JP2019501631A - 一本鎖gitr受容体アゴニストタンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
変異体は当業者に公知の任意の手法で生成させることができる。本明細書に述べるように、置換はGITRL、例えばヒトGITRL(例えば配列番号1)、又はその受容体結合ドメインのうちの少なくとも1つのアミノ酸に影響することがある。これに関し、好ましい置換は配列番号1のヒトGITRLの以下のアミノ酸、即ちL65A、P66A、K68A、P77、N80、V82、E88、L90、Q91、N106、N120、N129、K121、D122、V144、L159、N161、N172、P173及びQ174のうちの少なくとも1つに影響する。好ましい実施形態では、N106はA、S、R、D、E、Q又はNに変異し、及び/又はD122はA、S、D、E又はRに変異する。
アミノ酸置換はGITRL、例えばヒトGITRLのGITR結合又はGITR誘起シグナリングに対する結合及び/又は活性に影響することがある。GITRの結合及び/又は活性はプラスに、即ちより強く、より選択的に若しくはより特異的に、及び/又は受容体をより活性化させるように、影響されることがある。或いは、GITRの結合又は活性はマイナスに、即ちより弱く、より非選択的に若しくはより非特異的結合に、及び/又は受容体があまり若しくは全く活性化されないように、影響されることがある。
したがって、1つの実施形態は本明細書に記載したGITR受容体アゴニストタンパク質であって、可溶性ドメインのうちの少なくとも1つが野生型GITRLよりも少なくGITRに結合し及び/又はこれを活性化するGITRLの変異体又はその受容体結合ドメインを含む、GITR受容体アゴニストタンパク質である。
本発明のさらなる実施形態では、可溶性GITRLドメイン(i)、(iii)、及び(v)の1つ又は複数はGITRLの変異体又はその受容体結合ドメインを含んでよく、それにより自己凝集性が低減し、及び/又はインビボ安定性が延長する。
本発明の一本鎖融合分子は3つの可溶性GITRLドメイン、即ち成分(i)、(iii)及び(v)を含む。第2及び/又は第3の可溶性GITRLドメインがアミノ酸配列の変異を含んでもよいN末端が短縮されたドメインである場合には、一本鎖GITRL融合ポリペプチドの凝集に対する安定性が増大する。したがって、好ましくは第2及び第3の可溶性GITRLドメインの両方は、N末端領域に、好ましくは可溶性GITRLドメインのN末端の最初の5つのアミノ酸の中にアミノ酸配列変異を任意選択で含んでもよい、N末端が短縮されたドメインである。これらの変異は、中性アミノ酸、特にセリン又はグリシンによる塩基性アミノ酸の置き換えを含んでよい。
(a)Glu56又はPro57
(b)(Gly/Ser)56
から選択される。
グリコシル化部位の総数及び三次元における糖鎖の個別の場所はGITR受容体アゴニストタンパク質のインビボ安定性に影響する。更に、糖鎖の認識は末端サッカライドの局所的密度、糖鎖ツリーの分枝、及び糖鎖の互いの相対的な場所に依存する。
更に、部分的に分解した糖鎖はレクチンによって促進される機構によってGITR受容体アゴニストタンパク質のインビボ半減期を低下させる。分子上のグリコシル化部位の総数を減少させることによって、得られる化合物ではこれらの機構が起こりにくくなり、半減期が増大する。
内部表面領域に存在するCH2グリコシル化は通常、「オープンFcコンフォメーション遷移」の間、サブドメインをプロテアーゼから遮蔽し、ヒンジ-鎖間ジスルフィド結合は減少し、共有結合による鎖間リンケージは破壊される。これにより、CH2の解離と内部表面領域のプロテアーゼへの露出が可能になる。配列番号15のN297S等価変異を有するFcドメインを含むGITR受容体アゴニストタンパク質(プロテインA)(EU番号付けシステムによる)は非グリコシル化CH2ドメインを生成し、したがってプロテアーゼ消化の対象となりやすく、野生型のCH2グリコシル化を有する等価構造よりも安定性が低い。これは、宿主細胞のプロテアーゼが存在し、長期にわたって構造に接近するUSP/DSP/保存の間の化合物の安定性に影響する。したがって、ある実施形態では、GITR受容体アゴニストはCH2グリコシル化部位を有しないが、各ポリペプチド鎖のリンカー配列(例えばGSGSGNGS、配列番号2)中のグリコシル化部位を含む。
本発明の好ましい実施形態によれば、抗体Fc断片ドメインはヒンジ-リンカー要素を介して融合している。ヒンジ-リンカー要素は10〜30アミノ酸の長さ、特に15〜25アミノ酸の長さ、例えば22アミノ酸の長さを有する。「ヒンジ-リンカー」という用語は、ヒンジ-リンカー要素がドメインに結合して生物学的に活性なコンフォメーションを保持することができるために十分な長さを有する任意のリンカーを含む。ヒンジ-リンカー要素は好ましくは本明細書において「Igヒンジ領域」と称する免疫グロブリンのヒンジ領域配列を含む。「Igヒンジ領域」という用語は、1つ又は複数のシステイン残基、例えばジスルフィド結合が免疫グロブリンの2つの重鎖を連結する2つのシステイン残基を含む、天然に産生するIgヒンジ領域配列の一部と配列同一性又は類似性を共有するアミノ酸配列を含む任意のポリペプチドを意味する。
1つの実施形態では、本発明のGITR受容体アゴニストタンパク質は、上側ヒンジのリジン(EU番号付けシステムによるK223)のグリシンへの変異を更に含み、これによりこの部位におけるタンパク質分解プロセシングが低減され、したがって融合タンパク質の全体としての安定性が向上する。ヒンジ領域内における上述の第3のシステイン(EU番号付けシステムによるC225)の導入と上述のリジンのグリシンへの変異(EU番号付けシステムによるK223G)を併せることによって、本発明のGITR受容体アゴニストタンパク質の全体としての安定化がもたらされる。
上述のシステイン(C225)及びリジンのグリシンへの変異(K223G)を含む特に好ましいヒンジ-リンカー要素は、配列番号16(Table 4(表4))で示されるアミノ酸配列を含み、又はこれからなる。
六価のGITR受容体アゴニストタンパク質のホモ二量体を安定化させる鎖間-ジスルフィド結合性は、GITRサブ配列の遊離チオール基によっても影響される。遊離チオール基は、表面に露出したジスルフィド架橋の還元によって、例えばGITRLのC58〜C78ジスルフィドの還元によって作成することができる。これはまた、この構造のヒンジジスルフィド架橋が高タンパク質濃度における製剤の内因性遊離チオールによって自己還元することによる上述のオープンFcコンフォメーションをもたらす。その結果、遊離チオールを含む一本鎖GITRL-Fc融合タンパク質は、酸素及びプロテアーゼへの長時間の曝露が起こる製造及び保存の間、より不安定であることが予想される。
したがって、技術的なスケールでの六価のGITR受容体アゴニストの製造を可能にするために、C58及びC78残基は、好ましくは同時に異なったアミノ酸(例えばL、S、A又はG)に変異させられる。
更に、融合ポリペプチドは、配列番号16のヒンジリンカーを介して可溶性GITRLドメイン(v)にC末端で融合した配列番号13の抗体Fc断片ドメインを含む。発明者らは驚くべきことに、この特定の融合ポリペプチドが二価のアゴニスト抗GITR-mABと比較して改善された生物学的活性を提供し、223位にリジン及びCH2ドメインにN297S変異(EU番号付けによる)を含む融合タンパク質と比較して長期の安定性を有していることを見出した。本発明のGITR受容体アゴニストタンパク質の例示的な実施形態のアミノ酸配列は、配列番号27で示される。
更に、融合ポリペプチドは、例えば配列番号17のN末端シグナルペプチドドメインを含んでもよい。本発明のGITR受容体アゴニストタンパク質の特定の例を配列番号25に示す。
ンイフェックス(登録商標)、インターフェロンアルファ、インターフェロンアルファ-2b(PEGコンジュゲート)、イフォスファミド、インターロイキン-11(IL-11)、インターロイキン-2(IL-2)、イマチニブメシレート、イミダゾールカルボキサミド、イントロンA(登録商標)、イピリムマブ、イレッサ(登録商標)、イリノテカン、イソトレチノイン、イキサベピロン、イキセムプラ(商標)、KADCYCLA(登録商標)、キドロラーゼ(t)ラナコート(登録商標)、ラパチニブ、L-アスパラギナーゼ、LCR、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイケラン、ロイキン(商標)、ロイプロリド、ロイコクリスチン、ロイスタチン(商標)、リリルマブ、リポソーマルAra-C、リキッドプレッド(登録商標)、ロムスチン、L-PAM、L-ザルコリシン、ルプロン(登録商標)、ルプロンデポ(登録商標)、マツラン(登録商標)、マキシデックス、メクロレタミン、メクロレタミン塩酸、メドラロン(登録商標)、メドロール(登録商標)、メガス(登録商標)、メゲストロール、メゲストロール酢酸、MEK阻害剤、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メスネックス(商標)、メソトレキセート、メソトレキセートナトリウム、メチルプレドニソロン、メチコルテン(登録商標)、マイトマイシン、マイトマイシン-C、ミトキサントロンM-プレドニソール(登録商標)、MTC、MTX、ムスタルゲン(登録商標)、ムスチン、ムタマイシン(登録商標)、ミレラン(登録商標)、ミロセル(商標)、ミロタルグ(登録商標)、ナビトクラックス、ナベルビン(登録商標)、ネララビン、ネオサル(登録商標)、ニューラスタ(商標)、ニューメガ(登録商標)、ニューポゲン(登録商標)、ネキサバル(登録商標)、ニランドロン(登録商標)、ニロチニブ、ニルタミド、ニペント(登録商標)、ナイトロジェンマスタードノバルデックス(登録商標)、ニボルマブ、ノバントロン(登録商標)、エヌプレート、オクトレオチド、オクトレオチド酢酸、オファツムマブ、オンコスパル(登録商標)、オンコビン(登録商標)、オンタック(登録商標)、オンキサル(商標)、オプレルベキン、オラプレッド(登録商標)、オラソン(登録商標)、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルタンパク質結合、パミドロナート、パニツムマブ、パントレチン(登録商標)、パラプラチン(登録商標)、パゾパニブ、ペディアプレッド(登録商標)、PEGインターフェロン、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、PEG-INTRON(商標)、PEG-L-アスパラギナーゼ、PEMETREXED、ペムブロリズマブ、ペントスタチン、ペルツズマブ、フェニルアラニンマスタード、ピジリズマブ、プラチノール(登録商標)、プラチノール-AQ(登録商標)、プレドニソロン、プレドニソン、プレロン(登録商標)、プロカルバジン、PROCRIT(登録商標)、プロロイキン(登録商標)、カルムスチンインプラントを伴うプロリフェプロスパン20、プリネトール(登録商標)、BRAF阻害剤、ラロキシフェン、レブリミド(登録商標)、リューマトレックス(登録商標)、リツキサン(登録商標)、リツキシマブ、ロフェロン-A(登録商標)、ロミプロスチム、ルベックス(登録商標)、ルビドマイシン塩酸、サンドスタチン(登録商標)、サンドスタチンLAR(登録商標)、サルグラモスチム、ソル-コルテフ(登録商標)、ソル-メドロール(登録商標)、ソレフェニブ、SPRYCEL(商標)、STI-571、STIVAGRA(商標)、ストレプトゾシン、SU11248、スニチニブ、スーテント(登録商標)、タモキシフェンタルセバ(登録商標)、タルグレチン(登録商標)、タシグナ(登録商標)、タキソール(登録商標)、タキソテレ(登録商標)、テモダル(登録商標)、テモゾロミドテムシロリムス、テニポシド、TESPA、サリドマイド、サロミド(登録商標)、テラシス(登録商標)、チオグアニン、チオグアニンタブロイド(登録商標)、チオホスホアミド、チオプレックス(登録商標)、チオテパ、TICE(登録商標)、トポサル(登録商標)、トポテカン、トレミフェン、トリセル(登録商標)、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレアンダ(登録商標)、トレメリムマブ、トレチノイン、トレキサル(商標)、トリセノックス(登録商標)、TSPA、TYKERB(登録商標)、ウレルマブ、VCR、ベクチビックス(商標)、ベルバン(登録商標)、ベルカード(登録商標)、ベネトクラックス、VePesid(登録商標)、ベサノイド(登録商標)、ビアジュール(商標)、ビダザ(登録商標)、ビンブラスチン、ビンブラスチン硫酸、ビンカサルPfs(登録商標)、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビノレルビン酒石酸、VLB、VM-26、ボリノスタット、ボトリエント、VP-16、ブモン(登録商標)、キセロダ(登録商標)、ザノサル(登録商標)、ゼバリン(商標)、ジネカード(登録商標)、ゾラデックス(登録商標)、ゾレドロン酸、ゾリンザ、若しくはゾメタ(登録商標)、及び/又は同様の経路を標的とし、本明細書に特に挙げていない他の任意の薬剤が含まれ得る。
本明細書で提供するGITR受容体アゴニストタンパク質の治療又は予防有効量の例示的で非限定的な範囲は、約0.1〜100mg/kg(例えば約0.1〜0.5、0.1〜1、0.1〜10、0.1〜20、0.1〜50、0.1〜75、1〜10、1〜15、1〜7.5、1.25〜15、1.25〜7.5、2.5〜7.5、2.5〜15、5〜15、5〜7.5、1〜20、1〜50、7〜75、1〜100、5〜10、5〜15、5〜20、5〜25、5〜50、5〜75、10〜20、10〜50、10〜75若しくは10〜100mg/kg、又はその間の任意の濃度)である。いくつかの実施形態では、GITR受容体アゴニストタンパク質は医薬組成物中に治療有効濃度で、例えば約0.1〜100mg/mlの濃度(例えば約0.1〜0.5、0.1〜1、0.1〜10、0.1〜20、0.1〜50、0.1〜75、1〜10、1〜20、1〜50、1〜75、1〜100、5〜10、5〜15、5〜20、5〜25、5〜50、5〜75、10〜20、10〜50、10〜75若しくは10〜100mg/ml、又はその間の任意の濃度)で存在する。用量値は緩和すべき病状の型及び/又は重篤度によって変動することに注目されたい。いかなる特定の対象に対しても、特定の用量計画は個別の必要性及び/又は組成物を投与する者若しくは投与を監督する者の専門的判断によって時とともに調節できること、並びに本明細書で説明する用量範囲は例示的のみであって特許を請求する組成物の範囲又は実施を限定することを意図していないことを更に理解されたい。
GITR受容体アゴニストタンパク質の製造
1.1ポリペプチドの構造
A)アミノ酸Met1〜Gly20
Igカッパシグナルペプチド、アミノ酸Gly20の後の推定されるシグナルペプチダーゼ切断部位
B)アミノ酸Glu21〜Ser146
ヒトGITRLリガンドの第1の可溶性サイトカインドメイン(GITRL、配列番号1のアミノ酸52〜177)
C)アミノ酸Gly147〜Ser154
配列番号2の第1のぺプチドリンカー要素
D)アミノ酸Glu155〜Ser280
ヒトGITRLリガンドの第2の可溶性サイトカインドメイン(GITRL、配列番号1のアミノ酸52〜177)
E)アミノ酸Gly281〜Ser288
配列番号2の第2のぺプチドリンカー要素
F)アミノ酸Glu289〜Ser414
ヒトGITRLリガンドの第3の可溶性サイトカインドメイン(GITRL、配列番号1のアミノ酸55〜133)
G)アミノ酸Gly415〜Cys435
配列番号16のヒンジリンカー要素
H)アミノ酸Pro436〜Lys653
配列番号13の抗体Fc断片ドメイン
合成遺伝子は好適な宿主細胞、例えば昆虫細胞又は哺乳類細胞における発現のためのコドンの使用に鑑みて最適化される。好ましい核酸配列を配列番号37に示す。
発現及び精製
2.1 融合ポリペプチドのクローニング、発現及び精製
上述の融合タンパク質は、下記の方法によって異なった真核宿主細胞内で組み換えにより発現される。
上述のGITR受容体アゴニスト融合タンパク質の小スケール解析のため、Hek293細胞を10%のFBS、100units/mlのペニシリン及び100[mu]g/mlのストレプトマイシンを補ったDMEM+GlutaMAX(GibCo)中で増殖させ、融合ポリペプチドのための発現カセット及び好適な選択マーカー、例えばブラスチシジン、プロマイシン又はヒグロマイシン耐性遺伝子を含む機能性発現カセットを含むプラスミドを一時的にトランスフェクトする。これらの例では、最終生成物を得るために複数のポリペプチド鎖が必要な場合には、トランスフェクションの間、発現カセットは1つのプラスミドに結合するか、異なったプラスミドの上に位置する。トランスフェクションの3日後に組み換え融合ポリペプチドを含む細胞培養上清が回収され、300Xでの遠心で清澄化され、続いて0.22μmの無菌フィルターで濾過される。
GITR受容体アゴニスト融合タンパク質の大スケール発現のため、上述のタンパク質をコードする合成DNAカセットを、適切な選択マーカー(例えばブラスチシジン、プロマイシン又はヒグロマイシン耐性遺伝子を含む機能性発現カセット)及び宿主細胞ゲノム中でトランスクリプション活性の挿入部位の数を増大させるために好適な遺伝要素を含む真核細胞発現ベクターに挿入する。配列を検証した発現ベクターを、懸濁に適合したチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-S、Invitrogen)にエレクトロポレーションによって導入する。トランスフェクトした細胞に、トランスフェクション後3日間、適切な選択圧を適用することになる。選択圧の下に培養を続けることにより、ベクター由来の耐性遺伝子を有する生存細胞を回収する。選択した細胞プールを、軌道振盪インキュベーター(100rpm、振盪長50mm)中、37℃及び7%CO2雰囲気下、化学的に定義された培地(PowerCHO2-CD、Lonza)中で安定的に増殖させ、個別の上清をELISAアッセイによって分析し、上述のタンパク質及びタンパク質の産生の前に浸透フラスコ(軌道振盪器、100rpm、振盪長50mm)中で増殖した最大の特異的産生能を有する細胞プールを検出する。
三価の対照タンパク質
六価のGITR受容体アゴニスト融合タンパク質とバクテリオファージRB69-FOLDONで安定化されたホモ三量体の三価のGITR受容体アゴニスト融合タンパク質との間の相対的結合を比較するため、CHO-S細胞中で発現し、以前のセクションに記載したように精製した。配列を下の表に示す。
制限プロテアーゼ消化によるGITR受容体アゴニストタンパク質のインビトロ安定性の決定
実施例1に記載したように、検討すべき全てのGITR受容体アゴニストタンパク質を発現し、六価のFc融合タンパク質として精製する。セットは、CH2ドメインのN297S変異(EU番号付けシステムによる)、及び3つのジスルフィド架橋の生成が可能で、更に上部ヒンジのリジン(EU番号付けシステムによるK223)がグリシンに変異(K223G)して欠落しているヒンジ領域を含むGITR受容体アゴニストタンパク質を含んでいる。制限プロテアーゼ消化アッセイにおいて、3つのジスルフィドを可能にするヒンジの文脈でN297S変異及びK223G変異を同時に含む上述のGITR受容体アゴニストタンパク質を、2つのジスルフィド又は3つのジスルフィドのいずれかを可能にするヒンジ領域の文脈でN297S変異を含むがK223野生型は存在するGITR受容体アゴニストタンパク質と比較することになる。
更に、4アミノ酸に還元された第2のリンカー要素(iv)及び短縮されたヒンジ要素(vi)を有するGITR受容体アゴニストタンパク質を検討する(例えば配列番号32及び34)。両方の組み換え戦略(3つのジスルフィドを可能にするヒンジ領域の文脈でのN297SとK223Gの変異の組合せ)及びリンカー要素の短縮(iv及びvi)は、それぞれの分子の安定性に影響する可能性がある。
本発明の異なったGITRアゴニストタンパク質の安定性は、インビトロの制限プロテアーゼ消化によって取り扱うことができる。この分析のため、上述のGITR受容体アゴニストタンパク質を、異なった時間、異なった温度(例えば4℃、25℃、37℃)で、低濃度のプロテアーゼ(例えばトリプシン、V8プロテアーゼ)とともにインキュベートする。続いて、特定のタンパク分解断片の定量及びその外観を時間にわたって異なった方法、例えばSDS-PAGE、分析用SEC又は当技術で公知の分析用マススペクトリー法(例えばナノRP-HPLC-ESI-MSMS)によって測定することができる。検討するタンパク質はその配列の大部分を共通して有するので、個別のタンパク質から時間にわたって特定のタンパク分解断片がより速く出現し、その量が多いことを用いて、その相対的安定性を判定し、互いに順位を付けることができる。検討した上述のGITR受容体アゴニストタンパク質のプロテアーゼに基づくデコイ動力学に関して、そのタンパク分解安定性に関する以下の順序が予想される。
N297S及びK223G並びに3つのジスルフィドを可能にするヒンジ領域を含むGITR受容体アゴニストタンパク質は同時に、ヒンジ領域にN297Sと野生型K223とを含むGITR受容体アゴニストタンパク質と比較して長期の安定性を有している。ヒンジリンカーとして配列番号21を含むGITR受容体アゴニストタンパク質は、ヒンジリンカー要素として配列番号16を含むGITR受容体アゴニストタンパク質と比較して長期の安定性を有している。
安定性/凝集試験
実施例2に記載したように分析用SECによってモノマー及び凝集物の含量を決定する。この特定の目的のため、生理学的pHで生理学的食塩濃度を含む緩衝液(例えば0.9% NaCl、pH7.4、PBS pH7.4)中で分析を行なう。典型的な凝集分析はSuperdex200カラム(GE Healthcare)で行なう。このカラムは10〜800kDaの範囲のタンパク質を分離する。
モノマー含量[%]=[モノマータンパク質のピーク面積]/[全ピーク面積]×100
三価及び六価のGITR受容体リガンド構築物のQCM分析による平衡結合定数の決定
GITR受容体リガンドの三価及び六価の構築物の平衡結合定数(KD)は、自動化バイオセンサーシステム(Attana A100)によって決定される動的結合データ(kon及びkoff)に基づいて算出される。A100により、クオーツ結晶マイクロバランス(QCM)手法に基づいてリアルタイムで分子間相互作用を検討することができる。
この目的のため、カルボキシル活性化QCMチップの表面にヒトGITR受容体を固定化する。続いて、三価又は六価のGITR受容体リガンドをそれぞれ、異なった濃度(例えば0.5、1、2、5及び10μg/ml)で被分析物質として用いて、リガンド-受容体結合(kon)及び解離(koff)の動的結合データを解析する。解析はリアルタイムで行なわれ、対応するKDを算出することができる。KD=koff/kon。
QCM解析から、三価のGITR受容体リガンドは対応する固定化GITR受容体に低いnM範囲のKDで結合し、KDの予想値は1〜500nMであることが示される。しかし、GITR受容体リガンドの六価の構築物は対応する固定化GITR受容体に対してpM範囲の高い結合親和性を示し、KDの予想値は1pM〜500nMである。動的結合データ(kon及びkoff)の共通の特徴は六価の構築物が三価の構築物と比較してより速いkonを示すことである。更に、六価のリガンドは三価のリガンドと比較すればより遅い解離(koff)が一般に観察される。
T細胞増殖アッセイ
GITR受容体アゴニストのT細胞活性化能を評価するため、磁性ビーズを用いるネガティブ選択によってヒトバフィーコート製剤からT細胞を精製する。細胞をCFSEで標識し、種々の量のGITR受容体アゴニストありとなしで、抗ヒトCD3抗体と組み合わせて、37℃で2〜5日インキュベートする。細胞分割を測定する手段としてのCFSE希釈に関するデータをフローサイトメーターで取得する。細胞培養上清及び捕捉のための抗ヒトIFNγ抗体を用いるELISAアッセイによって、IFNγの産生を測定する。
GITRアゴニスト結合アッセイ
ネガティブ選択及び磁性ビーズを用いて、新鮮なバフィーコート製剤から一次ヒトT細胞を単離する。細胞をウェルあたり2×10e6細胞で24ウェルプレートに播種する。T細胞を抗ヒトCD3抗体(クローンHIT3a、1μg/ml)、抗ヒトCD28抗体(クローンCD28.2、5μg/ml)、及び種々の量のプロテインA(GITRL、10〜1000ng/ml)とともにインキュベートし、又は対照として単に培地中に放置する。37℃、3日後に細胞を抗ヒトGITR抗体、抗ヒトCD4抗体又は抗ヒトCD8抗体で蛍光標識する。CD4+及びCD8+T細胞集団中のGITR蛍光をグアバeasyCyteフローサイトメーターで評価する。
ヒトインビトロT細胞増殖アッセイ
健常なドナーの末梢血から全(ヒト)T細胞をネガティブ選択及び磁性ビーズ(パンT細胞分離キット、Miltenyi Biotec社)によって精製し、CFSE(フローサイトメトリー用CellTrace(商標)CFSE Cell Proliferation Kit、ThermoFisher社)で染色し、ウェルあたり2×10e6細胞で24ウェルプレートに播種した。細胞を培地のみ、可溶性抗CD3抗体(クローンOKT3、1μg/ml)のみ、抗CD3抗体及び抗CD28抗体(クローン28.2、1μg/ml)、又は抗CD3抗体及びそれぞれ10、100又は1000ng/mlのプロテインAと、37℃で5日間インキュベートした。
受容体結合アッセイ
OX40Lのその対応する受容体への機能的結合を評価するELISAアッセイのため、マイクロタイタープレートを1μg/mlのOX40-Fc(Bio-Techne GmbH社、Wiesbaden-Nordenstadt、Germany)でコートした。Starting Block(Life Technologies GmbH社、Darmstadt、Germany)でブロックした後、指示された濃度の異なった構造のGITRL化合物(プロテインA、プロテインB及びプロテインC)とともにウェルをインキュベートした。その対応する受容体に結合したGITRLは、抗Strep-tagペルオキシダーゼ StrepTactin-HRP(1:5000、IBA GmbH社、Goettingen, Germany)を用いるStrep-tag II、及びそれに続く転化したペルオキシダーゼ基質であるTMBワン(Kem-En-Tec Diagnostics社、Taastup、Denmark)のELISAリーダーにおける波長450nmでの検出によって検出した。図6は、試験した本発明の全てのタンパク質構造の機能的結合を明白に立証している。N末端又はC末端で短縮された多様体の結合能はプロテインAと同程度である。
2 CH2ドメイン
3 CH3ドメイン
4 ヒンジ-システイン
5 N297位に結合したCH2糖鎖
6 上側ヒンジリジン(K223)
Claims (24)
- 一本鎖融合ポリペプチドを含むGITR受容体アゴニストタンパク質であって、
(i)第1の可溶性GITRLドメイン、
(ii)第1のペプチドリンカー、
(iii)第2の可溶性GITRLドメイン、
(iv)第2のペプチドリンカー、並びに
(v)第3の可溶性GITRLドメイン、並びに
(vi)配列番号16及び19〜24を含む群から選択されるヒンジリンカー、並びに
(vii)抗体Fc断片を含み、
抗体Fc断片(vii)が配列番号13若しくは14で示されるアミノ酸配列又は配列番号13若しくは14のアミノ酸1〜217からなる、GITR受容体アゴニストタンパク質。 - 抗体Fc断片(vii)がヒンジリンカー(vi)を介して第3のGITRLドメイン(v)のC末端に融合している、請求項1に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。
- 実質的に非凝集性である、請求項1又は2に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。
- 第2及び/又は第3の可溶性GITRLドメインが、任意選択でアミノ酸配列変異を含む、N末端が短縮されたドメインである、請求項1から3のいずれか一項に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。
- 可溶性GITRLドメインのうちの少なくとも1つ、特に可溶性GITRLドメイン(iii)及び(v)のうちの少なくとも1つが、配列番号1のヒトGITRLのアミノ酸E52又はA54又はK55又はE56又はP57で開始するN末端配列を有する可溶性GITRLドメインであり、E52又はA54又はK55又はE56が中性アミノ酸、例えばSer又はGlyで置き換えられていてもよい、請求項1から4のいずれか一項に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。
- 可溶性GITRLドメインのうちの少なくとも1つ、特に可溶性GITRLドメイン(iii)及び(v)のうちの少なくとも1つが、
(a)E52〜P57及び
(b)(Gly/Ser)56〜P57
から選択されるN末端配列を有する可溶性GITRLドメインである、請求項5に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。 - 可溶性GITRLドメインが配列番号1のアミノ酸S177で終止し、及び/又は任意選択でE52、A54、K55、L65A、P66A、K68A、P77、N80、V82、E88、L90、Q91、N106、N120、N129、K121、D122、V144、L159、N161、N172、P173、Q174の位置に又は前記位置の2つ以上に変異を含む、請求項5又は6に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。
- 少なくとも前記可溶性GITRLドメイン(iii)が、配列番号1のA170、P171又はQ174で終止する、C末端が短縮されたGITRLドメインである、請求項5から7のいずれか一項に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。
- 可溶性GITRLドメイン(i)、(iii)及び(v)が配列番号1のヒトGITRLのアミノ酸E52〜S177からなる、請求項6から8のいずれか一項に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。
- 第1及び第2のペプチドリンカー(ii)及び(iv)が、独立に、グリコシル化されていてもよいアスパラギン残基を任意選択で含む、3〜8個のアミノ酸の長さ、特に3、4、5、6、7又は8個のアミノ酸の長さを有し、好ましくは、グリシン/セリンリンカーである、請求項1から9のいずれか一項に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。
- 第1及び第2のペプチドリンカー(ii)及び(iv)が配列番号2のアミノ酸配列からなる、請求項10に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。
- 例えば配列番号17のN末端シグナルペプチドドメインを更に含む、プロテアーゼ切断部位を含んでもよい、並びに/又は、認識/精製ドメイン、例えば配列番号18のStrep-tagを含み及び/若しくはこれに連結されていてもよいC末端要素を更に含む、請求項1から11のいずれか一項に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。
- 配列番号15、配列番号25〜35及び配列番号49〜50のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。
- それぞれが配列番号27、29、30、31、32、33、34、35、49又は50で示されるアミノ酸配列を有する2つのポリペプチドを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。
- 2つのポリペプチドが
a)配列番号27、29、30の406位、412位及び415位、又は
b)配列番号31の392位、398位及び401位、又は
c)配列番号32の391位、397位及び400位、又は
d)配列番号33の374位、380位及び383位、又は
e)配列番号34の397位、403位及び406位、又は
f)配列番号35の382位、388位及び391位、又は
g)配列番号49の394位、400位及び403位、又は
h)配列番号50の370位、376位及び379位
に形成された3つの鎖間ジスルフィド結合によって共有結合で連結されている、請求項14に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。 - 配列番号27、29、30のN132及びN266、又は配列番号31のN128及びN257、又は配列番号32のN128及びN258、又は配列番号33のN122及びN245、又は配列番号34のN129及びN260、又は配列番号35のN125及びN250、又は配列番号49のN128及びN258、又は配列番号50のN122のリストから選択される1つ又は複数のNグリコシル化アスパラギン残基を含む、請求項14又は15に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。
- ポリペプチドが更に翻訳後修飾されている、請求項1から16のいずれか一項に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。
- 翻訳後修飾がN末端グルタミンのピログルタメートへの修飾を含む、請求項17に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質。
- 好ましくは発現制御配列に作動可能に連結された、請求項1〜18のいずれか一項に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質をコードする核酸分子。
- 請求項19に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項19に記載の核酸分子又は請求項20に記載のベクターで形質転換された又はトランスフェクトされた細胞又は非ヒト生命体であって、細胞が例えば原核細胞又は真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、又はより好ましくはヒト細胞若しくはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、細胞又は非ヒト生命体。
- 請求項1から18のいずれか一項に記載のGITR受容体アゴニストタンパク質、請求項19に記載の核酸分子、又は請求項20に記載のベクターを活性薬剤として含む医薬組成物又は診断用組成物。
- 1つ又は複数の薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤及び/又はアジュバントを更に含む、請求項22に記載の医薬組成物又は診断用組成物。
- 治療、より詳細にはGITRLの機能不全によって引き起こされる、これに関連する、及び/又はこれに付随する障害、特に腫瘍等の増殖性障害、例えば固形又はリンパ腫瘍、感染症、炎症、代謝性疾患、自己免疫障害、例えばリウマトイド及び/又は関節炎疾患、退行性疾患、例えば多発性硬化症等の神経退行性疾患、アポトーシス関連疾患又は移植拒絶反応の予防及び/又は処置において用いるための、請求項22又は23に記載の医薬組成物。
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