JP2006258606A - 蛍光分析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】光源光の変動や外乱ノイズが低減され、励起光及び蛍光の分光波長を連続して変化させながら、高精度に蛍光スペクトル測定が可能な蛍光分析装置を実現する。
【解決手段】蛍光光量信号と励起光量信号とＡＤＣ１２、１３でＡＤ変換してデータ処理部１４に取込む度に、蛍光光量信号と励起光量信号のＡＤ変換データが同じ精度のデータになるように励起光信号の増幅器９の増幅度（Ｇ）を演算する。演算された増幅度（Ｇ）により励起光信号を増幅しＡＤ変換する。これにより、同じ精度の励起光データと蛍光データが得られる。得られた蛍光データを励起光データで割算することにより得られたデータに、増幅度（Ｇ）を乗算する。この処理により、スペクトルデータを低ノイズで得ることが可能になる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、試料に励起光を照射し試料からの蛍光を測定し、分析する蛍光分析装置に関する。

従来技術における蛍光分析装置は、特許文献１に記載されているように、励起光の一部の光を検知器で検出し、励起光信号として取り込み、この励起光信号の増幅度を、スリット幅の変更と波長変更のいずれか一方の変更に連動して可変して、励起光の信号を一定レベル以上にしている。

試料から発する蛍光量が励起光量に比例して変動するため、試料の定量測定を行う場合には、（蛍光量）／（励起光量）を計算することにより、励起光量の変動を補正した定量値を求める。このようにすれば、計算精度を向上させ、測定精度を高める効果がある。

特開平５３−５０８８５号公報

ところで、蛍光分析装置においては、励起光を試料に照射して試料から発せられる蛍光を測定するが、試料に含まれる物質の量を物質が発する蛍光量から求める定量分析のみならず、励起光の波長をスキャンさせながら、蛍光スペクトルを測定して、試料に含まれる物質の種類の存在を確認する定性分析が要求されている。

しかしながら、励起光の波長をスキャンさせながら、蛍光スペクトルを測定して定性分析する場合、上記従来技術では、以下に示す問題点（１）、（２）を有する。

（１）励起光の波長をスキャンさせながら蛍光スペクトルを測定する場合には、正しい蛍光スペクトルが得られなくなる。この理由は、励起波長を変化させた時に励起光信号の増幅度を変えると励起光の信号レベルは一定になるが、試料に照射される実際の励起光量の変動はそのままであるため、励起波長を変化させる前と後では、励起光量と励起光信号との比率が異なってしまうからである。蛍光３次元スペクトル測定のように、励起波長を変えながら蛍光物質濃度を測定する分析手法では、上記従来技術を使用することができない。
（２）試料による蛍光発光量の違いが配慮されていないために蛍光信号と、励起光信号の大きさが大きく異なる測定条件が発生する。この場合に両者の信号の分解能が異なり、励起光変動の補正精度を悪化させてしまう。

ここで、試料が発する蛍光光量は、励起光量に比例して変化するために、試料に含まれる物質の量だけに比例して変化する信号（定量信号）を得るためには、蛍光光量を励起光量で割算をすればよい。つまり、定量信号は、（蛍光光量信号）／（励起光量信号）の計算により得ることができる。

また、上記計算によって、励起光変動により蛍光光量が変動するノイズ成分を取り除く効果がある。

励起光は、キセノンランプが発する波長１９０ｎｍ〜９００ｎｍの光を分光して得る場合が多い。この波長を変化させながら各励起光波長における蛍光光量の測定を行うが、光源が発生する各波長の光量差、及び試料による蛍光光量差、分光器の波長特性、検知器の波長特性が影響し、励起光量は波長依存で１０００倍以上、蛍光光量は波長と試料依存で１，０００，０００倍以上変化する。

このため、励起光量信号の大きさが蛍光光量信号の大きさの１／１００以下になる条件も発生する。

図７に示す蛍光スペクトルは、試料に照射させる（励起光量信号）／（蛍光光量信号）が１／５０になる測定条件で測定したものである。ただし、励起光信号の増幅は行われていない。

図８は図７に示した蛍光スペクトルのピーク波長（４５０ｎｍ）における定量値信号（（蛍光光量信号：ＤＥＦ）／（励起光量信号：ＤＥＸ））の時間変化を測定した結果であり、大きいノイズ成分が含まれていることが分かる。

このノイズの主原因は２つあり、１つは光源光量の変動補正精度が悪化しているためである。この原因は、定量値信号＝（蛍光光量信号）／（励起光量信号）の計算における蛍光光量信号に対し励起光量信号の分解能が１／５０しか無いところにある。

例えば、蛍光光量信号のＡＤ変換値が５０００だとすると、１／５０の励起光量信号のＡＤ変換値は１００になり、励起光量信号のＡＤ変換値からは１／１００以下の分解能は得られなくなるために、１／１００以下の光源光量の変動を補正することが不可能になるためである。

２つ目の原因は、アナログ信号回路系ノイズの影響によるものである。アナログ信号回路系ノイズは、ほぼ一定レベルのノイズが測定信号に加算されるために、蛍光光量信号と比較して１／５０の励起光量信号への影響はほぼ５０倍になるためである。

以上のノイズ発生の２つの原因を解決するために、励起光量信号が小さい時に増幅度を上げる技術を提案することが考えられる。

上記提案技術について、以下に考察してみる。
図９は、図７に示した蛍光スペクトル測定と同等の条件において、励起光量信号を５０倍に増幅して測定した結果である。定量信号＝（蛍光光量信号）／（励起光量信号）×５０になるために、定量値信号ピーク波長の値は、図７に示したピーク波長の１／５０の値になってしまう。

このことは、測定条件により励起光量信号の増幅度を変えると、定量値信号が変わるために、定量値信号との相関が得られなくなるという大きな問題が残っていることを示す。

特に、蛍光スペクトル測定においては、励起光及び蛍光の分光波長を連続して変化させながら、連続して変化する定量値を得る必要があり、分光波長を変更させる途中で、励起光量信号の増幅度を変更することは、連続的に変化するスペクトル測定ができなくなるという問題がある。

本発明の目的は、光源光の変動や外乱ノイズが低減され、励起光及び蛍光の分光波長を連続して変化させながら、高精度に蛍光スペクトル測定が可能な蛍光分析装置及び方法を実現することである。

本発明においては、蛍光光量信号と励起光量信号をＡＤ変換して演算処理部に取り込む度に蛍光光量信号と励起光量信号のＡＤ変換データが同じ精度のデータになる励起光信号の増幅度（Ｇ）を計算し、求められて増幅度（Ｇ）により励起光信号を増幅しＡＤ変換する。

これにより同じ精度の励起光データと蛍光データが得られる。

このようにして得られた蛍光データを励起光データで割算することにより得られたデータに、このデータを得るために励起光信号を増幅した増幅度（Ｇ）を乗算する。

この処理により、スペクトルデータを低ノイズで得ることが可能になる。

但し、励起光の波長と蛍光波長によっては、蛍光量が０になる。この場合、求められた増幅度（Ｇ）が１以下になり、０になる場合もある。このように蛍光量が一定以下の値になった場合は、励起光信号の増幅度を予め定めた一定値にする。

また、励起光信号が０に近い値になる条件では、求められた増幅度（Ｇ）が設定不能な大きな増幅度になるために、励起光信号の増幅度を予め定めた一定値にする。

本発明によれば、光源光の変動や外乱ノイズが低減され、励起光及び蛍光の分光波長を連続して変化させながら、高精度に蛍光スペクトル測定が可能な蛍光分析装置及び方法を実現することができる。

光源光の変動や外乱ノイズの影響を大幅に低減した蛍光スペクトル測定を可能にし、極微量試料の分析が可能になる。

以下、本発明の実施形態について、添付図面を参照して説明する。
図１は、本発明の一実施形態である蛍光分析装置の概略構成図である。図１において、光源１からの光は、分光器２により分光される。この分光器２はモータ１５により回転され、分光波長を変えることができる。また、モータ１５はモータ駆動回路１７により駆動される。このモータ駆動回路１７は、データ処理部１４により回転速度と回転角度が指定され、指定された回転速度と回転角度となるようにモータ１５を駆動する。

分光器２により分光された光は、ミラー３により反射され、石英板４、スリット２１を通り、励起光として試料６に照射される。ミラー３により反射された励起光の一部は、石英板４の表面反射により、検知器５に照射される。

試料６から発せられる蛍光は、スリット２２を介して分光器７に照射され、分光器７により分光される。この分光器７は、モータ１６により回転され、分光波長を変える。モータ１６はモータ駆動回路１８により駆動される。モータ駆動回路１８はデータ処理部１４により、モータ１６の回転速度と回転角度が指定され、指定された回転速度と回転角度となるようにモータ１６を駆動する。分光器７により分光された光は検知器８に照射される。

検知器５からの検知信号は、ＡＭＰ９により増幅される。このＡＭＰ９の増幅度は、増幅度可変回路１０により可変可能である。ＡＭＰ９からの信号は、ＡＤＣ１２によりＡＤ変換される。

検知器８からの検知信号は、ＡＭＰ１１により増幅され、ＡＤＣ１３によりＡＤ変換される。ＡＤＣ１２とＡＤＣ１３とは、タイマー１９からの信号により、一定時間周期でＡＤ変換を行う。タイマー１９のタイマー周期はデータ処理部１４により指定される。

ＡＤＣ１２からのデータは、励起光量をモニタする励起光データ（ＤＥＸ）としてデータ処理部１４が読み取る。また、ＡＤＣ１３からのデータは、試料からの蛍光量をモニタする蛍光データ（ＤＥＦ）としてデータ処理部１４が読み取る。ＣＰＵであるデータ処理部１４はＡＤＣ１２とＡＤＣ１３とから読み取ったデータを処理し、表示装置２０に表示させる。

本発明の一実施形態におけるデータ処理部１４は、図２に示すデータ処理機能を有し、図３に示すタイムチャートに従った動作を行う。

本発明の一実施形態においては、測定のためのＡＤ変換の度に、励起光光量信号と蛍光光量信号との大きさを同等とする処理と、この処理により発生する測定信号の変化を補正する処理を行う。

最初に、励起光光量信号と蛍光光量信号との大きさを同等とする処理について説明する。
データ処理部１４は、図３の（１）に示す初期分光波長を設定するためにモータ駆動回路１７、１８を制御する。次に、図３の（２）に示すＡＭＰ９の増幅度を１にするために、ＡＭＰ増幅度可変回路１０を制御する。次に、図３の（３）に示すＡＤ変換周期時間の設定を行うためにタイマー１９を制御する。これにより、タイマー１９は、ＡＤＣ１２及びＡＤＣ１３の高速ＡＤ変換スタート信号を出力する（図３の（４））。この例においては、高速ＡＤ変換は、例えば、１６ビット、１０μｓ〜５０μｓとする。

高速ＡＤ変換スタート信号により、ＡＤＣ１２及びＡＤＣ１３は、励起光光量信号と蛍光光量信号との高速ＡＤ変換を行い、ＡＤ変換が終了した事をデータ処理部１４に知らせる。データ処理部１４は、ＡＤＣ１２及びＡＤＣ１３から高速ＡＤ変換が終了信号を受け取ると、図３の（５）に示されるように変換データの読取を行う。

読み込まれたデータは、図２の割算部５４により励起光光量信号の大きさを蛍光光量信号と同等にするための増幅度（Ｇ）が得られる。この増幅度（Ｇ）は増幅度設定処理部５２により、増幅度可変回路１０に設定される。また、この増幅度（Ｇ）はメモリ５５に保存される。

以上の動作により、ＡＤＣ１２及びＡＤＣ１３に入力される励起光光量信号と蛍光光量信号との大きさは同等になる。

ここで、ＡＤＣ１２及びＡＤＣ１３が高速ＡＤ変換をする理由は、主目的である試料濃度に比例する信号を得るための測定時間を減少させ、信号精度を低下させないためである。

励起光光量信号が小さ過ぎて増幅度可変回路１０により設定可能な増幅度を超えてしまう場合の処理として、本発明の一実施形態においては、図２の大小比較部５３により、励起光光量信号と固定値（Ｄ）と比較して、設定可能な増幅度（Ｄ）を超えるか否かの判定を行う。

その判定結果、設定可能な増幅度を超えてしまう場合は、大小比較部５３は、増幅度を固定値（Ｅ）（本発明の一実施形態では１００倍とする）に設定する。

この処理の効果は、ＡＭＰ９の増幅度を一定以上に大きくするとＡＭＰ系のノイズが増加してしまい、Ｓ／Ｎを悪化させてしまう事を防止するところにある。

また、蛍光光量信号が小さく、励起光光量信号の増幅度が１以下になるか否かを、図２の大小比較部５１により、蛍光光量信号と固定値（Ａ）とを比較することにより判定する。この結果、蛍光光量信号が小さいと判定された場合は、増幅度を固定値（Ｂ）（本発明の一実施形態では１倍）に設定する。

この処理の効果は、励起光光量信号の増幅度を１以下にすると励起光光量信号の分解能が減少し、Ｓ／Ｎを悪化させてしまう事を防止するところにある。

次に、主目的の測定と、励起光光量信号と蛍光光量信号の大きさを同等にする処理により発生する測定信号の変化を補正する処理を説明する。

ＡＭＰ９の増幅度が設定された後、タイマー制御部５７の制御動作に従って、タイマー１９から低速高精度ＡＤ変換スタート信号がＡＤＣ１２及びＡＤＣ１３に出力される（図３の（６））。ここで、この例のおいては、低速高精度ＡＤ変換は、例えば、２４ビット、１０ｍｓ〜５０ｍｓとする。

この低速高精度ＡＤ変換が終了した事が、タイマー１９からデータ処理部１４に伝えられると、ＡＤＣ１２及びＡＤＣ１３によるＡＤ変換データをデータ処理部１４が読取る。

そして、図２の割算部５４による割算処理により、主目的である試料濃度に比例する信号を得る測定と処理を行う。

但し、この時点で得られた値には、励起光光量信号の増幅度を変更した事による誤差が含まれるため、メモリ５５に保存された増幅度（Ｇ）の値を乗算部５６により乗算する。

図４は、信号処理のフローチャートである。
図４において、まず、励起光ＡＭＰ９の増幅度が１に設定され（ステップ（ａ））、ＡＤＣ１２とＡＤＣ１３において高速ＡＤ変換が行われる（ステップ（ｂ））。

データ処理部１４は、ＡＤＣ１２とＡＤＣ１３からのＡＤ変換終了信号を受信した時点で、励起光信号が増幅度１で増幅された信号（ＡＥＸ１ｎ）がＡＤ変換された信号（ＤＥＸ１ｎ）と、蛍光信号（ＡＥＦｎ）がＡＤ変換された信号（ＤＥＦｎ）とを読み取る（ステップ（ｃ）、（ｄ））。

ステップ（ｃａ）において、データ処理部１４は励起光のＡＤ変換データ（ＤＥＸ１ｎ）の値と固定値（Ｄ）とを比較する。この結果、ＡＤ変換データ（ＤＥＸ１ｎ）が固定値（Ｄ）以下の場合は、データ処理部１４のメモリ５５に予め記憶させて置いた固定値（Ｅ）により、励起光ＡＭＰの増幅度（Ｇ）を定める（ステップ（ｃｂ））。

次に、データ処理分１４は、ＡＤＣ１３からの蛍光信号ＡＤ変換データ（ＤＥＦｎ）を、データ処理部１４のメモリに予め記憶させておいた固定値（Ａ）と比較する（ステップ（ｅ））。

この結果、固定値（Ａ）よりも蛍光信号のＡＤ変換データ（ＤＥＦｎ）の値が大きい場合は、（ＤＥＦｎ）／（ＡＥＸ１ｎ）を計算することにより、励起光ＡＭＰ９の増幅度（Ｇ）を得る（ステップ（ｆ））。

蛍光信号のＡＤ変換データ（ＤＥＦｎ）の値が固定値（Ａ）以下の場合は、データ処理部１４のメモリに予め記憶させて置いた固定値（Ｂ）を、励起光ＡＭＰ９の増幅度（Ｇ）として定める（ステップ（ｇ））。

次に、励起光ＡＭＰ９からの信号増幅度を、ステップ（ｆ）、（ｇ）、（ｃｂ）のいずれかで計算された増幅度（Ｇ）に設定する（ステップ（ｈ））。

これにより、励起光信号（ＡＥＸ１ｎ）は増幅度（Ｇ）で増幅され、低速高精度でＡＤ変換され（ステップ（ｉ））、ＡＤ変換データ（ＤＥＸｎ）としてデータ処理部１４が読み取る（ステップ（ｊ））。同時に、蛍光信号は、ＡＤ変換データ（ＤＥＦｎ）としてデータ処理部１４が読み取る（ステップ（ｋ））。

データ処理部１４は、（ＤＥＦｎ）／（ＤＥＸｎ）を計算した後の結果に増幅度（Ｇ）を乗算することにより、（ＤＥＦｎ）×Ｇ／（ＤＥＸｎ）の計算を行いＤＡＴＡｎを得る（ステップ（ｌ））。

以上の処理により、励起光信号を増幅度（Ｇ）で増幅しない時と同じ測定信号レベルの信号を高精度に得ることができる。

そして、データ処理部１４は、ＤＡＴＡｎをメモリに保存し（ステップ（ｍ））、表示装置２０にＤＡＴＡｎを表示させる（ステップｎ）。続いて、励起光の波長を変えた後（ステップｏ）、ステップ（ａ）に戻る。

図５は、本発明の一実施形態で、図７に示したデータが得られた試料をスキャン測定した蛍光スペクトルであり、図６は、本発明の一実施形態で上記試料の蛍光スペクトルピーク波長における時間変化測定データであり、ピークデータのＳ／Ｎを測定したデータである。

本発明の一実施形態により得られたデータ（図５、図６）と、従来技術により得られたデータ（図７、図８）とを比較すれば理解できるように、本発明の一実施形態によれば、従来技術の５倍以上のＳ／Ｎで、かつ、ピーク値が従来技術と同じ値が得られる結果を得ることができる。

また、本発明によれば、分析条件によっては光源光量の変動及び電気系ノイズの影響を従来技術の１／６以下にすることが可能になり、従来はノイズに埋もれて測定できなかった、微量物質の測定が可能になり、研究開発・高精度品質管理・他への適用分野を広げることが可能となる。

なお、図１に示したスリット２１、２２は、波長分解能を向上するため、その幅が調整されるが、上記増幅度（Ｇ）の算出は、各波長の設定毎及びスリット２１、２２の幅の調整毎に行なわれるように構成することも可能である。

本発明の一実施形態である蛍光分析装置の概略構成図である。 図１に示した蛍光分析装置におけるデータ処理部の内部機能構成図である。 本発明の一実施形態におけるデータ処理部の動作説明図である。 本発明の一実施形態における信号処理の動作フローチャートである。 本発明の一実施形態における蛍光分析装置により試料をスキャン測定した蛍光スペクトルを示す図である。 図５に示した蛍光スペクトルピーク波長における定量値の時間変化の測定データを示す図である。 従来技術において試料を波長スキャンして測定した蛍光スペクトルを示す図である。 従来技術において図７に示した蛍光スペクトルピーク波長における定量値の時間変化の測定データを示す図である。 従来技術において励起光信号を５０倍増幅して試料を測定した蛍光スペクトルを示す図である。

符号の説明

１ 光源
２ 分光器
３ ミラー
４ 石英板
５ 検知器
６ 試料
７ 分光器
８ 検知器
９、１１ ＡＭＰ
１０ ＡＭＰ増幅度可変回路
１２、１３ ＡＤＣ
１４ データ処理部
１５、１６ モータ
１７、１８ モータ駆動回路
１９ タイマー
２０ 表示装置
２１、２２ スリット
５１、５３ 大小比較部
５２ 増幅度設定処理部
５４ 割算処理部
５５ メモリ
５６ 乗算部
５７ タイマー制御部

Claims (6)

1. 光源と、この光源から発せられる光を分光し、励起光として、その波長を変更させて試料に照射する分光手段と、上記励起光の一部を励起光検知器に照射する手段と、上記励起光検知器からの信号を増幅する励起光信号増幅器と、この励起光信号増幅器からの信号をＡＤ変換する励起光ＡＤ変換器と、上記試料が発する蛍光を検出する蛍光検知器と、この蛍光検知器からの蛍光信号を増幅する蛍光信号増幅器と、この蛍光信号増幅器からの信号をＡＤ変換する蛍光ＡＤ変換器とを有し、上記蛍光ＡＤ変換器からの蛍光信号に基づいて、試料を分析する蛍光分析装置において、
   上記励起光ＡＤ変換器の出力データと上記蛍光ＡＤ変換器の出力データとに基づいて上記励起光信号増幅器の増幅度を、上記励起光の波長変更毎に算出する増幅度手段と、
   上記算出した増幅度を記憶する記憶手段と、
   上記励起光信号増幅器の増幅度を上記算出した増幅度とする増幅度変更手段と、
   上記算出した増幅度の励起光信号増幅器により増幅された励起光信号が上記励起光ＡＤ変換器によりＡＤ変換されたデータにより、上記蛍光ＡＤ変換器によりＡＤ変換されたデータを割算し、この割算により得られたデータに、上記記憶手段に記憶された増幅度を乗算し、試料を分析するデータ処理手段と、
   を備えることを特徴とする蛍光分析装置。
2. 請求項１記載の蛍光分析装置において、
   上記蛍光ＡＤ変換器の出力信号を所定値と比較する手段と、
   上記比較手段の比較結果に従って、上記励起光信号増幅器の増幅度を、上記励起光ＡＤ変換器の出力データと上記蛍光ＡＤ変換器の出力データとが同等の精度となるための増幅度にするか、所定の固定増幅度値にするかを決定する手段とを備えることを特徴とする蛍光分析装置。
3. 請求項２記載の蛍光分析装置において、
   上記励起光ＡＤ変換器の出力信号を所定値と比較する手段と、
   上記比較手段の比較結果、上記励起光ＡＤ変換器の出力信号が所定値より小さい場合は、上記励起光信号増幅器の増幅度を所定の固定増幅度値にする手段とを備えることを特徴とする蛍光分析装置。
4. 請求項１記載の蛍光分析装置において、上記増幅度を算出する手段により増幅度を算出する期間における上記励起光ＡＤ変換器及び蛍光ＡＤ変換器のＡＤ変換速度は、上記励起光信号増幅器の増幅度が算出された増幅度に変更された後の、上記励起光ＡＤ変換器及び蛍光ＡＤ変換器のＡＤ変換速度より速いことを特徴とする蛍光分析装置。
5. 請求項１記載の蛍光分析装置において、上記分光手段からの励起光を通過し、上記試料に照射させるスリット手段を備え、このスリット手段は、スリット幅を変更でき、上記増幅度算出手段は、上記波長変更毎及びスリット幅変更毎に上記増幅度を算出することを特徴とする蛍光分析装置。
6. 光源と、この光源から発せられる光を分光し、励起光として、その波長を変更させて試料に照射する手段と、上記励起光の一部を励起光検知器に照射する手段と、上記励起光検知器からの信号を増幅する励起光信号増幅器と、この励起光信号増幅器からの信号をＡＤ変換する励起光ＡＤ変換器と、上記試料が発する蛍光を検出する蛍光検知器と、この蛍光検知器からの蛍光信号を増幅する蛍光信号増幅器と、この蛍光信号増幅器からの信号をＡＤ変換する蛍光ＡＤ変換器とを用いて、上記蛍光ＡＤ変換器からの蛍光信号に基づいて、試料を分析する蛍光分析方法において、
   上記励起光ＡＤ変換器の出力データと上記蛍光ＡＤ変換器の出力データとに基づいて上記励起光信号増幅器の増幅度を算出し、
   上記励起光信号増幅器の増幅度を上記算出した増幅度とし、
   上記算出した増幅度の励起光信号増幅器により増幅された励起光信号が上記励起光ＡＤ変換器によりＡＤ変換されたデータにより、上記蛍光ＡＤ変換器によりＡＤ変換されたデータを割算し、この割算により得られたデータに、上記算出した増幅度を乗算し、試料を分析することを特徴とする蛍光分析方法。

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