Λ találmány tárgyát urikolitikus aktivitású, genetikailag módosított proteinek képezik. közelebbről# a találmány tárgyát csonkított urát oxidézokPoi álló proteinek# valamint előállítási eljárásaik képezik.
At „urát oxidáz'* ás „úri Rázd* kifejezéseket egymás szinonimáiként használjuk. ár urát oxidézok (urikárok? E.C. 1.7.3.3} olyan enzimek# amelyek a húgysav oldókonyább termákká, aliantoinná történő oxidációját katalizálják, áz allantéin egy purin-anyageseretermék# amely könnyebben kiválasztható. Emberekben ensimatikusan aktív orikáz nem termelődik, ami az úrikérgén magasabb rendű főemlősök evolúciója során bekövetkezett számos mutációjának eredménye [id. rtn#· X. ás mtsai.; ai ttot. Evői. 34# 78-84 (1892), melyet teljes terjedelmében a kitanltás részének tekintünk]. következésképpen# fogékony egyénekben s hűgyeav túlzott vérben! koncentrációja (hiperuríkémia) fájdalmas Izületi gyulladást (köszvány) eredményezhet# alaktalan nrátlerakódéeokat (tophus-ok) és veseelegtelenséget okozhat. Eéhány érintett egyénben a rendelkezésre éllé hatóanyagok - mint pl. az alloporinol (amely a hdgysavsrintásis inhibitora) a kezelést korlátozó# zavaró hatásokat eredményeznek vagy nem enyhítik megfelelően ezeket ar állapotokat (Hande# K.é. éa mtsai.. ; Ám. ai bed. Tő, 47-öe (1984) # Eam# Á.G. Beilliere^s Clin. Rhsumatol, 4, 177-192 (1898), mely fórrá18ŐŐ2 KB sokat teljes terjedelmükben a kitanitás részének kell tekinteni] .
As urikáz Injekciók - legalább átmenetileg - csökkenthetik a hiperurikémiát és a .hiperuricosuriát. Mivel es úrikéz az emberi szervezetben idegen proteinnek minősül, a késéit páciensek néhány százalékában az Aspergillus .fi a vasból származó módosítatlan protein mér as első injektálás után ís anafiiaxiás .reakciókat indukált [Púi, OH, és mtsai,.: Leukémia 11, 1813-1616 (13975, melyet teljes terjedelmében a kitanitás részének kell tekinteni]; as általa kiváltott immunreakcíő'k pedig korlátozzák a .krónikus vagy időszakos keselés alkalmashatóságát. [Donadio, D. és mtsai.: Mouv* Presse Med. 10, 711-712 (1931); Leaustio, M. és mtsai*: Rév. Rhum. Mai, Osteoartíc, 50, 553-554 {1933}, mely forrásokat teljes térjedeimükben a kitanitás réssének kell tekinteni],
A híperurikémia hozzáférhető kezelési módszereinek azub-optimáüs teljesítményét évtizedekkel ezelőtt felismert ék [ld* Kissel, F. és mtsai., Natúré 217,- 72-74 (19635, melyet teljes terjedelmében a kítanitás réssének kell tekinteni] . Hasonlóan, már évekkel ezelőtt felismerték annak lehetőségét, hogy súlyos kössvényben szenvedő páciensek bizonyos csoportjai számára előnyös lehet as injektálható urikáz biztonságos és hatásos alakja [ld, Davis, Γ.Γ. és mtsai,, in: „Zn.zyme hngineeri.ng, 4. kötet, 155-173. old,, (19735, szerk,: Broun, S,8. éa mtsai*, hew k'ork, Plenum Press? ^ishimura, H, és mtsai*: Bnzyme 24, 261-264 (19735 ? Níshimura, 8» és mtsai*: Knsyme 26, 49-53 (.1381) ? Davis, S.
és mtsai..: Láncét 2(8241), 231-283 (1321} ? Afeuehowski, A, és mtsai.: 31 PharaacoL Bxp. Ther. 212, 352-354 (1381); Chan, EH-L, és mtsai»: Bíoehím. Biophys. Acta 665, 223-255 (1581) ? Chua, C.C. és mtsai»: Ann, Int. Mac. 103, 114-115 (1988); Greenberg, M.L. és mtsai.: Anal. Biochem. 176, 290283 (1983) ], moly források mindegyikét teljes terjedelmében, a kitanitás részének kell tekinteni]. Ac állati szervekből származó urikézok csaknem oldhatatlanok ac injektálással történő biztonságos adagolással kompatibilis oldáscetekben [id. a 3 616 2.31 számú egyesült államokbeli szabadalmi .leírást, melyet teljes terjedelmében a kitanitás részének kell tekinteni]. Bizonyos - növényekből vagy mikroorganizmusokból származó - úri kánok a gyógyászati szempontból elfogadható' oldószerekben nagyobb ol.dákonyságot mutatnak, azonban a mikrobíáiis enzimek injektálása gyorsan olyan immunreakciókat indukálhat, amelyek életveszélyes allergiás reakciókat okozhatnak vagy ac urikáz ínaktiválódását és/vagy keringésből történő clearance-át idézhetik elő. [Donadio és mtsai., (1831); beaustic és mtsai, (1383)], Emlősökből (pi. sertésből vagy páviánból) vagy rovarokból (pl. Drosophila melanogaster-ből vagy Drosophila paaudoobscuru-ből) származó úri károk leszármaztatott· aminosav-szekvenciáján alapuló enzimek [Wallrath, h.L. és mtsai.: Hol, Ceil. Bioi. 18, 5114-5125 (1330.) ] immunogenitásí problémák és fiziológiai pK-n tapasztalható oldhatatlanságuk miatt klinikai alkalmazásra nem bizonyultak megfelelő jelöltnek.
Korábban kutatók a húgysav allantoinná történő in vivő urikázt alkalmaztak átalakulásának kataiizálására injektált fid. Púi és mtsai. (199?)} . Ez képezi alapját az áspergillus fiavus gombából származó urikáz (üricozyme*» Franciaországban és Olaszországban hematológiai malignáns betegségek cítotoxikus terápiájával összefüggő hiperúrikérnia megelőzésére vagy ideiglenes korrigálására, illetve köszvényes páciensekben a súlyos fokú híperurikémia átmeneti csökkentésére - történő alkalmazásának [id. Potaux, L, és mtsai.: Mouv. Presse Med. 4, 1109 (1975); Legoux, H. és mtsai»: -J. Bioi. Chem. 367, 8565-8570 (1993); valamint az 5 382 518 és 5 541 098 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást, mely források mindegyikét teljes terjedelmében a kitanitás részének kell tekintenij. Mivel az Uricozyme® a keringésben rövid életidejü, alkalmazása napi injektálást igényel, továbbá - immnnogenitása miatt - hoszszú időtartamú terápiára nem alkalmas.
Fokozott felezési idejű és csökkentett immunogenitású, gyógyászati szempontból hatékony urikáz-alakok létrehozása céljából bizonyos ux'ikázok előnyösen alkalmazhatók poli(etilén-glikollal) vagy poli(etilén-oxiddal) (a továbbiakban mindkettőt „PEG#~nek nevezzük) alkotott konjugát űrnek előállítására [Id, a 4 1?9 3.37, 4 776 106, 4 847 325 és 6 876 235 számú egyesült államokbeli szabadalmi! leírásokat, valamint az ÜS2OO3/ÖO827§6A1 számon közzétett egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést, melyeket teljes terjedelműkben a kitanítás részének kell tekinteni]. Az urikáz PEG-től eltérő polimerekkel, alkotott konjugátumait szintén feltárták (ld. a 4 460 683 számú egyesült államokbeli szabadaimx leírást, melyet teljes terjedelmében a kitanitás részének kell tekinteni).
Az urikáz PEGilálása {azaz a PEG urikázhoz történd kovalens kapcsolása) céljából végzett, közzétett próbálkozások. csaknem mindegyikében a PEG-efc elsősorban aminocsoporfokhoz kapcsolják (ideértve az N-terminálís aminosavat és a hozzáférhető iízineket)> Az általánosan alkalmazott úrikárokban a lizinek összes mennyisége ···· a négy azonos alegységben kölön-kölön - 25 (az Aspergílius fia vasban? id. az 5 332 518 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást, melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni) és 29 [sertésben; id, Nu, X. éa mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 38, 9412-9418 (1939), melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni] között van. Az enzim natív konformációjában a lizinek némelyike a PEGiláláshoz nem férhető hozzá. Az urikáz immunogenitása csökkentésének legáltalánosabb módja nagyszámú kis molekula-tömegű PEG-szál urikázhoz történő kapcsolása, amely minden esetben a létrehozott konjngátumok enzimatikus aktivitásának nagymértékű csökkenését eredményezte.
Candida utiiis urikáz 5 kb-os PEG-hez kapcsolt készítményének egyszeri Intravénás injektálása öt emberben (akik injektálás előtti szérum urátkoncentrációja 8,2 mg/dl volt, amely normális tartományon belöli érték) a szérum urát szintjét kimutathatatlan értékre csökkentette (Davis és mtsai. (1981)]. A pácienseknek négy héttel később újabb oltást adtak, de reakcióikról nem számoltak .be, A második (ás sgyben utolsó) .Injekciót követően urikáz elleni antitesté' kát - viszonylag érzéketlen géidiffűzíós vizsgálati eljárással -' nem detektáltak. B hivatkozásban nem ismertettek emberek vagy kísérleti állatok krónikus vagy szubkrőnlkus kezeléseiből származó eredményekét.
Arthrobuezer pretefermiae-böl származó urikáz 5 kD-os PSG-hez kapcsolt készítményét sgy limfomás páciens (akinek injektálás előtti szérum urátkoncentrációja 15 mg/dl volt) hiperurikémiájának ideiglenes kontrollálására alkalmazták [Chua és mtsai, (1900)], A páciens kritikus állapota és a kezelés rövid időtartama {iá nap alatt négy injekció) nem volt lehetséges a konjugátum tartós hatékonyságának es biztonságosságának értékelése.
Az egyes urikáz-alegységek 2-10 szál nagy molekuletömenü PEG-gel <>S kb - 120 kb) történő módosítása az immunológiai felismeréssel szemben javított védelmet nyújtott (Saifer és mtsai,; (6 025 235 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás); Adv. kap, Med. Bioi. 306# 377-38? (1994), moly források mindegyikét teljes terjedelmében a kitani.tás részének kell tekinteni] . Bz a megoldás a különböző fajokból származó urikáz enzimetikus aktivitása (a Bséilálás után) több# mint ?S 1-ának megmaradását eredményezte; javította az urikáz keringési idejét? ée az enzim, ismételt injektálását tette lehetővé# anélkül# hogy egerekben vagy nyálakban antitestek termelődését váltotta volna ki,
Hershfield és Kelly (KO 00/05135 számú nemzetközi közzétételi irat; 60/095409 számú egyesült államokbeli azabadaimí bajelentés) illetve munkatársaik (WO ÜÖ/ÖÖ07629 számú nemzetköti közzétáteli irat) emiöofajokból származó# optimális számú PEGílálási helyet tartalmazó rekombináns urikázproteínek létrehozásának módszereit fejlesztették ki. Az enzim kiválasztott pontjain a hozzáférhető lízinek számának fokozására PCR-technikát alkalmaztak# és az enzimet úgy tervezték meg#- hogy megfelelő PSGilálást követően csökkenjen az immunrendszer általi felismerhetősége# miközben lényegében megmaradjon uríkölítikus aktivitása» Az általuk létrehozott urikázproteínek némelyike C-terminálísán és/vagy ^-terminálisán lett csonkítva« A szerzők a protein egyéb# specifikus# genetikailag indukált módosításaira vonatkozóan nem közöltek útmutatást.
Találmányunk leíráséban az ##imm.unogenitásí? kifejezésen immunreakcié - PEG-gel módosított vagy módosítatlan urikáz injektált készítménye (mint antigén) általi - índukálását értjük# míg az ##antigenitás#z kifejezés egy antigén már létező antitestekkel bekövetkező reakciójára vonatkozik. Az antigén it ás és az immunogenitást együttesen ##ímmunreaktívitás-nak nevezzük. A P'EG-uríkáz tanulmányozására végzett korábbi kísérletekben az ímmunreaktivítást különféle eljárásokkal értékelték# igy például: 1) a PEG-urikáz előre létrehozott antitestekkel történő in vitro reagáltafásával? 2) indukált antitest-szintézis meghatározásával? és 3) ismételt injektálások utáni felgyorsult oiearance alapján.
A különféle forrásokból származó urikázok immunogenitása csökkentésére ··· különböző számú FEG-szálak c\ ~ Ο különböze kapcsolökotzponenseken keresztüli kapcsolásával ···· tett korábbi kísérletek kevés sikerrel jártak, A PEGurikásokat elsőként F.F, Davis, valamint Y. Inada és munkatársaik tárták fel (ld, Davis és mtsai, (1978) ; 4 179 337 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Fishimura és mtsai. (1979); 55-99199 62-55079 számú japán szabadalmi leírások? mely forrásokat teljes terjedelmükben a kitanítás részének keli tekinteni]. A 4 179 337 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban feltárt konjagátamot egy meghatározatlan eredetű urikáz és egy 7 50 D molekulatömegű PEG 2000-szeres molekuláris feleslegének reagáltatásávai szintetizálták, ami arra atal, hogy mindegyik urikázaleeységhez valószínűleg nagyszámú polimermoiekula kapcsolódott. A 4 179 337 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban különböző polipeptid hormonok és enzimek - köztük az oridoreduktázok, amelyek három, példájának egyike az urikáz - aktív, vizoidékony és nem immunogén konjugátumainak létrehozására 500 D-tól 20 000 D-ig terjedő (előnyösen kb. 500-5000 D) molekulatömegö PEG vagy poli(propiién-glikol) kapcsolását tárták fel. Ezen túlmenően, az említett egyesült államokbeli szabadalmi leírásban hangsúlyozták az enzimmoiekuiánkénti 10-100 polimerszál kapcsolását és az enzimatikus aktivitás legalább 40 %-ának megtartását. A PEG-nek az urikáz hozzáférhető amlnocsoportjálhoz történő kapcsolódásának mértékére, a maradék specifikus uríkoiitikus aktivitásra és a kenjugátum immnnreaktivitására vonatkozó teszteredményeket nem ismertettek.
Korábbi publikációkban leírták# hogy különbőzé számú PBG-szái Gazdidé utilis-böl származó úrikárhoz történő kapcsolása az i.n vitro mért urikolitikus aktivitás jelentős mértékű csökkenését eredményezte, Nagyszámú 5 kE-os ESGszál sertésmájból szarmezé erikáéhoz történő kapcsolása hasonló eredményeket adott (Id, Chen publikációját és ugyanezen csoport szlmpézinm beszámolóját? Chen és mtsai, (1981)? Davis és mtsai. (1978)].
Hét korábbi vizsgalatban az erikaz immunreaktivitásának PEGiláiás hatására bekövetkező csökkenését tapasztalták# mig öt további vizsgálatban az immunreaktivitás teljes megszűnéséről számoltak be. Ezen öt vizsgálat közöl háromban az immünreaktivitás megszűnése az nrikoiitikna aktivitás jelentős mértékű (az eredeti aktivitás 15 %-ára# 28 %-ára# illetve 45 %-éra történő) csökkenésével járt együtt (Hlshimnra és mtsai.# 1979 (15 %-os aktivitás)? Chen és mtsai,# 1981 (28 l-os aktivitás)? Hishimura es mtsai*, 1981 (45 %-os aktivitás). A negyedik vizsgalatban a PEG-et a hozzáférhető ilzinek 81 %-ához kapcsolták hozzá# de a maradék specifikus aktivitást nem állapították meg [Ábuchosski és mtsai. (1981)}, Mindazonáltal# egy kutatócsoport (amelynek ugyanazon tudósok közül kettő is tagja volt# és amely azonos eljárásokat alkalmazott) másutt beszámolt arról#· hogy az ilyen mértékű kapcsolás mindössze 23-28 %-os maradék aktivitást eredményez (Chen és mtsai. (1981)}» ébnohoweki és mtsai.# illetve Chen ée mtsai. 1981as publikációja azt mutatja# hegy az orikáz iMunogenifásának jelentős mértékű csökkentése érdekében a hozzáférhető űrinek kb, 60 %-ához kell PEG-et kapcsolni. Az ötödik publikációban (amelyben sz etikáz iwun.reak.fcivitásának megszüntetését Ismertették) a PEG-kapcaoIás mértékét, a maradék urikolitikus aktivitást, illetve a PSGprotein kötés természetét nem Írták le fVeronese, F.M. és mtsai, (1997) ín: J.M, Harris és mtsai. (szerk,): „Poly(ethyiene glycol) Chemlstry and Biological Applications*', ÁCS Symposíum Sarlós 688 (182-192, old), Washington, D.C, : American Chemical Society, melyet teljes terjedelmében a .kitanítás részének kell tekinteni] .
Ha a urikáz kitinjeinek kisebb hányadához kapcsoltak PEG-et, kísérleti állatokban a létrehozott konjugátum ímmunreaktívitása csökkent ugyan, de nem szent meg teljesen [Tsuji# 01 és mtsai,: Int, 01 immunopharmacoi 2* 725-730 (1985), melyet teljes terjedelmében a kitanitás részének keli tekinteni; az aminocsoportok 28~<15 %-ának PEGíiálása]; Tasuda és mtsai,: Chem, Pharm, Bull, 3 8, 2053-2056 (1990), melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni; az aminocsoportok 38 %-ának PEGíiálása], A megfelelő addukiumok maradék urikolitikus aktivitása kezdeti aktivitásuk 33 %-a alatti értéktől (Tsuji és mtsai.) S0 %-ig (Yasuda és mtsai,) terjedt, Tsuji és mtsai, - az 5 kD-os PEG-en felül - 7,5 Kd-os és 10 kD-os PSG alkalmazásával szintetizáltak PSG-urikáz kon jugát nme kát. A létrehozott konjugátamok mindegyike mutatott valamilyen szintű immunogenitá.st és antigenitást, ugyanakkor, jelentős mértékben csökkent enzimatíkus aktivitással bírtak.
Davis és mtsai, (1981) leírták, hogy a Candída nfilisbői. származó urikáz PEGilált készítménye (amely őt emberben két alkalommal biztonságosan volt adagolható) a kezdeti aktivitás mindössze 11 %-át tartotta meg. Évekkel később az Arthrobacter pz-otoformiae-ből származó PEGilált urikázt egyetlen - előrehaladott iimfóméban és súlyos hiperúri kémiában szenvedő ··· páciensnek négy alkalommal adták be [Chua és mtsai. (1988)). Bár ez utóbbi enzimkészítmény maradék aktivitását nem mérték, Chua és mtsai. a páciens első PEG-urikáz injekció után 26 nappal vett. - szérumában, enzímkötött immunézorbens vizsgálati eljárás (ELISA) alkalmazásával kimutatták az urikáz elleni antitestek hiányát.
PSGilált urikázzal végzett korábbi vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy a katalitikus aktivitást az immunreaktivitás jelentős mértékű csökkentéséhez elegendő számú PEG-szál enzimhez történő kapcsolása jelentékeny arányban csökkentette. Ezenfelül, a PSG-urikáz legtöbb korábbi készítményt cianur-kloriddal aktivált PEG alkalmazásával szintetizálták [a cianur-klorid egy triazin-származék (2,4,6-tri.klór-l, 3,5-fcriazín), amelyről nyulakban kimutatták, hogy új antigén-determinánsok bejuttatását eredményezi és antitest-termelődést indukál; ld. Tsuji és mtsai. (1985)].
A 3-188298 számú japán szabadalmi leírásban (Sano és mtsai., melyet teljes terjedelmében a. kitanitás részének kell tekinteni) módosított proteineket - köztük urikázt. tártak fel, amelyek 1-12 kb-os PBG-gel. voltak derivatízálva, és amelyek csökkentett antigenitásüak és „javított tartós,v hatásúak voltak; továbbá feltárták e derivatizált peptidek előállítási eljárásait is, Mindazonáltal, nem ismertették a derivatizálásra alkalmazott PEGszálak számát, az alkalmazott enzim vizsgálati eljárásokat és biológiai teszteket, illetve a „javított tartós kifejezés jelentését. Az 55-99189 és 62-55079 számú japán szabadalmi leírásokban (mindkettő szerzője Y. Inadé) , melyeket, teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni, PEG-triazinnal, illetve bísz-PEG-triazinnai (rövidítése: PEG2) előállított urikáz-konjugátumokat tártak fel (Id. Nishimura és mtsai (1979 és 1981)! . Az első konjngátumtipusban a PEG-ek molekulát őrsege 2 kD és 5 kD volt, míg a másodikban csak 5 kD-os PEG-et alkalmaztak. Nishimura és mtsai. (1979) a hozzáférhető lázinak 5 kD-os lineáris PEG™ gel végzett módosítását követően sz urikolitikus aktivitás 15 %-os megmaradását Írták le, mig a lizinek 46 %-ának vagy 36 %-ának PEG^-vel végzett módosítását követően az urikolitikus aktivitás 31 %-os, illetve 45 %-os megmaradását ismertették (Id. Nishimura és mtsai. (1981)1.
A korábban tanulmányo-zott urikáz proteinek természetes vagy rekombináns proteinek, azonban SDS-PAGE-anaiízis vagy western-blot technika alkalmazásával végzett vizsgálatok nem várt, kis molekulatömegű peptidek jelenlétét mutatták, amelyek bomlástex'mékeknek tűntek, és az idő előrehaladásával gyakoriságuk növekedett.
Találmányunk tárgyát mutáns rekombináns urikáz proteinek képezik, amelyek csonkított szekvenciáinak és fokozott strukturális stabilitásüak.
A találmány értelmében űj rekombináns urikáz proteinékét tárunk, fel. Az egyik megvalósítási mód szerint a találmány szerinti proteinek csonkított szekvenciájúak és - a természetben előforduló urikáz proteinekkel összehasonlítva · mutagenizált amínosavakat tartalmaznak. A találmány előnyös megvalósítási módjai, érteimében a mutációk a 7., 46. , 291. és 301. aminosavaknál fordulnak elő, A peptld bármely részén előforduló konzervatív mutációk szintén a találmány tárgyához tartoznak.
A találmány érteimében mutáns rekombináns úrikért tárunk fel, amely 1-S- aminosavval van lerövidítve, ugyanakkor, megtartja a természetben előforduló urikáz uríkolitíkus aktivitását. A csonkítások a szekvenciák terminálisainál vagy azok környékén fordulnak elő, és a protein tartalmazza a láncvégi amínosavakat, Ezek a mutációk és csőnkítások fokozhatják az ilyen mutációkat hordozó protein stabilitását.
A találmány egy következő megvalósítási módja szerint egy eszközt tárunk fel hűgysav metabolizáiására, amely urikolitikus aktivitású új rekombináns urikáz proteint foglal magában. Ahogy itt használjuk, az urikolitikus aktivitás a hűgysav allantoinná történő enzimatikus átalakítására vonatkozik.
A találmány érteimében feltárunk továbbá egy gazdasejtet, amely 1-6 aminosavval csonkított urikáz termelésére képes, mely urikáz mutagenizált amínosavakat tartalmaz és megtartja urikolitikus aktivitását.
A találmány értelmében izolált, csonkított emlöseredetö. úrikért tárunk fel, amely ^-terminálisán vagy C~ terminálisán vagy mind ar mind a C-terminálisán 1-6 aminosavval csonkított emlőseredetö urikáz aminosavszekvenciát tartalmaz, továbbá treonin szubsztitúciót tartalmaz a 7. pozícióban CDIT), szintén treonin szubsztitúciót tartalmaz a 46, pozícióban (S4öT), lisin szubsztitúciót tartalmaz a 291, pozícióban CR291K) és szerín szubsztitúciót tartalmaz a 301, pozícióban (T3Ö1S), ahol a csonkítás és az amínosav szubsztitúciók a természetesen előforduló sertés urikáz 11, azonosítási számú amiriosav-szekvenciaként bemutatott aminosav-szekvenciájához képest állnak fenn,
Egy másik megvalósítási mód szerint az urikáz polimerrel van konjugálva, miáltal, például, poli(étilén-glikol)urikáz konjugátum jen létre. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a poliefilénglíkol-urikáz konjugátumok minden egyes urikáz-alegységen 2-12 {előnyösen 3-10) poli(étilén-glikol) molekulát tartalmaznak, Az előnyös megvalósítási utódokban a poli(étilén-glikol)-urikáz konjugátumban minden egyes poli(etilén-giikol) molekula kb. 1 kD és 100 kD közötti; kb. 1 kD ss 50 kD közötti; kb. 5 kD és 20 kD közötti; vagy kb, 10 kD molekulatömegö.
Feltárunk továbbá olyan gyógyászati készítményeket, amelyek találmány szerinti uríkázt tartalmaznak, ideértve a poli(etilén-glikol)-urikáz konjugátumot, Az egyik megvalósítási mód értelmében a gyógyászati készítmény hosszá időtartamú alkalmazásra alkalmas.
Feltárunk továbbá egy eljárást húgysav szintjének rászoruló páciens biológiai folyadékában történő csökkentésére, melynek során a páciensnek találmány szerinti uríkázt ,-η tartalmazó győcjyászati készítményt adagolunk. Az egyik előnyös megvalósítási mód értelmében a húgysav-szintet vérben csökkentjük.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint az urikáz a Sertés-KS-úN-urikáz 44, pozíciójától 56. pozíciójáig terjedő szekvenciát (14. azonosítószámú szekvencia) magában foglaló pepiidet tartalmazza.
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében az urikázprotein ^-terminális metionínt tartalmaz. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az urikáz a 7. azonosítószámú szekvenciaként megadott aminosav-szekvenciát tartalmazza.
A fentieken túlmenően, izolált nukieinsavakat tárunk fel, amelyek találmány szerinti uríkázt (például, a 7,, 8, 12, vagy 13. azonosítószámú aminosav-szekvenciát tartalmazó urikázokat) kőddé nukieinsav-szekvencíát tartalmaznak. Az egyik megvalósítási mód szerint az izolált nukleinsav működőképesen egy heterológ promóterhez (például, osmBpromóterhez} van kapcsolva. Feltárjak továbbá a találmány szerinti urikázokat kódoló nukieinsavakat tartalmazó vektorokat, valamint az ilyen vektorokat tartalmazó gazdasejteket. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a nukleinsav a 7, azonosítószámú szekvenciát tartalmazza. Ezen túlmenően, eljárásokat tárunk fel urikáz előállítására, melyek során találmány szerinti gazdasejtet olyan feltételek mellett tenyésztünk, amely elősegíti, hogy a gazdasejt urikázt termeljen, majd izoláljuk a termelődött uríkázt.
A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.
Az 1, ábrán a pOUR-F-AK-ks-l-piazmid szerkezetét mutatjuk be. A restrikciós helyek mellett feltüntetett számok a HaeXI-helyhez (amely ar 1-es pozíció) viszonyított nukleotídpozlciőkat jelölik. A klónozás során, kiesett restrikciós helyeket zárójelben tüntetjük fel.
A 2. ábrán a Sertés-KS-ÁN-urikáz DNS-szekvenciáját (9. azonosítószámú szekvencia) és leszármaztatott aminosavszekvenciáját (?. azonosítószámú szekvencia) mutatjuk be. Az aminosavak számozását a sertésexedetö urikáz teljes szekvenciájára vonatkoztatva adjuk meg. A kezdő metionint követően a sertés urikázszekvenciájának 7. pozíciójában lévő aszparaginsavat treonin helyettesíti. Az ábrán feltüntettük a szubklónozás különböző lépéseinek végrehajtására alkalmazott restrikciós helyeket. A 3'-oldali nem transzlálódó szekvenciát kisbetűkkel szedve adtuk meg. A transzlációs stop-kodont csillaggal jelöltük,
A 3. ábrán különböző rekombináns urikáz-szekvenciák [sertéseredetű (11. azonosítószámú szekvencia), PBC-ÁNC (12, azonosítószámú szekvencia) és Sertés-KS-ÁN (7. azonosítószámú szekvencia)] leszármazhatott aminosav-szekvenóiéinak relatív egymás alá rendezését mutatjuk be, A csillagok azokat a pozíciókat jelölik, amelyekben a Sertés-KSΔΝ aminosavai eltérést mutatnak a sertéseredetü urikáz közzétett szekvenciájától, míg a körök azokat a pozíciókat jelölik, amelyekben a Sertés-KS-ΔΝ aminosavai eltérést mutatnak a PBC-ΔΝ szekvenciájától. A szaggatott vonalak aminosav-deléciőkat jelölnek.
A 4. ábrán a sertéseredetű urikáz és az 1-3. példákban leírt, nagymértékben tisztított úrikázváltozatok SDS-PAGEanalízisének eredményeik mutatjuk be. Az előállítás dátumát (hónap/év),· valamint az egyes mintáknak megfelelő sávok sorszámát az alábbiakban adjuk .meg; 1. sáv; molekulatömegmarkerek? 2. sáv: sertés-KS-áN (7/98)? 3. sáv; sertés (9/98); 4. sáv; sertés-KS {8/991; 5, sáv: sertés-KS (6/99} ; 6. sáv: sertés-á^ {6/99}; 7. sáv; sertés-KS-AN (7/99); 8. sáv; sertés-KS-Δ^ (8/99), Az Y-tengelyen a molekulatömegmarkerek tömegét, mig ar ábra tetején a sávok sorszámát tüntettük fel.
Az 5. ábrán PEGiiált (9x10 kD) sertés-KS-ÁÍ4-uríkáz íntramuszkulárís <IM|, szubkután (SC) és intravénás (IV) injektálást kővetően - patkányokban megfigyelt farmakokinetikéi profiljait mutatjuk be, melyeket az enzimatikus aktivitás vérmintákban történő nyomon követésével határoztunk meg» A megadott időpontokban gyűjtött plazmamintákban az urikázaktivítást kolorímetríás teszttel határoztuk meg. Az aktivitási értékek (mAü millí-abszorbancia egység) az enzimatikus reakció 1 μί vérmintára vonatkoztatott sebességét reprezentálják. Az injektált urikáz biohasznosíthatóságát (a keringésbe jutó hatóanyag-mennyiség az intravénás injektálással beadott mennyiséghez viszonyítva) a grafikon görbe alatti területéből számítottuk ki,
A Ő, ábrán DEGilált (9x10 kD) sertés-KS-ÁH-uríkáz intramuszkuiátis (Xdj, szubkután (SC) és intravénás (XV) injektálást követően - nyálakban megfigyelt farmakokinetikéi profiljait mutatjuk be, melyeket az enzimatikus aktivitás vérmintákban történő nyomon követésével határoztunk meg, A megadott időpontokban gyűjtött plazmamintákban az urikázaktivitást kolorimetriás teszttel határoztuk meg. Az aktivitási értékek (mAD - míilí-abszorbancía egység) az enzimatíkus reakció 1 μί vérmintára vonatkoztatott sebességét reprezentálják. Az injektált urikáz biohasznosíthatóságát (a keringésbe jutó hatóanyag-mennyiség az intravénás injektálással beadott mennyiséghez viszonyítva) a grafikon görbe alatti területéből számítottuk kí.
A 7. ábrán PEGilált (9x10 kö) sertés-KS-ÁN-urikáz intramuszkuláris (ÍM), szubkután (SC) és intravénás (IV) injektálást követően - kutyákban megfigyelt farmakokínetikai profiljait mutatjuk be,· melyeket az enzimatíkus aktivitás vérmintákban történő nyomon követésével határoztunk meg. A megadott időpontokban gyűjtött plazmamíntákban az urikázaktivitást kolorimetriás teszttel határoztuk meg. Az aktivitási értékek (mAU - mílli-abszorbancia egység) az enzimatíkus reakció 1 μί vérmintára vonatkoztatott sebességét reprezentálják. Az injektált urikáz bíohasznosithatőságát (a keringésbe jutó hatóanyag-mennyiség az intravénás injektálással beadott mennyiséghez viszonyítva) a grafikon görbe alatti területéből számítottuk ki.
A 8. ábrán PBGilált (9x10 kD) sertés-KS-átí-urikáz intramuszkuláris (XM), szubkután (SC) és intravénás (IV) injektálást követően - sertésekben megfigyelt farmakokínetíkaí profiljait mutatjuk be, melyeket az enzimatíkus aktivitás vérmintákban történő nyomon követésével határoztunk meg. A megadott időpontokban gyűjtött plazmamintákban az urí'kázaktivitást kolorimetriás teszttel határoztuk meg. Az aktivitási értékek (mAU is millí-abszorbanoia egység) az enzimatikus reakció X ui vérmintára vonatkoztatott sebességét reprezentálják. Az injektált urikáz biohasznosíthatóságát (a keringésbe jutó hatóanyag-mennyiség az intravénás injektálással beadott mennyiséghez viszonyítva) a grafikon görbe alatti területéből számítottuk ki.
Korábbi tanulmányokban azt állapították meg, hogy ha .PEG Hálással az urikáz immunogenitásának és/vagy antigenírásának jelentékeny csökkenését sikerült elérni, ez minden, esetben az urikolitikus aktivitás jelentős mértékű csökkenésével járt. A biológiai gyógyszerek biztonságosságát, kényeimét és költséghatékonyságát egyaránt károsan befolyásolja a hatékonyságukban bekövetkező csökkenés, valamint az ebből adódó dózisnövelés szükségessége. Ilyenformán, a húgysav testfolyadékokban (ideértve a vért) megnövekedett szintjének biztonságos és hatékony alternatív eszközeire van szükség. Találmányunk értelmében rekombináns mutáns urikázt tárunk fel, amely N- vagy C~terminálisán (vagy mindkettőn) 1-6 amlnosavvai van lerövidítve, és lényegében megtartja a természetben előforduló urikáz urikolitikus aktivitását.
Ahogy itt használjuk, az „urikáz kifejezés, hacsak Teásképpen nem jelezzük, az egyes alegységekre, valamint a tetramerre egyaránt vonatkozik.
Ahogy itt használjuk, a „mutagenizált urikáz kifejezés olyan urikázmolekulákra Vonatkozik, amelyekben egyes amlnosavak más aminosavakkal vannak helyettesítve.
Ahogy itt használjuk, a „konzervatív mutáció kifejezésen egy vagy több olyan amlnosavak érintő mutációt ártönk# melyek a protein viselkedését lényegesen nem módosító pozícióban vagy pozíció környékén helyezkednek el, A találmány egy előnyős megvalósítási módja érteimében a legalább egy konzervatív mutációt hordozó urikáz azonos urikázaktivitással bír# mint az ilyen mutáció nélküli urikáz. Más megvalósítási módok szerint a legalább egy konzervatív mutációt hordozó urikáz aktivitása lényegében azonos az ilyen mutációt nem hordozó urikáz aktivitásával (5 1-on belüli# lö %-on belüli vagy 30 %~on belüli eltéréssel) .
A konzervatív aminosav-szuhsztitúciót a.z aminosavösszetétel olyan, megváltoztatásaként definiáljuk# amely egy peptid# polipeptid vagy protein (vagy fragmense) aminosavainak cseréjén alapul. A találmány konkrét megvalósítási módjaiban az urikáz négy konzervatív szubsztitúciót hordoz, A szubsztitúció általánosan hasonló tulajdonságú (pl. savasság# bázikosság# aromásság# méret# pozitív vagy negatív töltés# polárosáig# apoiárosság) aminosavak között valósulhat meg# miáltal az Így bekövetkezett szubsztitúciók nem befolyásolják jelentősen a peptid# polipeptid vagy protein tulajdonságait (pl. töltés# ISF# affinitás# aviditás# konformáció# oldékonys-ág) vagy aktivitását. A konzervatív amínosav-szubaztitúciók jellemzően a kővetkező aminosav csoportokon belül valósulhatnak meg:
- glicin (G) # alanin (A?# val ín (V) # ieucin (L) és izoleucin .<!} ?
- aszparagínsav (D) és glutaminsav {£)#♦
- alanin (A)# szerín (S) és treonin (T) í
- hisztidin (H), lizin (K) és arginin (B);
- aszpatagin (b) és glutamín (Q);
- feniialanin (F)f tirozin <¥} és triptoíán. (b)»
Az agy vagy több konzervatív szabsz titúciót hordozó protein még akkor is megtartja strukturális stabilitását és reakciót katalizáló képességét, ha DNS-szekvenciája nem azonos az eredeti proteinével.
Ahogy itt használjuk, a „csonkított urikáz kifejezésen olyan urikázmolekulákat értünk, amelyek elsődleges amino-sav-szekvenciája lerövidítésre került. A lehetséges csonkítások az B- és/vagy € -terminálison vagy annak közelében történhetnek. .Az ilyen típusú specifikus csonkítások eredményeként a természetben előforduló protein láncvégi aminosavai. (az b- és/vagy C-terminálison lévő amínosavak) jelen vannak a csonkított proteinben. Az h-terminális csonkítások az 1.,, 2., 3., 4., 5. vagy 6. pozíciótól kezdődhetnek. Az B-termínálís csonkítások előnyösen a 2» pozíciótól kezdődnek, ami az ^-terminális metionín megmaradását eredményezi. Ez a metionín poszt-transzlációs módosítással távolítható el. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az Kterminális metionin az urikáz előállítása után karúi eltávolításra. A.z egyik előnyős megvalósítási mód értelmében a metionínt endogén bakteriális aminopeptidázzal távolitjük el,
A csonkított úrikézből - a teljes szekvenciához képest
- egy vagy több aminosav-szekvencía kivágásra került. Egy csonkított urikázt tartalmazó protein a csonkított urikázszekvenclán felül bármilyen aminosav-szekvenciát ma__ .•y .-y gában foglalhat# de nem lehet olyan protein# amely további vad típusú amínosav-szekvenciát tartalmazó úrikárazekvenciát foglal magában, Más szavakkal; egy csonkított urikázt tartalmazó protein# amelyben a csonkítás a 6. pozíciónál kezdődik {azaz a csonkított urikáz a 7, pozíciónál, kezdődik)# a csonkított urikáztői közvetlenül ^-terminális irányban nem tartalmaz olyan aminosavat# amelyet a vad típusú urikáz a 6. po íóban tart aImaz„
Hacsak másképpen nem jelezzük (egy másik szekvenciára vagy egy adott azonosítószámú szekvenciára vonatkozó specifikus utalással)# a találmány szerinti urikázok amínosavainak számozását a sertéseredetű urikázszekvencia aminosavaínak pozíciójára vonatkoztatva adjuk meg. A sertéseredetö urikáz amínosav-szekvenciáját és az e szekvenciát alkotó aminosavak számozását a 3. ábrán mutatjuk be. Ahogy itt használjuk# az aminosavakra vagy nukleinsavakra vonatkozóan használt #,X pozíciótól 1 pozícióig terjedő kifejezés olyan folytonos szekvenciára vonatkozik# amely az X pozícióban kezdődik és az Y pozícióban végződik# és magában foglalja az X, illatve Y pozícióban lévő amínosavakat vagy nukleínsavakat is.
Urikáz gének és proteinek több emlősfajban (pl. sertésben# páviánban# patkányban# nyálban# egérben és rhesusma jómban) is azonosításra kerültek. A különféle úrikézprotninek szekvenciáját köz számára hozzáférhető adatbázis nyilvántartási számokra vonatkozó utalásokkal adjuk meg# a következők szerint: gis50403728)spIP25S89; gi i 20513534 i dbj i BA89153S, 1; gi j 1.76610 i gb f AAA3539S. 1;
gi >20513654 idbj ΪΒΑΒ91557.1; gí!47523SÖSiref'NP~9S9435«1; gi s 6678509!refj NPJ333500.1; gi i57463iembiCAA31490.1; gi s 20127 395 i rcfί 52J4 6220.1; gi i137107 s sp|E11645; gi|51458661)ref i X? J 97688.1; gi i 207619 i gb!AAA42318.1; gi!26340770idbjI8AC34047.1; és gi i57459sembiCAA30378.1. £ szekvenciák mindegyikét, illetve az adatbázisokban lévő, a Nemzeti Biotechnológiai Információs Központon („National Center fór Biotechnoiogy Information*, NCBI) keresztül hozzáférhető annotációikat teljes egészében a kitanítás részének keli tekinteni.
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében az urikáz ^-terminálisán 1-6 aminosavval lett lerövidítve. Egy másik megvalósítási mód szerint az urikáz C-termínálisán 46 aminosavval lett lerövidítve. Egy további megvalósítási mód szerint az urikáz C- és N~termináiisán egyaránt 4-6 aminosavval lett lerövidítve.
A találmány egyik megvalósítási módja érteimében az urikáz N-termínáiisán 6 aminosavval lett lerövidítve. Egy másik megvalósítási mód szerint az urikáz C-termínálisán 6 aminosavval lett lerövidítve. Egy további megvalósítási mód szerint az urikáz C- és N-terminálísán egyaránt 6 aminosavval lett lerövidítve.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja értelmében a találmány szerinti urikázprotein a sertéseredetű urikáz aminosav-szekvencíájának (11. azonosítószámú szekvencia)
13. pozíciójától 292. pozíciójáig terjedő aminosavszekvenoíát tartalmazza. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az urikázprotein a PBC-ANC aminosav-szekvencíájának (12. azonosítőszárná szekvencia) 8. pozíciójától 287. pozíciójáig terjedő aminosav-szekvenciát tartalmazza. Egy további előnyös megvalósítási mód értelmében az urikázprotein a sertés-KS~AN andnosav-szekvencíájának (7. azonosítószámú szekvencia) 8. pozíciójától 287. pozíciójáig terjedő ami no sav-szekvenciát tartalmazza.
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében a 46. , 291. és 301. pozíciókban lévő aminosavak kerültek mutagenizálásra.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a proteint olyan nukleinsav kódolja, amely N-terminális metionint kódol. Az N-terminális metionint előnyösen olyan kodon követi, amely lehetővé teszi ezen N-terminális metionin bakteriális metionín emínopeptidáz (MAE) általi eltávolítását (Ben-Bassat és Bauer: Natúré 326, 315 (1987), melyet teljes terjedelmében a ki tani tás részének, kell tekinteni] . Az N-terminális metionin legteljesebb eltávolítását lehetővé tevő aminosavak a következők: alanin, giicin, prolin, szerin és treonín.
A találmány egyik megvalósítási módja érteimében a ?. és/vagy 46. pozícióban lévő aminosavak treoninnal vannak helyettesítve. Az e mutációkkal előállított, csonkított urikázok enzimatikus aktivitása, meglepő módon, hasonló a nem rövidített enzim, aktivitásához. A találmány egy további megvalósítási módja szerint az aminosav-mutációk a 7., 46., 291. és 301. pozícióban, sorrendben, treonín, treonín, lizin, illetve szerin behelyettesítéséi foglalják magukban.
& találmány szerinti csonkított emlőseredetű urikázok ^-terminális aminosavként tartalmazhatnak metionint is? ilyen esetben az utolsó előtt pozícióban olyan aminosav helyezkedik elő, amely lehetövé teszi az ^-terminális metionin bakteriális metionin aminopeptidáz (MAP) által történő eltávolítását. Az N-termínáiis metionín legteljesebb eltávolítását lehetővé tevő aminosavak a következők: alanín, glicín, prolin, szerín és treonin. A találmány egy előnyös megvalósítási -módja szerint az urikáz két Ntermínális amínosavat tartalmaz, melyek közül az egyik a metionín, melyet alanín, glicín, prolin, szerin vagy treonin követ.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint a szubsztltuált aminosavak treonínnai lettek helyettesítve.
A találmány egyik megvalősitáti módja értelmében úrikézként emlőseredetű urikázt tárunk fel.
Az találmány egy következő megvalósítási módja szerint az emlőseredetű urikáz sertés-, szarvasmarha-, juh- vagy pávíánmáj-eredetű urikáz szekvenciáját tartalmazza.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint az urikáz két vagy több emlőseredetű urikázból létrehozott kimérikus urikáz.
A találmány egy következő megvalósítási módja értelmében sz emlőseredetű urikázok sertés-, szarvasmarha-, juhvagy pávíánmáj-eredetű urikázok lehetnek.
A találmány egy következő megvalósítási módja szerint az urikáz Ű. azonosítószámú szekvenciát tartalmaz.
A találmány egy következő megvalósítási módja szerint az urikáz 13. azonosítószámú szekvenciát tartalmaz.
A találmány értelmében urikázt kódoló nukleinsavakat tárunk fel, amelyek 10. azonosítószámú szekvenciát tartalmaznak.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint az uríkáz gombaeredetű vagy mikrobáéira urikázt tartalmaz.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint a gombaeredetú vegy mikrobáéira urikáz Aspergdilus fisvns, Artnrobacfeer globiforrnia vegy Candída etille urikáz.
A találmány egy következő megvalósítási módja értelmében az urikáz gerintelen állatból származó urikázt foglal magéban,
A találmány egy további megvalósítási módja szerint a gerinctelen állatból származó urikáz Drosophila meianogaster vagy Drosophila psendoobscn.rs urikáz.
A találmány egy következő megvalósítási módja szerint az urikáz növényi eredetű urikázt tartalmaz.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint a növényi eredetű urikáz Giyoire mse gyókrégumóíból származó urikáz,
A találmány értelmében urikázt ködeié nukleinsavszekvenciát is feltárunk.
Feltárunk továbbá egy vektort, amely urikázt kódoló nnkleinsav-szekvenciár tartalmaz.
Egy előnyős megvalósítási mód szerint az urikáz izolálva van. Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint az urikáz tisztítva van. Egy további előnyös megvalósítási mód. szerint az urikáz izolálva és tisztítva van.
A találmány érteimében feltárunk egy vektort tartalmaző gazdasejtet is,
A fentieken túlmenően eljárást tárunk fel nukieinsavszekvencia előállítására, mely eljárás egy nem rövidített urikázt tartalmazó nukleínsav-szekvencia PCR (polimerázláncreakció) technikával történd módosítását .foglalja magában, Szakember számára ismert, hegy egy kívánt nukieinsavszekvencia polimeráz-láncreakcíóval történő előállítása szintetikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával hajtható végre, melyek komplementerek az ampiifikálói kívánt céi-DNS régióival (mindkét szálon egy-egy). A láncindítő oligonukleotidokat ···· feleslegben lévő dezoxinukleotidok és Taq-poiimeráz (egy hőstabii DNS-polimeráz) jelenlétében - hozzáadjuk a céi-DNS-hez (amelynek nem szükséges tisztának lennie)< A PCR végrehajtása során hőmérsékleti ciklusok sorozatában (rendszerint 30 ciklus) a célDNS-t ismétlődő módon denaturáljuk (kb, 90 °C-on), a láncinditö oiigonukleotidokhoz hibrídizáltatjuk (rendszerint 5Ö-60 °C-on) és a iáncíndítőkből „leány szálat hosszabbítunk (72 ’C-on). Mivel a „leány szálak önmaguk is templátként szolgálnak a következő ciklusokban, a mindkét láncinditóval komplementer DNS-fragmensek exponenciálisan (és nem lineárisan) amplifíkálódnak,
A találmány értelmében feltárunk egy eljárást mutáns rekomhináns urikáz előállítására, melynek során egy gazdasejtet vektorral transzfektálunk, miáltal a gazdasejt úrikért expresszál, majd a gazdasejtből izoláljuk a mutáns rekomhináns úrikért, izoláljuk a tisztított mutáns rekomhináns urikázt (például, kromatográfiás technikák alka Ima zásával.) # és tisztítjuk a mutáns rekombináns urikázt. Például# az urikáz a WO 00/03196 számú nemzetközi közzétételi iratban (melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni) feltárt eljárások alkalmazásával állítható elé.
Az urikáz szakember' számára jól ismert eljárások bármelyikével izolálható és tisztítható. A találmány szerinti expresszáltatott polipeptideket általában lényegében tiszta alakban izoláljuk, A polipeptideket előnyösen legalább 00 % m/m arányú# még előnyösebben legalább 95 % m/m arányú# legelőnyösebben legalább 99 % m/m arányú tisztaságban izoláljuk. A tisztítást általában# például# standard ammőniumszulfátos £rakcionálás# 8DS-P&GE elektroforézis és affinitás! kromatográfia alkalmazásával hajtjuk végre. Az urikázt előnyösen kationos felületaktív anyag - például# cetlipiridínium-kiorid (CFC) - alkalmazásával# a 2005. 04. 1.1-én benyújtott 60/670520 számú egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben (## Purif ication Ot Proteiné With Cationic Surfactant*#* a meghatalmazott ikfcatösráma: 103064 »146644? mely forrást teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni) feltárt eljárással izoláljuk.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a gazdasejtet olyan kezelésnek vetjük alá# hogy előidézzük a mutáns rekombináns urikáz termelődését. Szakember számára ismeretes# hogy a sejtek vektorral történő transzfektálása rendszerint kalciumionokkal preoipítálfc DhS alkalmazásával hajtható végre# bár egyéb eljárások (pl, elektroporáoiő) is alkalmazható.
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében a vektor ozmózi«nyomásra érzékeny promöter szabályozása alatt áll, A promóter olyan DNS-régió, amelyhez az RMS-polimeráz
- a DÓS RdS-sé történő transzkripciójának beindítása előtt
- hozzákötődík. Az ozmőzisnyomásra érzékeny promoter a transzkripciót a sejt által érzékeit megnövekedett ozmózisnyomás eredményeként indítja be.
A találmány egyik megvalósítási módja értelmében promóterként módosított osmB-promőtert alkalmazunk.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a találmány szerinti urikáz polimerrel konjugált urikáz.
A találmány egy további megvalósítási módja értelmében urikázt tartalmazó gyógyászati készítményt tárunk fel. Az egyik megvalósítási mód szerint a készítmény uríkároldat. Egy előnyős megvalósítási mód szerint az oldat steril és injektálásra alkalmas. Az egyik megvalósítási módban a találmány szerinti készítmény foszfátpuffereit sóoldatban oldott uríkázt tartalmaz, Egy további megvalósítási mód szerint a készítmény fiolába van kiszerelve, amely, adott esetben, injekciós füvei átszűrható gumidugóval van lezárva. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a készítmény az uríkázoldatot 2-16 mg urikáz/ml oldat, 4-12 mg urikáz/ml oldat vagy 6-18 mg urikáz/ml oldat koncentrációban tartalmazza. Az egyik előnyős megvalósítási mód szerint a készítmény ar urikázt 8 mg/ml koncentrációban tartalmazza. Az urikáz tömegét előnyösen a protein tömegére vonatkoztatva mérjük.
A találmány szerinti készítmények hatékony adagolási sémáit szakember határozhatja meg. Egy adott séma hatékonyságának értékelésére alkalmas indikátorok szakember számára jól ismertek. Az ilyen indikátorok példái közé tartozik a vérplazma húgysav-színtjének (PDA) normalizálása és a PÜA
6,8 mg/dl vagy kisebb értékre történő csökkentése vagy fenntartása. Az egyik előnyös megvalésitási mód szerint a találmány szerinti készítménnyel kezelni kívánt páciens POA-szintje a kezelés teljes időtartamának legalább 70 %ában, legalább 89 %~ában vagy legalább 90 %~ában δ mg/mi vagy kevesebb. Például, 24 hetes kezelési időtartam eseten a páciens POA-szintje a 24 hetes kezelési periódus legalább 90 %-ában 6 mg/dl vagy kevesebb, azaz legalább 134,4 napon hét x 7 nap/hét x 0,8) nem haladja meg a 6 mg/dl értéket,
A találmány bizonyos megvalésitási módjai szerint 2-4 hetente egyszer 0,5-24 mg urikáz oldatát adagoljuk. Az urikáz szakember számára jól ismert módok bármelyikével (például# intravénásán, intramuszkuiarísan vagy szubkután) adagolható. Intravénás adagolás esetén előnyösen 0,5-12 mg urikázt, mig szubkután adagolással előnyösen 4-24 mg urikázt adunk be, A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint az urikázt intravénás infúzióval 30-240 percen keresztül adagoljuk, Az egyik megvalósítási möd szerint két hetenként egyszer 8 mg urikázt adunk be, A találmány bizonyos megvalósítási utódjaiban az infúziót 109-5.00 m.l sóoldat alkalmazásával adagoljuk. Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint 2 vagy 4 hetenként egyszer 120 perces időtartamban 8 mg urikáz oldatát adagoljuk, s az urikázt előnyősen 250 ml infúzióhoz való sóoldatban feloldva alkalmazzuk. A találmány bizonyos megvalósítási módjai szerint az urikáz adagolását 3 hónapos, 6 hónapos, 8 hónapos vagy 12 hónapos időtartamban végezzük. Más megvalósítási módok szerint a kezelési periódus 12 hét, 24 hét, 36 hét vagy 48 hét. Egy előnyös megvalósítási mód értelmében a kezelést hosszú ideig, pl. két évig vagy még hosszabb időtartamban {akár a páciens élete végéig) folytatjuk. Ezen túlmenően, alkalmazható több kezelési periódus is, melyeket kezelés nélküli időszakok válthatnak; például, hat hónapos kezelés után három hónapos kezelési szünet, majd ismét hat hónapos kezelés, stb.
A találmány bizonyos megvalósítási módjai értelmében az urikáz adagolása következtében kialakuló infúziós reakciók elkerülése vagy csökkentése érdekében, megelőzésszerűen gyulladáscsökkentő vegyüietek alkalmazhatók. Az egyik megvalósítási mód szerint legalább egy kortikoszteroidot# ) legalább egy antihisztamint és legalább egy KSAID-t vagy | ezek kombinációit adagoljuk, Az ilyen célra előnyös [ kortikoszteroidok közé tartozik a betamethason, budesonid, kortizon, dexamethason, hidrokorfcizon, metíiprednísolon, prednisoion, prednison és t.riamcinolon. Az előnyös NSAlD-k közé tartozik az ibuprofen, indomethacin, naproxen, aszpi( rin, aoetomiphen, celeooxib és valdeooxib. Az előnyős í
| antihisztaminok példái a kővetkezők; azatadin, brom| pheníramin, cetirizin, chlorpheníramin, olemastin, oypro| heptadin, desioratadin, dexclorpheniramin, dimenhvdrinat.
| díphenhydramin, doxyiamin, fexofenadin, hydroxyzin, lóratadin és pnenlndamin.
A találmány egyik megvalósítási médja szerint antihisztaminként fexofenadint# NSAID-ként acetamlnophent# kort!keszkenőidként pedig hidrokortizont és/vagy prednisont alkalmazunk. Az nrikázoldat infúziós adagolása ©lőtt előnyösen mindhárom említett vegyület kombinációját adagoljuk (nem szükségszerűen egyidejűleg), A találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint az ESAID-t és az antihisztamint az urikáz infúzió adagolása előtt 1-4 órával# orálisan adjuk be, A ferofenadin alkalmazható dózisa kb. 30-180 mg# kb, 40-150 mg# kb, 50-120 mg# kb, 80-90 mg# kb. 60 mg# előnyösen 60 mg, Az acetaminopnen alkalmas dózisa kb, 500-1500 mg# kb. ?00-120ömg# kb, 800-1100 mg# kb, 1000 mg# előnyösen 1000 mg. .A hidrokortizon alkalmas dózisa kb. 100-500 mg# kb. 150-300 mg# kb. 200 mg# előnyösen 200 mg. Az egyik megvalósítási mód érteimében antihisztaminként nem diphenhydamint alkalmazunk. Egy másik megvalósítási mód szerint ESAÍD-ként nem ecetaminoptent alkalmazunk. Az egyik előnyös megválásitásí mód érteimében ez urikáz infúzió előtti éjszakán orálisan 60 mg íexofenadint adagolunk# majd a kővetkező reggelen ugyancsak orálisan 60 mg fexofenadint és lOOö mg aceraminophent adunk be# végűi# közvetlenül az nrikázoldat infúziója előtt# 200 mg hidrokortizont adagolunk, Az egyik megvalósítási mód szerint a prednisont az urikáz adagolása előtti napon# előnyösen estén adjuk be. A prednizon alkalmas dózisa 5-5Ö mg# előnyösen 20 mg. Bizonyos megvalósítási módokban az infúziós reakciók megelőzése vagy csökkentese érdekében végzett profilaktikus kezelésekét ax uriká2zal (ideértve a PEGilált urikázt és a nem PEGilált urikázt egyaránt) kezelés alatt (vagy a kezelés megkezdése előtt) álló páciensekkel végezzük. A találmány más megvalósítási módjai szerint ezeket a profilaktikus kezeléseket «rakástól eltérő terápiás hatású peptidekkel (melyek PEGiiáltsk és nem PEGiláltak egyaránt lehetnek) kezelés alatt (vagy a kezelés megkezdése előtt) álló páciensekkel végezzük.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint a gyógyászati készítmény polimerrel végzett konjugálással módosított urikázt tartalmaz, amely megtartja urikolítikus aktivitását. Az egyik előnyös megvalósítási mód értelmében a polimer-urikáz konjugátumokat a WO 81/50078 számú nemzetközi közzétételi iratban és a 08/501730 számé egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben (melyeket teljes terjedelmükben a kitanítás részének keli tekinteni) feltárt módon állítjuk elő.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint a konjugálásra alkalmazott polimert a következők közül választjuk ki: poli(etílén-giikol), dextrán, poli(propiléngiikol) , hidroxi-propii-metii-cellulóz, karboxi-metilcellulóz, poli(vinil-pirrolidon) és poli(vinil-alkohol).
A találmány egy további megvalósítási módja szerint a készítmény minden egyes urikáz-alegységre 2-12, előnyösen
3-10 polimermolekulát tartalmaz.
Egy további megvalósítási mód érteimében minden egyes polímermolekuia molekulatömege kb, 1 kD-tói kb. 100 kD-ig terjed.
A találmány egy következő megvalósítási módja értelmében minden egyen polímermolekula molekulatömege kb, X kötői kfo. Sö kD-ig terjed, A taiálmány agy előnyös megvalósítási módja szerint minden egyes polimermoiekuia molekulatömege kb, 5-20 kb, kb, 2-15 kb, kb, 10-12 kb, előnyösen kfo, lö kb. Egy további előnyös megvalósítási mód szerint az egyes poiimermolekuiák molekula tömege kb. 5 kb-tői kb. 20 kD-ig terjed, A találmány agy különösen előnyös megvalósítási módja értelmében minden egyes poiímermolekula molekulatömege 10 kb, A különböző molekulatömegé molekulák elegye i szintén alkalmazhatok, Az egyik megvalósítási mód szerint a készítmény alkalmas hosszá időn át tartó adagolásra,
A találmány egy kővetkező megvalósítási módja érteimében az urikáz polimerrel alkotott konjugátuma uretánkőtést, másodlagos aminkötést vagy amidkötest tartalmaz,
A taiálmány értelmében leltárunk továbbá agy sejtet, amely rekombináns urikáz aminosav-szekvenciáját tartalmazó urikáz termelésére képes, mely urikáz 1-20 amlnosavvai van csonkítva, mutagenizált aminosavskat tartalmaz, valamint urikolitikus aktivitással foir.
Feltárunk továbbá egy eazközt húgysav metabolizálására urikáz alkalmazásával,
Ezen túlmenően, urikázkészítmény alkalmazását tárjuk fel biológiai folyadék húgysav-szintjének csökkentésére.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint az úrikézre®zitményt vér hűgysav-szintjének csökkentésére alkalmazzuk,
A fentieken túlmenően, urikéz-polipeptidekét kódoló új
-5 Ο nukieinsav-molekulákat tárunk fel. A létrehozásukat eredményező manipulációk szakember számára jól ismertek. Például, az urikáz nukleinsav-szakvenciák a szakirodalomból ismert számos módszer bármelyikével módosíthatók [Maniatis, T. : „Moleeular Cloning, A Laboratory Manual, 2« kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)], A szekvencia a megfelelő helyeken restrikciós endcnukleáz(ok) alkalmazásával hasítható, majd ···· kívánt esetben ~ további enzimatíkus módosításnak vetjük alá, izoláljuk és in vitro llgáljuk. Urikázt kódoló gén létrehozása során figyelmet keli fordítani arra, hogy a módosított gén a megfelelő transzlációs leolvasási fázisban maradjon (transzlációs stop-kodon általi megszakítás nélkül). Ezenfelül, az urikázt kódoló nukleínsav-szekvencia in vitro vagy in vivő mutagenizálhatő, például, transzlációs, iniciáclós és/vagy terminációs szekvenciák létrehozása és/vagy lebontása céljából, a kódolőrégiók változatainak létrehozása és/vagy új restrikciós endonukleáz-felismerési helyek kialakítása vagy a már meglévők megsemmisítése, illetve további in vitro módosítás elősegítése céljából. A szakirodalomból ismert mutagenizálási technikák bármelyike alkalmazható, ideértve, többek között, az in vitro helyspeeífikus mutagenezíst (Hutchínson, C. és mtsai.: J. Bioi. Chem. 253, 6551 (1978)1, a TAB'^ linkerek (Pharmacia) alkalmazását, stb.
Az urikázproteint kódoló nukleotidazekvenoi.a megfelelő expresszíós vektorba inszex'tálhatő, azaz olyan vektorba, amely tartalmazza. az inszertált, proteint kódoló szekvencia transzkripciójához és transzlációjához szükséges elemeket.
~ 36 ~
A proteint kódoló szekvencia expresszáitatására különféle ga.zda-vekt.or rendszerek alkalmazható. Ezek példái, többek között, a következők: vírussal {pl. vaccinia, adenovírus, stb.) fertőzött emiőseredetű sej trendszerek; vírussal (pl. baculovírussal) fertőzött rovareredetű sejtrendszerek; élesztővektort tartalmazó mikroorganizmusok, pl. élesztők; vagy bakteríofág-DNS-sel, plazmid-DNS-sel vagy kozmid-DNSsel transzformált baktériumok, E vektorok expressziós elemei erősségükben és specifírásukban különbözőek lehetnek. Az alkalmazott gazda-vektor rendszertől függően, az ilyen célra megfelelő számos transzkripciós és transzlációs elem bármelyike alkalmazható.
A megfelelő tzranszkripciős/fcranszláciős szabályozó szignálokból és a protein kódciószekvenciájából álló kimérikus gént tartalmazó expressziós vektorok létrehozására a DNS-fragmensek vektorba történő inszertálására alkalmas, ismert eljárások bármelyike alkalmazható. Az ilyen, eljárások közé tartoznak az in vitro rekombináns DNStechnikák, szintézises technikák, valamint ín vivő rekombinációs módszerek (genetikai rekombináció). ürikázproteint kódoló nukleínsav-szekvencia expresszióját egy másik nukleinsav-szekvencia szabályozhatja, miáltal az urikázproteín a rekombináns DNS-molekulával transzformáit gazdaszervezetben termelődik. Például, az urikáz expresszióját a szakirodalomból ismert bármely promőter/erősitőszekvencia szabályozhatja. Az urikáz expresszíőjának szabályozására alkalmas promóterek közé tartozik, többek között, az SV40 korai promóterrégiója [Bernoíst és Chambon: Natúré 290, 304-310 (1831)1 Rous sarcomé vírus 3f-oldali hosszú terminális ismétlődő szekvenciája (Yamamoto és mtsai,: Coli .22# 7 57797 (1980)]# a herpes vírus timidin kinéz promótere [Wagner és mtsai.í Proc. Matl. Acad. Sci, USA 78# 44-1445 (1981)]# a metailotionin-gén szabáiyozószekvenciái [Brinster és mtsai.: Natúré 298# 38-42 (1982)j; prokariőta expressziós vektorok# mint pl. a β-laktamáz promóter (Vilia-Kamaroff és mtsai.: Proc. háti. Acad. Sci. USA 75, 3727-373 (1878)]# a tae-promóter [DeBOer és mtsai.; Proc, Natl. Acad. Sci. USA 80# 21-25 (1983)]# valamint az osmB-promóter. A találmány előnyös megvalósítási módjaiban a nukleinsav - heterolőg promőterhez működőképesen kapcsolva - urikázt kódoló nukleínsav-szekvenciát tartalmaz.
Kódoló nukleinsavat tartalmazó rekombináns DNSmolekula előállítását és izolálását követően a sokszorosítására számos jöl ismert eljárás alkalmazható. Megfelelő gazdarendszer és növesztés! feltételek, kialakítását követően a rekombináns expressziós vektorok sokszorosíthatók és nagy mennyiségben állíthatók eiö. Ahogy fentebb említettük# az alkalmas expressziós vektorok közé tartoznak, többek között# a következő vektorok ás származékaik: embereket vagy állatokat fertőző vírusok# mint pl. a vaccínía vírus és adenovírus? rovarvírusok, pl. baculovírus; élesztővektorok# bakteriofág vektorok (pl, lambda)#· ée plazmid- és kozmidvektorok.
Rzen túlmenően# választhatunk olyan gszdassjt-törzset, amelyben az inszertált szekvenciák expresaziőja módosításra kerül vagy a géntermék módosítása éa érési folyamata speciális, kívánt mértékben következik be. Bizonyos promóterek által szabályozott expresszió bizonyos indukálőszerek jelenlétében fokozható# igy a genetikailag manipulált urikázprotein expressziója szabályozható. Ezenfelül, a proteinek transzlációs és poszt-transzlációs érése és módosítása (pl. glíkoziláció# hasítás) a különböző gazdasejtekben sajátos és specifikus mechanizmusok révén következik be. Az expresszált idegen protein kívánt módosításainak és érésének biztosítása céljából megfelelő sejtvonalak vagy gazdasejtrendszerek választhatók ki. A különféle vektor /gazdasejt expressziós rendszerek az érési reakciókat (pl, a proteolitikus hasítást) különböző mértékben segíthetik elő.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az urikáz E. eoli-ban történő expresszáltatását előnyösen rssraB-promtert tartalmazó vektorok alkalmazásával hajtjuk végre.
Urikáz expresszáItatásáraalkalmas gén .és „expressziós
Ρ1ezmid^létrehozása
Rekombináns sertéseredetű urikázt (urát oxídázt), a sertés-KS-ÁN-t. (amely egy ^-terminálisán csonkított sertéseredetű urikázprotein, melynek 291. és 301, aminosava lizlnnel, illetve szerinnei van helyettesítve) W310 F- E. coli K-12 törzsben expresszáltattuk. Plazmidok sorozatát hoztuk létre# melynek végeredménye a pOöR-P-ÓN-ks-l lett# amely E. coli sejtek transzformálását követően az urikáz hatékony expressziójának szabályozására volt képes. Uridaz-cDdSizolálása és sznfcklónozása.sertés- és páviánmájból
Grikáz-cDNS-ekat a megfelelő RNS-s izolálásával és szubklénozásávai sertés- és páviánmáj bél állítottunk elő. A sertés™ és páviánmájból össz ceiluláris RHS-t vontunk ki íld, Eriich# H,A.: „POR Technology; Príneiples and Application tor DBA Ampli £leállón (1988); Sambrook# u. éa mtsai.: „Molecular Cloning; A Laboratory Manna!# 2, kiadás (1989)? Ausubel# F. M. és mtsai,; „Current protocols in molecular Biology (1998)]# majd ##First-Strand oDEA Synthesis reagenskészlet (Pharmacia Biotech) alkalmazásával reverz transzkripciót végeztünk, A PCR-smplifíkáoiőt Tag DNS-polimeráz (Gibco BRL# Life Technologies) alkalmazásával hajtottuk végre,
A sertés- és páviáneredetű urát oxidáz (urikáz) PCRampiifikációjára alkalmazott szintetikus láncinditóoligonukleotidokat az 1. táblázatban mutatjuk he.
1. táblázat ürikáz-eDNS PCR-ampiifikációjára a1kalmazott 1ánc1ndltóoligonukleotidők
Sertésmáj -- n r i ká z;
szensz S? gcgcgaattccATGGCTGATTACCGTAATGACTACA 3 f (1. azonosítószámú szekvencia) antlszensz 5* gegetctagazghttcestggTCACAGCCTTGAAGTCAGC 3’ (2. azonositőszámá szekvencia) ff á viá n (DÜH j má. j - u r i ká z :
szedsz 5’ gcgcgaattccATGGCCCACTACCATAACAACTAT 3f (3. azonosítószámú szekvencia) antiszánsz 5? gegeccatggtctagaTCACAGTCTTGAAGACAACTTCCT 3’ (4. azonosítőszámű szekvencia)
A restrikciós enzimes felismerési hely szekvenciák (melyek a láncindítók végére lettek beépítve (az 1, táblázatban kisbetűkkel jelölve) a követkerek voltak; szánsz ScoRI és Deci (sertés és pávián) ás antiezensz Keol, HindIX'I és Xbal (sertés), illetve Xbal és .NcoX (pávián). A pávián szénaz Xáncindítófoan a páviánurikázban megtalálható harmadik. GAC kodért (aszparaginsav) a humán urát oxídáz pszeudogén kódolószekvenciájának e pozíciójában, megtalálható CAC kodonnal (hiszt.id.in) helyettesítettük. Az s léseindító-olígonukleotidok alkalmazásával létrehozott rekombináns pávíánuríkáz konstrukciót D3H-páviánuri'káznak neveztük el.
A sertésuríkáz PCR-térmékét ScoRI-gyel és HindiXX-mai emésztettük és pUCIS-vektorba klónozva püC13~sertésurikáz plazmidot hoztunk létre, A D3H-páviánurikáz PCR-terméket TA Cloníng** (Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával közvetlenül pCR**XI-vekto.rba klónoztuk, miáltal a pCR***XIDSH-páviánurikáz plazm.idot kaptuk.
A ligáit cDKS-ekat &. coli XLl-Blue törzs (Stratagene, La Jolla, CA) transzformálására alkalmaztuk. Klónozott urikáz-cDNS-t tartalmazé plazmid-DHS-t állítottunk elő, és a közzétett urikáz-DNS kódolószekvenciákat - a páviánurikázban lévő D3H szubsztitúció (id. 1. táblázat) kivételével - tartalmazó klónc'kat kiszelektáltuk és izoláltuk, A kiválasztott pCR^lI-DSH-páviánuríkáz klónban a pCR^lX-Szekvenciák közvetlenül az urikáz stop-kodonja mellett helyezkedtek el, ami a PCR-xel beépített szekvenciák déléciójából adódik. Következésképpen, a 3*-oldali nem transzlálódó régióból származó Xbal és NcoX restrikciós felismerési helyek, eltávolításra kerültek, ami a PCR-termék
5'-végén lévő Noel-hely ős a pCR^XI-vektorból származó
SamH.I~he.iy felhasználásával irányított klónozást, tesz lehetővé .
Urikáz-cDNS szubklónozása pET expresszíős vektorokba.
Páviáneredetű urikáz szubklónozása
A teljes hosszúságú urikáz-kődolószekveneiát magában foglaló D3H-pávián-cDNS~t pET~3d expressziős vektorba (Hovagen, Madison, 141) juttattuk be. A pCR^ll-DoHpáviánurikáz plazmidot Ncol- és BamHI-endonukleázzal emésztettük, majd izoláltuk a 960 bp-os fragmenst. A pET-3d expressziós plazmidot szintén NcoX-gyei és BamHI-gyel emésztettük, és 4600 bp-os fragmenst izoláltunk. A két fragmenst ligáivá a pST-3d-D3H-pávián plazmidot hoztuk létSe rt é s-pávi árt kiméra urikáz szubklőnozás a
A rekombináns gén nagyobb expressziójának, stabilitásának és aktivitásának biztosítása céljából sertés-pávián kiméra (PBC)-urikázt hoztunk létre. A PBC létrehozása céljából s p£T-3d~D3H-pávián klón 4936 bp-os Ncol/Apaliragmensét izoláltuk, és az izolált fragmenst püC18sertésuríkáz plazmidból izolált 624 bp-os Ncol./Apaifragmenssel ligáitok, miáltal a pEi-3d-PBC plazmidot kaptok, A PBC-urikáz-cDNS a sertésurikáz 1-225. kodonjaiból, s a páviánurikáz - előzőkhöz azonos leolvasási fázisban kapcsolt - 226-304. kodonjaiból áll,
Sertés-KS-urikáz szubklónozása
A sertés-KS-urikázfc egy lizin hozzáadása érdekében hoztuk létre, mely llzin további PEGilálási helyként szolgálhat. A „KS a sertésurikáz 231, pozíciójában arginin Iizinnel történd helyettesítését (R291K· jelenti. Ezenfelül, a 301. pozícióban lévő treonint szerinnel helyettesítettük (T301S), A sertés-KS-urikáz piazmid létrehozása céljából a pET-3d-B3H-páv.ián piazmid 4696 bp-os Nool/Ndelfragmenset izoláltuk, majd a püCIS-sertésurikázból izolált 864 bp-os hcol/hdel-fragmenshez lígáltuk, miáltal a pET-3dsertés-KS plazmidot kaptuk. Az igy létrehozott sertés-KSurikáz szekvencia a sertésurikáz 1-288. kodonjaiból, valamint a páviánurikáz - előzőekhez azonos leolvasási fázisban kapcsolt - 289-304, kodonjaiból áll, brlkázszekvenciaszubklónozása osmB-promőter szabályozása alá
Az uríkázgént osmB-promötert tartalmazó expressziős vektorba szubklonoztak, melynek során az 5 73S 776 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban feltárt eljárást követtük (mely forrást teljes terjedelmében a kitanitás részének kell tekinteni). Ez a vektor a proteinaxpressziö nagy ozmézisnyoztés vagy a tenyészet öregedése hatására bekövetkező - indukcióját teszí lehetővé. A pMEOA-18 expressziős piazmld osmB-promőtsrt, riboszóma-kötöneiy szekvenciát (rba) és transzkripciós fcsrmináciős szekvenciát (tér) tartaimez# továbbá ampioiiiin-rezisztsneiát (AmpE) biztosit és sxpresszáija a rekombináns humán acetükolin észterázt (AChb).
dűhEÉr^^^Arlbáz. sznbklónozása
A pMEOA-18-pXazmidot Aool- és Bemül-endonnkleázzal emésztettük és a nagyobb fragmenst izoláltuk, A pEl-3d-D3bpávián konstrukciót szintén Hcol- és BamHX-endonukisázzsX emésztettük, és a 960 kfe-os fragmenst (amely magában foglalta a DBK-páviénurikaz-gént) Izoláltuk, Ezt a két fragmenst egymáshoz ligáivá a ρΑΧΧΧΠΒ-plazmidot kaptuk,
A pfeEKT133 expresszién plazmád osmB-prométert, rífeoszóma-kötőhely szekvenciát (fb coli deo-operon)# transzkripciós terminéoiős szekvenciát (m, coli TrypA)# rekombináns Xa-fsktor inhibitor polipeptidet (EXal) tartalmaz és tetrecikiin-rezisztenoiát (TetE) biztosít. Az antibiotikum-rezisztencia gének kicserélése érdekében a péviánnrikáz-gént e plazmádba inszertáitak, A püFOfelS™ plazmidot hódi-gyei emésztettük, feltöltőttük, majd Xhdlgyel emésztettük és 1030 bp-os fragmenst izoláltunk, A pWFX1133-plazmidct bdeX-endonukleázzal emésztettük# féltői<$ főttük, majd Xhol-endonukieázzal emésztettük és a nagyobb fragmenst izoláltuk. A két izolált fragmenst egymáshoz ligáivá pü.RBAXé páviánurikáz expressziós vektort hoztunk létre.
A püRBAlá-plazmidot Apai- és &lwNI~endon.ukleázzaI emésztettük és 2320 bp-os fragmenst izoláltunk. A pMFXT133plazmidot Ndel-endonukieázzai emésztettük, feltöitöttük# majd AlwNX-endonukleázzal emésztettük, és 620 bp-os fragmenst izoláltunk. A. pET-3d-PBC-konstrukoíót Xbalendonukieázzal emésztettük, feltőitőttük, majd Apalendonukieázzai emésztettük, és a 7X0 kb-os fragmenst izoláltuk, Ezt a három izolált fragmenst egymáshoz ligáivá a pOR-PB-piazmidot kaptuk, amely a PBC-uríkázt osmB-promóter és rbs, valamint - a pET-3d-vektorból származó - T7-rbs szabályozása alatt express2álja.
A T7-rbs-f egy további lépésben kihasítottuk, A pORPB-plazmidot Ncol-endonukleázzai emésztettük, feltőltöttük, majd AIwNX-andonukleázzal emésztettük, és a 3000 kb-os fragmenst izoláltuk. A pHEXT1.33-pIazmidot NdeX-endonukleázzal emésztettük, feltöltüttük, majd AlwNX-endonukleázzai emésztettük ée 020 bp-os fragmenst izoláltunk, melyet az előbbi fragmenesel ligáivá a pOOR-PB-plazmídot kaptuk, amely a PBC-t osmB-promóter. szabályozása alatt expresszi!ja.
d ~ je 1 oá 1 litAga
Az urikáz-cORS-be több olyan változtatást is beiktattunk, melyek a rekombináns enzim stabilitásában jelentős mértékű növekedést eredményeztek. A pOUR-PBC-ANC-plazmidot hoztuk létre# amelyben ez ^-terminális hat aminosavas érési peptid és a C-termínáliscn lévő tripeptld (amelyek in vivő peroxiszomáiis céibajuttató szignálként funkcionálnak) egyaránt eltávolításra került. Ezt a pDüR-PB-plazmidban lévé PBC-szekvencia# valamint a 2, táblázatban bemutatott specifikus láncindltó-oligonukieotidok alkalmazásával# PCRampüfíkádéval hajtottuk végre,
9,r,,,fűb!ázat
9...r^d29^viu.réAié, FCR-ampIIlikélásépg elkplmgzott láncinditó-oligonuklegtldgk
PBC-AMC-urikáz;
üzensz gcgmtMOACTTACAAAAACáATGATGACGTAGAG 3f (5. azonosítószámú szekvencia)
Antíszensz s CCgtetw&l^AAÖACAACTiCCTCTTGACTGTACCAGTAATTTTTCCGTATGG3’ (6. azonosítószámú szekvencia)
A 2.· táblázatban a láncindítő-olígonnkleotidok végére beépített restrikciós enzimes felismerési helyeket félkövér betűtípussal szedve# mig a nem kódoló régiókat kisbetűkkel szedve jelöltök. Az Üde! szensz# az Xbal antiszensz. Az antiszensz lánoindifcőt egy pontmutáoió (aláhúzással jelölve) beiktatásával (amely az aminosav-szekvenciát nem befolyásolja) egy belső EdeX-felismerési hely megszűntetésére is felhasználtuk# ami elősegítette az RdeX-endonukleáz alkalmazásával történő szubklónozást.
A pDBR-PB-plazmíd PCB-amplifikácíőjával létrehozott
900 bp-os fragmenst Kdei- és Xbal-endonukleázzal hasítottuk és izoláltuk. A kapott fragmenst agy „deo expressziós plazmidba (pDBAST-RAT-b) inszertáltuk, amely deo-PlB2~ promótert és £. coli-böl származó rbs-t tartalmaz, és konstitutivan expresszálja a humán rekombináns inzulinprekurzort. A piazmidot Ndel- és Xbal-endonukleázzal emésztettük, a «035 kb~os fragmenst izoláltuk és a PSC-urikáz PCR-termékhez ligáitok. Az igy létrehozott pDUR-PB-ÁNCkonstrukciót .S. coli K-12S|733 (F-cytR strA) törzs transzformálására alkalmaztuk, amely az aktív, csonkított urikázt nagy mennyiségben expresszálía.
A kétszeresen csonkított ?BC-ANC-S2ekvencíát szintén osmB-promóter szabályozása alatt expresszáitattuk. A pDURPB-ÁNC-plazmidot. AlwNI- és Ndel-endonukleázzal emésztettük, és 3459 bp-os fragmenst izoláltuk. A fentebb leírt pMFXT'133-plazmidot szintén Ndel-gyei és AiwNI-gyei emésztettük, és 660 bp-os fragmenst izoláltunk. A két fragmenst egymáshoz ligáivá a pOüR-PR-ANC-piazmidot kaptuk, amelyet A, coli K-12 W3110F törzsbe juttattunk be, és az aktív, csonkított urikáz nagy mennyiségben történő expresszióját eredményezte.
p OüR-P-AN--ks-l uri ká z-express z i6s κ ρ1azmid előállítása
Szt a piazmidot a rekombináns enzim aktivitásának és stabilitásának javítása céljából hoztuk létre. A sertés-KSΔΝ urikáz csak az N-terminálisán lett csonkítva (AN, ahonnan hat amínosavas N-termínális érési pepiid került eltávolításra) és S46T, R291K és T301S mutációkat hordoz. A 46. pozícióban a szerin helyett treonin található., ami a PCRampiifi káció és a klónozás során bekövetkezett konzervatív mutáció eredménye, A 291, pozícióban az arginlnt lizin helyettesíti# míg a 301, pozícióban a treonin helyett szex'ín található (mindkettő a pávíáneredetü urikázszekvenciéból származik). Ahogy fentebb említettük# az R291K és T3Ö1S szubsztitúciókat együttesen ##XSw-sei jelöljük, A plusz Iizin újabb potenciális PBGíXálásí helyet biztosít,
A pOüA-P-AN-ks-l-plazmid (X, ábra) létrehozása céljából a pOüR-PP-Ő^C-pXazmidot Apai- és Xhal-endonukleázzal emésztettük és 3873 bp-os fragmenst izoláltunk, A pET-3dPKS-plazmidot (.konstrukcióját Id, a 4, ábrán) Apai- és SpeX-endonukleázzal emésztettük és 270 bp-os fragmenst izoláltunk. Az Spel-hasitás következtében S'CTAG túlnyúlás maradt vissza# amelyet hatékonyan tudtunk ligáin! az XbaXhasítással kapott DWS-fragmensekhez, A két fragmenst egymáshoz ligáivá a pOUP-P-AW-ks-X-pXazmídot kaptuk. Ligálás után az Spel- és xbal-felismerésí helyek elvesztek (pozícióikat az 1. ábrán zárójelben tüntettük fel). A pOÜR-P-ANks-l-konstrukcíót E. coli K-.12 W3X10F törzsbe (prototróf# ATGC 27325) juttattuk be. A létrejött sertés-KG-éN-urikáz# amely osmü-promóter szabályozása alatt expresszálódott# kiváló aktivitású és stabilitású rekombináns enzim nagy menynyiségét eredményezte.
Az 1, ábrán a pOGR-P-áW-ks-l-plazmld szerkezetét mutatjuk be. A restrikciós helyek mellett feltüntetett számok a HaeXI-heiyhez (amely az 1-essel jelölt pozíció) viszonyított nukieotídpozíciókat jelölik. A klónozás során kiesett restrikciós helyeket zárójelben tüntetjük fel, A sertés-K5ÁS-nrikázt kódoló pöOR-P-áX-ks-l-plazmid 4143 bázispár (bp) hosszúságú# és a kővetkező elemekből áll;
1» 113 bp hosszúságú DNS-fragmens.# amely az 1. nukleotídtól az XdeX-felismerési helyig (113. pozíció) húzódik# magában, foglalva az osmB-promőtert és a riboszőmakötőhelyet (rbs).
2. 332 bp hosszúságú DNS-fragmens# amely az bde'ifelismerési helytől (113. pozíció) az Spel/Xbal kapcsolódási helyig (1045. pozíció) húzódik# magában foglalva a sertés-XS-AX 900 bázispáros kódolórégióját (X-terminálísán csonkított# 291. és 301. pozíciójában iizínnel# illetve szerinnei helyettesített# sertéseredetű urlkázproteint kódoló nukleinsav-szekvencia) és a pCR^IX-ből (sz 3peX/Xba.I restrikciós helytől 5'-irányban lévő TA klónozóhelyból) származó 32 bp-os szegélyező szekvenciát.
3. 25 bp hosszúságú többszörös klónozőhely-szekvencia (KCS), amely a Spel/XbaX kapcsolódási helytől <1045. pozíció) a HindXXX-felismerésí helyig (1030. pozíció) húzódik.
4. 40 bp-os szintetikus oligonukleotid# amely TrpA transzkripciós terminációs szekvenciát (tér) tartalmaz, és az 1030. pozíciótól (KindlXX-felismerési hely) az 1110. pozícióig (AatXI-felismerési hely) húzódik.
5. 1513 bp hosszúságú DMS-fragmens, amely a pBR322plazmíd AatXI-felísmerési helyétől (Illő. pozíció) MsoX/EcaX-heiyéig (2629, pozíció) húzódik# magában foglalva a tetraoiklín-rezisztencia gént (TstM).
f. 1S14 bp hosszúságú üh'S-fragmens# amely a pBR322pla-zmíd Scal-belyétől (2é29. pozíció) MaeXX-belyéig (4.143, pozíció) terjed, magában foglalva a DNS-replikáciős kezdőhelyet.
A 2, ábrán a Sertés-KS-áN-urikáz DNS-szekvenciáját és leszármaztatott aminosav-szekvenciáját mutatjuk be, Az aminosavak számozását a sertéseredetű urikáz teljes szekvenciájára vonatkoztatva adjuk meg. A kezdő metionint követően a sertéseredetű urikázszekvenciában lévő aszparagínsav helyére treonint inszertáltunk, Ez a treonin lehetővé teszi a metionin bakteriális aminopeptídázok általi eltávolítását. Az aminosav-szskvenciában lévő hézag a deietált Ntsrmínális érési pepiidet jelzi. Az ábrán feltüntettük a szubkiőnozás különböző lépéseinek végrehajtására alkalmazott restrikciós helyeket (Apai, Nde'I, BamHJ, EcoRX és Spel) » A 3'-oldali nem transzlálődó szekvenciát (melyet kisbetűkkel szedve jelölünk) a pCR^XI-szekvenciáből származik. A transzlációs stop-kodont csillaggal jelöljük,
A 3. ábrán különböző .rekomhináns urikáz-szekvencíák amínosav-szekvenciálnak relatív egymás alá rendezését mutatjuk be. Az első sorban a sertéseredetű urikáz szekvenciája látható, amely a teljes aminosav-szekvenciát foglalja magában. A második sorban a kétszeresen csonkított sertéspávián kimére urikáz szekvenciáját mutatjuk be (PBC-ÁNC), mig a harmadik sorban a Sertés-KS-áN-urikáz szekvenciája látható, amely csak ^-terminálisán van csonkítva, és SáéT, valamint R291K és T301S mutációkat hordoz (mely utóbbi kettő ez urikáz kódolószekvencia C-termináiisának páviáneredetét tükrözi). A csillagok azokat a pozíciókat jelölik, amelyekben a Sertés-KS~Ab amínosavai. eltérést mutatnak a sertéeerodett urikáz közzétett szekvenciájától, míg a körök azokat a pozíciókat jelölik, amelyekben a Sertés-KS-AN aminosavai eltérést mutatnak a PBC-ΔΝ (a sertés-pávián kiméra) szekvenciájától. A szaggatott vonalak aminosav-deléciókat jelölnek.
Natív pávián, sertés és nyűi urikáz (amely Y97H mutációt hordoz), valamint sertés/pávián kiméra (PBC) cDNS-ét. állítottuk elő £. coií-ba történd klónozáshoz. Az uríkázvariánsckat nagy mennyiségben expresszáió kiónokat hoztunk létre, melyeket úgy szelektáltunk, hogy val amennyi W3110 F F coli legyen, és az expressziét osmB-promóter szabályozza. Plazmid-DNS-eket izoláltunk, szekvenciájukat DNS-szekvenáiással és restrikciós enzimes analízissel ellenőriztük, és a sejteket tenyésztésnek vetettük alá.
A csonkított urikázok (sertés-AN és sertés-KS-AN) létrehozása céljából - Apai és XbaX, illetve Apai * SpeX restrikciós en.de.nukl sásokkal végzett hasítást követ Óén - FBCANC és sertés-KS közötti keresztligálást hajtottunk végre. Belátható, hogy -ezek a csonkított mutánsok megtarthatják aktivitásukat, mivel a hat N-terminális aminosav, az űn. „érési peptld* (1-2) és a C-terminálís tripeptid, a „peroxiszomálís célbajuttató szignál* (3-5) egyike sem bír olyan funkcióval, amely lényegesen befolyásolná az enzimatikus aktivitást, továbbá valószínű., hogy ezek a szekvenciák immuncgének lehetnek. Azokat, a kiónokat választottuk ki, amelyek az uríkázvariánsckat nagyon nagy mennyiségben expresszálták.
Expressziós plazmld t ^űcszformálásaJgaktériámgazdasejtbe
A pOUB-P-AE-ks-1 expressziós piazmidot £. coli K-12 W3110 E' törzsbe juttattuk be, A baktériumáéjteket ~ a transzformációhoz történő előkészítéshez - Luriatápkőzegben (LB) mid-log fázisig szaporítottuk# majd centrifugálásaal betakarítottuk# hideg vízzel mostuk# és kb. 3xlO'iV sejt/ml se jt sűrűségben 10 %-os vizes glicerinben szuszpendáltuk, A sejteket aiikvotokban -70 ®C-on tároltuk, A plazmid-DHS~t etanolban precipitáituk és vízben oldottuk,
A baktériumáéjteket és a piazmld-DHS-t összekevertük# és a transzformációt Gene Pulser 11 típusú, készülék (BIOAAD) alkalmazáséval végzett nagyfeszültségű eiektroporáciős eljárássá! (Trevors és mtsai,: ,#Électrotransformat.ion of battéria by plasmid DMA# in Guide to Eieotroporation and Eieotrofusíon'* (szerk, : D.C. Chang# S, M. Cbassy# uk A, Saunders és A, S, Soeers)# 265-290, old,# Aeademic Press Inc»# San Diego (1992); Hanan.au és mtsai,: Meth, Enzymol, 201# 63-113 (1991)]» A transzformált sejteket SOCtápközegben (2% tryptone# 0#5 % élssztökivonat# 10 mM NaCl# 2#SmM KC1# 10 mM MgCij;# lö mM MgSCg# 20 mM glükóz) szusz™ pandáitok# 37 *C~on egy óra hosszat inkubáltuk# tstraciklín-rezieztenciára szelektáltuk# és kiválasztottunk egy magas szintű expressziét mutató kiönt.
Eekgttoináns urikáz elóáiiltása
A fentebb leírtak szerint transzformált baktériumokat giüköztartalmú tápközegben (pH-ját 7,2 ± 0,2 értéken tartva) , hozzávetőleg 37 °ü-on tenyésztettük. A tenyésztés utolsó 5-6 órájában a tápközeget 0,3 M végkoncentráeioban KCl-dál egészítettük ki, és a tenyésztést az urikáz felhalmozódása céljából tovább folytattuk,
A baktöriumsejtekben a rekombináns urikáz zárványtestekhez hasonló oldhatatlan pxecipltátum alakjában halmozódott fel, A sejtszuszpenziót centrifugáiássai mostuk és 10 mb SDTA-t tartalmazó 50 md Tris-puf f erben (ph ~ 8,0) szuszpendáltuk, s a szuszpenzíó végtérfogatát a sejtek száraztömegének kb. 40-szeresére egészítettük ki,
A baktériumsejteket nagy nyomáson, lízozím alkalmazásával feltártuk, és a rekombináns úrikért tartalmazó zárványtestaket centrifugáiássai izoláltuk, A lízozomos kezelést (2000-3000 egység/ml) 0,0 pH-η, 7±3 öC-on 16-20 órán át, keverés közben végeztük. Az üledéket vízzel mostuk és felhasználásig -20 °C-on tároltuk.
A feldúsított zárványtesteket - további feldolgozásuk érdekében - 50 mtí baKCÜu-puíferben (pH ~ 10,3 ± 0,1) szuszpendáltuk, A kapott szüszpenziöt a zárványtesiekben lévő urikáz szolubíiizáiésa céljából egy éjszakán át szobahőmérsékleten Ínkubáituk, majd centrifugáiássai derítettük,
Az uríkázt több kromatográfiás lépéssel további tiszti táenak vetettük alá. Az első kromatográfiás lépést QSephsrose FF oszlopon végeztük, A feltöltött oszlopot 150 mM naörium-kioridot tartalmazó hídrokarbonát-pufferrel mostuk, majd az uríkázt 250 mb nátrium-klóridőt tartalmazó hidrökarbonái-puíferrel eluáltuk, Szt követően az urikázkészítményben lévő csekély szennyeződés eltávolítására Xanthine-agaréz gyantát (Sigma.) alkalmaztunk. A Q-Sepharose FF oszlopról származó eluátumot 50 mM gllcin-pufferrei (pH - íö,3±0,l) hozzávetőleg 0,25 mg/ml proteínkoncentrációra hígítottuk és az oszlopra töltöttük. Az oszlopot löö mM NaCl-ot tartalmaző hidrokarbonát-pufferrei (pH ~ lö,3±ö,l) mostuk, majd az urikázt a mosáshoz használttal megegyező de 60 μΜ xanthinnai kiegészített - pufferrel eluáltuk. Ebben a szakaszban az urikázt az aggregáiődott alakok eltávolítása érdekében Q-Sepharose oszlopon ismételt tisztításnak vetettük alá.
Az egyes urikázkészltmények tisztasága ~ méretszelekciós kromatográfiával végzett meghatározás alapján - 95 %~ nál nagyobbnak bizonyult. Az egyes készítményekben az aggregáiődott alakokat Supordex 200 oszlop alkalmazásával 0,5 %-nái kisebb arányban detektáltuk.
A 3. táblázatban a 25 literes fermentációs táplevesből származó zárványtestekben lévő serfcés-KSÁN tisztítási lépéseit foglaljuk össze.
3, táblázat
Se r t é s - KSAb - ur 1 káé... ti Akti t á s g_
|
|
Tisztítási lépés |
Drótéin
(mg) |
Aktivitás
(E) |
Specifikus aktivitás (E/mg) |
fzrvsnytest feloldás |
12 742 |
47 225 |
3,7 |
Derített oldat |
11 045 |
44 858 |
4,1 |
Q-Sepharose 1 - fő állomány |
7 530 |
32 316 |
4,3 |
kanthine-sgsrőz fő állomány |
4 880 |
2 5 3 81 |
3,4 |
Q-Sepshrose II - fő állomány |
4 438 |
7 ’> & £· ··>
<s. <s· U' A-· |
5,2 |
30 kD DF retantát |
4 282 |
27 558 |
6,5 |
A rekombináns urikázok talajdonságal
SDS-PAGE
A nagymértékben tisztított erikazvariánsok SDS-EAGBanalízise (Id. a 4. ábrát) meglehetősen, jellegzetes mintázatot eredményezett, A mintákat karbonáton£fezben (pH - 10,3) 4 *C~on több hónapig tároltak, A teljes hosszúságé variánsok (sertésurikáz, sertés-KS és EBC) esetében két fő bomlástermék (kb, 20 kD és kb. 15 kD) falnaImozédását tapasztaltak, Ez a megfigyelés arra utal, hogy legalább egy bevágás hasítja az urikáz alegység-molekulát. Az bterminálison csonkított klánok esetében eltérő lebontási mintázatot detektáltunk, csakúgy, mint a nyél eredetű etikáznál, de ott kisebb arányban, A nyűlorikéz bterminálisa a csonkított klánokéra emlékeztet, A tisztítás és tárolás során létrejött nrikázfragmensek E-terminális szekvenciáit meghatároztuk.
Peptidszekvenálás
Az uríkázkészítmények d-- terminális szekvenálását Edman-féle lebontási eljárás alkalmazásával, tíz ciklussal végeztük. A rekombináns sertésurikáz (teljes hosszúságú klón) esetében nagyobb mennyiségben fordultak elő lebontási fragmensek, mint a sertés-KS-ΔΝ esetében. A lebontási fragmeneefcet eredményező hasítások leszármaztatott helyei a következők voltak:
1) FÖ hely a 168. pozíciónál, melynek szekvenciája:
—QSGÍFSGF12} Másodlagos hely a 142. pozíciónál, melynek szekvenciája;
—1RHÍGFWI-A fenti szekvenciák nem utalnak egyetlen ismert proteolítikus hasításra sem, Mindazonáltal, a hasítás protolízishől vagy veiamely kémiai reakcióból származhat. Az Ν-terminálison csonkított urikázok, meglepő módon, stabilabbak, mint a nem ^-terminálison csonkítottak, A PSC-AdC stabilitása hasonló az egyéb AN-molekulákého2, a nem dterminálison csonkított RföC-nez viszonyítva azonban kisebb. Hatékonyság
Az urikáz-aktivitást UV-eijárással mértük. Az enzimatikus reakciósebességet a 292 nm-tiél mért abszorbancia csökkenése alapján határoztuk meg., ami a hűgysav aliantoinná történő oxidációjából adódik. Egy aktivitási egység definíció szerint az urikáz azon mennyisége, amely egy ymol húgysav egy perc alatt, 25 °C-on, meghatározott feltételek mellett történő oxidálásához szükséges. Az urikáz hatékonyságát aktivitási egység/mg protein (E/mg) értékként fejezzük ki.
mM hűgysav extinkciós együtthatója 292 nm-nél 12,2 Ennek megfelelően# 1 pmol hűgysav/mi reakcióelegy oxidációja 12,2 mAasz abszorfoanciacsökkenést eredményezett. Az abszorbancia idő függvényében történő változását (AA^/perc) a görbe lineáris szakaszából származtattuk,
A proteinkoncentrációt módosított Bradford-eijárással. [Macart és Gerbaut: Clin. Chim. Acta 122# 93-101 (1982)1 határoztuk meg. Az urikáz specifikus aktivitását (hatékonyságát) az aktivitás (S/mi) proteinkoncentrációval (mg/ml) történő osztásával számítottuk ki. A különböző urikázok enzimatikus aktivitási eredményeit a 4, táblázatban foglaljuk össze. A táblázatban a kereskedelmi forgalomban beszerezhető készítmények eredményeit referencia értékekként mutatjuk be. Az eredményekből. látható, hogy az urikázproteinek csonkítása enzimatikus aktivitásukat nem befolyásolja jelentősen.
4, táblázat
Rekombináns éa... npálv paramótergingk bazy .grefoglalása
ürikázok |
Törzseidet-
koncentráció (mg/ml) íl; |
Specifikus
aktivitás (E/mg)Í2í |
(μΜ hűgy-
sav) |
-—r,,-
(1/perc) |
Hekcmbináns |
Sertés |
Ö,« |
7,45 |
4,33 |
305 |
Sertés-áM |
0,54 |
7, 68 |
4 y -$i |
822 |
Sertés“KS |
0,33 |
7,16 |
5,27 |
1085 |
Sertés-KS-áM |
1,14 |
6,20 |
3, 28 |
272 |
SBC |
0,76 |
3,3 6 |
4,87 |
662 |
BBC-bbC |
0, SS |
3,85 |
4,3 |
580 |
byöi |
0, 4 5 |
3,07 |
4,14 |
£ ·*> ··>
•x? a·. |
bakit |
Sertés
(Sigma) |
2, 70 |
3,26;í: |
5,35 |
301 |
A, finvsa
(Merck) |
1,35 |
|
23,54 |
671 |
íi5 A pnötainkoncentrániék a 278 nm-nél márt abszorfeanci.® alapján - lö mg/ml urikázoldatra 11,3-as extinkcióa együttható alkalmazásával - határoztuk meg (Mahler# 1983)« i2? 1 egység uríkázaktivitás definíció szerint az enzim azon mennyisége, amely egy perc alatt# 25 ®C~o« 1 pmol. hógysavat allantoinná oxidál, '3} A specifikus aktivitási értékeket a Liaeweaver-Burk diagramokból származtattuk (€0 μΜ-nak megfelelő szubsztrátkoncentrációnál)«
A. reakcióelegyek a következő törzsoldatok különböző kombinációiból álltaks
106 te nátrium-borát puffer (pH ss 9# 2);
300 μΜ húgyaavat tartalmazó 50 mM nátrium-borát puffer (pH - 9,2}?
mg/ml ESá-t tartalmazó 50 mM nátrium-borát puffer (pH - 3#2).
A M^fe érték kiszámításához a Vmax-értéket (melyet a megfelelő Lineweaver-Eurk diagramból számítottunk ki) elosztottuk a reakoióelegyben lévő urikáz koncentrációjával (az urikázok tetramer molekulatömegén alapuló móIngyenértékben kifejezve).
ő. példa
V r i ká z konj;ugá 1 ása_m-PEG-ge 1 (HEG 1,1 álásj
A sertás-KS-AN-urikáz konjugálását m-PEG-NPC (monometoxí-polí(etilén-glíkol)-nitrofenll-karbonát1 alkalmazásával hajtottuk végre. Urikáz-alegységenként 2-12 szál 5, 10 vagy 20 kb-os PEG jelenlétét eredményező feltételeket alakítottunk ki# és az m-PEG-EPC-t fokozatosan adtuk a proteinoldathoz. A PEG hozzáadásának befejezése után az urikáz/m-PEG-EPG reakcióelegyet 2-8 Λ0-οη 16-18 óra hosszat Ínkubáítuk# míg a maximális mennyiségű kötetlen m-PEG-szál uríkázhoz történő konjugálása be nem következett.
A PEG-szálak PEG-urikáz-monomerenkénti számát „Superose S* méretkíszorításos kromatográfiával (SEC)# PEG és urikáz standardok alkalmazásával. határoztuk meg. A kötött PEG-szálak alegységenként! számát a következő egyenlettel számítottuk ki:
PEG-szál/ - 3# 42 x beínjektált mintában lévő PEG (ug) alegység beinjektált mintában lévő protein (pg)
A EEG-urikáz mintában a FEG- és a protein-egységek koncentrációját méretkiazoritásos krosíatográfiávai (SBC), sorba rendezett ultraibolya™ <G7} és törésmutató- (Rí) detektorok [Kunitani és mtsai, (1991)1 alkalmazásával határoztuk. meg. Három kalibrációs görbét készítettünk; egy protein görbét (220 nm-nál mért abszorbancia) ? egy másik protein görbét (törésmutató alapján mérve)? éa agy EEG görbét (törésmutató alapján mérve). Est követően a PEC-urikáz mintákat ugyanezen, rendszer alkalmazásával analizáltuk. A EEG és s protein kalibrációs görbékhez viszonyított koncentrációinak kiszámítására a kísérleti mintákra kapott 07- és Rl-csúcs alatti terület értékeket használtok, A 3,42-os index az úrikéz-monomer molekulatömegének (34,192 D) a 10 kDoa EEG molekulatömegéhez viszonyított aránya.
Az urikázhoz kapcsolt EEG növelte az urikáz fiziológiai pH-jó oldatokban tapasztalható oldékonyaágáf, Az 5, táblázatban a EECiiáit aertás-KS-áN-nrikáz különböző tételei közötti variabilitást mutatjuk be. Általában fordított őszszefüggés található a EEG-szalak urikáznoz kapcsolt száma és az enzim megmaradt specifikus aktivitása (SA) között,.
táblázat
PEGiiált sertés-KŐ-A^-urikázkonjugátumok enzimatikus aktivitása
Konjugatom tétel |
EEG
molekula-
tömeg
(kö)' |
PEG-
szái/urikás-
alegység |
Urikáz
SA
CE/mg) |
SA
(a kontroll százalékában) |
Sertés-XS-
áh |
XX· |
|
<< ·*·> |
100 |
1-17 # |
5 |
9,7 |
5,3 |
70,4 |
EP-17 |
10 |
2,3 |
7,8 |
94,6 |
1-15 á |
10 |
5,1 |
6,4 |
77,9 |
13 # |
10 |
8,4 |
8,3 |
76, 9 |
14 # |
10 |
8,5 |
•4 |
77,5 |
3-15 á |
10 |
0,3 |
5,4 |
35,3 |
5-17 # |
10 |
11,3 |
4,5 |
55,3 |
4-17 # |
10 |
11,0 |
4,4 |
53,9 |
1-18 # |
|
11,5 |
4,5 |
54,4 |
A sertéa-KS-AK-urikázt az 5. példában leírt módon, 1000 D-os és 100 000 D-oe m-PEG-bPC alkalmazáséval kon jógáitok. Urikáz-alegyeégenként 2-12 szél PEG jelenlétét eredményező feltételeket alkalmaztunk. A EEG hozzáadásának befejezése után az urikáz/m-PSG-K'9C reakoióelegyet 2-6 fenn 16-18 éra hosszat Ínkubáltuk, min a maximális mennyiségű kötetlen m-PEG-szál. urikázhoz történő konjugálása be nem következett.
A EEG-ssálnk PEG-n.rlkáz monomerenként! számát a fentebb ieirtak szerint határoztuk meg.
Az urikázhoz kapcsolt EEG növelte az urikáz fizíolőgiai pH-jú oldatokban tapasztalható oldékonyságát.
7. példa
PEG-gei konjugált sertés-KS~ŐN~urikáz farmakokinetikája
A PEGiláiás terápiás haszon eléréséhez szükséges, optimális méretének és mértékének meghatározása céljából biológiai kísérleteket végeztünk.
Patkányokban, végzett farmakokínetikai vizsgálatok során a módosítatlan urikáz - 0,4 mg (2 egység)/testtömegkilogramm mennyiségben a kísérlet 1. és 3» napján intravénásán injektálva - a keringésben kb. 10 perces felezési időt mutatott. Mindazonáltal, a 2-11 x 10 kD PSG/sertés-SKΑΝ-urikáz konjugátummal patkányokban végzett clearance sebességi vizsgálatok kilenc, hetenként beadott injekciót követően azt mutatták, hogy a clearance nem állt összefüggésben a ?EG-szálak számával (ebben a nagyságrendben) , és a. vizsgálat időtartama alatt viszonylag állandó maradt (ld. a
6. táblázatot; felezési idő: kb. 30 óra) . A hétről hétre tapasztalt eltérések a kísérleti hibahatáron beiül maradtak. Az urikáz lOxSkb és 10x20 ko PEG-szálakkal létrehozott konjugátumainak kilenc alkalommal végzett injektálása után is hasonló eredményeket kaptunk. Az eredmények azt jelzik, hogy az urikáz PEGiláiásának mértékétől (ebben a nagyságrendben) függetlenül a patkánymodellben hasonló biológiai hatásokat tapasztaltunk.
6,táblázat
PEGilált serte s - K S - ÁH - u r 1 k á g k é s ζ 11 mé ry e k f e 1 e z é a 1. ideje
|
Módosítás mértéke
(FEG-szálak nrikáz-alegységenkénti száma) |
SkDFEG |
lOkü 26G |
20kD PEG |
Hét |
10x |
2x |
5x |
7x |
9x |
llx |
10x |
1. |
25,7
i 1,7
(5) |
2 9, 4
i 3,4
(5) |
37,7
± 3, 1
(5) |
37,6
± 3,9
(5) |
36,9
± 4, 3
(5) |
31,4
± 4,3
(5) |
21,6
± 1,5
(5) |
··>
Λ. Λ |
|
|
|
26, 7
± 3,0
(5) |
28,4 í
1, fc
(5) |
|
|
3, |
27,5
± 3,5
(5) |
29, 0
x 2,6
(5) |
29,9
±
11,7
(5) |
32,7
± 11,1
(5) |
26,3
±4,7
(5) |
11,3
± 3,3
(5) |
14,5
± 2,7
(5) |
4 . |
|
|
27,1
± 5,3
(5) |
18,4
± 2,2
(4) |
19,7
± 5, 6
(4) |
|
|
5, |
23,6
± 1,7
(5) |
a a s
Xv J' ·.··
± 2,7
(5) |
34, 3
± 3, 9
(4) |
37,3
x 3,0
(5) |
30,4
± 3,6
(5) |
30,5
x 1,3
(5) |
19,3
± 2,5
(5) |
6. |
|
|
35,4
± 3,1
(14) |
27,1
± 3,6
(13) |
30,7
±2,9
(13) |
|
|
7. |
16, 5
± 4,9
(5) |
32,5
±4,3
(5) |
|
|
|
16,1.2
± 2,7
(5) |
25,8
± 2,5
(5) |
b |
- |
|
|
· |
|
... |
... |
9, |
3 6,8
1 4,0
(15) |
28,7
±2,7
(15) |
34,0
± 2,4
(13) |
24,2
± 3,4
(13) |
31,0
± 2, 6
(13) |
29, 3
± 1, 4
(15) |
26,7
± 0,5
(15) |
A 6. táblázatban ez eredményeket öra ± szórás értékként adtuk meg, A zárójelben feltüntetett számok a tesztelt állatok számát jelentik.
A patkányokat a táblázatban jelzett megadottak szerint PEGiiált sertés-KE-Al^-urikázok 0#4 mg/testtömeg-kilogramm dózisával intravénásén hetente oltottuk. Eredetileg mindegyik csoport 15 patkányból állt# melyekből falváitva öt állatból álló alcsoportokban vettünk vért, A kísérlet során az altatás miatt több patkány is elpusztult, A felezési időket az injektálás után 5 perccel# illetve 6, 24 és 48 órával vett plazmamintákban, ez uríkáz-aktivitás mérésével Ckolorímatriás vizsgálati módszerrel) határoztuk meg.
Az 5. táblázatban feltüntettük a vizsgálat során alkalmazott EAGiláit urikázok tételszámát,
A kö .PEö/sertés-K5-áM-urikáz kenj ugat utasai nyálakban végzett biohasznosithatósági kísérletek eredményei azt jelzik# hogy az első injektálást kővetően a keringésben mérhető felezési idő 98,2 ± 1#8 óra (i.v.) volt, míg a biohasznosíthatóság intramuszkuláris (i.m.)# illetve szubkután (s.c.) injektálást követően ?1 t# illetve 52 á volt. Mindazonáltal, a második i.m. és s.c. injektálás után valamennyi nyélben jelentős anti-urikáz entltest-titert detektáltunk# és a clearance a további .injekciók beadása után felgyorsult. Ugyanezen konjugáturnékat patkányokba injektálva 2é±l#é órás (i.v.) felezési időt kaptunk, miközben az
i.m, és s.c. injektálás utáni biohasznosíthatóság 33 t# illetve 22 á volt.
A 9xlö kD PEG/aertéa-KS-ÁE-urikáz konjugátumal patkányokban végzett kísérletek eredményei azt jelzik# hogy az
XV ·<«
X első (i.v«) injektálás utáni keringési felezési idő 42,4 őrs volt, sz í.m. ás s.c. injektálás utáni biohesznosithatőság pedig 28,9 %, illetve 14,5 % volt (Iá, az S. ábrát és a 7» táblázatot). A negyedik injekció beadását kővetően a keringési felezési idő 32,1 i 2,4 óra# míg az i.m. és s.c. injektálás utáni biohasznosíthatóség 26,1 %, illetve 14,9 % volt.
A 9x1.0 kO PEG/sertés-KS—áü-urikáz konjugátummal nyilakban végzett hasonló farmakokínetikai kísérletek eredményei alapján e konjngátum injektálását (kéthetenkénti injektálás, összesen négy alkalommal) követően a ciearance felgyorsulása nem volt megfigyelhető. Ezekben az állatokban a keringési felezési idő az első injektálást (i.v.) követően 88, S óra, míg a biohasznosíthatóség i.m. és s.e. injektálást kővetően 98,3 %, illetve 84,4 % volt (ld. a 6. ábrát és a 7. táblázatot), A negyedik injektálás után a keringési felezési idő 141,1 ± 18,4 óra, a bíohasznosíthatóság pedig 85 % (í.m.), illetve 83 % (s.o.) volt.
A 9x18 kb PEG/sertés-KS-AN-urikáz konjugátummal hasonló bíohasznosithatósági kisérleteket végeztünk beagle kutyákban (csoportonként két hím és két nőstény). Az első
i.v. injektálás után regisztrált keringési felezési Idd
78111,7 óra, míg az i«m. és s.c, injektálás utáni biohasznosíthatóség 89,9 8, illetve S8,4 t volt (ld. a 7. ábrát és a 7, táblázatot), .A 9x18 kb PEG/sertés-KS-áM-uríkáZ kon. jogé tómmal sertésekben is végeztünk kísérleteket. Az i<v., s.c., és i.m. injektálásokhoz csoportonként három állatot alkalmaztunk. Az első i.v. injektálás után 178 ± 24 órás keringési .felezési időt regisztráltunk, ugyanakkor az i.m. és s.c. injektálások utáni foiohassnosíthatóság 71,6 %, illetve 76,8 % volt (Id, a 8, ábrát és a 7, táblázatot).
7, táblázat
A 9x10 kD PEG/sertés--KS-áK-urlkaz konjugátummal végzett farmakoklnetikai vizsgálatok eredményei
Injektálások
száma |
Felezési idő
(óra) |
Biohasznosithatóság |
i, V. |
i . m. |
s. o. |
Patkányok |
|
|
|
1 |
42,4 x 4,3 |
28, 9% |
14,5% |
·'> |
24,1 1 5,0 |
28, 9% |
14,5% |
4 |
32,1 ± 2,4 |
26,1% |
14,9% |
Eyuiak |
|
|
|
i |
8 8,5 ± 8, 9 |
98, 3% |
84,4% |
9 |
45,7 i 40,6 |
100% |
100% |
4 |
141,1 i 15,4 |
8 5% |
33% |
i Kutyák |
|
|
|
1 |
70,0 ± 11,7 |
6 9, 5 % |
50,4% |
Sertések |
|
|
|
1 |
178 1 24 |
71,6% |
76,3% |
A 9xlö kD PSG/sertés-KS-ÁN-urikáz konjugátum Bolton & Hunter-féle eljárással, ^'1-izotóppal végzett jódozása után abszorpciós, megoszlási, anyagcsere--· és exkréciós vizsgálatokat (ADMF) végeztünk. A radioaktivan jelzett konjugátumot patkányok hét csoportjának (csoportonként négy patkány -két him, két nőstény) injektáltuk. A radioaktivitás megoszlását az injektálás után egy órával, majd hét napon keresztül 24 óránként vizsgáltuk. Valamennyi csoportot leöltük, az állatok szerveit kimetszel;tok és analizáltuk. A hetedik csoportot anyagcsere-ketrecben tartottuk# amelyből a vizeletet es ürüléket összegyűjtöttük. Ac állatok testében as anyag megoszlását az egyes szervekben mért radioaktivitás# valamint a TCA-vai történő precipitáciőra (megkötött protein, a szerv méretére normalizálva) hozzáférhető beütesszámhányadok (vese, máj# tüdő és lép) alapján értékeltük. A kimetszett szervek közül egyikben sem tapasztaltunk a többiekénél nagyobb specifikus radioaktivitást# ami arra utal# hogy - például a májban vagy a vesében ···· jelentős mértékü felhalmozódás nem volt. A 7. napra a radioaktivitás 70 %·« kiválasztásra került,
S. példa
Klinikai kísérletek ezredményei
A PBG-urlkáz (Purioase®# Savient Pharmaceutlcals) ux'átreakcíójának# farmakokineti kajának és biztonságossági profiljának - híperurikémiaban és súlyos köszvénytöi szenvedő# hagyományos terápiára nem reagáló vagy azt nem toleráló páciensekben történő meghatározására randomizált# nyílt jelzésű# több központú# párhuzamos csoportokkal végzett vizsgálatot végeztünk. A betegség átlagos időtartama 14 év volt# és a vizsgálatba bevont személyek 70 %~ában egy vagy több tophus volt jelen.
A vizsgálat során 41 pácienst (átlagéletkor; 58#1 év) véletlenszerű kiválasztással# 12 héten keresztül intravénásán adagolt BEG-arikáz konjucátűmmel# az alábbi négy adagolási séma egyike szerint kezeltünk: kéthetente 4 mg (7 páciens); kéthetente 8 mg (8 páciens); négyhetente 8 mg (13 páciens)? négyhetente 12 mg (13 páciens). A vérplazma úrikázaktivitását és urátszintjét meghatározott időközönként mértük. Az urikázaktivitás és az urátszint analíziséből kiszámítottuk a farmakokinetikai paramétereket, a vérplazma átlagos urátkonoentrációját és azt az idöhányadot, amíg a. vérplazma urátkoncentráoíója legfeljebb 6 mg/dl volt.
A kéthetente 8 mg FEG-urikáz kenj aga búmmal kezelt páciensek esetében tapasztaltuk a vérplazma urátszintjének (FUA) legnagyobb csökkenését? a FUA-szint a kezelés időtartamának 92 %-ában volt 6 mg/dl alatt (a kezelés előtti vérplazma -urát szint 9,1 mg/dl, szemben a 12 hetes kezelési időtartamra számított 1,4 mg/dl átlagos vérplazmaurát az inttel5.
A PEG-urikáz konjugátummal kezelt további csoportokban is jelentős és tartós vérpiazma-urátszint csökkenést figyeltünk meg: a négyhetenként 8 mg konjugátummal kezelt csoportban a kezelés időtartamának 86 %-ában volt 6 mg/dl alatti PUA-színt (a kezelés előtti PÜÁ-színt 9,1 mg/dl, szemben a 12 hetes kezelési időtartamra számított 2,6 mg/dl átlagos PGA-szinttel)? a négyhetenként 12 mg konjugátummal kezelt csoportban a kezelés időtartamának 84 %-ában volt 6 mg/dl alatti PDA-színt (itt a kezelés előtti PUA-szint 8,5 mg/dl, szemben a 12 hetes kezelési időtartamra számított
2,6 mg/dl átlagos PÜA-szinttel)? és a kéthetenként 4 mg konjugátummal kezelt csoportban a kezelés időtartamának 73 %~éban volt 6 mg/dl alatti FUA-szint (a kezelés előtti FOAszint 7,6 mg/dl# szemben a 12 hetes kezelési időtartamra számított 4#2 mg/dl átlagos PbA-ezínttal) .
A FEG-urikáz konjugátum beadása utáni első 2< órában a vérplazma-urátszínt alapértékhez viszonyított maximális százalékos csökkenése a 4 mg/2 hét séma szerint kezelt csoportban 72 % (p - ö#0uÖz); a 8 mg/2 hát csoportban 94 % (p < 0,0001); a 8 mg./á hát séma szerint kezeit csoportban 87 % (p < 0,0001); ás a 12 mgZ4 hét séma szerint kezeit csoportban 93 % volt (p < 0,0001).
A kezelés 12 hetes időtartamé alatt a vérplazmanratszint alapértékhez viszonyított százalékos csökkenése s 4 mg/2 hát séma szerint kezeit csoportban 38 % (p 0,0002); a 8 mg/2 hét csoportban 88 1 (p < 0#00Ö1); a 8 mg/4 hét séma szerint kezelt csoportban 58 % (p - 0,0003); ás a 12 mg/4 hét séma szerint kezeit csoportban 87 % volt (p < 0,0001).
Meglepő módon# a PEG-urikás kenj«gátammal kezelt páciensek közül néhány infúzióval kapcsolatos zavaró eseményt# azaz infúziós reakciót tapasztalt. Ezek a reakciók az észszes infúzió 14 %-ánál fordultak elő.,
A találmány leírásában említett valamennyi hivatkozást teljes terjedelmében a kifanltás részének keli tekinteni, .Ahogy ez e leírás alapján szakember számára kézenfekvő# e találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezésében számoe módosítás ás variáció hajtható végre# anélkül# begy eltérnénk a. találmányi gondolat lényegétől. Az általunk feltárt specifikus megvalósítási módok csupán példaként szolgálnak; a találmány szerinti megoldást a mellékelt szabadalmi igénypontok határozzák meg egyértelműen,
A szekveneiaiistakötetlen szövegrészletelnek fordítása;
Az 1. azonosítószámú szekvenciához:
<223> Sertésmáj-urikáz (szensz)
A 2. azonosítószámú szekvenciához:
<223> Sertésmáj-urikáz (antiszensz)
A 3. azonosítószámú szekvenciához:
<223> Pávián (D3H) máj-urikáz (szánsz)
A 4. azonosítószámú szekvenciához:
<223> Pávián (D3H) máj-urikáz (antiszensz)
Az 5. azonosítószámú szekvenciához;
<223> PBC-DeltakC urikáz (szensz)
A 6, azonosítószámú szekvenciához;
<223> PSC-DeltahC urikáz (antiszensz)
A 7. azonosítószámú szekvenciához:
<223> Sertés-KS-Deltak
A 8, azonosítószámú szekvenciához:
<223> Sertés-KS-Deitak (kezdő Hot nélkül)
A 9. azonosítószámú szekvenciához:
<223> Sertés-KS-DeitakA
A lö, azonosítószámú szekvenciához;
<223> Serfcés-'KS-DeltsN (kezdő ATG nélkül)
A 12. azonosítószámú szekvenciához;
<223> PBC-Deitak
A 13. azonosítószámú szekvenciához;
<223> PBODeltak (kezdő bet nélkül)
A 14. azonos!tőszárná szekvenciához:
<223> PBC-Deltak (a PBC-OeltakC 44-56. aminosavaiböl álló fragmens)