KR20010022652A - 식물에서 국소적인 유전자변형을 유발하기 위한 혼성 이중나선올리고뉴클레오티드의 용도 - Google Patents

식물에서 국소적인 유전자변형을 유발하기 위한 혼성 이중나선올리고뉴클레오티드의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물세포에서 위치 특이적 유전자변형을 도입하는 25내지 30개 염기쌍의 이중나선 올리고뉴클레오티드의 용도와 관계한다. 올리고뉴클레오티드는 기계적(바이오리스틱)시스템에 의해 또는 식물 원형질체의 에렉트로포레이션에 의해 전달할 수 있다. 본 발명의 특정구체예에서, 본 발명은 산(acid) 인비타아제, UDP-글루코스 피로포스포리라제, 폴리페놀 옥시다제, O-메틸 트랜스퍼라제, 신나밀 알코올 탈수효소, etr-1또는 이의 상동체, ACC 합성효소, ACC 옥시다제를 인코드한 유전자상의 변형과 이런 유전자에서 격리된 점돌연변이를 갖는 식물에 관계한다.
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Description

식물에서 국소적인 유전자변형을 유발하기 위한 혼성 이중나선올리고뉴클레오티드의 용도{THE USE OF MIXED DUPLEX OLIGONUCLEOTIDES TO EFFECT LOCALIZED GENETIC CHANGES IN PLANTS}
2.1 MDON과 특정한 유전자변형을 유발하기 위한 이의 용도
혼합된 이중나선올리고뉴클레오티드(MDON)와 진핵세포에서 유전자변형을 유발하기 위한 이의 용도는 U.S 특허 5,565,350 내지 kmiec(Kmiec I)에 기술되어 있다. Kimed I은 두 가닥을 지닌 inter alia MDON을 기술하고 있는데, 여기서 제 1 가닥은 8개 이상의 RNA-유사 뉴클레오티드로 이루어지고, "삽입 뉴클레오티드로 불리는" 4내지 50개 DNA-유사 뉴클레오티드의 제 3 단편에 의해 분리되는 두 개의 단편으로 이루어진다. 제 1가닥의 뉴클레오티드는 제 2가닥의 DNA-유사 뉴클레오티드와 염기쌍을 이룬다. 제 1 및 제 2가닥은 단일 가닥의 뉴클레오티드에 의해 부가적으로 연결되어 제 1가닥과 제 2가닥은 단일 올리고뉴클레오티드 사슬의 일부가 된다. Kmiec I에서는 또한 표적유전자에 특정한 유전자변형을 도입하는 방법을 제사하고 있다. Kmiec I에 따르면, RNA 단편의 서열은 표적유전자의 제 1 및 제 2가닥의 서열과 상동하게, 즉, 동일하게 선별한다. 삽입된 DNA 단편의 서열은 "이질성 영역"으로 불리는 상이한 영역을 제외한 제 1 및 제 2 단편사이의 표적 유전자 서열과 동일하다. 이질성 영역은 삽입이나 결손을 유발하거나, 또는 표적 유전자의 서열과 잘못 짝지어진 한 두 개의 염기를 보유해 치환을 유발할 수도 있다. Kmiec I에 따르면, 표적유전자의 서열은 MDON의 서열과 상동하게 되도록 이질성영역에 의해 직접 변형된다. Kmiec I에서는 또한 리보즈 및 2'-오메틸리보즈(2'-메톡시리보즈)를 보유한 뉴클레오티드를 MDON에 사용할 수 있고 자연적으로-발생하는 데옥시리보즈를 보유한 뉴클레오티드를 DNA-유사 뉴클레오티드로 사용할 수 있다고 밝히고 있다.
미국 특허 출원 08/664,487(1996. 6. 17), 미국 특허 5,731, 181(Kmiec II)에서는 식물세포에서 유전자 변형을 유발하기 위한 MDON의 용도를 구체적으로 밝히고, 또한 특정한 표적유전자에서 유전자 변형을 유발하기 위해 사용할 수 있는 RNA-유사 및 DNA-유사 뉴클레오티드의 유사체와 유도체의 예를 제시하였다.
Yoon et al(1996, Proc. Natl. Acad. Sci.93:2071-2076)과 Colestratus et al(1996, SCIENCE 273:1336-1389)과 같은 과학 공개문에는 삽입 DNA 단편을 보유한 MDON의 용도가 공개되어 있다. 이런 과학 공개문에는 리포좀을 매개로 하여 전달하면 10개당 1개 세포의 비율로 돌연변이가 발생한다고 밝히고 있다. 하지만, MDON을 식물세포에서 유전자 변형을 유발하기 위해서 사용할 수 있다고 밝힌 문헌은 없다.
본 명세서에서는 MDON란 용어를 사용하는데, 이것은 널리 사용되고 있는 "키메라성 돌연변이 벡터". "키메라성 복구벡터", "키메라플라스트"와 동의어이다. 2.2 이종원성 식물세포와 이종원성 식물세포에서 식물의 발생
Kmiec I과 II에서 밝힌 MDON의 표적세포로의 전달을 위한 기술중에서, 식물세포에서 가장 널리 사용되고 있는 기술은 원형질체의 에렉트로포레이션이다. 원형질체 배양물에서 번식력 있는 식물의 재생은 쌍자엽식물군의 특정종(Nicotiana tobacum(tobacco))에서 알려지고 있다(미국 특허 5,231,019, Fromm,M.E.et al,.1988, Nature 312, 791, soybean variety Glycine max, WO 92/17598(Widholm,J.M)). 하지만 비-형질변형된 세포를 이용한 개개의 성공(Prioli, L.M.,et al.,Bio technology 7,589, Shillito, R.D.,et al., 1989, Bio technology 7, 581)에도 불구하고, 변형된 원형질체 배양물로부터 번식력 있는 단자엽 식물의 재생은 일상적 기술로는 얻을 수 없는 것으로 간주되고 있다. 빈번히, 단자엽 식물의 형질변환된 원형질체는 비-재생성 조직이 되거나 또는 조직이 재생된다 하더라도 생성된 식물은 번식력이 없었다.
킬로염기-크기의 플라스미드 DNA를 완전한 또는 약간 손상된 세포벽을 가진 식물세포에 도입하여 형질변환된 세포를 수득하는 기술이 개발되고 있다. 미국 특허 4,945,050, 5,100,792, 5,204,253은 플라스미드를 미세입자에 결부시켜 원형 식물세포로 플라스미드를 전달하는 것과 관계하는데, 이 세포에서 미세입자는 세포벽을 가로질러 탄도같이 움직인다(이후 "바이오리스틱하게 형질변환된" 세포). 가령, 미국 특허 5,489,520은 바이오리스틱하게 형질변환된 세포로부터 번식력이 있는 옥수수 식물을 재생하는 기술과 관계한다. 완전한 세포벽을 지닌 식물세포의 현탁액에 플라스미드 DNA를 도입하는 다른 기술은 실리콘 카바이드 섬유를 사용해 세포벽을 꿰뚫는 것이다(미국 특허 5,302,523( Coffee R.,과 Dunwell, J. M)).
복합성 세포벽을 지닌 옥수수 세포를 에렉트로포레이션하는 기술은 미국 특허 5,384,253(Krzyzek, laursen, P.C. Anderson)에 기술되어 있다. 이 기술에서는 실제 원형질체보다 번식할 수 있는 식물로 더 쉽게 재생되는 형질변환 세포를 만들기 위하여 엔도펙신 절단효소(E.C.3.2.1.15)와 엔도폴리갈락투로나제(E.C.4.2.2.3) 효소를 병용하여 사용한다. 하지만, 이 기술은 A188계통×B73계통을 교차시켜 얻은 F1세포계통에만 유용한 것으로 알려지고 있다.
본 발명의 요약
본 발명은 특히 식물세포에 유용한 MDON을 사용하는 신규한 방법을 제시한다.
본 발명의 한 특징은 MDON을 입자에 고착시키고, 이 입자가 세포벽을 통과한 후 세포내에서 MDON을 방출하여 식물세포의 표적유전자에서 돌연변이를 유발하도록 하는 것이다. 이런 기술에 의해 유도되는 돌연변이에는 적당한 조건하에서 돌연변이된 세포에 생장이점을 전달하는 돌연변이, 시각 검사에 의해 탐지될 수 있는 표현형을 야기하는 돌연변이가 있다. 이런 돌연변이들은 "선택성 돌연변이"로 칭한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에는 선택성 돌연변이를 제외한 돌연변이를 일정한 공정에 의해 표적유전자로 도입하는 방법이 포함되는데, 상기 공정은 식물세포에서 선택성 돌연변이를 유발하는 제 1 MDON과 비-선택성 돌연변이를 야기하는 제 2 MDON의 혼합물을 도입하는 단계로 이루어진다.
본 발명은 또한 종자를 생산하는 식물(이후, "번식력이 있는 식물"), 종자의 생산, 이런 번식력 있는 식물로부터 부가적인 식물을 얻기 위해서, 앞서 말한 본 발명의 구체예를 따라 돌연변이된 세포를 배양하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생산될 수 있고 신규한 특징을 지닌 번식력 있는 식물을 포함한다.
본 발명은 기존 식물계통의 계량을 위한 방법에 관계하고 또한 원하는 기질 가진 신규한 계통의 개발과 관계한다. 재조합 DNA 기술을 이용해 유전적으로 조작된 식물을 얻는 기존의 방법에서는, 사전작제된 외인성 유전자, 다시 말하면, 이종유전자를 임의의 아토피성 위치에 도입할 수 있다. 대조적으로, 본 발명에 따라 당업자는 식물의 기존 특정유전자를 특이적으로 변화시킬 수 있다. 본 발명에서는 변형을 유발하기 위한 RNA-유사 뉴클레오티드와 DNA-유사 뉴클레오티드의 혼합물로 이루어진 이중나선올리고뉴클레오티드를 이용해 변형을 유발하는데, 이후로 이를 "혼합된 이중나선올리고뉴클레오티드" 또는 MDON으로 부른다.
4.1 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기 및 혼합된 이중나선올리고뉴클레오티드
본 발명은 Kmiec I또는 Kmiec II에서 밝힌 형태와 화학성질을 가진 MDON으로 시행할 수 있다. Kmiec I또는 Kmiec II의 MDON은 두 개의 상보성 가닥을 가지는데, 이들 중 하나는 다른 가닥의 DNA형 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루는 RNA형 뉴클레오티드("RNA 단편")의 단편을 하나 이상 보유한다. 미국 특허출원 09/078,063(1998. 5.12), 09/078,064(1998. 5.12)에서는 본 발명에 유용하게 사용할 수 있는 또 다른 분자가 공개되어 있다. 여기에 사용된 "재조합유전자성 올리고뉴클레오염기"는 본 발명에 사용할 수 있는 분자를 나타낸다. 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기에는 MDON, 비-뉴클레오티드포함 분자(Kmiec II), 상기 특허출원에서 제시한 분자가 있다.
한 구체예에서, MDON의 RNA형 뉴클레오티드는 2'-하이드록시를 플루오르, 클로로 또는 브로모 기능체로 치환시키거나 또는 2'O위치에 치환체를 위치시켜면 리보핵산 분해효소에 저항성을 띠게 된다. 적절한 치환체에는 Kmiec II에서 밝힌 C1-6알칸이 포함된다. 변형치환체에는 미국 특허. 5,334,711(Sproat)에서 밝힌 치환체, 특허 출원 EP 629 387 및 EP 679 657(전반적으로, Martin 출원)에서 밝힌 치환체가 포함된다. 여기서 사용된 리보뉴클레오티드의 2'-플루오르, 클로로 또는 브로모 유도체, 또는 Martin 출원과 Sporat에서 밝힌 치환체로 치환된 2'-OH를 가진 리보뉴클레오티드를 "2'-치환된 리보뉴클레오티드"라고 한다. 여기서 사용된 "RNA형 뉴클레오티드"는 치환되지 않은 포스포디에스테르결합에 의해, 또는 임의의 비-고유 결합(Kmiec I, Kmiec II)에 의해 MDON의 다른 뉴클레오티드에 결합하는 "2'-하이드록실 또는 2'-치환된 뉴클레오티드"를 의미한다. 여기서 사용된 "데옥시리보형 뉴클레오티드"는 2'-H를 가진 뉴클레오티드를 의미하는데, 이 뉴클레오티드는 치환되지 않은 포스포디에스테르결합에 의해, 또는 임의의 비-고유 결합(Kmiec I, Kmiec II)에 의해 MDON의 다른 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.
본 발명의 구체예에는 치환되지 않은 포스포디에스테르결합에 의해서만 연결되는 MDON이 포함된다. 다른 구체예에는 치환된 포스포디에스테르결합, 포스포디에스테르유도체결합, 비-인산-기초한 결합(Kmiec II)이 포함된다. 또 다른 특정 구체예에는 각 RNA형 뉴클레오티드가 2'-치환된 뉴클레오티드인 MDON이 포함된다. 2'-치환된 리보뉴클레오티드의 선호되는 구체예는 2'-플루오르, 2'-메톡시, 2'-프로필옥시, 2'-알릴옥시, 2'-하이드록실에틸옥시, 2'-메톡시에틸옥시, 2'-플루오르프로필옥시, 2'-트리플루오르프로필옥시 치환된 리보뉴클레오티드이다. 2'-치환된 리보뉴클레오티드의 좀더 선호되는 구체예는 2'-플루오르, 2'-메톡시, 2'-메톡시에틸옥시, 2'-알릴옥시 치환된 뉴클레오티드이다. 한 구체예에서, MDON 과합체는 치환되지 않은 포스포디에스테르결합에 의해 연결된다.
비록 단일형의 2'-치환된 RNA형 뉴클레오티드만을 갖는 MDON은 훨씬 편하게 합성되지만, 본 발명은 두 가지 이상의 RNA형 뉴클레오티드를 갖는 MDON으로 실시할 수 있다. RNA 단편의 기능은 두 개의 RNA형 트리뉴클레오티드사이에 데옥시뉴클레오티드가 삽입되어 야기된 인터럽션에 어떠한 영향도 받지 않는데, 따라서, RNA 단편이란 용어는 이런 "중단된 RNA 단편"을 포함한다. 중단되지 않은 RNA 단편은 연속한 RNA 단편이라고 한다. 다른 구체예에서, RNA 단편은 리보핵산 분해효소에 저항성을 띠고 치환되지 않은 2'-OH 뉴클레오티드를 보유할 수 있다. 본 발명의 MDON은 가급적 100개미만의 뉴클레오티드를 갖고, 좀더 적절하게는 50 내지 85개 뉴클레오티드를 갖는다. 제 1 및 제 2 가닥은 왓슨-크릭(Watson-Crick)염기쌍을 이룬다. 한 구체예에서, MDON의 가닥은 링크에 의해 공유결합하며, 이런 링크의 예에는 단일 가닥 헥사, 펜타, 또는 테트라뉴클레오티드가 있는데, 이를 통해 제 1가닥과 제 2가닥은 단일 3', 단일 5' 말단을 가진 단일 올리고뉴클레오티드 사슬의 단편이 된다. 3'과 5' 말단은 "헤어핀 캡(hairpin cap)"을 추가하여 보호할 수 있는데, 여기서 3'과 5' 말단 뉴클레오티드는 인접한 뉴클레오티드에 왓슨-크릭쌍을 이룬다. 두 번째 헤어핀은 3'과 5' 말단에서 먼 제 1 및 제 2가닥사이의 접합점에 위치할 수 있는데, 이를 통해 제 1 및 제 2가닥사이의 왓슨-크릭쌍이 안정화된다.
제 1 및 제 2가닥은 표적유전자의 두 개의 단편과 상동한 두 개의 영역을 보유하는데, 다시 말하면, 표적유전자와 동일한 서열을 갖는다. 첫 번째 상동한 영역은 RNA 단편의 뉴클레오티드를 보유하고, DNA 단편을 연결하는 하나이상의 DNA형 뉴클레오티드를 보유하고, 중간 DNA 단편에 존재하지 않는 DNA형 뉴클레오티드를 또한 보유한다. 두 개의 상동영역들은 표적유전자와 상이한 서열을 가진 영역("이질성 영역(heterologous region)")에 의해 분리되고, 각각은 이 영역에 인접하여 위치한다. 이질성 영역은 하나, 둘 또는 세 개의 잘못 짝지어진 뉴클레오티드를 보유할 수 있다. 잘못 짝지어진 뉴클레오티드는 인접하거나 또는 표적유전자와 상동한 한 두 개의 뉴클레오티드에 의해 나뉘어 질 수 있다. 달리, 이질성 영역은 하나 내지 다섯 개의 뉴클레오티드 삽입을 보유할 수 있다. 또한, MDON 서열은 MDON으로부터 하나 내지 다섯 개의 뉴클레오티드 결손에 의해 표적 유전자의 서열과 달라진다. 비록 MDON의 어떤 뉴클레오티드도 이질성 영역에 없지만, 이질성영역의 길이와 위치는 이런 경우에 결손의 길이가 된다. 두 개의 상동영역에 상보적인 표적유전자 단편사이의 거리는 치환이 일어난 이질성 영역의 길이와 동일하다. 유전자내 이질성 영역에 삽입이 있으면, 이질성 영역은 상보적 상동영역보다 MDON에서 더욱 멀리 떨어지게 되며, 만약 이질성 영역에 결손이 있으면 이 반대의 현상이 일어난다.
MDON의 RNA 단편은 각 상동영역, 다시 말하면, 서열면에서 표적유전자 단편과 동일한 영역의 일부인데, 이때 단편들은 13개 이상의 RNA형 뉴클레오티드를 보유하고, 적절하게는 16 내지 25개의 RNA형 뉴클레오티드를, 좀더 적절하게는 18-22 RNA형 뉴클레오티드를, 가장 적절하게는 20개 뉴클레오티드를 보유한다. 한 구체예에서, 상동영역의 RNA 단편은 중간 DNA 단편에 의해 분리되고 인접해, 즉 "연결되어(connected by)" 위치한다. 한 구체예에서, 상동영역의 각 뉴클레오티드는 중간 DNA 단편의 뉴클레오티드이다. MDON의 이질성영역을 보유한 중간 DNA 단편은 "돌연변이유발유전자 단편(mutator segment)"이라고 한다.
미국 특허 출원 09/078,063(1998. 5.12), 09/078,064(1998. 5.12)에서 이중나선재조합유전자성 올리고뉴클레오염기의 한 유형을 밝혔는데, 여기서 한 가닥은 표적유전자의 서열과 동일한 서열을 갖고 "상보성(complementary)"가닥의 서열만 이질성영역을 보유한다. 이런 형태는 하나이상의 잘못 짝지어진 염기나 "이질성이중(heteroduplex)"구조를 야기한다. 본 발명에 유용한 이질성 이중나선재조합유전자성 올리고뉴클레오염기의 이질성 영역은 데옥시뉴클레오티드를 보유한 가닥에 위치한다. 한 구체예에서, 이질성영역은 5'말단 뉴클레오티드를 보유한 가닥에 위치한다.
4.2 MDON에 의해 도입된 돌연변이의 위치와 유형
빈번히, 식물 세포에 사용하기 위한 MDON 구성은 Kmiec I 및 II에서 밝힌 구성에서 변형시켰다. 포유류 및 효모세포에서, 한 위치에서 표적유전자와 다른 MDON에 의해 도입된 유전자 변형은 잘못 짝지어진 위치에서 MDON 뉴클레오티드와 상보적인 뉴클레오티드에 의해 표적유전자내 뉴클레오티드가 치환되는 것이다. 대조적으로, 식물세포에서는 DNA 돌연변이유발유전자 단편을 보유한 가닥과 상보적인 가닥의 잘못 짝지어진 위치에서 하나의 5'염기뉴클레오티드가 변형될 수 있다. 표적유전자의 뉴클레오티드는 잘못 짝지어진 위치에서 DNA 돌연변이유발유전자 단편의 뉴클레오티드와 상보적인 뉴클레오티드로 치환된다. 결과적으로, 돌연변이된 표적유전자는 두 개의 위치에서 MDON과 달라지게 된다.
MDON에 의해 표적유전자로 도입된 돌연변이는 MDON 상동영역의 리보뉴클레오티드 일부("RNA 단편")와 상동한 표적유전자 영역사이에 위치한다. 도입된 특정 돌연변이는 이질성 영역의 서열에 따라 달라진다. 표적유전자에 삽입이나 결손은 각각 삽입이나 결손을 보유한 이질성 영역을 이용해 도입할 수 있다. 표적유전자내 치환은 MDON 이질성 영역에 부적당한 짝을 가진 MDON을 이용해 성취할 수 있다. 한 구체예에서, 부적당한 짝은 표적유전자의 기존염기를 MDON의 잘못 짝지어진 염기와 상보적인 염기로 전환시킨다. 표적유전자내 치환위치는 부적당한 짝에 상응하는 위치이거나 또는 좀더 빈번하게는, 부적당한 짝의 위치, 즉, MDON의 잘못 짝지어진 염기의 3'MDON위치와 상보적인 위치에서 5'표적유전자상에 위치한다.
부적당한 짝-유발 치환의 각 위치의 상대적 빈도는 임의 유전자와 세포유형의 특징이 된다. 따라서, 당업자가 인지하는 바와 같이 치환위치가 본 발명의 실시에 중요한 경우에, 특정 유전자에서 치환의 위치를 결정하기 위한 예비연구를 전반적으로 언급하였다.
4.3 미소담체와 미소섬유에 의한 MDON의 전달
셀룰로즈 세포벽을 가진 식물세포에 큰 DNA 단편을 사출투과로 도입하기 위한 금속성 미소담체(중심체)의 사용은 관련분야(바이오리스틱 전달)에 통상적 지식을 가진 자에게 잘 공지되어 있다. 미국 특허 4,945,050, 5,100,792, 5,204,253은 이들을 사출하기 위한 미소담체와 도구를 선택하는 일반적 기술과 관계한다.
DNA 단편을 미소담체에 고착하는데 사용하는 조건은 MDON의 사용에는 부적당하다. 본 발명은 충분한 양의 MDON을 미소담체에 고착시켜, 바이오리스틱 전달을 가능하게 기술을 제공한다. 적당한 기술에서, 얼음냉각 미소담체(60 ㎎/ml), MDON(60 ㎎/ml) 2.5M CaCl2, 0.1M 스펄미딘을 순서대로 첨가한다; 혼합물은 부드럽게 교반(10분 동안 볼텍싱)하고 10분 동안 실온에서 방치하고, 미소담체는 5 체적의 에탄올에서 희석하고, 원심분리하고 100% 에탄올에서 다시 현탁시킨다. 8-10 ㎍/㎕ 미소담체, 14-17 ㎍/㎕ MDON, 1.1-1.4M CaCl2, 18-22 mM 스펄미딘을 고착용액으로 하여 일정농도로 처리하면 좋은 결과를 얻을 수 있다. 최적결과는 8 ㎍/㎕ 미소담체, 16.5 ㎍/㎕ MDON, 1.3M CaCl2, 21 mM 스펄미딘 조건하에서 얻었다.
본 발명의 실시를 위해, 세포벽과 세포막을 투과하는 미소섬유를 이용하여 MDON을 식물세포로 도입할 수 있다. 미국 특허 5,302,523(Coffee et al.,)에서는 30x0.5㎛ 및 10x0.3㎛ 실리콘 카비드 섬유를 사용해 흑색 멕시칸 스위트(Black Mexican Sweet)의 옥수수 현탁배양물의 형질변환이 이루어지는 것에 관해 기술하고 있다. 미소섬유를 이용해 DNA를 도입하여 식물세포를 형질변환시키는데 사용할 수 있는 임의의 기계기술은 MDON를 전달하여 변종시키는데 사용할 수 있다.
MDON의 미소섬유 전달을 위한 적당한 기술은 다음과 같다. 무균 미소섬유(2㎍)는 10㎍ MDON을 보유한 150㎕ 식물 배양배지에서 현탁시킨다. 현탁배양물은 가라앉히고 동량의 세포, 무균 섬유, MDON 현탁액을 10분동안 교반하고 도말한다. 기질에 따라, 선택배지를 곧바로 첨가하거나 또는 최대 120 시간이후에 첨가한다.
MDON을 전달하여 핵유전자를 변형시키는데 사용할 수 있는 기술은 또한 식물세포 형성체 유전자를 변형시키는데 사용할 수 있다. 플라스미드의 바이오리스틱 전달에 의한 고등식물의 형성자 변형과 뒤이은 플라스미드의 부적절한 재조합성 삽입은 당업자에게 공지되어 있다(Svab, Z., et al., 1990,Proc. Natl. Acad. Sci. 87,8526-8530). 초기실험에서 10-배 내지 100-배사이의 형질변환율은 핵형질변화율보다 적다는 것이 밝혀졌다. 계속된 실험에서, 핵형질변환율과 비슷한 플라스미드 형질변환율은 스펙티노마이신 저항성을 전달하는 박테리아성 아미노글리코시드 3'-아데노실트랜스퍼라제 유전자와 같은 우성 선택성 기질을 이용하여 성취할 수 있음이 밝혀졌다(Svab, Z., ＆ Maliga, P., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90,913-917).
본 발명에서, 형성자 유전자의 변형을 위한 MDON은 상기와 동일한 기술로 형성자에 도입할 수 있다. 도입하기 원하는 돌연변이가 선택성 돌연변이라면, MDON 단독으로 사용할 수 있다. 원하는 돌연변이가 비-선택성 돌연변이라면, 적당한 MDON을 선택성 형성자 돌연변이, 즉, 트리아진 저항성을 전달하는 PsbA 유전자상의 돌연변이를 도입하는 MDON과 함께, 또는 선택성 기질을 전달하는 선형이나 원형 플라스미드와 병용하여 도입할 수 있다.
MDON을 제외한 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기에서는 앞서 말한 기술을 이용할 수 있다.
4.4 원형질체 에렉트로포레이션
다른 구체예에서, 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기는 식물에서 유도한 원형질체를 에렉트로포레이션시켜 식물에 전달할 수 있다. 원형질체는 식물의 일부(특히, 잎)를 효소처리하면 만들어지는데, 이것은 당업자에게 공지된 기술이다( Gallois et al., 1996, in Methods in Molecular Biology 55, 89-107(Humana Press, Totowa, NJ 참조)). 원형질은 에렉트로포레이션하기전 생장배지에서 배양할 필요가 없다.
에렉트로포레이션을 위한 적당한 조건은 3 x 105원형질체이다(0.3ml의 전체부피에서, 0.6-4㎍/mL MDON농도로).
4.5 돌연변이의 도입
본 발명은 식물세포에서 유전자 변형("transmutate")을 유발시키는데 사용할 수 있다. 한 구체예에서, 식물세포는 세포벽을 가진다, 즉, 원형질체가 아니다.
식물세포의 유전자를 변형시키기 위한 MDON의 사용은 세포의 분화와 분리(이후, "선택(selection)")를 가능하게 하는 기질을 MDON이 삽입된 세포(기질을 갖고 있지 않음)에 도입시키면 가능해진다. 본 발명의 구체예에서, 선택은 유전자를 일시적으로 발현시키는 MDON과 플라스미드의 혼합물을 형성하여 실시하는데, 여기서 유전자는 선택성 기질, 즉, 특정조건(예, 카나마이신 저항성 유전자)하에서 생존을 가능하게 하는 기질을 전달한다. 이런 조건하에서, 선택성 기질이 결핍된 세포를 제거하면 MDON이 도입되지 않았던 세포는 없어진다. 선택성 기질을 도입하기 위해 일시발현 플라스미드를 사용하면, 단일 표준화 선택프로토콜을 반복하여 다중 유전자 변화를 식물세포에 연속적으로 도입할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 변형을 이용해 선택성 기질을 유도할 수 있다. 제 1표적유전자에 선택성 돌연변이를 야기하는 제 1 MDON과 제 2 표적유전자에 비-선택성 돌연변이를 야기하는 제 2 MDON의 혼합물을 만든다. 본 발명에서, 선택성 돌연변이를 갖는 세포중 적어도 1%가 제 2 표적유전자에서 제 2 MDON에 의해 도입된 돌연변이를 보유하는 것으로 밝혀졌다. 좀더 빈번하게는, 선택성 돌연변이를 가진 세포중 적어도 10%가 제 2 표적유전자에 돌연변이를 가지고 있는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 구체예의 한가지 용도는 관심을 갖고 있던 유전자의 기능을 조사하는 것이다. 혼합물은 선택성 돌연변이를 야기하는 MDON과 유전자를 "녹-아웃(knock-out)"시키는 돌연변이(즉, 종결코돈의 삽입이나 구조이동 돌연변이)를 야기하는 MDON으로 이루어진다. 하나 이상의 유전자 복사체가 녹-아웃된 세포는 선택성 돌연변이를 가진 개체군에서 수거할 수 있다. 이런 세포는 식물로 재생시켜 관심을 갖고 있던 유전자의 기능을 결정할 수 있다.
선택성 기질은 적당한 선택조건하에서 선별적으로 생장에 이로운 표현형의 변화 또는 쉽게 관찰되는 표현형의 변화(예, 유합조직에서 생장하는 식물세포의 색깔 변화)를 유발하는 임의의 돌연변이에 의해 발생한다. 선택성 기질은 그 자체가 유익한 기질(예, 제초제 저항성)이거나 또는 변환에 의해 도입된 비-선택성 기질을 갖는 식물을 분리하는데 단순히 이용할 수도 있다. 원하는 돌연변이를 유발하는 MDON과 선택성 돌연변이를 유발하는 MDON의 혼합물을 이용해 원하는 비선택성 기질을 세포에 도입하고 이후 선택조건하에서 배양할 수 있다. 이 계획에 따른 선택은 확실하게 각 선별된 세포가 MDON 혼합물을 받아들이고 또한 이 혼합물을 받아들인 세포가 MDON에 의한 변환되도록 하는데 강점을 가지고 있다.
적당한 조건하에서, 치명적인 표현형변화를 유발하는 돌연변이(부정적인 선택성 돌연변이) 또한 본 발명에서 사용할 수 있다. 이런 돌연변이는 부정적인 선택성 기질을 유발한다. 부정적인 선택성 기질은 돌연변이된 세포의 복제물 평판을 만들고, 복제물중 하나를 선택하고, 비-선택된 복제물로부터 원하는 성질을 가진 형질변환된 세포를 회수하여 선별할 수 있다.
4.6 변환되어 선택성 기질을 발생시키는 특정유전자
본 발명의 한 구체예에서, MDON은 아세토락테이트 합성효소(ALS)유전자로 돌연변이를 도입하는데 사용하는데, 아세토락테이트 합성효소(ALS)유전자는 또한 아세토-하이드록시 아미노산 합성효소(AHAS)유전자라고도 한다. 설포닐우레아 제초제와 이미다졸린 제초제는 야생형 ALS 효소의 저해물질이다. 식물을 설포닐우레아와 이미다졸린의 작용에 저항성을 나타내도록 하는 우성 돌연변이가 알려지고 있다(미국 특허 5,013,659, 5,378,824(베드브룩), Rajasekaran K., et al., 1996, Mol. Breeding 2, 307-319(Rajasekaran)). 표 2에서 베드브룩(Bedbrook)은 몇 가지 돌연변이(이후, "베드브룩 돌연변이")를 기술하였는데, 이들은 효모 ALS 효소를 설포닐우레아 제초제에 저항성을 띠도록 하는 것으로 밝혀졌다. 베드브룩은 각 베드브룩 돌연변이가 식물ALS 유전자에 도입되면, 식물이 설포닐우레아와 이미다졸린 제초제에 대해 저항성을 나타낸다고 밝혔다. 인지하는 바와 같이 대부분의 식물에서 ALS를 인코딩한 유전자는 복제된다. 돌연변이는 ALS 유전자의 임의 대립유전자로 도입할 수 있다.
세 가지의 베드브룩 돌연변이는 실제로, 식물에 저항성을 전달하는 것으로 나타났다(Pro→Ala197, Ala→Asp205and Trp→Leu591치환). 라자세카란(Rajasekaran)은 Trp→Ser591돌연변이는 설포닐우레아와 이미다졸린에 대해 저항성을 야기하고 Ser→Asn660은 이미다졸린 제초제에 대해 저항성을 유발한다고 밝혔다. 라자세카란의 결과는 베드브룩의 서열 번호화를 이용해 제시하였다. 당업자는 상이한 식물의 ALS 유전자가 동일하지 않은 길이를 가진다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 번호화 시스템에서, 명확하기 위해 상동위치는 각종(each species)에서 동일 위치번호로 지정한다. 따라서, 돌연변이의 지정위치는 이를 둘러싼 서열로 결정한다. 가령, 라자세카란의 Trp→Ser591돌연변이는 목화 ALS 유전자의 563 잔기에 위치하는데도 불구하고 베드르북 591위치로 지정되었는데, 그 이유는 돌연변이된 Trp가 베드브룩의 표 2에서 Trp591을 둘러싼 서열에 의해 싸여있기 때문이다. 본 발명에서는 자연발생 아미노 및 660위치 또는 베드브룩의 표2(참고문헌에 포함)에 제시된 위치에서의 임의 치환을 이용해 식물의 ALS 유전자에서 선택성 돌연변이를 만든다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 선택성 돌연변이는 광시스템 II의 D1 서버유니트를 인코드한 엽록체 유전자 psbA에서의 돌연변이이다(Hirschberg, J., et al., 1984, Z. Naturforsch. 39, 412-420 and Ohad, N., ＆ Hirschberg, J., The Plant Cell 4, 273-282). Hirschberg et al은 Ser→Gly264돌연변이가 일어나면 트리아진 제초제(예, 2-Cl-4-에틸아미노-6-이소프로필아미노-s-트리아진(Atrazine))에 대해 저항성이 나타난다고 밝혔다. 아트라진 제초제에 대해 저항성을 유발하는 psbA 유전자상의 다른 돌연변이(이후 "에릭슨(Erickson) 돌연변이")는 다음의 문헌:Erickson J.M., et al., 1989, Plant Cell 1, 361-371에 기술되어 있으며, 이들은 참고문헌으로 한다. 엽록체에 제 2의 신규한 기질을 도입하기 원할 때, 특히 에릭슨 돌연변이에 의해 야기된 선택성 기질을 이용한다.
이들 문헌에는 선택적 기질을 야기하는 다른 돌연변이에 대해서도 기술되어 있다. Ghislain M. et al.,(1995, The Plant Journal 8, 733-743)은 니코티아나 시일베스트리스(Nicotiana sylvestris) 디하이드로디피콜리네이트 합성효소(DHDPS, EC 4.2. 1.52)유전자에서 Asn-lle104돌연변이를 밝혀냈는데, 이 유전자는 S-(2-아미노에틸)L-시스테인에 대해 저항성을 나타낸다. Mourad, G., ＆ King, J.,(1995, Plant Physiology 109, 43-52)는 아라비도프시스 탈리아나(아라비도프시스 탈리아나 )의 트레오닌 탈수효소에서 돌연변이를 밝혀냈는데, 이것은 L-O-메틸트레오닌에 대해 저항성을 나타낸다. Nelson, J.A.E., et al.,(1994, Mol. Cell. Biol. 14, 4011-4019)은 S14/rp59 리보좀 단백질의 C-말단 Leu의 Pro로의 치환을 밝혀냈는데, 이것은 해독 저해물질인 크리토플루에린 및 이메틴에 대해 저항성을 유발한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 앞서 말한 돌연변이 각각은 선택성 기질을 만들기 위해 사용할 수 있다(Ghislain, Mourad, Nelson).
4.7 원하는 비-선택성 기질을 만들기 위해 돌연변이시킬 수 있는 유전자
실시예 1
상업적으로 키우는 식물은 대부분 하이브리드 종자로부터 만들어지는데, 이의 예에는 옥수수(maize, Zea Maize), 토마토, 대부분의 다른 야채가 있다. 하이브리드 종자를 생산하려면 하나의 순종계통의 식물을 다른 순종계통의 화분에 수분시켜야 한다, 즉 자가 수분은 없어야 한다. 순종 부모식물에서 화분-생산 기관을 제거하는 것은 손이 많이 가고 비용이 많이 든다. 따라서, 수컷-불임을 유도하는 돌연변이, 즉 화분 생산이나 기능을 억제하는 돌연변이가 이런 목적을 위하여 필요하다.
화분의 성숙이나 기능에 필요한 몇 가지 유전자가 확인되었는데, 이들은 식물의 다른 과정에는 별로 필요가 없다. 칼콘 합성효소(Chalcone 합성효소)(chs)는 플라보노이드 합성에 핵심 효소인데, 이들 플라보노이드는 꽃이나 화분에서 발견되는 색소다. 피튜니아에서 chs 앤티센스( I.M., et al., 1992, The Plant Cell 4, 253-262)발현 유전자를 도입해 chs를 억제하면, 식물의 수컷 불임이 발생한다(Van der Meer, I,M.,et al., 1992, The Plant Cell 4, 253-262). chs 유전자 페밀리는 대부분의 식물에서 존재한다(Koes, R.E., et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12, 213-226). 유사하게, 옥수수에서 전이가능 인자의 삽입에 의해 칼콘 합성효소 유전자의 기능이 마비되면 수컷 불임이 발생한다(Coe, E.H., J. Hered. 72, 318-320). 옥수수 칼콘 합성효소와 복제유전자(whp)의 구조는 Franken, P., et al.,(1991, EMBO J. 10, 2605-2612)에 제시되어 있다. 각 식물에서, 다중유전자 페밀리의 각 멤버들은 단지 제한된 조직범위에서만 발현한다. 따라서, 본 발명의 구체예에서는, 칼콘 합성효소 유전자의 다중 복사체를 가진 종에서, 특정 chs유전자나 꽃밥에서 발현되는 유전자는 확인되고 구조이동, 하나이상의 종결코돈의 도입에 의해 또는 프로모터의 중단에 의해 기능이 마비될 수 있어야 한다.
화분 생산에 필수적인 것으로 확인된 제 2 유전자는 토마토에서 Lat52로 불린다(Muschietti, J., et al., 1994, The Plant Journal 6, 321-338). LAT52는 트립신 저해물질과 관련된 분비 당단백질이다. Lat52의 상동체는 옥수수에서 확인되었다((Zm13으로 지칭, Hanson D.D., et al., 1989 Plant Cell 1, 173-179; Twell D., et al., 1989, Mol. Gen. 유전자t. 217, 240-245), 쌀(termed Ps1, Zou J., et al., 1994 Am. J. Bot. 81, 552-561, 올리브(termed Ole e l, Villalba, M., et al., 1993, Eur, J. Biochem. 276, 863-869). 따라서, 본 발명의 구체예는 구조이동, 하나이상의 종결코돈을 도입하거나, 또는 프로모터를 중단시켜 Lat52/Zm13유전자나 이의 상동체의 기능을 중단시킴으로써 수컷 불임을 성취하는 방법을 제공한다.
화분생산에 필수적인 것으로 확인된 제 3 유전자는 페닐알라닌 암모늄 절단효소(PAL,EC 4.3.1.5)를 인코드한 유전자이다. PAL은 페닐프라보노이드와 플라보노이드 둘 모두의 생산에 필수적인 효소이다. 그 이유는 페닐프라보노이드가 리그닌에 대한 전구물질이기 때문인데, 리그닌은 질병에 대한 저항성에 필수적이다. 한 구체예에서 꽃밥에서 발현되는 PAL 동위효소는 확인하고 기능을 중단시켜 수컷 불임을 얻는다.
실시예2 괴경의 탄수화물 대사 변형
일단 수확된 감자 괴경은 질병을 일으키고, 수축시키고, 저장하면서 싹이 나게 한다. 이들의 손실을 없애기 위하여, 저장온도는 35-40°F까지 줄인다. 하지만, 감소된 온도에서 괴경내 당은 자당("냉각 단화(cold sweetening)")으로 변질되고, 자당은 상업적이고 영양가 있는 괴경으로 된다. 두 개의 효소가 냉각 단화 과정에 중요하다: 산(acid) 인비타아제와 UDP-글루코스 피로포스포라제(Zrenner, R., et al., 1996, Planta 198, 246-252 and Spychalla, J.P., et al., 1994, J. Plant Physiol. 144, 444-453, 각각). 감자 산 인비타아제의 서열은 EMBL database(No. X70368(SEQ ID NO.1))에서 찾아 볼 수 있고, 감자 UDP 글루코스 피로포스포라제의 서열은 Katsube, T. et al.,(1991, Biochem. 30, 8546-8551)에 제시되어 있다. 따라서, 본 발명의 구체예는 구조이동, 하나이상의 종결코돈의 도입에 의해, 또는 프로모터의 중단에 의해 산 전환효소나 UDP 글루코스 포스포라제 유전자의 기능을 마비시켜 냉각 단화를 예방하는 방법을 제시한다.
실시예 3 PPO에 따른 수확후 갈색화의 감소
폴리페놀 옥시다제(PPO)는 고등식물에서 효소갈색화의 중요한 원인이다. PPO는 단일페놀의 o-디페놀로의 전환, o-디하이드록시페놀의 o-퀴논으로의 전환을 촉매한다. 이후 퀴논 산물은 중합화하고 세포단백질내 아미노산기와 반응하여 탈색된다. PPO 유도 갈색화의 문제점은 식물에 아황산염을 첨가하면 해결할 수 있는데, 하지만 아황산염은 건강상의 위험과 소비자 혐오의 가능성이 있다. PPO는 일상적으로 식물을 병원체나 해충으로부터 보호하는 기능을 하기 때문에 식물의 생존에 필수적인 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 구체예는 사과, 포도, 아보카도, 배, 바나나에서 구조이동, 하나이상의 종결코돈의 도입에 의해, 또는 프로모터의 중단에 의해 PPO 유전자의 기능을 마비시켜 효소에 의한 갈색화를 예방하는 방법을 제시한다.
식물의 게놈에서 PPO 유전자의 수는 다양하다; 토마토와 감자에서 PPO는 다중유전자 페밀리를 구성한다(Newman, S.M., et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21, 1035-1051, Hunt M.D., et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21, 59-68; Thygesen, P.W., et al., 1995, Plant Physiol. 109, 525-531). 포도는 단일 PPO 유전자만 보유한다(Dry, I.B., et al., 1994, Plant Mol. Biol. 26, 495-502). 관심을 갖고 있는 식물종이 PPO 유전자의 다중 복사체를 보유하면, 상업적 산물로 발현되는 PPO 유전자의 기능은 중단되어야 한다. 예를 들면, 단 하나의 PPO 유전자만 수확가능한 크기의 감자로 발현되고, 이 유전자는 POT 32로 일컬어지는데, 이의 서열은 GENBANK( No. U22921(SEQ ID No.2))에 기탁되어 있다. 다른 감자 PPO 동위효소도 서열화되어 있고 기탁되어 있어, 당업자는 POT32를 특이적으로 불활성화시키는 MDON을 구성할 수 있다.
실시예 4 마초 농작물과 나무 펄프에서 리그닌의 감소
리그닌은 복합 이질성 방향족중합체로 고등식물을 방수시키고 세포벽을 강화시킨다. 리그닌은 페닐프라보노이드 단일리그닌의 임의 중합화로 발생한다. 리그닌은 펄프산업에 심각한 문제를 야기하는데, 그 이유는 나무펄프로부터 이들을 제거하려면 돈과 환경을 소모해야 하기 때문이다. 유사하게, 마초 농작물의 리그닌 함 량으로 인해 반추동물에 의한 소화능력이 한정된다. 실제로, 사탕수수에서 (Porter, KS, et al., 1978, Crop Science 18, 205-218,), 그리고 옥수수(Lechtenberg, V.L., et al., 1972, Agron. J. 64, 657-660)에서 자연발생 돌연변이("갈색 주맥(brown midrib)"으로 지칭)는 리그닌 함량이 적은 것으로 확인되어 소를 위한 사료로서 시험받고 있다.
옥수수에서 갈색 주맥 돌연변이에는 O-메틸 트랜스퍼라제 유전자(Vignol, F., et al., 1995, Plant Cell 7, 407-416)가 포함된다. 많은 식물종의 O-메틸트랜스퍼라제가 클론되었다:Burgos, R.C., et al., 1991, Plant Mol. Biol. 17, 1203-1214(aspen); Gowri, G., et al., 1991, Plant Physiol. 97, 7-14(alfalfa, Medicago sativa) and Jaeck, E., et al., 1992, Mol. Plant-Microbe Interact. 4, 294-300(tobacco)(SEQ ID No. 3 and SEQ ID No.4). 따라서, 본 구체예의 한 특징은 옥수수와 사탕수수에서, 마초 농산물에서, 나무펄프의 제조를 위한 식물에서 O-메틸트랜스퍼라제 유전자의 기능을 마비시켜 갈색 주맥 표현형을 재생시키는 것이다.
리그닌 생산에 관계하는 제 2 유전자는 신나밀 알코올 탈수효소(CAD) 유전자로 담배에서 클론되었다(Knight, M.E., 1992 Plant Mol. Biol. 19, 793-801(SEQ ID No.5 and SEQ ID No.6)). CAD 앤티센스 전사체를 만드는 이종원성 담배식물은 CAD의 수준을 낮추고 좀더 쉽게 추출되는 리그닌을 생산하는데, 이것은 구아일아실 단일체에 대한 시링일의 비율증가와 알코올잔기에 유사한 알데하이드 단일체의 통합증가에 기인한다(Halpin, C., et al., 1994, The Plant Journal 6, 339-350). 따라서, 본 발명의 구체예는 구조이동, 하나이상의 종결코돈의 도입에 의해, 또는 프로모터의 중단에 의해 알파파, 옥수수, 사탕수수, 대두와 같은 마초 농작물과 짧은-잎 소나무(Pinus echinata), 긴-잎 소나무(Pinus plustris), 슬래시 소나무(Pinus elliottii), 라블로이 소나무(Pinus taeda), 황색-포플라(Lirioddenron tulipifera), 목화나무(Populus sp.)와 같은 종이 펄프 나무의 CAD 유전자의 기능을 마비시키는 것이다.
실시예 5 오일종자에서 불포화된, 다중불포화된 지질의 감소
평지, 땅콩, 해바라기, 대두와 같은 오일종자에서 얻은 식물성기름에 불포화지방산(예, 올레산), 다중불포화 지방산(예, 리놀레산과 리놀렌산)이 존재하면, 오일은 산화되어 더 오래, 더 높은 온도에서 저장할 수 있다. 결과적으로, 식물성 기름은 빈번히 수소화된다. 하지만, 화학적 수소화는 수소전이반응을 야기해, 비-자연발생 입체이성질체(건강에 해로운 것으로 보임)가 생성된다.
지방산 합성은 아실 담체 단백질(ACP)에서 포화지방산 합성에 의해 진행되며, 이후 수소쌍을 제거하는 불포화효소가 작용한다. 결과적으로, 오일종자에서 이들 불포화효소의 활성을 억제하는 것이 바람직하다.
올레산 합성에서 제 1 효소는 스테어로일-ACP 불포화효소다(EC 1.14.99.6.). 홍화, 비버콩에서 얻은 스테어로일-ACP 불포화효소는 클론되고 서열화되어있다(Thompson, G.A., et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 2578-2582(SEQ ID No. 7); Shanklin, J., ＆ Somerville, C., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci.88, 2510-2514(SEQ ID No.8); Knutzon, D.S., et al., 1991, Plant Physiology 96, 344-345). 따라서, 본 발명의 한 구체예는 구조이동, 하나이상의 종결코돈의 도입에 의해, 또는 프로모터의 중단에 의해 대두, 비버, 해바라기, 콩, 옥수수, 평지와 같은 오일종자의 스테어로일-ACP 불포화효소 유전자의 기능을 마비시키는 것이다.
본 발명에 따라 중단되는 제 2 효소는 ω-3 지방산 불포화효소(ω-3 FAD)로 이 효소는 리놀레산(디엔)을 리놀렌산(트리엔)으로 전환시킨다. 당업자가 알다시피 대부분의 식물에서 아라비도프시스 탈리아나(아라비도프시스 탈리아나 )에는 두 개의 ω-3 FAD 동위효소가 있다. 하나의 동위효소는 형성체에 특이적이고 종자의 저장기름 합성과 관련된 동위효소이다. 다른 것은 미립체 특이적이다. 아라비도프시스 탈리아나 원형체 ω-3 FAD의 클로닝은 lba., K. et al.,(1993, J. Biol. Chem. 268, 24099-24105(SEQ ID No.9))에 제시되어 있다. 따라서 본 발명의 구체예는 구조이동, 하나이상의 종결코돈의 도입에 의해, 또는 프로모터의 중단에 의해 대두, 비버, 해바라기, 콩, 옥수수, 평지와 같은 오일종자 농산물의 형성체 ω-3 FAD 유전자의 기능을 마비시키는 것이다.
실시예 6 동족번식계통을 가능하게 하는 S 대립 유전자의 불활성화
특정 식물종은 자가-불임을 예방하는 기작을 발전시켜왔다. 이들 종(밀과 쌀)에는, S라 불리는 좌위가 있는데, 이것은 다중 대립유전자를 갖는다. S 대립유전자를 발현하는 식물은 동일한 S 대립유전자를 발현하는 화분에 의해 번식할 수 없다(Lee, H-K., et al., 1994, Nature 367, 560-563; Murfett, J., et al., 1994, Nature 367, 563). S 좌위의 산물은 리보핵산 분해효소다(McClure, B.A., et al., 1989, Nature 342, 955-957). S 좌위의 산물은 식물에 꼭 필요한 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 한 구체예는 구조이동, 하나이상의 종결코돈의 도입에 의해, 또는 프로모터의 중단에 의해 식물의 동종번식을 가능하도록 하는 S 대립유전자의 기능을 마비시키는 것이다.
실시예 7 에틸렌 둔감화
에틸렌은 식물 생장과 발달에 관여하는 가스성 식물 호르몬이다. 에틸렌 작용의 원치않는 측면은 과일, 야채를 과도하게 성숙시키고 꽃을 시들게 하여 썩게 한다는 것이다. 아라비도프시스 탈리아나의 수용체는 클론되었고, ETR-1로 불린다( Chang, C., et al., 1993, Science 262, 539-544(SEQ ID No. 10)). Cys→Tyr65돌연변이가 발생하면 에틸렌의 둔감화가 일어난다. 아라비도프시스 탈리아나 돌연변이를 발현하는 ETR-1이종원성 토마토 식물에서는 에틸렌에 대한 둔감화가 발생하는데, 이것은 Cys-Tyr65돌연변이가 대부분의 식물종에서 에틸렌 작용의 주도적인 억제자라는 것을 암시한다. 따라서, 본 발명의 구체예의 한 측면은 Cys-Tyr65돌연변이를 ETR-1 유전자에 삽입하여 돌연변이된 과일, 야채, 또는 꽃의 생명주기를 늘리는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 과일과 꽃의 보존은 에틸렌 합성을 위한 효소: 1-아미노사이클로프로판-1-카르복실산 합성효소(ACC 합성효소)및 ACC 산화효소를 인코드한 유전자중 하나의 기능을 마비시킴으로써 성취할 수 있다. 본 발명의 상기 구체예에서, 에틸렌 합성효소의 양을 완전히 제거하여 성숙이 외인성 에틸렌에 의해 진행되도록 하거나 또는 소량의 에틸렌 생산을 유지하도록 하여 자발적으로 성숙하도록 하면서도 연장된 저장수명을 갖게 할 수 있다. 따라서, ACC 합성효소 또는 ACC 산화효소의 대립유전자중 하나의 기능을 마비시키면 에틸렌 수준을 효과적으로 감소시킬 수 있다는 것을 알 수 있다. 또한, 본 발명은 기능이 중단되지 않은 대립유전자에서 기능을 부분적으로 상실하게 하는 돌연변이의 도입과 함께 대립유전자의 기능을 중단시키는 것이다.
아라비도프시스 탈리아나 ACC 합성효소 및 ACC 산화효소의 서열은 Abel., S., et al.,(1995, J. Biol. chem. 270, 19093-19099(SEQ ID No.12), Gomez-Lim, M.A., et al., (1993, 유전자 134, 217-221(SEQ ID No. 11))에 제시되어 있는데, 각각은 여기에 참고문헌으로 한다.
실시예 8 카나마이신 저항성의 전환
식물에서 재조합성 DNA 기술에 의해 한 식물종 및 박테리아 유전자를 다른 식물종으로 도입할 있다. 예를 들면, Kinney, A.J.,(1996, Nature Biotech. 14, 946)는 베이 로우럴 ACP-티오에스테라제 유전자를 평지종자에 도입하여 라울산이 풍부한 야채 기름을 얻었다고 밝혔다. 이런 이종원성 유전자는 항생성 저항유전자(예, 카나마이신 저항성)를 이용해 일상적으로 작제하는데, 이들은 선택성 기질로서 이종원성 식물로 동시 도입된다. 생성된 이종원성 식물은 지속적으로 항체 저항성 유전자를 발현하여 대량의 저항성 산물과 유전자가 식량공급이나 환경으로 유입되게 되는데, 그래서 이들의 도입은 환경과 건강에 해롭다. 본 발명의 구체예는 구조이동, 하나이상의 종결코돈의 도입에 의해, 또는 프로모터의 중단에 의해 카나마이신 유전자의 기능을 마비시켜 위험을 제거하는 것이다..
실시예 9 저장 단백질 아미노산 함량의 조절
종자와 괴경은 대량의 저장 단백질(예, 감자에서 파타틴, 옥수수에서 제인)페밀리를 보유한다. 이런 저장 단백질의 아미노산 조성물은 이들 농작물에 의존하는 사람과 동물의 욕구를 종종 충족시키지 못한다(예, 콩은 리신, 메티오닌이 불충분하고 감자는 메티오닌이 불충분하다). 따라서 본 발명의 구체예는 식용 농작물의 저장 단백질을 돌연변이시켜 저량의 아미노산양을 증가시키는 것이다. 파타틴은 다중유전자 페밀리에 의해 인코드되고(Mignery, G.A., et al., 1988, 유전자 62, 27-44), 제인의 구조는 Marks, M.D., et al.,( 1985, J. Biol. Chem. 260, 16451459)에 제시되어 있는데, 둘 모두 여기에 참고문헌으로 한다. 또한, 메티오닌이나 리신 특이적 tRNA의 앤티코돈을 좀더 일반적인 아미노산의 앤티코돈으로 돌연변이시킬수 도 있다.
실시예 10 유전자의 기능을 결정하기 위한 MDON의 용도
조직 특이적 cDNA의 클로닝과 서열화를 위해 현재 가능한 기술을 통해, 당업자는 많은 유전자의 서열을 얻을 수 있다. 이들 유전자의 기능을 결정하는 기술은 상대적으로 부족하다. 본 발명의 한 구체예에서, MDON은 구조이동이나 종결코돈을 기능이 알려지지 않은 cDNA를 인코드한 유전자로 도입하는데 사용한다. 이렇게 하면 유전자 기능의 특이적 중단이 가능하다. 이런 특이적 "녹-아웃(knock-out)"을 가진 식물을 생장시키고 녹-아웃의 효과를 관찰하여 비공지된 유전자의 기능을 조사할 수 있다.
4.8 본 발명의 번식력 있는 식물
본 발명은 격리된 선택성 점돌연변이를 가진 번식력 있는 식물을 포함하는데, 분리되는 선택성 돌연변이는 드물지 않은 다형성이다, 즉 대략 10,000 개체군에서는 발견되지 않는다. 여기서 사용된 점돌연변이는 인접한 뉴클레오티드에서 6개미만, 가급적 3개미만, 좀더 적절하게는 한 개의 뉴클레오티드 치환, 또는 1 내지 5개 뉴클레오티드, 가급적 한 두 개의 삽입이나 결손이 일어난 돌연변이이다. 여기서 사용된 격리된 돌연변이는 어떤 다른 돌연변이와 유전적으로 밀접한 관련이 없는 돌연변이를 말하며, 당업자가 인식하는 바와 같이 100 Kb이상, 가급적 40 Kb이상, 가장 적절하게는 23 Kb이상의 돌연변이가 밀접한 관련이 없는 돌연변이이다.
바이오리스틱 작업 실시예
다음의 작업 실시예에서, 배지와 프로토콜은 Gelvin S.B., et al., ((eds) 1991, PLANT MOLECULAR BIOLOGY MANUAL(Kluwer Acad. Pub))에서 밝힌 대로 따랐다. 금입자는 다음의 프로토콜을 따라 MDON으로 피막하였다. 미세사출물은 먼저 키메라플라스트로 코팅하였다. 미세사출물을 만들기 위하여, 60mg 금입자를 1 ml의 100% 에탄올(Note 4)에 현탁시킨다. 세 번 30초동안 현탁액을 초음파 처리하여 입자를 깨드린다. 30초 동안 12,000xg로 원심분리하고 상청액은 버린다. 1 ml의 100% 에탄올을 첨가하고, 15초동안 교반하고, 5분동안 12,000xg로 원심분리하고, 이후 상청액은 제거한다. 물에 세척한 금입자(1.0㎛ 직경, 60mg/ml)의 25㎕현탁액은 천천히 교반하고, 여기에 40㎕ MDON (50㎍/ml), 75㎕의 2.5M CaCl2, 75㎕ 0.1M 스펄미딘을 연이어 첨가한다. 모든 용액은 얼음냉각한다. 완전혼합물은 추가로 10분동안 교반하고, 입자는 10분동안 실온에서 가라앉힌다. 펠렛은 100% EtOH에서 세척하고 50㎕ 절대용액에 다시 현탁시킨다. 바이오리스틱 전달은 다음의 실험장치: 탱크 압력 1100psi, 파열디스크x2 900psi로 파괴, 입자현탁부피 5㎕에서 비오라드 바이오리스틱 총(Biorad Biolistic Gun)을 이용해 실행한다.
NT-1(담배), 쌍자엽식물 세포 현탁액: 5 백만 세포를 함유한 대략 5cm 직경의 NT-1 잔디는 28℃ 표준 배지에서 3일 동안 배양하였다. 금입자는 ALS-1 또는 ALS-2로 피막하고 상기와 같이 하였다. 세포는 추가로 2.5일동안 배양하고, 현탁하고, 15-50ppb 클로르설퍼론(GLEAMTM)으로 보충한 고형배지로 옮겼다. 저항콜로니는 7-14일 이후 나타났다.
MDON의 서열은 다음과 같다:(표적유전자와 상동하지 않은 뉴클레오티드는 밑줄 긋고 굵게 나타내었다. 아래쪽 케이스 문자는 2'-오메틸리보뉴클레오티드를 표시한다.
ALS-1과 ALS-2는 Pro197(CCA)코돈의 제 2 뉴클레오티드에서 ALS 유전자와 부적당한 단일염기쌍을 갖는다:ALS-1는 CCA이고 ALS-2는 CTA이다. PCR 증폭과 저항세포계통인 돌연변이 ALS-1과 ALS-2 유전자의 서열화 이후, 각각 Thr(ACA) 및 Ser(TCA)가 발견되는 돌연변이가 표적코돈상에 위치한다. 관찰된 돌연변이는 포유류세포에서 코딩가닥에 대한 MDON의 작용에 의해 5'위치의 한 뉴클레오티드와 비-코딩가닥에서 3'위치의 한 뉴클레오티드가 이동한 것이다. 이런 돌연변이를 가진 전체 ALS-1(3개)과 ALS-2(5개) 돌연변이가 밝혀졌다. 저항성 캘리는 ALS-1 DNA 처리한 세포에서는 얻을 수 없었다.
클로르설퍼론 저항성 세포의 선별을 위해, 세포는 파열후 각 파열된 평판에서 5 ml의 CSM 2d 액체를 함유한 15ml용액에 옮겼다. 튜브는 여러번 뒤집어 세포 덩어리를 분산시켰다. 세포는 이후 15 ppb 클로르설퍼론(Dupont, Wilmington, DE)을 함유한 고형 CSM 배지로 옮겼다. 대략 3-5주후, 활성 생장세포(생육된, 밝은 색깔 콜로니)를 선택하여 50 ppb 클로르설퍼론을 함유한 고형 CSM에 옮겼다. 3-4주후, 활성생장세포를 선택하고, 이후 200ppb 클로르설퍼론을 함유한 고형 CSM에 옮긴다. 이후, 이런 처리를 이겨낸 세포를 분석한다.
배지
1. NT-1 세포 현탁액 배지(CSM): 무라시게및 스쿠그염(Gibco BRL, Grand Island, NY), 500mg/l MES, 1 mg/l 티아민, 100mg/l 미오이노시톨, 180 mg/l KH2PO4,2.21mg/L 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D), 30g/L 자당. 1M KOH 또는 HCl로 pH를 5.7로 조정하고 가압(증기)한다. 가압(증기)전, 고형배지에 8g/l 아가-아가(Sigma, St. Louis, MO)를 첨가한다.
2. 원형질체 분리전, 배지(POM): 80%(v/v) CSM, 0.3M 마니톨, 20%(v/v) 상청액(NT-1 세포 현탁액의 초기원심분리에서 얻는다)에 도말한다.
담배 잎, 쌍자엽식물: 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)과 삼선 (samsun)은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)LAB 4404로 공동-형질변환시키는데, 아그로박테이움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LAB 4404는 두 개의 유전자(카마마이신 유전자와 녹색 형광단백질(GFP, Chui, W., 1996, Current Biol. 6, 325-330)을 인코드한 유전자의 두 가지 돌연변이중 하나)를 보유한 nptll 발현 캐세트를 가진 빈(bin)19-유도 플라스미드를 포함한다. GFP 유전자 돌연변이들은 GEP산물을 생산하지 못한다. 돌연변이들은 6번째 코돈에서 G →T로 치환되어, 동일위치에서 하나의 뉴클레오티드가 종결코돈으로 되거나 또는 결손되는데, 이들을 각각. G-스톱과 G-△로 부른다. 선택성 MS 104 배지에서 배양한 후, 잎을 회수하고, 노잔 블라트로 GFP 유전자의 존재를 확인한다.
GFP의 첫 8개 코돈의 서열:
GFP ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG (SEQ ID No. 15)
G-스톱 -------------------T----------- (SEQ ID No. 16)
G-△ --------------------AGG AGC TGT (SEQ ID No. 17)
사용한 MDON 서열은 다음과 같다(G-스톱과 상동하지 않은 뉴클레오티드는 밑줄긋고 굵게 표시하였다. 아래쪽 케이스 문자는 2'-오메틸뉴클레오티드를 나타낸다.
G-스톱과 G-△ 이종원성 식물의 잎 화반은 MS 104 선택성 배지에서 배양하고 G-2 또는 G-1을 상기와 같이 두 번 연속하여 바이로리스틱하게 도입하였다. MDON을 도입한 후 10일째에, GFP-유사 형광을 보이는 캘리는 G-스톱 및 G-△잎 화반을 G-1 및 G-2로 처리한 배양물에서 나타났다. 크고 좀더 빠르게 생장하는 유합조직 단편은 스카펠(scalpel)로 세분하여 녹색 형광세포가 풍부한 캘리를 수득하였다. 형광표현형은 대략 30일간의 전체 관찰기간동안 안정적으로 유지되었다. G-1 처리한 G-스톱 배양물에서 녹색 형광세포가 존재한다는 것은 G-1이 잘못 짝지어진 뉴클레오티드의 5'염기만 배타적으로 돌연변이시키는 것이 아니다라는 것을 의미한다.
녹색 형광은 IMT-2 올림포스 현미경을 이용한 표준 FITC 필터장치로 관찰하였다.
에렉트로포레이션 작업 실시예
담배 엽육 원형질체에서 GFP의 전환
식물 재료
1. GFP의 결손돌연변이를 보유한 담배 식물 형질변형체(델타6)
2. 잎은 5 내지 6주 in vitro-생장 묘목에서 수거한다.
원형질체 분리
1. 기본적으로 Gallois, et al.,(1996)의 절차를 따르고, 플라스미드 DNA또는 전체 게놈DNA를 이용해 담배 잎 원형질체를 에렉트로포레이션시킨다(Biology, Vol. 55): 식물 세포 에렉트로포레이션과 에렉트로퓨젼 프로토콜(J.A. Nickoloff Humana Press Inc., Totowa, NJ. pp.89-107).
2. 효소 용액: 1.2% 셀룰라제 R-10 "오노주카"(Karlan, Santa Rosa, CA), 0.8% 마세로자임 R-10(Karlan, Santa Rosa, CA), 90g/l 마니톨, 10mM MES, 여과 멸균하고, 10 ml 액체에 -20℃로 보관한다.
3. 잎은 중앙-정맥으로부터 매 1 - 2 mm씩 자른다. 이후 이들을 배죽면에 위치시켜 100 x 20 mm 페트리 접시내 10 ml 효소용액과 접촉시킨다. 1 g인 전체 잎들을 각 평판에 놓는다.
4. 평판은 암실에서 16시간 동안 25℃로 배양한다.
5. 분해한 잎물질은 피펫으로 옮겨 100㎛ 나일론 선별천(screen cloth)(Small Parts, Inc., Miami Lakes, FL)으로 거른다. 필터는 이후 원심분리튜브에 옮겨, 10분동안 1000 rpm으로 원심분리한다. 이 프로토콜의 모든 원심분리는 이 조건하에서 실시한다.
6. 원형질체는 제일 위 밴드에서 회수한다. 원형질체 밴드는 이후 깨끗한 원심분리기에 옮기고, 여기에 10 ml 세척용액(0.4M 자당 and 80 mM KCl)을 첨가한다. 원형질체는 부드럽게 다시 현탁하고, 이후 원심분리한다.
7. 6단계를 두 번 반복
8. 마지막 세척후, 원형질체 밀도는 액체소량을 혈구계에 분산시켜 측정한다. 원형질체는 에렉트로포레이션 버퍼(80mM KCl, 4mM CaCl2, 2mM 칼슘인산염, pH 7.2, 8% 마니톨)에서 1 x 106원형질체/ml 밀도까지 다시 현탁하고, 가압한다. 원형질체는 2시간 동안 8℃에서 배양한다.
9. 2 시간후, 0.3ml(3 x 105원형질체)는 각 0.4cm 쿠벳트에 옮기고, 이후, 얼음에 놓아둔다. 에렉트로포레이션하지않은 콘트롤을 제외하고 각 쿠벳트에GFP-2(0.6-4㎍/mL)를 첨가한다. 원형질체는 에렉트로포레이션한다(250V, 정전용량 250 ㎌, 지속시간 10-14분).
10. 얼음위에서 10분동안 냉각한 원형질체를 회수하고, 페트리 평판(100 x 20mm)에 옮긴다. 35분후, 10ml POM을 각 평판에 첨가한다(상기 참조). 평판은 24 시간동안 25℃의 암실에 옮겨두고, 이후 밝은 곳으로 옮겨준다.
11. 원형질체 배양물은 칼로이스(Gallois supra)의 방법과 같이 유지시켜준다.
형광 현미경
1. 자외선하에서, 3 x 105원형질체중 8 GEP 전환된 원형질체를 관찰한다.

Claims (72)

  1. 식물세포내 표적유전자에 국소적 돌연변이를 유발하는 방법에 있어서,
    a. 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기를 입자에 고착시키고, 여기서 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기는 표적유전자의 제 1 단편과 적어도 6개 염기쌍 서열이 동일한 서열을 갖는 제 1 상동성영역, 표적유전자의 제 2 단편과 적어도 6개 염기쌍 서열이 동일한 서열을 갖는 제 2 상동성영역, 그리고 표적유전자에 이질적인 뉴클레오염기를 하나이상 포함하고 제 1 상동성 영역과 제 2 상동성 영역을 연결하는 중간영역을 보유한다.
    b. 입자를 식물세포 개체군중 하나의 세포로 도입하고,
    c. 표적유전자의 제 1 및 제 2 단편사이에 위치한 돌연변이를 갖는 개체군 세포를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기는 MDON이고, 각 상동성영역은 6개이상의 RNA형 뉴클레오티드의 RNA 단편을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 중간영역은 적어도 3개 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 더 나아가 확인된 세포를 배양하여 식물을 재생하는 것을 특징으로 방법.
  5. 제 2항에 있어서, 제 1 RNA 단편에는 적어도 8개의 인접한 2'-치환된 리보뉴클레오티드가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 제 2 RNA 단편에는 적어도 8개의 인접한 2'-치환된 리보뉴클레오티드가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 2항에 있어서, 돌연변이된 표적유전자의 서열은 MDON의 서열과 상동한 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 2항에 있어서, 고착단계는 1.1-1.4 M NaCl, 18-22??M 스펄미딘(spermidine), 14㎍/ml이상의 MDON을 포함하는 용액에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 2항에 있어서, 표적유전자는 제 1 ALS 유전자, 제 2 ALS 유전자, psbA 유전자, 트레오닌 탈수효소 유전자, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소 유전자, 또는 S14/rp59 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 식물세포는 옥수수, 밀, 쌀 또는 상추세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 식물세포는 감자, 토마토, 캐놀라(canola), 대두 또는 목화세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 2항에 있어서, 표적유전자는 산 인비타아제, UDP-글루코스 피로포스포리라제, 폴리페놀 옥시다제, O-메틸 트랜스퍼라제, 신나밀 알코올 탈수효소, etr-1또는 이의 상동체, ACC 합성효소, ACC 옥시다제를 인코드한 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 식물세포는 옥수수, 밀, 쌀 또는 상추식물에서 얻는 것을 특징으로 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 식물세포는 감자, 토마토, 캐놀라, 대두 또는 목화식물에서 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 2항에 있어서, 추가로 식물이나 식물의 자손으로부터 종자를 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 세포벽을 가진 식물세포내 표적유전자에 국소적인 돌연변이를 유발하는 방법에 있어서,
    a. 식물세포 개체군의 세포벽을 뚫고,
    b. 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기를 도입하고, 여기서 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기는 표적유전자의 제 1 단편과 적어도 6개 염기쌍 서열이 동일한 서열을 갖는 제 1 상동성영역, 표적유전자의 제 2 단편과 적어도 6개 염기쌍 서열이 동일한 서열을 갖는 제 2 상동성영역, 그리고 표적유전자에 이질적인 뉴클레오염기를 하나이상 포함하고 제 1 상동성 영역과 제 2 상동성 영역을 연결하는 중간영역을 보유한다.
    c. 표적유전자의 제 1 및 제 2 단편사이에 위치한 돌연변이를 갖는 개체군 세포를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기는 MDON이고, 각 상동성영역은 6개이상의 RNA형 뉴클레오티드의 RNA단편을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 더 나아가 확인된 세포를 배양하여 식물을 재생시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17항에 있어서, 제 1 및 제 2 단편사이의 표적유전자 서열은 잘못 짝지어진 하나의 뉴클레오티드에서 MDON의 중간영역과 차이가 나고, 표적유전자의 돌연변이는 잘못 짝지어진 뉴클레오티드에 인접하여 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17항에 있어서, 제 1 및 제 2 단편사이의 표적유전자 서열은 잘못 짝지어진 하나의 뉴클레오티드에서 MDON의 돌연변이유발유전자 단편의 서열과 차이가 나고, 표적유전자의 돌연변이는 잘못 짝지어진 뉴클레오티드에 인접하여 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 17항에 있어서, 표적유전자는 제 1 ALS 유전자, 제 2 ALS 유전자, psbA 유전자, 트레오닌 탈수효소 유전자, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소 유전자, 또는 S14/rp59 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 식물세포는 옥수수, 밀, 쌀 또는 상추세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 식물세포는 감자, 토마토, 캐놀라(canola), 대두 또는 목화세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 17항에 있어서, 표적유전자는 산(acid) 인비타아제, UDP-글루코스 피로포스포리라제, 폴리페놀 옥시다제, O-메틸 트랜스퍼라제, 신나밀 알코올 탈수효소, etr-1또는 이의 상동체, ACC 합성효소, ACC 옥시다제를 인코드한 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 표적유전자는 옥수수, 밀, 쌀 또는 상추식물에서 얻는 유전자인 것을 특징으로 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 표적유전자는 감자, 토마토, 캐놀라, 대두 또는 목화식물에서 얻는 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 17항에 있어서, 추가로 식물이나 식물의 자손으로부터 종자를 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 식물세포 형성체의 표적유전자에 국소적 돌연변이를 유발하는 방법에 있어서,
    a. 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기를 도입하고, 여기서 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기는 표적유전자의 제 1 단편과 적어도 6개 염기쌍 서열이 동일한 서열을 갖는 제 1 상동성영역, 표적유전자의 제 2 단편과 적어도 6개 염기쌍 서열이 동일한 서열을 갖는 제 2 상동성영역, 그리고 표적유전자에 이질적인 뉴클레오염기를 하나이상 포함하고 제 1 상동성 영역과 제 2 상동성 영역을 연결하는 중간영역을 보유한다.
    b. 표적유전자의 제 1 및 제 2 단편사이의 영역에서 돌연변이를 갖는 세포를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기는 MDON이고, 각 상동성영역은 6개이상의 RNA형 뉴클레오티드의 RNA 단편을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 더 나아가 확인된 세포를 배양하여 식물을 재생하는 것을 특징으로 방법.
  31. 식물세포내 표적유전자에 국소적인 비-선택성 돌연변이를 유발하는 방법에 있어서,
    a. 제 1 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기와 제 2 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기의 혼합물을 세포개체군의 세포에 도입하고, 여기서:
    i. 제 1 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기는 제 1 표적유전자의 제 1 단
    편과 적어도 6개 염기쌍 서열이 동일한 서열을 갖는 제 1 상동성영역,
    제 1 표적유전자의 제 2 단편과 적어도 6개 염기쌍 서열이 동일한 서
    열을 갖는 제 2 상동성영역, 그리고 표적유전자에 이질적인 뉴클레오
    염기를 하나이상 포함하고 제 1 상동성 영역과 제 2 상동성 영역을 연
    결하는 중간영역을 보유한다, 그리고
    ii. 제 2 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기는 제 2 표적유전자의 제 1 단
    편과 적어도 6개 염기쌍 서열이 동일한 서열을 갖는 제 1 상동성영역,
    제 2 표적유전자의 제 2 단편과 적어도 6개 염기쌍 서열이 동일한 서
    열을 갖는 제 2 상동성영역, 그리고 표적유전자에 이질적인 뉴클레오
    염기를 하나이상 포함하고 제 1 상동성 영역과 제 2 상동성 영역을 연
    결하는 중간영역을 보유한다;
    b. 개체군에서 얻은 제 1 표적유전자의 제 1 단편 및 제 2 단편사이에 위치한 선택성 돌연변이를 갖는 세포를 개체군에서 선별하고,
    c. 제 2 표적유전자의 제 1 단편 및 제 2 단편사이에 위치한 비-선택성 돌연변이를 갖는 선별된 세포를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 각 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기는 MDON이고, 각 상동성영역은 6개이상의 RNA형 뉴클레오티드의 RNA 단편을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 제 1 표적 유전자는 제 1 ALS 유전자, 제 2 ALS 유전자, psbA 유전자, 트레오닌 탈수효소 유전자, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소 유전자, 또는 S14/rp59 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 식물세포는 옥수수, 밀, 쌀 또는 상추세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 33항에 있어서, 식물세포는 감자, 토마토, 캐놀라(canola), 대두 또는 목화세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 32항에 있어서, 제 2표적유전자는 산(acid) 인비타아제, UDP-글루코스 피로포스포리라제, 폴리페놀옥시다제, O-메틸트랜스퍼라제, 신나밀 알코올 탈수효소, etr-1또는 이의 상동체, ACC 합성효소, ACC 옥시다제를 인코드한 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 식물세포는 옥수수, 밀, 쌀 또는 상추세포인 것을 특징으로 방법.
  38. 제 36항에 있어서, 식물세포는 감자, 토마토, 캐놀라, 대두 또는 목화세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 32항에 있어서, 더 나아가 확인된 세포를 배양하여 식물을 재생시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 39항에 있어서, 추가로 식물이나 식물의 자손으로부터 종자를 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 31항에 있어서, 제 2 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기는 헤테로듀플렉스 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기이고, 제 2 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기의 각 상동성영역은 6개이상의 RNA형 뉴클레오티드의 RNA 단편을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 제 1 표적유전자는 제 1 ALS 유전자, 제 2 ALS 유전자, psbA 유전자, 트레오닌 탈수효소 유전자, 디하이드로디피콜리네이트 합성효소 유전자, 또는 S14/rp59 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 42항에 있어서, 식물세포는 옥수수, 밀, 쌀 또는 상추세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 42항에 있어서, 식물세포는 감자, 토마토, 캐놀라(canola), 대두 또는 목화세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 41항에 있어서, 제 2 표적유전자는 산(acid) 인비타아제, UDP-글루코스 피로포스포리라제, 폴리페놀 옥시다제, O-메틸 트랜스퍼라제, 신나밀 알코올 탈수효소, etr-1또는 이의 상동체, ACC 합성효소, ACC 옥시다제를 인코드한 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 36항과 제 45항에 있어서, 제 2 표적유전자는 옥수수, 밀, 쌀 또는 상추식물에서 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 36항과 제 45항에 있어서, 제 2 표적유전자는 감자, 토마토, 캐놀라, 대두, 또는 목화식물에서 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 41항에 있어서, 더 나아가 확인된 세포를 배양하여 식물을 재생시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 48항에 있어서, 추가로 식물이나 식물의 자손으로부터 종자를 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 식물세포내 표적유전자에 국소적인 돌연변이를 유발하는 방법에 있어서,
    a. 식물일부를 셀룰라제로 분해하여 식물세포 원형질체를 만들고,
    b. 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기를 포함한 용액에 원형질을 현탁시키고, 여기서 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기는 표적유전자의 제 1 단편과 적어도 6개 염기쌍 서열이 동일한 서열을 갖는 제 1 상동성영역, 표적유전자의 제 2 단편과 적어도 6개 염기쌍 서열이 동일한 서열을 갖는 제 2 상동성영역, 그리고 표적유전자에 이질적인 뉴클레오염기를 하나이상 포함하고 제 1 상동성 영역과 제 2 상동성 영역을 연결하는 중간영역을 보유한다;
    c. 현탁액을 에렉트로포레이션시켜 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기를 현탁액의 원형질체속으로 도입하고,
    d. 원형질체를 배양하고,
    e. 표적유전자의 제 1 및 제 2 단편사이에 위치한 돌연변이를 갖는 원형질체의 자손을 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 50항에 있어서, 더 나아가 확인된 자손을 배양하여 식물을 재생시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 50항에 있어서, 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기는 MDON이고, 각 상동성영역은 6개이상의 RNA형 뉴클레오티드의 RNA 단편을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 50항에 있어서, 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기는 헤테로듀플렉스 재조합유전자성 올리고뉴클레오염기인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 유전자상의 점돌연변이가 야생형 유전자위치에 존재하는 식물이나 종자에 있어서, 이때 유전자는 산(acid) 인비타아제, UDP-글루코스 피로포스포리라제, 폴리페놀 옥시다제, O-메틸 트랜스퍼라제, 신나밀 알코올 탈수효소, etr-1또는 이의 상동체, ACC 합성효소, ACC 옥시다제를 인코드한 유전자에서 선택되고, 23KB 미만으로 돌연변이된 유전체 DNA의 서열은 야생형 DNA 서열이고, 점돌연변이는 종결코돈을 형성하거나 또는 구조이동 돌연변이인 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
  55. 제 54항에 있어서, 점돌연변이는 종결코돈을 형성하는 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
  56. 제 55항에 있어서, 40KB 미만으로 선택성 돌연변이된 유전체 DNA 서열은 야생형 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
  57. 제 55항에 있어서, 100KB 미만으로 선택성 돌연변이된 유전체 DNA 서열은 야생형 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
  58. 제 55항에 있어서, 점돌연변이는 단일염기쌍 돌연변이인 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
  59. 제 55항에 있어서, 식물이나 종자는 옥수수, 밀, 쌀 또는 상추식물이나 종자인 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
  60. 제 55항에 있어서, 식물이나 종자는 감자, 토마토, 캐놀라, 대두 또는 목화식물이나 종자인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 55항에 있어서, 식물이나 종자는 추가로 제 2유전자에 선택성 점돌연변이를 가지고, 23KB미만으로 선택성 점돌연변이된 유전체 DNA 서열은 야생형 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
  62. 제 61항에 있어서, 40KB미만으로 선택성 돌연변이된 유전체 DNA 서열은 야생형 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
  63. 제 61항에 있어서, 100KB미만으로 선택성 돌연변이된 유전체 DNA 서열은 야생형 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
  64. 제 54항에 있어서, 점돌연변이는 구조이동돌연변이인 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
  65. 제 64항에 있어서, 40KB미만으로 선택성 돌연변이된 유전체 DNA 서열은 야생형 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
  66. 제 64항에 있어서, 100KB미만으로 선택성 돌연변이된 유전체 DNA 서열은 야생형 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
  67. 제 64항에 있어서, 점돌연변이는 단일염기쌍 돌연변이인 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
  68. 제 64항에 있어서, 식물이나 종자는 옥수수, 밀, 쌀 또는 상추식물이나 종자인 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
  69. 제 64항에 있어서, 식물이나 종자는 감자, 토마토, 캐놀라, 대두 또는 목화식물이나 종자인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 64항에 있어서, 추가로 제 2유전자에 선택성 점돌연변이를 갖고, 23KB미만으로 선택성 점돌연변이된 유전체 DNA 서열은 야생형 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
  71. 제 70항에 있어서, 40KB미만으로 선택성 돌연변이된 유전체 DNA 서열은 야생형 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
  72. 제 70항에 있어서, 100KB미만으로 선택성 돌연변이된 유전체 DNA 서열은 야생형 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 식물이나 종자.
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