JP6396303B2 - アルブミン結合を含有するタンパク質の分離方法 - Google Patents
アルブミン結合を含有するタンパク質の分離方法 Download PDFInfo
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Description
i)EX2X3X4AX6X7EI X10X11LPNLX16X17X18QX20 X21AFIX25X26LX28D
(配列中、互いに独立して、
X2は、F、IおよびLから選択され;
X3は、H、K、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
X4は、A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X6は、F、I、LおよびYから選択され;
X7は、A、H、I、K、L、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
X10は、G、H、K、N、Q、RおよびSから選択され;
X11は、A、D、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、VおよびYから選択され;
X16は、NおよびTから選択され;
X17は、F、H、L、SおよびTから選択され;
X18は、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
X20は、H、KおよびRから選択され;
X21は、I、LおよびVから選択され;
X25は、F、I、L、VおよびYから選択され;
X26は、KおよびSから選択され;
X28は、DおよびEから選択される)
および
ii)i)に定義された配列と少なくとも89%の同一性を有するアミノ酸配列
選択されるアミノ酸配列からなる方法を提供する。
・リガンド結合マトリックスml当たりのより高い精製能力。
・例えば0.5M水酸化ナトリウムを用いた定置洗浄の反復手順との適合性、それによりABD結合ポリペプチドは、治療用物質の大規模生産に有用となる。
・より温和な溶離条件、例えばより高いpHでの溶離の使用可能性、それによりABDを含むより広い範囲さまざまな分子の精製が可能となる。
X2は、FおよびLから選択され;
X3は、H、K、R、TおよびVから選択され;
X4は、A、H、I、L、N、VおよびWから選択され;
X6は、FおよびLから選択され;
X7は、K、L、N、Q、RおよびSから選択され;
X10は、H、K、NおよびRから選択され;
X11は、A、F、L、R、TおよびYから選択され;
X16は、Tであり;
X17は、F、HおよびLから選択され;
X18は、D、H、I、KおよびQから選択され;
X20は、HおよびRから選択され;
X21は、IおよびLから選択され;
X25は、I、LおよびVから選択され;
X26は、Kであり;そして
X28は、Dである。
X2は、FおよびLから選択され;
X3は、H、K、TおよびVから選択され;
X4は、H、L、NおよびVから選択され;
X6は、FおよびLから選択され;
X7は、K、R、QおよびSから選択され;
X10は、H、KおよびNから選択され;
X11は、A、F、TおよびYから選択され;
X16は、Tであり;
X17は、F、HおよびLから選択され;
X18は、D、HおよびQから選択され;
X20は、Rであり;
X21は、IおよびLから選択され;
X25は、I、LおよびVから選択され;
X26は、Kであり;そして
X28は、Dである。
I.X2は、FおよびLから選択される;
II.X6は、FおよびLから選択される;
III.X16は、Tである;
IV.X20は、HおよびRから選択される;
V.X21は、IおよびLから選択される;
VI.X25は、IおよびVから選択される;
VII.X26は、Kである;および
VIII.X28は、Dである。
iii)K−[BM]−DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ;
(配列中、
[BM]は、上に定義されたようなABD結合モチーフであり;
Xaは、AおよびSから選択され;
Xbは、NおよびEから選択され;
Xcは、A、SおよびCから選択され;
Xdは、AおよびSから選択される)
および
iv)iii)によって定義された配列と少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。
てXdは、Sである。
v)YAK−[BM]−DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P;
(配列中、[BM]は、上に定義されたようなABD結合モチーフであり、そしてXcは、SおよびCから選択される)および
vi)v)によって定義された配列と少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、上に定義されたようなABD結合ポリペプチドの開示された分離方法における使用が提供される。
vii)YAK−[BM]−DPSQS SELLXc EAKKL NDAQA P;
(配列中、[BM]は、上に定義されたようなABD結合モチーフであり、そしてXcは、AおよびCから選択される)および
viii)vii)によって定義された配列と少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、上に定義されたようなABD結合ポリペプチドの開示された分離方法における使用が提供される。
ix)FNK−[BM]−DPSQS ANLLXc EAKKL NDAQA P;(配列中、[BM]は、上に定義されたようなABD結合モチーフであり、そしてXcは、AおよびCから選択される)および
x)ix)によって定義される配列に少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、上に定義されたようなABD結合ポリペプチドの開示された分離方法における使用が提供される。
ADNNFNK−[BM]−DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;
ADNKFNK−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
ADNKFNK−[BM]−DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;
ADAQQNNFNK−[BM]−DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;
AQHDE−[BM]−DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;
VDNKFNK−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;および
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの一部を形成してもよい。
xi)VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;(配列中、[BM]は、上に定義されたようなABD結合モチーフである)および
xii)xi)に定義された配列と少なくとも84%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む。
特記した場合を除いて、本研究の全体を通じて以下の物質を用いた:
・大腸菌(Escherichia coli)株XL1-Blue(アジレント・テクノロジー(Agilent Technologies)、カタログ番号200268)
・WO2009/016043またはWO2012/004384に記載されたとおり本質的に産生されたアルブミン結合ドメインABD001(配列番号:157)、C−ABD001(配列番号:158)、ABD035(配列番号:159)、PP013(配列番号:160)、PEP07986(配列番号:161)およびPEP07911(配列番号:162)。
ABD結合Z変異体の選択およびスクリーニング
物質および方法
標的タンパク質のビオチン化:EZ−リンクマレイミドPEG2−ビオチン(EZ-Link Maleimide PEG2-Biotin)(ピアース(Pierce)、カタログ番号21901)を用いて、N末端システインを有するABD001(C−ABD001;配列番号:158)およびPEP07911(配列番号:162)を、ビオチン化した。簡潔に言えば、タンパク質を、50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、2mM EDTA、pH7.5に溶解した。ジチオトレイトール(DTT)を20mMの最終濃度まで加え、試料を回転混合により34℃で1時間インキュベートした。使い捨てのPD−10カラム(GEヘルスケア(GE Healthcare)、カタログ番号17−0851−01)を用いて、緩衝液を結合緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、1mM EDTA、pH7.0)に交換した。5倍(5×)モル過剰のEZ−リンクマレイミドPEG2−ビオチン(EZ-Link Maleimide PEG2-Biotin)(結合緩衝液に溶解した)をタンパク質試料に加え、回転混合により室温(RT)で2時間インキュベーションを進行させた。その後のPBS(10mMリン酸、137mM NaCl、2.68mM KCl、pH7.4)への緩衝液交換は、PD−10カラムを用いて実施した。PEP07986(配列番号:161)は、No−Weigh EZ−リンクスルホ−NHS−LC−ビオチン(No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin)(ピアース(Pierce)、カタログ番号21327)を10×モル過剰で用いて、製造元の推奨に従って室温で30分間ビオチン化した。その後のPBSへの緩衝液交換は、透折カセット(Slide-a-lyzer 3.5 K、3500 MWCO、ピアース、カタログ番号66333)を用いて製造元の説明書に従って実施した。
ABD結合Z変異体のファージディスプレイ選択:ビオチン化ABDの異なる変異体に対するファージディスプレイ選択の3つのサイクル後、個々のクローンを得た。ファージ粒子収率(ファージ粒子アウト(out)/ファージ粒子イン(in))は、各サイクルで増加し、標的結合クローンの富化を示している。
ABD結合Z変異体のクローニングおよび産生
物質および方法
Z変異体のサブクローニング:7つのABD結合Z変異体のDNA、Z06608(配列番号:107)、Z06620(配列番号:110)、Z06638(配列番号:106)、Z06650(配列番号:108)、Z06677(配列番号:105)、Z06678(配列番号:109)およびZ06695(配列番号:111)を、ライブラリーベクターpAY02047から増幅した。標準分子生物学的手法を用いて、他の標的を結合するZ変異体についてWO2009/077175に詳細に記載されたとおり、N末端His6タグおよびC末端Cysを有する二量体Z変異体分子を作製するためのサブクローニング戦略を適用した。Z遺伝子フラグメントは、発現ベクターpAY01449にサブクローニングしてコードされた配列MGSSHHHHHHLQ−[Z#####][Z#####]−VDCを生成した。
培養および精製:7つのABD結合Z変異体Z06608(配列番号:107)、Z06620(配列番号:110)、Z06638(配列番号:106)、Z06650(配列番号:108)、Z06677(配列番号:105)、Z06678(配列番号:109)およびZ06695(配列番号:111)を、N末端His6タグおよびC末端Cysを有する二量体として作製し、E. coli中で適切に発現させた。細菌ペレット4.8gからのIMAC精製タンパク質の量は、分光測光法により280nmで吸光度を測定することによって決定され、種々のABD結合Z変異体について3mgから19mgの範囲であった。
ABD結合Z変異体の結合および溶離特性の評価
本実施例では、実施例1および2に記載されたとおり選択および産生された一連のABD結合ポリペプチドの結合および溶離特性を、それぞれ、スピンカラムを用いた小規模フォーマットで研究した。
樹脂へのABD結合Z変異体の結合:実施例2に記載されたとおり産生されたフォーマットHis6−(Z#####)2−Cysの凍結乾燥されたそれぞれのABD結合Z変異体Z06608、Z06620、Z06638、Z06650、Z06677、Z06678およびZ06695 1mgを還元緩衝液(50mM Tris−HCl、5mM EDTA、20mM DTT、pH8.5)中で再懸濁し、そして室温で2時間インキュベートした。還元されたタンパク質溶液を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて50mM DTTを含むカップリング緩衝液(50mM Tris−HCl、5mM EDTA、pH8.5)に移し、次いで、スルホリンクカップリングレジン(SulfoLink Coupling Resin)(サーモフィッシャーサイエンティフィック(Thermo Fisher Scientific)、カタログ番号20401)0.2mlの部分と混合した。この手順により、ABD結合Z変異体のC末端システイン残基のチオール基と樹脂のヨードアセチル基との間の部位特異的反応が可能となり、共有結合性のチオエーテル結合が形成される。結合反応は、製造元の説明書に従って実施した。結合度は、樹脂ml当たり結合したABD結合Z変異体のmgとして定義され、以下のように決定した:結合したABD結合Z変異体の量は、280nmでの吸光度の分光光度測定によって得られた濃度に基づいて、試料の最初の量から未結合の物質の量を引いて算出した。次いで、結合したABD結合Z変異体のmgでの量を、スルホリンクカップリングレジン(SulfoLink Coupling Resin)の体積で割った。
ABD結合ポリペプチドの結合効率:スルホリンクカップリングレジン(SulfoLink Coupling Resin)に対する各ABD結合ポリペプチドの結合度を表3に示す。
プロファイルを示しており、試料適用および洗浄中の試料漏出が少なく、大部分の試料がpH2.5の緩衝液による溶離で遊離された。
実施例3に示した結果に基づくABD結合Z変異体のさらなる特徴づけおよびカラム研究
クロマトグラフィー系に連結するカラムにおけるさらなる特徴づけおよび研究のためHis6−(Z06677)2−Cysを選択した。
円偏光二色性分析による融点の測定:His6−(Z06677)2−Cysの融点(Tm)を決定するため円偏光二色性(CD)分析を実施した。精製した試料をPBSで0.5mg/mlまで希釈した。可変温度測定(VTM)を実施し、その際、20℃から90℃までの試料の加熱中、5℃/分の温度勾配で220nmの吸光度をモニターした。温度プロットに対するCDシグナルの遷移の中間点からTmを決定した。CD測定は、光路長1mmのセルを用いてJasco J-810分光偏光計(ジャスコスカンジナビアAB(Jasco Scandinavia AB))において実施した。
円偏光二色性分析:His6−(Z06677)2−Cysの融点は、54℃であると決定された。
異なる樹脂に固定化されたABD結合Z変異体のカラム研究
本実施例では、ABD結合Z変異体His6−(Z06677)2−Cysを4つの異なるタイプの樹脂に固定化し、そして結合能力および耐アルカリ性をクロマトグラフィー的に評価した。
異なる樹脂に対するHis6−(Z06677)2−Cysの結合:凍結乾燥したHis6−(Z06677)2−Cys(実施例2に記載したとおり産生した)4mgを0.1M NaHCO3 1ml、0.5M NaCl、pH8.3に溶解した。試料の半分をNHS活性化セファロース4ファーストフロー(NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow)(GEヘルスケア、カタログ番号17−0906)0.67mlに固定化し、そして試料の半分をCNBr活性化セファロース4ファーストフロー(CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow)(GEヘルスケア、カタログ番号17−0981)0.67mlに固定化した。両結合反応は、製造元による説明書に従って実施した。
異なる樹脂に対するABD結合Z変異体His6−(Z06677)2−Cysの結合:本実験で評価した4つの異なる樹脂のそれぞれに対するHis6−(Z06677)2−Cysの固定化の程度を、表5に示す。
抗ABDアガロースの製造
本実施例は、二量体フォーマットで、C末端Cysを有するABD結合Z変異体Z006677、すなわち(Z06677)2−Cysのより大規模な産生、およびスルホリンク樹脂上でのその後の固定化を記載する。
培養および精製:ABD結合Z変異体Z06677を、発現がT7プロモーターによって調節される発現ベクターに二量体としてサブクローニングした。さらなるN末端アミノ酸配列GSSLQおよびさらなるC末端アミノ酸配列VDCを有するABD結合ポリペプチドを発現させた。したがって、発現されたポリペプチドは、配列GSSLQ−[Z06677][Z06677]−VDCを有する。E. coli BL21(DE3)細胞(ノバゲン(Novagen))をプラスミドで形質転換し、そして50μg/mlのカナマイシンで補充されたTSB+YE培地(酵母エキス入りトリプシンダイズブイヨン)20l中37℃で培養した。OD600=1で、最終濃度0.17mMのIPTGを加えてタンパク質発現を誘導し、そして培養物を37℃でさらに5時間インキュベートした。遠心分離によって細胞を集めた。
培養および精製:精製した二量体ABD結合Z変異体(Z06677)2−Cysを分光光度計において280nmで吸光度を測定することによって、そしてSDS−PAGEによって分析した。(Z06677)2−Cysはトリプトファンが欠如しており、280nmでの吸光度の測定値が低かった。したがって、Z変異体分子の濃度は、SDS−PAGE分析から推定し、それにはいくつかの異なる量の(Z06677)2−Cysが含まれた。SDS−PAGEゲルの目視検査により、(Z06677)2−Cysの濃度は、純度約95%で3.4mg/mlまでと推定された。
抗ABDアガロースを用いるPEP10986の精製
本実施例では、そのN末端でタンパク質Zのサイトカイン結合変異体に融合したアルブミン結合ドメイン(PP013、配列番号:160)を含むPEP10986(12.5kDa)を、抗ABDアガロースで充填されたカラムを用いて精製した。
可溶性のPEP10986を内部に有するペレット状のE. coli細胞を、ベンゾナーゼ(Benzonase)(R)20U/mlで補充されたTST−緩衝液(Tris、生理食塩水、Tween:25mM Tris−HCl、1mM EDTA、200mM NaCl、0.05%Tween20、pH8.0)中に懸濁した。細胞を超音波処理によって破壊し、細胞残屑を遠心分離によって除去した。クロマトグラフィーは、AEKTAexplorer 100系を用いて実施した。清澄化された試料を、抗ABDアガロース(実施例6に記載されたとおり製造した)100mlで充填され、TSTで予め平衡にしたXK−50カラムに適用した。カラムを8CVのTST、続いて8CVの5mM NH4Ac pH5.5で洗浄した。結合したタンパク質を、3CVの0.1M HAc(pH2.9)を適用することによって溶離した。SDS−PAGEおよびHPLC−MSによるさらなる分析のため、フロースルー画分、洗浄画分および溶出画分を集めた。
抗ABDアガロース樹脂におけるPEP10986の精製からのクロマトグラムを図8Aに示し、そして選択された画分のSDS−PAGE分析を図8Bに示す。図8B中のそれぞれレーン2、3および4に対応する溶出画分E1、E2およびE3を貯めた。PEP10986の正確な質量は、HPLC−MS分析によって検証し、そして純度は、SDS−PAGE分析から判断して95%より高いと推定された。分光光度分析により、貯留物には、精製されたPEP10986 908mgが含まれており、収率約90%に相当した。
抗ABDアガロースを用いるPEP03973の精製
本実施例では、そのN末端でタンパク質ZのHER2(ヒト上皮増殖因子受容体2)結合変異体に融合した野生型アルブミン結合ドメイン(ABD001、配列番号:157)を含むPEP03973(12.4kDa)を、抗ABDアガロースで充填されたカラムを用いて精製した。
可溶性のPEP03973を内部に有するペレット化E. coli細胞を、20U/mlのベンゾナーゼ(R)で補充されたTST−緩衝液中に懸濁した。細胞を超音波処理によって破壊し、細胞残屑を遠心分離によって除去した。AEKTAexplorer 100系を用いてクロマトグラフィーを実施した。清澄化された試料を、抗ABDアガロース(実施例6に記載したとおり製造した)100mlで充填され、TSTで予め平衡にしたXK−50カラムに適用した。カラムを、5CVのTST、続いて3CVの5mM NH4Ac pH5.5により洗浄した。結合したタンパク質を、3CVの0.1M HAc(pH2.9)を適用することによって溶離した。SDS−PAGEおよびHPLC−MSによるさらなる分析のためフロースルー画分、洗浄画分および溶出画分を集めた。
抗ABDアガロース樹脂上でのPEP03973の精製からのクロマトグラムを図9Aに示し、そして選択された画分のSDS−PAGE分析を図9Bに示す。図9B中のそれぞれレーン5、6および7に対応する溶出画分E2、E3およびE4を貯めた。PEP03973の正確な質量は、HPLC−MS分析によって検証し、そして純度は、SDS−PAGE分析から判断して95%より高いと推定された。分光光度分析によれば、貯留物は、精製されたPEP03973 1036mgを含んでおり、収率約97%に相当した。
抗ABDアガロースを用いるPEP06548の精製
本実施例では、TNF−α(TNFアルファ)に結合しているタンパク質Zの変異体の2つの部分(すなわち二量体)にN末端で融合したアルブミン結合ドメイン(ABD035、配列番号:159、C末端伸長VDCを有する)を含むPEP06548(20.3kDa)を、抗ABDアガロースで充填されたカラムを用いて精製した。また、PEP06548は、N末端ヘキサヒスチジンタグおよびC末端システイン残基を含む。
可溶性のPEP06548を内部に含むペレット化されたE. coli細胞を、27U/mlのベンゾナーゼ(R)で補充されたTST−緩衝液中で懸濁した。細胞を超音波処理によって破壊し、細胞残屑を遠心分離によって除去した。DTTを20mMの最終濃度まで添加し、続いて室温で30分間インキュベーションしてPEP06548試料分子のC末端システインを還元した。クロマトグラフィーは、AEKTAexplorer 100系を用いて実施した。清澄化および還元された試料を、抗ABDアガロース9mlで充填され、TSTで予め平衡にしたXK−16カラムに適用した。この抗ABDアガロースのバッチは、樹脂ml当たり約2.3mgの(Z06677)2−Cysのより低いリガンド密度を除いて、本質的に実施例6に記載したとおり調製した。カラムを、5.5CVのTST、続いて3.3CVの5mM NH4Ac pH5.5で洗浄した。結合したタンパク質を、2.9CVの0.1M HAc pH2.9を適用することによって溶離した。SDS−PAGEおよびHPLC−MSによるさらなる分析のため画分を集めた。
抗ABDアガロース樹脂上でのPEP06548の精製からのクロマトグラムを図10Aに示し、溶出画分E1のSDS−PAGE分析を図10Bに示す。SDS−PAGE分析から判断して、純度は95%より高いと推定された。40kDa付近のバンドが、試料分子のC末端システイン間の反応によって形成された二量体から誘導されたのは、ほぼ確実である。また、PEP06548、および二量体変異体の小さい方の部分の正確な質量は、HPLC−MS分析で確認された。
抗ABDアガロースを用いるPEP17081の精製
本実施例では、フォーマットZ−PEP07986−Zにおけるタンパク質Zのサイトカイン結合部分の2つの部分に融合したアルブミン結合ドメイン(PEP07986、配列番号:161)を含むPEP17081(18.6kDa)を、抗ABDアガロースで充填されたカラムを用いて精製した。その後の精製も記載する。
可溶性のPEP17081を内部に含むペレット化されたE. coli細胞を、TST−緩衝液中に懸濁した。細胞を、水浴中の熱処理(83℃、10分)、続いて氷上での冷却よって破壊した。ベンゾナーゼ(R)を15U/mlの最終濃度まで加えて核酸によって生じた粘度を低減した。細胞残屑を、遠心分離および濾過(0.45μmフィルター)によって除去した。
抗ABDアガロース樹脂上でのPEP17081の精製からのクロマトグラムを図11Aに示し、そしてSDS−PAGE分析を図11Bに示す。
抗ABDアガロースを用いるタンパク質ホルモンの精製
本実施例では、タンパク質ホルモンにそのC末端で融合したアルブミン結合ドメイン(ABD035、配列番号:159)を含むタンパク質1(22.6kDa;pI10)を、抗ABDアガロースが充填されたカラムを用いてAEKTAexplorer系において精製した。
タンパク質1を、封入体(inclusion body)の形態で、大腸菌中で発現させた。封入体の可溶化および再折たたみ後、緩衝液交換および精製のため、物質をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)に3回かけた。TST中で1:10希釈されたPBS中の8mgのSEC精製タンパク質1を、抗ABDアガロース10〜12mlで充填され、TSTで予め平衡にしたXK16/20カラム(GEヘルスケア)に0.5ml/分で装填した。カラムを、1ml/分の流速で、4CVのTSTで洗浄し、続いて5mM NH4Ac、pH5.5でさらに3CV洗浄した。結合したタンパク質を、3CVの0.1M HAc、pH2.9で溶離し、次いで、1M Tris−HCl、pH9でpH7に中和した。SDS−PAGEによるさらなる分析のため、フロースルー画分、洗浄画分および溶出画分を集めた。4〜12%のBis-Tris NuPAGEゲル(インビトロゲン)は、非還元で運転し、そしてタンパク質をシンプリーブルー(Simply Blue)(ライフテクノロジーズ)で染色した。溶離後、カラムをTSTで再び平衡にし、そして3CVの0.5M NaOH、続いて3CVのTSTにより定置(CIP)洗浄した。精製の間、樹脂をTST+20%のエタノール中に保存した。
抗ABDアガロース樹脂上でのタンパク質1の精製からのクロマトグラムを図12Aに示し、そして選択画分のSDS−PAGE分析を図12Bに示す。抗ABDアガロースカラム上に装填されたSEC精製タンパク質1の純度は、高かった。しかし、混在タンパク質の弱いバンドをSDS−PAGEゲル上で認めることができた。図12Bの矢印を参照のこと。これらの混在物質を、抗ABDアガロースカラム上の精製によって効果的に排除した。60倍濃縮された洗浄ステップからの試料をSDS−PAGEで分析し、そして混在物質を示した(ならびにタンパク質1の漏出;レーン6、図12B)。溶出タンパク質試料では混在物質が認められなかった(レーン7〜9、図12B)。溶出試料の純度は、SDS−PAGE分析から判断して98%より高いと推定された。溶出されたタンパク質1の正確な質量は、HPLC−MS分析によって検証された。
抗ABDアガロースを用いるペプチドホルモンの精製
本実施例では、ペプチドホルモンにそのN末端で融合したアルブミン結合ドメイン(ABD035、配列番号:159)を含むタンパク質2(9.5kDa、pI6.6)を、Pichia Pinkで発現させ、そして抗ABDアガロースで充填されたカラムを用いるAEKTAexplorer系において一段階で精製した。
分泌されたタンパク質2を含むPichia Pink上清100mlを凍結乾燥し、そしてDMSO(ジメチルスルホキシド)2ml中で再懸濁し、その後、TST200mlで希釈した。抗ABDアガロース10〜12mlで充填され、TSTで予め平衡にしたXK16/20カラムにおいて1ml/分で試料を装填した。カラムを8CVのTSTで洗浄し、5mM NH4Ac、pH5.5でさらに3CV洗浄した。培地からの混在タンパク質が高密度であるため、4CVのTSTの通常の洗浄を増やした。結合したタンパク質を、3CVの0.1M HAc、pH2.9で溶離し、次いで、1M Tris−HCl、pH9でpH4に調整した。溶離後、カラムをTSTで再び平衡にし、続いてCIP、そしてTST+20%エタノール中に貯蔵した。SDS−PAGEによるさらなる分析のため、フロースルー画分、洗浄画分および溶出画分を集めた。
抗ABDアガロース樹脂上でのタンパク質2の精製からのクロマトグラムを図13Aに示し、そして選択された画分のSDS−PAGE分析を図13Bに示す。抗ABDアガロースカラムから溶出ピークは、タンパク質2を3〜5mg含み、収率約75%(ウェスタンブロットから推定する)に相当した。溶出されたタンパク質2の正確な質量は、HPLC−MS分析によって検証した。純度は、SDS−PAGE分析、続いてシンプリーブルー染色から判断して98%より高いと推定された。混在培地タンパク質は、溶出画分中に検出できなかった(レーン7〜13、図13B)。タンパク質2は、ゲル上に含まれる分子量標準によって示されるように、SDS−PAGEゲル上で移動がより小さいことが理解される。
1.液体中に存在する少なくとも1つのABD含有分子を、液体中の他の成分から分離する方法であって、親和性分離のステップを含み、このステップにおいて、親和性リガンドとして、ABD結合モチーフBMを含むABD結合ポリペプチドを使用し、このモチーフが、
i)EX2X3X4AX6X7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28D
(配列中、互いに独立して、
X2は、F、IおよびLから選択され;
X3は、H、K、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
X4は、A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X6は、F、I、LおよびYから選択され;
X7は、A、H、I、K、L、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
X10は、G、H、K、N、Q、RおよびSから選択され;
X11は、A、D、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、VおよびYから選択され;
X16は、NおよびTから選択され;
X17は、F、H、L、SおよびTから選択され;
X18は、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
X20は、H、KおよびRから選択され;
X21は、I、LおよびVから選択され;
X25は、F、I、L、VおよびYから選択され;
X26は、KおよびSから選択され;
X28は、DおよびEから選択される)
および
ii)i)に定義された配列と少なくとも89%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなる方法。
a)親和性マトリックスに対するABD含有分子の結合をもたらす条件下で、上記液体を、上記ABD結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに適用するステップと;
b)親和性マトリックスに結合してない物質を除去するため親和性マトリックスを洗浄するステップと;
c)任意の結合したABD含有分子を親和性マトリックスから溶離し、こうしてABD含有分子の富化含量を含むABD含有分子画分を得るステップと;
d)上記ABD含有分子画分を回収するステップと
を含む方法。
a)親和性マトリックスに対するABD含有分子の結合をもたらす条件下で、上記液体を、上記ABD結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに適用するステップと;
b)親和性マトリックスに結合してない物質を回収するため親和性マトリックスを洗浄し、こうして実質的にABD含有分子含量が減少した、減損された画分を得るステップと;
c)上記減損された画分を回収するステップと
を含む方法。
a)親和性マトリックスに対するABD含有分子の結合をもたらす条件下で、上記液体を、上記ABD結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに提供するステップと;
b)親和性マトリックスに結合してない物質を回収するため親和性マトリックスを洗浄し、こうして実質的にABD含有分子含量が減少した、減損された画分を得るステップと;
c)結合したABD含有分子を親和性マトリックスから溶離し、こうしてABD含有分子含量を含むABD含有分子画分を得るステップと;
d)上記ABD含有分子画分および上記減損された画分を回収するステップと
を含む方法。
6.カラム構成で実施される、項目5に記載の方法。
7.バッチ構成で実施される、項目5に記載の方法。
8.配列i)のX2がFおよびLから選択される、項目1〜7のいずれか1項目に記載の方法。
9.配列i)のX2がFである、項目8に記載の方法。
10.配列i)のX2がLである、項目8に記載の方法。
11.配列i)のX3がH、K、R、TおよびVから選択される、項目1〜10のいずれか1項目に記載の方法。
12.配列i)のX3がH、K、RおよびVから選択される、項目11に記載の方法。
13.配列i)のX3がKおよびRから選択される、項目12に記載の方法。
14.配列i)のX3がKである、項目13に記載の方法。
15.配列i)のX3がRである、項目13に記載の方法。
16.配列i)のX4がA、H、I、L、N、VおよびWから選択される、項目1〜15のいずれか1項目に記載の方法。
17.配列i)のX4がH、L、NおよびVから選択される、項目16に記載の方法。
18.配列i)のX4がVである、項目17に記載の方法。
19.配列i)のX6がFおよびLから選択される、項目1〜18のいずれか1項目に記載の方法。
20.配列i)のX6がFである、項目19に記載の方法。
21.配列i)のX6がLである、項目19に記載の方法。
22.配列i)のX7がK、L、N、Q、RおよびSから選択される、項目1〜21のいずれか1項目に記載の方法。
23.配列i)のX7がK、N、Q、RおよびSから選択される、項目22に記載の方法。
24.配列i)のX7がK、Q、RおよびSから選択される、項目23に記載の方法。
25.配列i)のX7がKおよびRから選択される、項目24に記載の方法。
26.配列i)のX7がKである、項目25に記載の方法。
27.配列i)のX7がRである、項目25に記載の方法。
28.配列i)のX10がH、K、NおよびRから選択される、項目1〜27のいずれか1項目に記載の方法。
29.配列i)のX10がH、KおよびNから選択される、項目28に記載の方法。
30.配列i)のX10がK、NおよびRから選択される、項目28に記載の方法。
31.配列i)のX10がNである、項目29または30に記載の方法。
32.配列i)のX10がKおよびRから選択される、項目30に記載の方法。
33.配列i)のX10がKである、項目32に記載の方法。
34.配列i)のX10がRである、項目32に記載の方法。
35.配列i)のX11がA、F、L、R、TおよびYから選択される、項目1〜34のいずれか1項目に記載の方法。
38.配列i)のX16がTである、項目1〜37のいずれか1項目に記載の方法。
39.配列i)のX17がF、HおよびLから選択される、項目1〜38のいずれか1項目に記載の方法。
40.配列i)のX17がFおよびHから選択される、項目39に記載の方法。
41.配列i)のX17がHおよびLから選択される、項目39に記載の方法。
42.配列i)のX17がFである、項目40に記載の方法。
43.配列i)のX17がHである、項目40または41に記載の方法。
44.配列i)のX17がLである、項目41に記載の方法。
45.配列i)のX18がD、H、I、KおよびQから選択される、項目1〜44のいずれか1項目に記載の方法。
46.配列i)のX18がD、HおよびQから選択される、項目45に記載の方法。
47.配列i)のX18がHおよびQから選択される、項目46に記載の方法。
48.配列i)のX18がHである、項目47に記載の方法。
49.配列i)のX18がQである、項目47に記載の方法。
50.配列i)のX20がHおよびRから選択される、項目1〜49のいずれか1項目に記載の方法。
51.配列i)のX20がKおよびRから選択される、項目1〜49のいずれか1項目に記載の方法。
52.配列i)のX20がRである、項目50または51に記載の方法。
53.配列i)のX20がKである、項目51に記載の方法。
54.配列i)のX21がIおよびLから選択される、項目1〜53のいずれか1項目に記載の方法。
55.配列i)のX21がIである、項目54に記載の方法。
56.配列i)のX21がLである、項目54に記載の方法。
57.配列i)のX25がI、LおよびVから選択される、項目1〜56のいずれか1項目に記載の方法。
58.配列i)のX25がVおよびIから選択される、項目57に記載の方法。
59.配列i)のX25がIである、項目58に記載の方法。
60.配列i)のX25がVである、項目58に記載の方法。
61.配列i)のX26がKである、項目1〜60のいずれか1項目に記載の方法。
62.配列i)のX28がDである、項目1〜61のいずれか1項目に記載の方法。
I.X2は、FまたはLから選択される;
II.X6は、FまたはLから選択される;
III.X16は、Tである;
IV.X20は、HまたはRから選択される;
V.X21は、IまたはLから選択される;
VI.X25は、IまたはVから選択される;
VII.X26は、Kである;および
VIII.X28は、Dである
項目1〜62のいずれか1項目に記載の方法。
65.配列i)が8つの条件I〜VIIIのうちの少なくとも6つを満たす、項目64に記載の方法。
66.配列i)が8つの条件I〜VIIIのうちの少なくとも7つを満たす、項目65に記載の方法。
67.配列i)が8つの条件I〜VIIIのすべてを満たす、項目66に記載の方法。
68.配列i)が配列番号:1〜52から選択される、項目1〜67のいずれか1項目に記載の方法。
69.配列i)が配列番号:1〜7から選択される、項目68に記載の方法。
70.配列i)が配列番号:1〜4から選択される、項目69に記載の方法。
71.配列i)が配列番号:1である、項目70に記載の方法。
72.上記ABD結合モチーフが3−ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、項目1〜71のいずれか1項目に記載の方法。
73.上記ABD結合モチーフが上記3−ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で相互接続するループにより2つのヘリックスの一部を本質的に形成する、項目72に記載の方法。
74.上記3−ヘリックスのバンドルタンパク質ドメインが細菌受容体ドメインから選択される、項目72〜73のいずれか1項目に記載の方法。
75.上記3−ヘリックスのバンドルタンパク質ドメインが黄色ブドウ球菌からのプロテインAのドメインまたはその誘導体から選択される、項目74に記載の方法。
iii)K−[BM]−DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ;
(配列中、
[BM]は、項目1および8〜71のいずれか1項目に定義されたようなABD結合モチーフであり;
Xaは、AおよびSから選択され;
Xbは、NおよびEから選択され;
Xcは、A、SおよびCから選択され;
Xdは、AおよびSから選択される)
および
iv)iii)によって定義された配列と少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む方法。
78.配列iii)のXaがSである、項目76に記載の方法。
79.配列iii)のXbはがNである、項目76〜78のいずれか1項目に記載の方法。
80.配列iii)のXbがEである、項目76〜78のいずれか1項目に記載の方法。81.配列iii)のXcがAである、項目76〜80のいずれか1項目に記載の方法。82.配列iii)のXcがSである、項目76〜80のいずれか1項目に記載の方法。83.配列iii)のXcがCである、項目76〜80のいずれか1項目に記載の方法。84.配列iii)のXdがAである、項目76〜83のいずれか1項目に記載の方法。85.配列iii)のXdがSである、項目76〜83のいずれか1項目に記載の方法。86.配列iii)中、XaがAであり;XbがNであり;XcがAであり、そしてXdがAである、項目76に記載の方法。
87.配列iii)中、XaがAであり;XbがNであり;XcがCであり、そしてXdがAである、項目76に記載の方法。
88.配列iii)中、XaがSであり;XbがEであり;XcがSであり、そしてXdがSである、項目76に記載の方法。
89.配列iii)中、XaがSであり;XbがEであり;XcがCであり、そしてXdがSである、項目76に記載の方法。
90.配列iii)中、XaがSであり;XbがEであり;XcがCであり、そしてXdがAである、項目76に記載の方法。
91.配列iii)中、XaがSであり;XbがEであり;XcがAであり、そしてXdがAである、項目76に記載の方法。
92.配列iii)が配列番号:53〜104のいずれか1つから選択される、項目91に記載の方法。
93.配列iii)が配列番号:53〜59のいずれか1つから選択される、項目92に記載の方法。
94.配列iii)が配列番号:53〜56のいずれか1つから選択される、項目93に記載の方法。
95.配列iii)が配列番号:53である、項目94に記載の方法。
v)YAK−[BM]−DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P;
(配列中、[BM]は、項目1および8〜71のいずれか1項目に定義されたようなABD結合モチーフであり、そしてXcは、SおよびCから選択される)および
vi)v)によって定義された配列と少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む方法。
vii)YAK−[BM]−DPSQS SELLXc EAKKL NDAQA P;
(配列中、[BM]は、項目1および8〜71のいずれか1項目に定義されたようなABD結合モチーフであり、そしてXcは、AおよびCから選択される)および
viii)vii)によって定義された配列と少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む方法。
ix)FNK−[BM]−DPSQS ANLLXc EAKKL NDAQA P;(配列中、[BM]は、項目1および8〜71のいずれか1項目に定義されたようなABD結合モチーフであり、そしてXcは、AおよびCから選択される)および
x)ix)によって定義される配列に少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む方法。
ADNNFNK−[BM]−DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;
ADNKFNK−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
ADNKFNK−[BM]−DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;
ADAQQNNFNK−[BM]−DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;
AQHDE−[BM]−DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;
VDNKFNK−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;および
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK
(配列中、[BM]は、項目1および8〜71のいずれか1項目に定義されたようなABD結合モチーフである)
から選択されるアミノ酸配列を含む方法。
xi)VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;(配列中、[BM]は、項目1および8〜71のいずれか1項目に定義されたようなABD結合モチーフである)および
xii)xi)に定義された配列と少なくとも84%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む方法。
102.配列xi)が配列番号:105〜111のいずれか1つから選択される、項目101に記載の方法。
103.配列xi)が配列番号:105〜108のいずれか1つから選択される、項目102に記載の方法。
104.配列xi)が配列番号:105である、項目103に記載の方法。
105.上記ABD結合ポリペプチドが、多量体の形態で存在し、少なくとも2つのABD結合ポリペプチド単量体単位を含み、それらのアミノ酸配列が同一または異なってもよい項目1〜104のいずれか1項目に記載の方法。
106.上記ABD結合ポリペプチド単量体単位が一緒に共有結合される、項目105に記載の方法。
107.ABD結合ポリペプチド単量体単位が融合タンパク質として発現される、項目105に記載の方法。
108.上記ABD結合ポリペプチドが、ポリペプチドのC末端で、例えばC末端でシステイン残基を更に含む、項目1〜107のいずれか1項目に記載の方法。
Claims (14)
- 液体中に存在する少なくとも1つのアルブミン結合ドメイン(ABD)含有分子であって、ABDが配列番号161および162から選択されるアミノ酸配列を含む分子を、液体中の他の成分から分離する方法であって、親和性分離のステップを含み、該ステップにおいて、親和性リガンドとして、アルブミン結合ドメイン(ABD)結合モチーフ(BM)を含むABD結合ポリペプチドを使用し、該モチーフが、
i)EX2X3X4AX6X7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28D
(配列中、互いに独立して、
X2は、F、IおよびLから選択され;
X3は、H、K、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
X4は、A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
X6は、F、I、LおよびYから選択され;
X7は、A、H、I、K、L、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
X10は、G、H、K、N、Q、RおよびSから選択され;
X11は、A、D、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、VおよびYから選択され;
X16は、NおよびTから選択され;
X17は、F、H、L、SおよびTから選択され;
X18は、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
X20は、H、KおよびRから選択され;
X21は、I、LおよびVから選択され;
X25は、F、I、L、VおよびYから選択され;
X26は、KおよびSから選択され;
X28は、DおよびEから選択される)
および
ii)i)に定義された配列と少なくとも89%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなる方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
a)親和性マトリックスに対するABD含有分子の結合をもたらす条件下で、前記液体を、前記ABD結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに適用するステップと;
b)親和性マトリックスに結合してない物質を除去するため親和性マトリックスを洗浄するステップと;
c)任意の結合したABD含有分子を親和性マトリックスから溶離し、こうしてABD含有分子の富化含量を含むABD含有分子画分を得るステップと;
d)前記ABD含有分子画分を回収するステップと
を含む方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
a)親和性マトリックスに対するABD含有分子の結合をもたらす条件下で、前記液体を、前記ABD結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに適用するステップと;
b)親和性マトリックスに結合してない物質を回収するため親和性マトリックスを洗浄し、こうして実質的にABD含有分子含量が減少した、減損された画分を得るステップと;
c)前記減損された画分を回収するステップと
を含む方法。 - 請求項1に記載された方法であって、
a)親和性マトリックスに対するABD含有分子の結合をもたらす条件下で、前記液体を、前記ABD結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに提供するステップと;
b)親和性マトリックスに結合してない物質を回収するため親和性マトリックスを洗浄し、こうして実質的にABD含有分子含量が減少した、減損された画分を得るステップと;
c)結合したABD含有分子を親和性マトリックスから溶離し、こうしてABD含有分子含量を含むABD含有分子画分を得るステップと;
d)前記ABD含有分子画分および前記減損された画分を回収するステップと
を含む方法。 - 配列i)が8つの条件I〜VIIIのうちの少なくとも4つを満たす:
I.X2は、FまたはLから選択される;
II.X6は、FまたはLから選択される;
III.X16は、Tである;
IV.X20は、HまたはRから選択される;
V.X21は、IまたはLから選択される;
VI.X25は、IまたはVから選択される;
VII.X26は、Kである;および
VIII.X28は、Dである
請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 配列i)が配列番号:1〜52から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 配列i)が配列番号:1〜7から選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記ABD結合モチーフが黄色ブドウ球菌からのプロテインAのドメインまたはその誘導体から選択される3−ヘリックスのバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、前記ABD結合ポリペプチドが、
iii)K−[BM]−DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ;
(配列中、
[BM]は、請求項1および5〜7のいずれか1項に定義されたようなABD結合モチーフであり;
Xaは、AおよびSから選択され;
Xbは、NおよびEから選択され;
Xcは、A、SおよびCから選択され;
Xdは、AおよびSから選択される)
および
iv)iii)によって定義された配列と少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む方法。 - 配列iii)が配列番号:53〜104のいずれか1つから選択される、請求項9に記載の方法。
- 配列iii)が配列番号:53〜59のいずれか1つから選択される、請求項10に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法であって、前記ABD結合ポリペプチドが、
xi)VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;(配列中、[BM]は、請求項1および5〜7のいずれか1項に定義されたようなABD結合モチーフである)および
xii)xi)に定義された配列と少なくとも84%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む方法。 - 配列xi)が配列番号:105〜156のいずれか1つから選択される、請求項12に記載の方法。
- 配列xi)が配列番号:105〜111のいずれか1つから選択される、請求項13に記載の方法。
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