JPH03151399A - 変異ヒトエリスロポエチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 童呈上夏机■分！ 本発明は、エリスロポエチンのアミノ酸配列を構成する
アミノ酸の一部が欠失もしくは他のアミノ酸に置換され
た新規なエリスロポエチン及びこれをコードするＤＮＡ
に関する。

本発明によるエリスロポエチンは、エリスロポエチンと
しての活性をすべて備え、かつ高い比活性を有するため
臨床上有用である。

災来■肢歪 エリスロポエチン（以下ＥＰＯと称する）は、腎臓で生
産され、骨髄中に存在する赤血球系前駆細胞（ＣＦＵ−
Ｅ中に作用して赤血球への分化を促進する造血因子であ
る。したがって、ＥＰＯは、貧血治療に対して非常に有
効であることが知られている。

ＥＰＯは、ヒト尿中に微量に排出されており、特に再生
不良性貧血患者の尿中には高濃度にＥＰＯが含まれてお
り、これを抽出精製し、研究材料としていた。一方、近
年になり遺伝子組換え技術の発達により、生理活性を有
する蛋白質を大量に生産することが可能となり、ＥＰＯ
についてもそれをコードする遺伝子がクローニングされ
、これを利用してＥＰＯを生産することが可能となった
（Ｊａｃｏｂｓ他、「ネイチャー」（Ｎａｔｕｒｅ）　
ｖｏｌ、３１３＋８０６〜８１０〕。また、遺伝子組換
えによりＥＰＯを生産する方法は、特表昭６１−５０１
１５２号、特表昭６１−５０１６２７号、特表昭６２−
５０１０１０号、特開昭６２２６９６９７号、特開昭６
２−１９８３８号、特開昭６３−１２６４８８号および
特開昭６２−１７１６９６号等の各公報に開示されてい
る。

ＥＰＯは、分子量約３４，０００〜３９．０００の糖蛋
白質で、その分子量の約％が糖鎖で占られる特殊な糖蛋
白質である。ＥＰＯの生物活性の発現には、糖鎖の存在
が重要であると言われており、遺伝子組換えによりＥＰ
Ｏを生産する場合宿主細胞によってＩ！鎖構造が変化す
ることが後込らにより明らかにされている（Ｇｏｔｏ他
、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、６６７〜７１
．１９８８）。このように遺伝子組換えにより得られた
糖蛋白質であるＥＰＯの糖鎖構造が変化することは、先
に掲げた公開公報中には開示されていない。

遺伝子組換えＤＮＡ技術応用により生産される組換型ヒ
）ＥＰＯは、分子内に３ケ所のＮ−グリコシド型糖鎖の
結合部位および１ケ所の０−グリコシド結合部位を有し
ている。

第１図に＊で示したＡｓｎおよび（＊）で示したＳｅｒ
がそれぞれ糖鎖結合部位であることが知られている。

ＥＰＯＩ！鎖の非還元末端には、シアル酸が結合してお
り、このシアル酸を除去した場合、ＥＰＯの標的細胞（
骨髄細胞ＣＦＵ−Ｅ）表面に存在するＥＰＯレセプター
に対するＥＰＯの親和性が上昇し、その結果ＥＰＯ活性
が上昇することが知られている。しかしながら、シアル
酸を除去したＥＰＯはガラクトース残基が露出し、生体
内では、主として肝臓に存在するガラクトースと特異的
に結合するレセプターに捕獲され、速やかに分解代謝さ
れるため、活性を発揮できないという欠点があった。し
たがって、より高い活性を有するＥＰＯを貧血治療用医
薬として提供するには、ＥＰＯの標的細胞表面に存在す
るＥＰＯレセプターに対する親和性を高め、かつ結合糖
鎖の非還元末端にガラクトース残基を露出させないＥＰ
Ｏを作製することが必要である。このような糖鎖構造を
変更したＥＰＯおよびその製法は文献未載である。

■　く”しよ”と　る１ 上述したように、ＥＰＯ［鎖の構造を変えるとＥＰＯの
生物活性が変化することは知られているが、特定された
物質としては未だ得られていない。

本発明は、ＥＰＯ１ｉ鎖結合部位であるアミノ酸を他の
アミノ酸に置きかえることにより、ＥＰＯの本来持つべ
きＩ！鎖構造に存在するシアル酸末端を減少させ、かつ
ガラクトース残基の露出しないＥＰＯが得られることを
見出し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明は、糖鎖結合部位に存在するアスパ
ラギンを他のアミノ酸におきかえるか、もしくは欠失さ
せた新規なＥＰＯ及びこれをコードするＤＮＡを提供す
ることを課題とする。

量　を”°　るための 本発明においては、ＥＰＯのアミノ酸配列において糖鎖
結合部位である２４．３８．８３位のアスパラギン残基
の少くとも１個、すなわち該残基の１個、又は２個、或
は３個を欠失したか又は、他のアミノ酸に置き換えたＥ
ＰＯを得るために部位特異的ｉｎ　ｖｉｔｒｏ変異を行
う。このため、ＥＰＯをコードする遺伝子を入手する必
要がある。ＥＰＯをコードする遺伝子としては、イント
ロンを持たないｃＤＮＡとイントロンを持つ染色体ＤＮ
Ａの２種があげられるが、本発明においてはいずれのＤ
ＮＡも使用可能である。上記ｃＤＮＡは、特表昭６２−
５０１０１０号公報に開示された方法によりクローニン
グが可能である。また、染色体ＤＮＡは、後藤らの方法 （Ｇｏｔｏ他、［バイオチクノロシイＪ　（Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎ。

１ｏｇｙ）ｖｏｌ、６．６７〜７１．１９８８中に従っ
て遺伝子を得ることが可能である。また、常法により、
ヒト染色体ＤＮＡバンクから直接クローニングすること
も可能である。このＥＰＯをコードするＤＮＡをファー
ジベクターＭ１３ｍρ１９（宝酒造製中にクローニング
し、次いで、ＥＰＯ遺伝子の２４．３８．８３位に相当
するＤＮＡ配列を常法により特異的ｉｎνｉ　ｔｒ。

変異を行う。上述の該当するアミノ酸を欠失させる場合
は、当該アミノ酸に相当する塩基配列を欠失させた上記
部位を中央付近に１１ｖｅｒのオリゴヌクレチオドを合
成し、これをプライマーとして、市販の部位特異的ｉｎ
　ｖｉｔｒｏ変異キットを使用して行い得る。上記部位
特異的ｉｎ　ｖｉｔｒｏ変異キットとしてアマジャム社
製の市販キットが利用可能である。

該当するアミノ酸を他のアミノ酸に置換える場合も、該
当するアミノ酸配列に相当するコドンを置き換えるアミ
ノ酸のコドンに置きかえたプライマーを合成し、同様に
して部位特異的ｉｎ　ｖｉｔｒ。

変異を行わせることができる。本発明においては、アス
パラギンを置換する場合、蛋白質の構造に与える影響は
少なくするためグルタミンに置換しているが、目的に応
じて種々のアミノ酸に置換することが可能である。

このようにしてｉｎνｉ　ｔｒｏ変異を行ったＭ１３ｍ
ｐ１９を、大腸菌ＮＭ５２２にトランスフェクションを
行い、目的とするアミノ酸が変異した配列をもつファー
ジのプラークをＤＮＡ配列分析により検出し、変異遺伝
子をスクリーニングする。

目的とする変異配列を持った遺伝子は、制限酵素Ｂａｍ
ＨＥ　−Ｂｇｌ　ＩＩで切断し、分離し、得られた遺伝
子を哺乳動物細胞用シャトルベクターｐｚｔＰ−Ｎｅｏ
ＳＶ（Ｘ）１のＬＴＲの下流でＮｅｏ遺伝子の上流の制
限酵素ＢａｍＨＩ切断部位に挿入し、ＥＰＯ遺伝子が正
しく挿入されたものを制限酵素切断地図解析により選択
して得る。かくして得られた変異ＥＰＯ遺伝子保有ベク
ターをｐＺ　Ｉ　Ｐ−ＮｅｏＳＶ　（ＸＨ−Ｅ　Ｐ　Ｏ
（ｍ）と呼ぶ。尚、ｐＺ　Ｉ　Ｐ−Ｎｅ。

５Ｖ（Ｘ）１は、Ｃｅｐｋｏらの開発したシャトルベク
ターであり〔「セルＪ　　（Ｃｅｌｌ）　ｖｏｌ、３７
．１０５３〜１０６２（１９８４）　中に開示された方
法により得ることができる。

このようにして得た変異ＥＰＯ遺伝子を持ったプラスミ
ドを哺乳動物細胞にトランスフェクションし、得られた
変異細胞を培養することにより、培養液中に分泌される
Ｅ、Ｐ　Ｏを得る。

以下実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例 ＩＥＰｏ′　−のクローニング 後藤らの方法〔「バイオチクノロシイＪ　　（Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏ！ｏｇｙ）、ＶＯｌ、６．６７〜？１，１９
８８　中に従ってヒトＥＰＯ遺伝子をクローニングした
。

すなわち、ヒト胎児肝臓由来の染色体ＤＮＡバンクより
クローニングしたＥＰＯ遺伝子のＡｐａｌルミｌサイト
ｌｎサイトを含む遺伝子を、プラスミドベクターｐＵＣ
８の５ｅａｌ、ＥｃｏＲＩにより開裂した部位に挿入し
、ＥＰＯ遺伝子を持つベクターｐｈ　Ｅ　Ｐ　０１４０
４を得た。

■エ　スロポエチン　　　のＭ１３ｍ　１９へのクロー
ニング ９０μ２の水に溶解したプラスミドｐｈ　Ｅ　Ｐ　１４
０４（プラスミドｐＵＣ８の制限酵素ＥｃｏＲＬ　Ｓｍ
ａＩ切断部分にエリスロポエチンゲノム遺伝子の５′末
端Ａｐａｌ切断部位より下流部位２．４ｋｂの断片を挿
入したちの：大きさ５．１ｋｂ）　１３．４μｇに対し
１０倍濃度のＥｃｏＲＴ反応緩衝液（ＩＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ、ｐＨ７，５，７０＋＋Ｍ　ＭｇＣｈ、　５００
＋ｓＭ　ＮａＣ１，７０ｍＭ　２−メルカプトエタノー
ル、０．１％ウシ血清アルブミン）　１０μ２を加えた
後に、２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩを加え、３７°Ｃ
２時間反応させた。反応終了後、ＤＮＡをエタノール沈
澱により回収し、９０μ２の水に溶解し、１ＯｕｌのＢ
ａｍＨＩ反応緩衝液（１００Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐ
Ｈ８，０，７０ｍＭ　ＭｇＣｈ、ＬＭ　ＮａＣ１，２０
ｍＭ　２−メルカブトエタノール、０．１％ウシ血清ア
ルブミン）１０μｌを加えた後に２０単位の制限酵素Ｂ
ａ５ａｌを加え、３７°Ｃ２時間反応させた。反応終了
後、３．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、
２．４ｋｂのＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＴ断片（エリスロ
ポエチン遺伝子中に相当するゲルの部分を切り出し、含
まれるＤＮＡ断片を電気的に溶出させ、エタノール沈澱
後２０μｌの水に溶解し、エリスロポエチン遺伝子溶液
とした。

一方、ファージベクターＭ１３ｅ＋ｐ１９１０μｇ（９
０μｌの水に溶解）を、上記と同様にＥｃｏＲＬ　Ｂａ
＋ｓＨ１で処理した後エタノール沈澱を行い、２０μｉ
の水に溶解しベクター溶液とした。エリスロポエチン遺
伝子溶液８μ！とベクター溶液１μｌを混和し、ＤＮＡ
ライゲーションキット（宝酒造社製）のＡ液を７２μｆ
ｆｉ、Ｂ液を９μｌ加え、１６°Ｃで３０分間反応させ
た０反応液５μ２を用い５０μｌの大腸菌ＮＭ５２２コ
ンピテント細胞を１％Ｉ　ＰＴＧと１％Ｘｇａｌを含む
軟寒天を用い形質転換した。生じたプラークのうち無色
のプラークから２本鎖ファージＤＮＡを調製し、制限酵
素切断地図解析を行い、目的とするエリスロポエチン遺
伝子がＭ１３ｍｐ１９のＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩに挿
入されたものを選び出し、１本鎖ファージＤＮＡを調整
して部位特異的ｉｎ　ｖｉｔｒｏ変異の鋳型として用い
た。

部位特異的変異は、Ｎ−結合糖鎖付加の認識配列Ａｓｎ
−Ｘ−（Ｓｅｒ　ｏｒ　Ｔｈｒ）のＡｓｎコドンを糖鎖
付加のないＧｉｎコドンに置き換える方法により行った
。

すなわち、図に示すような３種のオリゴヌクレチオドを
アプライドバイオシステムズ社製ＤＮＡ自動合成装置を
用いて合成し、それぞれ、２４位、３８位、８３位のＡ
ｓｎ残基に相当するコドンをＧｌｎコドンに置き換える
部位特異的ｉｎ　ｖｉｔｒｏ変異のプライマーとして使
用した。

部位特異的ｉｎ　ｖｉｔｒｏ変異はアマジャム社製のオ
リゴヌクレチオドを用いた部位特異的ｉｎ　ｖｉｔｒ。

変異体作製システムを用いて行った。

反応終了後、大腸菌ＮＭ５２２を形質転換した。

生じたプラークから１本鎖ＤＮＡを調製し、Ｓａｎｇｅ
ｒらのｄｉｄｅｏｘｙ法によりＤＮＡ配列分析を行い、
目的とするプラークを選び出した。このようにして２４
位、３８位、８３位のＡｓｎ残基に相当するコドンをＧ
ｉｎコドンに置き換えたファージベクターＮＱ１、ＮＱ
−２、ＮＱ−３を得た。次にファージＤＮＡＮＱ−１を
鋳型として、３８位あるいは８３位のＡｓｎ残基に相当
するコドンをＧｌｎコドンに置き換えるｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏ変異、およびファージベクターＮＱ−２を鋳型として
８３位のＡｓｎ残基に相当するコドンを置き換えるｉｎ
　ｖｉＬｒｏ変異をそれぞれ行い、ファージベクターＮ
Ｑ−１２、ＮＱ−１３、ＮＱ−２３を得た。さらに、フ
ァージベクターＮ　Ｑ−１２を鋳型として８３位のＡｓ
ｎ残基に相当するコドンを置き換えるｉｎ　ｖｉｔｒｏ
変異を行い、ファージベクターＮ　Ｑ−１２３を得た。

■　　エ　スロポエチン　　　　　ベク　−の上記のよ
うにして得た７種の変異ファージベクターのそれぞれｌ
Ｏμｇを３６０μｌの水に溶解し、１０倍濃度のＢｇｌ
ＩＩ反応液（１０００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７
，５，７０ｍＭ　ＭｇＣｈ、　ＬＭ　ＮａＣｌ、　７０
ｍＭ　２−メルカプトエタノール、０．１％ウシ血清ア
ルブミン）を４０μ２加えた後にそれぞれ２０単位のＢ
ａｍＨＩ　、　Ｂｇｌ　Ｕを加えて３７°Ｃ２時間反応
させた０反応終了後、３．５％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行い、変異エリスロポエチン遺伝子を含む２
．４ｋｂのバンドを切り出し電気的に溶出させ、エタノ
ール沈澱後２０Ｉ１１の水に溶解した。

一方、発現ベクターｐＺＩＰＮｅｏｓＶ（Ｘ）１１０μ
ｇを９０ｕｌの水に溶解し、ｌＯ倍濃度のＢａｍＨ！反
応液１０ｕｌ、２０単位のＢａｎ＋ＨＩを加え、３７°
Ｃで２時間反応させ、同様に精製を行い、ベクタ溶液を
得た。

変異エリスロポエチン遺伝子溶液８μ！とベクター溶液
１μ！を混和し、前述の様にライゲージョンを行い、反
応液５μｌを用いて大腸菌ＨＢＩＯ１コンピテント細胞
５０μｌを形質転換した。

以上の操作により得たアンピシリン−カナマイシン耐性
形質転換株について、プラスミドの制限酵素切断地図解
析を行い、目的とする変異エリスロポエチン形質導入ベ
クターを有する７株の大腸菌を選択した。

これらの大腸菌から常法に従い、プラスミドを調製し、
ＤＮＡ）ランスフェクション法により下記手順で変異エ
リスロポエチン遺伝子をＢ）ＩＫ細胞（仔シリアンハム
スター腎臓細胞中に導入した。

４Ｘ１０’個のＢＨＫ細胞を６Ｃ−シャーレに播種し、
翌日、リン酸カルシウム法によりＤＮＡ）ランスフェク
シゴンを行った。すなわち、２５μｉの水に溶解した２
５Ｍｇの変異エリスロポエチン遺伝子発現ベクター、７
５μ２０２Ｍ塩化カルシウム溶液及び水５２５μｌを混
和しＡ溶液とした６次に、Ｂ溶液として、０．２８Ｍ　
ＮａＣ１を含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，１）６２
５μＮと３５＋ｗＭ　ＮａＨｔＰＯｎと３５１Ｍ　Ｎａ
ＨＰＯａ１２．５μｌを混合した。Ｂ溶液をはげしく攪
拌しながら、これにＡ溶液を徐々に滴下し、ＤＮＡをリ
ン酸カルシウムと共沈し、室温で３０分間放置すること
により沈澱を生長させた。

上記のように調製したＤＮＡ−リン酸カルシウム液０．
４１ｄを先に調製したＢＨＫ細胞の培養液（Ｂａｓａｌ
　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ（Ｂ　Ｍ　Ｅ）＋ｌＯ％Ｃ
３＋１０％Ｔｒｙｐｔａｓｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂ
ｒｏｔｈ）　Ｊ　ｙｔｌ中に添加し１８時間ＣＯｔイン
キエベーター内で培養した。

得られた培養液に２５％グリセロールを含むＰＢＳ溶液
０．４ｍを加え、２分間放置した後、ＢＭＥ溶液で３回
洗浄後、４１１１ｉ！の上記培養液を加えＣＯ□インキ
ュベーター内で更に培養を行った。１日後、シャーレ５
枚に播種しなおしく１１５５ｐｌｉｔ）、さらに翌日か
ら４００ｄｇｅｍの０４１８を含む培養液に取り換え、
その後適時培養液を交換し、２週間培養を行い０４１８
耐性細胞のコロニーを選択した。

コロニーの生じたシャーレの培養液を除き、ＰＢＳで洗
浄後、２５Ｍｇ／ｍのトリプシンを含ませた濾紙片をコ
ロニーの上に乗せ、１〜２分後、濾紙をはがし、・濾紙
についた細胞を２４穴プレート中で培養した。各ウェル
の培養上清中のエリスロポエチン活性をエンザイムイム
ノアッセイ法により測定し、エリスロポエチン活性の高
い細胞を選出した。

■　　工１スロボエチンの　　と　　　　　０の星製 上記のようにして得た、７種の変異エリスロポエチン遺
伝子をそれぞれ導入した細胞１．５Ｘ１０’個を１７０
ｃ＋ｄのＴ−フラスコ４個に播種し、培養液（ＢＭＥ＋
１０％Ｃ３＋１０％ＴＰＢ）（３（ｌｄ／フラスコ）を
用いて３日間培養した後、培養液をＢＭＥ＋２％Ｃ３に
交換した。その後３日毎に培養液を集めた。

得られた培養法名ＩＩ！、を温度管理下（５〜１０℃中
において、限外濾過装置を用いて分子！１１万上の百分
を濃縮し、蒸留水を加え脱塩し、凍結乾燥した。乾燥粉
末を少量のＰＢＳ　（リン酸塩緩衝食塩水中に溶解した
後、大量のＰＢＳに対し透析を行った。透析膜内液を遠
心し、生じた沈澱を除き、モノクローナル抗体ヒトエリ
スロポエチン抗体をＡｆｆｉ−Ｇｅｌ　１０に吸着させ
て作成した抗体吸着カラム（抗体吸着量：　１５ｍｇ／
ａｆＡｆｆｉ−Ｇｅｌ　１０　；　１．３ｃｍＸ１．５
ｃ−床容量２ｄ中に通した。次に、ＰＢＳ　１５０ｄと
０．５Ｍ　ＮａＣ１を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７，４）３０ｄ、０．１５Ｍ　ＮａＣ１３０ａｔの順で
カラムを洗浄後、０．２Ｍ酢酸と０．１５Ｍ　ＮａＣｌ
の混合液を流し、変異エリスロポエチンを溶出させた。

溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、溶出部分を集め
３．４ＭトＩＪス溶液を適量加え中和した後、セントリ
カットミニ（クラボウ社製、分画分子量１万）を用いて
！縮した。

各変異エリスロポエチンの回収量と回収率は表１のとお
りであった。

表 ■ 上述のようにして得た変異エリスロポエチンの活性をエ
リスロポエチン依存性細胞であるＥＰ−ＥＤＣ−Ｐ２を
用いたＭＴＴアッセイによる１ｎｖｉｔｒｏバイオアツ
セイで測定した。表２に最大エリスロポエチン活性のＡ
の活性を示す各変異エリスロポエチンの濃度を示した。

表 以上のように変異エリスロポエチンの大半は未変異の組
み換え型ユリスロポエチンに比べて高い活性を示した。

特にＮＱ１３では約４倍の活性上昇が見られた。

光尻皇須来 本発明により、新規なアミノ酸配列を持ったヒ）ＥＰＯ
変異体およびこれをコードする遺伝子を得ることが可能
となる。

また、本発明により得られるＥＰＯは、天然のＩＪ！鎖
を持つＥＰＯと比較し、高い生物活性を有する利点があ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図はＥＰＯの全アミノ酸配列を示す。なお、図中の
＊に相当するＡｓｎが本発明による変異蛋白質では欠失
又は他のアミノ酸に置換される。 第２図はＥＰＯ遺伝子のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓに使用するブライマーの構造を示す。 第３図はＥＰＯ遺伝子の変異した配列を持つベクターの
構築を示す。 第４図は変異ＥＰＯ遺伝子の発現ベクターの構築を示す
。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列において、
   Ｎ末端から２４番目、３８番目、ならびに８３番目に存
   在する３個のアスパラギンの少くとも１個が欠失してい
   るか又は、他のアミノ酸で置換されていることを特徴と
   する新規なヒトエリスロポエチン。
2. （２）置換したアミノ酸がグルタミンである請求１中に
   記載のエリスロポエチン。
3. （３）ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列においてＮ
   末端から２４番目、３８番目、ならびに８３番目に存在
   する３個のアスパラギンの少くとも１個が欠失している
   か又は、他のアミノ酸で置換されているヒトエリスロポ
   エチンをコードするＤＮＡ。
4. （４）置換したアミノ酸がグルタミンであるエリスロポ
   エチンをコードする請求項（３）に記載のＤＮＡ。