ES2856881T3 - Formas variantes de urato oxidasa y su uso - Google Patents

Abstract

Una uricasa truncada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, conjugada con polietilenglicol (PEG).

Description

DESCRIPCIÓN

Formas variantes de urato oxidasa y su uso

REFERENCIA CRUZADA A APLICACIONES RELACIONADAS

[0001] La presente solicitud reivindica prioridad y beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. N° de Serie: 60/670.573, presentada el 11 de abril de 2005.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002] La presente invención se refiere a proteínas modificadas genéticamente con actividad uricolítica. Más específicamente, la invención se refiere a proteínas que comprenden urato oxidasas truncadas y métodos para producirlas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0003] Los términos de urato oxidasa y uricasa se utilizan aquí de forma intercambiable. Las urato oxidasas (uricasas; E.C. 1.7.3.3) son enzimas que catalizan la oxidación del ácido úrico a un producto más soluble, alantoína, un metabolito de purina que se excreta más fácilmente. Los seres humanos no producen uricasa enzimáticamente activa, como resultado de varias mutaciones en el gen de la uricasa adquiridas durante la evolución de primates superiores. Wu, X y col., (1992) J Mol Evol 34: 78-84. Como consecuencia, en individuos susceptibles, concentraciones excesivas de ácido úrico en la sangre (hiperuricemia) pueden provocar artritis dolorosa (gota), depósitos de uratos desfigurantes (tofos) e insuficiencia renal. En algunas personas afectadas, los medicamentos disponibles como el alopurinol (un inhibidor de la síntesis de ácido úrico) producen efectos adversos que limitan el tratamiento o no alivian estas afecciones de manera adecuada. Hande, KR y col., (1984) Am J Med 76: 47-56; Fam, AG, (1990) Bailliere's Clin Rheumatol 4: 177-192. Las inyecciones de uricasa pueden disminuir la hiperuricemia y la hiperuricosuria, al menos de forma transitoria. Dado que la uricasa es una proteína extraña en los seres humanos, incluso la primera inyección de la proteína no modificada de Aspergillus flavus ha inducido reacciones anafilácticas en varios por ciento de los pacientes tratados (Pui, CH, et al., (1997) Leukemia 11: 1813-1816, y las respuestas inmunológicas limitan su utilidad para el tratamiento crónico o intermitente. Donadio, D, et al., (1981) Nouv Presse Med 10: 711-712; Leaustic, M, et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50: 553- 554.

[0004] El rendimiento sub-óptimo de los tratamientos disponibles para la hiperuricemia ha sido reconocida desde hace varias décadas Kissel, P, et al, (1968) Nature 217: 72-74 del mismo modo, la posibilidad de que determinados grupos de pacientes con la gota severa podría beneficiarse de una forma segura y eficaz de uricasa inyectable ha sido reconocida durante muchos años. Davis, et al., (1978) en GB Broun, et al., (Eds.) Enzyme Engineering Vol. 4 (págs. 169 -173) Nueva York, Plenum Press; Nishimura, H, et al., (1979) Enzyme 24: 261-264; Nishimura, H, et al., (1981) Enzyme 26: 49-53; Davis, S, et al., (1981) Lancet 2 (8241): 281-283, Abuchowski, A, et al., (1981) J Pharmacol Exp Ther 219: 352-354; Chen, RH-L y col., (1981) Biochim Biophys Acta 660: 293-298; Chua, CC y col., (1988) Ann Int Med 109: 114-117; Greenberg, ML y col., (1989) Anal Biochem 176: 290-293. Las uricasas derivadas de órganos animales son casi insolubles en disolventes que son compatibles con una administración segura por inyección. Patente de Estados Unidos N° 3.616.231. Ciertas uricasas derivadas de plantas o de microorganismos son más solubles en disolventes médicamente aceptables. Sin embargo, la inyección de enzimas microbianas induce rápidamente respuestas inmunológicas que pueden conducir a reacciones alérgicas potencialmente mortales o inactivación y/o eliminación acelerada de la uricasa de la circulación, Donadio, et al., (1981); Leaustic y col., (1983). Enzimas basadas en las secuencias de aminoácidos deducidas de uricasas de mamíferos, incluidos el cerdo y el babuino, o de insectos, como, por ejemplo, Drosophila melanogaster o Drosophila pseudoobscura (Wallrath, LL, et al., (1990) Mol Cell Biol 10: 5114-5127), no han sido candidatos adecuados para uso clínico, debido a problemas de inmunogenicidad e insolubilidad a pH fisiológico.

[0005] Anteriormente, los investigadores han utilizado uricasa inyectada para catalizar la conversión de ácido úrico a alantoína in vivo. Ver Pui, et al., (1997). Esta es la base para el uso en Francia e Italia de la uricasa del hongo Aspergillus flavus (Uricozyme®) para prevenir o corregir temporalmente la hiperuricemia asociada con la terapia citotóxica para las neoplasias hematológicas y para reducir transitoriamente la hiperuricemia severa en pacientes con gota. Potaux, L y col., (1975) Nouv Presse Med 4: 1109-1112; Legoux, R. y col., (1992) J Biol Chem 267: 8565-8570; Patentes de Estados Unidos 5.382.518 y 5.541.098. Debido a su corta vida en circulación, Uricozyme® requiere inyecciones diarias. Además, no es muy adecuado para la terapia a largo plazo debido a su inmunogenicidad.

[0006] Ciertas uricasas son útiles para preparar conjugados con poli(etilenglicol) o óxido de poli(etileno) (ambos referidos como PEG) para producir formas terapéuticamente eficaces de uricasa que tiene una mayor semivida de la proteína y la reducción de la inmunogenicidad. Patentes de Estados Unidos 4.179.337, 4.766.106, 4.847.325 y 6.576.235; Publicación de solicitud de patente estadounidense US2003/0082786A1. También se han descrito conjugados de uricasa con polímeros distintos de PEG. Patente de Estados Unidos 4.460.683.

[0007] En casi todos los intentos notificados para PEGilar uricasa (es decir, para acoplar de forma covalente PEG a la uricasa), el PEG está unido principalmente a grupos amino, incluyendo el residuo amino-terminal y los residuos de lisina disponibles. En las uricasas comúnmente utilizadas, el número total de lisinas en cada una de las cuatro subunidades idénticas está entre 25 (Aspergillus flavus (Patente de Estados Unidos 5.382.518)) y 29 (cerdo (Wu, X, et al., (1989) Proc Natl Acad Sci EE. UU. 86: 9412-9416)). Algunas de las lisinas no están disponibles para la PEGilación en la conformación nativa de la enzima. El enfoque más común para reducir la inmunogenicidad de la uricasa ha sido acoplar un gran número de hebras de PEG de bajo peso molecular. Esto ha resultado invariablemente en grandes disminuciones en la actividad enzimática de los conjugados resultantes.

[0008] Una sola inyección intravenosa de un preparado de Candida utilis uricasa acoplado a suero reducido urato de 5 kDa PEG a niveles indetectables en cinco sujetos humanos cuya pre-inyección de concentración de urato sérico promedio es de 6,2 mg/dl, que está dentro del rango normal. Davis y col., (1981). Los sujetos recibieron una inyección adicional cuatro semanas después, pero no se informaron sus respuestas. No se detectaron anticuerpos contra la uricasa después de la segunda (y última) inyección, utilizando un ensayo de difusión en gel relativamente insensible. Esta referencia no informó resultados de tratamientos crónicos o subcrónicos de pacientes humanos o animales de experimentación.

[0009] Una preparación de uricasa de Arthrobacter protofomiae acoplado a 5 kDa PEG se utilizó para controlar temporalmente hiperuricemia en un solo paciente con linfoma cuya concentración de urato en suero de pre-inyección es 15 mg/dL. Chua y col., (1988). Debido al estado crítico del paciente y la corta duración del tratamiento (cuatro inyecciones durante 14 días), no es posible evaluar la eficacia o seguridad a largo plazo del conjugado.

[0010] Una protección mejorada de reconocimiento inmune está habilitada mediante la modificación de cada subunidad de uricasa con 2 -10 filamentos de alto peso molecular PEG (> 5 kD -120 kD) Saifer, et al, (Patente de Estados Unidos 6.576.235;. (1994) Adv Exp Med Biol 366: 377-387). Esta estrategia permitió la retención de >75% de la actividad enzimática de la uricasa de varias especies, después de la PEGilación, mejoró la vida circulante de la uricasa y permitió la inyección repetida de la enzima sin provocar anticuerpos en ratones y conejos.

[0011] Hershfield y Kelly desarrollaron medios para proporcionar proteínas de uricasa recombinantes de especies de mamíferos con los números óptimos de sitios de PEGilación (Publicación de Patente Internacional WO 00/08196 Solicitud de Estados Unidos N° 60/095.489). Utilizaron técnicas de PCR para aumentar el número de residuos de lisina disponibles en puntos seleccionados de la enzima que está diseñada para permitir un reconocimiento reducido por parte del sistema inmunológico, después de la PEGilación posterior, mientras que conserva sustancialmente la actividad uricolítica de la enzima. Algunas de sus proteínas de uricasa están truncadas en los extremos carboxi y/o amino. No prevén la dirección de otras alteraciones específicas inducidas genéticamente en la proteína.

[0012] En esta aplicación, el término "inmunogenicidad" se refiere a la inducción de una respuesta inmune por una preparación inyectada de uricasa modificada o no modificada por PEG (el antígeno), mientras que "antigenicidad" se refiere a la reacción de un antígeno con anticuerpos preexistentes. En conjunto, la antigenicidad y la inmunogenicidad se denominan "inmunorreactividad". En estudios previos de PEG-uricasa, la inmunorreactividad se evalúa mediante una variedad de métodos, que incluyen: 1) la reacción in vitro de PEG-uricasa con anticuerpos preformados; 2) mediciones de la síntesis de anticuerpos inducida; y 3) tasas de aclaramiento aceleradas después de inyecciones repetidas.

[0013] Los intentos anteriores para eliminar la inmunogenicidad de las uricasas de varias fuentes mediante el acoplamiento de varios números de cadenas de PEG a través de varios enlazadores se han encontrado con un éxito limitado. Las PEG-uricasas fueron divulgadas por primera vez por FF Davis y por Y Inada y sus colegas. Davis y col., (1978); Patente de Estados Unidos 4.179.337; Nishimura y col., (1979); Patentes japonesas 55-99189 y 62-55079. El conjugado divulgado en la patente de EE. UU. 4.179.337 se sintetiza haciendo reaccionar uricasa de origen no especificado con un exceso molar de 2.000 veces de 750 dalton PEG, lo que indica que es probable que se haya unido un gran número de moléculas de polímero a cada subunidad de uricasa. La Patente de Estados Unidos 4.179.337 describe el acoplamiento de PEG o poli(propilenglicol) con pesos moleculares de 500 a 20.000 daltons, preferiblemente alrededor de 500 a 5000 daltons, para proporcionar conjugados activos, solubles en agua, no inmunogénicos de varias hormonas polipeptídicas y enzimas que incluyen oxidorreductasas, de las cuales la uricasa es uno de los tres ejemplos. Además, la Patente de Estados Unidos 4.179.337 enfatiza el acoplamiento de 10 a 100 hebras de polímero por molécula de enzima y la retención de al menos el 40% de la actividad enzimática. No se informaron resultados de prueba para el grado de acoplamiento de PEG a los grupos amino disponibles de uricasa, la actividad uricolítica específica residual o la inmunorreactividad del conjugado.

[0014] En las publicaciones anteriores, una disminución significativa en la actividad uricolítica medida in vitro fue causada por el acoplamiento de varios números de cadenas de PEG para uricasa derivada de Candida utilis. El acoplamiento de un gran número de hebras de PEG de 5 kDa a la uricasa de hígado porcino dio resultados similares, como se describe tanto en la publicación de Chen como en un informe de simposio del mismo grupo. Chen y col., (1981); Davis y col., (1978).

[0015] En siete estudios anteriores, se informa que ha disminuido la inmunorreactividad de uricasa por PEGilación y fue eliminada en otros cinco estudios. En tres de los últimos cinco estudios, la eliminación de la inmunorreactividad se asocia con una disminución profunda de la actividad uricolítica, hasta un máximo del 15%, 28% o 45% de la actividad inicial. Nishimura, et al., (1979) (15% de actividad); Chen y col., (1981) (28% de actividad); Nishimura, et al., (1981) (45% de actividad). En el cuarto informe, se informa que el PEG está acoplado al 61% de los residuos de lisina disponibles, pero no se indica la actividad específica residual. Abuchowski y col., (1981). Sin embargo, un equipo de investigación que incluyó a dos de los mismos científicos y utilizó los mismos métodos informó en otro lugar que este grado de acoplamiento dejaba una actividad residual de solo el 23-28%. Chen y col., (1981). Las publicaciones de 1981 de Abuchowski et al., Y Chen et al., indican que para reducir sustancialmente la inmunogenicidad de la uricasa, el PEG debe estar acoplado a aproximadamente el 60% de los residuos de lisina disponibles. La quinta publicación en la que se informa que se ha eliminado la inmunorreactividad de la uricasa no describe el grado de acoplamiento de PEG, la actividad uricolítica residual o la naturaleza del enlace PEG-proteína. Veronese, FM, et al., (1997) en JM Harris, et al., (Eds), Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (págs. 182-192) Washington, DC: American Chemical Society.

[0016] La conjugación de PEG con una fracción más pequeña de los residuos de lisina en uricasa redujo pero no eliminó su inmunorreactividad en animales de experimentación, Tsuji, J, et al., (1985) Int J Immunopharmacol 7: 725-730 (28-45% de los grupos amino acoplados); Yasuda, Y, et al., (1990) Chem Pharm Bull 38: 2053-2056 (38% de los grupos amino acoplados). Las actividades uricolíticas residuales de los aductos correspondientes oscilaron entre <33% (Tsuji, et al.) y 60% (Yasuda, et al.) de sus valores iniciales. Tsuji, et al., sintetizaron conjugados de PEG-uricasa con PEGS de 7,5 kDa y 10 kDa, además de PEG de 5 kDa. Todos los conjugados resultantes son algo inmunogénicos y antigénicos, mientras que muestran actividades enzimáticas notablemente reducidas.

[0017] Una preparación PEGilada de uricasa derivada de Candida utilis que se administra de manera segura dos veces a cada uno de cinco humanos se informa que han conservado sólo el 11% de su actividad inicial, Davis, et al., (1981). Varios años después, se administró uricasa modificada con PEG de Arthrobacter protoformiae cuatro veces a un paciente con linfoma avanzado e hiperuricemia grave. Chua y col., (1988). Si bien no se midió la actividad residual de esa preparación enzimática, Chua, et al., demostraron la ausencia de anticuerpos anti-uricasa en el suero del paciente 26 días después de la primera inyección de PEG-uricasa, utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA).

[0018] Los estudios previos de uricasa PEGilada muestran que la actividad catalítica está marcadamente deprimida por acoplamiento de un suficiente número de cadenas de PEG para reducir sustancialmente su inmunorreactividad, además, preparaciones más anteriores de PEG-uricasa se sintetizan usando PEG activado con cloruro cianúrico, un derivado de triazina (2,4,6-tricloro-1,3,5-triazina) que se ha demostrado que introduce nuevos determinantes antigénicos e induce la formación de anticuerpos en conejos. Tsuji y col., (1985).

[0019] Patente Japonesa N° 3-148.298 a A Sano, et al., da a conocer proteínas modificadas, incluyendo uricasa, derivatizada con p Eg que tiene un peso molecular de 1-12 kDa que muestran antigenicidad reducida y acción "mejorada prolongada", y métodos de hacer tales péptidos derivatizados. Sin embargo, no hay divulgaciones con respecto al recuento de hebras, ensayos enzimáticos, pruebas biológicas o el significado de "mejorado prolongado". Las patentes japonesas 55-99189 y 62-55079, ambas de Y Inada, describen conjugados de uricasa preparados con PEG-triazina o bis-PEG-triazina (indicados como PEG 2 ), respectivamente. Ver Nishimura, et al., (1979 y 1981). En el primer tipo de conjugado, los pesos moleculares de los PEG son 2 kDa y 5 kDa, mientras que en el segundo solo se usa PEG de 5 kDa. Nishimura, et al., (1979) reportaron la recuperación del 15% de la actividad uricolítica después de la modificación del 43% de las lisinas disponibles con PEG lineal de 5 kDa, mientras que Nishimura, et al., (1981) reportaron la recuperación del 31% o 45% de la actividad uricolítica tras la modificación del 46% o 36% de las lisinas, respectivamente, con PEG². El documento WO0008196 describe urato oxidasa (proteínas de uricasa y moléculas de ácido nucleico que codifican las mismas) que son útiles como intermedios para producir proteínas de uricasa modificadas mejoradas con inmunogenicidad reducida y biodisponibilidad aumentada.

El documento WO0007629 describe una urato oxidasa (uricasa) de origen natural o recombinante acoplada covalentemente a poli(etilenglicol) o óxido de poli(etileno), en donde un promedio de 2 a 10 hebras de PEG se conjugan a cada subunidad de uricasa, y el PEG tiene un promedio de peso molecular entre aproximadamente 5 kDa y 100 kDa. Se dice que los conjugados de PEG-uricasa resultantes no son inmunogénicos y retienen al menos el 75% de la actividad uricolítica de la enzima no modificada.

[0020] Proteínas de uricasa anteriormente estudiadas fueron ya sea proteínas naturales o recombinantes. Sin embargo, los estudios que utilizan SDSPAGE y/o técnicas Western revelaron la presencia de péptidos inesperados de bajo peso molecular que parecen ser productos de degradación y aumentan en frecuencia con el tiempo. La presente invención está relacionada con proteínas de uricasa recombinantes mutantes que tienen truncamientos y una estabilidad estructural mejorada.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0021] La presente invención proporciona una uricasa truncada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, conjugada con polietilenglicol (PEG). La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la uricasa como se define en las reivindicaciones. La presente invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica la uricasa como se define en las reivindicaciones, en donde opcionalmente la secuencia polinucleotídica está unida operativamente a un promotor osmB. La presente invención proporciona un vector que comprende el ácido nucleico que codifica la uricasa como se define en las reivindicaciones. La presente invención proporciona una célula huésped que comprende el vector definido en las reivindicaciones. La presente invención proporciona un método para producir una uricasa que comprende las etapas de cultivar la célula huésped como se define en las reivindicaciones en condiciones tales que la uricasa es expresada por la célula huésped y aislar la uricasa expresada. La presente invención proporciona una PEG-uricasa como se define en las reivindicaciones, en donde la uricasa consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, para su uso en el tratamiento de hiperuricemia y gota grave en pacientes humanos que no responden o no toleran terapia convencional, en donde el tratamiento comprende la administración intravenosa de la PEG-uricasa en un régimen de dosis seleccionado entre:

a) 4 mg cada dos semanas;

b) 8 mg cada dos semanas;

c) 8 mg cada cuatro semanas; o

d) 12 mg cada cuatro semanas.

[0022] La presente invención proporciona nuevas proteínas de uricasa recombinantes. En una realización, las proteínas de la invención contempladas están truncadas y tienen aminoácidos mutados con respecto a las proteínas de uricasa de origen natural. En realizaciones particulares, las mutaciones están en los aminoácidos 7, 46, 291, y 301.

[0023] Los truncamientos están en o alrededor de los extremos de secuencia de tal manera que la proteína puede contener los últimos aminoácidos. Estas mutaciones y truncamientos pueden potenciar la estabilidad de la proteína que comprende tales mutaciones.

[0024] La presente invención proporciona un medio para metabolizar el ácido úrico que comprende un nueva proteína de uricasa recombinante que tiene actividad uricolítica. La actividad uricolítica se usa en este documento para referirse a la conversión enzimática de ácido úrico en alantoína.

La uricasa puede comprender un aminoácido amino terminal, en donde el aminoácido amino terminal es alanina, glicina, prolina, serina o treonina. También se proporciona una uricasa en donde hay una sustitución en aproximadamente la posición 46 con treonina. En una realización, la uricasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 8. En una realización, la uricasa se conjuga con un polímero para formar, por ejemplo, un conjugado de polietilenglicol uricasa. En realizaciones particulares, los conjugados de polietilenglicol uricasa comprenden de 2 a 12 moléculas de polietilenglicol en cada subunidad de uricasa, preferiblemente de 3 a 10 moléculas de polietilenglicol por subunidad de uricasa. Cada molécula de polietilenglicol del conjugado de polietilenglicol-uricasa puede tener un peso molecular entre aproximadamente 1 kD y 100 kD; aproximadamente 1 kD y 50 kD; aproximadamente 5 kD y 20 kD; o alrededor de 10 kD. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden la uricasa de la invención, incluido el conjugado de polietilenglicol-uricasa. La composición farmacéutica puede ser adecuada para una administración repetida.

[0025] También se proporciona una composición farmacéutica para uso en la reducción de los niveles de ácido úrico en un fluido biológico de un sujeto. El fluido biológico puede ser sangre.

[0026] En una realización, la uricasa comprende un péptido que tiene la secuencia de la posición 44 a la posición 56 de Pig-KS-AN (SEQ ID NO. 14).

[0027] También se proporcionan ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una uricasa de la invención, por ejemplo, uricasas que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 8. En una realización, el ácido nucleico aislado se une operativamente a un promotor heterólogo, por ejemplo, el promotor osmB. También se proporcionan vectores que comprenden ácidos nucleicos que codifican uricasa y células huésped que comprenden dichos vectores. También se proporciona un método para producir una uricasa que comprende las etapas de cultivar dicha célula huésped en condiciones tales que la célula huésped exprese la uricasa y se aisla la uricasa expresada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0028]

La Figura 1 ilustra la estructura del plásmido pOUR-P-AN-ks-1. Los números junto a los sitios de restricción indican la posición de los nucleótidos, con respecto al sitio HaeII, designado como 1. Los sitios de restricción que se pierden durante la clonación están marcados entre paréntesis.

La Figura 2 representa el ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas de uricasa de Pig-KS-AN (SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO. 7, respectivamente). La numeración de aminoácidos en la Figura 2 es relativa a la secuencia completa de uricasa de cerdo. Después del residuo de metionina iniciador, una treonina reemplaza al ácido aspártico 7 de la secuencia de la uricasa de cerdo. Se indican los sitios de restricción que se utilizan para las diversas etapas de subclonación. La secuencia 3' sin traducir se muestra en letras minúsculas. El codón de terminación de la traducción se indica con un asterisco.

La Figura 3 muestra la alineación relativa de las secuencias de aminoácidos deducidas de los diversas secuencias de uricasa de cerdos recombinantes (SEQ ID NO. 11), PBC-ANC (SEQ ID NO. 12) y Pig-KS-AN (SEQ ID NO. 7). Los asteriscos indican las posiciones en las que hay diferencias de aminoácidos en Pig-KS-AN en comparación con la secuencia de uricasa de cerdo publicada; los círculos indican posiciones en las que hay diferencias de aminoácidos en Pig-KS-AN en comparación con PBC-AN. Las líneas discontinuas indican la deleción de aminoácidos.

La Figura 4 representa SDS-PAGE de uricasa de cerdo y las variantes de uricasa altamente purificadas producidas según los Ejemplos 1-3. La fecha de producción (mes/año) y el número de carril relevante para cada muestra se indican en la clave siguiente. El eje Y está etiquetado con los pesos de los marcadores de peso molecular y la parte superior de la figura está etiquetada con los números de los carriles. Los carriles son los siguientes: Carril 1 - Marcadores de peso molecular; Carril 2 - Cerdo KS-AN (7/98); Carril 3 - Cerdo (9/98); Carril 4 - Pig KS (6/99); Carril 5 - Pig KS (6/99); Carril 6 - Cerdo-AN (6/99); Carril 7 - Cerdo KS-AN (7/99); Carril 8 -Cerdo KS-AN (8/99).

La Figura 5 muestra los perfiles farmacocinéticos de uricasa Pig-KS-AN PEGilada (9x10 kD) en ratas después de inyecciones IM (intramuscular), SC (subcutánea) e IV (intravenosas), determinadas mediante el seguimiento de la actividad enzimática en muestras de sangre. La actividad de uricasa en muestras de plasma, que se recogen en los puntos de tiempo indicados, se determina utilizando el ensayo colorimétrico. Los valores de actividad (mAU = unidades de mili-absorbancia) representan la velocidad de reacción enzimática por 1 ml de muestra de plasma. La biodisponibilidad (cantidad de fármaco que alcanza la circulación en relación con una inyección intravenosa) de la uricasa inyectada se calculó a partir del área bajo la curva del gráfico.

La Figura 6 representa los perfiles farmacocinéticos de uricasa de Pig-KS-AN PEGilada (9x10 kD) en conejos después de inyecciones IM (intramuscular), SC (subcutánea) e IV (intravenosa), según se determina controlando la actividad enzimática en muestras de sangre. La actividad de uricasa en muestras de plasma recolectadas en los puntos de tiempo indicados se determina usando un ensayo colorimétrico. Los valores de actividad (mUA = mili-unidades de absorbancia) representan la velocidad de reacción enzimática por 1 pl de muestra de plasma. La biodisponibilidad (cantidad de fármaco que alcanza la circulación en relación con una inyección intravenosa) de la uricasa inyectada se calculó a partir del área bajo la curva del gráfico.

La Figura 7 representa los perfiles farmacocinéticos de uricasa de Pig-KS-AN PEGilada (9x10 kD) en perros después de inyecciones IM (intramuscular), SC (subcutánea) e IV (intravenosa), según se determina controlando la actividad enzimática en muestras de sangre. La actividad de uricasa en muestras de plasma, que se recogen en los puntos de tiempo indicados, se determina utilizando el ensayo colorimétrico. Los valores de actividad (mAU = unidades de mili-absorbancia) representan la velocidad de reacción enzimática por 1 pl de muestra de plasma. La biodisponibilidad (cantidad de fármaco que alcanza la circulación en relación con una inyección intravenosa) de la uricasa inyectada se calculó a partir del área bajo la curva del gráfico.

La Figura 8 representa los perfiles farmacocinéticos de uricasa de Pig-KS-AN PEGilada (9x10 kD) en cerdos después de inyecciones IM (intramuscular), SC (subcutánea) e IV (intravenosa), según se determina controlando la actividad enzimática en muestras de sangre. La actividad de uricasa en muestras de plasma, que se recogen en los puntos de tiempo indicados, se determina utilizando el ensayo colorimétrico. Los valores de actividad (mAU = unidades de mili-absorbancia) representan la velocidad de reacción enzimática por 1 pl de muestra de plasma. La biodisponibilidad (cantidad de fármaco que alcanza la circulación en relación con una inyección intravenosa) de la uricasa inyectada se calculó a partir del área bajo la curva del gráfico.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0029] Estudios anteriores enseñan que cuando una reducción significativa de la inmunogenicidad y/o antigenicidad de la uricasa se logra mediante la PEGilación, se asocia invariablemente con una pérdida sustancial de la actividad uricolítica. La seguridad, conveniencia y rentabilidad de los productos biofarmacéuticos se ven afectadas negativamente por la disminución de sus potencias y la necesidad resultante de aumentar la dosis administrada. Por tanto, existe la necesidad de un medio alternativo seguro y eficaz para reducir los niveles elevados de ácido úrico en los fluidos corporales, incluida la sangre. La presente invención proporciona una uricasa truncada de acuerdo con la reivindicación 1.

[0030] La uricasa, como se usa en el presente documento, incluye la subunidad individual, así como el tetrámero, a menos que se indique lo contrario.

[0031] La uricasa mutada, como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de uricasa que tienen aminoácidos intercambiados con otros aminoácidos.

[0032] Una mutación conservadora, tal como se usa en el presente documento, es una mutación de uno o más aminoácidos en o alrededor de una posición, que no altera sustancialmente el comportamiento de la proteína. Una uricasa que comprende al menos una mutación conservadora puede tener la misma actividad de uricasa que la uricasa sin dicha mutación. Una uricasa que comprende al menos una mutación conservadora puede tener sustancialmente la misma actividad de uricasa, dentro del 5% de la actividad, dentro del 10% de la actividad, o dentro del 30% de la actividad de la uricasa sin tal mutación.

[0033] La sustitución conservadora de aminoácidos se define como un cambio en la composición de aminoácidos mediante el cambio de aminoácidos de un péptido, polipéptido o proteína, o fragmento del mismo. La sustitución es de aminoácidos con propiedades generalmente similares (p. ej., ácidos, básicos, aromáticos, de tamaño, cargados positiva o negativamente, polares, no polares) de modo que las sustituciones no alteran sustancialmente las características de péptidos, polipéptidos o proteínas (p. ej., carga, IEF, afinidad, avidez, solubilidad de conformación) o actividad. Las sustituciones típicas que se pueden realizar para dicha sustitución conservadora de aminoácidos pueden estar entre los grupos de aminoácidos siguientes:

glicina (G), alanina (A), valina (V), leucina (L) e isoleucina (I)

ácido aspártico (D) y ácido glutámico (E)

alanina (A), serina (S) y treonina (T)

histidina (H), lisina (K) y arginina (R)

asparagina (N) y glutamina (Q)

fenilalanina (F), tirosina (y) y triptófano (W)

[0034] La proteína que tiene una o más sustituciones conservadoras conserva su estabilidad estructural y puede catalizar una reacción a pesar de que su secuencia de ADN no es la misma que la de la proteína original.

[0035] La uricasa truncada, como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de uricasa que tienen secuencias de aminoácidos primarias acortadas. Entre los posibles truncamientos se encuentran los truncamientos en o alrededor de los extremos amino y/o carboxi. Los truncamientos específicos de este tipo pueden ser tales que los aminoácidos finales (los del extremo amino y/o carboxi terminal) de la proteína de origen natural estén presentes en la proteína truncada. Los truncamientos amino terminales pueden comenzar en la posición 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Los truncamientos amino terminales pueden comenzar en la posición 2, dejando así la metionina amino terminal. Esta metionina puede eliminarse mediante modificación postraduccional. La metionina amino terminal puede eliminarse después de que se produce la uricasa. La metionina puede eliminarse mediante aminopeptidasa bacteriana endógena.

[0036] Una uricasa truncada, con respecto a la secuencia de longitud completa, tiene una o más secuencias de aminoácidos excluidas. Una proteína que comprende una uricasa truncada puede incluir cualquier secuencia de aminoácidos además de la secuencia de uricasa truncada, pero no incluye una proteína que comprende una secuencia de uricasa que contiene cualquier secuencia de aminoácidos de tipo salvaje secuencial adicional. En otras palabras, una proteína que comprende una uricasa truncada en donde el truncamiento comienza en la posición 6 (es decir, la uricasa truncada comienza en la posición 7) no tiene, inmediatamente corriente arriba de la uricasa truncada, cualquier aminoácido que tenga la uricasa de tipo salvaje en la posición 6.

[0037] A menos que se indique lo contrario por referencia específica a otra secuencia o una SEQ ID NO particular, referencia a las posiciones numeradas de los aminoácidos de las uricasas aquí descritas aquí con respecto a la numeración de los aminoácidos de la secuencia de uricasa de cerdo. La secuencia de aminoácidos de la uricasa de cerdo y las posiciones numeradas de los aminoácidos que comprenden esa secuencia se pueden encontrar en la Figura 3. Como se usa en este documento, la referencia a aminoácidos o ácidos nucleicos "desde la posición X a la posición Y" significa la secuencia contigua que comienza en posición X y termina en la posición y, incluyendo los aminoácidos o ácidos nucleicos en ambas posiciones X e Y.

[0038] Genes y proteínas de uricasa se han identificado en varias especies de mamíferos, por ejemplo, cerdo, babuino, rata, conejo, ratón, y mono rhesus. Las secuencias de diversas proteínas de uricasa se describen en el presente documento por referencia a sus números de acceso a la base de datos pública, como sigue: gi|50403728|sp|P25689; gi|20513634|dbj|BAB91555.1; gi| 176610|gb|AAA35395.1; gi|20153654|dbj|BAB91557.1; gi|47523606|ref|NP_999435.1; gi|6678509|ref|NP_033500.1; gi|57463|emb|CAA31490.1; gi|20127395|ref|NP_446220.1; gi|137107|sp|P11645; gi|51458661 |ref|XP_497688.1; gi|207619|gb|AAA42318.1; gi|26340770|dbj|BAC34047.1; y gi|57459|emb|CAA30378.1. Cada una de estas secuencias y sus anotaciones en las bases de datos públicas es accesible a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI).

[0039] La uricasa se puede truncar por 6 aminoácidos en su extremo amino.

[0040] En una realización particular, la proteína de uricasa comprende la secuencia de aminoácido de la posición 8 a la posición 287 de la secuencia de aminoácidos de Pig-KS-AN (SEQ ID NO. 7).

[0041] En otra realización, la proteína de uricasa comprende la secuencia de aminoácido de la posición 44 a la posición 56 de Pig-KS-AN (SEQ ID NO. 14). Esta región de uricasa tiene homología con secuencias dentro del dominio de pliegue túnel (pliegue T) de uricasa, y tiene dentro de él una mutación en la posición 46 con respecto a la secuencia de uricasa de cerdo nativa. Sorprendentemente, esta mutación no altera significativamente la actividad de uricasa de la proteína.

[0042] Los aminoácidos en o alrededor de cualquiera de los aminoácidos 7, 46, y 291, y 301 de arco mutado.

[0043] La proteína puede ser codificada por un ácido nucleico que codifica una metionina N-terminal. Preferiblemente, la metionina N-terminal va seguida de un codón que permite la eliminación de esta metionina N-terminal por la metionina aminopeptidasa bacteriana (MAP). (Ben-Bassat y Bauer (1987) Nature 326: 315). Los aminoácidos que permiten la eliminación más completa de la metionina N-terminal son alanina, glicina, prolina, serina y treonina.

[0044] En una realización de la invención, los aminoácidos en las posiciones 7 y 46 están sustituidos por treonina. Sorprendentemente, la actividad enzimática de las uricasas truncadas preparadas con estas mutaciones es similar a la de la enzima no truncada. En una realización adicional de la invención, las mutaciones de aminoácidos comprenden treonina, treonina, lisina y serina, en las posiciones 7, 46, 291 y 301, respectivamente.

[0045] Las uricasas de mamíferos truncadas según la invención pueden comprender además una metionina en el extremo amino. El penúltimo aminoácido puede ser uno que permita la eliminación de la metionina N-terminal por la metionina aminopeptidasa bacteriana (MAP). Los aminoácidos que permiten la eliminación más completa de la metionina N-terminal son alanina, glicina, prolina, serina y treonina. La uricasa puede comprender dos aminoácidos amino terminales, en los que los dos aminoácidos amino terminales son una metionina seguida de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina, glicina, prolina, serina y treonina.

[0046] La uricasa es una uricasa de mamíferos.

[0047] En una realización de la invención, la uricasa es una uricasa quimérica de dos o más uricasas de mamífero.

[0048] En una realización de la invención, las uricasas de mamíferos se seleccionan entre uricasa porcina o de hígado de babuino.

[0049] En una realización de la invención, la uricasa comprende la secuencia de SEQ ID NO. 8.

[0050] La presente invención proporciona uricasa que codifica ácidos nucleicos que comprenden la secuencia de SEQ ID NO. 10.

[0051] La presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica la uricasa.

[0052] La presente invención proporciona un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico.

[0053] En una realización particular, se aísla la uricasa. La uricasa se puede purificar. La uricasa se puede aislar y purificar.

[0054] La presente invención proporciona una célula huésped que comprende un vector.

[0055] Un método para producir la secuencia de ácido nucleico, puede comprender modificación por técnicas de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de una secuencia de ácido nucleico que codifica una reacción de uricasa no truncada). Un experto en la técnica sabe que una secuencia de ácido nucleico deseada se prepara mediante PCR mediante cebadores oligonucleotídicos sintéticos, que son complementarios a las regiones del ADN diana (una para cada hebra) a amplificar. Los cebadores se añaden al ADN diana (que no necesita ser puro), en presencia de un exceso de desoxinucleótidos y Taq polimerasa, una polimerasa de ADN termoestable. En una serie (típicamente 30) de ciclos de temperatura, el ADN diana se desnaturaliza repetidamente (alrededor de 90°C), se hibrida con los cebadores (típicamente a 50-60°C) y una hebra hija se extiende desde los cebadores (72°C). Dado que las propias cadenas hijas actúan como plantillas para los ciclos posteriores, los fragmentos de ADN que coinciden con ambos cebadores se amplifican exponencialmente, en lugar de linealmente.

[0056] Un método para producir una uricasa, tal como se define en las reivindicaciones, puede comprender la transfección de una célula huésped con el vector, en donde la célula huésped expresa la uricasa, el aislamiento de la uricasa recombinante mutante de la célula huésped, aislar la uricasa recombinante mutante purificada utilizando, por ejemplo, técnicas cromatográficas y purificando la uricasa recombinante mutante. Por ejemplo, la uricasa se puede preparar según los métodos descritos en la publicación de patente internacional WO 00/08196.

[0057] La uricasa puede aislarse y/o purificarse mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica. Los polipéptidos expresados de esta invención generalmente se aíslan en forma sustancialmente pura. Preferiblemente, los polipéptidos se aíslan a una pureza de al menos 80% en peso, más preferiblemente a una pureza de al menos 95% en peso y lo más preferiblemente a una pureza de al menos 99% en peso. En general, tal purificación se puede lograr usando, por ejemplo, las técnicas estándar de fraccionamiento con sulfato de amonio, electroforesis SDS pAg E y cromatografía de afinidad. La uricasa se aísla preferiblemente usando un tensioactivo catiónico, por ejemplo, cloruro de cetilpiridinio (CPC) de acuerdo con el método descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos en trámite presentada el 11 de abril de 2005 con la solicitud n° 60/670,520 y número de expediente del abogado 103864.146644, titulado Purification Of Proteins With Cationic Surfactant.

[0058] En una realización preferida, la célula huésped es tratada con el fin de causar la expresión de la uricasa como se define en las reivindicaciones. Un experto en la técnica sabe que la transfección de células con un vector se logra normalmente usando ADN precipitado con iones de calcio, aunque se pueden usar una variedad de otros métodos (por ejemplo, electroporación).

[0059] En una realización de la invención, el vector está bajo el control de un promotor sensible a la presión osmótica. Un promotor es una región de ADN a la que se une la polimerasa de ARN antes de iniciar la transcripción del ADN en ARN. Un promotor osmótico sensible a la presión inicia la transcripción como resultado del aumento de la presión osmótica detectada por la célula.

[0060] En una realización de la invención, el promotor es un promotor osmB modificado.

[0061] La uricasa de la invención es una uricasa conjugada con un polímero.

[0062] En una realización de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende la uricasa. La composición puede ser una solución de uricasa. La solución puede ser estéril y apta para inyección. Tal composición puede comprender uricasa como una solución en solución salina tamponada con fosfato. La composición se puede proporcionar en un vial, que opcionalmente tiene un tapón de inyección de caucho. La composición puede comprender uricasa en solución a una concentración de 2 a 16 miligramos de uricasa por mililitro de solución, de 4 a 12 miligramos por mililitro o de 6 a 10 miligramos por mililitro. En una realización preferida, la composición comprende uricasa a una concentración de 8 miligramos por mililitro. Preferiblemente, la masa de uricasa se mide con respecto a la masa de proteína.

[0063] Los regímenes de administración eficaces de las composiciones de la invención pueden ser determinados por un experto en la técnica. Los expertos en la técnica conocen indicadores adecuados para evaluar la eficacia de un régimen dado. Ejemplos de dichos indicadores incluyen la normalización o disminución de los niveles de ácido úrico en plasma (PUA) y la disminución o mantenimiento de PUA a 6,8 mg/dL o menos, preferiblemente 6 mg/dL o menos. En una realización preferida, el sujeto que está siendo tratado con la composición de la invención tiene un PUA de 6 mg/ml o menos durante al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% del período total de tratamiento. Por ejemplo, durante un período de tratamiento de 24 semanas, el sujeto preferiblemente tiene un PUA de 6 mg/ml o menos durante al menos el 80% del período de tratamiento de 24 semanas, es decir, durante al menos un tiempo igual a la cantidad de tiempo en 134,4 días (24 semanas x 7 días/semana x 0,8 = 134,4 días).

[0064] 0,5 a 24 mg de uricasa en solución se puede administrar una vez cada 2 a 4 semanas. La uricasa puede administrarse de cualquier forma apropiada conocida por un experto en la técnica, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Preferiblemente, cuando la administración es intravenosa, se administran de 0,5 mg a 12 mg de uricasa. Preferiblemente, cuando la administración es subcutánea, se administran de 4 a 24 mg de uricasa. La uricasa puede administrarse mediante infusión intravenosa durante un período de 30 a 240 minutos. En una realización, se administran 8 mg de uricasa una vez cada dos semanas. La infusión se puede realizar con 100 a 500 ml de solución salina. Se pueden administrar 8 mg de uricasa en solución durante un período de 120 minutos una vez cada 2 semanas o una vez cada 4 semanas; preferiblemente la uricasa se disuelve en 250 mL de solución salina para perfusión. Las administraciones de uricasa pueden tener lugar durante un período de tratamiento de 3 meses, 6 meses, 8 meses o 12 meses. El período de tratamiento puede ser de 12 semanas, 24 semanas, 36 semanas o 48 semanas. El período de tratamiento puede ser durante un período de tiempo prolongado, por ejemplo, 2 años o más, hasta la vida del sujeto que está siendo tratado. Además, se pueden utilizar períodos de tratamiento múltiples intercalados con tiempos sin tratamiento, por ejemplo, 6 meses de tratamiento seguidos de 3 meses sin tratamiento, seguidos de 6 meses adicionales de tratamiento, etc.

[0065] En ciertas realizaciones, los compuestos anti-inflamatorios se pueden administrar profilácticamente para eliminar o reducir la aparición de reacciones a la perfusión debido a la administración de uricasa. En una realización, se administran así al menos un corticosteroide, al menos un antihistamínico, al menos un AINE o combinaciones de los mismos. Los corticosteroides útiles incluyen betametasona, budesonida, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona y triamcinolona. Los AINE útiles incluyen ibuprofeno, indometacina, naproxeno, aspirina, acetaminofén, celecoxib y valdecoxib. Los antihistamínicos útiles incluyen azatadina, bromfeniramina, cetirizina, clorfeniramina, clemastina, ciproheptadina, desloratadina, dexclorfeniramina, dimenhidrinato, difenhidramina, doxilamina, fexofenadina, hidroxizina, loratadina y fenindamina.

[0066] El antihistamínico puede ser fexofenadina, el AINE puede ser acetaminofeno y el corticosteroide puede ser hidrocortisona y/o prednisona. Preferiblemente, se administra una combinación de los tres (no necesariamente de forma concomitante) antes de la infusión de la solución de uricasa. El AINE y el antihistamínico se pueden administrar por vía oral de 1 a 4 horas antes de la infusión de uricasa. Una dosis adecuada de fexofenadina incluye aproximadamente 30 a aproximadamente 180 mg, aproximadamente 40 a aproximadamente 150 mg, aproximadamente 50 a aproximadamente 120 mg, aproximadamente 60 a aproximadamente 90 mg, aproximadamente 60 mg, preferiblemente 60 mg. Una dosis adecuada de acetaminofén incluye aproximadamente 500 a aproximadamente 1500 mg, aproximadamente 700 a aproximadamente 1200 mg, aproximadamente 800 a aproximadamente 1100 mg, aproximadamente 1000 mg, preferiblemente 1000 mg. Una dosis adecuada de hidrocortisona incluye aproximadamente 100 a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 150 a aproximadamente 300 mg, aproximadamente 200 mg, preferiblemente 200 mg. En una realización, el antihistamínico no es difenhidramina. En otra realización, el AINE no es acetaminofén. Se pueden administrar 60 mg de fexofenadina por vía oral la noche anterior a la infusión de uricasa; se pueden administrar 60 mg de fexofenadina y 1000 mg de acetaminofeno por vía oral a la mañana siguiente y, finalmente, se pueden administrar 200 mg de hidrocortisona justo antes de la infusión de la solución de uricasa. La prednisona se puede administrar durante el día, preferiblemente por la noche, antes de la administración de uricasa. Una dosis apropiada de prednisona incluye de 5 a 50 mg, preferiblemente 20 mg. Estos tratamientos profilácticos para eliminar o reducir la aparición de reacciones de infusión se utilizan para sujetos que reciben o están a punto de recibir uricasa, incluyendo uricasa PEGilada y uricasa no PEGilada. En realizaciones particulares, estos tratamientos profilácticos se utilizan para sujetos que reciben o están a punto de recibir péptidos terapéuticos, en los que los péptidos terapéuticos están PEGilados.

[0067] La composición farmacéutica comprende una uricasa, como se define en las reivindicaciones, que se ha modificado por conjugación con un polímero, y la uricasa modificada retiene la actividad uricolítica. Los conjugados de polímerouricasa se pueden preparar como se describe en la Publicación de Patente Internacional N° WO 01/59078 y la Solicitud de EE.UU. N° 09/501730.

[0068] En una realización de la invención, el polímero es polietilenglicol.

[0069] En una realización de la invención, la composición comprende 2-12 moléculas de polímero en cada subunidad de uricasa, preferiblemente 3 a 10 moléculas de polímero por subunidad de uricasa.

[0070] Cada molécula de polímero puede tener un peso molecular entre aproximadamente 1 kD y aproximadamente 100 kD.

[0071] Cada molécula de polímero puede tener un peso molecular entre aproximadamente 1 kD y aproximadamente 50 kD. En una realización preferida de la invención, cada molécula de polímero tiene un peso molecular de entre aproximadamente 5 kD y aproximadamente 20 kD, aproximadamente 8 kD y aproximadamente 15 kD, aproximadamente 10 kD y 12 kD, preferiblemente aproximadamente 10 kD. En una realización preferida, cada molécula de polímero tiene un peso molecular de aproximadamente 5 kD o aproximadamente 20 kD. En una realización especialmente preferida de la invención, cada molécula de polímero tiene un peso molecular de 10 kD. También se contemplan mezclas de moléculas de diferente peso. La composición es adecuada para la administración repetida de la composición.

[0072] La conjugación de la uricasa con el polímero puede comprender enlaces seleccionados del grupo que consiste en enlaces uretano, enlaces de amina secundarios y enlaces amida.

[0073] La presente invención proporciona un medio para metabolizar el ácido úrico utilizando la uricasa.

[0074] La presente invención proporciona un uso de una composición de la uricasa como se define en las reivindicaciones para reducir niveles de ácido úrico en un fluido biológico.

[0075] En una realización de la invención, la composición de uricasa se utiliza para reducir el ácido úrico en un fluido biológico que comprende sangre.

[0076] También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos novedosos de uricasa de la invención. Las manipulaciones que dan como resultado su producción son bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico de uricasa pueden modificarse mediante cualquiera de las numerosas estrategias conocidas en la técnica (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). La secuencia se puede escindir en sitios apropiados con endonucleasa(s) de restricción, seguido de una modificación enzimática adicional si se desea, aislar y ligar in vitro. En la producción del gen que codifica una uricasa, se debe tener cuidado para asegurar que el gen modificado permanezca dentro del marco de lectura de traducción apropiado, ininterrumpido por señales de parada de traducción. Además, la secuencia de ácido nucleico que codifica la uricasa se puede mutar in vitro o in vivo, para crear y/o destruir secuencias de traducción, iniciación y/o terminación, o para crear variaciones en las regiones codificantes y/o formar nuevos sitios de restricción de endonucleasas o destruir los preexistentes, para facilitar una mayor modificación in vitro. Se puede usar cualquier técnica para mutagénesis conocida en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, mutagénesis dirigida al sitio in vitro (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem 253: 6551), uso de enlazadores TAB® (Pharmacia), etc.

[0077] La secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de uricasa puede ser insertada en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de la proteína insertada. Puede utilizarse una variedad de sistemas huésped-vector para expresar la secuencia que codifica la proteína. Estos incluyen, pero no se limitan a sistemas de células de mamíferos infectados con virus (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas de células de insectos infectados con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levadura, o bacterias transformadas con ADN de bacteriófago, ADN plasmídico o ADN cósmido. Los elementos de expresión de estos vectores varían en sus fortalezas y especificidades. Dependiendo del sistema huésped-vector utilizado, se puede usar cualquiera de varios elementos de transcripción y traducción adecuados.

[0078] Cualquiera de los métodos conocidos para la inserción de fragmentos de ADN en un vector puede usarse para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que consiste de señales de control apropiadas transcripcionales/traduccionales y la proteína de las secuencias de codificación. Estos métodos pueden incluir ADN recombinante in vitro y técnicas sintéticas y recombinaciones in vivo (recombinación genética). La expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de uricasa puede regularse mediante una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que la proteína de uricasa se exprese en un hospedador transformado con la molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de uricasa puede controlarse mediante cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica. Los promotores que pueden ser utilizados para controlar la expresión uricasa incluyen, pero no se limitan a la región del promotor temprano de SV40.

[0079] (Bernoist y Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787-797), el promotor de timidina quinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 78:144-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotionina (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de p-lactamasa (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. Uu.75: 3727-3731), el promotor tac (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 80: 21-25), y el promotor osmB. En realizaciones particulares, el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la uricasa unida operativamente a un promotor heterólogo.

[0080] Una vez que se prepara una molécula de ADN recombinante particular que comprende una codificación de secuencia de ácido nucleico aislado, varios métodos conocidos en la técnica pueden usarse para propagarla. Una vez que se establecen un sistema huésped y condiciones de crecimiento adecuados, los vectores de expresión recombinantes se pueden propagar y preparar en cantidad. Como se explicó anteriormente, los vectores de expresión que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a los siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales tales como virus vaccinia o adenovirus; virus de insectos tales como baculovirus; vectores de levadura; vectores de bacteriófagos (por ejemplo, lambda) y vectores de ADN de plásmidos y cósmidos, por nombrar solo algunos.

[0081] Además, una cepa de célula huésped se puede escoger que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico en la forma específica deseada. La expresión de ciertos promotores puede elevarse en presencia de ciertos inductores; por tanto, se puede controlar la expresión de la proteína de uricasa modificada genéticamente. Además, diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación traduccional y postraduccional (por ejemplo, glicosilación, escisión) de proteínas. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento deseados de la proteína extraña expresada. Diferentes sistemas de expresión de vector/huésped pueden efectuar reacciones de procesamiento tales como escisiones proteolíticas en diferentes grados.

[0082] En realizaciones particulares de la invención, la expresión de uricasa en E. coli se realiza preferiblemente utilizando vectores que comprenden el promotor osmB.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Construcción de genes y expresión de plásmido para expresión de uricasa

[0083] Uricasa porcina recombinante (urato oxidasa), Pig-KS-AN (aminoácidos de sustitución de proteína de uricasa de cerdo truncado con terminal de amino 291 y 301 con lisina y serina, respectivamente) se expresó en cepa E. coli K-12 W3110 F-. Se construyó una serie de plásmidos que culminaron en pOUR-P-AN-ks-1, que tras la transformación de las células huésped de E. coli fue capaz de dirigir la expresión eficaz de uricasa.

Aislamiento y subclonación de uricasa de ADNc a partir del hígado de cerdo y babuinos

[0084] ADNc de uricasa se prepararon a partir de hígados de cerdos y de babuino por el aislamiento y subclonación del ARN correspondiente. El ARN celular total se extrajo de hígados de cerdo y babuino (Erlich, HA (1989). PCR Technology; Principles and Application for DNA Amplification; Sambrook, J., et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición; Ausubel, FM et al. (1998). Current protocols in molecular Biology), luego se transcriben de forma inversa utilizando el First-Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia Biotech). La amplificación por PCR se realizó utilizando polimerasa de ADN Taq (Gibco BRL, Life Technologies).

[0085] Los cebadores de oligonucleótidos sintéticos utilizados para la amplificación por PCR de oxidasas de urato de cerdo y babuinos (uricasa) se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Cebadores para la amplificación por PCR del ADNc de uricasa

[0086] Las secuencias de enzimas de restricción, introducidas en los extremos de los cebadores y mostrados en minúsculas en la Tabla 1, fueron EcoRI y NcoI sentido (cerdo y babuino) y NcoI antisentido, HindlII y Xbal (cerdo), Xbal y NcoI (babuino). En el cebador sentido de babuino, el tercer codón GAC (ácido aspártico) presente en la uricasa de babuino se reemplazó por CAC (histidina), el codón que está presente en esta posición en la secuencia codificante del pseudogén de urato oxidasa humana. La construcción de uricasa de babuino recombinante generada usando estos cebadores se denomina Uricasa de babuino D3H.

[0087] El producto de PCR de uricasa de cerdo se digirió con EcoRI y HindlII y se clonó en pUC18 para crear pUC18 -uricasa de cerdo. El producto de PCR D3H Baboon Uricase se clonó directamente en el vector pCR™ II, usando TA Cloning™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), creando pCR™ II-D3H Baboon Uricase.

[0088] ADNc ligados se utilizaron para transformar cepa E. coli XL1-Blue (Stratagene, La Jolla, CA). Se preparó ADN plasmídico que contenía ADNc de uricasa clonado, y se seleccionaron y aislaron los clones que poseen las secuencias codificantes de ADN de uricasa publicadas (excepto la sustitución D3H en la uricasa de babuino, que se muestra en la Tabla 1). En el clon pCR™ II - D3H Baboon Uricase elegido, las secuencias de pCR™ II estaban próximas al codón de terminación de uricasa, como resultado de la deleción de secuencias introducidas por PCR. Como consecuencia, se eliminaron los sitios de restricción XbaI y NcoI de la región no traducida 3', permitiendo así la clonación direccional usando NcoI en el extremo 5' del producto de PCR y BamHI que se deriva del vector pCR™ II.

Subclonación de uricasa ADNc en vectores de expresión pET

Subclonación de uricasa de babuino

[0089] El ADNc de babuino D3H que contiene secuencia de codificación de uricasa de longitud completa se introdujo en el vector de expresión pET-3d (Novagen, Madison, WI), el pCR™ II - D3H Baboon Uricase se digirió con Ncol y BamHI, y se aisló el fragmento de 960 pb. El plásmido de expresión pET-3d se digirió con Ncol y BamHI y se aisló el fragmento de 4600 pb. Los dos fragmentos se ligaron para crear pET-3d-D3H-Baboon.

Subclonación de uricasa de quimera de cerdo-babuino

[0090] Se construyó uricasa de quimera (PBC) de cerdo-babuino (PBC) con el fin de obtener una mayor expresión, estabilidad y actividad del gen recombinante. PBC se construyó aislando el fragmento NcoI-ApaI de 4936 pb del clon pET-3d-D3H-Baboon y ligando el fragmento aislado con el fragmento NcoI-ApaI de 624 pb aislado de uricasa de cerdo pUC18, lo que resultó en la formación de pET-3d-PBC. El ADNc de uricasa de PBC consta de los codones 1-225 de uricasa de cerdo unidos en marco a los codones 226-304 de uricasa de babuino.

Subclonación uricasa cerdo-KS

[0091] Uricasa de cerdo-KS se construyó con el fin de añadir un residuo de lisina, que puede proporcionar un sitio de PEGilación adicional. KS se refiere al inserto de aminoácido de lisina en uricasa de cerdo, en la posición 291, en lugar de arginina (R291K). Además, la treonina en la posición 301 se reemplazó con serina (T301S). El plásmido uricasa de cerdo-KS se construyó aislando el fragmento NcoI-NdeI de 4696 pb de pET-3d-D3H-babuino, y luego se ligó con el fragmento NcoI-NdeI de 864 pb aislado de uricasa de cerdo pUC18, dando como resultado la formación de uricasa de cerdo pET-3d. La secuencia de uricasa PigKS resultante consiste en los codones 1-288 de uricasa de cerdo unidos en marco a los codones 289-304 de uricasa de babuino.

Subclonación de secuencia de uricasa bajo la regulación del promotor de osmB

[0092] El gen de la uricasa se subclonó en un vector de expresión que contiene el promotor osmB (siguiendo las enseñanzas de la Patente de los Estados Unidos N° 5.795.776, incorporada aquí como referencia en su totalidad). Este vector permitió la inducción de la expresión de proteínas en respuesta a una presión osmótica elevada o al envejecimiento del cultivo. El plásmido de expresión pMFOA-18 contenía el promotor osmB, una secuencia del sitio de unión al ribosoma (rbs) y una secuencia del terminador de la transcripción (ter). Confiere resistencia a la ampicilina (AmpR) y expresa la esterasa de acetilcolina humana recombinante (AChE).

Subclonación de uricasa de babuino D3H

[0093] Se digirió el plásmido pMFOA-18 con NcoI y BamHI, y se aisló el fragmento grande. La construcción pET-3d-D3H-babuino se digirió con NcoI y BamHI y se aisló el fragmento de 960 pb, que incluía el gen de uricasa de babuino D3H. Estos dos fragmentos se ligaron para crear pMFOU18.

[0094] El plásmido de expresión pMFXT133 contenía el promotor osmB, un RBS (E. coli deo operón), ter (E. coli TrypA), el polipéptido inhibidor de factor Xa recombinante (FXaI), y confirió el gen de resistencia a tetraciclina (TetR). El gen de la uricasa de babuino se insertó en este plásmido para intercambiar los genes de resistencia a los antibióticos. El plásmido pMFOU18 se digirió con Ncol, se rellenó, luego se digirió con XhoI y se aisló un fragmento de 1030 pb. El plásmido pMFXT133 se digirió con Ndel, se rellenó, luego se digirió con Xhol y se aisló el fragmento grande. Los dos fragmentos se ligaron para crear el vector de expresión de uricasa de babuino, pURBA16.

Subclonación de uricasa de quimera de babuino de cerdo

[0095] El plásmido pURBA16 se digirió con Apal y AlwNI, y se aisló el fragmento de 2320 pb. El plásmido pMFXTI 33 se digirió con NdeI, se rellenó, luego se digirió con AlwNI y se aisló el fragmento de 620 pb. La construcción pET-3d-PBC se digirió con Xbal, se rellenó, luego se digirió con ApaI y se aisló el fragmento de 710 pb. Los tres fragmentos se ligaron para crear pUR-PB, un plásmido que expresaba uricasa de PBC bajo el control del promotor osmB y rbs, así como el T7 rbs, que se derivó del vector pET-3d.

[0096] El rbs T7 se escindió en un paso adicional. El pUR-PB se digirió con Ncol, se rellenó, luego se digirió con AlwNI y se aisló el fragmento de 3000 pb. El plásmido pMFXT133 se digirió con NdeI, se rellenó y luego se digirió con AlwNI, y se aisló el fragmento de 620 pb. Los dos fragmentos se ligaron para formar pDUR-PB, que expresa PBC bajo el control del promotor osmB.

Construcción de pOUR-PB-ANC

[0097] Varios cambios se introdujeron en el ADNc de uricasa, que resultó en un aumento sustancial en la estabilidad de la enzima recombinante. Se construyó el plásmido pOUR-PBC-ANC, en donde se eliminaron el péptido de maduración de seis residuos N-terminal y el tripéptido en el C-terminal, que funcionan in vivo como señal de dirección peroxisomal. Esto se llevó a cabo utilizando la secuencia de PBC en el plásmido pDUR-PB y los cebadores de oligonucleótidos específicos enumerados en la Tabla 2, utilizando amplificación por PCR.

Tabla 2. Cebadores para amplificación por PCR de uricasa PBC-ANC

[0098] Las secuencias de enzimas de restricción introducidas en los extremos de los cebadores que se muestran en negrita y las regiones no codificantes se muestran en minúsculas en la Tabla 2. NdeI es de sentido y XbaI es anti-sentido. El cebador antisentido también se usó para eliminar un sitio de restricción interno Ndel introduciendo una mutación puntual (subrayada) que no afectó a la secuencia de aminoácidos y, por tanto, facilitó la subclonación usando NdeI.

[0099] El fragmento de 900 pares de bases generado mediante amplificación por PCR de pDUR-PB se escindió con NdeI y XbaI y aislado. A continuación, el fragmento obtenido se insertó en un plásmido de desoexpresión pDBAST-RAT-N, que alberga el promotor deo-P1P2 y rbs derivado de E. coli y expresa constitutivamente el precursor de insulina recombinante humana. El plásmido se digirió con NdeI y XbaI y el fragmento de 4035 pb se aisló y se ligó al producto de PCR de PBC-uricasa. La construcción resultante, pDUR-PB-ANC, se utilizó para transformar E. coli K-12 S⁹⁷³³ (F-cytR strA) que expresaba el alto nivel de uricasa truncada activa.

[0100] La secuencia de PBC-ANC doblemente truncada también se expresó bajo el control del promotor osmB. El plásmido pDUR-PB-ANC se digirió con AlwNI-NdeI y se aisló el fragmento de 3459 pb. El plásmido pMFXT133, descrito anteriormente, se digirió con NdeI - AlwNI y se aisló el fragmento de 660 pb. Los fragmentos fueron entonces ligados para crear Pour-PB-ANC, que se introdujo en la cepa E. coli K-12 W3110 F- y expresaron alto nivel de uricasa truncada activa.

Construcción de plásmido de expresión de uricasa Pour-P-AN-KS-1

[0101] Este plásmido se construyó con el fin de mejorar la actividad y la estabilidad de la enzima recombinante. La uricasa de cerdo KS-AN se truncó en el extremo N solamente (AN), donde se eliminó el péptido de maduración N-terminal de seis residuos, y contenía las mutaciones S46T, R291K y T301S. En la posición 46, había un residuo de treonina en lugar de serina debido a una mutación conservadora que se produjo durante la amplificación y clonación por PCR. En la posición 291, la lisina reemplazó a la arginina y en la posición 301, se insertó serina en lugar de treonina. Ambos se derivaron de la secuencia de uricasa de babuino. Las modificaciones de R291K y T301S se denominan KS y se comentan anteriormente. El residuo de lisina adicional proporcionó un sitio de PEGilación potencial adicional.

[0102] Para construir pOUR-P-AN-ks-1 (Figura 1), el plásmido pOUR-PB-ANC se digirió con ApaI - XbaI, y se aisló el fragmento de 3873 pb. El plásmido pET-3d-PKS (construcción mostrada en la Figura 4) se digirió con ApaI - Spel y se aisló el fragmento de 270 pb. La escisión de SpeI dejó una extensión de CTAG en 5' que se ligó eficazmente a los fragmentos de ADN generados por XbaI. Los dos fragmentos se ligaron para crear pOUR-P-AN-ks-1. Después de la ligación, se perdieron los sitios de reconocimiento de SpeI y XbaI (su sitio se muestra entre paréntesis en la Figura 9). La construcción pOUR-P-AN-ks-1 se introdujo en cepa E. coli K-12 W3110 F-, prototrófica, ATCC # 27325. La uricasa de cerdo KS-AN resultante, expresada bajo el control del promotor osmB, produjo altos niveles de enzima recombinante que tiene una actividad y estabilidad superiores.

[0103] La Figura 1 ilustra la estructura del plásmido pOUR-P-AN-ks-1. Los números junto a los sitios de restricción indican la posición de los nucleótidos, con respecto al sitio HaeII, designado como 1; los sitios de restricción que se perdieron durante la clonación están marcados entre paréntesis. El plásmido pOUR-P-AN-ks-1, que codifica uricasa de Pig-KS-AN tiene 4143 pares de bases (pb) de longitud y comprende los siguientes elementos:

1. Un fragmento de ADN, 113 pb de longitud, que abarca desde el nucleótido número 1 hasta Sitio Ndel (en la posición 113), que incluye el promotor osmB y el sitio de unión al ribosoma (rbs).

2. Un fragmento de ADN, de 932 pb de longitud, que se extiende desde Ndel (en la posición 113) hasta la unión Spel/Xbal (en la posición 1045), que incluye: 900 pb de región codificante Pig-KS-AN (secuencia de ácido nucleico del extremo amino truncado de cerdo proteína de uricasa en donde los aminoácidos 291 y 301 con lisina y serina, respectivamente, se reemplazan) y secuencia flanqueante de 32 pb derivada de pCR™ II, desde el sitio de clonación TA cadena arriba del sitio de restricción Spel/Xbal.

3. Una secuencia de sitios de clonación múltiple (MCS) de 25 pb desde la unión Spel/Xbal (en la posición 1045) a Hindlll (en la posición 1070).

4. Un oligonucleótido sintético de 40 pb que contiene el terminador (ter) de la transcripción TrpA con extremos Hindlll (en la posición 1070) y Aatll (en la posición 1110).

5. Un fragmento de ADN, de 1519 pb de longitud, que abarca desde los sitios Aatll (en la posición 1110) hasta los sitios Mscl/Scal (en la posición 2629) en pBR322 que incluye el gen de resistencia a la tetraciclina (TetR).

6. Un fragmento de ADN, de 1514 pb de longitud, que se extiende desde los sitios Scal (en la posición 2629) hasta los sitios Haell (en la posición 4143) en pBR322 que incluye el origen de la replicación del ADN.

[0104] La Figura 2 muestra el ADN y las secuencias de aminoácidos deducidas de uricasa de cerdo KS-AN. En esta figura, la numeración de aminoácidos está de acuerdo con la secuencia completa de uricasa de cerdo. Después del residuo de metionina iniciador, se insertó una treonina en lugar del ácido aspártico de la secuencia de uricasa de cerdo. Este residuo de treonina permitió la eliminación de metionina por la aminopeptidasa bacteriana. El espacio en la secuencia de aminoácidos ilustra el péptido de maduración N-terminal eliminado. Se indican los sitios de restricción que se usaron para las diversas etapas de subclonación de las diferentes secuencias de uricasa (Apal, Ndel, BamHl, EcoRl y Spel). La secuencia 3' sin traducir, que se muestra en letras minúsculas, se derivó de la secuencia pCR™ ll. El codón de terminación de la traducción se indica con un asterisco.

[0105] La Figura 3 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las diversas secuencias de uricasa recombinantes. La línea superior representa la uricasa de cerdo, que incluía la secuencia completa de aminoácidos. La segunda línea es la secuencia de la quimera uricasa de cerdo-babuino doblemente truncada (PBC-ANC). La tercera línea muestra la secuencia de uricasa de cerdo KS-AN, que solo está truncada en el extremo N-terminal y contenía las mutaciones S46T y los cambios de aminoácidos R291K y T301S, ambos reflejando el origen babuino del extremo carboxi terminal de la secuencia de codificación de uricasa. Los asteriscos indican las posiciones en las que hay diferencias de aminoácidos en cerdo KS-AN en comparación con la secuencia de uricasa de cerdo publicada; los círculos indican posiciones en las que hay diferencias de aminoácidos en cerdo KS-AN en comparación con PBC-AN, la quimera cerdobabuino; y las líneas discontinuas indican la deleción de aminoácidos.

[0106] ADNc para uricasa nativa de babuino, cerdo y conejo con la mutación Y97H, y la quimera de cerdo/babuino (PBC) se construyó para la clonación en E.coli. Se construyeron y seleccionaron clones que expresan altos niveles de las variantes de uricasa de manera que todos sean W3110 F- E. coli, y la expresión esté regulada por osmB. Se aislaron los ADN plasmídicos, se verificaron mediante secuenciación de ADN y análisis de enzimas de restricción, y se cultivaron las células.

[0107] La construcción de las uricasas truncadas, incluyendo cerdo AN y cerdo KS-AN se realizó mediante ligación cruzada entre PBC-ANC y cerdo KS, después de la escisión con endonucleasas de restricción Apal y Xbal, y Apal más Spel., respectivamente. Es razonable que estos mutantes truncados retengan actividad, ya que los seis residuos N-terminales, el "péptido de maduración" (1-2) y el tri-péptido C-terminal, "señal de dirección peroxisomal" (3-5), no tienen funciones que afecten significativamente a la actividad enzimática, y es posible que estas secuencias sean inmunogénicas. Se seleccionaron clones que expresan niveles muy altos de variantes de uricasa.

Ejemplo 2. Transformación de la expresión de plásmido en una célula célula huésped bacteriana

[0108] El plásmido de expresión, pOUR-P-AN-KS-1, se introdujo en la cepa E. coli K-12 W3110 F-. Las células bacterianas se prepararon para la transformación que implicó el crecimiento hasta la fase logarítmica media en caldo Luria (LB), luego las células se recolectaron por centrifugación, se lavaron en agua fría y se suspendieron en glicerol al 10%, en agua, a una concentración de aproximadamente 3x1010 células por ml. Las células se almacenaron en alícuotas, a -70°C. El ADN plasmídico se precipitó en etanol y se disolvió en agua.

[0109] Las células bacterianas y ADN de plásmido se mezclaron, y la transformación se realizó por el método de electroporación de alto voltaje utilizando Gene Pulser ll de Bio-Rad (Trevors et al (1992). Electrotransformación de bacterias por ADN de plásmido, en la guía de la electroporación y de electrofusión (DC Chang, BM Chassy, JA Saunders y AE Sowers, eds.), Págs. 265-290, Academic Press Inc., San Diego, Hanahan y col. (1991) Meth. Enzymol., 204, 63­ 113). Las células transformadas se suspendieron en medio SOC (triptona al 2%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCh 10 mM, MgSO⁴10 mM, glucosa 20 mM), se incubaron a 37°C durante 1 hora y seleccionado por su resistencia a la tetraciclina. Se seleccionó un clon de alto expresador.

Ejemplo 3. Preparación de uricasa recombinante

[0110] Las bacterias como las transformadas (véase más arriba) se cultivaron en medio que contiene glucosa; el pH se mantuvo a 7,2 ± 0,2, aproximadamente a 37°C.

[0111] Hacia las últimas 5-6 horas de cultivo, el medio se complementó con KCl hasta una concentración final de 0,3M. Se continuó el cultivo para permitir la acumulación de uricasa.

[0112] La uricasa recombinante acumula dentro de las células bacterianas como un precipitado insoluble similar a los cuerpos de inclusión (IBs). La suspensión de células se lavó por centrifugación y se suspendió en tampón Tris 50 mM, pH 8,0 y EDTA 10 mM y se llevó a un volumen final de aproximadamente 40 veces el peso de las células secas.

[0113] Se aislaron IB recombinantes que contenían uneasa mediante centrifugación después de la rotura de las células bacterianas usando lisozima y alta presión. El tratamiento con lisozima (2000-3000 unidades/ml) se realizó durante 16-20 horas a pH 8,0 y 7 ± 3°C, mientras se mezclaba. El sedimento se lavó con agua y se almacenó a -20°C hasta su uso.

[0114] Los IBs enriquecidos se procesaron adicionalmente después de suspender en 50 mM de tampón NaHCO³, pH 10,3 ± 0,1. La suspensión se incubó durante la noche, a temperatura ambiente, para permitir la solubilización de la uricasa derivada de IB, y posteriormente se aclaró mediante centrifugación.

[0115] La uricasa se purificó adicionalmente mediante varias etapas de cromatografía. Inicialmente, la cromatografía se realizó en una columna Q-Sefarosa FF. La columna cargada se lavó con tampón de bicarbonato que contenía NaCl 150 mM y la uricasa se eluyó con tampón de bicarbonato, que contenía NaCl 250 mM. Luego, se utilizó resina de xantinaagarosa (Sigma) para eliminar impurezas menores de la preparación de uricasa. El eluato de Q-Sefarosa FF se diluyó con tampón de glicina 50 mM, pH 10,3 ± 0,1, hasta una concentración de proteína de aproximadamente 0,25 mg/ml y se cargó. La columna se lavó con bicarbonato de tampón, pH 10,3 ± 0,1, que contenía NaCl 100 mM, y la uricasa se eluyó con el mismo tampón suplementado con 60 pM de xantina. En esta etapa, la uricasa se volvió a purificar mediante cromatografía de Q-Sefarosa para eliminar las formas agregadas.

[0116] La pureza de cada preparación de uricasa es superior al 95%, según se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Se detectan menos del 0,5% de formas agregadas en cada preparación utilizando una columna Superdex 200.

[0117] La Tabla 3 resume la purificación de uricasa de cerdo KSAN de IB derivados de 25 l de caldo de fermentación.

Tabla 3. Purificación de la uricasa de cerdo KSAN

Ejemplo 4. Características de las uricasas recombinantes

SDS-PAGE

[0118] El análisis SDS-PAGE de las variantes de uricasa altamente purificadas (Figura 4) reveló un patrón bastante distintivo. Las muestras se almacenaron a 4°C, en tampón de carbonato, pH 10,3, durante varios meses. Las variantes de longitud completa, cerdo, cerdo KS y PBC, muestran la acumulación de dos productos de degradación principales que tienen pesos moleculares de aproximadamente 20 y 15 kD. Esta observación sugiere que al menos una muesca dividió la molécula de la subunidad de uricasa. Se detecta un patrón de degradación diferente en los clones acortados aminoterminales y también en la uricasa de conejo, pero en menor proporción. El extremo amino del conejo se parece al de los clones acortados. Se determinaron las secuencias amino terminales de los fragmentos de uricasa generados durante la purificación y el almacenamiento.

Secuenciación de péptido

[0119] La secuenciación N-terminal de preparaciones de uricasa a granel se realizó utilizando el método de degradación de Edman. Se realizaron diez ciclos. La uricasa de cerdo recombinante (clon de longitud completa) generó una mayor abundancia de fragmentos de degradación en comparación con cerdo KS-AN. Los sitios deducidos de escisión que conducen a los fragmentos de degradación son los siguientes:

1) Sitio principal en la posición 168 que tiene la secuencia:

--QSG | FEGFI--2) Sitio menor en la posición 142 que tiene la secuencia:

--IRN | GPPVI--

[0120] Las secuencias anteriores no sugieren ninguna escisión proteolítica conocida. Sin embargo, la escisión podría surgir de la proteólisis o de alguna reacción química. Las uricasas amino truncadas son sorprendentemente más estables que las uncasas truncadas no amino. PBC-ANC también tenía una estabilidad similar a las otras moléculas AN y menos que la PBC truncada no amino.

Potencia

[0121] La actividad de la uricasa se midió mediante un método UV. La velocidad de reacción enzimática se determinó midiendo la disminución de la absorbancia a 292 nm resultante de la oxidación del ácido úrico a alantoína. Una unidad de actividad se define como la cantidad de uricasa necesaria para oxidar un pmol de ácido úrico por minuto, a 25°C, en las condiciones especificadas. La potencia de la uricasa se expresa en unidades de actividad por mg de proteína (U/mg).

[0122] El coeficiente de extinción de ácido úrico 1 mM a 292 nm es 12,2 mM'1 cirr1. Por lo tanto, la oxidación de 1 pmol de ácido úrico por ml de mezcla de reacción dio como resultado una disminución de la absorbancia de 12,2 mA²⁹². El cambio de absorbancia con el tiempo (AA²⁹² por minuto) se derivó de la parte lineal de la curva.

[0123] La concentración de proteína se determinó usando un método de Bradford modificado (Macart y Gerbaut (1982) Clin Chim Acta 122: 93-101). La actividad específica (potencia) de la uricasa se calculó dividiendo la actividad en U/ml con la concentración de proteína en mg/ml. Los resultados de la actividad enzimática de las diversas uricasas recombinantes se resumen en la Tabla 4. Los resultados de las preparaciones comerciales se incluyen en esta tabla como valores de referencia. Es evidente a partir de estos resultados que el truncamiento de las proteínas de uricasa no tiene un efecto significativo sobre su actividad enzimática.

Tabla 4. Resumen de los parámetros cinéticos de las uricasas recombinantes y nativas

Ejemplo 5. Conjugación de uricasa con M-PEG (PEGilación)

[0124] Uricasa de cerdo KS-AN se conjugó usando m-PEG-NPC (monometoxi-poli(etilenglicol)-carbonato de nitrofenilo). Se establecieron las condiciones que dieron como resultado de 2 a 12 hebras de PEG de 5, 10 o 20 kD por subunidad de uricasa. Se añadió gradualmente m-PEGNPC a la solución de proteína. Una vez concluida la adición de PEG, la mezcla de reacción uricasa/m-PEG-NPC se incubó a 2-8°C durante 16-18 horas, hasta que las hebras de m-PEG no unidas máximas se conjugaron con uricasa.

[0125] El número de hebras de PEG por monómero PEG-uricasa se determinó por cromatografía de exclusión de Superose 6 de tamaño (SEC), utilizando PEG y las normas de uricasa. El número de hebras de PEG unidas por subunidad se determinó mediante la siguiente ecuación:

Hebras/subunidad 3,42 x Cantidad de PEG en muestra inyectada (pg)____________ PEG = Cantidad de proteína en la muestra inyectada (pg)

[0126] La concentración de PEG y restos de proteínas en la muestra de PEG-uricasa se determinó por exclusión de tamaño cromatografía (SEC) usando luz ultravioleta (UV) y detectores del índice de refracción (RI) dispuestos en serie (desarrollados por Kunitani, et al., 1991). Se generan tres curvas de calibración: una curva de proteína (absorción medida a 220 nm); una curva de proteína (medida por RI); y curva de PEG (medida por RI). Luego, las muestras de PEG-uricasa se analizaron usando el mismo sistema. Los valores resultantes del área de pico de UV y RI de las muestras experimentales se utilizaron para calcular las concentraciones de PEG y proteína en relación con las curvas de calibración. El índice de 3,42 es la relación entre el peso molecular del monómero de uricasa (34.192 Daltons) y el del PEG de 10 kD.

[0127] PEG enlazados mejoraron la solubilidad de uricasa en soluciones que tienen valores de pH fisiológicos. La Tabla 5 proporciona una indicación de la variabilidad entre lotes de producto PEGilado de uricasa de cerdo KS-AN. En general, existe una relación inversa entre el número de cadenas de PEG unidas y la actividad específica retenida (SA) de la enzima.

Tabla 5. Actividad enzimática de conjugados de uricasa de cerdo KS-AN pegilados

Ejemplo 6. PEGilación de uricasa con 1000 D y 100.000 D PEG

[0128] Se conjugó uricasa de cerdo KS-AN usando 1000 D y 100.000 D m-PEG-NPC como se describe en el Ejemplo 5. Condiciones que dan como resultado 2-11 hebras de PEG por subunidad de uricasa se utilizaron. Una vez concluida la adición de PEG, la mezcla de reacción uricasa/m-PEG-NPC se incubó a 2-8°C durante 16-18 horas, hasta que las hebras de m-PEG no unidas máximas se conjugaron con uricasa.

[0129] Se determinó el número de hebras de PEG por monómero PEG-uricasa como se describe anteriormente.

[0130] PEG enlazado mejoró la solubilidad de uricasa en soluciones que tienen valores de pH fisiológicos.

Ejemplo 7. Farmacocinética de cerdo-KS-AN uricasa conjugada con PEG

[0131] Experimentos biológicos se llevaron a cabo con el fin de determinar la extensión óptima y el tamaño de la PEGilación necesaria para proporcionar el beneficio terapéutico.

[0132] Los estudios farmacocinéticos en ratas, utilizando inyecciones i.v. de 0,4 mg (2U) por kg de peso corporal de uricasa no modificada, administradas en el día 1 y el día 8, proporcionaron una vida media circulante de aproximadamente 10 minutos. Sin embargo, los estudios de la tasa de aclaramiento en ratas con 2-1 1x10 kD uricasa PEG-Cerdo-KS-AN, después de hasta 9 inyecciones semanales, indicaron que el aclaramiento no dependía del número de hebras de PEG (dentro de este rango) y permaneció relativamente constante durante todo el período de estudio (ver Tabla 6; con una vida media de aproximadamente 30 horas). Las diferencias de una semana a otra están dentro del error experimental. Este mismo patrón es evidente después de nueve inyecciones de conjugados de PEG de 10x5 kD y PEG de 10x20 kD-uricasa. Los resultados indicaron que independientemente del grado de PEGilación de uricasa, en este rango, se observaron efectos biológicos similares en el modelo de rata.

Tabla 6. Vidas medias de preparaciones de uricasa de cerdo-KS-AN pegiladas en ratas

___ ___ ___ ___ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____

[0133] Notas de Tabla 6: Los resultados se indican en horas ± error estándar de la media. Los números entre paréntesis indican el número de animales probados.

[0134] Las ratas recibieron inyecciones i.v. semanales de 0,4 mg por kilogramo de peso corporal de uricasa de cerdo KS-An modificada como se indica en la tabla. Cada grupo comprendía inicialmente 15 ratas, que se desangraron alternativamente en subgrupos de 5. Varias ratas murieron durante el estudio debido a la anestesia. Las semividas se determinaron midiendo la actividad de la uricasa (ensayo colorimétrico) en muestras de plasma recogidas a los 5 minutos y a las 6, 24 y 48 horas después de la inyección.

[0135] La Tabla 5 describe los lotes de uricasa PEGilada usados en el estudio.

[0136] Los estudios de biodisponibilidad con 6x5 kD PEG-uricasa de cerdo KS-AN en conejos indican que, después de la primera inyección, la vida media de circulación es 98,2 ± 1,8 horas (i.v.), y la biodisponibilidad después de i.m. e inyecciones subcutánea (s.c.) fue del 71% y 52%, respectivamente. Sin embargo, se detectaron títulos de anticuerpos anti-uricasa significativos, después de las segundas inyecciones i.m. y s.c., en todos los conejos, y el aclaramiento se aceleró después de las inyecciones posteriores. Las inyecciones de ratas con el mismo conjugado dieron como resultado una vida media de 26 ± 1,6 horas (i.v.), y la biodisponibilidad después de las inyecciones i.m. y s.c. fue del 33% y 22%, respectivamente.

[0137] Los estudios en ratas, con uricasa 9x10 kD PEG-Pig-KS-AN indican que la vida media en circulación después de la primera inyección es de 42,4 horas (i.v.), y la biodisponibilidad, después de inyecciones i.m. y s.c., fue del 28,9% y 14,5%, respectivamente (ver Figura 5 y Tabla 7). Después de la cuarta inyección, la vida media de circulación era 32,1 ± 2,4 horas y la biodisponibilidad, después de la inyección i.m. y las inyecciones s.c. fueron 26,1% y 14,9%, respectivamente.

[0138] Estudios farmacocinéticos similares, en los conejos, con uricasa 9x10 kD PEG-Pig-KS-AN indican que no se observó aclaramiento acelerado tras la inyección de este conjugado (se administraron 4 inyecciones quincenales). En estos animales, la vida media en la circulación después de la primera inyección fue de 88,5 horas (i.v.) y la biodisponibilidad, después de las inyecciones i.m. y s.c., fue del 98,3% y 84,4%, respectivamente (ver Figura 6 y Tabla 7). Después de la cuarta inyección, la vida media de circulación era 141,1 ± 15,4 horas y la biodisponibilidad, después de las inyecciones i.m. y s.c. fue de 85% y 83%, respectivamente.

[0139] Los estudios similares con 9x10 kD PBG-Pig-KS-AN se realizaron para evaluar la biodisponibilidad en perros beagle (2 machos y 2 hembras en cada grupo). Se registró una semivida en circulación de 70 ± 11,7 horas después de la primera inyección i.v., y la biodisponibilidad, después de las inyecciones i.m. y s.c. fue del 69,5% y 50,4%, respectivamente (ver Figura 7 y Tabla 7).

[0140] Se realizaron estudios con preparaciones de PEG-Pig-KS-AN de 9x10 kD utilizando cerdos. Se utilizaron tres animales por grupo para la administración por vía iv, s.c. e i.m. Se registró una vida media en circulación de 178 ± 24 horas después de la primera inyección intravenosa, y la biodisponibilidad, después de las inyecciones i.m. y s.c. fue del 71,6% y el 76,8%, respectivamente (ver Figura 8 y Tabla 7).

Tabla 7. Estudios farmacocinéticos con 9x10 kD PEG-Pig-KS-AN uricasa

[0141] Se realizaron estudios de absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) después de la yodación de uricasa 9x10 kD PEGPig-KS-AN por método Bolton & Hunter con 125I. El conjugado marcado se inyectó en 7 grupos de 4 ratas cada uno (2 machos y 2 hembras). La distribución de la radiactividad se analizó después de 1 hora y cada 24 horas durante 7 días (excepto el día 5). Cada grupo, a su vez, fue sacrificado y los diferentes órganos fueron extirpados y analizados. El séptimo grupo se mantuvo en una jaula metabólica, de la que se recogieron la orina y las heces. La distribución del material en todo el cuerpo del animal se evaluó midiendo la radiactividad total en cada órgano y la fracción de recuentos (riñón, hígado, pulmón y bazo) que estaban disponibles para la precipitación con TCA (es decir, unida a proteínas, normalizada a la tamaño del órgano). De los órganos que fueron extirpados, ninguno tenía una radiactividad específica más alta que los demás, por lo que no se observó una acumulación significativa, por ejemplo, en el hígado o el riñón. 70% de la radiactividad se excretó por día 7.

Ejemplo 8. Resultados de los ensayos clínicos

[0142] Un estudio de grupo aleatorizado, abierto, multicéntrico, paralelo se realizó para evaluar la respuesta de urato, y perfiles farmacocinéticos y de seguridad de PEG-uricasa (Puricase®, Savient Pharmaceuticals) en pacientes humanos con hiperuricemia y gota grave que no respondían o eran intolerantes a la terapia convencional. La duración media de la enfermedad fue de 14 años y el 70 por ciento de la población del estudio tenía uno o más tofos.

[0143] En el estudio, 41 pacientes (edad media de 58,1 años) fueron asignados aleatoriamente a 12 semanas de tratamiento con PEG-uricasa intravenosa en uno de los cuatro regímenes de dosis: 4 mg cada dos semanas (7 pacientes); 8 mg cada dos semanas (8 pacientes); 8 mg cada cuatro semanas (13 pacientes); o 12 mg cada cuatro semanas (13 pacientes). Se midieron la actividad de la uricasa plasmática y los niveles de urato a intervalos definidos. Los parámetros farmacocinéticos, la concentración plasmática media de urato y el porcentaje de tiempo en que el urato plasmático fue menor o igual a 6 mg/dL se derivaron de los análisis de las actividades de la uricasa y los niveles de urato.

[0144] Los pacientes que recibieron 8 mg de PEG-uricasa cada dos semanas tenían la mayor reducción en PUA con niveles por debajo de 6 mg/dl 92 por ciento del tiempo de tratamiento (pre-tratamiento de urato en plasma de 9,1 mg/dl vs. urato plasmático medio de 1,4 mg/dL durante 12 semanas).

[0145] Niveles de urato en plasma inferior sustancial y sostenido también se observaron en los otros grupos de dosificación de tratamiento PEG-uricasa: PUA por debajo de 6 mg/ml 86 por ciento del tiempo de tratamiento en el 8 mg cada grupo de cuatro semanas (pre-tratamiento de urato en plasma de 9,1 mg/dl frente a urato plasmático medio de 2,6 mg/dl durante 12 semanas); PUA por debajo de 6 mg/ml 84 por ciento del tiempo de tratamiento en el grupo de 12 mg cada cuatro semanas (urato plasmático previo al tratamiento de 8,5 mg/dl frente a urato plasmático medio de 2,6 mg/dl durante 12 semanas); y PUA por debajo de 6 mg/ml 73 por ciento del tiempo de tratamiento en el grupo de 4 mg cada dos semanas (urato plasmático previo al tratamiento de 7,6 mg/dl versus urato plasmático medio de 4,2 mg/dl durante 12 semanas).

[0146] El porcentaje máximo de disminución en el ácido úrico en plasma desde el valor inicial dentro de las primeras 24 horas de la dosificación de PEG-uricasa fue del 72% para los sujetos que recibieron 4 mg/2 semanas (p = 0,0002); 94% para sujetos que recibieron 8 mg/2 semanas (p menor que 0,0001); 87% para sujetos que recibieron 8 mg/4 semanas (p

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una uricasa truncada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, conjugada con polietilenglicol (PEG).

2. La uricasa truncada de la reivindicación 1, en donde el PEG tiene un peso molecular de entre 5 kD y 20 kD, opcionalmente de aproximadamente 10 kD.

3. La uricasa truncada de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende 2-12 moléculas de PEG en cada subunidad de uricasa.

4. La uricasa truncada de la reivindicación 1, en donde la uricasa consiste en SEQ ID NO: 7, conjugada con m-PEG-NPC (monometoxi-poli(etilenglicol)-carbonato de nitrofenil), y en donde la uricasa comprende 2-12 hebras de 5, 10 o 20 kD de m-PEG-NPC por subunidad de uricasa.

5. Una composición farmacéutica que comprende la uricasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la uricasa de la reivindicación 1, en donde opcionalmente la secuencia de polinucleótidos está operativamente unida a un promotor osmB.

7. Un vector que comprende el ácido nucleico que codifica la uricasa de la reivindicación 6.

8. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 7.

9. Un método para producir una uricasa que comprende las etapas de cultivar la célula huésped de la reivindicación 8 en condiciones tales que la uricasa es expresada por la célula huésped y aislando la uricasa expresada.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 5 para su uso en la reducción de los niveles de ácido úrico en un fluido biológico de un sujeto.

11. Composición farmacéutica para uso según la reivindicación 10, en donde:

la composición se administra a una dosis de 8 mg de uricasa una vez cada dos semanas;

la composición se administra mediante infusión intravenosa; y/o

el nivel de ácido úrico se reduce en el plasma del sujeto a 6,0 mg/dl o menos.

12. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 10, en donde al menos un corticosteroide, al menos un antihistamínico, al menos un AINE o combinaciones de los mismos se administran profilácticamente, opcionalmente en donde:

i) el al menos un corticosteroide se selecciona de betametasona, budesonida, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona y triamcinolona,

ii) el al menos un AINE se selecciona de ibuprofeno, indometacina, naproxeno, aspirina, acetaminofeno, celecoxib y valdecoxib; o

iii) el al menos un antihistamínico se selecciona de azatadina, bromfeniramina, cetirizina, clorfeniramina, clemastina, ciproheptadina, desloratadina, dexclorfeniramina, dimenhidrinato, difenhidramina, doxilamina, fexofenadina, hidroxizina, loraminatadina.

13. Una PEG-uricasa según la reivindicación 1, en donde la uricasa consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, para su uso en el tratamiento de hiperuricemia y gota grave en pacientes humanos que no responden o no toleran la terapia convencional, en donde el tratamiento comprende la administración intravenosa de la PEG-uricasa en un régimen de dosis seleccionado entre:

a) 4 mg cada dos semanas;

b) 8 mg cada dos semanas;

c) 8 mg cada cuatro semanas; o

d) 12 mg cada cuatro semanas.