JP6396303B2 - アルブミン結合を含有するタンパク質の分離方法 - Google Patents

アルブミン結合を含有するタンパク質の分離方法 Download PDF

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Description

本発明は、アルブミン結合ドメイン、ABDに結合するポリペプチドを利用する分離方法に関する。本明細書に開示されたポリペプチドは、さまざまな産業的用途および薬学的用途、例えば分離技術の親和性リガンドとして、または分子診断法の検出剤としての使用を有する。
血清アルブミンは、哺乳動物の血清中で最も豊富なタンパク質(ヒトでは、35〜50g/l、すなわち0.53〜0.75mM)であり、そしてin vivoで血清アルブミンに結合可能となる担体分子にペプチドまたはタンパク質を共有結合させるいくつかの戦略は、例えば、特許文献1、特許文献2およびDennis ら(非特許文献1)に記載されている。特許文献2は、とりわけ、他のタンパク質の半減期を高めるため連鎖球菌Gタンパク質(SpG)から誘導されたアルブミン結合ペプチドまたはタンパク質の使用を記載している。この着想は、細菌から誘導されたアルブミン結合ペプチド/タンパク質を、血液から迅速に除去されることがわかっている治療上興味深いペプチド/タンパク質に融合させることにある。生成された融合タンパク質は、in vivoで血清アルブミンに結合し、そしてそのより長い半減期から利益をもたらし、それにより、融合した治療上興味深いペプチド/タンパク質の正味の半減期を高める。血清アルブミンの半減期は、動物の大きさに正比例しており、ここで、例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)は19日の半減期を有し、そしてウサギ血清アルブミンは、約5日の半減期を有する(非特許文献2)。
連鎖球菌Gタンパク質(SpG)は、特定の連鎖球菌株の表面上に存在する二官能性受容体であり、IgGおよび血清アルブミンの両方に結合可能である(非特許文献3)。その構造は高度に反復性であり、いくつかの構造的および機能的に異なるドメイン(非特許文献4)、より正確には、3つのIg−結合ドメインおよび3つの血清アルブミン結合ドメインがある(非特許文献5)。SpG中の3つの血清アルブミン結合ドメインのうちの1つの構造は決定されており、3−ヘリックスバンドルフォールドを示す(非特許文献6、非特許文献7)。46アミノ酸モチーフがABD(アルブミン結合ドメイン)として定義され、その後、G148−GA3(Gタンパク質関連のアルブミン結合のためのGAおよび連鎖球菌の菌株から誘導されたG148)とも呼ばれている。
ヒト血清アルブミンに対して非常に改善された親和性を有するGA3−G148の人工変異体(非特許文献8;特許文献3)、および低下した免疫刺激性を有する改変された高親和性変異体(特許文献4)が開発された。後者の動機となったのは、GA3−G148内にいくつかのT細胞およびB細胞エピトープが実験的に確認されており(非特許文献9)、そのためこのドメインそれ自体が、ヒトに投与する医薬組成物中の使用にあまり適していないという事実であった。本明細書の全体を通じて、GA3−G148だけでなく、例えば特許文献5および特許文献6に示されたそのさまざまな改変された誘導体を、まとめて「ABD」と呼ぶ。したがって、本開示において、「ABD」は、これらの種類のアルブミン結合ポリペプチドを表しており、特定のアミノ酸配列を有する特定のポリペプチドというわけではない。
アルブミン結合ドメインを治療組成物または診断用組成物に組み込むことへの興味が高まるにつれて、例えば原核生物系もしくは真核生物系の組換え発現によって、またはABDへの直接的化学結合によって産生された、ABDに共有結合した分子を単離するための安価でありかつ効率的な精製戦略の必要性が増大している。組換え発現されたタンパク質の精製に関する一般的な戦略には、一般的に用いられる親和性タグ、例えばポリヒスチジンタグ、キチン結合タンパク質(CBP)、マルトース結合タンパク質(MBP)、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)−タグまたはFLAG−タグが含まれ、そしてそれぞれのタグ用に特別に開発された商業的な樹脂を用いて典型的な親和性分離を実施することになるであろう。しかし、ある種の用途、特に治療用物質として用いられる分子については、最終生成物は均質でなければならない。例えば、酵素または化学切断によってタグを除去することが必要となるため、均質な生成物を得るには完全な切断を確実に行う必要があり、つまり、不完全に切断された生成物を除去する際に収率の損失をこうむる必要がある。これらの問題はいずれも、生成物の製造費用を高めることになる。したがって、より興味深い戦略とは、ABD部分それ自体を精製タグとして用いることであろう。この一例は、組換えアルブミンを固体支持体に結合させることであろう(例えば非特許文献10;非特許文献11)。粗溶質から、ABDタグを含む化合物をアルブミンによって捕捉し、非特異的に吸着された混在物質を除去し、そしてその後、アルブミンとの特異的であるが可逆的な相互作用を阻害することによってABD−標識化合物を回収する。しかし、アルブミンは、さまざまなタンパク質、脂肪酸、ステロール、イオンなどに対するいくつかの相互作用部位を有する大きな天然の担体分子であり、そのため、特異的成分および非特異的成分のバックグラウンド結合により、回収された試料が汚染されることがある。組換えヒトアルブミンが開発されているという事実にもかかわらず、組換えヒトアルブミンは、特にアルブミン結合マトリックスの反復使用に適用が必要となるであろう定置洗浄(cleaning in place)の標準手順と適合しないため、治療用物質の大規模生産において親和性リガンドとして含めるにはなお高価である。さらにまた、アルブミンに対して非常に高い親和性を有するABD変異体を含む分子を回収するには、より苛酷な溶離条件が必要となることがある。このような条件は、ABD−標識分子にとっても好ましくないことがある。
モノクローナル抗体およびFc−融合タンパク質の工業生産では、IgGのFc部分に対するプロテインAの天然の親和性のため、黄色ブドウ球菌からのプロテインAが、親和性リガンドとして長い間使用されてきた。プロテインAは、その全体としてだけでなく、その個々のFc−結合ドメインが、その後、改善された性質を有する改変された親和性リガンドの合理的なデザインのための出発点として役立っている。導入については、Prot Eng(非特許文献12)およびNat Biotech(非特許文献13)中のNord Kおよび共同研究者による論文を参照のこと。
WO01/45746 WO91/01743 WO2009/016043 WO2012/004384 WO2009/016043 WO2012/004384
Dennis et al, J Biol Chem 277:35035-43, 2002 McCurdy et al, J Lab Clin Med 143:115, 2004 Bjoerck et al, Mol Immunol 24:1113, 1987 Guss et al, EMBO J 5:1567, 1986 Olsson et al, Eur J Biochem 168:319, 1987 Kraulis et al, FEBS Lett 378:190, 1996 Johansson et al, J. Biol. Chem. 277:8114-20, 2002 Jonsson et al, Prot Eng Des Sel 21:515-27, 2008 Goetsch et al, Clin Diagn Lab Immunol 10:125-32, 2003 Jonsson et al, Prot Eng Des Sel 21:515-27, 2008 Andersen et al, J Biol Chem 286:5234-41, 2011 Nord et al, Prot Eng 8:601-608; 1995 Nord et al, Nat Biotech 15:772-777; 1997
本開示の目的は、ABDを含むタンパク質分子、例えばABDが融合部分である融合タンパク質の精製、分離および/またはクロマトグラフィーのための新たな方法を提供することである。さらに、本開示の目的は、バイオテクノロジーにおいて、例えばタンパク質の精製および分離用途においてABD結合剤の使用を提供する。
これらの目的および本開示から当業者に明らかである他の目的は、下に開示された1つまたはそれ以上のさまざまな本発明の態様によって達成することができる。
したがって、第1の態様において、本開示は、液体中に存在する少なくとも1つのABD含有分子を液体中の他の成分から分離する方法であって、親和性分離ステップを含み、そのステップにおいて、親和性リガンドとして、ABD結合モチーフBMを含むABD結合ポリペプチドを使用し、このモチーフが、
i)EXAXEI X1011LPNLX161718QX2021AFIX2526LX28
(配列中、互いに独立して、
は、F、IおよびLから選択され;
は、H、K、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
は、A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
は、F、I、LおよびYから選択され;
は、A、H、I、K、L、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
10は、G、H、K、N、Q、RおよびSから選択され;
11は、A、D、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、VおよびYから選択され;
16は、NおよびTから選択され;
17は、F、H、L、SおよびTから選択され;
18は、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
20は、H、KおよびRから選択され;
21は、I、LおよびVから選択され;
25は、F、I、L、VおよびYから選択され;
26は、KおよびSから選択され;
28は、DおよびEから選択される)
および
ii)i)に定義された配列と少なくとも89%の同一性を有するアミノ酸配列
選択されるアミノ酸配列からなる方法を提供する。
親和性クロマトグラフィーの当業者に理解されるように、開示された分離方法は、ABDを含む分子、すなわち「ABD含有分子」の除去および/または精製に用いてもよい。このような分子は、特に1つの融合部分が1つまたはそれ以上のABDドメインを含み、そして他の融合部分が他の機能、例えば生物学的活性な機能、例えば治療または診断上の機能を有する融合タンパク質であってもよい。
本方法は、親和性分離ステップを含み、このステップで、上に定義されたポリペプチドを用いる。ABD結合ポリペプチドのより具体的な変異体および実施態様を、以下に示す。したがって、本発明は、親和性分離の方法における本明細書に記載されたポリペプチドの使用を提供する。適切には、本方法は、分離デバイスを含む。分離デバイスには、例えばクロマトグラフィー媒体、膜、セルロース、シリカ、アガロース、ポリアクリルアミド、磁性ビーズ、二相系および分離に一般に用いられる他のこのような物質から選択される固体支持体が適切に含まれてもよい。一実施態様において、本明細書に定義されたポリペプチドは、分離デバイスの固体支持体に結合されている。このようにして得た分離デバイスは、それに結合された本明細書に定義されたポリペプチドを有しており、説明および請求項を通じて「親和性マトリックス」または「樹脂」と呼ばれ、そしてその特定の実施態様は、実施例において「抗ABDアガロース」と呼ばれる。
液体からABD含有分子を精製するには、精製されるABD含有分子を含む液体を、マトリックスに対してABD含有分子の結合をもたらす条件下でこのような親和性マトリックスに適切に適用する。その後、マトリックスに対するABD含有分子の結合は維持されるが、マトリックスに結合したほとんどの、理想的にはすべての他のタンパク質および混在物質が洗い流されるような条件下で親和性マトリックスを洗浄する。溶離ステップでは、回収されうる「ABD含有分子画分」を意味するABD含有分子富化画分中に、ABD含有分子がマトリックスから放出されるようにマトリックスを処理する。
反対に、分離の目的が、ABD含有分子の除去である場合、いくつかの除外事項を伴って、本質的に上と同じステップに適切に従う。マトリックスに対するABD含有分子の結合をもたらす条件下で、除去されるABD含有分子を含む液体を親和性マトリックスに適切に適用する。その後、マトリックスに対するABD含有分子の結合が維持されるが、ほとんどの、理想的にはすべての他のタンパク質がフロースルー中に回収されるような条件下で親和性マトリックスを洗浄し、したがって回収される、ABD含有分子含量が実質的に減少した「減損された画分(depleted fraction)」が得られる。したがって、ABD含有分子でなく、上の精製方法で捨てられた液体の成分を、その代わりに貯留し、そしてさらに使用および/または処理してもよい。
本発明の方法のさらなる別法として、「減損された画分」および「ABD含有分子画分」を同じ分離運転から回収してもよい。その場合、もう一度、マトリックスに対するABD含有分子の結合をもたらす条件下で、ABD含有分子を含む液体を親和性マトリックスに適切に適用する。その後、マトリックスに対するABD含有分子の結合が維持されるが、ほとんどの、理想的にはすべての他のタンパク質がフロースルー中に回収されるような条件下で親和性マトリックスを洗浄する。このようにして得られた、ABD含有分子含量が実質的に減少した「減損された画分」が回収される。溶離ステップでは、回収される「ABD含有分子画分」を意味するABD含有分子富化画分中に、ABD含有分子がマトリックスから放出されるようにマトリックスを処理する。
一実施態様において、開示された分離法は、バッチ構成で実施される。別の実施態様において、本方法は、カラム構成で実施される。さらに別の実施態様において、本方法は、拡大床吸着を用いて実施される。開示された方法を、バッチモードでの結合、続いてカラム構成での洗浄および溶離のようなハイブリッド構成を用いて実施することも可能である。親和性クロマトグラフィーの熟練技術者は、利用可能な別法を知っており、そして不必要な努力なしにそれらを実施することができる。
本明細書に開示されたABD結合ポリペプチドは、一連の特徴を示し、これにより、例えば、固体支持体に結合されたときに、このABD結合ポリペプチドは、ABDを含む分子を精製するための親和性リガンドとして適したものとなっている。例えば、親和性リガンドとしてのヒトアルブミンの使用と比較すると、開示されたABD結合ポリペプチドの使用は、以下の利点を示す:
・リガンド結合マトリックスml当たりのより高い精製能力。
・例えば0.5M水酸化ナトリウムを用いた定置洗浄の反復手順との適合性、それによりABD結合ポリペプチドは、治療用物質の大規模生産に有用となる。
・より温和な溶離条件、例えばより高いpHでの溶離の使用可能性、それによりABDを含むより広い範囲さまざまな分子の精製が可能となる。
本開示の文脈において、用語「試料」および「液体」は、同じ意味で用いてもよい。いずれの用語も、例えば関与する液体の体積または他の特性に関してなんら制限を意味しない。液体は、小さな体積、例えば分析目的ではより大きな体積のアリコートなど;または、代わりに、ラージスケールの分離および/もしくは精製方法に用いられる供給物もしくは液体であってもよい。
本明細書に開示された方法は、1つまたはそれ以上の異なる精製段階で有用であってもよい。したがって、それは、任意の中間体精製ステップまたは最終的な仕上げステップにおいて、第1の捕捉ステップのいずれか1つまたはより以上で限定されることなく用いてもよい。
ABD部分が標的タンパク質のどこで位置するかに関係なく、本明細書に記載されたABD結合ポリペプチドを含む樹脂を利用する本開示の方法を用いる標的タンパク質の精製が良好に達成できることは、当業者に理解されるであろう。したがって、ABD部分は、標的タンパク質のN末端またはC末端に配置されてもよい。あるいは、標的タンパク質は、両側に他のタンパク質部分が隣接するABD部分を含む融合タンパク質であってもよい。
本開示の文脈において、「ABD」は、連鎖球菌Gタンパク質およびその誘導体からの3−ヘリックスアルブミン結合ドメインのことをいう。特に、「ABD」は、GA3−G148(Johanssonら、前出、参照により本明細書に組み込まれる)またはアルブミンに対して改善された親和性を有するGA3−G148の変異体(WO2009/016043、参照により本明細書に組み込まれる)、ならびに低下した免疫刺激性を有する高親和性変異体(WO2012/004384、参照により本明細書に組み込まれる)のことをいう。換言すれば、本開示において、「ABD」は、引用文献に記載されたアルブミン結合ポリペプチドの種類を表しており、特定のアミノ酸配列を有する特定のポリペプチドというわけではない。
ある種の関連した配列、開示された分離方法に使用するためのABD結合ポリペプチドの上の定義は、いくつかの異なる選択実験においてABDとの相互作用に関して選択された、親骨格の多数のランダムポリペプチド変異体の統計解析に基づく。特定されたABD結合モチーフ、すなわち「BM」は、親骨格の標的結合領域に相当し、この領域は、3ヘリクッスバンドルタンパク質ドメイン内の2つのアルファヘリックスを構成する。親骨格において、2つのBMヘリックスの多様なアミノ酸残基は、抗体の定常Fc部分との相互作用のための結合表面を構成する。本発明では、結合表面残基のランダムな変化およびその後の変異体の選択により、Fc相互作用能力を、ABDとの相互作用の能力で置き換えている。
当業者によって理解されるように、任意のポリペプチドの機能、例えば本開示の分離方法に使用するためのポリペプチドのABD結合能力は、ポリペプチドの三次構造によって決まる。したがって、その機能に影響を及ぼすことなく、ポリペプチド中のアミノ酸配列に少しの変更を加えることが可能である。したがって、本発明は、生成した配列がi)によって定義された配列と少なくとも89%同一であるようなBMの修飾された変異体を含むポリペプチドを用いる方法および使用を包含する。本発明の一実施態様において、上記のBMの修飾された変異体は、i)によって定義された配列と93%同一であるようなものである。さらに別の実施態様において、上記BM変異体は、i)によって定義された配列と96%同一である。
いくつかの実施態様では、このような変更は、開示された分離方法に使用されたABD結合ポリペプチドの配列のすべての位置で行ってもよい。別の実施態様において、このような変更は、非可変位置だけで行われるのではなく、骨格アミノ酸残基としても表される。そのような場合、可変位置、すなわち、配列i)中の「X」で表される位置では、変更が許されていない。例えば、アミノ酸残基のある種の機能性群(例えば疎水性、親水性、極性など)に属するアミノ酸残基は、同じ機能性群からの別のアミノ酸残基に交換できる可能性がある。
「%同一性」という用語は、全体に用いられるように、以下のように算出してもよい。CLUSTAL Wアルゴリズム(Thompson et al, Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994))を用いてクエリー配列を標的配列に整列させる。整列した配列の最も短いものに相当するウィンドウ上で比較を行う。整列した配列の最も短いものは、いくつかの場合、標的配列であってもよい。他の場合、クエリー配列は、整列した配列の最も短いものを構成してもよい。各位置のアミノ酸残基を比較し、標的配列中で同一の対応関係を有するクエリー配列の位置のパーセンテージを%同一性として報告する。
一実施態様において、配列i)のXは、FおよびLから選択される。
一実施態様において、配列i)のXは、Fである。
一実施態様において、配列i)のXは、Lである。
一実施態様において、配列i)のXは、H、K、R、TおよびVから選択される。
一実施態様において、配列i)のXは、H、K、RおよびVから選択される。
一実施態様において、配列i)のXは、H、KおよびVから選択される。
一実施態様において、配列i)のXは、KおよびRから選択される。
一実施態様において、配列i)のXは、Kである。
一実施態様において、配列i)のXは、Rである。
一実施態様において、配列i)のXは、Vである。
一実施態様において、配列i)のXは、A、H、I、L、N、VおよびWから選択される。
一実施態様において、配列i)のXは、H、L、NおよびVから選択される。
一実施態様において、配列i)のXは、Vである。
一実施態様において、配列i)のXは、Nである。
一実施態様において、配列i)のXは、Hである。
一実施態様において、配列i)のXは、Lである。
一実施態様において、配列i)のXは、A、L、N、VおよびWから選択される。
一実施態様において、配列i)のXは、A、N、VおよびWから選択される。
一実施態様において、配列i)のXは、A、NおよびWから選択される。
一実施態様において、配列i)のXは、FおよびLから選択される。
一実施態様において、配列i)のXは、Fである。
一実施態様において、配列i)のXは、Lである。
一実施態様において、配列i)のXは、K、L、N、Q、RおよびSから選択される。
一実施態様において、配列i)のXは、K、N、Q、RおよびSから選択される。
一実施態様において、配列i)のXは、K、Q、RおよびSから選択される。
一実施態様において、配列i)のXは、KおよびRから選択される。
一実施態様において、配列i)のXは、Kである。
一実施態様において、配列i)のXは、Rである。
一実施態様において、配列i)のX10は、H、K、NおよびRから選択される。
一実施態様において、配列i)のX10は、H、KおよびNから選択される。
一実施態様において、配列i)のX10は、K、NおよびRから選択される。
一実施態様において、配列i)のX10は、KおよびRから選択される。
一実施態様において、配列i)のX10は、Nである。
一実施態様において、配列i)のX10は、Kである。
一実施態様において、配列i)のX10は、Rである。
一実施態様において、配列i)のX10は、Hである。
一実施態様において、配列i)のX11は、A、F、L、R、TおよびYから選択される。
一実施態様において、配列i)のX11は、A、F、TおよびYから選択される。
一実施態様において、配列i)のX11は、Tである。
一実施態様において、配列i)のX11は、Aである。
一実施態様において、配列i)のX11は、Yである。
一実施態様において、配列i)のX11は、Fである。
一実施態様において、配列i)のX11は、A、L、TおよびYから選択される。
一実施態様において、配列i)のX11は、TおよびYから選択される。
一実施態様において、配列i)のX16は、Tである。
一実施態様において、配列i)のX17は、F、HおよびLから選択される。
一実施態様において、配列i)のX17は、FおよびHから選択される。
一実施態様において、配列i)のX17は、HおよびLから選択される。
一実施態様において、配列i)のX17は、Fである。
一実施態様において、配列i)のX17は、Hである。
一実施態様において、配列i)のX17は、Lである。
一実施態様において、配列i)のX18は、D、H、I、KおよびQから選択される。
一実施態様において、配列i)のX18は、D、HおよびQから選択される。
一実施態様において、配列i)のX18は、HおよびQから選択される。
一実施態様において、配列i)のX18は、Hである。
一実施態様において、配列i)のX18は、Qである。
一実施態様において、配列i)のX18は、Dである。
一実施態様において、配列i)のX20は、KおよびRから選択される。
一実施態様において、配列i)のX20は、HおよびRから選択される。
一実施態様において、配列i)のX20は、Rである。
一実施態様において、配列i)のX20は、Kである。
一実施態様において、配列i)のX21は、IおよびLから選択される。
一実施態様において、配列i)のX21は、Iである。
一実施態様において、配列i)のX21は、Lである。
一実施態様において、配列i)のX25は、I、LおよびVから選択される。
一実施態様において、配列i)のX25は、VおよびIから選択される。
一実施態様において、配列i)のX25は、Iである。
一実施態様において、配列i)のX25は、Vである。
一実施態様において、配列i)のX25は、Lである。
一実施態様において、配列i)のX26は、Kである。
一実施態様において、配列i)のX28は、Dである。
一実施態様において、配列i)は、以下のとおり定義され:互いに独立して、
は、FおよびLから選択され;
は、H、K、R、TおよびVから選択され;
は、A、H、I、L、N、VおよびWから選択され;
は、FおよびLから選択され;
は、K、L、N、Q、RおよびSから選択され;
10は、H、K、NおよびRから選択され;
11は、A、F、L、R、TおよびYから選択され;
16は、Tであり;
17は、F、HおよびLから選択され;
18は、D、H、I、KおよびQから選択され;
20は、HおよびRから選択され;
21は、IおよびLから選択され;
25は、I、LおよびVから選択され;
26は、Kであり;そして
28は、Dである。
一実施態様において、配列i)は、以下のとおり定義され:互いに独立して、
は、FおよびLから選択され;
は、H、K、TおよびVから選択され;
は、H、L、NおよびVから選択され;
は、FおよびLから選択され;
は、K、R、QおよびSから選択され;
10は、H、KおよびNから選択され;
11は、A、F、TおよびYから選択され;
16は、Tであり;
17は、F、HおよびLから選択され;
18は、D、HおよびQから選択され;
20は、Rであり;
21は、IおよびLから選択され;
25は、I、LおよびVから選択され;
26は、Kであり;そして
28は、Dである。
ABD結合ポリペプチドのサブクラスを定義するより具体的な実施態様において、配列i)は、8つの条件I〜VIIIのうちの少なくとも4つを満たす:
I.Xは、FおよびLから選択される;
II.Xは、FおよびLから選択される;
III.X16は、Tである;
IV.X20は、HおよびRから選択される;
V.X21は、IおよびLから選択される;
VI.X25は、IおよびVから選択される;
VII.X26は、Kである;および
VIII.X28は、Dである。
開示された分離方法に使用するためのABD結合ポリペプチドのいくつかの例において、配列i)は、8つの条件I〜VIIIのうちの少なくとも5つを満たす。より具体的には、配列i)は、8つの条件I〜VIIIのうちの少なくとも6つ、8つの条件I〜VIIIのうちのこのような少なくとも7つ、例えば8つの条件I〜VIIIのすべてを満たしてもよい。
以下、実験区分に詳細に説明するように、ABD結合ポリペプチド変異体の選択が、多くの個々のABD結合モチーフ(BM)配列の同定につながった。これらの配列は、配列i)の個々の実施態様を構成する。個々のABD結合モチーフの配列を、図1に配列番号:1〜52として示す。この態様のいくつかの実施態様において、配列i)は、配列番号:1〜52のいずれか1つから選択される。より具体的には、配列i)は、配列番号:1〜7のいずれか1つから、例えば配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3および配列番号:4から選択してもよい。特に、配列i)は、配列番号:1であってもよい。本開示のいくつかの実施態様において、上に定義されたBMは、3−ヘリックスのバンドルタンパク質ドメインの「一部を形成する」。これは、BMの配列を、最初の3−ヘリックスのバンドルドメインの配列に「挿入」または「移植」して、最初のドメインにおいてBMが類似の構造モチーフと置き換えられることを意味するものとして理解される。例えば、理論によって拘束されることを望むわけではないが、BMは、3−ヘリックスのバンドルの3つのヘリックスのうちの2つを構成すると考えられ、したがって、任意の3−ヘリックスのバンドル内で、このような2−ヘリックスモチーフを置換することができる。当業者に理解されるように、3−ヘリックスバンドルドメインのうちの2つのヘリックスを2つのBMヘリックスによって置き換えることは、ポリペプチドの基本構造に影響を及ぼさないように実施しなければならない。すなわち、本発明のこの実施態様によるポリペプチドのCα主鎖の全体的な折り畳みは、例えば同じ順序で二次構造の同じ要素を有するなど、それが一部を形成する3−ヘリックスバンドルタンパク質ドメインのものと実質的に同じである。したがって、本発明のこの実施態様によるポリペプチドが最初のドメインと同じ折り畳みを有する場合、本発明によるBMは、3−ヘリックスバンドルドメインの「一部を形成し」、基本的な構造特性、例えば類似のCDスペクトルを生じるそれらの性質は共有されることを意味する。当業者は、関連性のある他のパラメータに詳しい。
したがって、特定の実施態様において、ABD結合モチーフ(BM)は、3−ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する。例えば、BMは、上記3−ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で、相互に連結するループにより2つのアルファヘリックスを本質的に構成してもよい。特定の実施態様において、上記3−ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは、細菌の受容体タンパク質のドメインから選択される。このようなドメインの非限定的な例は、黄色ブドウ球菌からのプロテインAの5つの異なる3−ヘリックスドメイン、例えばドメインB、およびそれらの誘導体である。いくつかの実施態様では、3−ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは、タンパク質Zの変異体であり、それはブドウ球菌のプロンテインAのドメインBから誘導される。
開示された分離方法に使用するためのABD結合ポリペプチドが3−ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する実施態様において、ABD結合ポリペプチドは、
iii)K−[BM]−DPSQS XLLX EAKKL NDXQ;
(配列中、
[BM]は、上に定義されたようなABD結合モチーフであり;
は、AおよびSから選択され;
は、NおよびEから選択され;
は、A、SおよびCから選択され;
は、AおよびSから選択される)
および
iv)iii)によって定義された配列と少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含んでもよい。
上に議論したように、その三次構造および機能にほとんど影響を及ぼすことなく上のアミノ酸配列と比較して少しの変更を含んでいるポリペプチドの使用もまた、本開示の範囲内にある。したがって、いくつかの実施態様において、配列iv)は、iii)によって定義される配列と少なくとも83%、例えば少なくとも85%、例えば少なくとも87%、例えば少なくとも89%、例えば少なくとも91%、例えば少なくとも93%、例えば少なくとも95%、例えば少なくとも97%の同一性を有する。
開示された分離方法に使用するためのABD結合ポリペプチドの一実施態様において、配列iii)のXは、Aである。別の実施態様において、配列iii)のXは、Sである。
開示された分離方法に使用するためのABD結合ポリペプチドの一実施態様において、配列iii)のXは、Nである。別の実施態様において、配列iii)のXは、Eである。
開示された分離方法に使用するためのABD結合ポリペプチドの一実施態様において、配列iii)のXは、Aである。別の実施態様において、配列iii)のXは、Sである。さらに別の実施態様において、配列iii)のXは、Cである。
開示された分離方法に使用するためのABD結合ポリペプチドの一実施態様において、配列iii)のXは、Aである。別の実施態様において、配列iii)のXは、Sである。
開示された分離方法に使用するためのABD結合ポリペプチドの一実施態様において、配列iii)中、Xは、Aであり;Xは、Nであり;Xは、Aであり、そしてXは、Aである。
開示された分離方法に使用するためのABD結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、配列iii)中、Xは、Aであり;Xは、Nであり;Xは、Cであり、そしてXは、Aである。
開示された分離方法に使用するためのABD結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、配列iii)中、Xは、Sであり;Xは、Eであり;Xは、Sであり、そし
てXは、Sである。
開示された分離方法に使用するためのABD結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、配列iii)中、Xは、Sであり;Xは、Eであり;Xは、Cであり、そしてXはSである。
開示された分離方法に使用するためのABD結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、配列iii)中、Xは、Sであり;Xは、Eであり;Xは、Aであり、そしてXは、Aである。
開示された分離方法に使用するためのABD結合ポリペプチドのさらなる実施態様において、配列iii)中、Xは、Sであり;Xは、Eであり;Xは、Cであり、そしてXは、Aである。
なおさらなる実施態様において、上のABD結合ポリペプチドの定義の配列iii)は、配列番号:53〜104から、特に配列番号:53〜59から選択される。さらなる実施態様において、配列iii)は、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:55および配列番号:56から選択される。特に、配列iii)は、配列番号:53であってもよい。
また、さらなる実施態様において、
v)YAK−[BM]−DPSQS SELLX EAKKL NDSQA P;
(配列中、[BM]は、上に定義されたようなABD結合モチーフであり、そしてXは、SおよびCから選択される)および
vi)v)によって定義された配列と少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、上に定義されたようなABD結合ポリペプチドの開示された分離方法における使用が提供される。
別の実施態様において、
vii)YAK−[BM]−DPSQS SELLX EAKKL NDAQA P;
(配列中、[BM]は、上に定義されたようなABD結合モチーフであり、そしてXは、AおよびCから選択される)および
viii)vii)によって定義された配列と少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、上に定義されたようなABD結合ポリペプチドの開示された分離方法における使用が提供される。
あるいは、
ix)FNK−[BM]−DPSQS ANLLX EAKKL NDAQA P;(配列中、[BM]は、上に定義されたようなABD結合モチーフであり、そしてXは、AおよびCから選択される)および
x)ix)によって定義される配列に少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、上に定義されたようなABD結合ポリペプチドの開示された分離方法における使用が提供される。
上に議論したように、その三次構造および機能にほとんど影響を及ぼすことなく上のアミノ酸配列と比較して少しの変更を含んでいるポリペプチドの使用もまた、本開示の範囲内にある。したがって、いくつかの実施態様において、上に定義されたようなABD結合ポリペプチドは、例えば、v)、vii)またはix)によって定義された配列と少なくとも84%、少なくとも86%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも96%、または少なくとも98%同一である配列を有してもよい。
いくつかの実施態様では、ABD結合モチーフは、
ADNNFNK−[BM]−DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;
ADNKFNK−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
ADNKFNK−[BM]−DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;
ADAQQNNFNK−[BM]−DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;
AQHDE−[BM]−DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;
VDNKFNK−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;および
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの一部を形成してもよい。
一実施態様において、開示された分離方法に使用するためのABD結合ポリペプチドは、
xi)VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;(配列中、[BM]は、上に定義されたようなABD結合モチーフである)および
xii)xi)に定義された配列と少なくとも84%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む。
再び、その三次構造および機能にほとんど影響を及ぼすことなく上のアミノ酸配列と比較して少しの変更を含んでいるポリペプチドの使用もまた、本開示の範囲内にある。したがって、いくつかの実施態様において、上に定義されたようなABD結合ポリペプチドは、例えば、xi)によって定義された配列と少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも89%、少なくとも91%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも96%、または少なくとも98%同一である配列を有してもよい。
このようなポリペプチドの配列xi)は、配列番号:105〜156のいずれか1つから選択してもよい。特に、配列xi)は、配列番号:105〜111のいずれか1つから選択してもよく、例えば、配列番号:105、配列番号:106、配列番号:107および配列番号:108から選択してもよい。このポリペプチドの特定の実施態様において、配列xi)は、配列番号:105である。
開示された分離方法に使用するためのポリペプチドは、単量体または多量体の形態であってもよい。一実施態様において、ABD結合ポリペプチドは、少なくとも2つのABD結合ポリペプチド単量体単位を含み、それらのアミノ酸配列が同一または異なってもよい多量体の形態で存在する。ポリペプチドの多量体の形態は、増強された結合性を有することができる点で、好都合でありうる。
一実施態様において、上記ABD結合ポリペプチド単量体単位は、一緒に共有結合される。特定の実施態様において、ABD結合ポリペプチド単量体単位は、融合タンパク質として発現される。
ポリペプチドは、知られている有機化学的方法を用いて共有結合によって結合してもよいし、またはポリペプチドの組換え発現のための系において1つもしくはそれ以上の融合ポリペプチドとして発現してもよいし、または直接もしくはリンカー、例えばアミノ酸リンカーを介して他のいずれかのやり方で結合してもよい。
一実施態様において、上記ABD結合ポリペプチドは、二量体の形態である。可能な多量体の形態には、三量体の形態も含まれる。ポリペプチドの多量体の形態は、適した数の上に定義されたようなポリペプチド配列を含んでもよい。
本開示の範囲から逸脱することなくポリペプチドを特定の用途に合わせるために、本明細書に開示された任意の態様によるABD結合ポリペプチドにさまざまな修飾および/または付加を行うことができることは、当業者に理解されるであろう。例えば、本明細書に開示された任意のABD結合ポリペプチドは、さらなるC末端および/またはN末端アミノ酸を含んでもよい。このようなポリペプチドは、ポリペプチド鎖のまさに最初のおよび/またはまさに最後の位置で、すなわちN末端および/またはC末端でさらなるアミノ酸残基を有するポリペプチドとして理解しなければならない。したがって、ABD結合ポリペプチドは、任意の適した数のさらなるアミノ酸残基、例えば少なくとも1つのさらなるアミノ酸残基を含んでもよい。それぞれのさらなるアミノ酸残基は、例えば、ポリペプチドの産生、精製、インビボまたはインビトロでの安定化、結合、または検出を改善するために、個々に、またはまとめて加えてもよい。このようなさらなるアミノ酸残基は、化学結合のために加えられた1つまたはそれ以上のアミノ酸残基を含んでもよく、それにより、例えば、ABD結合ポリペプチドを樹脂またはマトリックス、例えばセファロースベースの樹脂またはスルホリンクカップリング(SulfoLink coupling)樹脂に結合可能にすることができる。この一例は、さらなるアミノ酸残基として、または多くのさらなるアミノ酸残基の1つとしてシステイン残基の付加である。一実施態様において、本明細書に開示されたABD結合ポリペプチドは、ポリペプチドのC末端で、例えばC末端でシステイン残基を含む。一実施態様において、上記システインは、C末端のさらなるトリペプチドVDCの一部である。一実施態様において、上記システインは、孤立C末端C(lone C-terminal C)である。
特に特定の一実施態様において、ABD結合ポリペプチドは、上に定義されたような2つのABD結合ドメインの二量体の他にC末端システイン残基を含む。
また、このようなさらなるアミノ酸残基は、ポリペプチドの精製または検出のための「タグ」、例えば、Hisタグまたは「myc」(c−myc)タグもしくは「FLAG」タグを、タグに特異的な抗体との相互作用のため、またはHis−タグの場合、固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)との相互作用のために提供することができる。
上で議論したようなさらなるアミノ酸を、化学的結合(知られている有機化学的方法を用いる)によって、または他のいずれかの手段、例えば融合タンパク質としてのABD結合ポリペプチドの発現によってABD結合ポリペプチドに結合してもよい。
本発明をさまざまな例示的実施態様に関して説明してきたが、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更を行うことができ、その要素を同等物で置換できることは、当業者によって理解される。さらに、本発明の必須の範囲から逸脱することなく、特定の状況または分子を本発明の教示に適合させるために多くの改変を行うことができる。したがって、本発明は、本発明を実施するために企図された任意の特定の実施態様に限定されることなく、本発明は、添付の特許請求の範囲内に帰属するすべての実施態様を含むものとする。
選択およびスクリーニングに用いた、または本発明の説明に関する融合タンパク質に用いた、本発明のABD結合ポリペプチドに含まれるABD結合モチーフの例(配列番号:1〜52)、本発明による49マーのABD結合ポリペプチドの例(配列番号:53〜104)、本発明による58マーのABD結合ポリペプチドの例(配列番号:105〜156)のアミノ酸配列、ならびにアルブミン結合ドメイン変異体の配列(配列番号:157〜162)のリストである。 図1Aの続き。 図1Bの続き。 図1Cの続き。 図1Dの続き。 図1Eの続き。 実施例1に記載したような、2μg/mlのビオチン化PEP07911で検定されたZ変異体の選択に関するELISAの反応を示す。吸光度をELISAプレート上の陽性対照からのシグナルで割ることによって反応を標準化した。 実施例1に記載したとおり実施したブロッキングELISAアッセイのZ変異体の選択のための反応を示す。Z変異体のペリプラズム調製は、10×過剰のHSAを添加してまたはそれを添加することなく0.2μg/mlのPEP07911に対して試験した。黒色のバーは、HSAなしの試料に相当し、そして灰色のバーは、ブロッキング剤として加えたHSAを含む試料に相当する。 実施例3に記載されたカラム研究Iからの結果を示す。図中のバーは、表1に明記された異なる洗浄および溶離ステップ後、ABD結合Z変異体結合樹脂のそれぞれから遊離された試料の相対量を表す。 実施例3に記載されたカラム研究IIからの結果を示す。図5Aは、それぞれ0.1Mクエン酸ナトリウム、pH3.0または0.5M HAc、pH2.5による(a)第1のまたは(b)第2の溶離の後、ABD結合Z変異体結合樹脂のそれぞれから、または参照として含まれたHSA−セファロース樹脂から遊離された試料の相対量を表す。 実施例3に記載されたカラム研究IIからの結果を示す。図5Bは、図5AのZ変異体結合樹脂から溶出された対応する画分のSDS−PAGE分析の結果を示す。「M」とは、Novex Sharp Pre-stained Protein標準(インビトロゲン;Mw:216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3.5kDa)のことをいい、そして「装填試料」とは、最初に各Z変異体結合樹脂に装填されたPEP08515を含む細菌抽出物のことをいう。Z変異体結合樹脂からの溶出液20μl、タンパク質標準または細菌抽出物5μlを、SDS−PAGEゲルのそれぞれを1レーンに装填した。 実施例3に記載されたカラム研究IIからの結果を示す。図5Cは、図5AでHSAセファロース樹脂から溶出された対応する画分のSDS−PAGE分析の結果を示す。レーン1:0.1Mクエン酸ナトリウム、pH3.0(pH3(a))による第1の溶離。レーン2:0.1Mクエン酸ナトリウム、pH3.0(pH3(b))による第2の溶離。レーン3:0.5M HAc、pH2.5(pH2.5(a))による第1の溶離。レーン4:0.5M HAc、pH2.5(pH2.5(b))による第2の溶離。それぞれの溶出液20μlを、SDS−PAGEゲルに装填した。「M」とは、Novex Sharp Pre-stained Protein標準の(インビトロゲン;Mw:216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3.5kDa)ことをいい、5μlを装填した。 実施例4に記載したとおり実施した、His−(Z06677)−Cysと結合したEAH−セファロース樹脂上でのABD−融合タンパク質の親和性精製からのクロマトグラムを示す(実線)。参照のため、HSAと結合したセファロース樹脂上での同一試料の精製(破線)が含まれた。試料注射地点を矢印で示す。AおよびBは、それぞれHis−(Z06677)−Cys結合樹脂およびHSA結合樹脂からのフロースルー画分を示し、そしてCおよびDは、それぞれからの溶出画分を示す。溶離は、線形pH勾配がpH5.5からpH2.3の範囲で実施した。pH(点線)は、HPLC系の内蔵pHメーターによってモニターした。 実施例4に示し、そしてさらに記載したとおり、反復アルカリインキュベーションを実施した後に測定されたEAH−セファロース樹脂に結合したHis−(Z06677)−Cys(実線)の動的結合能力を示す。参照のため、セファロース樹脂に結合したHSA(破線)の結合能力が含まれた。 実施例7に記載したとおり実施した抗ABDアガロース上でのABD−融合タンパク質PEP10986の親和性精製からのクロマトグラムを示す。試料注射地点を矢印によって示す。280nmの吸光度シグナルを示す(実線)。FTおよびEは、それぞれ、フロースルー画分および溶出画分のことをいう。溶離を0.1M HAc、pH2.9で実施し、そしてpH(点線)をHPLC系の内蔵pHメーターによってモニターした。 実施例7に記載した精製から選択された画分のSDS−PAGE分析の結果を示す。レーン1:カラムに装填された清澄化された細菌抽出物、レーン2:画分E1、レーン3:画分E2およびレーン4:画分E3。「M」は、Novex Sharp Pre-stained Protein標準(インビトロゲン;Mw:216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3.5kDa)のことをいう。各試料5μlをSDS−PAGEゲルのそれぞれのレーンに装填したが、但し、レーン2には1.25μlを装填した。 実施例8に記載したとおり実施した、抗ABDアガロース上のABD−融合タンパク質PEP03973の親和性精製からのクロマトグラムを示す。試料注射地点を、矢印によって示す。280nmの吸光度シグナルを示す(実線)。FTおよびEは、それぞれフロースルー画分および溶出画分のことをいう。溶離を0.1M HAc、pH2.9で実施し、そしてpH(点線)を、HPLC系の内蔵pHメーターによってモニターした。 実施例8に記載した精製から選択された画分のSDS−PAGE分析の結果を示す。レーン1:カラムに装填された清澄化された細菌抽出物、レーン2およびレーン3:フロースルー、レーン4:画分E1、レーン5:画分E2、レーン6:画分E3、レーン7:画分E4、レーン8:画分E5。「M」は、Novex Sharp Pre-stained Protein標準(インビトロゲン;Mw:216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3.5kDa)のことをいう。各試料5μlを、SDS−PAGEゲルのそれぞれのレーンに装填した。 実施例9に記載したとおり実施した抗ABDアガロース上でのABD−融合タンパク質PEP06548の親和性精製からのクロマトグラムを示す。試料注射地点を、矢印によって示す。280nmの吸光度シグナルを示す(実線)。FTおよびEは、それぞれ、フロースルー画分および溶出画分のことをいう。溶離を0.1M HAc、pH2.9で実施し、そしてpH(点線)を、HPLC系の内蔵pHメーターによってモニターした。 実施例9に記載した精製から選択された画分のSDS−PAGE分析の結果を示す。レーン1:カラムに装填された清澄化された細菌抽出物、レーン2:画分E1。「M」は、Novex Sharp Pre-stained Protein標準(インビトロゲン;Mw:216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3.5kDa)のことをいう。レーンMおよびレーン1に5μlを装填し、そしてSDS−PAGEゲルのレーン2に5.8μlを装填した。 実施例10に記載したとおり実施した抗ABDアガロース上のABD−融合タンパク質PEP17081の精製のクロマトグラムを示す。280nmの吸光度シグナル(実線)および導電率(点線)を示す。試料注射地点を、矢印によって示す。FTおよびEは、それぞれ、フロースルー画分および溶出画分のことをいう。 実施例11に記載した異なる精製段階から選択された画分のSDS−PAGE分析の結果を示す。レーンM:Novex Sharp Pre-stained Protein標準、インビトロゲン(216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3.5kDa)5μl。レーン1:抗ABDアガロースカラム上に装填された清澄化され、熱処置されたE. coli溶解物5μl。レーン2:抗ABDアガロースカラムからのフロースルー5μl(図11AのFT)。レーン3:抗ABDアガロースカラムからの溶出貯留物3.6μl(図11AのE)。レーン4:RPC(逆相クロマトグラフィー)によってさらに精製され、そして緩衝液交換されたPEP17081 12μl。 実施例11で記載したとおり実施した、抗ABDアガロース上での、そのC末端でタンパク質ホルモンに融合したABD035(配列番号:159)を含むタンパク質1の親和性精製からのクロマトグラムを示す。試料注射地点を、矢印によって示す。280nmの吸光度シグナル(実線)および導電率(点線)を示す。FT、WおよびEは、それぞれ、フロースルー画分、洗浄画分および溶出画分のことをいう。第1の洗浄ステップ、W1を4CVのTSTで実施し、そして第2の洗浄ステップ、W2を3CVの5mM NHAc、pH 5.5で実施した。 実施例11に記載した精製から選択された画分のSDS−PAGE分析の結果を示す。レーン1〜3:SEC精製タンパク質:(1)10μg、(2)5μgおよび(3)1μg。レーン4:抗ABDアガロースカラムに装填されたタンパク質試料、すなわち、TST中で1:10希釈されたSEC精製タンパク質。レーン5:20倍濃縮されたFT。レーン6:60倍濃縮されたW1。レーン7、8および9:溶出タンパク質:それぞれ(7)10μg、(8)5μgおよび(9)1μg。「M」でマークされたレーンは、タンパク質分子量マーカー(Mw:200、116.3、97.4、66.3、55.4、36.5、31、21.5、14.4、6、3.5、2.5kDa)で装填した。矢印は、混在タンパク質の弱いバンドを示しており、これはSECのみによって精製した試料のSDS−PAGEゲル上では認識できたが、抗ABDアガロース樹脂上の精製によって有効に除去された。 実施例12に記載したとおり実施した、抗ABDアガロース上での、そのN末端でペプチドホルモンに融合したABD035(配列番号:159)を含むタンパク質2の親和性精製からのクロマトグラムを示す。試料注射地点を、矢印によって示す。280nm(実線)の吸光度シグナルおよび導電率(点線)を示す。FT、WおよびEは、それぞれ、フロースルー画分、洗浄画分および溶出画分のことをいう。第1の洗浄ステップ、W1を8CVのTSTで実施し、そして第2の洗浄ステップ、W2を、3CVの5mM NHAc、pH5.5で実施した。 実施例12に記載した精製から選択された画分のSDS−PAGE分析の結果を示す。レーン1:抗ABDアガロースカラムに装填されたタンパク質試料。レーン2:FT。レーン4〜6:洗浄画分。レーン7〜13:図13Aでマークされた二重ピーク内の溶出タンパク質画分。二重ピーク内の第1のピークに相当する画分をレーン7〜10に装填した。「M」でマークされたレーンは、タンパク質分子量マーカー(Mw:200、116.3、97.4、66.3、55.4、36.5、31、21.5、14.4、6、3.5、2.5kDa)で装填した。
実施例
特記した場合を除いて、本研究の全体を通じて以下の物質を用いた:
・大腸菌(Escherichia coli)株XL1-Blue(アジレント・テクノロジー(Agilent Technologies)、カタログ番号200268)
・WO2009/016043またはWO2012/004384に記載されたとおり本質的に産生されたアルブミン結合ドメインABD001(配列番号:157)、C−ABD001(配列番号:158)、ABD035(配列番号:159)、PP013(配列番号:160)、PEP07986(配列番号:161)およびPEP07911(配列番号:162)。
実施例1
ABD結合Z変異体の選択およびスクリーニング
物質および方法
標的タンパク質のビオチン化:EZ−リンクマレイミドPEG2−ビオチン(EZ-Link Maleimide PEG2-Biotin)(ピアース(Pierce)、カタログ番号21901)を用いて、N末端システインを有するABD001(C−ABD001;配列番号:158)およびPEP07911(配列番号:162)を、ビオチン化した。簡潔に言えば、タンパク質を、50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、2mM EDTA、pH7.5に溶解した。ジチオトレイトール(DTT)を20mMの最終濃度まで加え、試料を回転混合により34℃で1時間インキュベートした。使い捨てのPD−10カラム(GEヘルスケア(GE Healthcare)、カタログ番号17−0851−01)を用いて、緩衝液を結合緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、1mM EDTA、pH7.0)に交換した。5倍(5×)モル過剰のEZ−リンクマレイミドPEG2−ビオチン(EZ-Link Maleimide PEG2-Biotin)(結合緩衝液に溶解した)をタンパク質試料に加え、回転混合により室温(RT)で2時間インキュベーションを進行させた。その後のPBS(10mMリン酸、137mM NaCl、2.68mM KCl、pH7.4)への緩衝液交換は、PD−10カラムを用いて実施した。PEP07986(配列番号:161)は、No−Weigh EZ−リンクスルホ−NHS−LC−ビオチン(No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin)(ピアース(Pierce)、カタログ番号21327)を10×モル過剰で用いて、製造元の推奨に従って室温で30分間ビオチン化した。その後のPBSへの緩衝液交換は、透折カセット(Slide-a-lyzer 3.5 K、3500 MWCO、ピアース、カタログ番号66333)を用いて製造元の説明書に従って実施した。
ABD結合Z変異体のファージディスプレイ選択:Groenwallら(J Biotechnol, 128:162-183, 2007)に記載されたとおり本質的にファージミドpAY02047中に作製されたファージ上に示されたタンパク質Zのランダム変異体のライブラリーを用いてABD結合ポリペプチドを選択した。ライブラリー、Zlib004Naive.Iは、Taq DNAポリメラーゼ結合分子Z03639(Gunneriusson et al, Protein Eng 12:873-878, 1999に記載されており、ここでは、ZTaqS1−1と表された)を融合パートナーとして利用する。ライブラリーは、1.4×1010の変異体の実測サイズを有した。
20lファーメンター中でファージストックを調製した。ファージミドライブラリーZlib004Naive.Iを含有するグリセロールストックからの細胞を、2%グルコースおよび100μg/mlアンピシリンで補充されたTSB−YE(トリプシンダイズブイヨン−酵母エキス;30g/lTSB、5g/l酵母エキス)20lに接種した。培養液をファーメンター(ベラーチ・バイオテクニーク(Belach Bioteknik)、BR20)中37℃で増殖させた。細胞が光学濃度(OD)0.7〜0.8に達したとき、10×モル過剰のM13K07ヘルパーファージ(ニュー・イングランド・バイオラボ(New England Biolabs)、カタログ番号N0315S)を用いて培養液約2.6lを感染させた。細胞を30分間インキュベートし、その後、0.1mM IPTG(イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド、発現誘導のため)、25μg/mlカナマイシンおよび12.5μg/mlカルベニシリンで補充されたTSB−YEを用いてファーメンターを20lまで充填し、細胞を30℃で22時間増殖させた。培養液中の細胞を15900gで遠心分離して沈殿させ、培地中に残っているファージ粒子をPEG/NaCl(ポリエチレングリコール/塩化ナトリ)中で2回沈澱させ、濾過し、そして前出、Groenwallらに記載されたとおり、PBSおよびグリセロールに溶解した。ファージストックを、使用前に−80℃で保存した。
選択は、ビオチン化ABDの異なる変異体に対して3つのサイクルで実施した。ファージストック調製、選択手順および選択サイクルの間のファージの増幅は、WO2009/077175中に別の標的に対する選択に関して記載されたとおり本質的に実施した。0.1%ゼラチンおよび0.1%Tween20で補充されたPBSを、選択緩衝液として用い、そして標的−ファージ複合体を、ダイナビーズ(Dynabeads)(R)M−280ストレプトアビジン(ダイナル(Dynal)、カタログ番号112.06)によって直接捕捉した。ABD0.25μg当たり1mgのビーズを用いた。E. coli菌株XL1-Blueをファージ増幅に用いた。選択は、3つのトラック:PEP07911を用いる1つのトラック、C−ABD001を用いる1つのトラック、およびC−ABD001とPEP07986とを交互にする1つのトラックに分けた3つのサイクルで実施した。選択のサイクル1では、異なる選択トラックに100nMのPEP07911またはC−ABD001を用い、そしてPBST0.1%(0.1%Tween−20で補充されたPBS)による2回の洗浄を実施した。その後の2つのサイクルでは、標的濃度を下げ、かつ洗浄回数を増やして、厳密性を高めた。1つの標的のみを用いる選択トラックについては、サイクル2および3において、それぞれ50nM、続いて25nMのPEP07911またはC−ABD001を用いた。標的を交換するトラックでは、サイクル2において75nMのPEP07986を用い、そしてサイクル3において40nMのC−ABD001を用いた。すべてのトラックについて、サイクル2および3では、PBST0.1%を用いてそれぞれ4回および8回の洗浄を実施した。洗浄後、結合したファージを、0.1Mグリシン−HCl(pH2.2)500μlで溶離し、Tris−HCl 50μl、pH8.0およびPBS 450μlで直ちに中和した。最後の選択サイクルでは、すべてのトラックを0.5MのHAc、pH4.0で最初に溶離し、続いて上記のようにグリシン−HClで溶離した。種々の溶出液を、その後、別々に処理した。
Z変異体のELISAスクリーニング:選択されたZ変異体分子が、ABDの種々の変異体と実際に相互作用できることを検証するため、ELISAアッセイを実施した。ディープウェルプレート(ヌンク(Nunc)、カタログ番号278752)中、100μg/mlのアンピシリンおよび0.1mMのIPTGで補充されたTSB−YE培地1mlに選択からの単一コロニーを接種することによってZ変異体を産生した。プレートを37℃で18〜24時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって沈殿させ、PBST0.05%400μl中で再懸濁し、そして−80℃で凍結して細胞の周辺質画分を遊離した。凍結した試料を、その後、水浴中で解凍し、そして凍結融解を8回繰り返した。PBST0.05%400μlを試料に加え、そして細胞を遠心分離によって沈殿させた。周辺質上清は、AQHDEALE−[Z#####]−VDYV−[Z03639]−YVPGとして表されるTaq DNAポリメラーゼ結合分子Z03639への融合物としてZ変異体を含んだ。Z#####は、個々の58アミノ酸残基Z変異体に相当する。
ハーフエリア96ウェルELISAプレート(コスター(Costar)、カタログ番号3690)を、Z変異体に特異的な抗体(アフィボディ(Affibody)、カタログ番号20.1000.01.0005)4μg/mlを含む50μl/ウェルのコーティング緩衝液(50mM炭酸ナトリウム、pH9.6)でコートし、そして4℃で一夜インキュベートした。抗体溶液を捨て、そしてウェルをPBSC(0.5%カゼインで補充されたPBS;シグマ(Sigma)、カタログ番号C8654)100μlにより室温で2時間ブロックした。ブロッキング溶液を捨て、そしてウェルに周辺質溶液50μlを加え、そしてゆっくり振盪しながら室温で1.5時間インキュベートした。上清を捨て、そしてウェルをPBST0.05%で4回洗浄した。次いで、ビオチン化PEP07986またはPEP07911 50μlを、PBSC中2μg/mlの濃度で、各ウェルに加えた。プレートを室温で1時間インキュベートし、続いて上記のように洗浄した。PBSC中で1:30000に希釈したストレプトアビジン−HRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ;サーモサイエンティフィック(Thermo Scientific)、カタログ番号N100)を、ウェルに加え、そしてプレートを45分間インキュベートした。上記のように洗浄した後、イムノピュアTMB(ImmunoPure TMB)基質(サーモサイエンティフィック(Thermo Scientific)、カタログ番号34021)50μlをウェルに加え、そしてプレートを製造元の推奨に従って処理した。マルチウェルプレートリーダー、ビクター(Victor3)(パーキンエルマー(Perkin Elmer))を用いて、ウェルの吸光度を450nmで測定した。
陽性対照として、無関係であるが、明記されておりかつ標的タンパク質に結合しているZ変異体を含み、そして上のように発現された周辺質画分を、5μg/mlのこのビオチン化された標的タンパク質に対して検定した。陰性対照として、同じ周辺質調製物をPEP07986またはPEP07911に対して検定した。PEP07986またはPEP07911に対してプラスの吸光度値を有するクローンについてシークエンシングを実施した。
シークエンシング:標準PCRプログラムならびにプライマーAFFI−21(5’−tgcttccggctcgtatgttgtgtg;配列番号:163)およびAFFI−22、(5’−cggaaccagagccaccaccgg:配列番号:164)を用いて単一コロニーから2ステップでPCRフラグメントを増幅した。増幅されたフラグメントのシークエンシングは、ビオチン化オリゴヌクレオチドAFFI−72(5’−ビオチン−cggaaccagagccaccaccgg;配列番号:165)およびBigDye(R)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(アプライドバイオシステムズ、カタログ番号4336919)を使用し、製造元のプロトコールに従って用いて実施した。シークエンシング反応物は、Magnatrix 8000(マグネティックバイオソリューション(Magnetic Biosolution))を用いて磁性ストレプトアビジンコーティングビーズ(Detach Streptavidin Beads、Nordiag、カタログ番号2012−01)への結合によって精製し、そしてABI PRISM(R) 3130xl Genetic Analyzer(PEアプライドバイオサイエンシズ(PE Applied Biosystems))上で分析した。
ブロッキングELISA:最初のELISA画面からのクローンのサブセットについて、それらの標的との結合がHSAの存在に影響を受けるかどうか明らかにするため、ELISAブロッキングアッセイにかけた。選択されたZ変異体については、上と同じ周辺質画分を用いた。ELISAブロッキングアッセイは、標的ステップで以下のプロトコール改変を導入してELISAスクリーニングアッセイとして実施した:HSAを標的タンパク質と混合した後、アッセイプレートに添加した。0.2μg/mlのビオチン化PEP07911の10×モル過剰のHSAと混合し、次いで、室温で15分間インキュベートして複合体形成させた後、プレートに添加した。陽性対照として、無関係な標的タンパク質を結合する分子を含有し、かつ上のように発現させた周辺質画分を、5μg/mlのビオチン化された特定の標的タンパク質に対して検定した。陰性対照として、同じ周辺質調製物を、ビオチン化PEP07911に対して検定した。ブランクとして、周辺質調製物の代わりにPBSCを加え、そしてビオチン化PEP07911を標的として加えた。すべての対照は、上と同じ方法でHSAを添加した試料および添加してない試料として調製した。
結果
ABD結合Z変異体のファージディスプレイ選択:ビオチン化ABDの異なる変異体に対するファージディスプレイ選択の3つのサイクル後、個々のクローンを得た。ファージ粒子収率(ファージ粒子アウト(out)/ファージ粒子イン(in))は、各サイクルで増加し、標的結合クローンの富化を示している。
Z変異体のELISAスクリーニング:3つの選択サイクル後に得られたクローンを96ウエルプレート中で産生し、そしてELISAにおいてABD結合活性についてスクリーニングした。PEP07911に対して検定した陽性クローンの選択の結果(シグナルは、陰性対照の少なくとも2×に相当する)を図2に示す。無関係なタンパク質に特異的な対照分子により、特定のタンパク質に対する陽性シグナルを得たが、PEP07986またはPEP07911に対してはシグナルが得られなかった。
ブロッキングELISA:Z変異体が天然リガンドHSAとオーバーラップ結合部位を有するかどうか調べるため、PEP07986またはPEP07911に対して陽性であるクローンを、HSAを含むブロッキングアッセイにかけた。試験したすべてのクローンについて、PEP07911に対する結合シグナルは、HSAの存在によって完全に消失し、バックグラウンドと同じレベルに達した(図3)。陽性対照の結合は、過剰のHSAの添加によって影響を受けず、そしてブランクはバックグラウンドシグナルを示さなかった。
シークエンシング:ELISAスクリーニングにおいてABDに対して陽性の吸光度値を有するクローンについてシークエンシングを実施した。各変異体に固有の識別番号#####を与え、そして個々の変異体をZ#####と称した。58アミノ酸残基長のZ変異体のアミノ酸配列を図1に、そして配列番号:105〜156として配列リストに記載した。これらのZ変異体の推測されたABD結合モチーフをBM#####と表し、図1に、そして配列番号:1〜52として配列リストに記載した。これらのZ変異体のそれぞれの中に完全な3−ヘリックスバンドルを構成すると予測される49アミノ酸残基長のポリペプチドのアミノ酸配列をP#####と表し、図1に、そして配列番号:53〜104として配列リストで記載した。
実施例2
ABD結合Z変異体のクローニングおよび産生
物質および方法
Z変異体のサブクローニング:7つのABD結合Z変異体のDNA、Z06608(配列番号:107)、Z06620(配列番号:110)、Z06638(配列番号:106)、Z06650(配列番号:108)、Z06677(配列番号:105)、Z06678(配列番号:109)およびZ06695(配列番号:111)を、ライブラリーベクターpAY02047から増幅した。標準分子生物学的手法を用いて、他の標的を結合するZ変異体についてWO2009/077175に詳細に記載されたとおり、N末端HisタグおよびC末端Cysを有する二量体Z変異体分子を作製するためのサブクローニング戦略を適用した。Z遺伝子フラグメントは、発現ベクターpAY01449にサブクローニングしてコードされた配列MGSSHHHHHHLQ−[Z#####][Z#####]−VDCを生成した。
培養および精製:E. coli BL21(DE3)細胞(ノバゲン(Novagen))を、それぞれ個々のZ変異体の二量体遺伝子フラグメントを含むプラスミドを用いて形質転換し、そして50μg/mlのカナマイシンで補充されたTSB+YE培地(酵母エキス入りトリプシンダイズブイヨン)1l中、37℃で培養した。OD600=1で、IPTGを加え、0.17mMの最終濃度でタンパク質発現を誘導し、そして培養液をさらに5時間37℃でインキュベートした。細胞を遠心分離によって集めた。
各細胞沈殿物4.8gを、29U/mlのベンゾナーゼ(R)(メルク(Merck)、カタログ番号1.01654.0001)で補充された変性結合緩衝液(denaturing binding buffer)(20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、20mMイミダゾール、8M尿素、pH7.4)30ml中に再懸濁し、そして撹拌しながら室温で1時間インキュベートして発現タンパク質を遊離させた。細胞残屑を遠心分離によって除去し、そして各上清を1mlのHis GraviTrap IMACカラム(GEヘルスケア、カタログ番号11−0033−99)に適用した。変性結合緩衝液、天然結合緩衝液(20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、20mMイミダゾール、pH7.4)および洗浄緩衝液(20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、60mMイミダゾール、pH7.4)で洗浄することによって混在物質を除去し、そしてABD結合Z変異体を、溶離緩衝液(20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、250mMイミダゾール、pH7.4)で続いて溶離した。精製された各ABD結合Z変異体を、サイズ排除クロマトグラフィーによって10mM NHHCOに移した。NanoDrop(R)ND-1000分光光度計を用いて280nmで吸光度を測定し、それぞれのタンパク質の吸光係数を用いてタンパク質濃度を決定した。ABD結合Z変異体を凍結乾燥し、そしてクーマシーブルーで染色したSDS−PAGEによって最終生成物の純度を分析した。精製された各ABD結合Z変異体の同一性を、HPLC−MS分析を用いて確認した。
結果
培養および精製:7つのABD結合Z変異体Z06608(配列番号:107)、Z06620(配列番号:110)、Z06638(配列番号:106)、Z06650(配列番号:108)、Z06677(配列番号:105)、Z06678(配列番号:109)およびZ06695(配列番号:111)を、N末端HisタグおよびC末端Cysを有する二量体として作製し、E. coli中で適切に発現させた。細菌ペレット4.8gからのIMAC精製タンパク質の量は、分光測光法により280nmで吸光度を測定することによって決定され、種々のABD結合Z変異体について3mgから19mgの範囲であった。
それぞれの最終的なタンパク質産生のSDS−PAGE分析は、これらがそれぞれのABD結合Z変異体を主に含むことを示した。各ABD結合Z変異体の正確な分子量は、HPLC−MSによって確認した。
実施例3
ABD結合Z変異体の結合および溶離特性の評価
本実施例では、実施例1および2に記載されたとおり選択および産生された一連のABD結合ポリペプチドの結合および溶離特性を、それぞれ、スピンカラムを用いた小規模フォーマットで研究した。
物質および方法
樹脂へのABD結合Z変異体の結合:実施例2に記載されたとおり産生されたフォーマットHis−(Z#####)−Cysの凍結乾燥されたそれぞれのABD結合Z変異体Z06608、Z06620、Z06638、Z06650、Z06677、Z06678およびZ06695 1mgを還元緩衝液(50mM Tris−HCl、5mM EDTA、20mM DTT、pH8.5)中で再懸濁し、そして室温で2時間インキュベートした。還元されたタンパク質溶液を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて50mM DTTを含むカップリング緩衝液(50mM Tris−HCl、5mM EDTA、pH8.5)に移し、次いで、スルホリンクカップリングレジン(SulfoLink Coupling Resin)(サーモフィッシャーサイエンティフィック(Thermo Fisher Scientific)、カタログ番号20401)0.2mlの部分と混合した。この手順により、ABD結合Z変異体のC末端システイン残基のチオール基と樹脂のヨードアセチル基との間の部位特異的反応が可能となり、共有結合性のチオエーテル結合が形成される。結合反応は、製造元の説明書に従って実施した。結合度は、樹脂ml当たり結合したABD結合Z変異体のmgとして定義され、以下のように決定した:結合したABD結合Z変異体の量は、280nmでの吸光度の分光光度測定によって得られた濃度に基づいて、試料の最初の量から未結合の物質の量を引いて算出した。次いで、結合したABD結合Z変異体のmgでの量を、スルホリンクカップリングレジン(SulfoLink Coupling Resin)の体積で割った。
カラム研究I:純粋な試料を用いたABD結合Z変異体結合樹脂の評価:樹脂に結合した7つのABD結合Z変異体のそれぞれの結合、洗浄および溶離の性質を試験するため、ABD融合タンパク質PEP08517の以前に精製された試料を用いることによって第1のカラム研究を実施した。PEP08517は、そのN末端でタンパク質Zのサイトカイン結合変異体に融合したアルブミン結合ドメインPP013(配列番号:160)を含む。樹脂の0.1ml部分を試験管に移し、そして結合緩衝液中2mg/mlでPEP08517の純粋な試料0.1mlを加えた。管を、回転輪上、室温で1時間インキュベートした。各試料−樹脂混合物を、空のスピンカラムに移した。未結合タンパク質を遠心分離(フロースルー、FT)によって集めた。その後、表1に明記された種々の溶液0.1mlを加えて洗浄し、続いて結合したPEP08517分子を溶離した。各洗浄および溶出画分を遠心分離によって集めた。
集めた画分を、分光光度計において280nmで吸光度を測定することによって分析した。
カラム研究II:細菌抽出物を用いたABD結合Z変異体結合樹脂の評価:カラム研究Iからの4つのABD結合Z変異体結合樹脂の結合性、洗浄性および溶離性をさらに試験するため第2のカラム研究を実施した。これらの樹脂のリガンドは、His−(Z06608)−Cys、His−(Z06638)−Cys、His−(Z06677)−CysおよびHis−(Z06650)−Cysであった。HSAセファロース(製造元による説明書に従って、CNBr活性化セファロース4ファーストフローに遊離アミンを介してヒト血清アルブミン結合した、GEヘルスケア、カタログ番号17−0981)で充填されたさらなるカラムを参照として含んだ。E. coliペレットから超音波処理および遠心分離によって調製された清澄化細菌抽出物を、本実験の試料として用いた。PEP08515(そのN末端でタンパク質ZのPDGFRβ(血小板由来増殖因子受容体ベータ(Platelet Derived Growth Factor Receptor beta))の結合変異体に融合したアルブミン結合ドメインPP013(配列番号:160)を含む)約0.5mgを含む細菌抽出物0.17mlを、それぞれ個々にABD結合Z変異体結合樹脂またはHSAセファロースで充填されたスピンカラムに移した。フロースルーを遠心分離によって集め、そしてカラムに2回、再適用した。表2に明記された種々の溶液を加えて細菌宿主タンパク質を除去し、続いて、結合したPEP08515分子を溶離した。洗浄および溶出画分を遠心分離によって集め、そして分光光度計において280nmで吸光度を測定することによって、およびSDS−PAGEによって分析した。
結果
ABD結合ポリペプチドの結合効率:スルホリンクカップリングレジン(SulfoLink Coupling Resin)に対する各ABD結合ポリペプチドの結合度を表3に示す。
カラム研究I:純粋な試料を用いたABD結合Z変異体結合樹脂の評価:表1に明記された種々の洗浄および溶離ステップ後、7つのABD結合Z変異体結合樹脂のそれぞれから遊離され、そして280nmで吸光度を測定することによって決定された、試料PEP08517の量を図4に示す。
研究した条件下で、それぞれABD結合Z変異体(His−(Z06608)−Cys、His−(Z06638)−Cys、His−(Z06650)−Cys)およびHis−(Z06677)−Cysと結合した樹脂は、非常に望ましい溶離
プロファイルを示しており、試料適用および洗浄中の試料漏出が少なく、大部分の試料がpH2.5の緩衝液による溶離で遊離された。
pH4で多くの試料を溶離したABD結合Z変異体結合樹脂はなかった。興味深いことに、いくつかの樹脂、例えばHis−(Z06608)−Cysは、pH2.5の緩衝液(「(b)pH2.5」)の2回目の添加でほとんどの試料を溶離したが、例えばHis−(Z06677)−Cysは、最初のpH2.5の緩衝液の添加(「(a)pH2.5」)で多くの試料を溶離しており、親和性リガンドHis−(Z06677)−Cysでは、他の候補と比較してより高い溶離pHを使用できることを示している。
カラム研究II:細菌抽出物を用いたABD結合Z変異体結合樹脂の評価:さらなる結合、洗浄および溶離の研究のため、親和性リガンドHis−(Z06608)−Cys、His−(Z06638)−Cys、His−(Z06650)−CysおよびHis−(Z06677)−Cysを含む、カラム研究Iからの4つの良好な性能を発揮するABD結合Z変異体結合樹脂を選択し、ここでは、PEP08515を含む細菌抽出物を試料として用いた。表2に明記された種々の異なる溶離ステップの後、4つのABD結合Z変異体結合樹脂のそれぞれから、または参照として含まれたHSA−セファロース樹脂から遊離され、280nmでの吸光度を測定することによって決定されたPEP08515の量を、図5Aに示す。
同じ溶出画分のSDS−PAGE分析を、図5Bに示す。2つの分析からの結果は十分に一致しており、すなわち、ある種の親和性リガンドについて、高い吸光度測定値の溶出画分からSDS−PAGEゲル上の太いバンドも得られており、そしてより低い吸光度測定値の画分についてその逆も同じであった。カラム研究I中のとおり、His−(Z06677)−Cysと結合した樹脂は、より高いpHの溶離範囲(「pH3(a)」および「pH3(b)」)で、その結合タンパク質の大部分を遊離した。
すべての溶出試料の純度は、一般に非常に高かったが(SDS−PAGE分析から算定して95%を超える)、種々のABD結合Z変異体については僅かな違いを観察することができた。
HSAセファロース樹脂(図5Cに示すSDS−PAGE分析)との比較では、ABD結合Z変異体結合樹脂は、吸光度の測定値およびSDS−PAGE分析から判断してより高い結合能力およびより望ましい溶離性を有すると考えられる。能力の違いは、リガンド密度の違いによるはずがない;実際、HSAセファロース上の結合HSA分子の数は、ABD結合Z変異体結合樹脂と比較して約1.5〜2.2倍高かった。
実施例4
実施例3に示した結果に基づくABD結合Z変異体のさらなる特徴づけおよびカラム研究
クロマトグラフィー系に連結するカラムにおけるさらなる特徴づけおよび研究のためHis−(Z06677)−Cysを選択した。
物質および方法
円偏光二色性分析による融点の測定:His−(Z06677)−Cysの融点(Tm)を決定するため円偏光二色性(CD)分析を実施した。精製した試料をPBSで0.5mg/mlまで希釈した。可変温度測定(VTM)を実施し、その際、20℃から90℃までの試料の加熱中、5℃/分の温度勾配で220nmの吸光度をモニターした。温度プロットに対するCDシグナルの遷移の中間点からTmを決定した。CD測定は、光路長1mmのセルを用いてJasco J-810分光偏光計(ジャスコスカンジナビアAB(Jasco Scandinavia AB))において実施した。
溶離pHのクロマトグラフィー研究:His−(Z06677)−Cysを、活性化EAH−セファロース4B上に固定化した(GEヘルスケア、カタログ番号17−0569−01)。活性化および固定化を製造元の説明書に従って実施し、そして実施例3に記載したとおり結合度を決定した。活性化EAHセファロースは、親和性リガンドのC末端システインを介して部位特異的結合を可能にするヨードアセチル基を含む。樹脂0.43mlをTricorn 5/50カラム(GEヘルスケア)に充填した。参照として、HSAセファロース(実施例3参照)0.47mlを同じ種類のカラムに充填した。
AEKTAexplorer 10クロマトグラフィー系(GEヘルスケア)を用いて溶離実験を実施した。2つのカラムを系に取り付け、PBSで平衡にした。PEP08519(そのN末端でタンパク質ZのTaqポリメラーゼ結合変異体に融合したアルブミン結合ドメインPP013(配列番号:160)を含む)1mgを含む試料2mlを各カラムに装填し、続いてPBSおよび0.1Mクエン酸ナトリウム、0.9%NaCl、pH5.5で洗浄した。結合したタンパク質を、pH5.5からpH2.3の範囲の線形pH勾配(0.1Mクエン酸ナトリウム、0.9%NaCl、pH5.5および0.1Mクエン酸ナトリウム、0.9%NaCl、pH2.3を用いる)によって16カラム体積(CV)にわたって溶離した。AEKTAexplorer系の内蔵pHメーターによってpHをモニターした。
ABD結合ポリペプチドの結合能力および耐アルカリ性のクロマトグラフィー研究:本実験では、前節に記載されたクロマトグラフィー研究に用いた、Tricorn 5/50カラムに充填されたHis−(Z06677)−Cys樹脂およびHSAセファロース樹脂について動的結合能力および耐アルカリ性を試験した。
本実験は、AEKTAexplorer 10クロマトグラフィー系を用いて実施した。2つのカラムを系に取り付け、PBSで平衡にした。この能力研究では、カラムから出る溶液の280nmでの吸光度が最初の試料の吸光度の10%に達するまで(すなわち10%ブレークスルー)、PBS中に0.25mg/mlのPEP08519を含む試料を流量0.2ml/分(滞留時間2.4分に相当する)で各カラムに装填した。デッドボリューム(すなわち、親和性リガンドを含まないカラムに試料を通すことによって測定した管およびカラム体積)を試料体積から引いた。結合したタンパク質を、0.1Mクエン酸ナトリウム、0.9%NaCl、pH2.3で溶離した。次いで、カラムをPBSで再び平衡にした。
この能力運転後、1ml/分の流量で5CVの0.2M NaOH、続いて流量なしでインキュベーション期間を適用することによってカラムをアルカリ処理にかけた。アルカリの総インキュベーション時間は、25分であった。カラムの中和は、1ml/分で5CVのPBSによる洗浄、上記のような新たな能力測定によって実施した。
さらに2回のアルカリ処理、続いて能力測定を上のように実施したが、NaOH濃度を0.5Mまで高め、そして最後のアルカリ処理では、インキュベーション時間を2時間まで延長した。
結果
円偏光二色性分析:His−(Z06677)−Cysの融点は、54℃であると決定された。
ABD結合Z変異体の溶離pHのクロマトグラフィー研究:活性化EAHセファロース樹脂に対するHis−(Z06677)−Cysの結合度は、樹脂ml当たりポリペプチド2.8mgであると決定された。
図6に示すように、His−(Z06677)−Cys樹脂を含むカラムからのABD−融合分子PEP08519の溶離は、HSAセファロース樹脂のカラムからよりも、勾配中でより早期に(すなわちより高いpHで)に現れ、それはまた、フロースルー中に現れるより大きな画分ではより低い結合能力を示した。
His−(Z06677)−Cysカラムからの溶出ピークのピーク最大値のpHは、3.3であったが、HSAセファロースカラムの対応するpHは、2.6であった。
ABD結合Z変異体の結合能力および耐アルカリ性のクロマトグラフィー研究:動的結合能力は、10%ブレークスルーまでに装填された試料の量を測定することによって決定した。His−(Z06677)−Cysカラムの動的結合能力は、樹脂ml当たり3.0mgのPEP08519であると決定された。HSAセファロースカラムの対応する能力は、樹脂ml当たり0.5mgと決定された。実施例3中のとおり、固定化HSA分子の数は、それらのそれぞれの樹脂上のHis−(Z06677)−Cys分子の数の2倍であると推定されるため、能力の違いをリガンド密度の違いによって説明することはできない。
各アルカリインキュベーション後に動的結合能力を再測定した。結果を図7に示す。His−(Z06677)−Cysカラムは、すべてのインキュベーション後、その最初の能力を維持した。これは、比較的苛酷なアルカリ条件に対する高い耐性を示しており、そしてそれはカラムの反復使用を可能にする定置洗浄(CIP)手順にとって重要な特徴である。対照的に、参照として含まれたHSAセファロースカラムでは、0.2M NaOHで25分後にその能力のほとんどが失われた。
実施例5
異なる樹脂に固定化されたABD結合Z変異体のカラム研究
本実施例では、ABD結合Z変異体His−(Z06677)−Cysを4つの異なるタイプの樹脂に固定化し、そして結合能力および耐アルカリ性をクロマトグラフィー的に評価した。
物質および方法
異なる樹脂に対するHis−(Z06677)−Cysの結合:凍結乾燥したHis−(Z06677)−Cys(実施例2に記載したとおり産生した)4mgを0.1M NaHCO 1ml、0.5M NaCl、pH8.3に溶解した。試料の半分をNHS活性化セファロース4ファーストフロー(NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow)(GEヘルスケア、カタログ番号17−0906)0.67mlに固定化し、そして試料の半分をCNBr活性化セファロース4ファーストフロー(CNBr-activated Sepharose 4 Fast Flow)(GEヘルスケア、カタログ番号17−0981)0.67mlに固定化した。両結合反応は、製造元による説明書に従って実施した。
凍結乾燥されたHis−(Z06677)−Cys 2mgを、0.5mlの50mM Tris−HCl、5mM EDTA、20mM DTT、pH8.5に溶解し、そして2時間インキュベートした。DTTを、サイズ排除クロマトグラフィーによって除去し、そして還元されたポリペプチドをスルホリンクカップリングレジン(SulfoLink Coupling Resin)0.67mlと混合した。結合反応は、製造元による説明書に従って実施した。
本実験で評価した第4の樹脂は、実施例4に記載されたHis−(Z06677)−Cysで固定化されたEAHセファロースであった。
各樹脂に対する結合度は、実施例3で記載されたとおり決定した。
4つのABD結合樹脂の結合能力および耐アルカリ性のクロマトグラフィー研究:4つのHis−(Z06677)−Cys結合樹脂をTricorn 5/50カラムに充填した。動的結合能力を試験し、その後、樹脂を0.5M NaOHに2時間、続いて第2の動的結合能力試験にかけた。能力試験およびアルカリインキュベーションは、実施例4に記載されたとおり実施した。
結果
異なる樹脂に対するABD結合Z変異体His−(Z06677)−Cysの結合:本実験で評価した4つの異なる樹脂のそれぞれに対するHis−(Z06677)−Cysの固定化の程度を、表5に示す。
4つのABD結合樹脂の結合能力および耐アルカリ性のクロマトグラフィー研究:4つの樹脂のそれぞれに対するHis−(Z06677)−Cysの結合後に決定された動的結合能力を表6に示す。
2つのヨードアセチル結合樹脂、スルホリンクカップリングレジン(SulfoLink Coupling Resin)およびアクチベイテッドEAHセファロース(Activated EAH Sepharose)の動的結合能力は、それぞれ樹脂ml当たり試料2.3mgおよび3.4mgと決定された。しかし、親和性リガンドのモル当たり結合できる試料のモル量を比較したとき、これらの樹脂は、同じ動的結合能力を示す(試料1.4mol/His−(Z06677)−Cysリガンドのmol)。換言すれば、スルホリンク樹脂に結合したHis−(Z06677)−Cysでは、EAHセファロース樹脂に結合したHis−(Z06677)−Cysと比較して、二量体内の2つのZ分子は、それぞれより高度に試料分子を結合する。
2つのアミン結合樹脂、すなわちNHS活性化セファロースおよびCNBr活性化セファロースの動的結合能力は、2つのヨードアセチル結合樹脂よりも低かった。これは、ヨードアセチル樹脂への結合に用いたような、単一システインによる部位特異的固定化のため、ABD結合Z変異体の結合部位が、移動相中の試料分子に対してより接近可能となることを示している。
NHS樹脂が、親和性リガンドをより接近可能にすることによって能力を理論的に改善するスペーサーアームを保持する事実にもかかわらず、NHS樹脂の動的結合能力は、CNBr樹脂と比較して半分未満であった。
0.5M NaOHで2時間アルカリ処理した後の4つの異なる樹脂の動的結合能力を表7に示す。ヨードアセチル結合樹脂の動的結合能力は、アルカリインキュベーションによって影響を受けなかったが、アミン結合樹脂の能力は約10%低下した。
実施例6
抗ABDアガロースの製造
本実施例は、二量体フォーマットで、C末端Cysを有するABD結合Z変異体Z006677、すなわち(Z06677)−Cysのより大規模な産生、およびスルホリンク樹脂上でのその後の固定化を記載する。
物質および方法
培養および精製:ABD結合Z変異体Z06677を、発現がT7プロモーターによって調節される発現ベクターに二量体としてサブクローニングした。さらなるN末端アミノ酸配列GSSLQおよびさらなるC末端アミノ酸配列VDCを有するABD結合ポリペプチドを発現させた。したがって、発現されたポリペプチドは、配列GSSLQ−[Z06677][Z06677]−VDCを有する。E. coli BL21(DE3)細胞(ノバゲン(Novagen))をプラスミドで形質転換し、そして50μg/mlのカナマイシンで補充されたTSB+YE培地(酵母エキス入りトリプシンダイズブイヨン)20l中37℃で培養した。OD600=1で、最終濃度0.17mMのIPTGを加えてタンパク質発現を誘導し、そして培養物を37℃でさらに5時間インキュベートした。遠心分離によって細胞を集めた。
実施例4および実施例5でわかったように、His−(Z06677)−Cysは、耐アルカリ性であることが立証された。高濃度のNaOHは、細胞破壊および精製の両方に貢献しているため、この性質は、(Z06677)−Cysの精製に利用され、そしてE. coli宿主タンパク質の大部分は、高いpHで変性するが、(Z06677)−Cysは溶液中に残る。
Ultra-Turrax T-50 basic(IKA WERKE)を使用して、細胞ペレット165gを0.5M NaOH 1.2l中に再懸濁した。懸濁液を撹拌下、室温で1時間インキュベートし、次いで−20℃で凍結した。凍結試料を解凍し、2M HClおよびTris塩基300mlを最終濃度20mMまで添加することによってpH8.2に滴定した。細胞残屑、変性したタンパク質およびDNAを、遠心分離によって除去した。清澄化試料に、800ml[20mM Tris−HCl、pH8.0、4.6gのDTT]およびベンゾナーゼ(Benzonase)(R)(メルク、カタログ番号1.01654.0001)を、10U/mlの最終濃度まで加え、室温で1時間インキュベーションを進行させた。その後、硫酸アンモニウム300gを1M濃度まで加え、試料を撹拌下、室温で40分間インキュベートした。硫酸アンモニウムを添加した後に沈殿したタンパク質を遠心分離によって除去し、続いてNalgeneボトルトップフィルター(0.45μm)を通して濾過した。
アセトニトリル(ACN)を、2%(v/v)の濃度まで試料に加えた。AEKTAexplorer 100クロマトグラフィー系(GEヘルスケア)を使用して、SOURCE 30 RPC(GEヘルスケア)125mlで充填されたFineLine 35カラム(GEヘルスケア)上に試料を装填した。カラムを、0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)を含むミリQ水中2%ACNで洗浄し、続いて4%ACNを含む同一の緩衝液で洗浄した。結合したタンパク質を、15CVにわたってACN4%から25%までACN濃度を高めることによって溶離した。溶出画分を集め、そしてSDS−PAGEおよびLC−MSによって分析した。関連画分を貯め、セファデックスG−25(GEヘルスケア)500mlで充填されたXK−50カラム(GEヘルスケア)を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって、それを結合緩衝液(50mM Tris−HCl、5mM EDTA、pH8.5)に移した。緩衝液を交換した試料を、分光測光法により280nmで吸光度を測定し、そしてSDS−PAGEにより、いくつかの異なる量の(Z06677)−Cysを装填し、その後、クマシーブルー(Comassie Blue)で染色して分析した。
樹脂に対するABD結合ポリペプチド(Z06677)−Cysの結合:結合緩衝液中3.4mg/mlの濃度で(Z06677)−Cysを含む試料に、DTTを20mMの濃度まで添加し、続いて撹拌下、室温で1時間インキュベーションすることによってこの試料を還元した。セファデックスG−25 500mlで充填され、結合緩衝液で予め平衡にしたXK−50カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによってDTTを除去した。還元された(Z06677)−Cysをスルホリンクカップリングレジン(SulfoLink Coupling Resin)(サーモサイエンティフィック、カタログ番号20404)と、樹脂ml当たり6mgの(Z06677)−Cysの比率で混合した。その後の結合反応は、製造元による説明書に従って実施したが、タンパク質−樹脂混合物のインキュベーションは、15分から35分まで延長した。結合効率は、未結合タンパク質のSDS−PAGE分析によって推定した。
結果
培養および精製:精製した二量体ABD結合Z変異体(Z06677)−Cysを分光光度計において280nmで吸光度を測定することによって、そしてSDS−PAGEによって分析した。(Z06677)−Cysはトリプトファンが欠如しており、280nmでの吸光度の測定値が低かった。したがって、Z変異体分子の濃度は、SDS−PAGE分析から推定し、それにはいくつかの異なる量の(Z06677)−Cysが含まれた。SDS−PAGEゲルの目視検査により、(Z06677)−Cysの濃度は、純度約95%で3.4mg/mlまでと推定された。
樹脂に対するABD結合ポリペプチド(Z06677)−Cysの結合:リガンド密度は、結合反応の未結合タンパク質画分において実施したSDS−PAGEゲルを視覚的に調べることによって(Z06677)−Cys5.8mg/スルホリンクカップリングレジンmlと推定された。
製造された(Z06677)−Cys結合樹脂は、さらに「抗ABDアガロース」と呼ばれ、そして以下の実施例では、様々なサイズおよび機能の異なるタンパク質との融合において異なるアルブミン結合ドメイン部分に対する結合に関して樹脂の広い適用性を示すために使用された。ABD部分が標的タンパク質のどこに位置するかに関係なく、精製が成功することが示されている。換言すれば、ABD部分は、N末端に、C末端に、またはいずれかの側に他のタンパク質部分が隣接するように融合タンパク質内にさえ配置されてもよい。
実施例7
抗ABDアガロースを用いるPEP10986の精製
本実施例では、そのN末端でタンパク質Zのサイトカイン結合変異体に融合したアルブミン結合ドメイン(PP013、配列番号:160)を含むPEP10986(12.5kDa)を、抗ABDアガロースで充填されたカラムを用いて精製した。
物質および方法
可溶性のPEP10986を内部に有するペレット状のE. coli細胞を、ベンゾナーゼ(Benzonase)(R)20U/mlで補充されたTST−緩衝液(Tris、生理食塩水、Tween:25mM Tris−HCl、1mM EDTA、200mM NaCl、0.05%Tween20、pH8.0)中に懸濁した。細胞を超音波処理によって破壊し、細胞残屑を遠心分離によって除去した。クロマトグラフィーは、AEKTAexplorer 100系を用いて実施した。清澄化された試料を、抗ABDアガロース(実施例6に記載されたとおり製造した)100mlで充填され、TSTで予め平衡にしたXK−50カラムに適用した。カラムを8CVのTST、続いて8CVの5mM NHAc pH5.5で洗浄した。結合したタンパク質を、3CVの0.1M HAc(pH2.9)を適用することによって溶離した。SDS−PAGEおよびHPLC−MSによるさらなる分析のため、フロースルー画分、洗浄画分および溶出画分を集めた。
抗ABDアガロース樹脂の頑健性およびアルカリ安定性を調べるため、上と同じカラムを用いて、数回の精製、それぞれ続いて0.5M NaOHの2〜3カラム体積のCIP(定置洗浄)サイクルを、その後に実施した。
結果
抗ABDアガロース樹脂におけるPEP10986の精製からのクロマトグラムを図8Aに示し、そして選択された画分のSDS−PAGE分析を図8Bに示す。図8B中のそれぞれレーン2、3および4に対応する溶出画分E1、E2およびE3を貯めた。PEP10986の正確な質量は、HPLC−MS分析によって検証し、そして純度は、SDS−PAGE分析から判断して95%より高いと推定された。分光光度分析により、貯留物には、精製されたPEP10986 908mgが含まれており、収率約90%に相当した。
本実施例中と同じカラムを用いる、PEP10986および他のABD融合分子のさらなる精製、それぞれ続いて2〜3カラム体積の0.5M NaOHのCIP(定置洗浄)サイクルによって、抗ABDアガロース樹脂の頑健性およびアルカリ安定性が確認された。23CIPサイクル後、能力の有意な低下は、まだ観察されなかった。
実施例8
抗ABDアガロースを用いるPEP03973の精製
本実施例では、そのN末端でタンパク質ZのHER2(ヒト上皮増殖因子受容体2)結合変異体に融合した野生型アルブミン結合ドメイン(ABD001、配列番号:157)を含むPEP03973(12.4kDa)を、抗ABDアガロースで充填されたカラムを用いて精製した。
物質および方法
可溶性のPEP03973を内部に有するペレット化E. coli細胞を、20U/mlのベンゾナーゼ(R)で補充されたTST−緩衝液中に懸濁した。細胞を超音波処理によって破壊し、細胞残屑を遠心分離によって除去した。AEKTAexplorer 100系を用いてクロマトグラフィーを実施した。清澄化された試料を、抗ABDアガロース(実施例6に記載したとおり製造した)100mlで充填され、TSTで予め平衡にしたXK−50カラムに適用した。カラムを、5CVのTST、続いて3CVの5mM NHAc pH5.5により洗浄した。結合したタンパク質を、3CVの0.1M HAc(pH2.9)を適用することによって溶離した。SDS−PAGEおよびHPLC−MSによるさらなる分析のためフロースルー画分、洗浄画分および溶出画分を集めた。
結果
抗ABDアガロース樹脂上でのPEP03973の精製からのクロマトグラムを図9Aに示し、そして選択された画分のSDS−PAGE分析を図9Bに示す。図9B中のそれぞれレーン5、6および7に対応する溶出画分E2、E3およびE4を貯めた。PEP03973の正確な質量は、HPLC−MS分析によって検証し、そして純度は、SDS−PAGE分析から判断して95%より高いと推定された。分光光度分析によれば、貯留物は、精製されたPEP03973 1036mgを含んでおり、収率約97%に相当した。
実施例9
抗ABDアガロースを用いるPEP06548の精製
本実施例では、TNF−α(TNFアルファ)に結合しているタンパク質Zの変異体の2つの部分(すなわち二量体)にN末端で融合したアルブミン結合ドメイン(ABD035、配列番号:159、C末端伸長VDCを有する)を含むPEP06548(20.3kDa)を、抗ABDアガロースで充填されたカラムを用いて精製した。また、PEP06548は、N末端ヘキサヒスチジンタグおよびC末端システイン残基を含む。
物質および方法
可溶性のPEP06548を内部に含むペレット化されたE. coli細胞を、27U/mlのベンゾナーゼ(R)で補充されたTST−緩衝液中で懸濁した。細胞を超音波処理によって破壊し、細胞残屑を遠心分離によって除去した。DTTを20mMの最終濃度まで添加し、続いて室温で30分間インキュベーションしてPEP06548試料分子のC末端システインを還元した。クロマトグラフィーは、AEKTAexplorer 100系を用いて実施した。清澄化および還元された試料を、抗ABDアガロース9mlで充填され、TSTで予め平衡にしたXK−16カラムに適用した。この抗ABDアガロースのバッチは、樹脂ml当たり約2.3mgの(Z06677)−Cysのより低いリガンド密度を除いて、本質的に実施例6に記載したとおり調製した。カラムを、5.5CVのTST、続いて3.3CVの5mM NHAc pH5.5で洗浄した。結合したタンパク質を、2.9CVの0.1M HAc pH2.9を適用することによって溶離した。SDS−PAGEおよびHPLC−MSによるさらなる分析のため画分を集めた。
結果
抗ABDアガロース樹脂上でのPEP06548の精製からのクロマトグラムを図10Aに示し、溶出画分E1のSDS−PAGE分析を図10Bに示す。SDS−PAGE分析から判断して、純度は95%より高いと推定された。40kDa付近のバンドが、試料分子のC末端システイン間の反応によって形成された二量体から誘導されたのは、ほぼ確実である。また、PEP06548、および二量体変異体の小さい方の部分の正確な質量は、HPLC−MS分析で確認された。
吸光度測定によれば、樹脂ml当たり3.7mgの精製されたPEP06548、すなわち(Z06677)−Cysリガンド当たりの約1つのPEP06548分子が得られた。
実施例10
抗ABDアガロースを用いるPEP17081の精製
本実施例では、フォーマットZ−PEP07986−Zにおけるタンパク質Zのサイトカイン結合部分の2つの部分に融合したアルブミン結合ドメイン(PEP07986、配列番号:161)を含むPEP17081(18.6kDa)を、抗ABDアガロースで充填されたカラムを用いて精製した。その後の精製も記載する。
物質および方法
可溶性のPEP17081を内部に含むペレット化されたE. coli細胞を、TST−緩衝液中に懸濁した。細胞を、水浴中の熱処理(83℃、10分)、続いて氷上での冷却よって破壊した。ベンゾナーゼ(R)を15U/mlの最終濃度まで加えて核酸によって生じた粘度を低減した。細胞残屑を、遠心分離および濾過(0.45μmフィルター)によって除去した。
第1の精製ステップは、AEKTApurifier 100系を用いる抗ABDアガロース親和性クロマトグラフィーによって実施した。清澄化された試料を、抗ABDアガロース25mlで充填され、2×TST(すなわちすべての成分を二倍の濃度で含むTST緩衝液)で予め平衡にしたXK−26カラムに適用した。カラムを、5CVの2×TST、続いて8CVの5mM NHAc、pH5.5で洗浄した。結合したタンパク質を、3CVの0.1M HAc(pH2.9)を適用することによって溶離した。SDS−PAGEおよびHPLC−MSによるさらなる分析のため画分を集めた。
第2の精製ステップは、AEKTAexplorer 100系を用いてRPCによって実施した。抗ABDアガロースカラムから溶出されたタンパク質を10%の最終濃度までアセトニトリルで補充し、そしてSOURCE 15 RPC(GEヘルスケア)24mlで充填され、ミリQ水中の10%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)(溶媒A)で予め平衡にしたHR−16カラム(GEヘルスケア)に装填した。カラムを3.9CVの溶媒Aで洗浄した。結合した物質を、ミリQ水中の80%アセトニトリル、0.1%TFA(溶媒B)の濃度を増大させて50%溶媒Bで終了する15CVの線形勾配で溶離した。SDS−PAGEおよびHPLC−MSによるさらなる分析のため画分を集めた。
第3の精製および緩衝液交換ステップは、AEKTAexplorer 100系を用いるサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって実施した。RPCカラムから溶出された選択画分を貯め、そしてセファデックスG−25(GEヘルスケア)500mlで充填されたXK−50カラム上で緩衝液を1×PBSに交換した。SDS−PAGEおよびHPLC−MSによってさらなる分析のため画分を集めた。
結果
抗ABDアガロース樹脂上でのPEP17081の精製からのクロマトグラムを図11Aに示し、そしてSDS−PAGE分析を図11Bに示す。
E. coli細胞の熱処理は、細胞破壊ステップおよび精製ステップの両方として作用した。PEP17081は、熱に抵抗性であるが、他の多くのE. coliタンパク質はそうではなく、そのため、加熱すると沈澱する。結果として、抗ABDアガロースカラムに装填された物質は、比較的純粋であった(レーン1、図11B)。
大多数のPEP17081は、抗ABDアガロース樹脂に結合し、これは、フロースルー試料中のPEP17081の明らかな欠如によって示される(レーン2、図11B)。吸光光度法によれば、溶出された貯留物は、330mgのPEP17081を含み、樹脂ml当たり13mgのPEP17081の結合能力および95%を超える収率に相当した。溶出されたPEP17081の純度は、SDS−PAGE分析から判断して95%より高いと推定された(レーン3、図11B)。RPCおよびSECによる緩衝液交換後に、さらなる純度の増加が得られた(レーン4、図11B)。PEP17081の正確な質量は、HPLC−MS分析によって検証した。
実施例11
抗ABDアガロースを用いるタンパク質ホルモンの精製
本実施例では、タンパク質ホルモンにそのC末端で融合したアルブミン結合ドメイン(ABD035、配列番号:159)を含むタンパク質1(22.6kDa;pI10)を、抗ABDアガロースが充填されたカラムを用いてAEKTAexplorer系において精製した。
物質および方法
タンパク質1を、封入体(inclusion body)の形態で、大腸菌中で発現させた。封入体の可溶化および再折たたみ後、緩衝液交換および精製のため、物質をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)に3回かけた。TST中で1:10希釈されたPBS中の8mgのSEC精製タンパク質1を、抗ABDアガロース10〜12mlで充填され、TSTで予め平衡にしたXK16/20カラム(GEヘルスケア)に0.5ml/分で装填した。カラムを、1ml/分の流速で、4CVのTSTで洗浄し、続いて5mM NHAc、pH5.5でさらに3CV洗浄した。結合したタンパク質を、3CVの0.1M HAc、pH2.9で溶離し、次いで、1M Tris−HCl、pH9でpH7に中和した。SDS−PAGEによるさらなる分析のため、フロースルー画分、洗浄画分および溶出画分を集めた。4〜12%のBis-Tris NuPAGEゲル(インビトロゲン)は、非還元で運転し、そしてタンパク質をシンプリーブルー(Simply Blue)(ライフテクノロジーズ)で染色した。溶離後、カラムをTSTで再び平衡にし、そして3CVの0.5M NaOH、続いて3CVのTSTにより定置(CIP)洗浄した。精製の間、樹脂をTST+20%のエタノール中に保存した。
結果
抗ABDアガロース樹脂上でのタンパク質1の精製からのクロマトグラムを図12Aに示し、そして選択画分のSDS−PAGE分析を図12Bに示す。抗ABDアガロースカラム上に装填されたSEC精製タンパク質1の純度は、高かった。しかし、混在タンパク質の弱いバンドをSDS−PAGEゲル上で認めることができた。図12Bの矢印を参照のこと。これらの混在物質を、抗ABDアガロースカラム上の精製によって効果的に排除した。60倍濃縮された洗浄ステップからの試料をSDS−PAGEで分析し、そして混在物質を示した(ならびにタンパク質1の漏出;レーン6、図12B)。溶出タンパク質試料では混在物質が認められなかった(レーン7〜9、図12B)。溶出試料の純度は、SDS−PAGE分析から判断して98%より高いと推定された。溶出されたタンパク質1の正確な質量は、HPLC−MS分析によって検証された。
SEC精製タンパク質1の最初の8mgのうち、抗ABDアガロースカラムからの溶出画分中に5.4mgを集め、収率約68%となった。レーン5(図12B)に装填されたフロースルー試料にはタンパク質が検出されなかったが、TSTで洗浄すると、タンパク質1のいくらかの漏出ならびに二量体の除去および混在タンパク質があった。
実施例12
抗ABDアガロースを用いるペプチドホルモンの精製
本実施例では、ペプチドホルモンにそのN末端で融合したアルブミン結合ドメイン(ABD035、配列番号:159)を含むタンパク質2(9.5kDa、pI6.6)を、Pichia Pinkで発現させ、そして抗ABDアガロースで充填されたカラムを用いるAEKTAexplorer系において一段階で精製した。
物質および方法
分泌されたタンパク質2を含むPichia Pink上清100mlを凍結乾燥し、そしてDMSO(ジメチルスルホキシド)2ml中で再懸濁し、その後、TST200mlで希釈した。抗ABDアガロース10〜12mlで充填され、TSTで予め平衡にしたXK16/20カラムにおいて1ml/分で試料を装填した。カラムを8CVのTSTで洗浄し、5mM NHAc、pH5.5でさらに3CV洗浄した。培地からの混在タンパク質が高密度であるため、4CVのTSTの通常の洗浄を増やした。結合したタンパク質を、3CVの0.1M HAc、pH2.9で溶離し、次いで、1M Tris−HCl、pH9でpH4に調整した。溶離後、カラムをTSTで再び平衡にし、続いてCIP、そしてTST+20%エタノール中に貯蔵した。SDS−PAGEによるさらなる分析のため、フロースルー画分、洗浄画分および溶出画分を集めた。
結果
抗ABDアガロース樹脂上でのタンパク質2の精製からのクロマトグラムを図13Aに示し、そして選択された画分のSDS−PAGE分析を図13Bに示す。抗ABDアガロースカラムから溶出ピークは、タンパク質2を3〜5mg含み、収率約75%(ウェスタンブロットから推定する)に相当した。溶出されたタンパク質2の正確な質量は、HPLC−MS分析によって検証した。純度は、SDS−PAGE分析、続いてシンプリーブルー染色から判断して98%より高いと推定された。混在培地タンパク質は、溶出画分中に検出できなかった(レーン7〜13、図13B)。タンパク質2は、ゲル上に含まれる分子量標準によって示されるように、SDS−PAGEゲル上で移動がより小さいことが理解される。
実施態様の項目別に挙げたリスト
1.液体中に存在する少なくとも1つのABD含有分子を、液体中の他の成分から分離する方法であって、親和性分離のステップを含み、このステップにおいて、親和性リガンドとして、ABD結合モチーフBMを含むABD結合ポリペプチドを使用し、このモチーフが、
i)EXAXEIX1011LPNLX161718QX2021AFIX2526LX28
(配列中、互いに独立して、
は、F、IおよびLから選択され;
は、H、K、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
は、A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
は、F、I、LおよびYから選択され;
は、A、H、I、K、L、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
10は、G、H、K、N、Q、RおよびSから選択され;
11は、A、D、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、VおよびYから選択され;
16は、NおよびTから選択され;
17は、F、H、L、SおよびTから選択され;
18は、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
20は、H、KおよびRから選択され;
21は、I、LおよびVから選択され;
25は、F、I、L、VおよびYから選択され;
26は、KおよびSから選択され;
28は、DおよびEから選択される)
および
ii)i)に定義された配列と少なくとも89%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなる方法。
2.項目1に記載の方法であって、
a)親和性マトリックスに対するABD含有分子の結合をもたらす条件下で、上記液体を、上記ABD結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに適用するステップと;
b)親和性マトリックスに結合してない物質を除去するため親和性マトリックスを洗浄するステップと;
c)任意の結合したABD含有分子を親和性マトリックスから溶離し、こうしてABD含有分子の富化含量を含むABD含有分子画分を得るステップと;
d)上記ABD含有分子画分を回収するステップと
を含む方法。
3.項目1に記載の方法であって、
a)親和性マトリックスに対するABD含有分子の結合をもたらす条件下で、上記液体を、上記ABD結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに適用するステップと;
b)親和性マトリックスに結合してない物質を回収するため親和性マトリックスを洗浄し、こうして実質的にABD含有分子含量が減少した、減損された画分を得るステップと;
c)上記減損された画分を回収するステップと
を含む方法。
4.項目1に記載された方法であって、
a)親和性マトリックスに対するABD含有分子の結合をもたらす条件下で、上記液体を、上記ABD結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに提供するステップと;
b)親和性マトリックスに結合してない物質を回収するため親和性マトリックスを洗浄し、こうして実質的にABD含有分子含量が減少した、減損された画分を得るステップと;
c)結合したABD含有分子を親和性マトリックスから溶離し、こうしてABD含有分子含量を含むABD含有分子画分を得るステップと;
d)上記ABD含有分子画分および上記減損された画分を回収するステップと
を含む方法。
5.バッチ、カラム、拡大床およびそれらの混合物から選択される構成で実施される、項目1〜4のいずれか1項目に記載の方法。
6.カラム構成で実施される、項目5に記載の方法。
7.バッチ構成で実施される、項目5に記載の方法。
8.配列i)のXがFおよびLから選択される、項目1〜7のいずれか1項目に記載の方法。
9.配列i)のXがFである、項目8に記載の方法。
10.配列i)のXがLである、項目8に記載の方法。
11.配列i)のXがH、K、R、TおよびVから選択される、項目1〜10のいずれか1項目に記載の方法。
12.配列i)のXがH、K、RおよびVから選択される、項目11に記載の方法。
13.配列i)のXがKおよびRから選択される、項目12に記載の方法。
14.配列i)のXがKである、項目13に記載の方法。
15.配列i)のXがRである、項目13に記載の方法。
16.配列i)のXがA、H、I、L、N、VおよびWから選択される、項目1〜15のいずれか1項目に記載の方法。
17.配列i)のXがH、L、NおよびVから選択される、項目16に記載の方法。
18.配列i)のXがVである、項目17に記載の方法。
19.配列i)のXがFおよびLから選択される、項目1〜18のいずれか1項目に記載の方法。
20.配列i)のXがFである、項目19に記載の方法。
21.配列i)のXがLである、項目19に記載の方法。
22.配列i)のXがK、L、N、Q、RおよびSから選択される、項目1〜21のいずれか1項目に記載の方法。
23.配列i)のXがK、N、Q、RおよびSから選択される、項目22に記載の方法。
24.配列i)のXがK、Q、RおよびSから選択される、項目23に記載の方法。
25.配列i)のXがKおよびRから選択される、項目24に記載の方法。
26.配列i)のXがKである、項目25に記載の方法。
27.配列i)のXがRである、項目25に記載の方法。
28.配列i)のX10がH、K、NおよびRから選択される、項目1〜27のいずれか1項目に記載の方法。
29.配列i)のX10がH、KおよびNから選択される、項目28に記載の方法。
30.配列i)のX10がK、NおよびRから選択される、項目28に記載の方法。
31.配列i)のX10がNである、項目29または30に記載の方法。
32.配列i)のX10がKおよびRから選択される、項目30に記載の方法。
33.配列i)のX10がKである、項目32に記載の方法。
34.配列i)のX10がRである、項目32に記載の方法。
35.配列i)のX11がA、F、L、R、TおよびYから選択される、項目1〜34のいずれか1項目に記載の方法。
36.配列i)のX11がA、F、TおよびYから選択される、項目35に記載の方法。37.配列i)のX11がTである、項目36に記載の方法。
38.配列i)のX16がTである、項目1〜37のいずれか1項目に記載の方法。
39.配列i)のX17がF、HおよびLから選択される、項目1〜38のいずれか1項目に記載の方法。
40.配列i)のX17がFおよびHから選択される、項目39に記載の方法。
41.配列i)のX17がHおよびLから選択される、項目39に記載の方法。
42.配列i)のX17がFである、項目40に記載の方法。
43.配列i)のX17がHである、項目40または41に記載の方法。
44.配列i)のX17がLである、項目41に記載の方法。
45.配列i)のX18がD、H、I、KおよびQから選択される、項目1〜44のいずれか1項目に記載の方法。
46.配列i)のX18がD、HおよびQから選択される、項目45に記載の方法。
47.配列i)のX18がHおよびQから選択される、項目46に記載の方法。
48.配列i)のX18がHである、項目47に記載の方法。
49.配列i)のX18がQである、項目47に記載の方法。
50.配列i)のX20がHおよびRから選択される、項目1〜49のいずれか1項目に記載の方法。
51.配列i)のX20がKおよびRから選択される、項目1〜49のいずれか1項目に記載の方法。
52.配列i)のX20がRである、項目50または51に記載の方法。
53.配列i)のX20がKである、項目51に記載の方法。
54.配列i)のX21がIおよびLから選択される、項目1〜53のいずれか1項目に記載の方法。
55.配列i)のX21がIである、項目54に記載の方法。
56.配列i)のX21がLである、項目54に記載の方法。
57.配列i)のX25がI、LおよびVから選択される、項目1〜56のいずれか1項目に記載の方法。
58.配列i)のX25がVおよびIから選択される、項目57に記載の方法。
59.配列i)のX25がIである、項目58に記載の方法。
60.配列i)のX25がVである、項目58に記載の方法。
61.配列i)のX26がKである、項目1〜60のいずれか1項目に記載の方法。
62.配列i)のX28がDである、項目1〜61のいずれか1項目に記載の方法。
63.配列i)が8つの条件I〜VIIIのうちの少なくとも4つを満たす:
I.Xは、FまたはLから選択される;
II.Xは、FまたはLから選択される;
III.X16は、Tである;
IV.X20は、HまたはRから選択される;
V.X21は、IまたはLから選択される;
VI.X25は、IまたはVから選択される;
VII.X26は、Kである;および
VIII.X28は、Dである
項目1〜62のいずれか1項目に記載の方法。
64.配列i)が8つの条件I〜VIIIのうちの少なくとも5つを満たす、項目63に記載の方法。
65.配列i)が8つの条件I〜VIIIのうちの少なくとも6つを満たす、項目64に記載の方法。
66.配列i)が8つの条件I〜VIIIのうちの少なくとも7つを満たす、項目65に記載の方法。
67.配列i)が8つの条件I〜VIIIのすべてを満たす、項目66に記載の方法。
68.配列i)が配列番号:1〜52から選択される、項目1〜67のいずれか1項目に記載の方法。
69.配列i)が配列番号:1〜7から選択される、項目68に記載の方法。
70.配列i)が配列番号:1〜4から選択される、項目69に記載の方法。
71.配列i)が配列番号:1である、項目70に記載の方法。
72.上記ABD結合モチーフが3−ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、項目1〜71のいずれか1項目に記載の方法。
73.上記ABD結合モチーフが上記3−ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で相互接続するループにより2つのヘリックスの一部を本質的に形成する、項目72に記載の方法。
74.上記3−ヘリックスのバンドルタンパク質ドメインが細菌受容体ドメインから選択される、項目72〜73のいずれか1項目に記載の方法。
75.上記3−ヘリックスのバンドルタンパク質ドメインが黄色ブドウ球菌からのプロテインAのドメインまたはその誘導体から選択される、項目74に記載の方法。
76.項目1〜75のいずれか1項目に記載の方法であって、上記ABD結合ポリペプチドが、
iii)K−[BM]−DPSQS XLLX EAKKL NDXQ;
(配列中、
[BM]は、項目1および8〜71のいずれか1項目に定義されたようなABD結合モチーフであり;
は、AおよびSから選択され;
は、NおよびEから選択され;
は、A、SおよびCから選択され;
は、AおよびSから選択される)
および
iv)iii)によって定義された配列と少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む方法。
77.配列iii)のXがAである、項目76に記載の方法。
78.配列iii)のXがSである、項目76に記載の方法。
79.配列iii)のXはがNである、項目76〜78のいずれか1項目に記載の方法。
80.配列iii)のXがEである、項目76〜78のいずれか1項目に記載の方法。81.配列iii)のXがAである、項目76〜80のいずれか1項目に記載の方法。82.配列iii)のXがSである、項目76〜80のいずれか1項目に記載の方法。83.配列iii)のXがCである、項目76〜80のいずれか1項目に記載の方法。84.配列iii)のXがAである、項目76〜83のいずれか1項目に記載の方法。85.配列iii)のXがSである、項目76〜83のいずれか1項目に記載の方法。86.配列iii)中、XがAであり;XがNであり;XがAであり、そしてXがAである、項目76に記載の方法。
87.配列iii)中、XがAであり;XがNであり;XがCであり、そしてXがAである、項目76に記載の方法。
88.配列iii)中、XがSであり;XがEであり;XがSであり、そしてXがSである、項目76に記載の方法。
89.配列iii)中、XがSであり;XがEであり;XがCであり、そしてXがSである、項目76に記載の方法。
90.配列iii)中、XがSであり;XがEであり;XがCであり、そしてXがAである、項目76に記載の方法。
91.配列iii)中、XがSであり;XがEであり;XがAであり、そしてXがAである、項目76に記載の方法。
92.配列iii)が配列番号:53〜104のいずれか1つから選択される、項目91に記載の方法。
93.配列iii)が配列番号:53〜59のいずれか1つから選択される、項目92に記載の方法。
94.配列iii)が配列番号:53〜56のいずれか1つから選択される、項目93に記載の方法。
95.配列iii)が配列番号:53である、項目94に記載の方法。
96.項目1〜76のいずれか1項目に記載の方法であって、上記ABD結合ポリペプチドが、
v)YAK−[BM]−DPSQS SELLX EAKKL NDSQA P;
(配列中、[BM]は、項目1および8〜71のいずれか1項目に定義されたようなABD結合モチーフであり、そしてXは、SおよびCから選択される)および
vi)v)によって定義された配列と少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む方法。
97.項目1〜76のいずれか1項目に記載の方法であって、上記ABD結合ポリペプチドが、
vii)YAK−[BM]−DPSQS SELLX EAKKL NDAQA P;
(配列中、[BM]は、項目1および8〜71のいずれか1項目に定義されたようなABD結合モチーフであり、そしてXは、AおよびCから選択される)および
viii)vii)によって定義された配列と少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む方法。
98.項目1〜76のいずれか1項目に記載のABD結合ポリペプチドであって、上記ABD結合ポリペプチドが、
ix)FNK−[BM]−DPSQS ANLLX EAKKL NDAQA P;(配列中、[BM]は、項目1および8〜71のいずれか1項目に定義されたようなABD結合モチーフであり、そしてXは、AおよびCから選択される)および
x)ix)によって定義される配列に少なくとも83%の同一性を有するアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む方法。
99.項目75に記載された方法であって、ABD結合ポリペプチドが、
ADNNFNK−[BM]−DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;
ADNKFNK−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
ADNKFNK−[BM]−DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;
ADAQQNNFNK−[BM]−DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;
AQHDE−[BM]−DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;
VDNKFNK−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;および
AEAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK
(配列中、[BM]は、項目1および8〜71のいずれか1項目に定義されたようなABD結合モチーフである)
から選択されるアミノ酸配列を含む方法。
100.項目1〜99のいずれか1項目に記載の方法であって、上記ABD結合ポリペプチドが、
xi)VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;(配列中、[BM]は、項目1および8〜71のいずれか1項目に定義されたようなABD結合モチーフである)および
xii)xi)に定義された配列と少なくとも84%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む方法。
101.配列xi)が配列番号:105〜156のいずれか1つから選択される、項目100に記載の方法。
102.配列xi)が配列番号:105〜111のいずれか1つから選択される、項目101に記載の方法。
103.配列xi)が配列番号:105〜108のいずれか1つから選択される、項目102に記載の方法。
104.配列xi)が配列番号:105である、項目103に記載の方法。
105.上記ABD結合ポリペプチドが、多量体の形態で存在し、少なくとも2つのABD結合ポリペプチド単量体単位を含み、それらのアミノ酸配列が同一または異なってもよい項目1〜104のいずれか1項目に記載の方法。
106.上記ABD結合ポリペプチド単量体単位が一緒に共有結合される、項目105に記載の方法。
107.ABD結合ポリペプチド単量体単位が融合タンパク質として発現される、項目105に記載の方法。
108.上記ABD結合ポリペプチドが、ポリペプチドのC末端で、例えばC末端でシステイン残基を更に含む、項目1〜107のいずれか1項目に記載の方法。

Claims (14)

  1. 液体中に存在する少なくとも1つのアルブミン結合ドメイン(ABD含有分子であって、ABDが配列番号161および162から選択されるアミノ酸配列を含む分子を、液体中の他の成分から分離する方法であって、親和性分離のステップを含み、該ステップにおいて、親和性リガンドとして、アルブミン結合ドメイン(ABD結合モチーフBMを含むABD結合ポリペプチドを使用し、該モチーフが、
    i)EX2X3X4AX6X7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28D
    (配列中、互いに独立して、
    X2は、F、IおよびLから選択され;
    X3は、H、K、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
    X4は、A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、WおよびYから選択され;
    X6は、F、I、LおよびYから選択され;
    X7は、A、H、I、K、L、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
    X10は、G、H、K、N、Q、RおよびSから選択され;
    X11は、A、D、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、VおよびYから選択され;
    X16は、NおよびTから選択され;
    X17は、F、H、L、SおよびTから選択され;
    X18は、D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、TおよびVから選択され;
    X20は、H、KおよびRから選択され;
    X21は、I、LおよびVから選択され;
    X25は、F、I、L、VおよびYから選択され;
    X26は、KおよびSから選択され;
    X28は、DおよびEから選択される)
    および
    ii)i)に定義された配列と少なくとも89%の同一性を有するアミノ酸配列
    から選択されるアミノ酸配列からなる方法。
  2. 請求項1に記載の方法であって、
    a)親和性マトリックスに対するABD含有分子の結合をもたらす条件下で、前記液体を、前記ABD結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに適用するステップと;
    b)親和性マトリックスに結合してない物質を除去するため親和性マトリックスを洗浄するステップと;
    c)任意の結合したABD含有分子を親和性マトリックスから溶離し、こうしてABD含有分子の富化含量を含むABD含有分子画分を得るステップと;
    d)前記ABD含有分子画分を回収するステップと
    を含む方法。
  3. 請求項1に記載の方法であって、
    a)親和性マトリックスに対するABD含有分子の結合をもたらす条件下で、前記液体を、前記ABD結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに適用するステップと;
    b)親和性マトリックスに結合してない物質を回収するため親和性マトリックスを洗浄し、こうして実質的にABD含有分子含量が減少した、減損された画分を得るステップと;
    c)前記減損された画分を回収するステップと
    を含む方法。
  4. 請求項1に記載された方法であって、
    a)親和性マトリックスに対するABD含有分子の結合をもたらす条件下で、前記液体を、前記ABD結合ポリペプチドを含む親和性マトリックスに提供するステップと;
    b)親和性マトリックスに結合してない物質を回収するため親和性マトリックスを洗浄し、こうして実質的にABD含有分子含量が減少した、減損された画分を得るステップと;
    c)結合したABD含有分子を親和性マトリックスから溶離し、こうしてABD含有分子含量を含むABD含有分子画分を得るステップと;
    d)前記ABD含有分子画分および前記減損された画分を回収するステップと
    を含む方法。
  5. 配列i)が8つの条件I〜VIIIのうちの少なくとも4つを満たす:
    I.X2は、FまたはLから選択される;
    II.X6は、FまたはLから選択される;
    III.X16は、Tである;
    IV.X20は、HまたはRから選択される;
    V.X21は、IまたはLから選択される;
    VI.X25は、IまたはVから選択される;
    VII.X26は、Kである;および
    VIII.X28は、Dである
    請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
  6. 配列i)が配列番号:1〜52から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
  7. 配列i)が配列番号:1〜7から選択される、請求項6に記載の方法。
  8. 前記ABD結合モチーフが黄色ブドウ球菌からのプロテインAのドメインまたはその誘導体から選択される3−ヘリックスのバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
  9. 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、前記ABD結合ポリペプチドが、
    iii)K−[BM]−DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ;
    (配列中、
    [BM]は、請求項1および5〜7のいずれか1項に定義されたようなABD結合モチーフであり;
    Xaは、AおよびSから選択され;
    Xbは、NおよびEから選択され;
    Xcは、A、SおよびCから選択され;
    Xdは、AおよびSから選択される)
    および
    iv)iii)によって定義された配列と少なくとも81%の同一性を有するアミノ酸配列
    から選択されるアミノ酸配列を含む方法。
  10. 配列iii)が配列番号:53〜104のいずれか1つから選択される、請求項9に記載の方法。
  11. 配列iii)が配列番号:53〜59のいずれか1つから選択される、請求項10に記載の方法。
  12. 請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法であって、前記ABD結合ポリペプチドが、
    xi)VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;(配列中、[BM]は、請求項1および5〜7のいずれか1項に定義されたようなABD結合モチーフである)および
    xii)xi)に定義された配列と少なくとも84%の同一性を有するアミノ酸配列
    から選択されるアミノ酸配列を含む方法。
  13. 配列xi)が配列番号:105〜156のいずれか1つから選択される、請求項12に記載の方法。
  14. 配列xi)が配列番号:105〜111のいずれか1つから選択される、請求項13に記載の方法。
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