JP4233423B2

JP4233423B2 - 定量方法及びスペクトル測定装置

Info

Publication number: JP4233423B2
Application number: JP2003321669A
Authority: JP
Inventors: 純小勝負
Original assignee: Jasco Corp
Current assignee: Jasco Corp
Priority date: 2003-09-12
Filing date: 2003-09-12
Publication date: 2009-03-04
Anticipated expiration: 2023-09-12
Also published as: JP2005091024A

Description

本発明は、スペクトル吸光度を用いた定量方法、特にフーリエ変換型赤外分光光度計等のスペクトル測定装置における定量方法及びその装置の改良に関する。

赤外吸収スペクトルの測定は、試料の定性分析、定量分析に利用されており、試料濃度の定量分析は次の式を基礎として行なわれている。
ｌｏｇ（Ｉ_０／Ｉ）＝εｃｌ
ここで、Ｉ_０は入射光の強度、Ｉは透過光の強度、εは吸光係数、ｌが試料の厚み、ｃが試料の濃度を示している。Ｉ／Ｉ_０を透過度と呼び、その逆数の常用対数、Ａ＝ｌｏｇ（Ｉ_０／Ｉ）、が吸光度と呼ばれる量である。
目的物質の標準物質に対して、複数の濃度で吸光度を測定し、横軸を標準物質の濃度、縦軸を吸光度にとった検量線を作成し、定量分析を行なう。上式から分かるように吸光度は濃度に比例することから、原理的には検量線は直線となる。

しかしながら、赤外分光光度計では、分光手段としてマイケルソン干渉計を用いたフーリエ変換赤外分光法(ＦＴ／ＩＲ)が主に用いられているが、このＦＴ／ＩＲで測定を行なったとき、線幅の狭い吸収帯の縦軸値が、低分解能測定では試料濃度に関係なく吸光度がある一定値で飽和するという現象が起こる。
この現象の原因は特定されておらず、低分解測定では直線関係にない検量線のままで定量分析を行っているというのが現状である。
本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、その目的は、吸光度と試料濃度の間の比例関係を回復するための検量方法を提供することにある。

上記の現象について本発明者らが検討を行なった結果、縦軸直線性の歪みは、吸収帯の線幅に対して測定分解能が低すぎることで振幅情報が欠落したことが原因であることを突き止めた。
つまり、分解能が低い装置では干渉計の最大光路差が十分大きくないため、インターフェログラムの持つ振幅情報の一部を落としてしまう。その結果、測定分解能に比べ、ピーク幅の小さい吸収スペクトルに対しては、そのピーク高さが欠落した振幅情報の分だけ小さくなってしまう。このピーク高さの減少は、元のピーク高さ、つまり、干渉計の最大光路差が無限大としたときに得られるはずのピーク高さ、に応じて一定割合で減少する。吸光度を算出する際には、対数変換を行なう必要があるが、上記のようにピーク高さに一定割合の誤差が含まれると、吸光度値での誤差は一定割合とはならず非線形な誤差を生じる。つまり、吸光度値は透過率が小さい極限では一定値に漸近することになる。以上が、本発明者によって究明された縦軸直線性の歪みの原因である。

また、上記のピーク値の減少の割合値(以下では、縦軸係数と呼ぶ)は、吸収ピークの形状及び半値半幅と、干渉計の最大光路差とを与えることで計算可能である。吸収ピークの形状は、一般にローレンツ波形やガウス波形等として扱うことが可能であり、また、ピークの半値半幅も他のデータからある程度推定することは可能である。よって、ピークの形状及び半値半幅を仮定することで、上記の縦軸係数を求めることができ、測定された吸光度から、試料濃度に比例した真の吸光度を求めることが可能となる。

つまり、本発明の検量方法は、試料のインターフェログラムを検出してスペクトル測定を行うフーリエ変換型スペクトル測定装置から得られるスペクトルデータを用いた検量方法において、干渉計の最大光路差が有限値Ｌのときと、最大光路差が無限としたときとの、ピーク高さの比である縦軸係数ａを、測定吸収帯のピーク形状及び半値半幅を仮定することで算出する縦軸係数演算工程と、前記スペクトルデータから得た実測スペクトル吸光度Ｍを、前記縦軸係数ａを用いて下記の数式によって、真のスペクトル吸光度Ｈに補正する補正工程と、を含むことを特徴とする。

また、本発明のスペクトル測定装置は、試料のインターフェログラムをフーリエ変換することでスペクトルデータを得るフーリエ変換型のスペクトル測定装置において、干渉計の最大光路差が有限値Ｌのときと、最大光路差が無限としたときとの、ピーク高さの比である縦軸係数ａを、測定吸収帯のピーク形状及び半値半幅を仮定することで算出する縦軸係数演算手段と、前記スペクトルデータから得た実測スペクトル吸光度Ｍを、前記縦軸係数ａを用いて下記の数式から、真のスペクトル吸光度Ｈに補正する補正手段と、を備えることを特徴とする。

本発明の検量方法によれば、縦軸係数ａを測定吸収帯のピーク形状及び半値半幅を仮定することで算出し、該縦軸係数ａを用いて実測スペクトル吸光度Ｍを真のスペクトル吸光度Ｈに補正しているため、吸光度と試料濃度との比例関係が回復する。
また、本発明のスペクトル測定装置によれば、縦軸係数ａを算出する縦軸係数演算手段と、該縦軸係数ａを用いて、実測スペクトル吸光度Ｍから真のスペクトル吸光度Ｈを算出するための補正手段と、を備えているので、試料濃度との比例関係が回復した吸光度が得ることが可能である。

まず、上記課題の欄で述べた現象の原因を特定するために行なったシミュレーションについて説明する。
まず、シミュレーションのためのデータとして、中心を２０００点、高さ１で半値半幅６００点のガウス波形をした８１９２点のバックグラウンドデータ(つまり、赤外光源のスペクトルを示している)と、同じく２０００点を中心に高さ１で半値半幅５と３０点のローレンツ波形を持つ吸収ピークデータと、を作成した。この吸収ピークデータの高さを変化させたものをバックグラウンドデータから減算することでサンプルデータを作成した。図３にそのバックグラウンドデータ(図３上図)と、半値半幅３０点の吸収ピークデータをバックグラウンドデータから引いたサンプルデータ(図３下図)を示す。これらのデータを原点を中心に対称に折り返し偶関数としたものを逆フーリエ変換し、インターフェログラムデータを作成する。

作成した片側８１９２点のインターフェログラムデータを、通常の測定の際に行なうように、アポダイゼーション関数を適用してフーリエ変換を行い、スペクトルの算出を行なう。また、低分解能の場合をシミュレーションするため、上記の片側８１９２点のインターフェログラムデータの両端をカットし、片側１０２４点のインターフェログラムデータも作成した。この片側１０２４点のインターフェログラムデータも上記と同様にフーリエ変換し、スペクトルの算出を行なう。

図４は半値半幅５または３０点の吸収ピークの高さを吸光度０．０１から３まで変化させて、さらにアポダイゼーション関数と分解能を変化させて得られたそれぞれの場合のピーク高さ(縦軸)と、正しい吸光度値を与えるピーク高さ(横軸)をプロットした結果を示す。図４の上図が半値半幅が５の場合、下図が半値半幅が３０の場合を示している。

また、アポダイゼーション関数Ａ(ｘ)として以下の式で表されるＢｏｘｃａｒとＣｏｓｉｎｅを適用した。
Ｂｏｘｃａｒ
Ａ(ｘ)＝１ (０≦ｘ≦Ｌ)，０ (|ｘ|＞Ｌ)
Ｃｏｓｉｎｅ
Ａ(ｘ)＝[１＋ｃｏｓ(πｘ／Ｌ)]／２
ここで、Ｌは最大光路差を示す。

図４上図の符号４１０の実線が半値半幅５の８１９２点のＣｏｓｉｎｅの場合、符号４１２の実線が半値半幅５の１０２４点のＢｏｘｃａｒの場合、符号４１４の実線が半値半幅５の１０２４点のＣｏｓｉｎｅの場合をそれぞれ示している。また図４下図の符号４１６の実線が半値半幅３０の１０２４点のＢｏｘｃａｒの場合、符号４１８の実線が半値半幅５の８１９２点のＣｏｓｉｎｅの場合、符号４２０の実線が半値半幅３０の１０２４点のＣｏｓｉｎｅの場合をそれぞれ示している。

縦軸直線性がある場合には傾き１の直線になるはずであるが、半値半幅３０の１０２４点のＢｏｘｃａｒの場合(符号４１６の実線)を除いてすべて非線形に歪んでいる。半値半幅が小さいものの方が歪みが大きく、さらに、同じ半値半幅ではアポダイゼーション関数としてＣｏｓｉｎｅを用いたものの方が、Ｂｏｘｃａｒを用いたものよりも歪みが大きいことが分かる。このことから測定やスペクトル算出時のピークのなまりに直線性が歪む原因があると考えられる。

そこで、ピークのなまりの要因を探るため、バックグラウンドデータと吸収データを分離してスペクトル算出を行なった。図５(ａ)と(ｅ)にバックグラウンドデータとその逆フーリエ変換後のインターフェログラムデータを示す。また、図５(ｂ)と(ｆ)は吸収ピークデータとその逆フーリエ変換後のインターフェログラムデータを示しいる。

バックグラウンドデータはスペクトル面でブロードな形状をしているため、そのインターフェログラムはセンターバースト付近から急激に減衰した振動波形となっている。一方吸収スペクトルデータはスペクトル面で輝線状であるため、そのインターフェログラムの振動波形は急激には減衰しない。図５(ｇ)は図５(ｅ)のインターフェログラムの両端をカットして８分の１にしたもので、それをフーリエ変換をしたものを図５(ｃ)に示す。図５(ｃ)をもとの波形である図５(ａ)と比較しても、もともとスペクトル形状はブロードなものであったため、違いはほとんどない。

図５(ｈ)は図５(ｆ)のインターフェログラムの両端をカットして８分の１にしたもので、それをフーリエ変換したものを図５(ｄ)に示す。こちらは図５(ｂ)と比較して分解能が劣化しているため線幅が拡がり、さらにピーク高さも小さくなっている。
図５(ｃ)ではピーク高さは変わらないのに、図５(ｄ)ではピーク高さが小さくなっている理由は、インターフェログラムの振幅が十分減衰していない所で打ち切ったことにより振幅情報が欠落したためである。一般に単一スペクトルではインターフェログラムの振動形状がスペクトル形状を、振動波形の周期がスペクトル位置を、そして振動波形の振幅または面積がピーク高さを決める。

例えば、図５(ｆ)の振動波形の絶対値の面積は１．２７３２であり、図５(ｈ)の面積は１．０９４５であり、それらの比は０．８５９６となる。これは図５(ｄ)のピーク高さに等しい。つまり、インターフェログラムの打ち切りによるピーク高さの減少は元のピーク高さに応じて一定割合で減少することになる。
このことは、一見どのピーク高さでも同じ影響を受けるので悪くないようにも思える。しかし、ＦＴ／ＩＲでは濃度に対して縦軸直線性を得るためにスペクトル算出時に対数変換を行なっている。このことから、ピーク高さに一定割合の誤差が含まれると吸光度値での誤差は一定値とはならず非線形な誤差を生じることが分かる。つまり、透過率値が小さいほど最終的な誤差は大きくなり、一定割合値を対数変換した値に漸近する。

実際に縦軸値の大きさに応じた一定割合の誤差を導入して対数変換時の誤差を求めたものを図６に示す。図６の横軸が試料濃度、縦軸が吸光度である。一定割合の誤差として図４での半値半幅５の場合の、１０２４点のインターフェログラムと８１９２点のインターフェログラムとの面積比を使用した。符号６１２の実線がＢｏｘｃａｒの場合、符号６１４の実線がＣｏｓｉｎｅの場合を示している。加えて、符号６１６の丸印で図４の１０２４点のＢｏｘｃａｒの場合の結果、符号６１８の三角印で図４の１０２４点のＣｏｓｉｎｅの場合の結果、を重ね書きしている。実線とシミュレーションの結果である丸印及び三角印が完全に一致している。
以上のことから縦軸直線性の歪みは、吸収帯の線幅に対して測定分解能が低すぎることで振幅情報が欠落したことが原因であると言える。

以上の原因を理解すると、測定分解能が低すぎるために縦軸値が歪んでしまったものでも元に戻せることが分かる。本発明はその方法を具体的に示したものである。
まず、フーリエ変換型のスペクトル測定装置の簡単な説明をしておく。図２はその概略構成図であり、スペクトル測定装置として赤外分光光度計を用いた場合を示している。図２のスペクトル測定装置２１０は、赤外光を発する光源２１２と、該光源２１２からの赤外光を干渉光とするためのマイケルソン干渉計等からなる干渉計２１４と、試料２１６からの透過光を検出するための検出器２１８とを備えている。

この赤外分光光度計は通常用いられているものと同じものである。つまり、前記干渉計２１４からの干渉光の光路上に試料２１６が設置される。該干渉光を試料２１６に照射し、試料２１６からの射出光を検出器２１８で検出することで試料のインターフェログラムを得る。検出器２１８からの信号は、パーソナルコンピュータ等からなるデータ処理系２２０へと送られ、そこでインターフェログラムをフーリエ変換することでスペクトルデータが得られる。このスペクトルデータから透過率を求め対数変換することでスペクトル吸光度を得る。
本発明の検量方法は、このようにして得られた実測のスペクトル吸光度から、試料濃度に比例する真のスペクトル吸光度を得るというものである。以下にその検量方法を図１を参照して説明する。

まず、ステップ１００(吸光度測定工程)では上記のようにして実測のスペクトル吸光度を測定する。次にステップ１１０(縦軸係数演算工程)で、干渉計の最大光路差が有限値Ｌのときと、最大光路差が無限遠としたときとのピーク高さの比である縦軸係数ａを算出する。該縦軸係数ａは、吸収ピークの形状及び半値半幅を仮定し、測定に使用した装置の干渉計の持つ最大光路差を与えることで算出できる。そして、ステップ１２０(補正工程)では、実測スペクトル吸光度Ｍを、前記縦軸係数ａを用いて真のスペクトル吸光度Ｈに補正する。

次に各ステップの詳細を説明する。まず、縦軸係数を算出するステップ１１０を次の三つのステップ(ステップ１１２、１１４、１１６)に分けて説明する。
初めにステップ１１２では、測定の対象となる吸収帯のピーク形状及び半値半幅を仮定する。ピーク形状としては、ローレンツ波形、ガウス波形、実際の測定データをフィッティングして得たデータ等、適切な形状を選べばよい。
また、仮定するピーク形状及び半値半幅は、他のデータ、例えば別に高分解測定を行なったときの結果をフィッティングして得たデータ等、から推定できる。

ステップ１１４では、仮定したピーク形状に対応するインターフェログラムＦ(ｘ)を取得する。このインターフェログラムは、上記で仮定したピーク形状及び半値半幅と、装置のアポダイゼーション関数とにより求めることができる。
ステップ１１６では、上記のインターフェログラムＦ(ｘ)を用いて、下記の式より縦軸係数ａを算出する。

ここで、Ｌは最大光路差、ν_０は吸収帯のピーク位置(波数)である。つまり、最大光路差が無限大という理想的なときのピーク高さと、有限の最大光路差Ｌを持つ実際のピーク高さの比を求めている。この有限の最大光路差Ｌは、測定に用いた装置の干渉計によって決まる。また、実際の計算の上では、分母の積分区間は∞(無限大)までではなく十分に大きな値で近似して差し支えない。

ステップ１２０では、ステップ１１０で求めた縦軸係数ａを用いて、実測のスペクトル吸光度Ｍから真のスペクトル吸光度を以下の式を用いて算出する。

以上のようにして求められた真のスペクトル吸光度Ｈは、試料濃度との比例関係を回復したものとなる。よって、真のスペクトル吸光度Ｈを用いれば、一次式の検量線を作成することができるため、測定分解能や試料濃度に依存しない定量精度を得ることが可能となる。

また、ここで仮定した吸収帯の真のピーク形状は、例えば高分解能測定の結果をフィッティングすることで推定できるため、一度だけ高分解能測定を行ない、次の測定からは低分解能測定を行なうというようにすることで、測定時間を著しく短縮することが可能となる。
また、真のピーク形状が既知であれば低分解能のデータでも縦軸直線性の回復は可能である。すなわち低分解能のデータでも高分解能のデータと同様な検量線の直線性を得ることができる。つまり、高分解能測定が行なえない汎用機でも高級機と同等な精度の定量分析を行なうことが可能である。
さらに、縦軸直線性が回復すれば、原理的には標準試料測定が一点でも検量線の作成を行なうことができる。

次に例として、吸収帯の真のピーク形状をローレンツ波形で半値半幅σと仮定した場合を具体的に説明する。この場合のインターフェログラムＦ(ｘ)は下記の式のようになる。

ここで、アポダイゼーション関数Ａ(ｘ)はＣｏｓｉｎｅとした。また、ｘは光路差、ν_０は吸収帯位置、Ｌは最大光路差を示している。上式から分かるように、インターフェログラムの形状はピーク形状の指数減衰関数、ピーク位置の余弦関数およびアポダイゼーション関数で表すことができる。

このインターフェログラムＦ(ｘ)を数３に当てはめれば、次の式のように縦軸係数ａが求まることとなる。

上式のｃｏｓ^２(２πν_０ｘ)の因子は、ｃｏｓ^２(２πν_０ｘ)＝｛１＋ｃｏｓ(４πν_０ｘ)｝／２と変形できる。ここで、実際の測定においてのピーク位置ν_０は極低波数ではないので、上記余弦関数の周期は十分に短い。つまり、ｃｏｓ(４πν_０ｘ)の因子は正負に早く振動するため、その積分値は十分小さくなり、無視することができる。従って、最大光路差Ｌでインターフェログラムの測定を打ち切ったことによるピーク高さのなまりは、指数減少関数とアポダイゼーション関数Ａ(ｘ)との積を、最大光路差Ｌまで積分して得られる面積と、無限遠まで積分して得られる面積との比で決まる。つまり、縦軸係数ａは以下の式から求まる。

この式を用いて、実際に図６の符号６１２で示された実線の縦軸値を真値に復元したものが図６で符号６１０で示された実線である。図６より明らかに完全に直線性が保たれた状態に復元できたことが分かる。

次に本発明のスペクトル測定装置の説明を行なう。図２がその概略構成図である。図２のスペクトル測定装置は、上記の検量方法を実行するため、データ処理系２２０内に、縦軸係数を算出するための縦軸係数演算手段２２２と、測定したスペクトルデータから得た実測スペクトル吸光度Ｍを、前記縦軸係数ａを用いて真のスペクトル吸光度Ｈに補正する補正手段２２４と、を備えている。次に装置の作用を説明する。

まず、検出器２１８から得れれたインターフェログラムデータはデータ処理系に送られ、記憶手段２２６に記憶される。このインターフェログラムデータは、フーリエ変換手段２２８によって、スペクトルデータとされる。そして、該スペクトルデータから吸光度演算手段２３０によって、実測のスペクトル吸光度を得る。そして、これらのデータは記憶手段２２６に記憶される。

次に設定手段２３２によって、ピーク形状の選択、半値半幅、干渉計の最大光路差、アポダイゼーション関数の選択、等の設定を行なう。設定手段２３２は、データ処理系２２０を構成するパーソナルコンピュータの入力装置等からなり、装置の使用者が条件に応じて上記の設定を行ない、設定データは記憶手段２２６に記憶される。そして、設定手段２３２による設定に基づき、縦軸係数演算手段２２２によって縦軸係数ａを算出する。縦軸係数の算出は上記の数３を用いて行なえばよい。
補正手段２２４では、吸光度演算手段によって得られた実測のスペクトル吸光度Ｍと、前記縦軸係数ａから数４の式に従って、真のスペクトル吸光度を算出する。
以上のような構成の結果、低分解能の測定でも試料濃度との比例関係が回復した真のスペクトル吸光度Ｈを求めることが可能となる。

以上が本発明の説明であるが、検量線の直線性に歪みが生じるという現象の原因を理解したことで、その他の応用も考えられる。以下にそのうちの幾つかを述べる。
必要測定分解能の見積もり
縦軸係数ａから一次の検量線による定量精度と測定分解能を見積もることもできる。つまり、実測スペクトル吸光度Ｍと真のスペクトル吸光度Ｈの関係を示した式(数４)から、要求される定量精度に必要な縦軸係数ａの値を見積もることができる。この縦軸係数ａを保証するような最大光路差Ｌを数３から求めればよい。
例えば、吸光度０〜１の範囲で定量精度１％以上が要求される場合には、ａが０．９９７４１２以上となる最大光路差Ｌまでの測定分解能が最低限必要となる。

検量線の対数関数フィッティング
従来では、縦軸直線性の歪みの原因ははっきりと特定されていなかったため、検量線のフィッティングを多項式近似によっておこなっていた。
しかしながら、上記のシミュレーション解析から分かったように、対数関数によってフィッティングを行なう方が正確なことが分かる。
つまり、複数の異なった濃度を持つ標準試料の吸光度を測定し、横軸を試料濃度、縦軸を吸光度としてプロットする。これを対数関数を用いてフィッティングを行なえばよい。

半値半幅の推定
上記では、ピークの半値半幅を仮定して、試料濃度との比例関係を回復した真の吸光度に補正する方法を説明したが、吸光度と試料濃度の直線性からピークの半値半幅を推定することができる。つまり、ピークの関数形は仮定して、ピークの半値半幅σを未知とする。そして、通常の検量線の作成と同様にして、幾つかの異なる濃度を持った試料のスペクトル吸光度を測定する。
次に半値半幅を仮の値に固定し、上記数３より仮の縦軸係数を求める。そして、数４によって、上記複数の実測のスペクトル吸光度から、仮のスペクトル吸光度をそれぞれ求める。
このようにして求められた複数の濃度に対する仮のスペクトル吸光度を用い、仮の検量線を作成する。

以上の手順を半値半幅の値を変化させて行なう。そして仮の検量線の直線性がもっとも回復したときの半値半幅の値を求める。例えば、相関係数を計算して所定の値以上になるときの半値半幅を真の半値半幅の推定値とすればよい。このように、補正式による検量線の直線性の回復を利用して、測定吸収帯の真の半値半幅を推定することができる。

本発明の検量方法の説明図本発明のスペクトル測定装置の概略構成図シミュレーションのためのスペクトルデータシミュレーションデータから得た検量線ピークなまりの説明図シミュレーション結果のグラフ

符号の説明

１００吸光度測定工程
１１０縦軸係数演算工程
１２０補正工程

Claims

光源から発される赤外光を干渉計に照射し、該干渉計の最大光路差が有限長Ｌであり、該干渉計から生ずる干渉光を試料に照射し、試料照射後のインターフェログラムＦ（ｘ）を検出してスペクトル測定を行うフーリエ変換型スペクトル測定装置から得られるスペクトルデータを用いた検量方法において、
該干渉計の該最大光路差の有限長Ｌのピーク高さと、最大光路差を無限としたときのピーク高さとの比である縦軸係数ａを、該インターフェログラムＦ（ｘ）と、
ピーク位置ｖ _０を用いて下記の数式によって算出する縦軸係数演算工程と、

前記スペクトルデータから得た実測スペクトル吸光度Ｍを、前記縦軸係数ａを用いて下記の数式によって、真のスペクトル吸光度Ｈに補正する補正工程と、を含むことを特徴とする検量方法。
光源から発される赤外光を干渉計に照射し、該干渉計の最大光路差が有限長Ｌであり、該干渉計から生ずる干渉光を試料に照射し、試料照射後のインターフェログラムＦ（ｘ）をフーリエ変換することでスペクトルデータを得るフーリエ変換型のスペクトル測定装置において、
該干渉計の該最大光路差の有限長Ｌのピーク高さと、最大光路差を無限としたときのピーク高さとの比である縦軸係数ａを、該インターフェログラムＦ（ｘ）と、
ピーク位置ｖ _０を用いて下記の数式によって算出する縦軸係数演算手段と、

前記スペクトルデータから得た実測スペクトル吸光度Ｍを、前記縦軸係数ａを用いて下記の数式から、真のスペクトル吸光度Ｈに補正する補正手段と、を備えることを特徴とするスペクトル測定装置。