KR20020039346A - 서브유니트가 최적화된 융합 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 융합 단백질이 제1일원 및 제2일원을 보유하며, 제1일원 및 제2일원은 융합단백질이 다량체 형태의 제2일원의 활성을 최적화시키는 다수의 서브유니트를 보유하는 복합체로 조립하도록 선택되는 것이 특징인 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
Description
융합 단백질은 구별되는 단백질들의 유용한 특성을 결합할 수 있다. 예를들면, 융합 단백질은 항체 분자의 표적화 특성을 독소의 세포독성 효과와 결합시킬 수 있다.
관련 출원
본 출원은 본 명세서에 인용되고 1998. 9. 18.에 출원된 가출원 제60/101,083호의 우선권을 주장한다.
본 발명은 제1일원 및 제2일원을 보유하는 융합단백질에 관한 것으로, 여기서 융합 단백질의 제2일원은 다량체로 조립되고, 다른 일원은 제2일원이 예정된 수 또는 최적의 수의 서브유니트로 조립되는 것을 촉진시키도록 선택 또는 수정된다.
도 1A는 인간화된 항-태아성 암 항원 항체 431의 경쇄(LC)의 지놈성 서열을 함유하는 구조물의 도식적인 개략도이다. 신호 펩티드 서열(들)의 위치 및 경쇄 가변 영역(Vk) 및 Ck 영역의 위치도 표시되어 있다. 제한 효소의 위치도 표시되어 있다.
도 1B는 인간화된 항-태아성 암 항원 항체 431의 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도시한다. 제한 효소의 위치도 표시되어 있다.
도 2는 인간화된 항-태아성 암 항원 항체 431의 경쇄의 암호화 서열을 함유하는 Sal I 삽입체에 대한 뉴클레오티드 서열을 도시한다.
도 3은 인간화된 항-태아성 암 항원 항체 431의 경쇄의 암호화 서열을 함유하는 Sal I 삽입체를 포함하는 구조물(Bc 458)의 도식적인 개략도이다. 또한 침묵인자(silencer), 5'β-카제인 비번역 영역, 경쇄 암호화 영역 및 3'β-카제인 비변역 영역의 위치가 표시되어 있다.
도 4A는 β-글루쿠로니다제 서열에 연결된 인간화된 항-태아성 암 항원 항체 431의 중쇄(HC)의 지놈성 서열을 함유하는 구조물의 도식적인 개략도이다. 신호 펩티드 서열(들)의 위치 및 중쇄 가변영역(Vh) 및 CH1 영역의 위치도 표시되어 있다. 제한 부위 효소의 위치도 표시되어 있다.
도 4B는 인간화된 항-태아성 암 항원 항체 431의 중쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도시한다. 제한 효소의 위치도 표시되어 있다.
도 5는 인간화된 항-태아성 암 항원 항체 431의 돌연변이체 중쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도시한다. 돌연변이체 중쇄는 힌지 영역이 결여되어 있다. 제한 효소 부위의 위치가 표시되어 있다.
도 6은 β-글루쿠로니다제 서열에 연결된 인간화된 항-태아성 암 항원 항체 431의 돌연변이체 중쇄를 포함하는 구조물(Bc 454)의 도식적인 개략도이다. 또한, 침묵인자, 5'β-카제인 비번역 영역, 중쇄 돌연변이체/β-글루쿠로니다제 융합체 암호화 영역 및 3'β-카제인 비변역 영역의 위치가 표시되어 있다. 제한 효소 부위의 위치도 표시되어 있다.
도 7은 중쇄 돌연변이체의 구조물의 개요도이다.
도 8은 β-글루쿠로니다제에 대한 돌연변이를 확대한 도면이다.
발명의 요약
일반적으로, 본 발명은 제1일원, 예를들면 표적화 부분, 예컨대 면역글로불린 서브유니트(예, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 또는 이들의 단편) 그리고 이에 융합된 제2일원, 예를들면 효소, 예컨대 독소(예, 효소 또는 독소 서브유니트)를 보유하는 융합 단백질의 제법을 특징으로 한다. 제1일원 및 제2일원은 융합단백질이 다량체 형태의 제2일원의 활성을 최적화시키면서 다수의 서브유니트를 보유하는 복합체로 조립되도록 선택된다. 바람직한 구체예에서 제1일원 또는 융합 단백질은 활성 형태(예, 천연 형태)의 제2일원에 존재하는 것과 같은 동일 수량의 서브유니트를 보유하는 형태로 조립된다. 바람직한 구체예에서, 제1일원 또는 융합 단백질은 활성 형태(예, 천연 형태)의 제2일원에 존재하는 것보다 더 적은 수량의 서브유니트를 보유하는 형태로 조립된다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 복합체, 예를들면 이량체, 삼량체, 사량체 또는 그이상의 다량체 복합체로 조립된다. 바람직하게 융합 단백질은 이량체 또는 사량체로 조립된다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 효소 활성을 보유한 복합체로 조립된다.
바람직한 구체예에서, 제1일원은 단량체이다. 예를들면, 이것은 일반적인 단량체 종 또는 (예컨대, 다량체의 서브유니트를 형성 또는 유지하는 것을 조절하는 부위의 돌연변이에 의해) 수정된 종이다. 몇몇 구체예에서, 단량체 형태는 제2일원에 의한 다량체 형성을 방해하지 않기 때문에 유용하다.
다른 바람직한 구체예에서, 제1일원은 이량체의 형태이며, 예를들면, 이종이량체 또는 동종이량체이다. 예를들면, 이것은 일반적인 이량체 종 또는 (예컨대, 다량체의 서브유니트를 형성 또는 유지하는 것을 조절하는 부위의 돌연변이에 의해) 수정되어 이량체가 되는 종이다. 몇몇 구체예에서, 이량체 형태는 제2일원에 의한 다량체 형성을 방해하지 않기 때문에 유용하다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 R1-L-R2; R2-L-R1; R2-R1; 또는 R1-R2의 식을 갖는다(여기서, R1은 제1일원, 예를들면 면역글로불린 서브유니트이고, L은 펩티드 링커이며, R2는 제2일원, 예를들면 효소 서브유니트임). 바람직하게, R1 및 R2는 공유결합으로 연결되며, 예를들면 펩티드 링커에 의해 직접 융합 또는 연결된다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질의 제1일원 또는 제2일원, 또는 둘다는 아미노산 서열의 일부를, 예를들면 치환 또는 결실시킴으로써 수정된다. 특히 바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 Ig 수퍼패밀리 일원, 바람직하게는 Ig 서브유니트인 제1일원을 포함하며, 제1일원은 다량체 형태, 예를들면 사량체 형태의 형성을 억제하도록 수정되었다. 바람직하게는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 변화, 삽입 또는 결실될 수 있는 수정은 그 결과 다량체를 형성하지 않거나 정상적으로 형성하는 것보다 더 낮은 정도의 다량체를 형성하는(예를들면 사량체가 아닌 이량체를 형성하는) 서브유니트를 산출한다. 바람직하게는, 다량체 구조의 형성 또는 유지를 매개하는 영역이 수정되어 이로인해 전체 또는 부분적으로 불활성화된다. 예를 들면, 면역글로불린 서브유니트의 일부, 예컨대 중쇄(예, 힌지 영역)가 수정(예, 결실)된다. 면역글로불린의 힌지 영역이 수정(예, 제거)된 구체예에서, 수정된 면역글로불린은 1가이다.
바람직한 구체예에서, 제1일원의 수정은 제1일원 또는 융합 단백질가 다량체로 조립되는 것을 저해하여, 예를들면 그 결과 단량체 또는 이량체를 생산하고, 이 경우 그렇지않으면 더 높은 정도의 다량체가 형성될 것이다.
바람직한 구체예에서, 제1일원은 표적화 제제, 예를들면, 표적에 대해 고친화성을 보유하는 폴리펩티드(예, 항체, 리간드 또는 효소)이다.
바람직한 구체예에서, 제1일원은 면역글로불린 또는 이의 단편(예, 이의 항원 결합 단편)이다. 바람직하게는, 면역글로불린은 단클론성 항체, 예를들면, 인간, 쥐(예, 마우스) 단클론성 항체; 또는 재조합 단클론성 항체이다. 바람직하게는, 단클론성 항체는 인간 항체이다. 다른 구체예에서, 단클론성 항체는 재조합 항체, 예를들면 키메라 또는 인간화된 항체[예컨대, 비인간 항체(예, 쥐) 유래의 가변 영역 또는 적어도 상보성 결정 영역(CDR)과 인간 유래의 잔여 부분을 보유함]; 또는 유전자도입법에 의해(transgenically) 생성된 인간 항체(예를들면, 인간 중쇄 트랜스 유전자 및 경쇄 트랜스 유전자를 함유하는 지놈을 보유하는 트랜스제닉 비인간 동물, 예컨대 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포가 불멸 세포에 융합된 하이브리도마에 의해 생성된 항체)이다.
바람직한 구체예에서, 제1일원은 전길이 항체(예, IgG1 또는 IgG4 항체)이거나 오직 항원 결합 부위(예, Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일쇄의 Fv 단편)만을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 제1일원은 IgG(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA1, IgA2, IgA 하위 분절(sub. sec), IgD, IgE의 서브유니트로 구성된 군에서 선택된 면역글로불린 서브유니트이다. 바람직하게는, 면역글로불린 서브유니트는 IgG 이소타입(예, IgG3)이다.
바람직한 구체예에서, 제1일원은 단량체, 예를들면 단일쇄 항체이거나; 또는 이량체, 예를들면 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 이량체를 형성한다.
바람직한 구체예에서, 제1일원은 1가 항체(예를들면, 한쌍의 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원 결합 부위를 포함함)이다. 다른 구체예에서, 제1일원은 2가 항체(예를들면 2쌍의 중쇄 및 경쇄 또는 이의 항체 결합 부위를 포함함)이다.
바람직한 구체예에서, 제1일원은 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편, 예를들면 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 바람직하게는, 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(예, 이의 항원 결합 단편)은 효소에 (예를들면 펩티드 링커에 의해) 연결되거나 직접 융합된다. 바람직하게는, 면역글로불린 중쇄-효소 융합 단백질은 기능적인 복합체, 예를들면 효소 활성을 보유하는 이량체, 삼량체, 사량체 또는 다량체 복합체로 조립될 수 있다. 가장 바람직한 형태는 이량체이다.
바람직한 구체예에서, 제1일원은 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(예, 이의 항원 결합 단편), 그리고 경쇄 또는 이의 단편(예, 이의 항원 결합 단편)을 포함한다. 바람직하게는, 면역글로불린 중쇄는 효소에 (예를들면 펩티드 링커에 의해) 연결되거나 직접 융합된다. 바람직하게는, 융합된 면역글로불린 중쇄-효소 융합 단백질은 경쇄와 조립되어, 예를들면 효소활성을 보유하는 예컨대 이량체, 삼량체, 사량체, 또는 다량체 복합체와 같은 기능적인 복합체를 생성한다. 가장 바람직한 형태는 이량체이다.
바람직한 구체예에서, 제1일원은 표적 세포(예, 암 세포) 상의 세포 포면 항원과 상호작용하는(예, 이에 결합하는) 면역글로불린이다. 예를들면, 면역글로불린은 다른 것들 중 종양 세포 항원, 예컨대 태아성암 항원(CEA), TAG-72, her-2/neu, 표피 성장인자 수용체, 트랜스페린 수용체에 결합한다.
바람직한 구체예에서, 제1일원은 표적 세포(예, 암 세포)에 근접하여 융합 단백질을 국소화(예컨대 융합단백질의 농도를 증가)시킨다.
바람직한 구체예에서, 제2일원은 효소(예, 하나 이상의 서브유니트를 보유하는 효소)의 서브유니트(예, 촉매성 서브유니트)이다. 바람직하게는, 효소는 1개, 바람직하게는 2개, 더욱 바람직하게는 3개, 가장 바람직하게는 4개 서브유니트를 포함한다. 바람직한 효소는 베타-글루쿠로니다제(예, 인간 베타-글루쿠로니다제)이다. 효소는 동종다량체 또는 이종다량체일 수 있다. 효소가 이종다량체인 경우 두개(또는 그 이상)의 융합 단백질이 활성있는 생성물을 형성하기 위해 필요하다.
바람직한 구체예에서, 제2일원은 전구체 약물, 예, 프로드럭을 독성 약물로 전환할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 제1일원은 면역글로불린 G(IgG) 중쇄 및 경쇄이고, 제2일원은 인간 베타-글루쿠로니다제 융합 단백질이다.
바람직한 구체예에서, 제1일원의 경쇄는 도 1B(서열번호 2)에 나타난 아미노산 서열을 보유하고; 제1일원의 경쇄는 도 1B(서열번호 2)의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98%, 99% 아미노산 서열 동일성 또는 상동성을 갖는다.
바람직한 구체예에서, 제1일원의 경쇄는 도 1B(서열번호 1) 또는 도 2(서열번호 37)에 나타난 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 보유하고; 제1일원의 경쇄는 도 1B(서열번호 2, 3 또는 4) 또는 도 2(서열번호 37)에 나타난 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 70%, 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98%, 99% 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호되는 아미노산을 보유하며; 제1일원의 경쇄는 엄격 조건하에 도 1B에 나타난 뉴클레오티드 서열에 하이브리드할 수 있는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호되는 아미노산 서열을 보유한다.
바람직한 구체예에서, 제1일원의 중쇄는 도 4B(서열번호 6, 7, 8, 9, 10 및/또는 11) 또는 도 5(서열번호 13, 14, 15, 및/또는 16)에 나타난 아미노산 서열을 보유하고; 제1일원의 중쇄는 도 4B(서열번호 6, 7, 8, 9, 10 및/또는 11) 또는 도 5(서열번호 13, 14, 15 및/또는 16)의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98%, 99% 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 아미노산 서열을 보유한다.
바람직한 구체예에서, 제1일원의 중쇄는 도 4B(서열번호 5) 또는 도 5(서열번호 12)에 나타난 뉴클레오티드 서열에 의해 암호되는 아미노산 서열을 보유하고; 제1일원의 중쇄는 도 4B(서열번호 5) 또는 도 5(서열번호 12)에 나타난 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 70%, 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98%,99% 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호되는 아미노산 서열을 보유하며; 제1일원의 중쇄는 엄격 조건하에 도 4B 또는 도 5에 나타난 뉴클레오티드 서열에 하이브리드할 수 있는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호되는 아미노산 서열을 보유한다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 펩티드 링커를 포함하며, 펩티드 링커는 하나 이상의 하기 특성을 갖는다:
a) 제1일원 및 제2일원이 서로에 대해 상대적으로 회전가능하게 한다.
b) 단백분해효소에 의한 소화에 내성이 있다.
c) 제1일원 또는 제2일원과 상호작용하지 않는다
d) 융합단백질이 효소 활성을 보유하는 복합체(예, 이량체, 삼량체, 사량체 또는 다량체 복합체)를 형성할 수 있도록 한다.
e) 융합 단백질이 활성있는 복합체로 접힘 및/또는 조립되는 것을 촉진한다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 펩티드 링커를 포함하며, 펩티드 링커는 길이가 5 내지 60, 더욱 바람직하게는 10 내지 30개 아미노산이고; 펩티드 링커는 길이가 20개 아미노산이며; 펩티드 링커는 길이가 17개 아미노산이고; 펩티드 링커 내 각 아미노산은 Gly, Ser, Asn, Thr 및 Ala로 구성된 군에서 선택되며, 펩티드 링커는 Gly-Ser 요소를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 펩티드 링커를 포함하고, 펩티드 링커는 식 (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y(여기서 y는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8임)를 갖는서열을 포함한다. 바람직하게 펩티드 링커는 식 (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3을 갖는 서열을 포함한다. 바람직하게 펩티드 링커는 식 ((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro)를 갖는 서열을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 숙주 세포(예, 배양된 세포) 또는 트랜스제닉 동물, 예컨대 트랜스제닉 포유류(예를들면 염소, 암소 또는 설치류(예, 마우스))에서 재조합기술에 의해 생성된다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 트랜스제닉 포유류(예, 염소, 암소 또는 설치류(예, 마우스))에서 생성된다. 따라서, 본 방법은 본 명세서에 설명된 융합 단백질을 발현하기 위해 제공되는 트랜스유전자를 포함하는 트랜스제닉 동물을 제공하는 단계; 트랜스 유전자를 발현시키도록 하는 단계; 및 바람직하게는 트랜스제닉 포유류의 젖으로부터 융합 단백질을 회수하는 단계를 더 포함한다.
융합 단백질이 유전자도입기술에 의해 생성되는 구체예의 경우, 융합 단백질은 분비성 단백질 유래의 신호(예, 젖으로 분비되는 단백질 유래의 신호; 또는 면역글로불린 분비 신호)를 비롯한 융합 단백질의 분비를 유도하는 신호 서열; 및 (선택적으로) 분비성 단백질(예, 젖으로 분비되는 단백질) 또는 면역글로불린의 아미노 말단 암호화 영역의 상당 부분을 암호하여 (예를들면 트랜스제닉 포유류의 젖으로의) 융합 단백질의 분비를 촉진시키는 서열을 더 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 트랜스제닉 포유류(예, 반추동물, 예컨대, 염소 또는 암소)의 유선에서 생성된다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 트랜스제닉 포유류, 예컨대 반추동물(예, 낙농업 동물(예, 염소 또는 암소))의 젖으로 분비된다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 적어도 약 0.1㎎/㎖, 0.5㎎/㎖, 1.0㎎/㎖, 1.5㎎/㎖, 2㎎/㎖, 3㎎/㎖, 5㎎/㎖ 또는 그 이상의 농도로 트랜스제닉 포유류의 젖으로 분비된다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 유선 특이 프로모터, 예컨대 젖 특이 프로모터(예, 젖 유장 단백질 또는 카제인 프로모터)의 제어하에 생성된다. 젖 특이 프로모터는 카제인 프로모터, 베타 락토글로불린 프로모터, 유장산(whey acid) 프로모터 또는 락트알부민 프로모터일 수 있다. 프로모터는 염소 β카제인 프로모터가 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질을 암호하는 트랜스 유전자는 하기의 것들을 포함하는 핵산 구조물이다:
(a) 선택적으로 절연체 서열;
(b) 프로모터, 예컨대 유선 상피조직 특이 프로모터(예, 젖 단백질 프로모터);
(c) 융합 단백질의 분비를 유도할 수 있는 신호 서열, 예컨대 젖 특이 단백질 또는 면역글로불린 유래의 신호를 암호하는 뉴클레오티드 서열;
(d) 선택적으로, (예를들면 트랜스제닉 포유류의 젖으로) 융합 단백질을 분비할 수 있도록 하기 위해 분비성 단백질(예, 젖으로 분비되는 단백질 또는 면역글로불린)의 아미노 말단 암호화 영역의 상당 부분을 암호하는 뉴클레오티드 서열;
(e) 융합 단백질, 예컨대 본 명세서에 설명된 면역글로불린-효소 융합 단백질을 암호하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열; 및
(f) (선택적으로) 포유류 유전자, 예컨대 유선 상피조직 특이 유전자(예, 젖 단백질 유전자) 유래의 3'비번역 영역.
바람직한 구체예에서, 트랜스 유전자 중 요소 a(존재하는 경우), b, c, d(존재하는 경우) 및 f는 동일한 유전자로부터 유래한다; 트랜스 유전자 중 요소 a(존재하는 경우), b, c, d(존재하는 경우) 및 f는 두개 이상의 유전자로부터 유래한다. 예를들면, 신호 서열, 프로모터 서열 및 3' 비번역 서열은 유선 상피조직 특이 유전자, 예컨대 젖 유장 단백질 또는 카제인 유전자(예, β카제인 유전자)로부터 유래할 수 있다. 신호 서열, 프로모터 서열 및 3'비번역 서열은 염소 β카제인 유전자로부터 유래하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 트랜스 유전자의 프로모터는 유선 상피조직 특이 프로모터, 예컨대 젖 유장 단백질 또는 카제인 프로모터(예, β카제인 프로모터)이다. 젖 특이 프로모터는 카제인 프로모터, 베타 락토글로불린 프로모터, 유장산 단백질 프로모터, 또는 락트알부민 프로모터일 수 있다. 프로모터는 염소 β카제인 프로모터가 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 트랜스 유전자에 의해 암호되는 신호 서열은 세포 외부로 또는 세포막 내로 단백질 발현을 유도하는 아미노 말단 서열이다. 예를들면, 신호 서열은 면역글로불린 단백질로부터 수득될 수 있다. 신호 서열은 젖(예, 트랜스제닉 동물의 젖)으로 분비되는 단백질로부터 유래하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질을 암호화는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열은 제2일원, 예컨대 효소에 작동가능하게 연결된 제1일원, 예컨대 면역글로불린 중쇄(또는 이의 항원 결합 부위)을 암호하는 뉴클레오티드 서열; (선택적으로) 면역글로불린 경쇄(또는 이의 항원 결합 부위)를 암호하는 뉴클레오티드 서열 또는 둘다 중 하나 이상을 포함한다. 일구체예에서, 중쇄 융합체 및 경쇄를 암호하는 뉴클레오티드 서열은 단일 구조물, 예컨대 단일 코스미드에 작동가능하게 연결된다. 다른 구체예에서, 중쇄 융합체 및 경쇄를 암호하는 뉴클레오티드 서열은 분리된 구조물로 하나의 트랜스제닉 동물에 도입된다. 연결되는 경우 뉴클레오티드 서열은 하기의 순서로 배열되는 것이 바람직하다: 5'-N2-3'에 연결된 5'-N1-3'; 또는 5'-N1-3'에 연결된 5'-N1-3'(여기서, N1은 제2일원, 예컨대 효소에 작동가능하게 연결된 제1일원, 예컨대 면역글로불린 중쇄(또는 이의 항원 결합 부위)이고; N2는 면역글로불린 경쇄(또는 이의 항원 결합 부위)이다). 뉴클레오티드 서열은 서로에 대해 임의의 방향, 예컨대 센스/센스; 역방향(reverse)/역방향; 센스/역방향; 또는 역방향/센스로 있을 수 있다.
바람직한 구체예에서, 트랜스 유전자의 3'비번역 영역은 폴리아데닐화 부위를 포함하고, 포유류 유전자, 예컨대 유선 상피조직 특이 유전자(예, 젖 유장 단백질 유전자 또는 카제인 유전자)로부터 얻는다. 3'비번역 영역은 카제인 유전자(예, β카제인 유전자), 베타 락토글로불린 유전자, 유장산 단백질 유전자 또는 락트알부민 유전자로부터 얻을 수있다. 3'비번역 영역은 염소 β카제인 유전자 유래인 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 트랜스 유전자, 예를들면 본 명세서에 설명된 트랜스 유전자를 트랜스제닉 동물의 생식 세포 및/또는 체세포 안으로 통합시킨다.
다른 일면에서, 본 발명은 유전자도입법에 의해 트랜스제닉 포유류의 젖에서 생성되는 융합 단백질, 예컨대 본 명세서에 기재된 융합 단백질을 제공하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 융합 단백질을 암호하는 트랜스 유전자, 예를들면 배선에 도입된 것, 예컨대 본 명세서에 설명된 핵산 구조물을 포함하고 그 결과 유선 상피조직 세포에서 융합 단백질의 단백질-암호화 서열을 발현하고 포유류의 젖에 융합 단백질을 분비하는 트랜스제닉 포유류로부터 젖을 수득하는 단계를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 포유류는 양, 마우스, 돼지, 암소 및 염소로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 트랜스제닉 포유류는 염소이다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 적어도 약 0.1㎎/㎖, 0.5㎎/㎖, 1.0㎎/㎖, 1.5㎎/㎖, 2㎎/㎖, 3㎎/㎖, 5㎎/㎖ 또는 그 이상의 농도로 트랜스제닉 포유류의 젖으로 분비된다.
바람직한 구체예에서, 면역글로불린-효소 융합 단백질을 암호하는 트랜스 유전자는 하기의 것들을 포함하는 핵산 구조물이다:
(a) 선택적으로 절연체 서열;
(b) 프로모터, 예컨대 유선 상피조직 특이 프로모터(예, 젖 단백질 프로모터);
(c) 융합 단백질의 분비를 유도할 수 있는 신호 서열, 예컨대 젖 특이 단백질 또는 면역글로불린 유래의 신호를 암호하는 뉴클레오티드 서열;
(d) 선택적으로, (예를들면 트랜스제닉 포유류의 젖으로) 비-분비성 단백질을 분비할 수 있도록 하기 위해 분비성 단백질(예, 젖으로 분비되는 단백질 또는 면역글로불린)의 아미노 말단 암호화 영역의 상당 부분을 암호하는 뉴클레오티드 서열;
(e) 융합 단백질, 예컨대 본 명세서에 설명된 융합 단백질을 암호하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열; 및
(f) 선택적으로 포유류 유전자, 예컨대 유선 상피조직 특이 유전자(예, 젖 단백질 유전자) 유래의 3'비번역 영역.
바람직한 구체예에서, 트랜스 유전자 중 요소 a(존재하는 경우), b, c, d(존재하는 경우) 및 f는 동일한 유전자로부터 유래한다; 트랜스 유전자 중 요소 a(존재하는 경우), b, c, d(존재하는 경우) 및 f는 두개 이상의 유전자로부터 유래한다. 예를들면, 신호 서열, 프로모터 서열 및 3' 비번역 서열은 포유류 유전자, 예컨대 유선 상피조직 특이 유전자, 예를들면 젖 유장 단백질 또는 카제인 유전자(예, β카제인 유전자)로부터 유래할 수 있다. 신호 서열, 프로모터 서열 및 3'비번역 서열은 염소 β카제인 유전자로부터 유래하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 트랜스 유전자의 프로모터는 유선 상피조직 특이 프로모터, 예컨대 젖 유장 단백질 또는 카제인 프로모터(예, β카제인 프로모터)이다. 젖 특이 프로모터는 카제인 프로모터, 베타 락토글로불린 프로모터, 유장산 단백질 프로모터, 또는 락트알부민 프로모터일 수 있다. 프로모터는 염소 β카제인 프로모터가 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 트랜스 유전자에 의해 암호되는 신호 서열은 세포 외부로 또는 세포막 내로 단백질 발현을 유도하는 아미노 말단 서열이다. 바람직하게, 신호 서열은 젖(예, 트랜스제닉 동물의 젖)으로 분비되는 단백질로부터 유래하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질을 암호하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열은 효소에 융합된 면역글로불린 중쇄(또는 이의 항원 결합 부위)을 암호하는 뉴클레오티드 서열; 면역글로불린 경쇄(또는 이의 항원 결합 부위)를 암호하는 뉴클레오티드 서열 또는 둘다 중 하나 이상을 포함한다. 일구체예에서, 중쇄 융합체 및 경쇄를 암호하는 뉴클레오티드 서열은 단일 구조물, 예컨대 단일 코스미드 내에 작동가능하게 연결된다. 다른 구체예에서, 중쇄 융합체 및 경쇄를 암호하는 뉴클레오티드 서열은 분리된 구조물로 하나의 트랜스제닉 동물에 도입된다. 연결되는 경우 뉴클레오티드 서열은 하기의 순서로 배열되는 것이 바람직하다: 5'-N2-3'에 연결된 5'-N1-3'; 또는 5'-N1-3'에 연결된 5'-N1-3'(여기서, N1은 효소에 연결된 면역글로불린 중쇄(또는 이의 항원 결합 부위)이고; N2는 면역글로불린 경쇄(또는 이의 항원 결합 부위)이다). 뉴클레오티드 서열은 서로에 대해 임의의 방향, 예컨대 센스/센스; 역방향/역방향; 센스/역방향; 또는 역방향/센스로 있을 수 있다.
바람직한 구체예에서, 트랜스 유전자의 3'비번역 영역은 폴리아데닐화 부위를 포함하고, 포유류 유전자, 예컨대 유선 상피조직 특이 유전자(예, 젖 유장 단백질 유전자 또는 카제인 유전자)로부터 얻는다. 3'비번역 영역은 카제인 유전자(예, β카제인 유전자), 베타 락토글로불린 유전자, 유장산 단백질 유전자 또는 락트알부민 유전자로부터 얻을 수 있다. 3'비번역 영역은 염소 β카제인 유전자 유래인 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 트랜스 유전자, 예를들면 본 명세서에 설명된 트랜스 유전자를 트랜스제닉 동물의 생식 세포 및/또는 체세포 안으로 통합시킨다.
다른 일면에서, 본 발명은 하기의 것을 포함하는 트랜스 유전자, 예를들면 핵산 구조물 바람직하게는 분리된 핵산 구조물을 특징으로 한다:
(a) 선택적으로, 절연체 서열;
(b) 프로모터, 예컨대 유선 상피조직 특이 프로모터(예, 젖 단백질 프로모터);
(c) 융합 단백질의 분비를 유도할 수 있는 신호 서열, 예컨대 젖 특이 단백질 또는 면역글로불린 유래의 신호 서열을 암호하는 뉴클레오티드 서열;
(d) 선택적으로, (예를들면 트랜스제닉 포유류의 젖으로) 융합 단백질을 분비할 수 있도록 하기 위해 분비성 단백질(예, 젖으로 분비되는 단백질 또는 면역글로불린)의 아미노 말단 암호화 영역의 상당 부분을 암호하는 뉴클레오티드 서열;
(e) 융합 단백질, 예컨대 본 명세서에 설명된 융합 단백질을 암호하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열; 및
(f) 선택적으로, 포유류 유전자, 예컨대 유선 상피조직 특이 유전자(예, 젖 단백질 유전자) 유래의 3'비번역 영역.
바람직한 구체예에서, 트랜스 유전자 중 요소 a(존재하는 경우), b, c, d(존재하는 경우) 및 f는 동일한 유전자로부터 유래한다; 트랜스 유전자 중 요소 a(존재하는 경우), b, c, d(존재하는 경우) 및 f는 두개 이상의 유전자로부터 유래한다. 예를들면, 신호 서열, 프로모터 서열 및 3' 비번역 서열은 포유류 유전자, 예컨대 유선 상피조직 특이 유전자, 예를들면 젖 유장 단백질 또는 카제인 유전자(예, β카제인 유전자)로부터 유래할 수 있다. 신호 서열, 프로모터 서열 및 3'비번역 서열은 염소 β카제인 유전자로부터 유래하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 트랜스 유전자의 프로모터는 유선 상피조직 특이 프로모터, 예컨대 젖 유장 단백질 또는 카제인 프로모터(예, β카제인 프로모터)이다. 젖 특이 프로모터는 카제인 프로모터, 베타 락토글로불린 프로모터, 유장산 단백질 프로모터, 또는 락트알부민 프로모터일 수 있다. 프로모터는 염소 β카제인 프로모터가 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 트랜스 유전자에 의해 암호되는 신호 서열은 세포 외부로 또는 세포막 내로 단백질 발현을 유도하는 아미노 말단 서열이다. 바람직하게 신호 서열은 젖 특이 프로모터 또는 면역글로불린으로부터 유래한다. 바람직하게, 신호 서열은 트랜스제닉 동물(예, 트랜스제닉 포유류)의 젖으로 암호된 단백질을 분비하도록 유도하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질을 암호하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열은 효소에 융합된 면역글로불린 중쇄(또는 이의 항원 결합 부위)를 암호하는 뉴클레오티드 서열; 면역글로불린 경쇄(또는 이의 항원 결합 부위)를 암호하는 뉴클레오티드 서열 또는 둘다 중 하나 이상을 포함한다. 일구체예에서, 중쇄 융합체 및 경쇄를 암호하는 뉴클레오티드 서열은 단일 구조물, 예컨대 단일 코스미드 내에 작동가능하게 연결된다. 다른 구체예에서, 중쇄 융합체 및 경쇄를 암호하는 뉴클레오티드 서열은 분리된 구조물로 하나의 트랜스제닉 동물에 도입된다. 연결되는 경우 뉴클레오티드 서열은 하기의 순서로 배열하는 것이 바람직하다: 5'-N2-3'에 연결된 5'-N1-3'; 또는 5'-N1-3'에 연결된 5'-N1-3'(여기서, N1은 효소에 연결된 면역글로불린 중쇄(또는 이의 항원 결합 부위)이고; N2는 면역글로불린 경쇄(또는 이의 항원 결합 부위)이다). 뉴클레오티드 서열은 서로에 대해 임의의 방향, 예컨대 센스/센스; 역방향/역방향; 센스/역방향; 또는 역방향/센스로 있을 수 있다.
바람직한 구체예에서, 트랜스 유전자의 3'비번역 영역은 폴리아데닐화 부위를 포함하고, 포유류 유전자, 예컨대 유선 상피조직 특이 유전자(예, 젖 유장 단백질 유전자 또는 카제인 유전자)로부터 얻는다. 3'비번역 영역은 카제인 유전자(예, β카제인 유전자), 베타 락토글로불린 유전자, 유장산 단백질 유전자 또는 락트알부민 유전자로부터 얻을 수 있다. 3'비번역 영역은 염소 β카제인 유전자 유래인 것이 바람직하다.
다른 일면에서, 본 발명은 융합 단백질, 예컨대 본 명세서에 설명된 융합 단백질을 암호하는 핵산 분자를 특징으로 한다.
바람직한 구체예에서, 핵산은 도 1B(서열번호 1), 도 2(서열번호 37), 도 4B(서열번호 5) 또는 도 5(서열번호 12)에 나타난 뉴클레오티드 서열을 보유하며; 핵산은 도 1B(서열번호 1), 도 2(서열번호 37), 도 4B(서열번호 5) 또는 도 5(서열번호 12)에 나타난 뉴클레오티드 서열과 적어도 60%, 70%, 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장바람직하게는 적어도 98%, 99% 서열 동일성 또는 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 보유하며; 핵산은 엄격 조건하에 도 1B, 도 2, 도4B 또는 도 5에 나타난 뉴클레오티드 서열에 하이브리드할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 보유한다.
바람직한 구체예에서, 핵산은 도 1A(서열번호 2, 3, 4), 도 4B(서열번호 6, 7, 8, 9, 10, 11) 또는 도 5(서열번호 13, 14, 15, 16)에 나타난 아미노산 서열을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 보유하며; 핵산은 도 1A(서열번호 2, 3, 4), 도 4B(서열번호 6, 7, 8, 9, 10, 11) 또는 도 5(서열번호 13, 14, 15, 16)의 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98%, 99% 서열 동일성 또는 상동성이 있는 아미노산 서열을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 보유한다.
또다른 일면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산(예, 본 명세서에 설명된 핵산 또는 트랜스 유전자, 예를들면 핵산 구조물)을 포함하는 숙주 세포, 예컨대 분리된 숙주 세포(예, 배양된 세포)를 특징으로 한다.
다른 일면에서, 본 발명은 본 명세서에 설명된 융합 단백질 또는 이의 정제된 제제를 특징으로 한다.
또다른 일면에서, 본 발명은 치료 유효량의 융합 단백질, 예컨대 본 명세서에 설명된 융합 단백질 및 약학적 허용 담체를 보유하는 약학 조성물 또는 기능식품(nutraceutical) 조성물을 특징으로 한다.
바람직한 구체예에서, 조성물은 젖을 포함한다.
다른 일면에서, 본 발명은 융합 단백질을 암호하는 트랜스 유전자, 예컨대 본 명세서에 설명된 융합 단백질을 암호하는 트랜스 유전자를 포함하는 트랜스제닉 동물을 특징으로 한다.
바람직한 트랜스제닉 동물은 포유류, 조류, 파충류, 유대동물 및 양서류를 포함한다. 적절한 포유류는 반추동물, 유제동물, 가축 및 낙농업 동물을 포함한다. 특히 바람직한 동물은 마우스, 염소, 양, 낙타, 토끼, 암소, 돼지, 말, 황소, 및 라마를 포함한다. 적절한 조류는 닭, 거위 및 칠면조를 포함한다. 트랜스제닉 단백질이 트랜스제닉 동물의 젖으로 분비되는 경우 동물은 1년마다 적어도 1ℓ, 더욱 바람직하게는 적어도 10 또는 100ℓ의 젖을 생산할 수 있어야 한다. 트랜스제닉 동물은 반추동물, 예컨대 염소, 암소 또는 양이 바람직하다. 트랜스제닉 동물은 염소가 가장 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 포유류는 융합 단백질을 암호하는 트랜스 유전자, 예컨대 본 명세서에 설명된 융합 단백질을 암호하는 트랜스 유전자를 함유하는 생식 세포 및 체세포를 보유한다.
바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 동물에서 발현되는 융합 단백질은 유선 특이 프로모터, 예컨대 젖 특이 프로모터, 예를들면 젖 유장 단백질 또는 카제인 프로모터의 제어하에 있다. 젖 특이 프로모터는 카제인 프로모터, 베타 락토글로불린 프로모터, 유장산 단백질 프로모터, 또는 락트알부민 프로모터일 수 있다. 프로모터는 염소 β카제인 프로모터가 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 동물은 포유류이고, 융합 단백질은 적어도약 0.1㎎/㎖, 0.5㎎/㎖, 1.0㎎/㎖, 1.5㎎/㎖, 2㎎/㎖, 3㎎/㎖, 5㎎/㎖ 또는 그 이상의 농도로 트랜스제닉 포유류의 젖으로 분비된다.
또다른 일면에서, 본 발명은 융합 단백질 트랜스 유전자를 보유하는 트랜스제닉 유기체의 제조방법을 특징으로 한다. 본 방법은 유기체의 세포 내에 융합 단백질, 예컨대 본 명세서에 설명된 융합 단백질을 암호하는 트랜스 유전자를 제공 또는 형성시키는 단계 및 상기 세포 또는 상기 세포로부터 파생된 것이 트랜스제닉 유기체를 생성하도록 하는 단계를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 유기체는 트랜스제닉 식물 또는 동물이다. 바람직한 트랜스제닉 동물은 포유류, 조류, 파충류, 유대동물 및 양서류를 포함한다. 적절한 포유류는 반추동물, 유제동물, 가축 및 낙농업 동물을 포함한다. 특히 바람직한 동물은 마우스, 염소, 양, 낙타, 토끼, 암소, 돼지, 말, 황소, 및 라마를 포함한다. 적절한 조류는 닭, 거위 및 칠면조를 포함한다. 트랜스제닉 단백질이 트랜스제닉 동물의 젖으로 분비되는 경우 동물은 1년마다 적어도 1ℓ, 더욱 바람직하게는 적어도 10 또는 100ℓ의 젖을 생산할 수 있어야 한다.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 유선 특이 프로모터, 예컨대 젖 특이 프로모터, 예를들면 젖 유장 단백질 또는 카제인 프로모터의 제어하에 있다. 젖 특이 프로모터는 카제인 프로모터, 베타 락토글로불린 프로모터, 유장산 단백질 프로모터, 또는 락트알부민 프로모터일 수 있다. 프로모터는 염소 β카제인 프로모터가 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 유기체는 포유류이고, 융합 단백질은 적어도 약0.1㎎/㎖, 0.5㎎/㎖, 1.0㎎/㎖, 1.5㎎/㎖, 2㎎/㎖, 3㎎/㎖, 5㎎/㎖ 또는 그 이상의 농도로 트랜스제닉 동물의 젖으로 분비된다.
다른 일면에서, 본 발명은 표면에 표적 항원을 발현하는 비정상 또는 질환성 세포, 예컨대 세포 표면 항원을 발현하는 암 세포를 선별적으로 사멸시키는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 상기 비정상 또는 질환성 세포를 유효량의 융합 단백질, 예컨대 본 명세서에 설명된 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이때 융합 단백질의 제1일원 또는 제2일원은 상기 표적 항원을 인식하여 선별적인 세포 사멸을 일으킨다.
본 방법은 배양물(예, 암세포를 포함하는 배양물) 내 세포 상에서, 예컨대 시험관내 또는 탈체로 사용할 수 있다. 예를들면, 세포는 배양배지에서 시험관내 배양될 수 있으며, 접촉 단계는 배양 배지에 본 발명의 융합 단백질을 첨가함으로써 수행될 수 있다. 대안으로, 본 발명은 피험체 내에 존재하는 세포(예, 암 세포)상에서 생체내(예, 치료 또는 예방) 프로토콜의 일부로서 수행될 수 있다.
다른 일면에서, 본 발명은 표면 상에 표적 항원을 발현하는 비정상 또는 질환성 세포(예, 세포 표면 항원을 발현하는 암세포)를 선별적으로 사멸시키는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 상기 비정상 또는 질환성 세포 안으로 융합 단백질, 예컨대 본 명세서에 설명된 융합 단백질을 암호하는 핵산을 도입시키는 단계를 포함하고, 이때 융합 단백질의 제1일원 또는 제2일원은 상기 표적 항원을 인식하여 선별적인 세포 사멸을 일으킨다.
본 방법은 배양물(예, 암세포를 포함하는 배양물) 내 세포 상에서, 예컨대시험관내 또는 탈체로 사용할 수 있다. 예를들면, 세포는 배양배지에서 시험관내 배양될 수 있으며, 본 발명의 핵산은 배양 배지에 도입될 수 있다. 대안으로, 본 발명은 피험체 내에 존재하는 세포(예, 암 세포)상에서 생체내(예, 치료 또는 예방) 유전자 요법 프로토콜의 일부로서 수행될 수 있다.
다른 일면에서, 본 발명은 표면에 표적 항원을 발현하는 세포(예, 표적 항원을 발현하느 암세포)의 비정상적인 성장 또는 활성에 의해 특징지워지는 장애를 피험체에서 치료하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 유효량의 융합 단백질, 융합 단백질(예, 본 명세서에 설명된 융합 단백질)을 암호하는 핵산을 피험체에 투여하는 단계를 포함하고, 이때 융합 단백질의 제1일원 또는 제2일원은 상기 표적 항원을 인식한다.
바람직한 구체예에서, 질환은 세포(예, 암 세포, 면역 세포)의 비정상적인 성장 또는 활성에 의해 특징지워진다.
또다른 일면에서, 본 발명은, 예를들면 질환을 진단하기 위해, 샘플 내 표적 항원의 존재를 시험관내 또는 생체내로 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 표지된 융합 단백질(예, 본 명세서에 설명된 융합 단백질)이 상호작용하도록 하는 조건하에 샘플 또는 대조 샘플을 접촉시키는 단계, 및 (ii) 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함한다. 대조 샘플과 비교하여 융합 단백질 항체 및 표적 항원 사이의 복합체 형성 상의 통계학적으로 상당한 변화는 샘플 내 표적 항원의 존재를 제시한다.
바람직한 구체예에서, 제2일원은 효소, 예컨대 서양고추냉이 과산화효소이다.
본 발명은 융합체 중 제1일원이 다량체를 형성하는 능력이 제2일원의 특성, 예컨대 활성 또는 용해도를 최적화하기 위해 선택된 융합 단백질을 특징으로 한다.
펩티드, 단백질 및 폴리펩티드 용어는 본 명세서에서 서로 교환가능하게 사용된다.
본 명세서에서 사용된, 정제된 제제, 거의 순수한 폴리펩티드 제제 또는 분리된 폴리펩티드는 이를 발현하는 세포 또는 유기체에서 발생하는 하나이상의 다른 단백질, 지질 또는 핵산으로부터, 예를들면 트랜스 동물 내 또는 트랜스제닉 동물에 의해 생산되는 유체, 예컨대 젖 또는 다른 물질(예, 난) 내 있는 단백질, 지질 또는 핵산으로부터 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드는 이를 정제하기 위해 사용된 항체 같은 물질 또는 폴리아크릴아미드 같은 겔 매트릭스로부터 분리되는 것이 바람직하다. 폴리펩티드는 정제된 제제 중 적어도 10, 20, 50, 70, 80 또는 95% 건조 중량을 구성하는 것이 바람직하다. 제제는 단백질 서열분석하기에 충분한 폴리펩티드; 적어도 1, 10 또는 100㎍의 폴리펩티드; 적어도 1, 10 또는 100㎎의 폴리펩티드를 함유하는 것이 바람직하다.
거의 순수한 핵산은 핵산이 유래한 유기체의 천연 발생 지놈 내에 바로 인접한 서열들(즉, 5' 말단에 하나 및 3' 말단에 하나)(예, 암호화 서열) 중 한쪽 또는 양쪽과 바로 인접하기 않은 것; 또는 핵산이 유래한 유기체 내에서 함께 발생하는 핵산 서열이 거의 없는 것 중 어느 하나 또는 둘 모두인 핵산이다. 이 용어는 예를들면, 벡터(예 유니트으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스)안으로 또는 원핵또는 진핵세포의 지놈성 DNA 안으로 통합되거나 또는 다른 DNA 서열과 무관하게 분리된 분자(예, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생성되는 cDNA 또는 지놈성 DNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 거의 순수한 DNA는 또한 추가 융합 단백질 서열을 암호하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
본 명세서에 사용된 상동성 또는 서열 동일성은 두개의 폴리펩티드 분자 사이 또는 두개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 언급한다. 제1 서열 내 위치가 제2 서열 내 해당 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 차지되는 경우 분자는 상기 위치에서 상동성이 있다(즉, 본 명세서에 사용된 바와 같이 아미노산 또는 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "동일성"과 동일하다). 두개의 서열 사이의 상동성(%)은 서열들에 의해 공유되는 동일 위치 수의 함수이다(즉, 상동성(%)= (동일 위치 수/ 총 위치 수)×100). 예를들면, 두개의 서열에서 10개 위치들 중 6개가 일치 또는 상동성이 있는 경우 두개 서열은 60% 상동성 또는 60% 서열 동일성을 갖는다. 예를들면, DNA 서열 ATTGCC와 TATGGC는 50% 상동성 또는 서열 동일성을 공유한다. 통상, 최대 상동성 또는 서열 동일성이 주어지도록 두개 서열이 정렬될 때 비교한다.
두개 서열 사이의 서열 비교 및 상동성(%) 결정은 수학적 알고리듬을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 서열 비교에 사용되는 수학적 알고리듬의 비제한적인 예는 Karlin 및 Altschul[Proc, Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68(1990)]의 알고리듬이며, 문헌[Karlin and Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:5873-77]과 같이 수정된다. 이러한 알고리듬은 문헌[Altschul et al.(1990) J. Mol.Biol.215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(2.0 판)안으로 통합된다. BLAST 뉴클레오티드 조사를 NBLAST 프로그램, 점수=100, 단어길이=12로 수행하여, 본 발명의 ITALY 핵산 분자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 조사는 XBLAST 프로그램, 점수=50, 단어길이=5로 수행하여, 본 발명의 ITALY 단백질 분자와 상동성이 있는 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적용으로 공백이 있는 정렬을 수득하기 위해, 문헌[Altschul et al.,(1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 공백이 있는 BLAST를 사용할 수 있다. BLAST 및 공백이 있는 BLAST 프로그램을 사용하는 경우,각 프로그램(예, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수를 사용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조하라. 서열 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리듬의 또다른 바람직한 예는 비제한적으로 Myers 및 Miller[CABIOS(1989)]의 알고리듬이다. 이러한 알고리듬은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 팩키지의 일부인 ALIGN 프로그램(2.0판)에 통합된다. 아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN 프로그램을 사용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표, 공백 길이 벌점 12, 및 공백 벌점 4를 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 트랜스 유전자는 트랜스제닉 유기체의 지놈 내로 도입되는 핵산 서열(예를들면 하나이상의 융합 단백질 폴리펩티드를 암호함)을 의미한다. 트랜스 유전자는 융합 단백질을 암호하는 핵산의 최적 발현 및 분비에 필요할 수 있는 하나이상의 전사 조절 서열 및 기타 핵산(예, 인트론)을 포함할수 있다. 트랜스 유전자는 인헨서 서열을 포함할 수 있다. 융합 단백질 서열은 조직 특이 프로모터, 예컨대 트랜스제닉 포유류의 젖으로의 단백질 분비를 산출하는 유선 특이 프로모터 서열, 소변 특이 프로모터 또는 난 특이 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "트랜스제닉 세포"는 트랜스 유전자를 함유하는 세포를 언급한다.
본 명세서에 사용된 트랜스제닉 유기체는 트랜스제닉 동물 또는 식물을 언급한다.
본 명세서에 사용된 "트랜스제닉 동물"은 동물의 하나 이상의 세포 바람직하게는 거의 모든 세포가 인간의 조정(예, 당업계 알려진 트랜스제닉 기법)에 의해 도입된 트랜스 유전자를 함유하는 비인간 동물이다. 트랜스 유전자는 직접 또는 간접적으로 하기 세포의 전구 세포 안으로의 통합, 의도적인 유전자 조작(예, 미세주입 또는 재조합 바이러스로의 감염)에 의해 세포 안으로 도입될 수 있다.
포유류는 유선을 보유하고 젖을 생산하고 인간을 제외한 모든 동물로 본 명세서에 정의되어 있다.
본 명세서에 사용된 "낙농업 동물"은 설치류보다 큰 젖 생산 비인간 동물을 언급한다. 바람직한 구체예에서, 낙농업 동물은 대량의 젖을 생산하고 젖분비 기간이 길며, 예로는 암소 또는 염소가 있다.
본 명세서에 사용된 "피험체"는 인간 및 비인간 동물을 포함한다. 본 발명 중 "비인간 동물"은 척추동물, 예컨대 포유류 및 비포유류, 예를들면 비인간 영장류, 반추동물, 조류, 양서류, 파충류 및 설치류, 예 마우스 및 래트를 포함한다. 또한 이 용어는 토끼를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "트랜스제닉 식물"은 식물의 하나 이상의 세포 바람직하게는 거의 모든 세포가 인간의 조정(예, 당업계 알려진 트랜스제닉 기법)에 의해 도입된 트랜스 유전자를 함유하는 식물, 바람직하게는 다세포 또는 고등 식물이다.
본 명세서에 사용된 "식물"은 전체 식물, 식물의 일부, 식물 세포 또는 일군의 식물세포를 언급한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 식물 부류는 통상 형질전환 기법에 잘 따르는 고등 식물의 부류와 같이 광범위하며, 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물을 포함한다. 이는 다양한 배수성 수준, 예를들면 다배수성, 이배수성, 및 일배수성을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "면역글로불린" 및 "항체"는 이황화 결합에 의해 연결된 적어도 두개 중쇄(H) 및 두개 경쇄(L)를 포함하는 당단백질을 언급한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인인 CH1, CH2 및 CH3로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더 보존된 영역들 사이에 점재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성 영역으로 더 소구분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개 CDR 및 4개 FR로 구성되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열되어 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자[면역 시스템의 각종 세포(예, 효과인자 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 구성성분(Clq)을 포함]에 면역글로불린이 결합하는 것을 매개할 수 있다.
본 명세서에 사용된 항체 중 "항원 결합 부위"(또는 간단히 "항체 부위")는 항원(예, 표적 항원)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 하나이상의 항체 단편을 언급한다. 항체 중 항원 결합 기능은 전길이 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다고 알려져 있다. 항체 중 "항원 결합 부위" 용어 내에 포함되는 결합 단편들의 예는 (i) Fab 단편, 즉 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 일가 단편; (ii) F(ab')2단편, 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 두개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔(arm)의 VH 및 VL 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al.,(1989) Nature 341:544-546); (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 게다가, 비록 Fv 단편 중 두개 도메인인 VL 및 VH가 분리된 유전자들에 의해 암호되더라도, 이들은 재조합 방법으로 합성 링커에 의해 연결될 수 있으며, 이때 합성 링커는 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 일가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬(단일쇄 Fv(scFv)로 알려짐; 예컨대 Bird et al.(1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883을 참조하라)로 제조할 수 있도록 한다. 이러한 단일쇄 항체는 또한 항체 중 "항원 결합 부위"의 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 알려진종래 기법으로 수득되며, 단편은 완전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본 명세서에 사용된 "단클론성 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자를 언급한다. 단클론성 항체 조성은 하나의 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 따라서, "인간 단클론성 항체"는 인간 배선 면역글로불린 서열 유래의 가변 영역 및 불변 영역을 보유하는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 언급한다. 일 구체예에서, 인간 단클론성 항체는 인간 중쇄 트랜스 유전자 및 경쇄 트랜스 유전자를 포함하는 지놈을 보유한 트랜스제닉 비인간 동물, 예컨대 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포가 불멸 세포에 융합된 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 명세서에 사용된 "재조합 인간 항체"는 재조합 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리되는 모든 인간 항체, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자가 도입된 동물(예, 마우스)로부터 분리된 항체; 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합 순열조합적 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열이 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 기타 임의의 방법에 의해 제조, 발현, 형성 또는 분리된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 배선 면역글로불린 서열 유래의 가변 영역 및 불변 영역을 보유한다. 그러나, 몇몇 구체예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 인간 Ig 서열에 대한 트랜스제닉 동물이 사용된 경우는 생체내 체세포 돌연변이유발)시키고, 이로인해 재조합 항체의VH 및 VL 영역의 아미노산 서열들은 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되어 있으나 생체내 인간 항체 배선 레파토리에서는 천연적으로 존재하지 않는 서열이다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적인 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결된다". 예를들면, 프로모터 또는 인헨서는 상기 서열의 전사에 영향을 준다면 암호화 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 전사 조절 서열에 대하여, '작동가능하게 연결된'은 연결되어 있는 DNA 서열들이 인접하고, 두개 단백질 암호화 영역을 연결하는 것이 필요한 경우 인접하고 해독틀 내에 있는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "벡터" 또는 "구조물"은 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 언급하는 것으로 의도된다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이고, 이것은 추가 DNA 분절이 그 안에 라이게이션될 수 있는 환형 이본쇄 DNA 루프를 언급한다. 벡터의 다른 유형은 바이러스 벡터이며, 여기서 추가 DNA 분절은 바이러스 지놈안으로 라이게이션될 수 있다. 몇몇 벡터는 도입될 숙주 세포에서 자가복제할 수 있다(예, 박테리아의 복제 기원을 보유한 박테리아 벡터 및 에피좀성 포유류 벡터). 다른 벡터(예, 비에포좀 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포의 지놈 안으로 통합될 수 있으며, 이로인해 숙주 지놈과 함께 복제된다. 게다가, 몇몇 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 "재조합 발현 벡터"(또는 단순히 "발현 벡터")로 본 명세서에서 언급된다. 통상, 재조합 DNA 기법에 사용되는 발현 벡터는 자주 플라스미드 형태로 있다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 일상적으로 사용되는 형태의벡터이기 때문에 서로 교환하여 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터(예, 복제 결여 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 벡터)를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "재조합 숙주 세포" (또는 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 통합된 세포를 언급하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 특정 목적 세포뿐만아니라 이러한 세포의 자손도 언급하는 것을 의도한다는 것이 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 세대를 거듭할 때 특정 수정이 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 부모 세포와 동일하지 않을지도 모르나 본 명세서에 사용된 "숙주 세포" 용어의 범주내에 여전히 포함된다.
본 발명의 다른 특징 및 잇점은 하기 자세한 설명 및 청구범위로부터 분명할 것이다.
자세한 설명
본 발명은 적어도 부분적으로 유전자도입법에 의해 생성된 융합 단백질을 제공하는데, 이 융합 단백질 중 일원은 다량체로 조립되고 다른 일원은 최적 수의 서브유니트로 조립되는 것을 촉진하도록 선택 또는 수정된다. 일구체예에서, 융합 단백질은 독소(예, 효소의 서브유니트)에 융합된 면역글로불린 서브유니트(예, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄)를 포함한다. 본 명세서에 기술된 면역글로불린-효소 융합 단백질은 바람직하지 못한 세포(예, 종양 세포)에 세포독성 제제(예, 효소)를 표적화시킨다. 예를들면, 하기 실시예에 기술된 융합 단백질(즉, 효소, 예 글루쿠로니다제에 융합된 태아성암 항원에 대한 항체)은 종양 세포에 표적화되도록 사용할 수 있다. 충분한 시간동안 면역글로불린-효소 융합체가 종양 부위에 위치하도록 한 후, 비독성 프로드럭을 투여할 수 있다. 이 프로드럭은 종양 부위에 위치한 표적화된 효소의 작용에 의해 고도의 세포독성 약물로 전환되어, 환자에게 용인할 수 없는 독성 없이 치료 수준의 약물을 획득하게 할 수 있다.
면역글로불린의 생산
세포상 표적 항원, 예컨대 세포 표면 단백질(예, 수용체)에 대한 단클론성 항체는 종래 단클론성 항체 방법론, 예컨대 Kohler와 Milstein[Nature 256:495(1975)]의 표준 체세포 하이브리드화 기법을 포함하는 다양한 기법에 의해 생산될 수 있다. 체세포 하이브리드화 공정이 대체로 바람직하나, 단클론성 항체를 생산하는 다른 기법, 예컨대 B 림프구의 바이러스 또는 암유전자 형질전환이 사용될 수 있다.
하이브리도마를 준비하기 위한 바람직한 동물 시스템은 쥐 시스템이다. 마우스 내 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립된 공정이다. 면역화 프로토콜 및 융합체를 위한 면역화된 비장세포의 분리 기법이 당업계에 알려져 있다. 융합 파트너(예, 쥐 골수종 세포) 및 융합 공정도 알려져 있다.
인간 단백질에 대한 인간 단클론성 항체(mAb)는 마우스 시스템이 아닌 완전한 인간 면역 시스템을 운반하는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 형성시킬 수 있다. 관심있는 항원으로 면역시킨 이들 트랜스제닉 마우스로부터 나온 비장세포를 사용하여 인간 단백질의 에피토프에 대해 특이적인 친화성을 갖는 인간 mAb를 분비하는 하이브리도마를 생산한다(예컨대, Wood et al. 국제출원 WO 91/00906,Kucherlapati et al. PCT 공개 WO 91/10741; Lonberg, N. et al. 국제 출원 WO 92/03918; Kay et al. 국제 출원 92/03917; Lonberg et al. 1994 Nature 368:856-859; Green, L.L. et al. 1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S.L. et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al. 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al. 1991 Eur J Immunol 21:1323-1326를 참조).
또한, 단클론성 항체는 재조합 DNA 기법의 당업자에게 알려진 다른 방법에 의해 형성될 수 있다. "순열조합적 항체 디스플레이" 방법으로 언급되는 다른 방법은 특정 항원 특이성을 갖는 항체 단편을 동정 및 분리하도록 개발되었고 이를 이용하여 단클론성 항체를 생산할 수 있다(순열조합론적 항체 디스플레이에 대한 설명은, 예컨대 Sastry et al. 1989 PNAS 86:5728; Huse et al. 1989 Science 246:1275; 및 Orlandi et al. 1989 PNAS 86:3833을 참조). 전술한 면역원으로 동물을 면역시킨 후, 형성된 B-세포 풀의 항체 레퍼토리를 클로닝한다. 올리고머 프라이머의 혼합물 및 PCR을 사용하여 다양한 집단의 면역글로불린 분자들 중가변 영역들의 DNA 서열을 수득하는 방법이 통상 알려져 있다. 예를들면, 5'리더(신호 펩티드) 서열 및/또는 프레임워크 1(FR1) 서열에 해당하는 혼합된 올리고뉴클레오티드 프라이머 뿐만아니라, 보존된 3'불변 영역 프라이머가 다수의 쥐 항체로부터 나온 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 PCR 증폭시키는데 사용될 수 있다(Larrick et al., 1991, Biotechniques 11:152-156). 또한, 유사한 전략을 사용하여 인간 항체로부터 나온 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 증폭시킬 수 있다(Larrick et al., 1991,Methods: Companion to Methods in Enzymology 2:106-110).
예시적인 구체예에서, RNA는 표준 프로토콜을 사용하여 B 림프구, 예를들면, 말초 혈액 세포, 골수 또는 비장 제제로부터 분리한다(예, 미국 특허 제4,683,202호; Orlandi, et al. PNAS(1989) 86:3833-3837; Sastry et al., PNAS(1989) 86:5728-5732;및 Huse et al.(1989) Science 246:1275-1281). 중쇄(들) 및 각 κ 및 λ경쇄의 불변 영역에 특이적인 프라이머뿐만아니라 신호 서열에 대한 프라이머를 사용하여 제1 가닥 cDNA를 합성한다. 가변 영역 PCR 프라이머를 사용하여 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 영역을 단독적으로 또는 함께 증폭하고 디스플레이 팩키지를 형성하는 추가 조작을 위해 적절한 벡터 안으로 라이게이션한다. 증폭 프로토콜에 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 유일하거나 축퇴성일 수 있거나 축퇴성 위치에서 이노신이 통합될 수 있다. 또한, 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열은 프라이머 내로 통합되어, 발현을 위해 미리 결정된 해독틀 내 벡터 안으로 증폭된 단편을 클로닝시킬 수 있다.
면역화에 의해 유도된 항체 레퍼토리로부터 클로닝된 V-유전자 라이브러리는, 바람직하게는 실모양 파아지 유래의, 디스플레이 팩키지 집단에 의해 발현되어 항체 디스플레이 라이브러리를 형성할 수 있다. 이상적으로는, 디스플레이 팩키지는 다양한 항체 디스플레이 라이브러리를 표본추출하고, 각 친화성 분리 라운드 이후 신속히 분류하고, 정제된 디스플레이 팩키지로부터 항체 유전자를 용이하게 분리하도록 할 수 있는 시스템을 포함한다. 상업적으로 입수가능한 파아지 디스플레이 라이브러리 형성용 키트(예, the Pharmacia Recombinant Phage AntibodySystem, catalog no. 27-9400-01;및 the Stratagene SurfZAPTMphage display kit, catalog no. 240612)에 부가하여, 다양한 항체 디스플레이 라이브러리 형성용 용도에 특히 잘 따르는 방법 및 시약들의 예는 예를들면 문헌[Ladnet et al. 미국특허 제5,223,409호; Kang et al. 국제 공개 제WO 92/18619호; Dower et al. 국제 공개 제WO91/17271호; Winter et al. 국제 공개 제W92/20791O호; Markland et al. 국제 공개 제WO92/15679호; Breitling et al. 국제 공개 제W93/01288O호; McCafferty et al. 국제 공개 제WO92/01047호; Garrard et al. 국제 공개 제WO92/09690호; Ladner et al. 국제 공개 제WO90/02809호; Fuchs et al.(1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al.(1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al(1989)Science 246:1275-1281; Griffths et al.(1993) EMBO J12:725-734; Hawkins et al.(1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al.(1991) Nature 352:624-628; Gram et al(1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al.(1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al.(1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; 및 Barbas et al.(1991) PNAS 88:7978-7982]에서 찾을 수 있다.
특정 구체예에서, 중쇄 및 경쇄의 V 영역 도메인은 가요성있는 링커에 의해 연결되어 단일쇄 Fv 단편을 형성하는 동일한 폴리펩티드 상에서 발현될 수 있으며, 이어서 scFV 유전자는 원하는 발현 벡터 또는 파아지 지놈 안으로 클로닝될 수 있다. McCaggerty등의 문헌[Nature(1990) 348:552-554]에 일반적으로 기재된 바와 같이, 가용성있는 (Gly4-Ser)3링커에 의해 연결된 항체의 완전한 VH및 VL도메인을사용하여 항원 친화성에 기초하여 분리할 수 있는 디스플레이 팩키지를 만들 수 있는 단일쇄 항체를 생산할 수 있다. 항원과 면역반응성있는 분리된 scFV 항체는 이어서 목적 방법에 사용하기 위한 약학 제제로 제형될 수 있다.
일단 디스플레이 팩키지(예, 실모양 파아지)의 표면에 디스플레이되면, 항체 라이브러리는 표적 항원 또는 이의 펩티드 단편으로 스크리닝하여 표적 항원에 특이성을 보유한 항체를 발현하는 팩키지를 동정 및 분리한다. 선별된 항체를 암호하는 핵산을 디스플레이 팩키지(예 파아지 지놈)으로부터 회수하여 표준 재조합 DNA 기법에 의해 다른 발현 벡터로 서브클로닝할 수 있다.
표면 단백질에 높은 친화도를 갖는 특이 항체 분자는 당업계에 알려진 방법, 예를들면 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함하는 방법에 따라 제조될 수 있다(Ladner, R.C., et al., 미국특허 제5,233,409호; Ladner, R.C., et al., 미국특허 제5,403,484호). 게다가, 이들 라이브러리 방법을 스크리닝에 사용하여 항체의 구조적 결정요소의 모방체인 결합요소를 획득할 수 있다.
특히, 특정 항체 분자의 Fv 결합 표면은 단백질-단백질 상호작용의 원리에 따라 그 표적 리간드와 상호작용하며, 따라서, VH및 VL(후자는 κ 또는 λ사슬 유형일 수 있음)의 서열 데이타는 당업자에게 알려진 단백질 조작 기법의 기초이다. 결합 결정 요소를 포함하는 단백질 표면에 대한 자세한 설명은 NMR 연구 또는 결정학적 데이터로부터 얻은 다른 항체로부터 이전에 결정된 3차원 구조를 사용하는 모델링 공정에 의해 항체 서열 정보로부터 얻을 수 있다. 예를들면, Bajorath, J.and S. Sheriff, 1996, Proteins: Struct., Funct., and Genet. 24(2), 152-157; Webster, D.M. and A.R. Rees, 1995, "Molecular modeling of antibody-combining sites" in S. Paul, Ed., Methods in Molecular Biol. 51, Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, pp 17-49;및 Johnson, G., Wu, T.T. and E.A. Kabat, 1995, "Seqhunt: A program to screen aligned nucleotide and amino acid sequences" in Methods in Molecular Biol. 51, op. cit., pp1-15를 참조하라.
일구체예에서, 다양한 펩티드 라이브러리는 펩티드 디스플레이 라이브러리를 형성하는 디스플레이 팩키지 집단에 의해 발현된다. 이상적으로는, 디스플레이 팩키지는 다양한 펩티드 디스플레이 라이브러리를 표본추출하고, 각 친화성 분리 라운드 이후 신속히 분류하고, 정제된 디스플레이 팩키지로부터 펩티드-암호 유전자를 용이하게 분리하도록 할 수 있는 시스템을 포함한다. 펩티드 디스플레이 라이브러리는 신속히 증폭될 수 있고 다소 조작이 용이하며 다수의 클론을 형성할 수 있게 하는 예를들면 원핵 유기체 및 바이러스에서 만들어질 수 있다. 바람직한 디스플레이 팩키지는 예를들면 식물계 박테리아 세포, 박테리아 포자를 포함하며, 박테리아 바이러스(특히 DNA 바이러스)가 가장 바람직하다. 그러나, 본 발명은 또한 잠재성있는 디스플레이 팩키지로서 효모 및 이들의 포자를 포함한 진핵 세포를 사용하는 것도 포함한다. 파아지 디스플레이 라이브러리는 전술되어 있다.
다른 기법은 적절한 "수용체", 예컨대 표적 항원으로 친화성 크로마토그래피를 한 후 통상 기법(예, 질량 분광학 및 NMR)으로 분리된 결합 제제 또는 리간드를동성하는 것을 포함한다. 수용성 수용체는 검출될 수 있는 표지(예, 형광체, 색채계 효소, 방사선동위원소 또는 발광 화합물)에 연결되어 리간드 결합을 표시하는 것이 바람직하다. 대안으로, 고정된 화합물이 선별적으로 방출되어 막을 통해 분산되어 수용체와 상호작용할 수 있다.
또한, 순열조합적 라이브러리의 화합물은 라이브러리 각 일원의 정체성을 암호하는 "태그"와 함께 합성될 수 있다(예컨대 W.C. Still et al., 국제 출원 제WO94/08051호 참조). 일반적으로, 이 방법은 비활성이나 즉각적으로 검출가능한 태그를 사용하는 것을 특징으로 하며, 이 태그는 고형 지지체 또는 화합물에 결합된다. 활성있는 화합물이 검출되는 경우, 화합물의 정체성은 독특한 수반 태그를 동정함으로써 결정한다. 이 태그 방법은 라이브러리 내 모든 세트의 모든 화합물에 대해 매우 낮은 수준에서 동정될 수 있는 화합물들의 대규모 라이브러리를 합성할 수 있게 한다.
또한, 수정된 항체란 용어는 예컨대 항체의 일부를 결실, 부가 또는 치환함으로써 수정된, 단클론성 항체, 키메라 항체 및 인간화된 항체와 같은 항체들을 포함하는 것으로 의도된다. 예를들면, 항체는 힌지 영역을 결실시킴으로써 일가 항체를 형성하도록 수정될 수 있다. 항체가 적어도 하나의 항원 결합 영역 특이성을 보유하는 한 임의의 수정은 본 발명의 범주에 속한다.
키메라 마우스-인간 단클론성 항체(즉, 키메라 항체)는 당업계에 알려진 재조합 DNA 기법에 의해 생산될 수 있다. 예를들면, 쥐(또는 다른 종) 단클론성 항체 분자의 Fc 불변 영역을 암호하는 유전자를 제한 효소로 소화시켜 쥐 Fc를 암호하는영역을 제거하고, 인간 Fc 불변 영역을 암호하는 유전자의 등가 부위로 치환한다(Robinson et al., 국제 특허 공개 PCT/US86/02269; Akira, et al., 유럽특허공개 제184,187호; Taniguchi, M., 유럽특허출원 제171,496호; Morrison et al, 유럽 특허출원 제173,494호; Neuberger et al., 국제 출원 제WO 86/01533호; Cabilly et al. 미국특허 제4,816,567호; Cabilly et al., 유럽특허출원 제125,023호; Better et al.(1988 Science 240:1041-1043); Liu et al.(1987)PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al.(1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al.(1985) Nature 314:446-449; 및 Shaw et al., 1988, J.Natl Cancer Inst. 80:1553-1559를 참조하라).
키메라 항체는 추가로 항원 결합에 직접 관여하지 않는 Fv 가변 영역의 서열을 인간 Fv 가변 영역으로부터 나온 등가 서열로 치환함으로써 인간화될 수 있다. 인간화된 키메라 항체에 대한 일반적인 개관은 Morrison, S.L.의 문헌[1985, Science 229:1202-1207] 및 Oi등의 문헌[1986, BioTechniques 4:214]에 제공되어 있다. 이들 방법은 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄로부터 나온 면역글로불린 Fv 가변 영역의 전부 또는 일부를 암호하는 핵산 서열의 분리, 조작 및 발현을 포함한다. 이러한 핵산의 공급원은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를들면 7E3, 즉 항-GPIIbIIIa항체 생산 하이브리도마로부터 얻을 수 있다. 이어서, 키메라 항체 또는 이의 단편을 암호하는 재조합 DNA는 적절한 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 적절하게 인간화된 항체는 달리 CDR 치환에 의해 생성될 수 있다[미국특허 제5,225,539호; Jones et al. 1986 Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534; 및 Beidler et al. 1988 J. Immunol. 141:4053-4060].
특정 인간 항체의 CDR 모두를 비인간 CDR의 적어도 일부로 대체할 수 있거나, 오직 몇몇 CDR만을 비인간 CDR로 대체할 수 있다. 오직 필요한 것은 Fc 수용체에 인간화된 항체가 결합하는데 필요한 CDR의 수의 대체이다.
항체는 임의의 방법에 의해 인간화될 수 있으며, 이 방법은 인간 항체의 CDR 중 적어도 일부를 비인간 항체 유래의 CDR로 대체할 수 있다. Winter는 본 발명의 인간화된 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 방법을 설명하고 있으며(영국트허출원 GB 2188638A, 1987. 3. 26. 출원), 이 내용은 본 명세서에 분명히 인용되어 있다. 인간 CDR은 올리고뉴클레오티드 부위-지정 돌연변이유발법을 사용하여 비인간 CDR로 대체될 수 있다.
또한, 특정 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 키메라 및 인간화된 항체도 본 발명의 범주내에 있다. 특히, 바람직한 인간화된 항체는 프레임워크 영역에 아미노산 치환을 보유하여 항원의 결합을 증진시킨다. 예를들면, 마우스 CDR을 보유하는 인간화된 항체에서, 인간 프레임워크 영역에 위치한 아미노산을 마우스 항체 내 대응 위치에 있는 아미노산으로 치환할 수 있다. 이러한 치환은 몇몇 예에서, 항원에 인간화된 항체가 결합하는 것을 증진시킨다고 알려져 있다. 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 항체는 본 명세서에서 수정된 항체 또는 변형된 항체로 언급된다.
표적 항원
바람직한 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질의 제1일원은 표적화 제제, 예를들면 표적에 고 친화도를 보유하는 폴리펩티드(예, 항체, 리간드, 또는 효소)이다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 융합 단백질의 제2 일원이 선별적으로 바람직하지 않은 세포 부근으로 안내(예, 위치)될 수 있다.
예를들면, 제1일원은 상호작용하는(예컨대 표적 항원에 결합하는) 면역글로불린일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 표적 항원은 세포, 예컨대 과증식성 세포(예, 암 세포)와 같은 비정상 세포의 표면 상에 존재한다. 예시적인 표적 항원은 다른 것들 중 태아성 암 항원(CEA), TAG-72, her-2/neu, 표피 성장 인자 수용체, 트랜스페린 수용체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "표적 세포"는 본 발명의 융합 단백질에 의해 표적화될 수 있는 피험체(예, 인간 또는 동물) 내 원하지 않는 임의의 세포를 의미한다. 예시적인 표적 세포는 종양 세포, 예컨대 암종 또는 선암종 유래 세포(예, 결장, 유방, 전립선, 난소 및 자궁내 암세포)를 포함한다(Thor, A. et al.(1997) Cancer Res 46:3118; Soisson A.P. et al.(1989) Am. J.Obstet. Gynecol.:1258-63). "암종"은 상피 또는 내분비 조직의 악성 종양으로 당업계에 인식되고 언급되며, 호흡계 암종, 위장계 암종, 비뇨생식계 암종, 고환 암종, 유방 암종, 난소 암종, 전립선 암종, 내분비계 암종 및 흑색종을 포함한다. 예시적인 암종은 자궁경관, 폐, 전립선, 유방, 머리 및 목, 결장 및 난소 조직으로부터 형성된 것들을 포함한다. 또한 이 용어는, 예컨대 암종 및 육종 조직으로 구성된 악성 종양을 포함하는, 암육종(carcinosarcomas)를 포함한다. "선암종"은 선 조직 유래의 선종이거나 또는 종양 세포가 인식가능한 선 구조를 형성하는 선종을 언급한다. "육종"은 간엽 파생의 악성 종양으로 당업계에 인식되고 언급되고 있다.
융합 단백질의 생산
융합 단백질의 제1일원 및 제2일원을 각각 서로, 바람직하게는 링커 서열을 통해, 연결시킬 수 있다. 링커 서열은 각 일원이 적절하게 2차 및 3차 구조로 확실하게 접히기에 충분한 거리로 융합 단백질의 제1일원 및 제2일원을 분리하여야 한다. 바람직한 링커 서열은 (1) 가요성있게 연장되는 입체형태를 채택하여야 하고, (2) 기능적인 제1일원 및 제2일원과 상호작용할 수 있는 정연한 2차 구조를 발휘하는 경향을 나타내서는 않되며, (3) 기능적인 단백질 도메인과의 상호작용을 증진시킬 수 있는, 소수성 또는 전하를 띤 특성을 최소한도로 보유하여야 한다. 가요성있는 단백질 영역 내 특유한 표면 아미노산은 Gly, Asn 및 Ser를 포함한다. Gly, Asn 및 Ser를 포함하는 아미노산 서열의 치환은 링커 서열의 상기 기준을 충족시키는 것으로 예상된다. Thr 및 Ala 같이 거의 중성인 다른 아미노산도 링커 서열에 사용될 수 있다.
20개 아미노산의 링커 서열 길이를 사용하여 기능적인 단백질 도메인들을 적절히 분리할 수 있으나, 더 길거나 또는 짧은 링커 서열도 사용할 수 있다. 제1일원 및 제2일원을 분리하는 링커 서열의 길이는 5 내지 500개 아미노산 길이일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 5 내지 100개 아미노산 길이이다. 링커 서열 길이는 5-30개 아미노산이 바람직하다. 바람직한 구체에에서, 링커 서열은 약 5 내지 약 20개 아미노산이며, 약 10개 내지 20개 아미노산이 유리하다. 제1일원 및 제2일원의 링커로 유용한 아미노산 서열은 비제한적으로 (SerGly4)y(여기서, y는 8이상임) 또는 Gly4SerGly5Ser를 포함한다. 바람직한 링커 서열은 식(SerGly4)4를 보유한다. 다른 바람직한 링커는 서열((Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)3-Ser-Pro)을 보유한다.
제1일원 및 제2일원은 링커 서열 없이 직접 융합될 수 있다. 링커 서열은 융합된 단백질이 기능적인 도메인들을 분리하고 입체 장애를 방어하는데 사용될 수 있는 비필수 N- 또는 C-말단 아미노산 영역을 보유하는 경우 불필요하다. 바람직한 구체예에서, 제1일원의 C-말단은 제2일원의 N-말단에 직접 융합될 수 있으며, 그 반대도 마찬가지이다.
재조합 생산
본 발명의 융합 단백질은 융합 단백질을 암호하는 핵산 분자를 사용하여 표준 재조합 DNA 기법으로 제조될 수 있다. 융합 단백질을 암호하는 뉴클레오티드 서열은 표준 DNA 합성 방법에 의해 합성될 수 있다.
융합 단백질을 암호하는 핵산은 숙주 세포, 예컨대 1차 또는 불멸 세포주의 세포 안으로 도입될 수 있다. 재조합 세포를 사용하여 융합 단백질을 생산할 수 있다. 융합 단백질을 암호하는 핵산을 숙주 세포 안으로, 예컨대 상동성 재조합에 의해, 통합시킬 수 있다. 대부분의 경우, 융합 단백질을 암호하는 핵산은 재조합 발현 벡터 안으로 통합된다.
융합 단백질을 암호하는 뉴클레오티드 서열은 발현을 위해 사용되는 숙주 세포에 기초하여 선택된, 하나 이상의 조절성 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 융합 단백질 화합물을 암호하는 서열이 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 방식으로 조절성 서열(들)에 연결된 것을 의미한다. "조절성 서열"은 프로모터, 인헨서 및 기타 발현 제어 요소(예, 폴리아데닐화 신호)을 언급한다. 이러한 조절성 서열은 예를들면, 문헌[Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)]에 설명되어 있으며, 이 내용은 본 명세서에 인용되어 있다. 조절성 서열은 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성성 발현을 유도하는 것들, 특정 숙주 세포(예, 조직-특이 조절성 서열)에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도하는 것들, 및 조절가능한 방식으로(예, 오직 유도성 제제의 존재하에서만) 발현을 유도하는 것들을 포함한다. 발현 벡터의 설계가 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 융합 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 융합 단백질 발현 벡터는 숙주 세포 안으로 도입되어 핵산에 의해 암호된 융합 단백질을 생산할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서 융합 단백질을 발현하도록 설계될 수 있다. 예를들면, 융합 단백질은 이.콜리, 곤충 세포(예, 바큘로바이러스 발현 시스템), 효모 세포 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 몇몇 적절한 숙주 세포가 문헌[Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)]에 더 논의되어 있다. 효모 S. 세레비시애에서의 발현벡터의 예는 pYepSec1(Baldari et al.,(1987) EMBO J. 6:229-234),pMFa(Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88(Schultz et al.,(1987) Gene 54:113-123) 및 pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, CA)를 포함한다. 배양된 곤충 세포(예, Sf 9 세포)에서의 융합 단백질의 발현에 유용한 바큘로바이러스 벡터는 pAc 시리즈(Smith et al.,(1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165) 및 pVL 시리즈(Lucklow, V.A., 및 Summers, M.D.,(1989) Virology 170:31-39)를 포함한다.
포유류 발현 벡터의 예는 pCDM8(Seed, B.,(1987) Nature 329:840) 및 pMT2PC(Kaufman et al.(1987), EMBO J. 6:187-195)을 포함한다. 포유류 세포에 사용되는 경우, 발현 벡터의 제어 기능은 바이러스 조절성 요소에 의해 제공된다. 예를들면, 통상 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 시토메갈로바이러스 및 원숭이 바이러스 40으로부터 유래한다.
상기 논의된 조절성 제어 서열에 부가하여, 재조합 발현 벡터는 추가의 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 예를들면, 재조합 발현 벡터는 선별 마커 유전자를 암호하여 벡터를 통합한 숙주 세포를 확인할 수 있다. 게다가, 숙주 세포(특히, 포유류 숙주세포)로부터 융합 단백질의 분비를 촉진시키기 위해, 재조합 발현 벡터는 융합 단백질의 아미노 말단을 암호하는 서열에 작동가능하게 연결된 신호 서열을 암호하여, 발현시 융합 단백질이 아미노 말단에 융합된 신호 서열과 함께 합성되게 할 수 있다. 이 신호 서열은 세포의 분비 경로로 융합 단백질을 안내하고 이어서 절단되어 숙주 세포로부터 성숙한 융합 단백질(즉, 신호 서열이 없는 융합 단백질)이 방출될 수 있도록 한다. 포유류 숙주 세포로부터 단백질 또는 펩티드의 분비를 용이하게 하기 위해 신호 서열을 사용하는 것은 당업계에 알려져 있다.
벡터 DNA는 종래 형질전환 또는 형질감염 기법을 통해 원핵 또는 진핵 세포 안으로 도입될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 외래 핵산(예, DNA)을 숙주 세포 안으로 도입시키기 위해 당업계에 인식된 다양한 기법을 언급하며, 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침법, DEAE-덱스트란-매개성 형질감염, 리포펙션, 전기천공법, 미세주입법 및 바이러스-매개성 형질감염을 포함한다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 적절한 방법은 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)] 및 기타 실험실 매뉴얼에서 찾을 수 있다.
종종 오직 작은 분획의 포유류 세포가 외래 DNA를 지놈에 통합시킨다. 이들 통합체를 확인 및 선별하기 위해, 선별 마커(예, 항생제 내성)를 암호하는 유전자를 융합 단백질 암호 유전자와 함께 숙주 세포 안으로 도입시킬 수 있다. 바람직한 선별 마커는 약물(예, G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트)에 내성을 부여하는 것을 포함한다. 선별 마커를 암호하는 핵산은 융합 단백질을 암호하는 벡터와 동일한 벡터 상에서 숙주 세포 내로 도입될 수 있거나 분리된 벡터 상에서 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정하게 형질감염된 세포는 약물 선별에 의해 동정될 수 있다(예, 선별 마커 유전자가 통합된 세포는 생존하나 다른 세포는 죽을 것이다).
재조합 발현 벡터는, 예를들면 T7 프로모터 조절성 서열 및 T7 폴리머라제를 사용하여, 시험관내 전사 및 번역을 할 수 있다.
트랜스제닉 포유류
비인간 트랜스제닉 동물을 형성시키는 방법이 본 명세서에 설명되어 있다. DNA 구조물을 포유류의 배선에 도입시켜 트랜스제닉 포유류를 만들 수 있다. 예를들면, 하나 또는 수개 사본의 구조물을 표준 트랜스제닉 기법에 의해 포유류 배아의 지놈 내로 통합시킬 수 있다.
트랜스제닉 포유류의 젖에 트랜스제닉 단백질을 발현시키는 것이 종종 바람직하다. 대량의 젖을 생산하고 젖분비 기간이 긴 포유류가 바람직하다. 바람직한 포유류는, 반추동물, 예를들면 암소, 양, 낙타 또는 염소(예, 스위스산 염소, 알파인, 사아넨 및 토그젠부르그 변종 염소)이다. 다른 바람직한 동물은 황소, 토끼 및 돼지이다.
예시적인 구체예에서, 트랜스제닉 비인간 동물은 트랜스 유전자를 비인간 동물의 배선 안으로 도입시킴으로써 생산된다. 트랜스 유전자는 다양한 발달 단계에서 배아 표적 세포 안으로 도입될 수 있다. 배아 표적 세포의 발달 단계에 따라 상이한 방법이 사용된다. 사용되는 임의의 동물의 특정 주(들)는 가능하다면 일반적으로 우수한 건강 상태, 우수한 배아 수율, 우수한 배아내 전핵 가시성, 및 우수한 재생산 적합성에 대해 선별되어야 한다.
배아 내로의 융합 단백질 트랜스 유전자의 도입은 미세주입법, 전기천공법 또는 리포펙션 같은 당업계에 알려진 각종 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를들면, 융합 단백질 트랜스 유전자는 수정된 포유류 난(들)의 전핵 안으로 구조물을 미세주입시킴으로써 포유류 내로 통합시켜, 발달하는 포유류(들)의 세포 내에하나 이상 사본의 구조물이 유지되도록 할 수 있다. 수정된 난 안으로 트랜스 유전자 구조물을 통합시킨 후, 다양한 시간 동안 난을 시험관내 항온배양하거나/하고 대리모 숙주 안으로 재이식시킬 수 있다. 통상적인 방법 중 하나는 종에 따라 약 1-7일 동안 배아를 시험관내 항온배양하고 대리모 숙주 안으로 이들을 재이식한다.
유전자도입법으로 조작한 배아의 자손은 조직 분절의 서던 블럿 분석에 의해 구조물의 존재 여부를 시험할 수 있다. 지놈 안으로 안정하게 통합된 하나 이상 사본의 외래성 클론 구조물을 보유하는 배아를 사용하여 유전자 도입법에 의해 부가된 구조물을 운반하는 영구 트랜스제닉 포유류 주를 확립할 수 있다.
유전자도입법에 의해 변형된 포유류의 한배 새끼들은 출산 후 자손의 지놈 내로 구조물이 통합되었는지 여부에 대해 분석할 수 있다. 이는 융합 단백질 또는 이의 분절을 암호하는 DNA 서열에 대응하는 프로브를 자손의 염색체 재료 상에서 하이브리드시킴으로써 수행될 수 있다. 지놈 내 하나 이상 사본의 구조물을 함유하는 것으로 밝혀진 이들 포유류 자손을 성장시켜 충분히 발달시켰다. 이들 자손 중 암컷 종은 젖 내에 또는 젖과 함께 원하는 단백질을 생산할 것이다. 트랜스제닉 포유류는 사육하여 젖에서 원하는 단백질을 젖에 생산하는데 유용한 다른 트랜스제닉 자손을 생산할 수 있다.
트랜스제닉 암컷은 당업게에 알려진 분석 기법, 예컨대 웨스턴 블럿 또는 효소 분석을 사용하여 젖 안으로 단백질이 분비되는지 시험할 수 있다.
다른 트랜스제닉 동물
융합 단백질은 다양한 트랜스제닉 동물로부터 발현될 수 있다. 트랜스제닉돼지의 생산에 대한 프로토콜은 문헌[White and Yannoutsos, Current Topics in Complement Research: 64th Forum in Immunology, pp.88-94; 미국특허 제5,523,226호; 미국특허 제5,573,933호; PCT 출원 제WO93/25071호; 및 PCT 출원 제WO95/04744호]에서 확인할 수 있다. 트랜스제닉 마우스의 생산에 대한 프로토콜은 미국특허 제5,530,177호에서 확인할 수 있다. 트랜스제닉 래트의 생산에 대한 프로토콜은 문헌[Bader and Ganten, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, Supp. 3:S81-S87, 1996]에서 확인할 수 있다. 트랜스제닉 암소의 생산에 대한 프로토콜은 문헌[Trnasgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc.]에서 확인할 수 있다. 트랜스제닉 양의 생산에 대한 프로토콜은 문헌[Trnasgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc.]에서 확인할 수 있다. 트랜스제닉 토끼의 생산에 대한 프로토콜은 문헌[Hammer et al., Nature 315:680-683, 1985 및 Taylor and Fan, Frontiers in Bioscience 2:d298-308, 1997]에서 확인할 수 있다.
트랜스제닉 동물의 젖 안으로의 트랜스제닉 단백질 생산
젖 특이 프로모터
유용한 전사 프로모터는 유선 상피 세포에서 우선적으로 활성화되는 프로모터들이며, 카제인, 베타 락토글로불린(Clark et al., (1989) Bio/Technology 7:487-492), 유장산 단백질(Gorton et al.(1987) Bio/Technology 5:1183-1187) 및 락트알부민(Soulier et al.,(1992) FEBS Letts. 297:13)과 같은 젖 단백질 암호 유전자를 제어하는 프로모터를 포함한다. 임의의 포유류 종의 알파, 베타, 감마 또는카파 카제인 유전자 프로모터를 사용하여 유선 발현을 제공할 수 있고; 바람직한 프로모터는 염소 베타 카제인 유전자 프로모터(DiTullio, (1992) Bio/Technology 10:74-77)이다. 젖-특이 단백질 프로모터 또는 유선 조직에서 특이적으로 활성화되는 프로모터들은 cDNA 또는 지놈성 서열들로부터 분리될 수 있다. 이들의 기원은 지놈이 바람직하다.
DNA 서열 정보는, 적어도 하나 그리고 종종 수개 유기체에서, 상기 나열된 유선 특이 유전자에 유용하다. 예를들면, 문헌[Richards et al., J. Biol. Chem. 256, 526-532(1981)(α-락트알부민 래트); Campbell et al., Nucleic Acids Res. 12, 8685-8697(1984)(래트 WAP); Jones et al., J.Bio.Chem. 260, 7042-7050(1985)(래트 β-카제인); Yu-Lee & Rosen, J.Biol.Chem. 258, 10794-10804(1983)(래트 γ-카제인); Hall, Biochem. J.242, 735-742(1987)(α-락트알부민 인간); Stewart, Nucleic Acids Res. 12, 389(1984)(소 αs1 및 κ카제인 cDNAs); Gorodetsky et al., Gene 66, 87-96(1988)(소 β카제인); Alexander et al., Eur.J.Biochem. 178, 395-401(198)(소 κ카제인); Brignon et al., FEBS Lett. 188, 48-55(1977)(소 αS2 카제인); Jamieson et al., Gene 61, 85-90(1987), Ivanov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 425-429(1988), Alexander et al., Nucleic Acids Res. 17, 6739(1989)(소 β락토글로불린); Vilotte et al., Biochimie 69, 609-620(1987)(소 α-락트알부민)]을 참조하라. 다양한 젖 단백질 유전자의 구조 및 기능은 문헌[Mercier & Vilotte, J. Dairy Sci. 76, 3079-3098(1993), 본 명세서에 인용되어 있음]에 개괄되어 있다. 추가 인접 서열이 발현을 최적화하는데 유용하다면, 이러한 서열은 프로브로서 현존하는 서열을 사용하여 클로닝할 수 있다. 상이한 유기체로부터 나온 유선 특이 조절성 서열은 알려진 동족 뉴클레오티드 서열 또는 프로브로서 동족 단백질에 대한 항체를 사용하여 이러한 유기체로부터 나온 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다.
신호 서열
유용한 신호 서열은 젖-특이 신호 서열 또는 진핵 또는 원핵 단백질 분비를 산출하는 기타 신호 서열이다. 바람직하게는 신호 서열은 젖-특이 신호 서열로부터 선택된다. 즉, 젖으로 분비되는 생산물을 암호하는 유전자로부터 나온다. 가장 바람직한 젖-특이 신호 서열은 본 발명의 발현 시스템에 사용되는 젖-특이 프로모터와 관련이 있다. 신호 서열의 크기는 본 발명에서 중요하지 않다. 필요한 것은, 예를들면 유선 조직에서, 원하는 재조합 단백질을 분비하기에 충분한 크기를 서열이 가지는 것이다. 예를들면, 카제인(예컨대 알파, 베타, 감마 또는 카파 카제인), 베타 락토글로불린, 유장산 단백질 및 락트알부민에 대한 암호 유전자로부터 나온 신호 서열이 본 발명에 유용하다. 바람직한 신호 서열은 염소 β-카제인 신호 서열이다.
다른 분비성 단백질(예, 면역글로불린, 또는 간세포, 신장세포 또는 췌장세포에 의해 분비되는 단백질)로부터 나온 신호 서열도 사용될 수 있다.
절연체 서열
본 발명의 DNA 구조물은 적어도 하나의 절연체 서열을 추가로 포함한다. 용어 "절연체", "절연체 서열" 및 "절연체 요소"는 본 명세서에서 서로 호환되어 사용된다. 절연체 요소는 작용 범위내에 배치된 유전자들의 전사를 격리시키나 유전 자 발현을 음성적으로 또는 양성적으로 교란시키지 않는 제어 요소이다. 절연체 서열은 번역되는 DNA 서열 양쪽 중 한쪽에 삽입되는 것이 바람직하다. 예를들면, 절연체는 프로모터의 5'으로부터 약 200bp 내지 약 1kb 위치에 있고, 프로모터로부터 적어도 약 1kb 내지 5kb 위치에, 관심있는 유전자의 3' 단부에서 있을 수 있다. 프로모터로부터의 절연체 서열과 관심있는 유전자의 3'단부 사이의 거리는 당업자에 의해 측정될 수 있고, 구조물 내에 사용되는 관심있는 유전자, 프로모터 및 인헨서의 상대적인 크기에 따라 다르다. 게다가, 하나이상의 절연체 서열은 프로모터로부터 5'위치에 또는 트랜스 유전자의 3' 단부 위치에 있을 수 있다. 예를들면, 두개 이상의 절연체 서열은 프로모터의 5' 위치에 있을 수 있다. 절연체 또는 트랜스 유전자의 3'단부에 있는 절연체들은 관심있는 유전자의 3' 단부에, 또는 3' 조절성 서열의 3' 단부에, 예를들면 3'비번역 영역(UTR) 또는 3' 인접 서열에 위치할 수 있다.
바람직한 절연체는 닭 β-글로빈 좌위의 5' 단부를 포함하고 PCT 공개 제94/23046호(본 명세서에 인용되어 있음)에 설명된 닭 5' 구성성 과민감성 부위에 해당하는 DNA 분절이다.
DNA 구조물
융합 단백질은 유선 상피 세포에 특이적인 프로모터, 예컨대, 카제인 프로모터(예, 염소 베타 카제인 프로모터), 젖-특이 신호 서열, 예컨대 카제인 신호 서열(예, β-카제인 신호 서열) 및 융합 단백질 암호 DNA를 포함하는 구조물로부터발현될 수 있다.
또한, 구조물은 비분비성 단백질을 암호하는 DNA 서열의 하류에 있는 3'비번역 영역을 포함할 수 있다. 이러한 영역은 발현 시스템의 RNA 전사체를 안정화시키고 이로인해 발현 시스템으로부터 원하는 단백질의 수율을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 구조물에 유용한 3'비번역 영역 중에는 폴리 A 신호를 제공하는 서열이 있다. 이러한 서열은, 예를들면 SV40 소(小) t 항원, 카제인 3'비번역 영역 또는 당업계에 잘 알려진 기타 3' 비번역 서열들로부터 유래될 수 있다. 3'비번역 영역은 젖 특이 단백질로부터 유래하는 것이 바람직하다. 3'비번역 영역의 길이는 중요하지 않으나 폴리 A 전사체의 안정화 효과는 발현 서열의 RNA를 안정화시키는데 중요한 것으로 보인다.
구조물은 프로모터와 신호서열 암호 DNA 서열 사이에 있는 5'비번역 영역을 포함할 수 있다. 이러한 비번역 영역은 프로모터가 취해진 동일한 제어 영역으로부터 나올 수 있거나 상이한 유전자로부터 나올 수 있다(예, 이들은 다른 합성, 반합성 또는 천연 공급원으로부터 유래될 수 있다). 다시 이들의 특정 길이는 중요하지 않으나, 이들은 발현 수준을 향상시키는데 유용한 것으로 보인다.
또한 구조물은 유선 상피 세포에서 우선적으로 발현되는 유전자 중 약 10%, 20%, 30% 또는 그 이상의 N-말단 암호화 영역을 포함할 수 있다. 예를들면, N-말단 암호화 영역은 사용된 프로모터에 해당할 수 있으며, 예컨대 염소 β-카제인 N-말단 암호화 영역이 있다.
선행기술 방법은 구조물을 제작하는 단계 및, 배양된 세포에서 생산물의 생산 능력에 대해 시험한 후 트랜스제닉 동물에 구조물의 위치시키는 단계를 포함할 수 있다. 놀랍게도, 본 발명자는 이러한 프로토콜이, 예를들면 트랜스제닉 동물의 젖에서, 정상적으로 비-분비성 단백질이 분비되는지 여부를 결정하는데 있어서 예언적인 평가(predictive value)를 갖지 않을 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 트랜스제닉 동물, 예컨대 트랜스제닉 마우스에서 직접 구조물을 시험하는 것이 바람직할 수 있으며, CHO 세포에서 분비되지 못하는 몇몇 구조물이 트랜스제닉 동물의 젖으로 분비된다.
젖으로부터의 정제
트랜스제닉 융합 단백질은 다소 고농도로 그리고 대량으로 젖 안에 생산될 수 있으며, 이로인해 연장할 수 있는 자원으로부터 용이하게 수확되는 정상적으로 프로세싱된 펩티드를 계속적으로 고수준으로 제공할 수 있다. 젖으로부터 단백질을 분리하는데 있어서 당업계에 알려진 수개의 상이한 방법이 있다.
통상 젖 단백질은 공정들의 조합에 의해 분리된다. 먼저 미처리 젖을 분류하여, 예컨대 웃더껑이를 걷어냄(skimming), 원심분리, 침강(H.E. Swaisgood, Developments in Dairy Chemisty, I: Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers, NY, 1982), 산 침전(미국특허 제4,644,056호) 또는, 레닌 또는 키모트립신으로의 효소적 응집(Swaisgood, ibid.)에 의해, 지방을 제거한다. 이어서 주요 젖 단백질은 관심있는 특정 단백질이 즉시 정제될 수 있는 큰 부피의 침전물 또는 투명 용액으로 분류할 수 있다.
USSN 08/648,235는 접선 유동 여과법에 의해 전체 젖 또는 젖 분획으로부터생물학적으로 활성있는 형태로 펩티드와 같은 수용성 젖 성분을 분리하는 방법을 개시하고 있다. 이전의 분리 방법과 달리, 이 방법은 전체 젖의 최초 분류가 지방 및 카제인 교질입자를 제거할 필요를 제거하여, 이로인해 공정을 단순화시키고 회수 및 생활성의 손실을 피할 수 있게 한다. 이 방법은 추가로 오염물을 제거하고 관심있는 성분을 정제하기 위한 부가적인 정제 단계와 병용하여 사용될 수 있다.
트랜스제닉 동물의 난에서의 트랜스제닉 단백질 생산
융합 단백질은 트랜스제닉 동물의 조직, 분비물 또는 기타 생산물(예, 난)에서 생산될 수 있다. 예를들면, 융합 단백질은 당업계에 알려진 방법(Sang et al., Trends Biotechnology, 12:415-20, 1994)을 사용하여 트랜스제닉 동물(바람직하게는 트랜스제닉 칠면조, 오리, 거위, 타조, 기니 새, 공작, 자고, 꿩, 비둘기 그리고 더욱 바람직하게는 트랜스제닉 닭)의 난에서 생산될 수 있다. 난에서 특이적으로 발현되는 단백질을 암호하는 유전자, 예컨대 난황 단백질 유전자 및 알부민 단백질 유전자를 수정하여 융합단백질의 발현을 유도할 수 있다.
난 특이 프로모터
유용한 전사 프로모터는 난에서 우선적으로 활성화되는 프로모터이며, 난 단백질, 예컨대 난백 알부민, 리소자임 및 아비딘을 암호하는 유전자를 제어하는 프로모터를 포함한다. 닭 난백 알부민, 리소자임 또는 아비딘 유전자로부터 나온 프로모터가 바람직하다. 난 특이 단백질 프로모터 또는 난 조직에서 특이적으로 활성화되는 프로모터는 cDNA 또는 지놈성 서열들로부터 나올 수 있다. 난-특이 프로모터의 기원은 지놈인 것이 바람직하다.
난 특이 유전자의 DNA 서열은 당업계에 알려져 있다(예를들면, Burley et al., "The Avian Egg", John Wiley and Sons, p.472, 1989을 참조하라. 본 명세서에 인용되어 있음). 추가 인접 서열이 발현을 최적화하는데 유용하다면, 이러한 서열들은 프로브로서 현존하는 서열들을 사용하여 클로닝될 수 있다. 상이한 유기체로부터 나온 난 특이 조절성 서열은 알려진 동족 뉴클레오티드 서열 또는 프로브로서 동족 단백질에 대한 항체를 사용하여 이 유기체로부터 나온 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다.
트랜스제닉 식물
융합 단백질은 트랜스제닉 유기체, 예컨대 트랜스제닉 식물(예, DNA 트랜스 유전자가 핵 또는 색소체 지놈 안으로 삽입된 트랜스제닉 식물)에서 발현될 수 있다. 식물 형질전환은 당업계에 알려져 있다. 통상, 문헌[Methods in Enzymology Vol. 153("Recombinant DNA Part D" 1987, Wu and Grossman Eds., Academic Press 및 유럽특허출원 EP 693554]을 참조하라.
수개 방법을 통해 식물 세포 또는 원형질체 안으로 외래 핵산을 도입시킬 수 있다. 예를들면, 핵산은 미세피펫을 사용하여 식물 세포 안으로 직접 미세주입함으로써 기계적으로 전달될 수 있다. 또한 외래 핵산은 세포에 의해 흡수되고 유전자 물질과 침전 복합체를 형성하는 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 식물 세포 내로 전달될 수 있다(Paszkowski et al.(1984) EMBO J. 3:2712-22). 외래 핵산은 전기천공법에 의해 식물 세포 내로 도입될 수 있다(Fromm et al.(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824). 이 기법에서, 식물 원형질체는 관련 유전자 구조물을 함유하는플라스미드 또는 핵산의 존재 하에 전기천공된다. 높은 장 세기의 전기 충격은 가역적으로 생체막을 투과가능하게 하여 플라스미드가 도입될 수 있게 한다. 전기천공된 식물 원형질체는 세포벽을 재형성하고, 이분되고 식물 캘러스를 형성한다. 형질전환된 유전자로 형질전환된 식물 세포의 선별은 표현형적 마커를 사용하여 수행할 수 있다.
꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)는 외래 핵산을 식물 세포 안으로 도입시키기 위한 벡터로 사용할 수 있다(Hohn et al.(1982) "Molecular Biology of Plant Tumors" Academic Press, New York, pp.549-560; Howell, 미국특허 제4,407,956호). CaMV 바이러스 DNA 지놈은 박테리아 내에서 증식될 수 있는 재조합 DNA 분자를 형성하는 부모 박테리아 플라스미드 안으로 삽입된다. 재조합 플라스미드는 원하는 DNA 서열을 도입함으로써 추가 수정될 수 있다. 이어서, 재조합 플라스미드의 수정된 바이러스 부위를 부모 박테리아 플라스미드로부터 잘라내어 식물 세포 또는 식물을 접종하는데 사용한다.
소(小)입자에 의한 고속 탄도 관통을 사용하여 외래 핵산을 식물 세포 내로 도입시킬 수 있다. 핵산은 소 비드 또는 입자의 매트릭스 사이 또는 표면상에 배치되어 있다(Klein et al.(1987) Nature 327:70-73). 통상 새로운 핵산 분절의 단일 도입이 필요하지만 이러한 방법은 또한 다수개 도입에 제공된다.
핵산은 핵산으로 형질전환된아그로박테륨 투메파시엔스로 식물 세포, 이식편, 분열조직 또는 종자를 감염시킴으로써 식물 세포 안으로 도입될 수 있다. 적절한 조건하에, 형질전환된 식물 세포가 성장하여 줄기, 뿌리를 형성하고 식물로 추가 발달된다. 핵산은, 예를들면아그로박테륨 투메파시엔스의 Ti 플라스미드에 의해, 식물 세포 안으로 도입될 수 있다. Ti 플라스미드는아그로박테륨 투메파시엔스로 감염될 때 식물 세포에 전달되고, 식물 지놈 안으로 안정하게 통합된다(Horsh et al.(1984) "Inheritance of Functional Foreign Genes in Plants" Science 233:496-498; Fraley et al.(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803).
원형질체를 분리 및 배양하여 완전히 재생된 식물을 수득할 수 있는 식물을 형질전환시켜, 전달된 외래 유전자를 함유하는 전체 식물을 회수할 수 있다. 몇몇 적절한 식물은, 예를들면, 프라가리아, 로투스, 메디카고, 오노브리치스, 트리폴륨, 트리고넬라, 비그나, 시트루스, 리눔, 제라늄, 마니핫, 다우쿠스, 아라비돕시스, 브라시카, 라파누스, 시나피스, 아트로파, 카프시쿰, 하이오시키아무스, 리코페르시콘, 니코티아나, 솔라눔, 페투니아, 디지탈리스, 마조라나, 시오호륨, 헬리안투스, 락투카, 브로무스, 아스파라구스, 안티리눔, 헤레로칼리스, 네메시아, 펠라르고늄, 파니쿰, 페니세툼, 라눈쿨루스, 세네시오, 살피글로시스, 쿠쿠미스, 브로와알리아, 글리신, 롤륨, 지아, 트리티쿰, 소르그훔, 및 다투라 속으로부터 나온 종들을 포함한다.
배양된 원형질체로부터의 식물 재생은 문헌[Evans et ., "Protoplasts Isolation and Culture" Handbook of Plant Cell Cultures 1:124-176(MacMillan Publishing Co. NY 1983); M.R. Davey, "Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts" Protoplasts(1983)-Lecture Proceedings, pp.12-29, (Birkhauser, Basal 1983); P.J. Dale, "Protoplast Culture and PlantRegeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops", Protoplasts(1983)-Lecture Proceedings, pp.31-41,(Birkhauser, Basel 1983); 및 H. Binding, "Regeneration of Plants", Plant Protoplasts, pp. 21-73,(CRC Press, Boca Raton 1985)]에 설명되어 있다.
원형질체로부터의 재생은 식물의 종마다 다르나, 통상 외래성 서열의 사본을 함유하는 형질전환된 원형질체 현탁액을 먼저 형성한다. 이어서, 특정 종에서, 원형질체 현탁액으로부터 천연 배아와 같이 원숙 및 발아 단계로 배아 형성을 유도할 수 있다. 배양 배지는 다양한 아미노산 및 호르몬(예, 옥신 및 시토키닌)을 함유할 수 있다. 또한, 특히 옥수수 및 자주개자리와 같은 종의 경우, 배지에 글루탐산 및 프롤린을 첨가하는 것이 유익할 수 있다. 줄기 및 뿌리는 일반적으로 동시에 발달한다. 효과적인 재생은 배지, 유전자타입 및 배양의 내력에 좌우될 것이다. 이들 3개의 변수가 제어되면 재생은 완전히 재현가능하며 반복가능하다.
무성 번식 작물에서, 성숙한 트랜스제닉 식물은 자른 가지들을 취득함으로써 또는 조직 배양 기법에 의해 증식되어, 생산 특성에 대한 시험과 같이 실험하고자 하는 다수개의 동일 식물을 생산할 수 있다. 원하는 트랜스제닉 식물을 선별하고, 이로인해 새로운 변종을 수득하고, 상업적 판매용으로 무성적으로 번식시킨다. 종자 번식 작물에서, 성숙한 트랜스제닉 식물은 자가 교배시켜 동형접합성 교배 식물을 생산할 수 있다. 교배 식물은 새롭게 도입된 외래 유전자 활성 수준을 위해 유전자 함유 종자를 생산한다. 이들 종자는 성장하여 선택된 표현형을 보유한 식물을 생산할 수 있다. 본 발명에 따른 교배를 사용하여 새로운 하이브리드를 개발할 수있다. 이 방법에서 선택된 교배주는 다른 교배주와 교배시켜 하이브리드를 형성한다.
트랜스제닉 식물로부터 얻은 부분들, 예컨대 꽃, 종자, 잎, 가지, 과수 등은, 이렇게 형질전환된 세포들을 포함하는 한, 본 발명에 포함된다. 재생된 식물의 자손 및 변이체 및 돌연변이체는 또한 그 부분이 도입된 DNA 서열을 포함하는 한 본 발명에 포함된다. 재생된 식물의 자손 및 변이체 및 돌연변이체도 본 발명의 범주 내에 포함된다.
트랜스제닉 식물 또는 식물 세포의 선별은 육안 분석, 예컨대 색상 변화 관찰(예, 백색 꽃, 다양한 색소 생산 및 꽃의 일정한 색상 패턴 또는 불규칙적인 패턴)에 기초할 수 있으나 또한 효소 활성 또는 생성물 정량과 같은 생화학적 분석을 포함할 수 있다. 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포는 관심있는 식물 부분을 보유하는 식물로 성장하고 유전자 활성이, 예를들면 육안적 외관(플라보노이드 유전자의 경우) 또는 생화학적 분석(노던 블럿); 웨스턴 블럿; 효소 분석 및 플라보노이드 화합물 분석(분광학 포함)에 의해, 모니터링된다. 문헌[Harborne et al.(Eds), (1975) The Flavonoids, Vols. 1 and 2, [Acad. Press]]을 참조하라. 적절한 식물을 선택하고 추가 평가한다. 유전적으로 조작된 식물의 형성 방법은 미국특허 제5,283,184호, 미국특허 제5,482,852호 및 유럽 특허 출원 EP 693 554에 추가로 설명되어 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 인용되어 있다.
본 발명의 구체예는 하기 실시예에 의해 더 설명되나, 이들 실시예를 제한의 목적으로 해석되어서는 않된다. 본 출원 전체를 통해 인용된 모든 문헌(인쇄물, 발행된 특허, 공개된 특허출원 및 공계류 중인 특허 출원)의 내용은 본 명세서에 분명하게 인용문헌으로 인용되어 있다.
하기 실시예 1 및 2는 두개의 구조물인 경쇄 구조물 및 중쇄/β-글루쿠로니다제 융합체 구조물의 형성을 설명한다. 하나는 항체 중쇄/인간 β-글루쿠로니다제 융합 단백질의 클론을 함유하고 다른 하나는 카파 경쇄 서열을 함유하는 두개의 플라스미드를 Behringwerke AG로부터 얻었다.
실시예 1: 경쇄(LC) 구조물의 제작
이 실시예는 유선 특이 발현 벡터(Bc163) 및 상업용 포유류 발현 벡터(pcDNA3) 안으로 서브클로닝된, 태아성 암 항원(431)에 대한 인간화된 단클론성 항체로부터 나온 경쇄 뉴클레오티드 서열을 사용하여 경쇄 핵산 구조물을 형성시키는 것을 설명한다.
간단히 말하자면, 경쇄 서열을 함유하는 Hind III-EcoRI 단편을 pGEM3z 안으로 서브클로닝하여 추가 조작을 용이하게 했다. a) 암호화 영역의 시작점에 Sal I, Xho I, 및 Kozak 공통 서열을 형성하고 b) 종결 코돈 직후에 Sal I 부위를 형성하기 위해 두개의 돌연변이를 만들었다.
원래 구조물은 대략 1300개 염기의 비공지 서열을 함유하였다. 비공지 서열을 제거하기 위해 틈이 있는 이종이중쇄(heteroduplex) 방법을 사용하여 종결 코돈 직후에 Sal I부위를 형성시켰다. 종결 코돈 직전 그리고 Eco RI 부위 근처에 Sal I 부위들을 사용하여 틈을 만들고, 클레나우 단편, 데옥시뉴클레오티드, T4 DNA 리가제, 및 하기 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 채웠다.
이어서, 틈이 형성된 영역(종결 코돈과 새로운 Sal I 부위에 걸쳐있음)을 서열분석하여 서열상 어떠한 변화도 없음을 확인하였다.
하기 설명되는 차후 단계를 위해 제거되었던 비공지 서열 안에서 두번째 Nco I 부위가 발견되었다. 이 부위를 제거하기 위해, 새로운 Sal I 부위를 함유하는 구조물을 EcoRI으로 소화시키고 클레나우 단편과 데옥시뉴클레오티드로 단부를 채우고, 일상적인 실험 공정에 따라 New England Biolab에서 구매한 Sal I 링커에 라이게이션시켰다. 이어서 두개의 SalI 부위를 함유하는 이 구조물을 SalI로 소화시키고 재라이게이션시켜, 두번째 NcoI 부위를 함유하는 비공지 서열을 제거하였다.
이어서, 택일가능한 시작 부위로 잠재적으로 사용할 수 있는 정확한 시작 코돈 이전에 수개의 ATG 서열이 존재하기 때문에, (Hind III 부위를 단순히 변화시키는 대신) Sal I 부위 및 Kozak 공통 서열을 최초 메티오닌 코돈 직전에 삽입시켰다. 이들 ATG 서열은 조직 배양에서 문제가 되지 않는 것처럼 보이나 가장 안정한 방법은 이 영역을 제거하는 것이었다. 이들 ATG 서열은 Hind III Nco I 부위를 절단하고 SaL I과 Xho I를 함유하는 Hind III--Nco I 어댑터와 Kozak 공통 서열로 교체함으로써 제거되었다. 교체된 영역은 또한 서열분석에 의해 확인되었다.
서열변화는 다음과 같다:
원래 5' 프라이머 영역은 하기 뉴클레오티드 서열(ATG 서열은 대문자로 표시되어 있음, 최초 메티오닌에 해당하는 ATG는 굵은 글씨로 표시되어 있음)을 보유하였다:
원래 서열은 하기 치환 서열로 교체되었다:
이어서, 경쇄의 전체 암호화 영역을 함유하는 SalI 단편을 Bc163, 유선 특이 발현 벡터 및 pcDNA3(상업용 포유류 발현 벡터)의 Xho I 부위 안으로 서브클로닝하였다. 제한 효소 분석 및/또는 서열분석에 의해 배향을 결정하였다. 도 1A는 경쇄구조물(431A)의 도식적인 개략도이다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 1B에 나타나 있다. 도 2는 인간화된 항-태아성 암 항원 항체 431의 경쇄의 암호화 서열을 함유하는 Sal I 삽입체에 대한 뉴클레오티드 서열을 도시한다. 도 3은 인간화된 항-태아성 암 항원 항체 431의 경쇄의 암호화 서열을 함유하는 Sal I 삽입체를 포함하는 구조물(Bc 458)의 도식적인 개략도이다. 또한 침묵인자, 5'β-카제인 비번역 영역, 경쇄 암호화 영역 및 3'β-카제인 비변역 영역의 위치가 표시되어 있다.
실시예 2: 중쇄/β-글루쿠로니다제 융합 구조물의 제작
이 실시예는 유선 특이 발현 벡터(Bc163) 및 상업용 포유류 발현 벡터(pcDNA3) 안으로 서브클로닝된, 태아성 암 항원(431)에 대한 인간화된 단클론성 항체로부터 나온 중쇄 뉴크레오티드 서열을 사용하는 중쇄/β-글루쿠로니다제 융합 단백질 구조물의 형성 방법을 설명한다.
중쇄/β-글루쿠로니다제 융합 서열을 함유하는 Hind III-Xba I 단편을 pGEM3z 안으로 서브클로닝하여 추가 조작을 용이하게 했다. a) 암호화 영역의 시작점에 Sal I, Xho I, 및 Kozak 공통 서열을 형성하고; b) 정확한 아미노산 서열을 유지하면서 내부 Sal I 부위에 있는 서열을 변화시키고; c) 종결 코돈 직후에 Sal I 부위를 형성하기 위한 세개의 돌연변이를 중쇄/β-글루쿠로니다제 융합 구조물의 암호화 영역에 만들었다.
경쇄에 사용한 신호 서열도 중쇄에 사용하였다. Hind III과 Nco I부위 사이의 영역을 제거하고 경쇄에 사용한 동일한 세트의 올리고뉴클레오티드들로 교체하여 최초 메티오닌 코돈 직전에 Sal I 부위 및 Kozak 공통 서열을 형성하였다(상기참조).
내부 Sal I 부위는 단편을 베타 카제인 발현 벡터 안으로 서브클로닝하기 위해서는 변화되어야 했다.
3-프라임 인접 서열은 두개의 폴리아데닐화 신호 부위 및 번역 정지 코돈과 Xba I 부위 사이에 일련의 16개 아데닌 잔기를 포함하였다. 이들 서열을 제거하기 위해 Sal I 부위를 정지 코돈 직후에 삽입시켰다.
상기 변화를 제공하기 위해 틈이 있는 이종이중쇄 방법을 사용하였다. 원래 계획은 Not I와 Xba I 부위 사이의 DNA에 틈을 형성시키고 내부 Sal I 부위를 변화시키고 동시에 3-프라임 Sal I 부위를 첨가하는 것이었다. 이것은 3-프라임 Sal I 부위가 먼저 첨가되고 새로운 틈이 두개의 Bgl II 부위 사이에 만들어져 내부 Sal I 부위를 변화시키도록 수행하기가 어렵다는 것을 입증하였다. 이어서, 틈이 있는 영역 전체를 서열분석하여 상기 서열에 어떠한 변화도 없음을 확인하였다. 오직 발견된 차이는 최초 ATG로부터 1673개 염기 떨어진 4번째 인트론 안에 있었다. 상기 인쇄된 서열에 나타난 바와 같이, 돌연변이된 것과 원래 플라스미드 둘다에서 아데닌 대신 시토신이 발견되었다. 이어서, 중쇄/β-글루쿠로니다제 융합 단백질의 전체 암호화 영역을 함유하는 Sal I 단편을 Bc163, 유선 특이 발현 벡터 및 pcDNA3(상업용 포유류 발현 벡터)의 Xho I 부위 안으로 서브클로닝하였다. 제한 효소 분석 및/또는 서열분석에 의해 배향을 결정하였다. 도 4A는 경쇄 구조물(431A)의 개략적인 도식도이다. 뉴클레오티드와 아미노산 서열이 도 4B에 나타나 있다.
실시예 3: 연결된 구조물의 형성
이 실시예는 단일 코스미드 안으로 함께 연결된 대응하는 상류 및 하류 베타 카제인 서열과 함께 경쇄 및 중쇄/β-글루쿠로니다제 융합체를 포함하는 구조물의 형성을 설명한다.
마우스 또는 기타 종 안으로 함께 투여된 두개의 사슬 단백질(예, 항체) 중 한 사슬만이 통합되는 가능성을 제거하기 위해, 양 사슬을 이들 자체의 대응 상류 및 하류 베타 카제인 서열과 함께 단일 코스미드 안으로 함께 라이게이션시켰다.
이를 달성하기 위해, 하기 올리고뉴클레오티드를 Bam HI 부위 안으로 삽입시킴으로써 이 supercos1(Stratagene)을 수정하였다:
이들 수정은 유일한 Sal I 및 Xho I 부위를 보유한, supercos 334로 지칭되는 새로운 수퍼코스 플라스미드를 형성한다. Pvu I, Not I 및 Eco RI 부위가 이들의 부위에 인접하고 Barn HI 부위가 파괴되어 있다.
수정된 경쇄 및 중쇄/β-글루쿠로니다제 암호화 영역을 각 베타 카제인 5-프라임 그리고 3-프라임 인접 영역 안에 함유하는 Bc174 또는 Bc175로부터 나온 Sal I 단편들을 supercos 334의 Xho I 부위 안으로 삽입하였다. 3개의 클론을 분리하고준비하였다. 배향은 제한 효소 분석에 의해 확인하였다.
클론 # | 이름 | 삽입체 | 배향 |
1 | LC14 | LC | 역방향 |
2 | LC13 | LC | 센스 |
11 | HC9 | HC | 역방향 |
이어서, (상기 사용된) Bc174 및 Bc175로부터 나온 상보적인 Sal I 단편들을 상기 구조물의 Sal I 부위 안으로 라이게이션시켰다(중쇄 단편은 LC 13 및 LC 14 안으로, 경쇄 단편은 HC9 안으로). 이어서 형성된 라이게이션물은 충분히 커서 람다 파아지 입자 안으로 시험관내 팩키지하였고(Amersham kit N.334), 이를 사용하여 이. 콜리 XL1 블루를 감염시켰다. 3개의 변형물이 형성되었고 이들 각 클론 중 하나를 분리 및 준비하였다:
클론 # | 이름 | 삽입체 | 배향 |
1 | Bc180 | HC/LC | 역방향/역방향 |
9 | Bc181 | HC/LC | 센스/센스 |
20 | Bc182 | LC/HC | 역방향/역방향 |
두개의 상이한 경로로 제조되었지만, Bc181과 Bc182는 벡터로부터 절단되어 나올 때 거의 동일한 삽입체이다. 센스 방향에서 관찰할 때, 이들 둘다는 중쇄/β-글루쿠로니다제 Sal I 카세트와 이 뒤에 연결된 경쇄 Sal I 카세트를 함유한다. 각 Sal I 카세트는 5-프라임 베타 카제인 프로모터 영역, 항체 암호화 영역, 그리고 3-프라임 베타 카제인 인접 서열을 함유한다.
본질적으로 두개 종은 경쇄 카세트 이어서 중쇄 카세트, 또는 중쇄 카세트 이어서 경쇄 카세트로 되어 있었다.
실시예 4: 경쇄 및 중쇄/b-글루쿠로니다제 구조물의 특성분석
Opti-MEM(Gibco-BRL)을 사용한 리포펙타민에 대한 표준 프로토콜을 사용하여 cos 7 세포 안으로 형질감염시킨 전술한 pcDNA3 구조물을 사용하여 조작된 DNA 단편들을 조직 배양에서 시험하였다. 제한 배지(DMEM+10%FBS)를 48시간 이후 제거하고 웨스턴 블러팅을 위해 10-20% SDS-PAGE 겔 상에서 전개시켰다.
웨스턴 블럿을 표준 공정에 따라 수행하였다. 간단히 말하자면, 중쇄/베타-글루쿠로니다제의 경우, 샘플을 환원성 조건 하에 3개 한벌로 전개하고 니트로셀룰로즈 상에서 엘렉트로블럿하였다. 이어서, 니트로셀룰로즈를 3개의 분획으로 절단하고 3개의 단클론성 항체 Mab 2149/80, Mab 2156/94, 그리고 Mab 2156/215 각각과 함께 밤새 항온처리하였다. 검출용 2차 항체는 Cappel(cat. no. 55570)로부터 유래하였으며, 친화도로 서양고추냉이 과산화효소에 연결된 염소 항-마우스 IgG를 정제하였다. Amersham에서 나온 ECL 키트로 검출하였다. Mab 2149/80은 웨스턴 블럿 상에서 신호를 보유준 유일한 항체이었다.
경쇄의 경우, 샘플을 다시 환원성 조건 하에 전개하고 니트로셀룰로즈 상에서 엘렉트로블럿하였다. 이어서, 니트로셀룰로즈를 서양 고추냉이 과산화효소에 연결된 염소 항-인간 카파 사슬 항체(Cappel no. 55233)와 함께 밤새 항온처리하였다. Amersham에서 나온 ECL 키트로 검출하였다.
실시예 5: 트랜스제닉 동물의 생산
Sal I로 베타 카제인 구조물 Bc174(경쇄)와 Bc175(중쇄)를 절단하여 박테리아 서열을 방출시킴으로써 미세주입 단편들을 준비하였다. 단편들을 겔 정제하고 이어서 완충액을 교환하고 Promega에 의한 Wizard 시스템을 사용하여 농축하였다.
원래 뉴클레오티드 서열의 미세주입은 염소 베타 카제인 상류 및 암호화 서열들을 함유하는 발현벡터를 사용하여 마우스 모델 시스템에서 시험하였다. 두개의 분리된 구조물을 만들어 마우스 배아 안으로 함께 주입하였다. 이 배아로부터 나온 시조 주를 동정하고 더 시험하였다. 더 높은 백분율의 고생산 동물 주를 생산하도록 하는 "절연체"와 함께 원래 DNA 서열을 동시 주입하였다. 예를들면, 절연체 없이는, 통상 3개 주 중 하나가 다소 높은 생산자일 것이다. 절연체가 있으며, 많은 경우 생산된 거의 모든 주가 고발현 주이다.
두 세트의 주입은 하기와 같이 수행하였다:
제1 세트 주입의 경우, 1249개 배아가 주입되었으며 이중 838개가 생존하고 737개가 가임신 암컷으로 전달되었다. 이들 암컷으로부터 80마리의 생존 새끼가 태어나고, 이중 8마리가 트랜스제닉하고 이중 7마리가 양 사슬을 운반하였다.
제2 세트 주입의 경우, 508개 배아가 주입되었으며 이중 435개가 생존하고 426개가 가임신 암컷으로 전달되었다. 이들 암컷으로부터 44마리의 생존 새끼가 태어나고, 이중 2마리가 트랜스제닉하고 둘다 양 사슬을 운반하였다.
3일에 걸쳐 Bc181이 주입되었다. 이 세트에서, 840개 배아가 주입되었으며 이중 641개가 생존하고 618개가 가임신 암컷으로 전달되었다. 이들 암컷으로부터 39마리의 생존 강아지가 태어나고, 이중 5마리가 트랜스제닉하고 이중 3마리가 양 사슬을 운반하였다. 인접 베타 카제인 서열의 반복으로 인해 몇몇 경우 재조합이 하나의 사슬 또는 다른 하나의 사슬을 결실시키는 것으로 나타난다.
4일에 걸쳐 침묵인자와 함께 Bc181이 주입되었다. 이 세트에서, 1495개 염소배아가 주입되었으며 이중 1183개가 생존하고 1073개가 가임신 염소 암컷으로 전달되었다. 이들 암컷으로부터 111마리의 생존 새끼가 태어나고, 이중 10마리가 트랜스제닉하고 6마리가 양 사슬을 운반하였다. 두마리 새끼는 모두 침묵인자 단편과 양 항체 사슬을 운반한다.
실시예 5: 중쇄/β-글루쿠로니다제 융합 단백질의 돌연변이체 형성
활성있는 분자의 발현을 증가시킬 의도로, 두개의 돌연변이를 중쇄 융합 단백질에서 수행하였다. 제1 돌연변이는 구조물의 힌지 영역을 제거하였다. 제2 돌연변이는 β-글루쿠로니다제 암호화 서열의 시작점에 있는 힌지 및 링커 서열(ala-ala-ala-ala-vla)(서열번호 31)을 제거하여 CH2 부위를 β-글루쿠로니다제에 융합시킨다.
이를 달성하기 위해, 틈이 있는 이종이중쇄 돌연변이유발법을 다시 사용하였다. 구조물 Behring HC5(양 단부가 수정되고 내부 Sal I 부위가 제거된 pGem3Z 내 융합 단백질을 함유)를 (Xba I)로 직선화하였다. 제2 분취량을 BstE2와 Not I로 절단하였다. 함께 끓이고 냉각시킬 때 각 가닥의 일부는 어닐링되어, 이경우는 BstE2와 Not I부위 사이에, 단일 가닥의 틈을 함유하는 이종이중쇄를 형성한다. 이어서, 두개의 구조물을 만들고, 틈이 있는 부위를 서열분석하여 더이상 돌연변이가 우연히 만들어지지 않았다는 것을 확인하였다.
GTC#403: 올리고뉴클레오티드 "Behr 힌지-교대물"(하기 굵은 글씨로 표시함)을 사용하여 힌지 영역 및 이의 직전 및 직후에 있는 인트론들의 일부를 제거한다.
GTC#406: 올리고뉴클레오티드 "Behr 힌지/링커"(하기 굵은 글씨로 표시함)를 사용하여 힌지 영역 및 ala-ala-ala-ala-val 링커를 제거하여 CH2와 β-글루쿠로니다제 암호화 영역을 융합한다.
이어서 돌연변이된 융합 단백질 암호화 서열을 Sal I로 절단하고 적절한 발현벡터안으로 서브클로닝할 수 있다.
침묵인자(또는 절연체) 단편 이어서 염소 베타 카제인 프로모터, 삽입체 DNA 및 염소 베타 카제인 3 프라임 비번역 영역으로 구성된 벡터로 암호된 단백질을 고수준으로 발현시켰다. 중쇄 및 경쇄의 양 돌연변이체는 Bc450와 같은 벡터 안으로 서브클로닝하여, Sal I 부위 옆에 인접시켰으며, 이것은 완전한 주입 단편을 방출한다.
Bc454: 중쇄 돌연변이체 403(마이너스 힌지)를 갖는 Bc450
Bc456: 중쇄 돌연변이체 406(마이너스 힌지/링커)을 갖는 Bc450
Bc458: 경쇄를 갖는 Bc450
도 5는 힌지 영역을 결여한 인간화된 항-태아성 암 항원 항체 431의 돌연변이체 중쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도시한다. 도 6은 β-글루쿠로니다제 서열에 연결된 인간화된 항-태아성 암 항원 항체 431의 돌연변이체 중쇄를 포함하는 구조물(Bc 454)의 도식적인 개략도이다. 또한, 침묵인자, 5'β-카제인 비번역 영역, 중쇄 돌연변이체/β-글루쿠로니다제 융합체 암호화 영역 및 3'β-카제인 비변역 영역의 위치가 표시되어 있다. 제한 효소의 위치도 표시되어 있다.
실시예 6: 트랜스제닉 동물의 특성규명
이전의 실시예들은 젖 발현 시스템 내에서 원래 융합 단백질과 2개의 중쇄 돌연변이체를 시험하는 것에 대하여 설명하고 있다. 원래 융합 단백질은 절연체 없이 시험되고 또한 분리된 절연체 단편들과 함께 주입되었다. 한편, 중쇄 돌연변이체는 구조물 내에 통합된 절연체와 함께 시험되었다.
처음으로, 젖에서 생산되는 융합 단백질의 농도를 웨스턴 블럿 상에서 표준의 것에 대한 샘플의 신호를 비교함으로써 평가하였다. 나중에, 실험은 웨스턴 블럿에 기초하여 농도 이외의 활성을 측정하였다. 활성 측정이 더욱 정확하였다.
제1 세트의 구조물 Bc174 + Bc175를 제외하고, 웨스턴 블럿에 의한 단백질 농도 평가는 대충의 추정치이다. 통상 잘 발현되는 주들은 1-2mg/ml의 범위로 나타난다.
발현 데이타가 하기에 요약되어 있으며 각 구조물에 대해 더 수용된 데이타가 첨부되어 있다.
구조물 | DNA | 절연체 | 웨스턴(HC) ug/ml 측정값 | 최대활성 ug/ml |
Bc174/Bc175 | 원래 | no | ∼ 800 | 20 |
Bc181 | 원래, 연결된 | No | 1000-2000 | Na |
Bc181 + 절연체 | 원래, 연결된 | 함께 주입된 단편 | ∼1000 | 100 |
Bc456/Bc458 | 마이너스 힌지/링커 | yes | 1000-2000 | 8 |
Bc454/Bc458 | 마이너스 힌지 | yes | 1000-2000 | 800 |
본래 여기에 나타난 결과에 따르면 고수준의 단백질을 젖에서 만들 수 있지만, 대부분의 이 단백질이 활성이 없다는 것을 제시한다. 이러한 비활성은 접힘 문제 또는 사량체 조립상의 문제에 기인할 수 있다. 또한, 힌지 및 링커의 제거는 낮은 활성의 단백질을 생산하였다. 대조적으로, 상당량의 효소적 활성이 힌지만 제거한 경우 얻어졌다.
대략 8mg의 이 단백질이 마우스 젖에서 생산되었다. 목하 분리된 단백질이 생체내 연구("인간 CEA 양성 결장 암 전이 모델")에서 시험되어 있다.
마우스에 대한 데이타의 요약이 제공되어 있으며 분석이 하기와 같이 표의 형태로 수행되어 있다.
A. Bc174/175 시조
주(Line) | 2 nd Gen. | 성 | PCR LC HC | 사본 # LC HC | 웨스턴 ug/ml HC | 활성 ug/ml * | ||
2 | F | + | + | 10 | 10 | --- | 0.14 | |
4 | F | + | + | 1 | 1 | --- | <0.1 | |
10 | F | + | + | 10 | 10 | ~800 | 18 | |
142 | F | + | + | ~800 | ||||
22 | F | + | + | 10 | 10 | --- | <0.1 | |
154 | F | + | + | ~800 | ||||
23 | F | + | + | 50 | 50 | ~400 | 4 | |
200 | F | + | + | 0.0 | ||||
40 | M | + | + | 100 | 100 | --- | <0.1 | |
62 | F | + | + | + | + | --- | <0.1 | |
81 | M | + | --- | --- | --- | n.a. | ||
85 | F | + | + | 25 | 25 | --- | .3 | |
116 | M | + | + | 5 | 5 | |||
216 | F | + | + | ~800 | ||||
221 | F | + | + | ~800 | ||||
n.a= 분석되지 않음(라인이 오직 하나의 사슬만을 수반함) |
B. Bc181 시조
PCR | 사본# | 웨스턴 ug/ml (approx.) | 활성 ug/ml * | |||||
주 | F1 | 성 | LC | HC | LC | HC | HC | |
6 | M | + | + | 12 | 12 | |||
49 | F | 0.0 | ||||||
50 | F | 0.0 | ||||||
52 | F | >1000 | 39 | |||||
60 | F | >1000 | 41 | |||||
25 | F | + | + | 15 | 15 | 0.0 | ||
29 | F | --- | + | n.a. | n.a. | 0.0 | ||
33 | M | --- | + | n.a. | n.a. | n.a. | ||
36 | F | + | + | 100 | 100 | 0.0 | ||
n.a.= 분석되지 않음 |
C. Bc181 + 절연체 시조
PCR | 사본 # | 웨스턴 ug/ml (approx.) | 활성 ug/ml * | |||||||
주 | 2 nd gen. | 성 | LC | HC | Sil | LC | HC | sil | HC | |
9 | M | --- | + | n.a. | 0 | 1 | --- | n.a. | ||
13 | M | + | --- | n.a. | 2 | 0 | --- | n.a. | ||
15 | F | + | --- | n.a. | 3 | 0 | --- | n.a. | ||
33 | F | + | + | n.a. | 3 | 3 | --- | ~800 | ||
40 | M | --- | + | n.a. | 0 | 2 | --- | n.a. | ||
58 | M | + | + | n.a. | 2 | 10 | --- | |||
2-139 | F | + | + | --- | ~800 | 43 | ||||
2-140 | F | + | + | --- | ~800 | 31 | ||||
66 | F | + | + | n.a. | 1 | 1 | + | |||
78 | F | + | + | n.a. | 1 | 1 | --- | 0.0 | ||
81 | M | + | + | n.a. | 1 | 1 | --- | Not pass | ||
90 | M | + | + | n.a. | 20 | 20 | + | |||
2-123 | F | + | + | + | ~1000 | ~100 | ||||
2-124 | F | + | + | + | ~1000 | 60 | ||||
2-126 | F | + | + | --- | Low | 15 | ||||
n.a.= 분석되지 않음 |
D. Bc456 + Bc458시조
1 st 세대 | 2 nd 세대 | 성 | 웨스턴 HC | 활성 ug/ml. |
6 | F | none | 0 | |
8 | F | 0 | ||
13 | F | none | 0 | |
18 | F | 0 | ||
24 | F | none | 0 | |
57 | F | good | 2 | |
65 | F | good | 8 | |
66 | F | low | 0 | |
138 | M | |||
175 | F | |||
152 | F | none | 0 |
E. Bc454 + Bc458 시조
1 st 세대 | 2 nd 세대 | 3 rd 세대 | 성 | 웨스턴 HC | 활성 ug/ml. |
162 died | c-section | F | --- | ||
4 | F | High | 66 | ||
180 | F | Good | 177 | ||
11 | F | 133 | |||
12 | F | 185 | |||
182 | M | --- | |||
15 | F | Good | 83 | ||
187 | M | Not passinggene | |||
193 | M | --- | |||
27 | F | High | 838 | ||
57 | F | 829 | |||
58 | F | 742 | |||
59 | F | 944 | |||
60 | F | 574 | |||
61 | F | 752 | |||
62 | F | 534 | |||
201 | F | Good | 416 | ||
215 | F | (died) | |||
219 | M | --- | |||
F | |||||
220 | M | --- | |||
F |
실시예 7: 트랜스제닉 염소의 형성 및 특성 규명
하기 설명된 섹션은 간단히 트랜스제닉 염소의 생산에 있어서 주요 단계들을 설명하고 있다.
염소 종 및 품종:
스위스산 염소, 예컨대, 알파인, 사아넨 및 토그젠부르그 품종이 트랜스제닉 염소의 생산에 바람직하다.
염소 과잉배란:
6mg 피하 노르게스토메트(norgestomet) 귀 이식조직편으로 공여체의 발정기를 0일째로 동시화시켰다(Syncromate-B, CEVA Laboratories, Inc., Overland Park, KS). 최초 7 내지 9일 이후 프로스타글란딘을 투여하여 프로게스테론의 내인성 합성을 중단시켰다. 이식조직편을 삽입한 후 13일째에 시작하여 총 18mg의 여포 자극 호르몬(FSH-Schering Corp., Kenilworth, NJ)를 3일간 일일 2회 근육내 주입하였다. 이식조직편을 14일째 제거하였다. 이식조직편을 제거하고 24시간 후 공여체 동물을 번식력있는 숫컷과 2일 기간에 걸쳐 수번 짝짓기시켰다(Selgrath et al., Theriogenology, 1990. pp.1195-1205).
배아 수집:
교배후 2일째(또는 이식조직편 제거하고 72시간후)에 배아 수집을 위해 수술하였다. 과잉배란된 암컷을 수술하기 36시간 전에 음식 및 물을 절식시켰다. 암컷에 0.8mg/kg 디아제팜(Valium(등록상표)) IV를 투여하고 즉시 5.0mg/kg 케타민(Keteset) IV을 투여하였다. 할로탄(2.5%)을 기관내 튜브를 통해 2L/분 산소로 수술중에 투여하였다. 중심선 복벽절개를 통해 생식관을 몸밖으로 꺼냈다. 황체, 직경이 6mm이상인 파열되지 않은 여포, 및 난소낭을 계산하여 과잉배란 결과를 평가하고 난관 수세에 의해 수집되어야 하는 배아의 수를 예측하였다. 캐뉼라를 난관의 소공에 배치하고 3.0 프롤렌의 임시 봉합사 1가닥으로 제자리에 유지시켰다. 20게이지 바늘을 자궁난관 연결부로부터 약 0.5cm 떨어진 자궁내에 배치시켰다. 10 내지 20ml의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 캐뉼러가 주입된 난관을 세척하고 페트리 접시에 수집하였다. 이 공정을 반대측에서 반복하였고, 이어서 생식관을 복부에 재배치시켰다. 폐쇄하기 전에, 10-20ml의 멸균 식염수 글리세롤 용액을 복강에 부어 부착을 예방하였다. 2.0 폴리디옥사논 또는 수프라미드로된 단순 단속 봉합으로 백색선을 닫고 멸균 상처 클립으로 피부를 닫았다.
입체현미경 상에서 PBS로 난관 수세한 것으로부터 수정된 염소 난들을 수집하고, 이어서 시그마사로부터 구매한 10% 태아 소 혈청을 함유한 Ham's F12 배지(Sigma, St.Louis, MO)에서 세척하였다. 전핵이 육안관측가능한 경우, 배아를 즉시 미세주입시켰다. 전핵이 육안관측가능하지 않은 경우는 전핵이 육안관측가능해질때까지 공기 중 5% CO2를 함유하는 적셔진 가스 챔버에 37℃에서 단기간 배양용 10% FBS를 함유하는 Ham's F12에 배아를 놓을 수 있다(Selgrath, et al., Theriogenology, 1990. pp.1195-1205)
미세주입 공정
단세포 염소 배아를 유리 함몰 슬라이드상에 있는 오일내 미세방울의 배지에 놓았다. Normarski 광학을 사용하여 고정된 단계를 갖는 Zeiss 직립 현미경상에서 화염으로 연마된 고정 미세피펫 상에 두개의 육안관측가능한 전핵을 보유한 수정된 난을 고정시켰다. 주입 완충액(Tris-EDTA) 내에서 가느다란 유리 미세바늘을 사용하여 관심있는 DNA 구조물(예, 염소 베타-카제인 유전자의 조절성 요소에 작동가능하게 연결된 융합단백질 유전자를 함유한 BC355 벡터)로 전핵을 미세주입시켰다(Selgrath, et al., Theriogenology, 1990. pp.1195-1205).
배아 발달
미세주입 후, 생존한 배아를 10% FBS 함유 Ham's F12의 배양물에 놓고 이어서 수용체 동물이 배아 전달을 위해 준비될 때까지 공기 중 5% CO2를 함유하는 적셔진 가스 챔버에 37℃에서 항온배양하였다(Selgrath, et al., Theriogenology, 1990. p.1195-1205).
수용체의 준비:
수용체 동물에서 발정기 동시화는 6mg 노르게스토메트 귀 이식조직편(Syncromate-B)에 의해 유도되었다. 이식조직편을 삽입한 후 13일째, 시그마사로부터 수득한 임신 암컷 혈청 고나도트로핀(PMSG)을 이 동물에 단일의 비-과잉배란성 주입(400 I.U.)하였다. 수용체 암컷을 발정기 동시화를 확실히 하고 정관절개수술한 숫컷과 짝짓기를 하였다(Selgrath, et al., Theriogenology, 1990. p.1195-1205).
배아 전달
하나의 공여체 암컷으로부터 나온 모든 배아를 함께 유지시키고, 가능할 때 단일 수용체에 전달시켰다. 수술 공정은 상기 개략된 배아 수집에 설명된 것과 동일하며, 단 예외로 난관을 캐뉼라로 처리하지 않고, 유리 미세피펫을 사용하여 술을 통해 난관 루멘 안으로 최소 부피의 10% FBS 함유 Ham's F12 내 배아를 전달시켰다. 난소 상에 6개 내지 8개 배란 지점을 갖는 동물은 수용체로서 부적절하다. 절개, 폐쇄 및 수술후 간호는 공여체 동물과 동일하다(Selgrath, et al., Theriogenology, 1990. p.1195-1205).
자손 및 분만의 모니터링
임신은 괴어 있는 발정기 첫날 이후 45일째 초음파검사로 결정한다. 110일째 제2 초음파검사를 수행하여 임신을 확인하고 태아 스트레스를 평가한다. 130일째 임신 수용체 암컷을 파상풍 독소 및 클로스트리듐 C&D로 예방접종하였다. 셀레늄과 비타민 E(Bo-Se)를 IM으로 주고, 이베르멕틴을 SC로 주었다. 145일째 깨끗한 마구간으로 암컷을 옮기고, 이 환경에 순응시킨 후 약 147일째 분만을 유도하였다. 147일째 40mg의 PGF2a(Lutalyse(등록상표), Upjohn Company, Kalamazoo Michigan)으로 분만을 유도시켰다. 이 주입은 한번은 20mg 용량으로, 이어서 4시간 후 20mg 용량으로 2회 IM으로 수행하였다. 147일째 Lutalyse(등록상표)을 제1 주입하고 첫날 이후 밤낮으로 암컷을 주기적으로 관찰하였다. 2일째 아침에 시작하여 매 30분마다로 관찰을 증가시켰다. 최초 주입후 30시간과 40시간 사이에 분만하였다. 출산 후 암컷의 젖을 짜 초유를 수집하고 태반의 계대(passage)를 확인하였다.
F
0
동물의 트랜스제닉 특성 검사
트랜스제닉 F0동물을 스크리닝하기 위해, 지놈성 DNA를 두개의 상이한 세포주로부터 분리하여 임의의 모자이크 트랜스제닉들을 놓치지 않도록 하였다. 모자이크 동물들은 모든 세포에 적어도 1개 사본의 트랜스 유전자를 보유하지 않는 임의의 염소로 정의된다. 따라서, 지놈성 DNA 분리를 위해 2일령된 F0동물로부터 귀 조직 샘플(중배엽) 및 혈액 샘플을 채취하였다(Lacy, et al, A Laboratory Manual, 1986, Cold Springs Harbor, NY; 및 Herrmann and Frischauf, Methods Enzymology,1987. 152:pp.180-183). 융합 단백질 유전자에 특이적인 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄 반응(Gould, et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 1989. 86:pp.1934-1938)에 의해 그리고 무작위하게 프라임된 제1일원 또는 제2일원 cDNA 프로브(Feinberg and Vogelstein, Anal. Bioc., 1983. 132:pp.6-13)를 사용한 서던 블럿(Thomas, Proc Natl. Acad. Sci., 1980. 77:5201-5205)에 의해 DNA 샘플을 분석하였다. 분석 민감도를 평가하여 10%의 체세포에 트랜스 유전자 한 사본을 검출한다.
생산 무리의 형성 및 선별
전술한 공정을 사용하여 트랜스제닉 시조(F0) 염소뿐만아니라 다른 트랜스제닉 염소를 생산할 수 있다. 예를들면, 트랜스제닉 F0시조 염소는 암컷인 경우 젖을 생산하도록 양육되거나 숫컷인 경우 트랜스제닉 암컷 자손을 생산하기 위해 양육된다. 이러한 트랜스제닉 시조 숫컷은 비-트랜스제닉 암컷과 교배하여 트랜스제닉 암컷 자손을 생산할 수 있다.
트랜스 유전자의 전달 및 관련 특성 규명
염소 주에서 관심있는 트랜스 유전자의 전달을 귀 조직 및 혈액에서 PCR 및 서던 블럿 분석에 의해 분석하였다. 예를들면, 시조 암컷과 3마리의 트랜스제닉 자손들의 서던 블럿 분석은 세대간에 사본 수에 있어서 변화 또는 재배열을 보여주지 않는다. 서던 블럿은 면역글로불린-효소 융합 단백질 cDNA 프로브로 탐침하였다. 블럿은 Betascope 603에서 분석하고 사본수는 트랜스 유전자 대 염소 베타 카제인 내인성 유전자를 비교함으로써 결정하였다.
발현 수준의 평가
트랜스제닉 동물의 젖에서 트랜스제닉 단백질의 발현 수준은 효소적 분석 또는 웨스턴 블럿으로 결정하였다.
기타 구체예는 하기 청구범위내에 있다.
Claims (19)
- 제1일원 및 이에 융합된 제2일원을 보유하는 융합 단백질의 제조방법으로서, 제1일원 및 제2일원은 융합 단백질이 다량체 형태의 제2일원의 활성을 최적화시키는 다수의 서브유니트를 보유하는 복합체로 조립되도록 선택된 것이 특징인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 제1일원 또는 융합 단백질은 활성있는 형태의 제2일원에 존재하는 것과 동일한 수의 서브유니트를 보유한 형태로 조립되는 것이 특징인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 제1일원은 Ig 서브유니트를 포함하는 것이 특징인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 제2일원은 Ig 서브유니트 이외의 서브유니트를 포함하는 것이 특징인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 제1일원은 다량체의 서브유니트들의 형성 또는 유지를 조절하는 부위가 수정된 것이 특징인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 제1일원은 이량체를 형성하는 것이 특징인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 제1일원은 Ig 서브유니트를 포함하고, 다량체 형태의 형성을 저해하도록 수정된 것이 특징인 제조방법.
- 제7항에 있어서, 수정은 하나 이상의 아미노산 잔기의 변화, 삽입 또는 결실이고, 수정 결과 다량체를 형성하지 않거나 정상적으로 형성되는 것보다 낮은 정도로 다량체를 형성하는 서브유니트를 산출하는 것이 특징인 제조방법.
- 제7항에 있어서, 면역글로불린의 힌지 영역이 수정되는 것이 특징인 제조방법.
- 제7항에 있어서, 수정 결과는 이량체 Ig 구조를 산출하는 것이 특징인 제조방법.
- 제10항에 있어서, 이량체는 중쇄 융합체 및 경쇄 융합체를 포함하는 것이 특징인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 제2일원은 베타-글루쿠로니다제를 포함하는 것이 특징인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 제1일원은 면역글로불린(Ig) 중쇄 또는 경쇄이고, 제2일원은 인간 베타-글루쿠로니다제 융합 단백질을 포함하는 것이 특징인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 융합 단백질은 트랜스제닉 동물에서 생산되는 것이 특징인 제조방법.
- 유전자도입법에 의해(transgenically) 생산된 제1항의 융합단백질을 제공하는 방법으로서, 유선 상피세포에서 융합 단백질의 단백질 암호화 서열을 발현하고 포유류의 젖에 융합 단백질을 분비하는 결과를 산출하는 융합 단백질 암호화 트랜스 유전자를 포함하는, 트랜스제닉 포유류로부터 젖을 수득하는 단계를 포함하는 것이 특징인 제공 방법.
- 하기의 것들을 포함하는 핵산 구조물:(a) 선택적으로, 절연체(insulator) 서열;(b) 프로모터, 예컨대 유선 상피조직 특이 프로모터(예, 젖 단백질 프로모터);(c) 융합 단백질의 분비를 유도할 수 있는 신호 서열, 예컨대 젖 특이 단백질 또는 면역글로불린 유래의 신호 서열을 암호하는 뉴클레오티드 서열;(d) 선택적으로, (예를들면 트랜스제닉 포유류의 젖으로) 융합 단백질을 분비할 수 있도록 하기 위해 분비성 단백질(예, 젖으로 분비되는 단백질 또는 면역글로불린)의 아미노 말단 암호화 영역의 상당 부분을 암호하는 뉴클레오티드 서열;(e) 융합 단백질, 예컨대 본 명세서에 설명된 융합 단백질을 암호하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열; 및(f) 선택적으로, 유선 상피조직 특이 유전자(예, 젖 단백질 유전자) 유래의 3' 비번역 영역.
- 제1항의 융합 단백질을 암호하는 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조물.
- 제1항에 설명된 융합 단백질.
- 제1항의 융합 단백질을 암호하는 트랜스 유전자를 포함하는 트랜스제닉 동물.
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