JP4087563B2 - エリスロポエチン類似体−ヒト血清アルブミン融合物 - Google Patents

Description

【０００１】
発明の背景
この発明は、エリスロポエチン類似体−ヒト血清アルブミン(ＥＰＯａ−ｈＳＡ)融合蛋白質、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする核酸及びＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質及び核酸の製造方法及び利用方法に関係する。
【０００２】
発明の要約
一般に、この発明は、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質であって、その融合蛋白質のＥＰＯａ部分の少なくとも１つのアミノ酸残基が、エリスロポエチン(ＥＰＯ)におけるグリコシル化部位として働く部位がＥＰＯにおけるグリコシル化部位として働かないように変化している当該ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質、例えばエリスロポエチンにおけるグリコシル化部位として働き得る少なくとも１つのアミノ酸残基が例えば置換又は欠失により変化してそれによりそれがグリコシル化部位として働かなくなっているＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を特徴とする。
【０００３】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、式Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１；又はＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１(式中、Ｒ１は、ＥＰＯａアミノ酸配列であり、Ｌは、ペプチドリンカーであり、そしてＲ２は、ヒト血清アルブミンアミノ酸配列である)を有する。好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、ペプチドリンカーを介して共有結合により結合されている。
【０００４】
好適具体例において：グリコシル化のための付着点として働くＥＰＯのアミノ酸残基は欠失しており；グリコシル化部位として働くＥＰＯのアミノ酸残基はグリコシル化部位として働かないアミノ酸残基で置換されており；変化させるアミノ酸残基を、アミノ酸残基Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８、Ａｓｎ８３及びＳｅｒ１２６よりなる群から選択し；アミノ酸残基Ｓｅｒ１２６のグリコシル化部位と、Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８及びＡｓｎ８３よりなる群から選択する少なくとも１つの更なるＮ結合グリコシル化部位を変化させ；Ｎ結合グリコシル化に供するグリコシル化部位は、Ａｓｎ残基をそれ以外のアミノ酸残基例えばＧｌｎで置換することにより変化させ；Ｏ結合グリコシル化に供するグリコシル化部位は、Ｓｅｒ残基をそれ以外のアミノ酸残基例えばＡｌａで置換することにより変化させる。
【０００５】
好適具体例において、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、トランスジェニック哺乳動物例えば反芻動物例えばヤギの乳腺において作られる。
【０００６】
好適具体例において、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、トランスジェニック哺乳動物例えば反芻動物例えばヤギの乳汁中に分泌される。
【０００７】
好適具体例において、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、トランスジェニック動物において、乳腺特異的プロモーター例えば乳汁特異的プロモーター例えば乳清又はカゼインプロモーターの制御下で作られる。この乳汁特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、べータラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸蛋白質プロモーター又はラクトアルブミンプロモーターであってよい。好ましくは、このプロモーターは、ヤギのβカゼインプロモーターである。
【０００８】
好適具体例において、トランスジェニック動物のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、トランスジェニック動物の乳汁中に、少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で分泌される。
【０００９】
好適具体例において、アミノ酸残基Ａｓｎ２４は、変化している(例えば、置換され又は欠失している)。好ましくは、このアミノ酸残基Ａｓｎ２４は、Ｇｌｎで置換されている。
【００１０】
好適具体例において、アミノ酸残基Ａｓｎ３８は、変化しており、例えば置換され又は欠失している。好ましくは、アミノ酸残基Ａｓｎ３８は、Ｇｌｎで置換されている。
【００１１】
好適具体例において、アミノ酸残基Ａｓｎ８３は、変化しており、例えば置換され又は欠失している。好ましくは、このアミノ酸残基Ａｓｎ８３は、Ｇｌｎで置換されている。
【００１２】
更に別の具体例においては、アミノ酸残基Ｓｅｒ１２６が変化しており、例えば置換され又は欠失している。好ましくは、このアミノ酸残基Ｓｅｒ１２６は、Ａｌａにより置換されている。
【００１３】
好適具体例において：アミノ酸残基Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８、Ａｓｎ８３及びＳｅｒ１２６の各々は、変化しており(例えば、置換され又は欠失している)、それにより、それは、グリコシル化部位として働かず、アミノ酸残基Ａｓｎ２４、Ａｓｎ２８、Ａｓｎ８３及びＳｅｒ１２６は、それぞれ、Ｇｌｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｎ及びＡｌａにより置換されている。
【００１４】
好適具体例において、この融合蛋白質は、ペプチドリンカーを含み、このペプチドリンカーは、次の特徴の少なくとも１つを有する：ａ）それは、エリスロポエチン類似体のアミノ酸配列とヒト血清アルブミンのアミノ酸配列の相互の回転を可能にし；ｂ）それは、プロテアーゼによる消化に耐性であり、そしてｃ）それは、エリスロポエチン類似体又はヒト血清アルブミンと相互作用しない。
【００１５】
好適具体例において、この融合蛋白質は、ペプチドリンカーを含み、このペプチドリンカーは、５〜６０アミノ酸長、一層好ましくは１０〜３０アミノ酸長であり；このペプチドリンカーは、２０アミノ酸長であり；このペプチドリンカーは、１７アミノ酸長であり；このペプチドリンカー中の各アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ及びＡｌａよりなる群から選択し；このペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒエレメントを含む。
【００１６】
好適具体例において、この融合蛋白質は、ペプチドリンカーを含み、このペプチドリンカーは、式(Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)_y(式中、ｙは、１、２、３、４、５、６、７又は８である)を有する配列を含む。好ましくは、このペプチドリンカーは、式(Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃を有する配列を含む。好ましくは、このペプチドリンカーは、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有する配列を含む。
【００１７】
好適具体例において、この融合蛋白質は、ペプチドリンカーを含み、このペプチドリンカーは、式(Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ)_y(式中、ｙは、１、２、３、４、５、６、７又は８である)を有する配列を含む。好ましくは、このペプチドリンカーは、式((Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有する配列を含む。
【００１８】
他の面において、この発明は、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質であって、そのＥＰＯａがアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含む当該融合蛋白質を特徴とする。
【００１９】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである(即ち、アミノ酸２４、３８、８３及び１２６のみが野生型と異なっている)。
【００２０】
他の面において、この発明は、左から右に、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含むＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を特徴とする。
【００２１】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００２２】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンである。
【００２３】
他の面において、この発明は、左から右にヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含むＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を特徴とする。
【００２４】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００２５】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右に、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００２６】
他の面において、この発明は、ここに記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質、例えば少なくとも１つのアミノ酸残基が変化していてそれによりＥＰＯにおけるグリコシル化部位として働く部位がそのＥＰＯにおけるグリコシル化部位として働かないＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質、例えばエリスロポエチンにおけるグリコシル化部位として働くことのできるコードされたＥＰＯａ−ｈＳＡの少なくとも１つのアミノ酸残基が例えば置換又は欠失により変化してそれによりグリコシル化部位として働かなくなっているＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸を特徴とする。
【００２７】
他の面において、この発明は、ＥＰＯａがアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする核酸を特徴とする。
【００２８】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００２９】
他の面において、この発明は、左から右に、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含むＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする核酸を特徴とする。
【００３０】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００３１】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右に、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンである。
【００３２】
他の面において、この発明は、左から右に、ヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含むＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする核酸を特徴とする。
【００３３】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００３４】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００３５】
他の面において、この発明は、この発明の核酸を含む発現ベクター又は構築物を特徴とする。
【００３６】
好適具体例において、このベクター又は構築物は、更に、プロモーター；選択マーカー；複製起点；又はヒト以外の種に相同なＤＮＡ例えばヤギＤＮＡを含む。
【００３７】
好適具体例において、このプロモーターは、乳汁特異的プロモーター例えば乳清蛋白質又はカゼインプロモーターである。この乳汁特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、ベータラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸蛋白質プロモーター又はラクトアルブミンプロモーターである。好ましくは、このプロモーターは、ヤギβカゼインプロモーターである。
【００３８】
他の面において、この発明は、この発明のベクター又は核酸を含む細胞を特徴とする。
【００３９】
他の面において、この発明は、核酸構築物又はベクター中のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合物の調製方法を特徴とする。この方法は、エリスロポエチン類似体をコードする核酸がヒト血清アルブミンをコードする核酸とイン・フレームで結合された配列をこの構築物又はベクター中に形成することを含む。
【００４０】
他の面において、この発明は、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を例えば培養細胞から調製する方法を特徴とする。この方法は、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする核酸を含む細胞を準備し、そのＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をこの核酸から発現させ、それにより、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を作成することを含む。
【００４１】
好適具体例において、この細胞は、哺乳動物、酵母、植物、昆虫又は細菌の細胞である。適当な哺乳動物細胞には、ＣＨＯ細胞又は他の類似の発現系が含まれる。
【００４２】
好適具体例において、この細胞は、微生物細胞、培養細胞、又は細胞株由来の細胞である。
【００４３】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、培養培地中に放出される。
【００４４】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡは、培養培地中に放出され、この方法は、更に、そのＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を培養培地から精製することを含む。
【００４５】
好適具体例において、このＥＰＯａは、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含む。
【００４６】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００４７】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
【００４８】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンである。
【００４９】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含む。
【００５０】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００５１】
この発明は又、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質例えばここに記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする核酸を含む培養細胞をも包含する。この発明は又、かかる細胞を例えばＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質例えばここに記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする核酸をこの細胞に導入し又はこの細胞中で形成することにより調製する方法をも包含する。
【００５２】
他の面において、この発明は、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質例えばここに記載のＥＰＯａ−ｈＳＡの製造方法を特徴とする。この方法は、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質の発現を指示するトランスジーンを含むトランスジェニック生物を用意し；そのトランスジーンを発現させ；そして好ましくは、トランスジーンにより生成されたＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を例えばその生物から又はその生物により生成された生成物から回収することを含む。
【００５３】
好適具体例において、このトランスジェニック生物は、トランスジェニック動物例えばトランスジェニック哺乳動物例えばトランスジェニック乳用動物例えばトランスジェニックヤギ又はトランスジェニックウシである。
【００５４】
好適具体例において、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、体液中に分泌され、この方法は、更に、そのＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をその体液から精製することを含む。
【００５５】
好適具体例において、トランスジーンにより生成されるＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において好ましくは乳汁特異的プロモーター例えば乳清蛋白質又はカゼインプロモーターの制御下で作られる。この乳汁特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、ベータラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸蛋白質プロモーター、又はラクトアルブミンプロモーターであってよい。好ましくは、このプロモーターは、ヤギのβカゼインプロモーターである。
【００５６】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、トランスジェニック哺乳動物例えば反芻動物例えば乳用動物例えばヤギ又はウシの乳腺において作られる。
【００５７】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、トランスジェニック哺乳動物の乳汁中に少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で分泌される。
【００５８】
好適具体例において、この方法は、更に、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を生物から又はその生物により生成された生成物例えば乳汁、種子、毛、血液、卵又は尿から回収することを含む。
【００５９】
更に別の具体例においては、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、トランスジェニック植物において生成される。
【００６０】
好適具体例において、このエリスロポエチン類似体は、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含む。
【００６１】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００６２】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
【００６３】
好適具体例において、この融合タンパク質は、左から右へ、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンである。
【００６４】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含む。
【００６５】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００６６】
他の面において、この発明は、トランスジェニックＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質例えばここに記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合物の製造方法を特徴とする。この方法は、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質の発現を与えるトランスジェニック動物例えばヤギ又はウシを準備し；そのトランスジーンを発現させ；そして好ましくはＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をこのトランスジェニック動物の乳汁から回収することを含む。
【００６７】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、トランスジェニック哺乳動物例えば反芻動物例えばヤギ又はウシの乳腺において生成される。
【００６８】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、トランスジェニック哺乳動物例えば反芻動物例えば乳用動物例えばヤギ又はウシの乳汁中に分泌される。
【００６９】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、乳腺特異的プロモーター例えば乳汁特異的プロモーター例えば乳清蛋白質又はカゼインプロモーターの制御下で生成される。この乳汁特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、ベータラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸蛋白質プロモーター又はラクトアルブミンプロモーターであってよい。好ましくは、このプロモーターは、ヤギのβカゼインプロモーターである。
【００７０】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、トランスジェニック哺乳動物の乳汁中に少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で分泌される。
【００７１】
好適具体例において、このＥＰＯａは、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含む。
【００７２】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００７３】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
【００７４】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンである。
【００７５】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含む。
【００７６】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００７７】
他の面において、この発明は、トランスジェニック哺乳動物の乳汁中にＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質例えばここに記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を含むトランスジェニック調製物を準備する方法を特徴とする。この方法は、乳腺上皮細胞中で蛋白質をコードする配列の発現を生じるプロモーター配列と機能的に結合されたＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする配列を有するトランスジェニック哺乳動物を準備し、この融合蛋白質を発現させ、そしてこの哺乳動物から乳汁を得、それにより、トランスジェニック調製物を与えることを含む。
【００７８】
好適具体例において、プロモーター配列に機能的に結合されたこのＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする配列を、トランスジェニック哺乳動物の生殖細胞系統に導入する。
【００７９】
好適具体例において、このエリスロポエチン類似体は、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含む。
【００８０】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００８１】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
【００８２】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンである。
【００８３】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含む。
【００８４】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００８５】
他の面において、この発明は、トランスジェニックヤギ又はウシの乳汁中にＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質例えばここに記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を含むトランスジェニック調製物を準備する方法を特徴とする。この方法は、乳腺上皮細胞における蛋白質をコードする配列の発現を生じるプロモーター配列に機能的に結合されたＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする配列を有するトランスジェニックヤギ又はウシを準備し、その融合蛋白質を発現させ、そして、ヤギ又はウシに由来する乳汁を得、それにより、トランスジェニック調製物を与えることを含む。
【００８６】
好適具体例において、このエリスロポエチン類似体は、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含む。
【００８７】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００８８】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
【００８９】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンである。
【００９０】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含む。
【００９１】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００９２】
他の面において、この発明は、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質例えばここに記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードするトランスジーンを含むトランスジェニック生物を特徴とする。
【００９３】
好適具体例において、このトランスジェニック生物は、トランスジェニック植物又は動物である。好適なトランスジェニック動物には、哺乳動物；鳥類；爬虫類；有袋類；及び両生類が含まれる。適当な哺乳動物には、反芻動物；有蹄動物；家畜化哺乳動物；及び乳用動物が含まれる。特に好適な動物には、マウス、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、ウサギ、雌ウシ、ブタ、ウマ、雄ウシ及びラマが含まれる。適当な鳥類には、ニワトリ、ガチョウ及び七面鳥が含まれる。このトランスジェニック蛋白質がトランスジェニック動物の乳汁中に分泌される場合には、この動物は、１年間に少なくとも１、一層好ましくは少なくとも１０又は１００リットルの乳汁を生成することができるであろう。
【００９４】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、乳腺特異的プロモーター例えば乳汁特異的プロモーター例えば乳清蛋白質又はカゼインプロモーターの制御下にある。この乳汁特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、ベータラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸蛋白質プロモーター、またはラクトアルブミンプロモーターであってよい。好ましくは、このプロモーターは、ヤギのβカゼインプロモーターである。
【００９５】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、乳汁中に、少なくとも役０．２ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で分泌される。
【００９６】
好適具体例において、このＥＰＯａは、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含む。
【００９７】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【００９８】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
【００９９】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンである。
【０１００】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含む。
【０１０１】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１０２】
他の面において、この発明は、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質例えばここに記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードするトランスジーンを含むトランスジェニックウシ、ヤギ又はヒツジを特徴とする。
【０１０３】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、乳腺特異的プロモーター例えば乳汁特異的プロモーター例えば乳性蛋白質又はカゼインプロモーターの制御下にある。この乳汁特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、ベータラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸蛋白質プロモーター又はラクトアルブミンプロモーターであってよい。好ましくは、このプロモーターは、ヤギのβカゼインプロモーターである。
【０１０４】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で乳汁中に分泌される。
【０１０５】
好適具体例において、このＥＰＯａは、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含む。
【０１０６】
好適具体例において、ＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１０７】
好適具体例において、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
【０１０８】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンである。
【０１０９】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含む。
【０１１０】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１１１】
他の面において、この発明は、少なくとも一の雌と一の雄のトランスジェニック動物を有する一群のトランスジェニック動物であって、各動物がＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質トランスジーン例えばここに記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードするトランスジーンをふくむ、一群のトランスジェニック動物を特徴とする。
【０１１２】
好適具体例において、この群のトランスジェニック動物は、哺乳動物、鳥類、爬虫類、有袋類又は両生類である。適当な哺乳動物には、有蹄類；家畜化哺乳動物；及び乳用動物が含まれる。特に好適な動物には、マウス、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、ウサギ、雌ウシ、ブタ、ウマ、雄ウシ及びラマが含まれる。適当な鳥類には、ニワトリ、ガチョウ及び七面鳥が含まれる。このトランスジェニック蛋白質がトランスジェニック動物の乳汁中に分泌される場合には、その動物は、年間に少なくとも１リットルの、一層好ましくは少なくとも１０又は１００リットルの乳汁を生成することができるであろう。
【０１１３】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、乳腺特異的プロモーター例えば乳汁特異的プロモーター例えば乳清蛋白質又はカゼインプロモーターの制御下にある。この乳汁特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、ベータラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸蛋白質プロモーター又はラクトアルブミンプロモーターであってよい。
【０１１４】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で乳汁中に分泌される。
【０１１５】
好適具体例において、このＥＰＯａは、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含む。
【０１１６】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１１７】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
【０１１８】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンである。
【０１１９】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含む。
【０１２０】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１２１】
他の面において、この発明は、治療上有効な量のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質例えばここに記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質及び製薬上許容し得るキャリアーを有する製薬組成物を特徴とする。
【０１２２】
好適具体例において、この組成物は、乳汁を含む。
【０１２３】
好適具体例において、このＥＰＯａは、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含む。
【０１２４】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１２５】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
【０１２６】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンである。
【０１２７】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含む。
【０１２８】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１２９】
他の面において、この発明は、エリスロポエチンを必要とする患者を治療するための指示と一緒にパッケージにされたＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質例えばここに記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を有するキットを特徴とする。
【０１３０】
好適具体例において、この患者は、腎不全、慢性疾患、ＨＩＶ感染、失血又は癌に関係して貧血症を患った患者である。
【０１３１】
他の好適具体例において、この患者は、手術前の患者である。
【０１３２】
好適具体例において、このエリスロポエチン類似体は、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含む。
【０１３３】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１３４】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
【０１３５】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンである。
【０１３６】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含む。
【０１３７】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１３８】
他の面において、この発明は、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質例えばここに記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質の精製した調製物を特徴とする。
【０１３９】
好適具体例において、この調製物は、少なくとも１、１０、１００又は１０００マイクログラムのＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を含む。好適具体例において、この調製物は、少なくとも１、１０、１００又は１０００ミリグラムのＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を含む。
【０１４０】
他の面において、この発明は、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質又はその精製した調製物を特徴とし、ここに、このエリスロポエチン類似体は、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含む。
【０１４１】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１４２】
好適具体例において、この調製物は、少なくとも１、１０、１００又は１０００マイクログラムのＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を含む。好適具体例において、この調製物は、少なくとも１、１０、１００又は１０００ミリグラムのＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を含む。
【０１４３】
他の面において、この発明は、左から右へ、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含むＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質又はその精製した調製物を特徴とする。
【０１４４】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１４５】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンである。
【０１４６】
好適具体例において、この調製物は、少なくとも１、１０、１００又は１０００マイクログラムのＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を含む。好適具体例において、この調製物は、少なくとも１、１０、１００又は１０００ミリグラムのＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を含む。
【０１４７】
他の面において、この発明は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含むＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質又はその精製した調製物を特徴とする。
【０１４８】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１４９】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１５０】
好適具体例において、この調製物は、少なくとも１、１０又は１００ミリグラムのＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を含む。好適具体例において、この調製物は、少なくとも１、１０又は１００グラムのＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を含む。
【０１５１】
他の面において、この発明は、エリスロポエチンを必要とする患者例えばヒトを治療する方法を特徴とする。この方法は、治療上有効な量のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質例えばここに記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をその患者に投与することを含む。
【０１５２】
好適具体例において、この患者は、腎不全、慢性疾患、ＨＩＶ感染、失血又は癌に関係する貧血症を患っている患者である。
【０１５３】
他の好適具体例において、この患者は、手術前の患者である。
【０１５４】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡを、例えば少なくとも２、３、５又は１０回反復投与する。
【０１５５】
好適具体例において、このエリスロポエチン類似体は、アミノ酸残基酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含む。
【０１５６】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１５７】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
【０１５８】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンである。
【０１５９】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含む。
【０１６０】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１６１】
他の面において、この発明は、エリスロポエチンを必要とする患者を治療する方法を特徴とする。この方法は、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質例えばここに記載の融合蛋白質をコードする核酸をその患者に送達し又は供給することを含む。
【０１６２】
好適具体例において、この核酸を患者の標的細胞に送達する。
【０１６３】
好適具体例において、この核酸を、生物学的に有効なキャリアー例えば発現ベクターで送達し又は供給する。
【０１６４】
好適具体例において、この核酸を、細胞例えば自家細胞、同種異系細胞又は異種細胞にて送達し又は供給する。
【０１６５】
好適具体例において、このＥＰＯａは、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含む。
【０１６６】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１６７】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ有効蛋白質は、左から右へ、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
【０１６８】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンである。
【０１６９】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含む。
【０１７０】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１７１】
他の面において、この発明は、ＥＰＯａ−ｈＳＡトランスジーンを有するトランスジェニック動物の作製方法を特徴とする。この方法は、生物の細胞中にＥＰＯａ−ｈＳＡトランスジーン例えばここに記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードするトランスジーンを供給し又は形成し；その細胞又はその細胞の子孫にトランスジェニック動物を生じさせることを含む。
【０１７２】
好適具体例において、このトランスジェニック生物は、トランスジェニック植物又は動物である。好適なトランスジェニック動物には、哺乳動物；鳥類；爬虫類；有袋類；及び両生類が含まれる。適当な哺乳動物には、反芻動物；が有蹄類；家畜化哺乳動物；及び乳用動物含まれる。特に好適な動物には、マウス、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、ウサギ、雌ウシ、ブタ、ウマ、雄ウシ及びラマが含まれる。適当な鳥類には、ニワトリ、ガチョウ及び七面鳥が含まれる。このトランスジェニック蛋白質がトランスジェニック動物の乳汁中に分泌される場合には、この動物は、年間少なくとも１リットルの、一層好ましくは少なくとも１０又は１００リットルの乳汁を生成することができよう。
【０１７３】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、乳腺特異的プロモーター例えば乳汁特異的プロモーター例えば乳清蛋白質又はカゼインプロモーターの制御下にある。この乳汁特異的プロモーターは、カゼインプロモーター、べータラクトグロブリン、乳漿酸蛋白質プロモーター又はラクトアルブミンプロモーターであってよい。好ましくは、このプロモーターは、ヤギのβカゼインプロモーターである。
【０１７４】
好適具体例において、この生物は、哺乳動物であり、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、そのトランスジェニック動物の乳汁中に、少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．７５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で分泌される。
【０１７５】
好適具体例において、このＥＰＯａは、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含む。
【０１７６】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１７７】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンを含む。
【０１７８】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びヒト血清アルブミンである。
【０１７９】
好適具体例において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー例えば式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含む。
【０１８０】
好適具体例において、この融合蛋白質は、左から右へ、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー、及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１８１】
他の面において、この発明は、エリスロポエチン類似体(ＥＰＯａ)蛋白質又はその精製した調製物例えばここに記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質のＥＰＯａ部分を特徴とし、該類似体蛋白質においては、少なくとも１つのアミノ酸残基が変化しており、それにより、ＥＰＯにおいてグリコシル化部位として働く部位がＥＰＯａ(例えば、エリスロポエチンにおけるグリコシル化部位として働くことのできる少なくとも１つのアミノ酸残基が例えば置換又は欠失により変化し、それにより、それがグリコシル化部位として働かなくなったＥＰＯａ)においてはグリコシル化部位として働かない。
【０１８２】
好適具体例において、このエリスロポエチン類似体は、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含む。
【０１８３】
好適具体例において、このＥＰＯａは、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである。
【０１８４】
他の面において、この発明は、ここに記載のＥＰＯａをコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸を特徴とする。
【０１８５】
他の面において、この発明は、ここに記載のＥＰＯａ核酸を含む発現ベクター又は構築物を特徴とする。
【０１８６】
好適具体例において、このベクター又は構築物は、更に、プロモーター；選択マーカー；複製起点；又はヒト以外の種に相同なＤＮＡ例えばヤギのＤＮＡを含む。
【０１８７】
他の面において、この発明は、ここに記載のＥＰＯａ核酸を含むベクター又は構築物を含む細胞を特徴とする。
【０１８８】
ポリペプチドの精製した調製物、実質的に純粋な調製物又は単離されたポリペプチドは、ここで用いる場合、それがそれを発現する細胞又は生物中で共存している少なくとも一の他の蛋白質、脂質又は核酸から(例えば、トランスジェニック動物中の又はトランスジェニック動物により生成される液体(例えば、乳汁)若しくは他の物質(例えば、卵)中の蛋白質、脂質又は核酸から)分離されたポリペプチドを意味する。このポリペプチドは、好ましくは、それを精製するのに用いた物質例えば抗体又はゲルマトリクス例えばポリアクリルアミドから分離される。このポリペプチドは、好ましくは、精製された調製物の少なくとも１０、２０、５０、７０、８０又は９５％(乾燥重量)を構成する。好ましくは、この調製物は、蛋白質配列決定を可能にするのに十分なポリペプチド；少なくとも１、１０又は１００μｇのポリペプチド；少なくとも１、１０又は１００ｍｇのポリペプチドを含む。
【０１８９】
ここで用いる場合、「ヒト血清アルブミン」又は「ｈＳＡ」は、Minghetti等 J.Biol.Chem.261:6747-6757,1986；Lawn等 Nucl.Acids Res.9:6103,1981に記載されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。好適具体例においては、１つ又は最大で２、５、１０若しくは２０のアミノ酸残基が置換され、挿入され又は欠失した配列変異体が含まれる。変異体は、例えばマウス、ラット、ウサギ、霊長類、ヒヒ又はヒトにおいて、実質的に、ｈＳＡと同じ免役原性を有するであろう。変異体は、ＥＰＯａを含む融合蛋白質に取り込まれた場合に、例えばマウス、ウサギ又はヒトにおいて、ＥＰＯａとｈＳＡとを含む融合蛋白質と同様のクリアランス時間と活性とを有するＥＰＯａ−ｈＳＡ融合物を生じるであろう。
【０１９０】
ここで用いる場合、「エリスロポエチン」又は「ＥＰＯ」は、赤血球前駆細胞の赤血球への成熟に関与する糖蛋白質ホルモンをいう。ＥＰＯの配列は、Powell等、Proc.Natl.Acad.Sci. USA,83:6465-6469(1986)に見出すことができる。
【０１９１】
実質的に純粋な核酸は、次の一方又は両方である核酸である：この核酸が由来した生物の天然のゲノムにおいて直接隣接している配列例えばコード配列の一方又は両方(即ち、５’側のものと３’側のもの)と直接隣接していない；又はそれが由来した生物において共存している核酸配列を実質的に含まない。この用語は、例えば、ベクター (例えば、自律的に複製するプラスミド若しくはウイルス) 中に又は原核若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に取り込まれた組換えＤＮＡ、又は他のＤＮＡ配列と独立の別個の分子として存在するＤＮＡ(例えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ断片)を包含する。実質的に純粋なＤＮＡは又、更なるＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えＤＮＡをも包含する。
【０１９２】
相同性又は配列同一性は、ここで用いる場合、２つのポリペプチド分子間の又は２つの核酸分子間の配列類似性をいう。第１の配列のある位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占められているならば、これらの分子は、その位置で相同である(即ち、ここで用いる場合、アミノ酸又は核酸の「相同性」は、アミノ酸又は核酸の「同一性」に等しい)。２つの配列間の相同性パーセントは、それらの配列により共有される同じ位置の数の関数である(即ち、相同性％＝同じ位置の数／位置の総数×１００)。例えば、もし２つの配列の位置１０の内の６が一致し又は相同であるならば、これらの２つの配列は、６０％相同であり又は６０％の配列同一性を有する。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性又は配列同一性を共有する。一般に、比較は、２つの配列を最大の相同性又は配列同一性を与えるように整列させて行う。
【０１９３】
配列の比較及び２つの配列間の相同性パーセントの測定は、数学的アルゴリズムを利用して達成することができる。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好適な非制限的な例は、Karlin及びAltschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-68(Karlin及びAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77において改変)のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Altschul(1990)J.Mol.Biol.215:403-10のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム(バージョン２．０)に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行って、この発明のＩＴＡＬＹ核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴ蛋白質サーチは、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行って、この発明のＩＴＡＬＹ蛋白質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップを入れたアラインメントを得るためには、ギャップトＢＬＡＳＴを、Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402に記載されたように利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップトＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラメーターを利用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの他の好適な非制限的な例は、Myers及びMiller, CABIOS(1989)のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム(バージョン２．０)に組み込まれており、これは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの部分である。ＡＬＩＧＮプログラムをアミノ酸配列の比較に利用する場合には、ＰＡＭ１２０ウェイトレジデューテーブル、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を用いることができる。
【０１９４】
用語ペプチド、蛋白質及びポリペプチドは、ここでは、交換可能に用いる。
【０１９５】
ここで用いる場合、用語トランスジーンは、トランスジェニック生物のゲノム中に導入された核酸配列(少なくとも１つのＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質ポリペプチドをコードするもの)を意味する。トランスジーンは、この融合蛋白質をコードする核酸の最適の発現及び分泌に必要であり得る少なくとも１つの転写調節配列及び他の核酸例えばイントロンを含んでよい。トランスジーンは、エンハンサー配列を含むことができる。ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質配列は、組織特異的プロモーター例えば乳腺特異的プロモーター配列(この蛋白質のトランスジェニック哺乳動物の乳汁中への分泌を生じる)、尿特異的プロモーター、又は卵特異的プロモーターに機能的に結合することができる。
【０１９６】
ここで用いる場合、用語「トランスジェニック細胞」は、トランスジーンを含む細胞をいう。
【０１９７】
トランスジェニック生物は、ここで用いる場合、トランスジェニック動物又は植物をいう。
【０１９８】
ここで用いる場合、「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物であって、その動物の細胞の少なくとも１つ好ましくは本質的にすべてが人間の介入により例えば当業者に公知のトランスジェニック技術によって導入されたトランスジーンを含んでいる当該非ヒト動物である。このトランスジーンは、細胞の前駆細胞に意図的遺伝子操作例えばマイクロインジェクション又は組換えウイルス感染により導入することによって直接又は間接に細胞に導入することができる。
【０１９９】
ここで用いる場合、「トランスジェニック植物」は、その植物の細胞の少なくとも１つ好ましくはすべてが 植物好ましくは多細胞の又は高等植物である。
【０２００】
この発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求の範囲から明らかとなろう。
【０２０１】
詳細な説明
グリコシル化
ＥＰＯは、赤血球前駆細胞の赤血球への成熟を媒介する糖蛋白質ホルモンである。それは、循環における赤血球細胞のレベルの調節において重要な役割を演じている。天然のＥＰＯは、胎児期の肝臓及び成体の腎臓で産生され、血中を循環して骨髄における赤血球細胞の産生を刺激する。
【０２０２】
多くの細胞の表面及び真核細胞により産生される分泌蛋白質は、少なくとも一のオリゴ糖基の付着により修飾される。この修飾は、グリコシル化と呼ばれ、蛋白質の物理的特性に劇的に影響し得て、蛋白質の安定性、分泌及び局在性において重要であり得る。グリコシル化は、ポリペプチド主鎖の特定の位置に起きる。通常次の２つの主要なタイプのグリコシル化がある：セリン又はスレオニン残基に結合するＯ結合されるオリゴ糖により特徴付けられるグリコシル化；及びＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列中のアスパラギン残基に結合するＮ結合されるオリゴ糖により特徴付けられるグリコシル化(ここに、Ｘは、プロリン以外の何れのアミノ酸であってもよい)。Ｎ−アセチルノイラミン酸(以後、シアル酸と呼ぶ)が、通常、Ｎ結合したオリゴ糖及びＯ結合したオリゴ糖の両者の末端残基である。
【０２０３】
ヒト尿由来のＥＰＯは、３つのＮ結合したオリゴ糖鎖と１つのＯ結合したオリゴ糖鎖を含んでいる。Ｎ結合するグリコシル化は、２４、３８及び８３位に局在するアスパラギン残基で起きるが、他方、Ｏ結合するグリコシル化は、１２６位に局在するセリン残基に起きる(Lai等、J.Biol.Chem.261,3116(1986)；Broudy等、Arch.Biochem.Biophys.265,329(1988))。
【０２０４】
ここに記載のように、この発明のＥＰＯ類似体は、これらの部位の１つ、２つ、３つ又はすべてにおけるグリコシル化が完全に破壊されるように例えばアミノ酸残基の置換又は欠失により修飾されている。
【０２０５】
ＥＰＯグリコシル化類似体
ＥＰＯ類似体は、天然の又は組換えのＥＰＯと、アミノ酸Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８、Ａｓｎ８３又はＳｅｒ１２６の少なくとも１つにおいて異なってよい。ＥＰＯａにおいては、その一次配列は、これらの残基の少なくとも１つがグリコシル化を支持できないように変化させることができる。
【０２０６】
好適類似体を、以下に列記するが、ここに、Ｘａａは、糖残基の結合を支持しないアミノ酸例えばＧｌｎ又はＡｌａである
【表１】

【０２０７】
ＥＰＯａは、２４、３８、８３及び１２６位の少なくとも１つ又は全部においてのみＥＰＯと異なっており、以下で検討するように更なるアミノ酸置換及び／又は欠失を有することができる。
【０２０８】
ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする配列
好適なＥＰＯａ−ｈＳＡ融合物は、１つのｈＳＡ分子に結合した１つのＥＰＯａを有するが、他の構成もこの発明の範囲内にある。例えば、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、次の式の何れでも有することができる：Ｒ₁−Ｌ−Ｒ₂；Ｒ₂−Ｌ−Ｒ₁；Ｒ₁−Ｌ−Ｒ₂−Ｌ−Ｒ₁；又はＲ₂−Ｌ−Ｒ₁−Ｌ−Ｒ₂；Ｒ₁−Ｒ₂；Ｒ₂−Ｒ₁；Ｒ₁−Ｒ₂−Ｒ₁；又はＲ₂−Ｒ₁−Ｒ₂(式中、Ｒ₁は、ＥＰＯ類似体であり、Ｒ₂は、ｈＳＡであり、Ｌは、ペプチドリンカー配列である)。
【０２０９】
ＥＰＯａとｈＳＡドメインは、互いに結合されており、好ましくはリンカー配列により結合されている。このリンカー配列は、ＥＰＯａドメインとｈＳＡドメインを、各ドメインが適当にその二次及び三次構造へと折り畳まることを確実にするのに十分な距離で離すべきである。好適なリンカー配列は、(１)フレキシブルな伸長した構成を採るべきであり、(２)機能的ＥＰＯａ及びｈＳＡドメインと相互作用することのできる規則正しい二次構造を発達させる傾向を示すべきであり、そして(３)これらの機能的な蛋白質ドメインとの相互作用を促進することのできるであろう最少の疎水性又は帯電した特性を有するべきである。フレキシブル蛋白質領域内の典型的な表面アミノ酸には、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒが含まれる。Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒを含むアミノ酸配列の順列は、リンカー配列についての上記の基準を満たすことが期待されよう。他のほぼ中性のアミノ酸例えばＴｈｒ及びＡｌａも又、このリンカー配列において用いることができる。
【０２１０】
２０アミノ酸のリンカー配列長を用いて、機能的蛋白質ドメインの適当な分離を与えることができる(もっとも、一層長いか又は一層短いリンカー配列も又、用いることはできる)。このＥＰＯａ及びｈＳＡを分離するリンカー配列の長さは、５〜５００アミノ酸長であってよく、一層好ましくは５〜１００アミノ酸長であってよい。好ましくは、このリンカー配列は、約５〜３０アミノ酸長である。好適具体例において、このリンカー配列は、約５〜２０アミノ酸であり、有利には、約１０〜２０アミノ酸である。ＥＰＯａとｈＳＡのリンカーとして有用なアミノ酸配列には、(ＳｅｒＧｌｙ₄)_y(式中、ｙは８以上である)又はＧｌｙ₄ＳｅｒＧｌｙ₅が含まれる(但し、これらに限定はしない)。好適なリンカー配列は、式(ＳｅｒＧｌｙ₄)₄を有する。他の好適なリンカーは、式((Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)配列を有する。
【０２１１】
これらのＥＰＯａ及びｈＳＡ蛋白質は、リンカー配列を用いずに直接融合することができる。リンカー配列は、これらの融合される蛋白質が、それらの機能的ドメインを分離して立体障害を防止するのに利用することのできる必須でないＮ又はＣ末端アミノ酸領域を有する場合には不必要である。好適具体例において、ＥＰＯａのＣ末端は、ｈＳＡのＮ末端に直接融合させることができ、又はｈＳＡのＣ末端は、ＥＰＯａのＮ末端に直接融合させることができる。
【０２１２】
組換えによる生成
ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて、この融合蛋白質をコードする核酸分子を用いて調製することができる。融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、標準的ＤＮＡ合成法により合成することができる。
【０２１３】
融合蛋白質をコードする核酸は、宿主細胞例えば初代細胞株又は不死化細胞株の細胞に導入することができる。それらの組換え細胞を用いて、この融合蛋白質を生成することができる。融合蛋白質をコードする核酸は、例えば相同組換えによって宿主細胞に導入することができる。殆どの場合において、このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする核酸を組換え発現ベクターに組み込む。
【０２１４】
この融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、発現に用いる宿主細胞に基づいて選択される少なくとも１つの調節配列に機能的に結合することができる。用語「操作可能に結合する」は、この融合蛋白質化合物をコードする配列を、この融合蛋白質の発現を可能にする仕方で調節配列に結合することを意味する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)をいう。かかる調節配列は、例えば、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego,カリフォルニア(1990)に記載されている(その内容を本明細書中に参考として援用する)。調節配列には、ヌクレオチド配列の構成的発現を多くの型の宿主細胞において指示するもの、ある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの(例えば、組織特異的調節配列)及び調節可能な仕方で(例えば、誘導因子の存在下でのみ)発現を指示するものが含まれる。発現ベクターのデザインは、トランスフォームすべき宿主細胞の選択、所望の融合蛋白質の発現レベル等の要因に依存するということは、当業者に認められよう。これらの融合蛋白質発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより、核酸にコードされる融合蛋白質を生成することができる。
【０２１５】
組換え発現ベクターを、原核又は真核細胞における融合蛋白質の発現のためにデザインすることができる。例えば、融合蛋白質を細菌細胞例えば大腸菌、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス発現系)、酵母細胞又は哺乳動物細胞において発現させることができる。幾つかの適当な宿主細胞は、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego,カリフォルニア(1990)において更に検討されている。酵母Ｓ．セレビシエにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１(Baldari等(1987)EMBO J.6:229-234)、ｐＭＦａ(Kurjan及びHerskowitz(1982)Cell 30:933-943)、ｐＪＲＹ８８(Schultz等(1987)Gene 54:113-123)及びｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego,カリフォルニア)が含まれる。培養昆虫細胞(例えば、Ｓｆ９細胞)における融合蛋白質の発現に利用することのできるバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ(Smith等(1983)Mol.Cell.Biol.3:2156-2165)及びｐＶＬシリーズ(Lucklow,V.A.及びSummers,M.D.(1989)Virology 170:31-39)が含まれる。
【０２１６】
哺乳動物用発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８(Seed,B.(1987)Nature 329:840)及びｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman等(1987)EMBO J.6:187-195)が含まれる。哺乳動物細胞中で用いる場合には、これらの発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントにより与えられる。例えば、一般に用いられているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス及びサルウイルス４０に由来するものである。
【０２１７】
上記の調節制御配列に加えて、この組換え発現ベクターは、更なるヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、この組換え発現ベクターは、このベクターを取り込んだ宿主細胞を同定するための選択マーカー遺伝子をコードすることができる。その上、この融合蛋白質の宿主細胞(特に、哺乳動物宿主細胞)からの分泌を容易にするために、この組換え発現ベクターは、発現に際してこの融合蛋白質がそのアミノ末端に融合されたシグナル配列を伴って合成されるように、この融合蛋白質のアミノ末端をコードする配列に機能的に結合されたシグナル配列をコードすることができる。このシグナル配列は、この融合蛋白質がこの細胞の分泌経路に入ることを指示してから開裂され、成熟融合蛋白質(即ち、シグナル配列を伴わない融合蛋白質)を宿主細胞から放出させる。蛋白質又はペプチドの哺乳動物宿主細胞からの分泌を容易にするためのシグナル配列の利用は、当分野で公知である。
【０２１８】
ベクターＤＮＡは、慣用のトランスフォーメーション又はトランスフェクション技術によって原核又は真核細胞に導入することができる。ここで用いる場合、用語「トランスフォーメーション」及び「トランスフェクション」は、外来核酸(例えば、ＤＮＡ)を宿主細胞に導入するための分野で認められた様々な技術をいい、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション及びウイルス媒介のトランスフェクションを包含する。宿主細胞をトランスフォームし又はトランスフェクトするための適当な方法は、Sambrook等(Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版、Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))及び他のラボラトリーマニュアル中に見出すことができる。
【０２１９】
しばしば、ほんの少数の哺乳動物細胞しか外来ＤＮＡをそれらのゲノム中に組み込まない。これらのインテグラントを同定して選択するために、選択マーカー(例えば、抗生物質耐性)をコードする遺伝子を、融合蛋白質をコードする遺伝子と共にこれらの宿主細胞に導入することができる。好適な選択マーカーには、薬物例えばＧ４１８、ヒグロマイシン及びメトトレキセートに対する耐性を与えるものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、融合蛋白質をコードするベクターと同じベクターで宿主細胞に導入することができ、又は別々のベクターで導入することもできる。導入された核酸により安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択により同定することができる(例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生き残るが、その他の細胞は死滅する)。
【０２２０】
組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーターの調節配列とＴ７ポリメラーゼを用いて、イン・ビトロで転写されて翻訳され得る。
【０２２１】
トランスジェニック哺乳動物
非ヒトトランスジェニック動物を生成する方法を、ここに記載する。ＤＮＡ構築物を哺乳動物の生殖細胞系統に導入して、トランスジェニック哺乳動物を作製することができる。例えば、この構築物の少なくとも１コピーを、標準的トランスジェニック技術により、哺乳動物胚のゲノム中に組み込むことができる。
【０２２２】
トランスジェニック蛋白質をトランスジェニック哺乳動物の乳汁中で発現させることは、しばしば、望ましい。多量の乳汁を生成する及び長い泌乳期間を有する哺乳動物は、好適である。好適な哺乳動物は、反芻動物例えばウシ、ヒツジ、ラクダ又はヤギ(例えば、スイス起源のヤギ、例えばAlpine、Saanen及びToggenburg産のヤギ)である。他の好適な動物には、雄ウシ、ウサギ及びブタが含まれる。
【０２２３】
典型的具体例において、非ヒトトランスジェニック動物は、トランスジーンを、非ヒト動物の生殖細胞系統へ導入することにより生成される。トランスジーンは、胚性標的細胞に様々な発生ステージにおいて導入することができる。胚性標的細胞の発生のステージに依って異なる方法が用いられる。用いる任意の動物の特定の系統は、可能であれば、一般的に良好な健康、良好な胚の収率、胚の前核がよく見えること、及び良好な再現性により選択されるべきである。
【０２２４】
このＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質のトランスジーンの胚への導入は、この分野で公知の様々な手段の何れか例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション又はリポフェクションにより達成することができる。例えば、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質のトランスジーンは、その構築物を受精した哺乳動物卵の前核にマイクロインジェクションすることにより哺乳動物に導入することができ、この構築物の少なくとも１コピーを発生中の哺乳動物の細胞中に維持させることができる。このトランスジーン構築物の受精卵への導入後に、その卵をイン・ビトロで様々な時間にわたってインキュベートすることができ、又は代用宿主中に再移植することができ、又はこれらの両方が可能である。１つの一般的方法は、これらの胚をイン・ビトロで種に応じて約１〜７日間インキュベートしてから、代用宿主に再移植することである。
【０２２５】
これらのトランスジェニック技術により操作した胚の子孫を、その構築物の存在について、組織切片のサザーンブロット分析により試験することができる。このゲノム中に安定に組み込まれた外因性のクローン化構築物の少なくとも１コピーを有する胚を用いて、トランスジェニック技術により加えられた構築物を有する永久的トランスジェニック哺乳動物系統を樹立することができる。
【０２２６】
トランスジェニック技術により変えられた哺乳動物の同腹子を、誕生後に、この構築物の子孫のゲノムへの組込みについてアッセイすることができる。これは、この融合蛋白質又はその断片をコードするＤＮＡ配列に対応するプローブをこの子孫に由来する染色体物質にハイブリダイズさせることにより行うことができる。この構築物の少なくとも１コピーをゲノム中に含むことが見出された哺乳動物の子孫を成熟するまで育てる。これらの子孫の雌は、所望の蛋白質をそれらの乳汁中に又は乳汁と共に生成するであろう。これらのトランスジェニック哺乳動物を交配させて、所望の蛋白質の乳汁中への生産に有用な他のトランスジェニック子孫を生成することができる。
【０２２７】
トランスジェニックの雌は、乳汁中への蛋白質分泌について、分野で公知のアッセイ技術例えばウエスタンブロット又は酵素的アッセイを用いて試験することができる。
【０２２８】
トランスジェニック動物の乳汁中のトランスジェニック蛋白質の生成
乳汁特異的プロモーター
有用な転写プロモーターは、***上皮細胞で優先的に活性化されるプロモーターであり、乳汁蛋白質例えばカゼイン、ベータラクトグロブリン(Clark等(1989)Bio/Technology 7:487-492)、乳漿酸蛋白質(Gorton等(1987)Bio/Technology 5:1183-1187)、及びラクトアルブミン(Soulier等(1992)FEBS Letts.297:13)をコードする遺伝子を制御するプロモーターを含む。任意の哺乳動物種のアルファ、ベータ、ガンマ又はカッパカゼイン遺伝子プロモーターを用いて、***での発現を与えることができ；好適プロモーターは、ヤギのベータカゼイン遺伝子プロモーターである(DiTullio(1992)Bio/Technology 10:74-77)。乳汁特異的蛋白質プロモーター又は***組織で特異的に活性化されるプロモーターを、ｃＤＮＡ又はゲノム配列から単離することができる。好ましくは、それらは、ゲノム起源のものである。
【０２２９】
ＤＮＡ配列情報は、少なくとも一の生物において(しばしば、数種の生物において)、上記の乳腺特異的遺伝子が利用することができる。例えば、Richards等 J.Biol.Chem.256,526-532(1981)(α−ラクトアルブミン)；Campbell等Nucleic Acids Res.12,8685-8697(1984)(ラットＷＡＰ)；Jones等 J.Biol.Chem.260,7042-7050(1985)(ラットβ−カゼイン)；Yu-Lee及びRosen,J.Biol.Chem.258,10794-10804(1983)(ラットγ−カゼイン)；Hall,Biochem.J.242,735-742(1987)(ヒトα−ラクトアルブミン)；Stewart,Nucleic Acids Res.12,389(1984)(ウシαｓ１及びκカゼインｃＤＮＡ)；Gorodetsky等Gene 66,87-96(1988)(ウシβカゼイン)；Alexander等 Eur.J.Biochem.178,395-401(1988)(ウシκカゼイン)；Brignon等 FEBS Lett.188,48-55(1977)(ウシαＳ２カゼイン)；Jamieson等Gene 61,85-90(1987),Ivanov等 Biol.Chem.Hoppe-Seyler 369,425-429(1988) Alexander等 Nucleic Acids Res.17,6739(1989)(ウシβラクトグロブリン)；Vilotte等 Biochimie 69,609-620(1987)(ウシα−ラクトアルブミン)。様々な乳汁蛋白質遺伝子の構造と機能が、Mercier及びVilotte,J.Dairy Sci.76,3079-3098(1993)(そのまますべての目的のために参考として援用する)により総説されている。更なる隣接配列が発現の最適化に有用であるならば、存在する配列をプローブとして用いて、かかる配列をクローン化することができる。種々の生物に由来する乳腺特異的な調節配列を、かかる生物に由来するライブラリーを、公知の同起源のヌクレオチド配列又は同起源の蛋白質に対する抗体をプローブとして用いてスクリーニングすることにより得ることができる。
【０２３０】
シグナル配列
有用なシグナル配列は、乳汁特異的なシグナル配列又は真核若しくは原核蛋白質の分泌を生じる他のシグナル配列である。好ましくは、このシグナル配列は、乳汁特異的シグナル配列から選択する(即ち、それは、乳汁中に分泌される生成物をコードする遺伝子に由来する)。最も好ましくは、この乳汁特異的シグナル配列は、この発明の発現系で用いられる乳汁特異的プロモーターに関連する。このシグナル配列の大きさは、この発明にとって重要ではない。必要とされるすべてのことは、この配列が、例えば***組織において、所望の組換え蛋白質の分泌をもたらすのに十分な大きさのものであるということである。例えば、カゼイン(例えば、アルファ、べータ、ガンマ又はカッパカゼイン)、べータラクトグロブリン、乳漿酸蛋白質及びラクトアルブミンをコードする遺伝子に由来するシグナル配列は、本発明において有用である。好適なシグナル配列は、ヤギのβ−カゼインシグナル配列である。
【０２３１】
他の分泌される蛋白質(例えば、肝細胞、腎臓細胞又は膵臓細胞により分泌される蛋白質)に由来するシグナル配列も又、用いることができる。
【０２３２】
ＤＮＡ構築物
ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を、***上皮細胞に特異的なプロモーター例えばカゼインプロモーター例えばヤギのべータカゼインプロモーター、乳汁特異的シグナル配列例えばカゼインシグナル配列例えばβ−カゼインシグナル配列、及びＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む構築物から発現させることができる。
【０２３３】
構築物は又、非分泌蛋白質をコードするＤＮＡ配列の下流の３’非翻訳領域をも含んでよい。かかる領域は、この発現系のＲＮＡ転写物を安定化させることができ、それ故、この発現系からの所望の蛋白質の収率を増大させる。この発明の構築物において有用な３’非翻訳領域の内には、ポリＡシグナルを与える配列がある。かかる配列は、例えば当分野で周知のＳＶ４０小型ｔ抗原、カゼイン３’非翻訳領域又は他の３’非翻訳配列から導くことができる。好ましくは、３’非翻訳領域は、乳汁特異的蛋白質に由来する。この３’非翻訳領域の長さは重要でないが、そのポリＡ転写物の安定化効果は、この発現配列のＲＮＡの安定化において重要であるようである。
【０２３４】
構築物は、プロモーターとシグナル配列をコードするＤＮＡ配列との間に５’非翻訳領域を含むことができる。かかる非翻訳領域は、プロモーターが得られたのと同じ制御領域に由来してよいし、又は異なる遺伝子に由来してもよい(例えば、それらは、他の合成の、半合成の又は天然の起源に由来するものであってよい)。
【０２３５】
構築物は又、***上皮細胞において優先的に発現される遺伝子のＮ末端コード領域の約１０％、２０％、３０％以上を含んでもよい。例えば、このＮ末端コード領域は、用いられるプロモーターに対応することができる(例えば、ヤギのβ−カゼインのＮ末端コード領域)。
【０２３６】
従来技術の方法は、構築物を作製し、それを、培養細胞において生成物を生成する能力について試験してから、その構築物をトランスジェニック動物中に配置することを含むことができる。驚くべきことに、本願発明者は、かかるプロトコールが、例えばトランスジェニック動物の乳汁中に通常分泌されない蛋白質が分泌されるかどうかの測定における予測値ではあり得ないということを見出した。それ故、構築物を直接トランスジェニック動物例えばトランスジェニックマウスにおいて試験することは望ましいことであろう(ＣＨＯ細胞において分泌され得ない幾つかの構築物がトランスジェニック動物の乳汁中に分泌されるので)。
【０２３７】
乳汁からの精製
このトランスジェニック蛋白質は、乳汁中に比較的高濃度で且つ多量に生成され得て、再生可能な起源から容易に収穫することのできる正常に処理を受けたペプチドの連続的な高レベルのアウトプットを与える。乳汁からの蛋白質の単離のための当分野で公知の幾つかの異なる方法がある。
【０２３８】
乳汁蛋白質は、通常、工程の組合せにより単離される。生乳は、先ず、例えばスキミング、遠心分離、沈降(H.E. Swaisgood, Developments in Dairy Chemistry, I: Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers, NY,1982)、酸沈殿(米国特許第４，６４４，０５６号)又はレンニン若しくはキモトリプシンによる酵素的凝固(Swaisgood,同書)により分画されて脂肪を除去される。次に、主要な乳汁蛋白質を、透明な溶液と沈殿の塊とに分画することができ、後者から関心ある特定の蛋白質を容易に精製することができる。
【０２３９】
米国特許出願第０８／６４８，２３６号は、可溶性の乳汁成分例えばペプチドを、その生物学的に活性な形態で、全乳汁又は乳汁画分から、接線流濾過により単離する方法を開示している。以前の単離方法と異なり、これは、脂肪及びカゼインミセルを除去するための全乳汁の最初の分画の必要性を排除し、それによりこの工程を単純化して回収率と生物活性の損失を回避する。この方法を更なる精製ステップと組み合わせて用いて、更に夾雑物を除去して関心ある成分を精製することができる。
【０２４０】
トランスジェニック動物の卵におけるトランスジェニック蛋白質の生成
ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、トランスジェニック動物の組織、分泌物又は他の生成物例えば卵において生成され得る。ＥＰＯａ−ｈＳＡは、トランスジェニック動物好ましくは七面鳥、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、ホロホロチョウ、クジャク、コリンウズラ、キジ、ハトの卵、一層好ましくはトランスジェニックニワトリの卵において、当分野で公知の方法を用いて生成され得る(Sang等、Trends Biotechnology,12:415-20,1994)。この卵中で特異的に発現される蛋白質をコードする遺伝子例えば卵黄蛋白質遺伝子及びアルブミン蛋白質遺伝子は、ＥＰＯａ−ｈＳＡの発現を指示するように改変することができる。
【０２４１】
卵特異的プロモーター
有用な転写プロモーターは、卵において優先的に活性化されるプロモーターであり、卵蛋白質例えばオバルブミン、リゾチーム及びアビジンをコードする遺伝子を制御するプロモーターを含む。ニワトリのオバルブミン、リゾチーム又はアビジン遺伝子由来のプロモーターは、好適である。卵特異的蛋白質のプロモーター又は卵組織で特異的に活性化されるプロモーターは、ｃＤＮＡ又はゲノム配列に由来し得る。好ましくは、これらの卵特異的プロモーターは、ゲノム起源のものである。
【０２４２】
卵に特異的な遺伝子のＤＮＡ配列は、当分野で公知である(例えば、Burley等、「The Avian Egg」、John Wiley and Sons, p.472,1989(この内容を参考として本明細書中に援用する)を参照されたい)。もし更なる隣接配列が発現の最適化に有用であるならば、かかる配列を、存在する配列をプローブとして用いてクローン化することができる。種々の生物に由来する卵特異的な調節配列を、かかる生物に由来するライブラリーを公知の同起源のヌクレオチド配列又は同起源の蛋白質に対する抗体をプローブとして用いてスクリーニングすることにより得ることができる。
【０２４３】
トランスジェニック植物
ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、トランスジェニック生物例えばトランスジェニック植物例えばＤＮＡトランスジーンが核又は色素体ゲノム中に挿入されたトランスジェニック植物において発現させることができる。植物のトランスフォーメーションは、当分野で公知である。一般的には、Methods in Enzymology Vol.153(「Recombinant DNA Part D」)及び編、及び欧州特許出願ＥＰ６９３５５４号を参照されたい。
【０２４４】
外来の核酸を幾つかの方法により植物細胞又はプロトプラストに導入することができる。例えば、核酸は、マイクロピペッターの使用により、植物細胞に直接マイクロインジェクションすることにより、機械的にトランスファーすることができる。外来核酸は、遺伝物質と沈殿複合体(これは、細胞により取り込まれる)を形成するポリエチレングリコールを用いて植物細胞にトランスファーすることもできる(Paszkowski等(1984)EMBO J.3:2712-22)。外来核酸は、植物細胞に、エレクトロポレーションにより導入することができる(Fromm等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5824)。この技術において、植物プロトプラストは、適当な遺伝子構築物を含むプラスミド又は核酸の存在下で電気穿孔される。高電界強度の電気的インパルスは、可逆的に生体膜を透過性にしてこれらのプラスミドの導入を可能にする。電気穿孔された植物プロトプラストは、細胞壁を再建し、***して植物カルスを形成する。これらのトランスフォームされた遺伝子有するトランスフォームされた植物細胞の分泌を、表現型マーカーを用いて達成することができる。
【０２４５】
カリフラワーモザイクウイルス(ＣａＭＶ)を、外来核酸を植物細胞に導入するためのベクターとして利用することができる(Hohn等(1982)「Molecular Biology of Plant Tumors」Academic Press, New York, p.549-560；Howell,米国特許第４，４０７，９５６号)。ＣａＭＶのウイルスＤＮＡゲノムは、親細菌プラスミドに挿入されて組み換えＤＮＡ分子を造り、これは、細菌中で増殖することができる。この組換えプラスミドを更に所望のＤＮＡ配列の導入により改変することができる。この組換えプラスミドの改変されたウイルス部分を、次いで、親細菌プラスミドから切り出して植物細胞又は植物への接種に用いる。
【０２４６】
小さい粒子による高速弾道式透過を用いて、外来核酸を植物細胞に導入することができる。核酸は、小さいビーズ若しくは粒子のマトリクス内で又はその表面で処理される(Klein等(1987)Nature 327:70-73)。典型的には新しい核酸セグメントの単一の導入しか必要とされなくても、この方法は、多数の導入をも与える。
【０２４７】
核酸は、植物細胞中に、植物細胞、外植体、***組織又は種子への、この核酸でトランスフォームされたアグロバクテリウム・ツメファシエンスの感染により導入することができる。適当な条件下で、これらのトランスフォームされた植物細胞を生育させて、苗条、根を形成し、更には、植物へ発生させる。これらの核酸は、植物細胞へ、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドによって導入することができる。Ｔｉプラスミドは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの感染の際に植物細胞に伝えられて、その植物ゲノム中に安定に組み込まれる(Horsch等(1984)「Inheritance of Functional Foreign Genes in Plants」Science 233:496-498；Fraley等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803)。
【０２４８】
プロトプラストを単離して培養して全体が再生された植物体を与えることのできる植物は、トランスファーされた外来遺伝子を含む全植物体が回復されるようにトランスフォームすることができる。幾つかの適当な植物には、Fragaria、Lotus、Medicago、Onobrychis、Trifolium、Trigonella、Vigna、Citrus、Linum、Geranium、Manihot、Daucus、Arabidopsis、Brassica、Raphanus、Sinapis、Atropa、Capsicum、Hyoscyamus、Lycopersicon、Nicotiana、Solanum、Petunia、Digitalis、Majorana、Ciohorium、Helianthus、Lactuca、Bromus、Asparagus、Antirrhinum、Hererocallis、Nemesia、Pelargonium、Panicum、Pennisetum、Ranunculus、Senecio、Salpiglossis、Cucumis、Browaalia、Glycine、Lolium、Zea、Triticum、Sorghum及びDatura属の種が含まれる。
【０２４９】
培養プロトプラストからの植物の再生は、Evans等「Protoplasts Isolation and Culture」Handbook of Plant Cell Cultures 1:124-176(MacMillan Publishing Co.New York 1983)；M.R.Davey「Recent Development in the Culture and Regeneration of Plant Protoplast」Protoplasts(1983)-Lecture Proceedings, p.12-29(Birkhauser, Basal 1983)；P.J.Dale「Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops」Protoplasts(1983)-Lecture Proceedings, p.31-41(Birkhauser, Basel 1983)；及びH.Binding「Regeneration of Plants」Plant Protoplasts, p.21-73(CRC Press, Boca Raton 1985)に記載されている。
【０２５０】
プロトプラストからの再生は、植物の種によって異なるが、一般的には、先ず外因性配列のコピーを含むトランスフォームされたプロトプラストの懸濁液を生成する。ある種においては、胚芽形成を、次いで、プロトプラスト懸濁液から成熟及び発芽のステージ(天然の胚芽としての)まで誘導することができる。培養培地は、様々なアミノ酸及びホルモン例えばオーキシン及びサイトカイニンを含むことができる。グルタミン酸及びプロリンを培地に加えることも又、特にコーン及びアルファルファ等の種には有利であり得る。苗条と根は、通常、同時に発育する。効率的な再生は、培地、遺伝子型及び培養履歴に依るであろう。これらの３つの変数を制御することができるならば、再生は、十分に、再現可能であり且つ反復可能である。
【０２５１】
栄養的に繁殖する作物においては、成熟トランスジェニック植物を、挿し木により又は組織培養技術により繁殖させて多数の同じ植物を試験例えば生産特性の試験のために生成することができる。望ましいトランスジェニック植物の選択を行って、それにより新しい品種を得、商業的販売のために栄養的に繁殖させる。種子で繁殖する作物においては、成熟トランスジェニック植物を、自家受粉させてホモ接合の同系交配植物を生成する。この同系交配植物は、新たに導入された外来遺伝子活性レベルについての遺伝子を含む種子を生成する。これらの種子は、生長して、選択された表現型を有する植物を生成することができる。この発明による同系交配植物を用いて、新たな雑種を開発することができる。この方法においては、選択した同系交配系統を他の同系交配系統と交配させて雑種を生成する。
【０２５２】
トランスジェニック植物から得られる部分例えば花、種子、葉、枝、果実等は、この発明によりカバーされる(但し、これらの部分は、上記のようにトランスフォームされた細胞を含む)。再生された植物の子孫及び変種並びに変異体も又、この発明の範囲内に含まれる(但し、それらの部分は、導入されたＤＮＡ配列を含む)。再生された植物の子孫及び変種並びに変異体も又、この発明の範囲内に含まれる。
【０２５３】
トランスジェニック植物又は植物細胞の選択は、視覚的アッセイ例えば色の変化の観察(例えば、白い花、変化しやすい色素の生成及び花における均一な色彩パターン又は不規則なパターン)に基づくものであってよいが、酵素活性又は生成定量の生化学的アッセイをも包含することができる。トランスジェニック植物又は植物細胞は、関心ある植物部分を有する植物へと生長し、遺伝子活性は、視覚的外観(フラボノイド遺伝子)により又は生化学的アッセイ(ノーザンブロット)；ウエスタンブロット；酵素アッセイ及びフラボノイド化合物アッセイ(分光学をふくむ。Harborne等(編)(1975)The Flavonoids,第1及び2巻[Acad.Press]参照)等によってモニターされる。適当な植物を選択して、更に評価する。遺伝子工学処理した植物の生成方法は、更に、米国特許第５，２８３，１８４号、米国特許第５，４８２，８５２号及び欧州特許出願ＥＰ６９３，５５４号(すべてを参考として本明細書に援用する)に記載されている。
【０２５４】
他のエリスロポエチン類似体
好ましくは、ＥＰＯ類似体は、少なくとも１つの変化をアミノ酸Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８、Ａｓｎ８３又はＳｅｒ１２６に有する。ＥＰＯ類似体は又、下記のような更なるアミノ酸変化をも有する。
【０２５５】
好適具体例において、このＥＰＯａは、アミノ酸配列が、最大で１、２、３、５又は１０残基天然のＥＰＯ蛋白質の配列と異なっている。これらの変化は、Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８、Ａｓｎ８３又はＳｅｒ１２６の変化に追加されるものであってよい。他の好適具体例において、このＥＰＯａは、アミノ酸配列が、最大でこれらの残基の１、２、３、５又は１０％天然のＥＰＯ蛋白質の配列と異なっている。これらの変化は、Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８、Ａｓｎ８３又はＳｅｒ１２６の変化に追加されるものであってよい。好適具体例において、これらの変化は、エリスロポエチン類似体がｈＳＡに融合されたときにエリスロポエチン生物学的活性を示すようなものである。好適具体例において、これらの差異の少なくとも１つ又はすべては、保存的アミノ酸変化である。他の好適具体例において、これらの変化の少なくとも１つ又はすべては、保存的アミノ酸変化以外である。
【０２５６】
好適具体例において、このＥＰＯａは、断片例えば完全長エリスロポエチンの中間配列が削除された配列の末端断片である。
【０２５７】
好適具体例において：この断片は、少なくとも５０、６０、８０、１００又は１５０アミノ酸長であり；この断片は、天然のエリスロポエチンの生物学的活性を有し；この断片は、天然のエリスロポエチンの生物学的活性のアゴニスト又はアンタゴニストであり；この断片は、エリスロポエチンのレセプターへの結合を競争的に又は非競争的に阻害することができる。
【０２５８】
好適具体例において、この断片は、天然のエリスロポエチンの対応するアミノ酸配列との少なくとも６０％の、一層好ましくは少なくとも７０、８０、９０、９５、９９又は１００％の配列同一性を有する。
【０２５９】
好適具体例において、この断片は、脊椎動物例えば哺乳動物例えば霊長類例えばヒトのエリスロポエチンの断片である。
【０２６０】
好適具体例において、この断片は、アミノ酸配列が、最大で１、２、３、５又は１０残基天然のエリスロポエチンの対応する残基と異なっている。これらの変化は、Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８、Ａｓｎ８３及びＳｅｒ１２６の変化に追加されるものであってよい。他の好適具体例において、この断片は、アミノ酸配列が、最大で１、２、３、５又は１０％天然のエリスロポエチンの対応する残基と異なっている。これらの変化は、Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８、Ａｓｎ８３及びＳｅｒ１２６の変化に追加されるものであってよい。好適具体例において、これらの差異は、この断片がｈＳＡと融合されたときにエリスロポエチンの生物学的活性を示すようなものである。好適具体例において、これらの差異の少なくとも１つ又はすべては、保存的アミノ酸変化である。他の好適具体例において、これらの差異の少なくとも１つ又はすべては、保存的アミノ酸変化以外である。
【０２６１】
この発明のポリペプチドは、選択的翻訳事象及び翻訳後事象の結果として生じるものを包含する。
【０２６２】
ＥＰＯの多くの類似体が、当分野で公知である。これらの変種の一次構造及び活性は、ＥＰＯａへの追加の変化(グリコシル化を改変する変化に追加される変化)の導入のための手引きとして役立つ。活性を減じるか又はグリコシル化部位を造る変化は、回避すべきである。
【０２６３】
当分野で公知のＥＰＯ類似体の幾つかを、下記の表１に略述する。
【０２６４】
【表２】

【０２６５】
ｈＳＡが好適な融合パートナーであるが、他のポリペプチドも用いることはできる。このましくは、グリコシル化を支持しないポリペプチドがある。句「グリコシル化を支持しない」は、ここで用いる場合、天然においてグリコシル化を支持しないポリペプチド及びグリコシル化を支持しないように改変されたポリペプチドをいう。例えば、この融合パートナーは、Ｉｇの可溶性断片好ましくはグリコシル化を支持しないように改変されたＩｇの可溶性断片であってよい。
【０２６６】
ここに記載の任意の具体例において、融合物のｈＳＡ部分は、他の蛋白質好ましくはＥＰＯ又はＥＰＯａの循環半減期を改善することのできる蛋白質例えば血漿蛋白質又はその断片で置き換えることができる。例えば、この融合蛋白質は、ＥＰＯａ配列が免疫グロブリンスーパーファミリーに由来する配列に融合されたＥＰＯａ−免疫グロブリン(Ｉｇ)融合蛋白質であってよい。細胞表面糖蛋白質の細胞外ドメインが免疫グロブリンの定常Ｆ(ｃ)領域と融合している幾つかの可溶性融合蛋白質構築物が開示されている。例えば、Capon等(1989)Nature 337(9):525-531は、ＣＤ４を免疫グロブリン(ＩｇＧ１)に融合させることにより一層長く続くＣＤ４類似体を生成することについての手引きを提供している。Capon等の米国特許第５，１１６，９６４号及び５，４２８，１３０号(ＣＤ４−ＩｇＧ融合構築物)；Linsley等米国特許第５，４３４，１３１号(ＣＴＬＡ４−ＩｇＧ１及びＢ７−ＩｇＧ１融合構築物)；Linsley等(1991)J.Exp.Med.174:561-569(ＣＴＬＡ４−ＩｇＧ１融合構築物)；及びLinsley等(1991)J.Exp.Med.173:721-730(ＣＤ２８−ＩｇＧ１及びＢ７−ＩｇＧ１融合構築物)も参照されたい。かかる融合蛋白質は、レセプター−リガンド相互作用を調節するのに及びイン・ビボで炎症を低減させるのに有用であることが判明している。例えば、細胞表面腫瘍壊死因子レセプター(ＴＮＦＲ)蛋白質の細胞外ドメインが免疫グロブリン定常(Ｆｃ)領域に融合した融合蛋白質は、イン・ビボで利用されてきた。例えば、Moreland等(1997)N.Engl.J.Med.337(3):141-147；及びvan der Poll等(1997)Blood 89(10):3727-3734を参照されたい。
【０２６７】
製薬組成物
ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質又は核酸を、例えば、不十分なレベルのＥＰＯ活性を特徴とする病状(ＥＰＯ活性のレベルが正常である(が、不十分である)症状及びそれが正常を下回るものを含む)を治療する(例えば、阻止し、減じ、予防し、又は改善する)のに有用な製薬組成物に組み込むことができる。
【０２６８】
好ましくは、この発明の調製物を、腎不全、慢性疾患、ＨＩＶ感染、失血若しくは癌を患っている患者又は手術前の患者に投与する。これらの組成物は、治療用の又は予防用の量の組換えにより生成したＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を製薬上許容し得るキャリアー又はトランスジェニック動物の乳汁中に含む。
【０２６９】
この製薬上許容し得るキャリアーは、これらのポリペプチドを患者に送達するのに適した任意の適合性の無毒性の物質であってよい。滅菌した水、アルコール、脂肪、ワックス及び不活性固形物をキャリアーとして用いることができる。製薬上許容し得るアジュバント、緩衝剤、分散剤等も、これらの製薬組成物中に取り込むことができる。このキャリアーは、ＥＰＯ−ｈＳＡ融合蛋白質と、注射(通常、静脈注射又は皮下注射)による又はその他の投与に適した如何なる形態で結合してもよい。静脈投与のためには、適当なキャリアーには、例えば、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ(商標)(BASF,ニュージャージー、Parsippany)又はリン酸緩衝塩溶液(ＰＢＳ)が含まれる。トランスジェニック技術により生成されたペプチド又は他の活性剤の製薬組成物中の濃度は、広範囲で変わり得る(即ち、約０．１重量％未満から、通常、少なくとも約１重量％であり、最大で２０重量％以上まで)。
【０２７０】
このＥＰＯ−ｈＳＡ融合蛋白質の静脈投与のためには、この組成物を滅菌しなければならず且つ容易に注射できる程度に流動性であるべきである。それは、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、微生物例えば細菌及びカビの汚染作用から防護されていなければならない。微生物の作用からの防護は、種々の抗菌剤及び抗カビ剤例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成することができる。多くの場合に、等張剤例えば糖類、ポリアルコール例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含有することは、好ましいことであろう。これらの注射用組成物の延長された吸収を、この組成物に、吸収を遅延させる薬剤例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有させることによってもたらすことができる。
【０２７１】
経口投与のためには、活性成分を、固形投薬形態例えばカプセル、錠剤及び粉末で、又は液体投薬形態例えばエリキシル、シロップ及び懸濁液で投与することができる。活性成分は、ゼラチンカプセルに不活性成分及び粉末キャリアー例えばグルコース、ラクトース、シュークロース、マンニトール、澱粉、セルロース又はセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ナトリウムサッカリン、タルク、炭酸マグネシウム等と共にカプセル封入することができる。所望の色、味、安定性、緩衝能力、分散又は他の公知の望ましい特徴を与えるために加えることのできる付加的な不活性成分の例は、赤酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食べられる白色インク等である。類似の希釈剤を用いて圧縮錠剤を作ることができる。錠剤とカプセルの両方とも、薬物の数時間にわたる連続的放出を与える持続放出性製品として製造することができる。圧縮錠剤は、糖衣錠にし又はフィルムでコートして不快な味をマスクし、その錠剤を環境から保護し又は胃腸管における選択的消化のために腸溶性コートをすることができる。経口投与のための液体投薬形態は、患者の許容度を増すために着色及び香料を含有することができる。
【０２７２】
鼻投与のために、これらのポリペプチドを、エアゾールとして配合することができる。用語「エアゾール」は、細気管支又は鼻気道に吸入することのできる本発明の化合物の任意の気体担持された相を包含する。特に、エアゾールは、投与量を計量する吸入器若しくは噴霧器、又はミスト機により調製できる本発明の化合物の液滴の気体担持懸濁物を包含する。エアゾールは又、例えば吸入器からの吸入治療により送達することのできる空気その他のキャリアーガスに浮遊している本発明の化合物の乾燥粉末組成物をも包含する。Ganderton及びJones,Drug Delivery to the Respiratory Tract, Ellis Horwood(1987)；Gonda(1990)Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313；及びRaeburn等(1992)J.Pharmacol.Toxical.Methods 27:143-159を参照されたい。
【０２７３】
この発明のＥＰＯ−ｈＳＡ融合蛋白質の投薬量は、特定のペプチド及びその特異的イン・ビボ活性、投与経路、医学的条件、患者の年齢、体重又は性別、患者のＥＰＯ−ｈＳＡ融合蛋白質又はビヒクル成分に対する感受性、主治医が容易に考慮することのできる他の要因に応じて、個体間で幾分か変わり得る。
【０２７４】
ＥＰＯａ−ｈＳＡは、透析溶液を含む無菌の容器で、又は塩溶液、血液、血漿、代用血液若しくは他の患者に送達すべき成分を有する無菌の容器例えばバッグで供給することができる。
【０２７５】
栄養療法剤
ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を栄養療法剤(nutraceutical)に含有させることができる。好ましくは、それは、融合蛋白質を発現するトランスジェニック哺乳動物から得られる乳汁又は乳製品を含む。それは、この融合蛋白質を発現するトランスジェニック植物から得られる植物又は植物産物を含むことができる。この融合蛋白質は、粉末又は錠剤形態で、他の公知の添加剤、キャリアー、充填剤及び希釈剤を伴って又は伴わないで供給することができる。栄養療法剤は、Scott Hegenhart, Food Product Design(1993年、12月)に記載されている。この栄養療法剤は、乳幼児用調合乳であってよい。それは、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を生成するトランスジェニック植物の成分を含有することができる。
【０２７６】
遺伝子治療
ＥＰＯａ−ｈＳＡ構築物は、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする核酸を送達する遺伝子治療プロトコールの一部分として利用することができる。
【０２７７】
核酸の細胞へのイン・ビボ導入のための好適アプローチは、ＥＰＯ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする核酸を含むウイルスベクターの利用によるものである。細胞へのウイルスベクターの感染は、標的細胞の大きな集団がその核酸を受けることができるという利点を有している。更には、ウイルスベクター内に例えばそのウイルスベクターに含まれるｃＤＮＡによってコードされる分子は、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞において効率的に発現される。
【０２７８】
レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターは、ＥＰＯ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする外因性核酸分子のトランスファーのための組換え遺伝子送達システムとしてイン・ビボで用いることができる。これらのベクターは、核酸の細胞への効率的な送達を与え、トランスファーされた核酸は、宿主の染色体ＤＮＡ中に安定に組み込まれる。複製欠損レトロウイルスだけを生成する特殊化された細胞株(「パッケージング細胞」と呼ばれる)の開発は、遺伝子治療のためのレトロウイルスの有用性を増したが、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療目的のための遺伝子トランスファーにおける利用について特性表示される(総説としては、Miller,A.D.(1990)Blood 76:271を参照されたい)。複製欠損レトロウイルスは、標的細胞への感染に用いることのできるビリオン中に、ヘルパーウイルスの利用により、標準的技術によってパッケージされ得る。組換えレトロウイルスを生成するプロトコール及びイン・ビトロ又はイン・ビボで細胞にかかるウイルスを感染させるプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,F.M.等(編)Greene Publishing Associates,(1989),9.10-9.14節及び他の標準的実験室マニュアル中に見出すことができる。
【０２７９】
他の本発明で有用なウイルス性遺伝子送達システムは、アデノウイルス由来のベクターを利用する。アデノウイルスのゲノムは、それが関心ある遺伝子産物をコードして発現するが、正常の溶菌性ウイルス生活環で複製する能力に関して不活性化されるように操作することができる。例えば、Berkner等(1988)BioTechniques 6:616；Rosenfeld等(1991)Science 252:431-434；及びRosenfeld等(1992)Cell 68:143-155を参照されたい。アデノウイルス株Ａｄ５ｄ１３２４型又は他のアデノウイルス株(例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等)に由来する適当なアデノウイルスベクターが、当業者には公知である。組換えアデノウイルスは、それらが非***細胞に感染できず、上皮細胞を含む多種類の細胞型に対する感染に利用することのできるある種の状況において有利であり得る(Rosenfeld等(1992)、前出)。その上、このウイルス粒子は、上記のように、比較的安定であり且つ精製及び濃縮しやすく、感染スペクトルに影響するように改変することができる。更に、導入されたアデノウイルスＤＮＡ(及びそれに含まれる外来ＤＮＡ)は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれずにエピソームのままであり、それにより、導入されたＤＮＡが宿主ゲノムに組み込まれる状況(例えば、レトロウイルスＤＮＡ)での挿入による突然変異誘発の結果として生じ得る潜在的問題が回避される。その上、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡの運搬能力は、他の遺伝子送達ベクターと比べて大きい(最大８キロベース)(Berkner等、前出；Haj-Ahmand及びGraham(1986)J.Virol.57:267)。
【０２８０】
ＥＰＯ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする主題のヌクレオチド配列の送達に有用な他のウイルスベクターシステムは、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)である。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製及び生産的生活環に他のウイルス(例えば、アデノウイルス又はヘルペスウイルス)をヘルパーウイルスとして必要とする天然の欠損ウイルスである。(総説としては、Muzyczka等 Curr.Topics in Micro. and Immunol.(1992)158:97-129を参照されたい)。それは、そのＤＮＡを非***細胞に組み込むことのできる少数のウイルスの１つでもあり、高頻度の安定な組込みを示す(例えば、Flotte等(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356；Samulski等(1989)J.Virol.63:3822-3828；及びMcLaughlin等(1989)J.Virol.62:1963-1973を参照されたい)。３００塩基対程の少数を含むＡＡＶのベクターは、パッケージされて組み込まれることができる。外因性ＤＮＡのためのスペースは、約４．５ｋｂに限られる。Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.5:3251-3260に記載されたようなＡＡＶベクターを用いて、ＤＮＡを細胞に導入することができる。様々な核酸が、種々の細胞型に、ＡＡＶベクターを用いて導入されてきた(例えば、Hermonat等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470；Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.4:2072-2081；Wondisford等(1988)Mol.Endocrinol.2:32-39；Tratschin等(1984)J.Virol.51:611-619；及びFlotte等(1993)J.Biol.Chem.268:3781-3790を参照されたい)。
【０２８１】
上記のようなウイルスによるトランスファー方法に加えて、非ウイルス性の方法も又、動物の組織においてＥＰＯ−ｈＳＡ融合蛋白質の発現を引き起こすために用いることができる。殆どの遺伝子トランスファーの非ウイルス的方法は、哺乳動物細胞が巨大分子を取り込んで細胞内を輸送するために用いる正常の機構に依存する。好適具体例において、本発明の非ウイルス性遺伝子送達システムは、主題のヌクレオチド分子の標的細胞による取り込みのためのエンドサイトーシス経路に依存している。この型の典型的な遺伝子送達システムには、リポソーム送達システム、ポリリジン結合体及び人工的ウイルスエンベロープが含まれる。
【０２８２】
典型的具体例において、ＥＰＯ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする核酸分子は、表面に正電荷を有して(適宜)標的組織の細胞表面抗原に対する抗体で標識した(Mizuno等(1992)No Shinkei Geka 20:547-551；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６３０９；日本国特許出願１０４７３８１；及び欧州特許公開ＥＰ−Ａ−４３０７５)リポソーム(例えば、リポフェクチン)に閉じ込めることができる。
【０２８３】
ＥＰＯ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする遺伝子のための遺伝子送達システムは、幾つもの方法の内の何れかによって患者に導入することができる。例えば、この遺伝子送達システムの製薬調製物を、例えば静脈注射によって全身に導入することができ、標的細胞における蛋白質の特異的形質導入が、主として、遺伝子送達ビヒクルにより与えられるトランスフェクションの特異性、レセプター遺伝子の発現を制御する転写調節配列による細胞型若しくは組織型発現、又はこれらの組合せから生じる。他の具体例において、組換え遺伝子の初期の送達は、動物への導入(全く局所的である)に一層限られている。例えば、遺伝子送達ビヒクルを、カテーテル(米国特許第５，３２８，４７０号参照)又は定位的注射(例えば、Chen等(1994)PNAS 91:3054-3057)により導入することができる。
【０２８４】
この遺伝子治療用構築物の製薬調製物は、本質的に、許容し得る希釈剤中の遺伝子送達システムよりなってよく、又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれたゆっくり放出するマトリクスよりなってよい。この融合蛋白質が組換え細胞(例えば、レトロウイルスベクター)から無傷で生成され得るならば、この製薬調製物は、この融合蛋白質を生成する少なくとも１つの細胞を含むことができる。
【０２８５】
他の具体例
他のトランスジェニック動物
ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、様々なトランスジェニック動物から発現させることができる。トランスジェニックブタの作製のためのプロトコールは、White及びYannoutsos, Current Topics in Complement Research: 64th Forum in Immunology, 88-94頁；米国特許第５，５２３，２２６号；米国特許第５，５７３，９３３号ＰＣＴ出願ＷＯ９３／２５０７１；及びＰＣＴ出願ＷＯ９５／０４７４４に見出すことができる。トランスジェニックマウスの生成のためのプロトコールは、米国特許第５，５３０，１７７号に見出すことができる。トランスジェニックラットの生成のためのプロトコールは、Bader及びGanten, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology,前出、3:S81-S87,1996中に見出すことができる。トランスジェニックウシの生成のためのプロトコールは、Transgenic Animal Technology, A Handbook,1994,Carl A.Pinkert編,Academic Press,Inc.中に見出すことができる。トランスジェニックヒツジの生成のためのプロトコールは、Transgenic Animal Technology, A Handbook,1994,Carl A.Pinkert編,Academic Press,Inc.中に見出すことができる。トランスジェニックウサギの生成のためのプロトコールは、Hammer等 Nature 315:680-683,1985及びTaylor及びFan, Frontiers in Bioscience 2:d298-308,1987中に見出すことができる。
【０２８６】
この発明の具体例を、下記の実施例により更に説明するが、これらは、制限するものと解釈すべきではない。この出願中で引用されたすべての引用文献(参考文献、発行された特許、公開された特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む)の内容を、はっきりと、本明細書中に参考として援用する。
【０２８７】
実施例
実施例１：ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合構築物
ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合物において用いられるヒトエリスロポエチン類似体をコードするｃＤＮＡをデザインし、遺伝子工学処理してグリコシル化の３つのＮ結合及び１つのＯ結合部位(それぞれ、残基２４、３８、８３及び１２６)を変化させた。その上、残りのアミノ酸残基を変えることなく、コドン使用量を乳腺蛋白質コドン使用量テーブルを用いて変化させてトランスジェニック動物の乳汁における蛋白質発現を最大化した。これらの融合構築物の図式表示は、図１に略記してある。ｈＳＡが融合蛋白質のＮ末端側半分である場合には、ｈＳＡシグナルペプチドを無傷で残し、ヒトエリスロポエチン類似体のシグナルを削除した。ヒトエリスロポエチン類似体が融合物のＮ末端側半分である場合には、そのシグナル配列を無傷で残し、ｈＳＡ蛋白質のそれを削除した。最初の場合には、野生型ｈＳＡ停止コドンも除去し、第２の構築物中のヒトエリスロポエチン類似体ｃＤＮＡのそれも除去した。加えて、リンカー蛋白質(Ｓｅｒ−Ｇｌｙ₄)₄即ちヒンジをこれらの２つの融合パートナーの間に置いて、ｈＳＡがこの分子のＥＰＯ部分に及びその後の活性に対して有し得る如何なる抑制性の拘束をも最小化した。
【０２８８】
これらのｃＤＮＡ融合構築物を、組織培養物及びトランスジェニックマウスの乳腺における発現のための適当なベクター中に置いた。これらの構築物を、組織培養物(ＣＯＳ７細胞)中で一時的に発現させることにより、これらのｃＤＮＡ融合物の生成物の重要な特徴の幾つかを試験することができる。例えば(１)これらの蛋白質が生成されて分泌されるか？(２)これらの蛋白質は、忠実に作られていて、ＥＰＯａ及びｈＳＡに対する抗血清により認識可能であるか？(３)これらの蛋白質は、イン・ビトロ及びイン・ビボで生物活性を有するか？
【０２８９】
実施例２：ＣＯＳ７細胞トランスフェクション／ウエスタンブロット分析
ＣＯＳ７細胞を、融合ｃＤＮＡ構築物により一時的にトランスフェクトした(三連のプレートで又はベクター(ｐｃＤＮＡ３)のみを有する単一プレートで)。トランスフェクションの２４時間後に、培地を低血清培地(Optimem)で置き換えた。５日後に、すべての培地を収穫して夾雑細胞を遠心分離により除去した。調整培地の試料を、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティングにより分析した(図２参照)。
【０２９０】
ＨＩＰ／ｐｃＤＮＡ３構築物又はｐｃＤＡ３のみ(擬似)でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の上清を、ヒト血清アルブミンに対するポリクローナル抗体(α−ｈＳＡ)を用いる免疫ブロッティングにより分析した。このｈＳＡ抗体を用いる分析の後に、そのブロットを条片化してヒトエリスロポエチンに対するモノクローナル抗体(α−ｈＥｐｏ)を用いて再分析した。このゲルに次のようにロードした：レーン１、１０ｎｇｈＳＡ標準；レーン２、１０μｌ擬似ＣＭ；レーン３−５、１０μｌｈＳＡ−ｈＥｐｏＣＭ；レーン６−８、１０μｌｈＥｐｏ−ｈＳＡＣＭ。
【０２９１】
ウエスタンブロッティング実験の結果は、可溶性の分泌される蛋白質が生成されることを明らかに示している。両融合蛋白質は、適当な予想される大きさ(約８９ｋＤａ)である。ｈＳＡ抗体ブロットにおける調整培地のレーンに見られるバンドは、ｈＳＡ(約６６ｋＤａ)ではなくｂＳＡである(この抗体が、用いた組織培養培地中に見出されたｂＳＡと幾らか交差反応性を有するので)。しかしながら、最も重要なことには、これら２つの抗体の両融合蛋白質を認識する能力がある。これは、完全な融合物ｍＲＮＡの適当な翻訳が達成されて、完全で且つ抗体に受け入れられる適当なエピトープが残ったことを示唆している。
【０２９２】
実施例３：生物活性
上記のウエスタンブロットアッセイで用いたのと同じα−ｈＳＡ抗体を用いてＥＬＩＳＡを行って、これら２つの融合蛋白質の組織培養上清中の濃度を測定した。ウエスタンブロットの結果と一致して、このＥＰＯａ−リンカー−ｈＳＡ融合蛋白質は、ｈＳＡ−リンカー−ＥＰＯａ融合蛋白質より約４倍高レベルで作られることが示された(それぞれ、２３２ｎｇ／ｍｌ対５９ｎｇ／ｍｌ)。これらのレベルは、イン・ビトロ及び多分イン・ビボの生物活性を評価するのに十分な生成物を与えるであろう。もしこの融合蛋白質のＥＰＯａ画分がこの分子の全体の大きさの２０％であるならば、２３２ｎｇ／ｍｌは、約１０Ｕ／ｍｌのｈＥｐｏ−ｈＳＡ融合蛋白質を表す[(２．１×１０⁵Ｕ／ｍｇ)２．３２×１０^-4ｍｇ／ｍｌ)(０．２)＝９．７Ｕ／ｍｌ]。イン・ビトロのＥＰＯａ活性は、Ｅｐｏ応答性細胞株を用いて評価されよう。簡単にいえば、細胞を２２〜２７時間にわたって、増大する量の組換えＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質とインキュベートして、細胞の生長を[³Ｈ]チミジンの取り込みにより又は比色ＭＴＴアッセイ(Sigma)により測定する。
【０２９３】
ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質は、よく特性決定されているｈＳＡの結合特性を利用するカチオン交換クロマトグラフィーを用いて、迅速に殆ど均質にまで精製することができる。融合蛋白質は、必要ならば濃縮してマウスで試験することができる。マウスに融合蛋白質を皮下注射して(できるだけ少量の３×５０ｎｇ／マウス、全ＥＰＯａ)、網状赤血球数又は赤血球容積レベルの変化を測定することにより応答を検出することができる。ｐｃＤＮＡ３ベースのプラスミドＤＮＡの高濃度(＞１００μｇ)での直接的筋肉注射とその後の網状赤血球及び赤血球容積レベルの変化のモニターは、イン・ビボアッセイとして利用できる。プラスミドの注射は、サイトメガロウイルスプロモーター(ＣＭＶ)から発現される野生型ｈＥｐｏｃＤＮＡを用いた場合には、マウスにおける赤血球容積レベルを有意に上げることが示されている。
【０２９４】
実施例４：エリスロポエチン類似体−ヒト血清アルブミン ( ＥＰＯａ−ｈＳＡ ) 融合蛋白質構築物の生成
ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードするｃＤＮＡを、ヤギベータ−カゼイン遺伝子の調節エレメントを含むＢＣ３５５ベクターに導入して、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質配列を乳汁特異的プロモーターの制御下に有するトランスジーンを造った。この構築物を用いて、トランスジェニック哺乳動物の泌乳乳腺に対してＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質発現を狙った。
【０２９５】
実施例５：トランスジェニックマウスにおける遺伝子構築物の試験及び特性決定 トランスジーン構築物を、一般に、マウスモデル系で試験して、それらの高レベルの発現を指示する能力及び組織特異的様式で発現させる能力を評価する。トランスジェニックマウスを、乳腺に対してＥＰＯａ−ｈＳＡ融合物の発現を狙って生成した。
【０２９６】
トランスジェニックマウスを、マウス胚に融合蛋白質をコードするＤＮＡ構築物をマイクロインジェクションすることにより生成した。ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質トランスジェニックマウスの乳汁のウエスタン分析を、モノクローナル抗ＥＰＯ又は抗ｈＳＡ抗体を用いて行って、どの動物がＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を乳汁中に発現するかを測定した。検出されたＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質のレベルは、約０．２〜４ｍｇ／ｍｌに及んだ。
【０２９７】
実施例６：トランスジェニックマウスにおけるＥＰＯａ−ｈＳＡの生物活性
ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質の生物活性を、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を発現するトランスジェニックマウスの赤血球容積レベルの変化を測定することにより分析した。表１参照。これらのトランスジェニックマウスの赤血球容積レベル(６５５−１−８、６５５−１−１６、６５５−１−４３)を、対照用マウス(ＣＤ１マウス)のレベルと比較した。正常の赤血球容積レベルは、約５０である。
【０２９８】
【表３】

【０２９９】
表Ｉに示したように、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質のトランスジェニックマウスにおける発現は、それらのマウスにおいて赤血球容積を有意に増した。
【０３００】
加えて、表ＩＩは、これらの創出トランスジェニックマウスの処女子孫の赤血球容積レベル及び創出雄についての赤血球容積レベル(６７８−１−１１及び６７８−１−２３)を与え、これらのマウスにおけるＥＰＯａ−ｈＳＡの発現及びＥＰＯａ−ｈＳＡの生物活性を示している。
【０３０１】
【表４】

【０３０２】
この子孫の赤血球容積レベルは、カゼインプロモーターの制御下のＥＰＯａ−ｈＳＡの発現の基底レベルを与える。表ＩＩに示したように、たとえ低いＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質の発現レベルであっても、有意のイン・ビボ効果を有している。
【０３０３】
実施例７：トランスジェニックヤギの生成及び特性決定
下記の数節は、トランスジェニックヤギの作製における主要なステップを簡単に記載している。
【０３０４】
ヤギの種及び品種：
スイス起源のヤギ例えばAlpine、Saanen及びToggenburg産のヤギが、トランスジェニックヤギの作製に好適である。
【０３０５】
ヤギの過剰***：
ドナーの発情の時間的調節を、０日目に、６ｍｇの皮下ノルゲストメット耳インプラント(Syncromate-B, CEVA Laboratories, Inc., Overland Park, KS)により同期させる。プロスタグランジンを、最初の７〜９日後に投与して、内因性プロゲステロンの合成を止める。インプラントの挿入後１３日目に開始して、全部で１８ｍｇの濾胞刺激ホルモン(ＦＳＨ Schering Corp.,Kenilworth,NJ)を、１日２回の注射で３日間にわたって筋肉内に与える。インプラントを１４日目に取り出す。インプラントを取り出してから２４時間後に、これらのドナー動物を２日間にわたって繁殖力のある雄と数回交配させる(Selgrath等、Theriogenology,1990.p.1195-1205)。
【０３０６】
胚の収集：
胚の収集のための外科手術は、繁殖後第２日目(又はインプラント除去後７２時間)に起きる。過剰***させたヤギには、手術前３６時間は、餌と水を与えない。ヤギに、０．８ｍｇ／ｋｇのジアゼパム(Valium(登録商標))ＩＶを投与してから、直ちに５．０ｍｇ／ｋｇのケタミン(Keteset)ＩＶを投与する。ハロタン(２．５％)を、手術中、２Ｌ／分酸素で気管内チューブにより投与する。生殖管を、腹壁切開により体外に出す。黄体、直径が６ｍｍより大きい未破裂濾胞及び卵巣嚢胞を計数して、過剰***の結果を評価し且つ卵管のフラッシュにより収集されるべき胚の数を予想する。カニューレを卵管の口に置き、３．０プロレンの単一の一時的結紮により保持する。２０ゲージの針を子宮内に、子宮卵管接合部から約０．５ｃｍの位置に置く。１０〜１２ｍｌの無菌リン酸緩衝塩溶液(ＰＢＳ)を、カニューレを通して卵管中にフラッシュさせてペトリ皿中に集める。この手順を、反対側について反復してから、生殖管を胴体内に戻す。閉じる前に、１０〜２０ｍｌの無菌食塩水グリセロール溶液を腹腔内に注入して癒着を防止する。白線を、２．０ポリジオキサノン又はスプラミドの単一中断縫合により閉じて皮膚を無菌の傷クリップで閉じる。
【０３０７】
ヤギの受精卵を、実体顕微鏡により、ＰＢＳ卵管フラッシュから集め、次いで、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)(Sigma社より購入)を含有するハムのＦ１２培地(Sigma、ミズーリ、St.Louis)中で洗う。前核が見える場合には、これらの胚に直接マイクロインジェクションを行う。もし前核が見えないならば、これらの胚を、５％ＣＯ₂を空気中に含む加湿ガスチャンバー中で、１０％ＦＢＳを含有するハムのＦ１２中に３７℃で短い培養期間にわたって、前核が見えるようになるまで置くことができる(Selgrath等、Theriogenology,1990.p.1195-1205)。
【０３０８】
マイクロインジェクション手順：
一細胞期のヤギ胚を、ホールスライドガラス上の油下の小滴培地中に置く。２つの可視的前核を有する受精卵を、Normarskiオプティクスを用いる固定ステージを有するZeiss直立顕微鏡上のフレームポリッシュトホールディングマイクロピペット上に固定する。前核に、関心あるＤＮＡ構築物例えばヤギベータカゼイン遺伝子の調節エレメントに操作可能に結合されたヒトエリスロポエチン類似体−ヒト血清アルブミン(ＥＰＯａ−ｈＳＡ)融合蛋白質遺伝子を含むＢＣ３５５ベクター(インジェクション用緩衝液(トリス−ＥＤＴＡ)中)を、細いガラス極微針を用いてマイクロにジェクションする(Selgrath等、Theriogenology,1990.p.1195-1205)。
【０３０９】
胚発生
マイクロインジェクション後、生存胚を、１０％ＦＢＳを含有するハムのＦ１２培養物中に置き、次いで、３７℃の空気中に５％ＣＯ₂を含む加湿ガスチャンバー中でレシピエント動物が胚トランスファーのために調製されるまでインキュベートする(Selgrath等、Theriogenology,1990.p.1195-1205)。
【０３１０】
レシピエントの準備
レシピエント動物における発情の同期化を、６ｍｇのノルゲストメット耳インプラント(Syncromate-B)により誘導する。インプラントの挿入後１３日目に、これらの動物に、Sigma社から購入した妊娠雌ウマ血清ゴナドトロピン(ＰＭＳＧ)の単一の非過剰***注射(４００Ｉ．Ｕ．)をする。レシピエント雌を精管切除した雄と交配させて発情同期性を確実にする(Selgrath等、Theriogenology,1990.p.1195-1205)。
【０３１１】
胚トランスファー：
一匹のドナー雌からのすべての胚を一緒に保ち、可能であれば一匹のレシピエントにトランスファーする。この外科手術手順は、上記の胚の収集のために概説したものと同じである(但し、卵管にカニューレを入れず、胚を、ガラスマイクロピペットを使って、ふさ状へりから卵管の内腔に１０％ＦＢＳを含有する最少容量のハムＦ１２にてトランスファーする)。卵巣に６〜８より多くの***点を有する動物は、レシピエントとして不適当であると認められる。切開を閉じて術後のケアを行うのは、ドナー動物についてと同じである(Selgrath等、Theriogenology,1990.p.1195-1205)。
【０３１２】
妊娠及び分娩のモニター
持続的発情の最初の日から４５日後に、超音波検査法によって妊娠を測定する。１１０日目に、第２の超音波検査を行って妊娠を確認し、胎児の重みを評価する。１３０日目に、妊娠レシピエントヤギに、破傷風毒素及びクロストリジウムＣ＆Ｄのワクチン接種をする。セレン及びビタミンＥ(Ｂｏ−Ｓｅ)を与え(ＩＭ)、及びイベルメクチンを与えた(ＳＣ)。これらの雌ヤギを１４５日目に清潔な畜舎に移し、約１４７日目に分娩を誘導する前にこの環境に順応させる。１４７日目に、分娩を、４０ｍｇのＰＧＦ２ａ(Ｌｕｔａｌｙｓｅ(登録商標)、ミシガン、 Kalamazoo、Upjohn社)を用いて誘導する。この注射を２回行い(ＩＭ)、１回目は、２０ｍｇの投与量で、その４時間後に、２０ｍｇを投与する。この雌ヤギを、１４７日目の最初のＬｕｔａｌｙｓｅ(登録商標)注射の後に、昼夜定期的な監視下に置く。監視を２日目の朝から３０毎に増やす。分娩は、最初の注射から３０〜４０時間後に起きた。分娩後、この雌ヤギから搾乳して初乳を集め、胎盤の排出を確認する。
【０３１３】
Ｆ ₀ 動物のトランスジェニック特性の確認
トランスジェニックＦ₀動物をスクリーニングするために、如何なるモザイクトランスジェニックをも見逃さないように２つの異なる細胞株からゲノムＤＮＡを単離する。モザイク動物を、各細胞にトランスジーンの少なくとも１コピーを有しない任意のヤギと定義する。それ故、耳組織試料(中胚葉)及び血液試料を、２日齢のＦ₀動物からゲノムＤＮＡの単離のために採取する(Lacy等、A Laboratory Manual, 1986, Cold Spring Harbor, NY；及びHerrmann及びFrischauf, Methods Enzymology, 1987.152:p.180-183)。これらのＤＮＡ試料を、ヒトＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質遺伝子に特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(Gould等、Proc.Natl.Acad.Sci.,1989.86:p.1934-1938)により、及びランダムプライムされたＥＰＯ又はｈＳＡｃＤＮＡ(Feinberg及びVogelstein, Anal.Bioc.,1983.132:p.6-13)を用いるサザーンブロット分析(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.,1980.77:5201-5205)によって分析する。アッセイの感度は、体細胞の１０％中のトランスジーンの１コピーの検出が可能と見積もられている。
【０３１４】
生成集団の生成及び選択
上記の手順を、トランスジェニック創出(Ｆ₀)ヤギ並びに他のトランスジェニックヤギの生成のために利用することができる。トランスジェニックＦ₀創出ヤギは、例えば、雌であれば、乳汁生産用に繁殖され、雄の創出動物であれば、雌のトランスジェニック子孫を生成するために繁殖される。このトランスジェニック創出雄動物を非トランスジェニック雌と交配させて雌のトランスジェニック子孫を生成することができる。
【０３１５】
トランスジーン及び適当な特性の伝達
このヤギ系統における関心あるトランスジーンの伝達を、耳組織及び血液において、ＰＣＲ及びサザーンブロット分析により分析する。例えば、この創出雄及びその３匹のトランスジェニック子孫のサザーンブロット分析は、世代間で再配列又はコピー数の変化のないことを示している。これらのサザーンブロットは、ヒトＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質ｃＤＮＡプローブを用いて調べる。これらのブロットを、Ｂｅｔａｓｃｏｐｅ６０３で分析し、コピー数はこのトランスジーンのヤギベータカゼイン内因性遺伝子との比較により測定する。
【０３１６】
発現レベルの評価
このトランスジェニック蛋白質のトランスジェニック動物の乳汁中での発現レベルは、酵素的アッセイ又はウエスタンブロットにより測定する。
【０３１７】
他の具体例は、請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合構築物の図式表示である。アスタリスクは、天然のヒトエリスロポエチンのグリコシル化部位を示している。
【図２】 ＥＰＯａ−ｈＳＡｃＤＮＡ構築物により一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞のウエスタンブロット分析を描写した写真である。

Claims (46)

1. ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質であって、この融合蛋白質のＥＰＯａ部分のアミノ酸残基Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８、Ａｓｎ８３並びにＳｅｒ１２６を変化させて、ＥＰＯにおけるグリコシル化部位として働く部位がこのＥＰＯａにおいてはグリコシル化部位として働かないようにした上記のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
2. 下記式を有する、請求項１に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質：
   Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１；又はＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１
   (式中、Ｒ１は、エリスロポエチン類似体アミノ酸配列であり；Ｌは、ペプチドリンカーであり、そしてＲ２は、ヒト血清アルブミンアミノ酸配列である)。
3. Ｒ１及びＲ２が、前記のペプチドリンカーにより共有結合で結合された、請求項２に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
4. グリコシル化のための付着点として働くアミノ酸残基を欠失させた、請求項１〜３いずれか１項に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
5. グリコシル化部位として働くヒトＥＰＯのアミノ酸残基がグリコシル化部位として働かないアミノ酸残基で置換されている、請求項１〜４いずれか１項に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
6. 前記のグリコシル化部位を、少なくとも１つの更なるＮ結合グリコシル化部位で変化させた、請求項１〜５いずれか１項に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
7. 前記のグリコシル化部位がＮ結合グリコシル化を与え、アミノ酸残基ＡｓｎをＧｌｎで置き換えることにより変化させた、請求項１〜６いずれか１項に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
8. 前記のグリコシル化部位がＯ結合グリコシル化を与え、アミノ酸残基ＳｅｒをＧｌｎで置き換えることにより変化させた、請求項１〜７いずれか１項に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
9. アミノ酸残基２４、３８又は８３の少なくとも１つをＧｌｎで置き換えた、請求項１〜８いずれか１項に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
10. 前記のアミノ酸残基１２６をＡｌａで置き換えた、請求項１〜９いずれか１項に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
11. アミノ酸残基Ａｓｎ２４、Ａｓｎ３８、Ａｓｎ８３及びＳｅｒ１２６の各々を、それぞれ、Ｇｌｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｎ及びＡｌａで置き換えた、請求項１〜１０いずれか１項に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
12. 前記のペプチドリンカーが、１０〜３０アミノ酸長である、請求項２〜９いずれか１項に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
13. 前記のペプチドリンカー中の前記のアミノ酸の各々を、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ及びＡｌａよりなる群から選択する、請求項１２に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
14. 前記のペプチドリンカーが、式(Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ)_y(式中、ｙは１〜８の整数である)を有する配列を含む、請求項２〜１３いずれか１項に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
15. 前記のペプチドリンカーが、式(Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏを有する配列を含む、請求項１４に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
16. ＥＰＯａが、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである、請求項１〜１５いずれか１項に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
17. Ｎ末端からＣ末端へ、アミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａ、ペプチドリンカー及びヒト血清アルブミンを含む、請求項１に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
18. ＥＰＯａが、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである、請求項１７に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
19. Ｎ末端からＣ末端へ、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯ、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー及びヒト血清アルブミンである、請求項１に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
20. Ｎ末端からＣ末端へ、ヒト血清アルブミン、ペプチドリンカー及びアミノ酸残基Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３及びＡｌａ１２６を含むＥＰＯａを含む、請求項１に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
21. ＥＰＯａが、Ｇｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである、請求項２０に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
22. Ｎ末端からＣ末端へ、ヒト血清アルブミン、式((Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ)₃−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ)を有するペプチドリンカー及びＧｌｎ２４、Ｇｌｎ３８、Ｇｌｎ８３、Ａｌａ１２６ＥＰＯである、請求項１に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
23. 請求項１のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
24. 請求項２３に記載の核酸を含む発現ベクター又は構築物。
25. 請求項２４に記載のベクター又は構築物を含む細胞。
26. 構築物又はベクター中での請求項１のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合物の製造方法であって、ＥＰＯａをコードするヌクレオチド配列を含む核酸がヒト血清アルブミンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸にイン・フレームで結合された配列を構築物又はベクター中に形成することを含む、上記の製造方法。
27. 請求項１のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質の製造方法であって、下記を含む当該製造方法：
    ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする核酸を含む細胞を準備し、そして
    該ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を該核酸から発現させ、それにより、該ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を生成する。
28. 前記の細胞を、哺乳動物、酵母、植物、昆虫又は細菌細胞よりなる群から選択する、請求項２７に記載の方法。
29. 請求項１のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質の製造方法であって、下記を含む当該製造方法：
    ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質の発現を指示するトランスジーンを含むトランスジェニック非ヒト生物を準備し；
    そのトランスジーンを発現させ；そして
    ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を回収する。
30. トランスジェニック非ヒト生物が、トランスジェニック動物である、請求項２９に記載の方法。
31. トランスジェニック非ヒト生物が、トランスジェニック乳用動物である、請求項２９に記載の方法。
32. ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質が、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において、乳汁特異的プロモーターの制御下で作られる、請求項２９に記載の方法。
33. 前記のプロモーターが、乳清蛋白質又はカゼインプロモーターである、請求項３２に記載の方法。
34. トランスジェニック哺乳動物が、ヤギである、請求項３３に記載の方法。
35. 請求項１のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をトランスジェニック哺乳動物の乳汁中に含むトランスジェニック調製物を提供する方法であって、下記を含む当該方法：
    蛋白質コード配列の乳腺上皮細胞における発現を生じるプロモーター配列に機能的に結合されたＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする配列を有するトランスジェニック哺乳動物を準備し、
    この融合蛋白質を発現させ、そしてこの哺乳動物から乳汁を得、それにより、トランスジェニック調製物を供給する。
36. 請求項１のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードするトランスジーンを含むトランスジェニック非ヒト生物。
37. トランスジェニック非ヒト生物が、トランスジェニック動物である、請求項３６に記載の方法。
38. トランスジェニック非ヒト生物が、トランスジェニック乳用動物である、請求項３６に記載の方法。
39. ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質が、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において、乳汁特異的プロモーターの制御下で作られる、請求項３６に記載の方法。
40. 前記のプロモーターが、乳清蛋白質又はカゼインプロモーターである、請求項３９に記載の方法。
41. トランスジェニック哺乳動物が、ヤギ又はウシである、請求項４０に記載の方法。
42. 請求項１の治療上有効な量のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を有する製薬組成物。
43. エリスロポエチンを必要とする患者の治療に使用される請求項１に記載のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質。
44. 請求項１のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードするトランスジーンを含むトランスジェニックウサギ。
45. 請求項１のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードするトランスジーンを含むトリ。
46. 請求項１のＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質の培養細胞における製造方法であって、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をコードする核酸を含む細胞を準備し、そのＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質をその核酸から発現させ、それにより、ＥＰＯａ−ｈＳＡ融合蛋白質を生成することを含む、上記の製造方法。

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