidazolinone resistance,characterization of cross-resistance pattern, and identification of molecularmarkers in sunflower (Helianthus annuus L.). Ph.D. Thesis, North DakotaState University, Fargo, ND5 USA, pp 1-78.

A presente invenção descreve a seqüência de aminoácidos deuma proteína AHASLl de arroz resistente a herbicida com a substituição deAla179 por Val (SEQ ID NO:2) e a seqüências de polinucleotídeos codificandoesta AHASLl resistente a herbicida (SEQ ID NOS: 1 e 3).

12Chang and Duggleby (1998) Bioehem.l 333:765-777.

13Lee et ai. (1999) FEBSLett 452:341-345.

Todas as publicações e pedidos de patente mencionados norelatório são indicativos do nível daqueles versados na arte ao qual estainvenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patente são neste lugarincorporadas por referência no mesmo grau que se cada publicação ou pedidode patente individual fosse especificamente e individualmente indicado paraser incorporado por referência.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algumdetalhe como forma de ilustração e exemplo para propósitos de claridade deentendimento, será óbvio que certas mudanças e modificações podem serpraticadas dentro do escopo das reivindicações anexadas.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Instituto Nacional de Tecnologia AgropecuáriaLivore, BlasPrina, Alberto RaulSingh, BijayAscenzi, RobertWhitt, Sherry R.

<120> Plantas de arroz resistentes a herbicida, polinucleotideoscodificando proteínas de subunidade grande de acetohidroxiácido sintaseresistentes a herbicida, e métodos de uso

<130> 038867/306618

<150> 60/657.968<151> 2005-03-02

<160> 18

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 1961

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<220>

<221> CDS

<222> (7)...(1938)

<400> 1

cccacc atg gct acg acc gcc gcg gcc gcg gcc gcc acc ttg tcc gcc 48Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Leu Ser Ala1 5 10

gcc gcg acg gcc aag acc ggc cgt aag aac cac cag cga cac cac gtc 96Ala Ala Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val15 20 25 30

ttt ccc gct cga ggc cgg gtg ggg gcg gcg gcg gtc agg tgc tcg gcg 144Phe Pro Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala35 40 45

gtg tcc ccg gtc acc ccg ccg tcc ccg gcg ccg ccg gcc acg ccg ctc 192Val Ser Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu50 55 60

cgg ccg tgg ggg ccg gcc gag ccc cgc aag ggc gcg gac ate ctc gtg 240Arg Pro Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val65 70 75

gag gcg ctg gag cgg tgc ggc gtc age gac gtg ttc gcc tac ccg ggc 288Glu Ala Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly80 85 90

ggc gcg tcc atg gag ate cac cag gcg ctg acg cgc tcc ccg gtc ate 336Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile95 100 105 110

acc aac cac ctc ttc cgc cac gag cag ggc gag gcg ttc gcg gcg tcc 384Thr Asn His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser115 120 125

ggg tac gcg cgc gcg tcc ggc cgc gtc ggg gtc tgc gtc gcc acc tcc 432Gly Tyr Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser130 135 140

ggc ccG ggg gca acc aac ctc gtg tcc gcg ctc gcc gac gcg ctg ctc 480Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu145 150 155

gac tcc gtc ccg atg gtc gcc ate acg ggc cag gtc ccc cgc cgc atg 528Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met160 165 170

ate ggc acc gac gtc ttc cag gag acg ccc ata gtc gag gtc acc cgc 576Ile Gly Thr Asp Val Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg175 180 185 190

tcc ate acc aag cac aat tac ctt gtc ctt gat gtg gag gac ate ccc 624Ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro195 200 205

cgc gtc ata cag gaa gcc ttc ttc ctc gcg tcc tcg ggc cgt cct ggc 672Arg Val Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly210 215 220

ccg gtg ctg gtc gac ate ccc aag gac ate cag cag cag atg gct gtg 720Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val225 230 235

cca gtc tgg gac acc tcg atg aat cta ccg ggg tac att gca cgc ctg 768Pro Val Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu240 245 250

ccc aag cca ccc gcg aca gaa ttg ctt gag cag gtc ttg cgt ctg gtt 816Pro Lys Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val255 260 265 270

ggc gag tca cgg cgc ccg att ctc tat gtc ggt ggt ggc tgc tet gca 864Gly Glu Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala275 280 285

tet ggt gat gaa ttg cgc cgg ttt gtt gag ctg acc ggc ate cca gtt 912Ser Gly Asp Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val290 295 300

aca acc act ctg atg ggc ctc ggc aat ttc ccc agt gat gat ccg ttg 960Thr Thr Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu305 310 315

tcc ctg cgc atg ctt ggg atg cat ggc acg gtg tac gca aat tat gcg 1008Ser Leu Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala320 325 330

gtg gat aag gct gac ctg ttg ctt gca ttt ggc gtg cgg ttt gat gat 1056Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp335 340 345 350

cgt gtg aca ggg aaa att gag gct ttt gca age agg gcc aag att gtg 1104Arg Val Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val355 360 365

cac att gac att gat cca gcg gag att gga aag aac aag caa cca cat 1152His Ile Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His370 375 380

gtg tca att tgc gca gat gtt aag ctt gct tta cag ggc ttg aat gct 1200Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala385 390 395

ctg cta gac cag age aca aca aag aca agt tet gat ttt agt gcg tgg 1248Leu Leu Asp Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp400 405 410

cac aat gag ttg gac cag cag aag agg gag ttt cct ctg ggg tac aag 1296His Asn Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys415 420 425 430

act ttt ggt gaa gag ate cca ccg caa tat gct att cag gtg ctg gat 1344Thr Phe Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp435 440 445

gag ctg acg aaa ggg gag gca ate ate gct act ggt gtt gga cag cac 1392Glu Leu Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His450 455 460

cag atg tgg gcg gca caa tat tac acc tac aag cgg cca cgg cag tgg 1440Gln Met Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp465 470 475

ctg tet tcg gct ggt ctg ggc gca atg gga ttt ggg ctg cct gct gca 1488Leu Ser Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala480 485 490

gct ggt gct tet gtg gct aac cca ggt gtc aca gtt gtt gat att gat 1536Ala Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp495 500 505 510

ggg gat ggt age ttc ctc atg aac att cag gag ttg gca ttg ate cgc 1584Gly Asp Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg515 520 525

att gag aac ctc ccg gtg aag gtg atg gtg ttg aac aac caa cat ttg 1632Ile Glu Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu530 535 540

ggt atg gtt gtg caa tgg gag gat agg ttt tac aag gca aat agg gcg 1680Gly Met Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala545 550 555

cat aca tac ttg ggc aac cca gaa tgt gag agt gag ata tat cca gat 1728His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp560 565 570

ttt gtg act att gct aaa ggg ttc aat att cct gca gtc cgt gta aca 1776Phe Val Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr575 580 585 590

aag aag agt gaa gtc cgt gcc gcc ate aag aag atg ctc gat acc cca 1824Lys Lys Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Asp Thr Pro595 600 605

ggg cca tac ttg ttg gat ate ate gtc cca cac cag gag cat gtg ctg 1872Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu610 615 620cct atg ate cca agt ggg ggc gea ttc aag gac atg ate ctg gat ggt 1920Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly625 630 635

gat ggc agg act gtg tat taatctataa tctgtatgtt ggc 1961

Asp Gly Arg Thr Val Tyr640

<210> 2<211> 644<212> PRT

<213> Oryza sativa<400> 2

Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Leu Ser Ala Ala Ala

15 10 15

Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Phe Pro

20 25 30

Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser

35 40 45

Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro

50 55 60

Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala65 70 75 80

Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala

85 90 95

Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn

100 105 110

His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr

115 120 125

Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro

130 135 140

Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser145 150 155 160

Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly

165 170 175

Thr Asp Val Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile

180 185 190

Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val

195 200 205

Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val

210 215 220

Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val225 230 235 240

Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys

245 250 255

Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu

260 265 270

Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly

275 280 285

Asp Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr

290 295 300

Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu305 310 315 320

Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp

325 330 335

Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val

340 345 350

Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile

355 360 365

Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser370 375 380Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu385 390 395 400

Asp Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn

405 410 415

Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe

420 425 430

Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu

435 440 445

Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met

450 455 460

Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser465 470 475 480

Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly

485 490 495

Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp

500 505 510

Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu

515 520 525

Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met

530 535 540

Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr545 550 555 560

Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val

565 570 575

Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys

580 585 590

Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro

595 600 605

Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met

610 615 620

Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly625 630 635 640

Arg Thr Val Tyr

<210> 3<211> 1932<212> DNA<213> Oryza sativa

<400> 3

atggctacga ccgccgcggc cgcggccgccggccgtaaga accaccagcg acaccacgtcgcggtcaggt gctcggcggt gtccccggtcccgctccggc cgtgggggcc ggccgagcccctggagcggt gcggcgtcag cgacgtgttccaccaggcgc tgacgcgctc cccggtcatcgaggcgttcg cggcgtccgg gtacgcgcgcacctccggcc ccggggcaac caacctcgtggtcccgatgg tcgccatcac gggccaggtccaggagacgc ccatagtcga ggtcacccgcgatgtggagg acatcccccg cgtcatacagcctggcccgg tgctggtcga catccccaagtgggacacct cgatgaatct accggggtacgaattgcttg agcaggtctt gcgtctggttggtggtggct gctctgcatc tggtgatgaaccagttacaa ccactctgat gggcctcggccgcatgcttg ggatgcatgg cacggtgtacttgcttgcat ttggcgtgcg gtttgatgatagcagggcca agattgtgca cattgacattccacatgtgt caatttgcgc agatgttaaggaccagagca caacaaagac aagttctgat

accttgtccg ccgccgcgac ggccaagacc 60tttcccgctc gaggccgggt gggggcggcg 120accccgccgt ccccggcgcc gccggccacg 180cgcaagggcg cggacatcct cgtggaggcg 240gcctacccgg gcggcgcgtc catggagatc 300accaaccacc tcttccgcca cgagcagggc 360gcgtccggcc gcgtcggggt ctgcgtcgcc 420tccgcgctcg ccgacgcgct gctcgactcc 480ccccgccgca tgatcggcac cgacgtcttc 540tccatcacca agcacaatta ccttgtcctt 600gaagccttct tcctcgcgtc ctcgggccgt 660gacatccagc agcagatggc tgtgccagtc 720attgcacgcc tgcccaagcc acccgcgaca 780ggcgagtcac ggcgcccgat tctctatgtc 840ttgcgccggt ttgttgagct gaccggcatc 900aatttcccca gtgatgatcc gttgtccctg 960gcaaattatg cggtggataa ggctgacctg 1020cgtgtgacag ggaaaattga ggcttttgca 1080gatccagcgg agattggaaa gaacaagcaa 1140cttgctttac agggcttgaa tgctctgcta 1200tttagtgcgt ggcacaatga gttggaccag 1260cagaagaggg agtttcctct ggggtacaaggctattcagg tgctggatga gctgacgaaacagcaccaga tgtgggcggc acaatattactcggctggtc tgggcgcaat gggatttgggaacccaggtg tcacagttgt tgatattgatgagttggcat tgatccgcat tgagaacctccatttgggta tggttgtgca atgggaggattacttgggca acccagaatg tgagagtgaggggttcaata ttcctgcagt ccgtgtaacaaagatgctcg ataocccagg gccatacttggtgctgccta tgatcccaag tgggggcgcaaggactgtgt at

acttttggtg aagagatccc accgcaatat 1320ggggaggcaa tcatcgctac tggtgttgga 1380acctacaagc ggccacggca gtggctgtct 1440ctgcctgctg cagctggtgc ttctgtggct 1500ggggatggta gcttcctcat gaacattcag 1560ccggtgaagg tgatggtgtt gaacaaccaa 1620aggttttaca aggcaaatag ggcgcataca 1680atatatccag attttgtgac tattgctaaa 1740aagaagagtg aagtccgtgc cgccatcaag 1800ttggatatca tcgtcccaca ccaggagcat 1860ttcaaggaca tgatcctgga tggtgatggc 1920

1932

<210> 4<211> 19<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação por PCR e seqüenciamento U136851<400> 4

gacatatggg gcccactgt 19

<210> 5<211> 19<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> iniciador de amplificação por PCR e seqüenciamento L789<400> 5

gtagattcat cgaggtgtc 19

<210> 6<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação por PCR e seqüenciamento U642<400> 6

gtccttgatg tggaggacat 20

<210> 7<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação por PCR e seqüenciamento L1369<400> 7

catattgcgg tgggatctct 2 0

<210> 8<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220><223> iniciador de amplificação por PCR e sequenciamento U1229<400> 8

gggcttgaat gctctgctac 20

<210> 9<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação por PCR e seqüenciamento L1742<400> 9

cgggttgccc aagtatgtat 20

<210> 10<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação por PCR e sequenciamento Ul633<400> 10

acctccctgt gaaggtgatg 20

<210> 11<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação por PCR e sequenciamento L2155<400> 11

aggattacca tgccaagcac 20

<210> 12<211> 18<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação por PCR e sequenciamento U037<400> 12

caccacccac catggcta 18

<210> 13<211> 18<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<22 0>

<223> iniciador de amplificação por PCR e sequenciamento U114<400> 13

gtaagaacca ccagcgac 18

<210> 14<211> 19<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação por PCR e seqüenciamento U1109<400> 14

<210> 15<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação por PCR e seqüenciamento Ull66<400> 15

gggaaaattg aggcttttgc a 21

<210> 16<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação por PCR e seqüenciamento L1299

<210> 17<211> 19<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação por PCR e seqüenciamento U1721<400> 17

gcatacatac ttgggcaac 19

<210> 18<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação por PCR e seqüenciamento L2054

gtggataagg ctgacctgt

19

<400> 16

ctcattgtgc catgcactaa

20

<400> 18

cataccactc tttatgggtc

20

Claims (83)

1. Planta de arroz, caracterizada pelo fato de compreender emseu genoma pelo menos uma cópia de um polinucleotídeo de subunidadegrande de acetohidroxiácido sintase (AHASLl) de arroz que codifica umaproteína AHASLl resistente a herbicida, dita proteína AHASLl resistente aherbicida compreendendo um aspartato ou valina em posição de aminoácido179 ou posição equivalente, em que dita planta tem resistência aumentadapara pelo menos um herbicida ser comparada a uma planta de arroz tiposelvagem.

2. Planta de arroz de acordo com reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que dita proteína AHASLl resistente a herbicida compreendeuma valina em posição de aminoácido 179 ou posição equivalente.

3. Planta de arroz de acordo com reivindicação 1 ou 2,caracterizada pelo fato de que dita proteína AHASLl resistente a herbicidacompreende a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2.

4. Planta de arroz de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que dito polinucleotídeoAHASLl de arroz compreende a seqüência de nucleotídeos estabelecida naSEQ ID NO: 1 ou 3.

5. Planta de arroz de acordo com reivindicação 1 ou 2,caracterizada pelo fato de que dita proteína AHASLl resistente a herbicidacompreende adicionalmente pelo menos um membro selecionado a partir dogrupo consistindo de:(a) uma treonina em posição de aminoácido 96 ou posiçãoequivalente;(b) uma alanina, treonina, histidina, leucina, arginina,isoleucina, glutamina, ou serina em posição de aminoácido 171 ou posiçãoequivalente;(c) uma leucina em posição de aminoácido 548 ou posiçãoequivalente; e(d) uma asparagina, treonina, ou fenilalanina em posição deaminoácido 627 ou posição equivalente,

6. Planta de arroz de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que dita planta é transgênica.

7. Planta de arroz de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que dita planta é nãotransgênica.

8. Semente da planta de arroz como definida em qualquer umadas reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que dita sementecompreende em seu genoma pelo menos uma cópia de dito polinucleotídeoAHASL1.

9. Planta de arroz, caracterizada pelo fato de compreender ascaracterísticas de resistência a herbicida da planta de arroz com Número deAcesso de NCIMB, NCIMB 41262.

10. Planta de arroz de acordo com reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que dita planta de arroz:(a) tem Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262;(b) é uma progenia da planta com Número de Acesso deNCIMB, NCIMB 41262;(c) é um mutante, recombinante, ou um derivadogeneticamente modificado da planta com Número de Acesso de NCIMB,NCIMB 41262, ou de qualquer progenia da planta com Número de Acesso deNCIMB, NCIMB 41262; ou(d) é uma progenia de pelo menos uma das plantas de (a)-(c).

11. Planta de arroz de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que dita planta temresistência aumentada para pelo menos um herbicida selecionado a partir dogrupo consistindo de herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfoniluréia,herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de pirimidiniloxibenzoato, eherbicidas de sulfonilamino-carboniltriazolinona.

12. Planta de arroz de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que dita planta é transgênica.

13. Planta de arroz de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ali, caracterizada pelo fato de que dita planta é nãotransgênica.

14. Semente da planta de arroz como definida em qualqueruma das reivindicações 9 a 13, caracterizada pelo fato de que dita sementecompreende as características de resistência a herbicida da planta de arrozcom Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262.

15. Método para controlar ervas daninhas na vizinhança deuma planta de arroz, caracterizado pelo fato de compreender aplicar umaquantidade efetiva de um herbicida de imidazolinona, um herbicida desulfoniluréia, um herbicida de triazolopirimidina, um herbicida depirimidiniloxibenzoato, e um herbicida de sulfonilamino-carboniltriazolinona,ou mistura destes às ervas daninhas e à planta de arroz, em que dita planta dearroz é selecionada a partir do grupo consistindo de:(a) uma planta de arroz compreendendo em seu genoma pelomenos uma cópia de um polinucleotídeo AHASLl que codifica uma proteínaAHASLl resistente a herbicida, dita proteína AHASLl resistente a herbicidacompreendendo um aspartato ou valina em posição de aminoácido 179 ouposição equivalente, em que dita planta tem resistência aumentada para pelomenos um herbicida se comparada a uma planta de arroz tipo selvagem;(b) uma planta de arroz compreendendo as características deresistência a herbicida da planta de arroz com Número de Acesso de NCIMB,NCIMB 41262;(c) a planta de arroz com Número de Acesso de NCIMB,NCIMB 41262;(d) uma planta de arroz que é uma progenia da planta comNúmero de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262, dita planta de arrozcompreendendo as características de resistência a herbicida da planta de arrozcom Número de Acesso de NCIMB, NCIMB 41262;(e) é um mutante, recombinante, ou um derivadogeneticamente modificado da planta com Número de Acesso de NCIMB,NCIMB 41262, ou de qualquer progenia da planta com Número de Acesso deNCIMB, NCIMB 41262, dita planta de arroz compreendendo ascaracterísticas de resistência a herbicida da planta de arroz com Número deAcesso de NCIMB, NCIMB 41262; e(f) uma planta de arroz que é uma progenia de pelo menos umadas plantas de arroz de (b)-(e), dita planta de arroz compreendendo ascaracterísticas de resistência a herbicida da planta de arroz com Número deAcesso de NCIMB, NCIMB 41262.

16. Método de acordo com reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que dito herbicida de imidazolinona é selecionado a partir dogrupo consistindo de: ácido [2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-]imidiazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil)-4-metil-5 -oxo-2-imidazolin-2-il)-3 -quinolinacarboxílico, ácido [5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-]5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin--2-i 1 )-5-(metoximetil)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico, e uma mistura de metil 6-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato, metil [2-(4-] isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin2-il)-p-toluato, e mistura destes.

17. Método de acordo com reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que dito herbicida de sulfoniluréia é selecionado a partir do grupoconsistindo de: clorsulfuron, metsulfuron metil, sulfometuron metil,clorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulfuron metil,nicosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, triflusulfuron metil,triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron,imazosulfuron, pirazosulfuron etil, halosulfuron, e misturas dos mesmos.

18. Molécula de polinucleotídeo isolada, caracterizada pelofato de compreender uma seqüência de nucleotídeos selecionada a partir dogrupo consistindo de:(a) a seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1ou 3;(b) uma seqüência de nucleotídeos codificando a seqüência deaminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2;(c) uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteínavariante compreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida, ditaproteína variante compreendendo adicionalmente a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO:2 com pelo menos uma substituição de aminoácidoselecionada a partir do grupo consistindo de (i) a alanina em posição deaminoácido 96 ou posição equivalente é substituída com treonina, (ii) aprolina em posição de aminoácido 171 ou posição equivalente é substituídacom alanina, treonina, histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina, ouserina, (iii) o triptofano em posição de aminoácido 548 ou posição equivalenteé substituído com leucina, e (iv) a serina em posição de aminoácido 627 ouposição equivalente é substituída com asparagina, treonina, ou fenilalanina;(d) um fragmento da seqüência de nucleotídeos de qualqueruma de (a) a (c), em que dito fragmento codifica um polipeptídeo, quecompreende um aspartato ou valina em posição de aminoácido 179 ouposição equivalente e atividade de AHAS resistente a herbicida; e(e) uma seqüência de nucleotídeos que é completamentecomplementar a pelo menos uma seqüência de nucleotídeos selecionada apartir do grupo consistindo das seqüências de nucleotídeos estabelecidas em(a)-(d).

19. Cassete de expressão, caracterizado por compreender umpromotor operavelmente ligado à molécula de polinucleotídeo como definidana reivindicação 18.

20. Cassete de expressão de acordo com reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que dito promotor é capaz de acionar expressão degene em uma bactéria, uma célula fiíngica, uma célula animal, ou uma célulavegetal.

21. Célula hospedeira não humana, caracterizada por sertransformada com o cassete de expressão como definido na reivindicação 19ou 20.

22. Célula hospedeira de acordo com reivindicação 21,caracterizada pelo fato de que dita célula hospedeira é selecionada a partir dogrupo consistindo de uma bactéria, uma célula fungica, uma célula animal, euma célula vegetal.

23. Vetor de transformação, caracterizado pelo fato decompreender um gene de interesse e um gene marcador selecionável, ditogene marcador selecionável compreendendo um promotor operavelmenteligado a uma seqüência de nucleotídeos, em que dito promotor acionaexpressão em uma célula hospedeira e dita seqüência de nucleotídeos éselecionada a partir do grupo consistindo de:(a) a seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 3;(b) uma seqüência de nucleotídeos codificando a seqüência deaminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2;(c) uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteínavariante compreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida, ditaproteína variante compreendendo adicionalmente a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO:2 com pelo menos uma substituição de aminoácidoselecionada a partir do grupo consistindo de (i) a alanina em posição deaminoácido 96 ou posição equivalente é substituída com treonina, (ii) aprolina em posição de aminoácido 171 ou posição equivalente é substituídacom alanina, treonina, histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina, ouserina, (iii) o triptofano em posição de aminoácido 548 ou posição equivalenteé substituído com leucina, e (iv) a serina em posição de aminoácido 627 ouposição equivalente é substituída com asparagina, treonina, ou fenilalanina; e(d) um fragmento da seqüência de nucleotídeos de qualqueruma de (a) a (c), em que dito fragmento codifica um polipeptídeo, quecompreende um aspartato ou valina em posição de aminoácido 179 ouposição equivalente e atividade de AHAS resistente a herbicida.

24. Vetor de transformação de acordo com reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que dito promotor é expressável em uma célulavegetal.

25. Vetor de transformação de acordo com reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que dito promotor é um promotor constitutivo.

26. Vetor de transformação de acordo com qualquer uma dasreivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que dito gene marcadorselecionável compreende adicionalmente uma seqüência tendo como alvocloroplasto operavelmente ligada.

27. Vetor de transformação de acordo com reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que dito promotor é expressável em uma bactériaou uma levedura.

28. Célula hospedeira não humana, caracterizada pelo fato decompreender o vetor de transformação como definido em qualquer uma dasreivindicações 23 a 27.

29. Planta transformada, caracterizada pelo fato decompreender estavelmente incorporado em seu genoma um construto depolinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeosoperavelmente ligada a um promotor que aciona expressão em uma célulavegetal, em que dita seqüência de nucleotídeos é selecionada a partir do grupoconsistindo de:(a) a seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 3;(b) uma seqüência de nucleotídeos codificando a seqüência deaminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2;(c) uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteínavariante compreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida, ditaproteína variante compreendendo adicionalmente a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO:2 com pelo menos uma substituição de aminoácidoselecionada a partir do grupo consistindo de (i) a alanina em posição deaminoácido 96 ou posição equivalente é substituída com treonina, (ii) aprolina em posição de aminoácido 171 ou posição equivalente é substituídacom alanina, treonina, histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina, ouserina, (iii) o triptofano em posição de aminoácido 548 ou posição equivalenteé substituído com leucina, e (iv) a serina em posição de aminoácido 627 ouposição equivalente é substituída com asparagina, treonina, ou fenilalanina;(d) um fragmento da seqüência de nucleotídeos de qualqueruma de (a) a (c), em que dito fragmento codifica um polipeptídeo, quecompreende um aspartato ou valina em posição de aminoácido 179 ouposição equivalente e atividade de AHAS resistente a herbicida; e(e) uma seqüência de nucleotídeos que é completamentecomplementar a pelo menos uma seqüência de nucleotídeos selecionada apartir do grupo consistindo das seqüências de nucleotídeos estabelecidas em(a)-(d).

30. Planta transformada de acordo com reivindicação 29,caracterizada pelo fato de que dito promotor é selecionado a partir do grupoconsistindo de promotores constitutivos e promotores preferidos para tecidos.

31. Planta transformada de acordo com reivindicação 29 ou 30,caracterizada pelo fato de que dito construto de polinucleotídeo compreendeadicionalmente uma seqüência tendo como alvo cloroplasto operavelmenteligada.

32. Planta transformada de acordo com qualquer uma dasreivindicações 29 a 31, caracterizada pelo fato de que a atividade de AHAS dedita planta transformada é aumentada em relação a uma planta nãotransformada.

33. Planta transformada de acordo com qualquer uma dasreivindicações 29 a 32, caracterizada pelo fato de que a resistência de ditaplanta transformada para pelo menos um herbicida é aumentada quandocomparada a uma planta não transformada.

34. Planta transformada de acordo com reivindicação 33,caracterizada pelo fato de que dito herbicida é um herbicida de imidazolinona.

35. Planta transformada de acordo com reivindicação 33,caracterizada pelo fato de que dito herbicida de imidazolinona é selecionado apartir do grupo consistindo de: ácido [2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-]imidiazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil)-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3-quinolinacarboxílico, ácido [5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-]5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-i 1 )-5-(metoximetil)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico, e uma mistura de metil 6-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato e metil [2-(4-] isopropil--4-metil-5-oxo-2-imidazolin2-il)-p-toluato.

36. Planta transformada de acordo com reivindicação 33,caracterizada pelo fato de que dito herbicida é um herbicida de sulfoniluréia.

37. Planta transformada de acordo com reivindicação 33,caracterizada pelo fato de que dito herbicida de sulfoniluréia é selecionado apartir do grupo consistindo de: clorsulfuron, metsulfuron metil, sulfometuronmetil, clorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulfuron metil,nicosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, triflusulfuron metil,triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron,imazosulfuron, pirazosulfuron etil, halosulfuron, e misturas dos mesmos.

38. Planta transformada de acordo com qualquer uma dasreivindicações 29 a 37, caracterizada pelo fato de que dita planta transformadaé uma dicotiledônea ou uma monocotiledônea.

39. Planta transformada de acordo com reivindicação 38,caracterizada pelo fato de que dita dicotiledônea é selecionada a partir dogrupo consistindo de girassol, soja, algodão, Brassica spp., tabaco, batata,beterraba açucareira, alfafa, açafrão, e amendoim.

40. Planta transformada de acordo com reivindicação 38,caracterizada pelo fato de que dita monocotiledônea é selecionada a partir dogrupo consistindo de trigo, arroz, cevada, centeio, aveia, triticale, milheto, esorgo.

41. Semente transformada, caracterizada pelo fato de ser daplanta transformada como definida em qualquer uma das reivindicações 29 a 40.

42. Célula vegetal transformada, caracterizada pelo fato decompreender estavelmente incorporado em seu genoma um construto depolinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeosoperavelmente ligada a um promotor que aciona expressão em uma célulavegetal, em que dita seqüência de nucleotídeos é selecionada a partir do grupoconsistindo de:(a) a seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1ou 3;(b) uma seqüência de nucleotídeos codificando a seqüência deaminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2;(c) uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteínavariante compreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida, ditaproteína variante compreendendo adicionalmente a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO:2 com pelo menos uma substituição de aminoácidoselecionada a partir do grupo consistindo de (i) a alanina em posição deaminoácido 96 ou posição equivalente é substituída com treonina, (ii) aprolina em posição de aminoácido 171 ou posição equivalente é substituídacom alanina, treonina, histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina, ouserina, (iii) o triptofano em posição de aminoácido 548 ou posição equivalenteé substituído com leucina, e (iv) a serina em posição de aminoácido 627 ouposição equivalente é substituída com asparagina, treonina, ou fenilalanina;(d) um fragmento da seqüência de nucleotídeos de qualqueruma de (a) a (c), em que dito fragmento codifica um polipeptídeo, quecompreende um aspartato ou valina em posição de aminoácido 179 ouposição equivalente e atividade de AHAS resistente a herbicida; e(e) uma seqüência de nucleotídeos que é completamentecomplementar a pelo menos uma seqüência de nucleotídeos selecionada apartir do grupo consistindo das seqüências de nucleotídeos estabelecidas em(a)-(d).

43. Método para aumentar atividade de AHAS resistente aherbicida em uma planta, caracterizado pelo fato de compreender transformaruma célula vegetal com um construto de polinucleotídeo compreendendo umaseqüência de nucleotídeos operavelmente ligada a um promotor que acionaexpressão em uma célula vegetal e regenerar uma planta transformada a partirde dita célula vegetal transformada, em que dita seqüência de nucleotídeos éselecionada a partir do grupo consistindo de:(a) a seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 3;(b) uma seqüência de nucleotídeos codificando a seqüência deaminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2;(c) uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteínavariante compreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida, ditaproteína variante compreendendo adicionalmente a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO:2 com pelo menos uma substituição de aminoácidoselecionada a partir do grupo consistindo de (i) a alanina em posição deaminoácido 96 ou posição equivalente é substituída com treonina, (ii) aprolina em posição de aminoácido 171 ou posição equivalente é substituídacom alanina, treonina, histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina, ouserina, (iii) o triptofano em posição de aminoácido 548 ou posição equivalenteé substituído com leucina, e (iv) a serina em posição de aminoácido 627 ouposição equivalente é substituída com asparagina, treonina, ou fenilalanina; e(d) um fragmento da seqüência de nucleotídeos de qualqueruma de (a) a (c), em que dito fragmento codifica um polipeptídeo, quecompreende um aspartato ou valina em posição de aminoácido 179 ouposição equivalente e atividade de AHAS resistente a herbicida;em que a atividade de AHAS resistente a herbicida éaumentada em dita planta ou pelo menos uma parte desta, quando comparadaa uma planta não transformada.

44. Método para produzir uma planta resistente a herbicida,caracterizado pelo fato de compreender transformar uma célula vegetal comum construto de polinucleotídeo compreendendo uma seqüência denucleotídeos operavelmente ligada a um promotor que aciona expressão emuma célula vegetal e regenerar uma planta transformada a partir de dita célulavegetal transformada, em que dita seqüência de nucleotídeos é selecionada apartir do grupo consistindo de:(a) a seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 3;(b) uma seqüência de nucleotídeos codificando a seqüência deaminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2;(c) uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteínavariante compreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida, ditaproteína variante compreendendo adicionalmente a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO:2 com pelo menos uma substituição de aminoácidoselecionada a partir do grupo consistindo de (i) a alanina em posição deaminoácido 96 ou posição equivalente é substituída com treonina, (ii) aprolina em posição de aminoácido 171 ou posição equivalente é substituídacom alanina, treonina, histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina, ouserina, (iii) o triptofano em posição de aminoácido 548 ou posição equivalenteé substituído com leucina, e (iv) a serina em posição de aminoácido 627 ouposição equivalente é substituída com asparagina, treonina, ou fenilalanina; e(d) um fragmento da seqüência de nucleotídeos de qualqueruma de (a) a (c), em que dito fragmento codifica um polipeptídeo, quecompreende um aspartato ou valina em posição de aminoácido 179 ouposição equivalente e atividade de AHAS resistente a herbicida;em que dita planta transformada tem resistência aumentadapara pelo menos um herbicida em relação à resistência de uma planta nãotransformada para dito herbicida.

45. Método de acordo com reivindicação 44, caracterizadopelo fato de que dito promotor é selecionado a partir do grupo consistindo depromotores constitutivos e promotores preferidos para tecidos.

46. Método de acordo com reivindicação 44 ou 45,caracterizado pelo fato de que dito construto de polinucleotídeo compreendeadicionalmente uma seqüência tendo como alvo cloroplasto operavelmenteligada.

47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 46, caracterizado pelo fato de que a atividade de AHAS de dita plantatransformada é aumentada em relação a uma planta não transformada.

48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 47, caracterizado pelo fato de que dito herbicida é um herbicida deimidazolinona.

49. Método de acordo com reivindicação 48, caracterizadopelo fato de que dito herbicida de imidazolinona é selecionado a partir dogrupo consistindo de: ácido [2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-]imidiazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil)-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3-quinolinacarboxílico, ácido [5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-]5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin--2-i 1 )-5-(metoximetil)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico, e uma mistura de metil 6-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato e metil [2-(4-] isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin2-il)-p-toluato.

50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-44 a 47, caracterizado pelo fato de que dito herbicida é um herbicida desulfoniluréia.

51. Método de acordo com reivindicação 50, caracterizadopelo fato de que dito herbicida de sulfoniluréia é selecionado a partir do grupoconsistindo de: clorsulfuron, metsulfuron metil, sulfometuron metil,clorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulfuron metil,nicosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, tríflusulfuron metil,triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron,imazosulfuron, pirazosulfuron etil, halosulfuron, e misturas dos mesmos.

52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-44 a 51, caracterizado pelo fato de que dita planta transformada é umadicotiledônea ou uma monocotiledônea.

53. Método de acordo com reivindicação 52, caracterizadopelo fato de que dita dicotiledônea é selecionada a partir do grupo consistindode girassol, soja, algodão, Brassica spp., tabaco, batata, beterraba açucareira,alfafa, açafrão, e amendoim.

54. Método de acordo com reivindicação 52, caracterizadopelo fato de que dita monocotiledônea é selecionada a partir do grupoconsistindo de trigo, arroz, cevada, centeio, aveia, triticale, milheto, e sorgo.

55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 54, caracterizado pelo fato de que dita célula vegetal compreenderesistência para pelo menos um herbicida, antes de dita etapa detransformação.

56. Método para aumentar tolerância a herbicida em umaplanta tolerante a herbicida, caracterizado pelo fato de compreender as etapasde transformar uma planta tolerante a herbicida com um construto depolinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeosoperavelmente ligada a um promotor que aciona expressão em uma célulavegetal e regenerar uma planta transformada a partir de dita célula vegetaltransformada, em que dita seqüência de nucleotídeos é selecionada a partir dogrupo consistindo de:(a) a seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 3;(b) uma seqüência de nucleotídeos codificando a seqüência deaminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2;(c) uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteínavariante compreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida, ditaproteína variante compreendendo adicionalmente a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO:2 com pelo menos uma substituição de aminoácidoselecionada a partir do grupo consistindo de (i) a alanina em posição deaminoácido 96 ou posição equivalente é substituída com treonina, (ii) aprolina em posição de aminoácido 171 ou posição equivalente é substituídacom alanina, treonina, histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina, ouserina, (iii) o triptofano em posição de aminoácido 548 ou posição equivalenteé substituído com leucina, e (iv) a serina em posição de aminoácido 627 ouposição equivalente é substituída com asparagina, treonina, ou fenilalanina; e(d) um fragmento da seqüência de nucleotídeos de qualqueruma de (a) a (c), em que dito fragmento codifica um polipeptídeo, quecompreende um aspartato ou valina em posição de aminoácido 179 ouposição equivalente e atividade de AHAS resistente a herbicida;em que a tolerância a herbicida de dita planta tolerante aherbicida é aumentada em dita planta quando comparada a uma plantatolerante a herbicida não transformada.

57. Método de acordo com reivindicação 56, caracterizadopelo fato de que dita planta tolerante a herbicida compreende uma proteínaAHASLl tolerante a herbicida, antes de dita etapa de transformação.

58. Método de acordo com reivindicação 56 ou 57,caracterizado pelo fato de que dita planta tolerante a herbicida não foigeneticamente modificada para expressar dita proteína AHASLl tolerante aherbicida.

59. Método de acordo com reivindicação 56 ou 57,caracterizado pelo fato de que dita planta tolerante a herbicida foigeneticamente modificada para expressar dita proteína AHASLl tolerante aherbicida.

60. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-56 a 59, caracterizado pelo fato de que dita planta tolerante a herbicida é umaplanta tolerante a imidazolinona, antes de dita etapa de transformação.

61. Método para selecionar para uma célula vegetaltransformada, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:transformar uma célula vegetal com o vetor de transformaçãovegetal,expor dita célula vegetal transformada a pelo menos umherbicida em uma concentração que inibe o crescimento de uma célulavegetal não transformada, eidentificar dita célula vegetal transformada por sua capacidadede crescer na presença de dito herbicida;em que dito vetor de transformação vegetal compreende umgene marcador selecionável compreendendo um promotor e uma seqüência denucleotídeos operavelmente ligada, dito promotor aciona expressão em umacélula vegetal, e dita seqüência de nucleotídeos é selecionada a partir dogrupo consistindo de:(a) a seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1ou 3;(b) uma seqüência de nucleotídeos codificando a seqüência deaminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2;(c) uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteínavariante compreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida, ditaproteína variante compreendendo adicionalmente a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO:2 com pelo menos uma substituição de aminoácidoselecionada a partir do grupo consistindo de (i) a alanina em posição deaminoácido 96 ou posição equivalente é substituída com treonina, (ii) aprolina em posição de aminoácido 171 ou posição equivalente é substituídacom alanina, treonina, histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina, ouserina, (iii) o triptofano em posição de aminoácido 548 ou posição equivalenteé substituído com leucina, e (iv) a serina em posição de aminoácido 627 ouposição equivalente é substituída com asparagina, treonina, ou fenilalanina; e(d) um fragmento da seqüência de nucleotídeos de qualqueruma de (a) a (c), em que dito fragmento codifica um polipeptídeo, quecompreende um aspartato ou valina em posição de aminoácido 179 ouposição equivalente e atividade de AHAS resistente a herbicida.

62. Método de acordo com reivindicação 61, caracterizadopelo fato de que dito herbicida é um herbicida de imidazolinona, um herbicidade sulfoniluréia, um herbicida de triazolopirimidina, um herbicida depirimidiniloxibenzoato, e um herbicida de sulfonilamino-carboniltriazolinona,ou mistura destes.

63. Método de acordo com reivindicação 61 ou 62,caracterizado pelo fato de que dito vetor de transformação vegetalcompreende adicionalmente pelo menos um gene de interesse.

64. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-61 a 63, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de regeneraruma planta transformada a partir de dita célula vegetal transformada.

65. Método para controlar ervas daninhas na vizinhança deuma planta transformada, caracterizado pelo fato de compreender aplicar umaquantidade efetiva de um herbicida de imidazolinona, um herbicida desulfoniluréia, um herbicida de triazolopirimidina, um herbicida depirimidiniloxibenzoato, e um herbicida de sulfonilamino-carboniltriazolinona,ou mistura destes às ervas daninhas e à planta transformada, em que ditaplanta transformada tem resistência aumentada ao herbicida de imidazolinonase comparada a uma planta não transformada, e a planta transformadacompreende em seu genoma pelo menos um cassete de expressãocompreendendo uma seqüência de nucleotídeos operavelmente ligada a umpromotor que aciona expressão de gene em uma célula vegetal, dita seqüênciade nucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo de:(a) a seqüência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 3;(b) uma seqüência de nucleotídeos codificando a seqüência deaminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2;(c) uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteínavariante compreendendo atividade de AHAS resistente a herbicida, ditaproteína variante compreendendo adicionalmente a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO:2 com pelo menos uma substituição de aminoácidoselecionada a partir do grupo consistindo de (i) a alanina em posição deaminoácido 96 ou posição equivalente é substituída com treonina, (ii) aprolina em posição de aminoácido 171 ou posição equivalente é substituídacom alanina, treonina, histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina, ouserina, (iii) o triptofano em posição de aminoácido 548 ou posição equivalenteé substituído com leucina, e (iv) a serina em posição de aminoácido 627 ouposição equivalente é substituída com asparagina, treonina, ou fenilalanina; e(d) um fragmento da seqüência de nucleotídeos de qualqueruma de (a) a (c), em que dito fragmento codifica um polipeptídeo, quecompreende um aspartato ou valina em posição de aminoácido 179 ouposição equivalente e atividade de AHAS resistente a herbicida.

66. Método de acordo com reivindicação 65, caracterizadopelo fato de que dito herbicida de imidazolinona é selecionado a partir dogrupo consistindo de: ácido [2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-]imidiazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil)-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3-quinolinacarboxílico, ácido [5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-]5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin--2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico, e uma mistura de metil 6-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato e metil [2-(4-] isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin2-il)-p-toluato, e mistura destes.

67. Método de acordo com reivindicação 65, caracterizadopelo fato de que dito herbicida de sulfoniluréia é selecionado a partir do grupoconsistindo de: clorsulfuron, metsulfuron metil, sulfometuron metil,clorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulíuron metil,nicosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, triflusulfuron metil,triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron,imazosulfuron, pirazosulfuron etil, halosulfuron, e misturas dos mesmos.

68. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-65 a 67, caracterizado pelo fato de que dita planta é uma dicotiledônea ouuma monocotiledônea.

69. Método de acordo com reivindicação 68, caracterizadopelo fato de que dita dicotiledônea é selecionada a partir do grupo consistindode girassol, alfafa, Brassica, soja, algodão, açafrão, amendoim, tabaco, tomatee batata.

70. Método de acordo com reivindicação 68, caracterizadopelo fato de que dita monocotiledônea é selecionada a partir do grupoconsistindo de trigo, triticale, milho, arroz, sorgo, centeio, e milheto e cevada.

71. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato decompreender uma seqüência de aminoácidos selecionada a partir do grupoconsistindo de:(a) a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:2;(b) a seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência denucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 3;(c) uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 com pelomenos uma substituição de aminoácido selecionada a partir do grupoconsistindo de (i) a alanina em posição de aminoácido 96 ou posiçãoequivalente é substituída com treonina, (ii) a prolina em posição deaminoácido 171 ou posição equivalente é substituída com alanina, treonina,histidina, leucina, arginina, isoleucina, glutamina, ou serina, (iii) o triptofanoem posição de aminoácido 548 ou posição equivalente é substituído comleucina, e (iv) a serina em posição de aminoácido 627 ou posição equivalenteé substituída com asparagina, treonina, ou fenilalanina, em que ditopolipeptídeo compreende uma atividade de AHAS resistente a herbicida; e(d) um fragmento da seqüência de aminoácidos de qualqueruma de (a) a (c), em que dito fragmento compreende atividade de AHASresistente a herbicida e um aspartato ou valina em posição de aminoácido 179ou posição equivalente.

72. Método para produzir uma planta resistente a herbicida,caracterizado pelo fato de compreender cruzar uma primeira planta que éresistente a um herbicida com uma segunda planta que não é resistente aoherbicida, em que a primeira planta é a planta de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 7, 9 a 13, e 29 a 40.

73. Método de acordo com reivindicação 72, caracterizadopelo fato de compreender adicionalmente selecionar para uma planta deprogenia que é resistente ao herbicida.

74. Planta resistente a herbicida, caracterizada por serproduzida pelo método como definido na reivindicação 72 ou 73.

75. Semente da planta de acordo com reivindicação 74,caracterizada pelo fato de que dita semente compreende as características deresistência a herbicida da primeira planta.

76. Método para aumentar a resistência a herbicida de umaplanta, caracterizado pelo fato de compreender cruzar uma primeira plantacom uma segunda planta, em que a primeira planta é a planta como definidaem qualquer uma das reivindicações 1-7, 9-13, 29-40 e 74.

77. Método de acordo com reivindicação 76, caracterizadopelo fato de compreender adicionalmente selecionar para uma planta deprogenia que compreende resistência a herbicida aumentada quandocomparada à resistência a herbicida de dita segunda planta.

78. Planta, caracterizada por ser produzida pelo método comodefinido na reivindicação 76 ou 77.

79. Semente da planta como definida na reivindicação 78,caracterizada pelo fato de que dita semente compreende a resistência aherbicida aumentada.

80. Semente da planta de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 7, 9 a 13, 29 a 40, 74, e 78, caracterizada pelo fato de quedita semente é tratada com um herbicida inibindo AHAS.

81. Semente de acordo com reivindicação 81, caracterizadapelo fato de que dito herbicida inibindo AHAS é selecionado a partir do grupoconsistindo de um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia,um herbicida de triazolopirimidina, um herbicida de pirimidiniloxibenzoato, eum herbicida de sulfonilamino-carboniltriazolinona, ou mistura destes.

82. Método para combater vegetação indesejada, caracterizadopor compreender colocar em contato uma semente da planta como definidaem qualquer uma das reivindicações 1 a 7, 9a 13, 29 a 40, 74, e 78 antes desemeadura e/ou depois de pré-germinação com um herbicida inibindo AHAS.

83. Método de acordo com reivindicação 81, caracterizadopelo fato de que dito herbicida inibindo AHAS é selecionado a partir do grupoconsistindo de um herbicida de imidazolinona, um herbicida de sulfoniluréia,um herbicida de triazolopirimidina, um herbicida de pirimidiniloxibenzoato, eum herbicida de sulfonilamino-carboniltriazolinona, ou mistura destes.