JP4273998B2

JP4273998B2 - プロテオーム解析用試料の調製方法

Info

Publication number: JP4273998B2
Application number: JP2004051354A
Authority: JP
Inventors: 朋洋荒木
Original assignee: Tokai University Educational Systems
Current assignee: Tokai University Educational Systems
Priority date: 2004-02-26
Filing date: 2004-02-26
Publication date: 2009-06-03
Anticipated expiration: 2024-02-26
Also published as: JP2005241424A

Description

本発明はプロテオーム解析用のタンパク質試料の調製方法に関し、特に生体由来の試料が高濃度で含有する粘性多糖を迅速かつ効果的に除去し、２次元電気泳動などのプロテオーム解析に好適なタンパク質試料を調製する方法に関する。本発明はまた、プロテオーム解析用のタンパク質試料の調製用試薬に関する。本発明はさらに、プロテオーム解析用の試料の前処理装置および該前処理装置を備えたプロテオーム解析装置に関する。

タンパク質研究の分野においては、近年、特定のフェノタイプに関与するタンパク質の探索などを行うために、２次元電気泳動などを用いたタンパク質の網羅的解析（プロテオーム解析）が行われている。プロテオーム解析のための試料の調製には、従来、トライトン X-100（登録商標）、Nonidet P-40またはCHAPS（3-［（3-Cholamidopropyl）dimethylammonio］-1-propanesulfonate）などの界面活性剤を用いてタンパク質を抽出する方法などが用いられてきた。しかし、多糖類を多量に含む試料など、一部の試料については、粘性が高いため、従来の調製法では満足のいく分析結果が得られず、電気泳動を行うことさえもできないものがあった。プロテオーム解析にはより多くのタンパク質をより高い解像度で分離・検出することが重要であるため、プロテオーム解析により適した試料の調製方法の開発が望まれていた。

セチルトリメチルアンモニウムブロミド（Cetyltrimethylammonium Bromide）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（Cetyltrimethylammonium Chloride）、セチルピリジニウムブロミド（Cetylpyridinium bromide）、セチルピリジニウムクロリド（Cetylpyridinium chloride）又はセチルジメチルブチルアンモニウムブロミド（Cetyldimethylethylammonium Bromide）などは、４級アンモニウムイオン系界面活性剤に分類され、従来より核酸の精製やタンパク質の変性などに使用されていた。また、キチナーゼの精製に使用できることが報告されているが（非特許文献１参照）、その他の多くの種類のタンパク質の精製にも使用できるかは不明であったため、プロテオーム解析用試料のように多種類のタンパク質を含む試料の調製には使用されていなかった。
Biosci. Biotech. Biochem., vol. 59, p430-434, 1995

本発明は、プロテオーム解析において高い分離度及び検出感度で解析しうるタンパク質試料の調製方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、４級アンモニウムイオンを含む溶液を用いて調製したタンパク質試料を用いることにより、２次元電気泳動の分離度が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）生体試料からプロテオーム解析用のタンパク質試料を調製する方法であって、生体試料または生体試料の抽出液に４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む溶液を加えて沈殿物を形成させ、該沈殿物を分離してタンパク質溶液を得ることを特徴とする方法。
（２）前記４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む溶液を、前記界面活性剤の最終濃度が０．０５〜０．１％になるように加える、（１）の方法。
（３）前記界面活性剤がセチルトリメチルアンモニウムブロミド（Cetyltrimethylammonium Bromide）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（Cetyltrimethylammonium
Chloride）、セチルピリジニウムブロミド（Cetylpyridinium bromide）、セチルピリジニウムクロリド（Cetylpyridinium chloride）及びセチルジメチルブチルアンモニウムブロミド（Cetyldimethylethylammonium Bromide）からなる群より選ばれる１又は２種類以上の界面活性剤である、（１）又は（２）の方法。
（４）前記生体試料が植物由来試料である、（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含むことを特徴とする、プロテオーム解析用試料の調製用試薬。
（６）４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む沈殿剤供給部、試料導入部、混合部、分離部を含む、プロテオーム解析用試料の前処理装置。
（７）（６）に記載の前処理装置を含むプロテオーム解析装置。

本発明の方法によって調製したタンパク質試料を用いることにより、高い分離度及び検出感度でプロテオーム解析を行うことが可能になった。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明の方法は、生体試料からプロテオーム解析用タンパク質試料を調製する方法であって、生体試料または生体試料の抽出液に４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む溶液を加えて沈殿物を形成させ、該沈殿物を分離してタンパク質溶液を得ることを特徴とする方法である。本発明において、プロテオーム解析とは、２次元電気泳動や質量分析などの多種類のタンパク質を含む試料を解析する方法を意味する。また、生体試料としては、生体より得られる試料であれば特に限定されないが、例えば、動物や植物より得られる組織や細胞、微生物の細胞などが挙げられる。これらの中では植物などの多糖類を多く含む試料が、本発明の方法において特に好適に用いることができる。植物由来の試料としては例えば、日本シバ、ヤマノイモ、ラピルスなどが挙げられる。また、粘性多糖類が多い海藻類も好適に用いることができる。

本発明においては、４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む溶液を生体試料に直接加えてもよいし、生体試料を抽出用バッファーに溶解して抽出液を得た後、該抽出液に４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む溶液を加えもよい。

生体試料に直接４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む溶液を加える場合、タンパク質を安定に保つため、溶液は４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含むリン酸緩衝液などの緩衝液を用いることが好ましい。緩衝液には生理的濃度の塩が含まれていてもよい。また、トライトンX-100（登録商標）などの他の界面活性剤が含まれていてもよい。具体的な方法としては、例えば、試験チューブ内などに入れた生体試料に４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む緩衝液を加え、該緩衝液中で生体試料をすりつぶすなどして溶解させる方法を挙げることができる。

一方、生体試料から得た抽出液に４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む溶液を加える場合、まず、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの抽出用バッファーを用いて生体試料からタンパク質を抽出する。抽出バッファーには生理的濃度の塩が含まれていてもよい。また、トライトンX-100（登録商標）などの他の界面活性剤が含まれていてもよい。抽出は、常法に従って行うことができるが、例えば、試験チューブ内などに入れた生体試料に抽出用バッファーを加えて該試料を溶解し、遠心分離などにより不溶物を除去することにより行うことができる。このようにして得られる抽出液に４級アンモニウムイオン系界面活
性剤を含む溶液を加える。

本発明において用いる４級アンモニウムイオン系界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（Cetyltrimethylammonium Bromide：CTAB）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（Cetyltrimethylammonium Chloride：CTAC）、セチルピリジニウムブロミド（Cetylpyridinium bromide：CPB）、セチルピリジニウムクロリド（Cetylpyridinium chloride：CPC）又はセチルジメチルブチルアンモニウムブロミド（Cetyldimethylethylammonium Bromide：CDEAB）などが挙げられる。これらの４級アンモニウムイオン系界面活性剤は２種類以上を用いてもよい。これらの４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む溶液は、該界面活性剤の最終濃度が０．０１〜０．２％の範囲になるように加えることが好ましく、０．０５〜０．１％になるように加えることがより好ましい。なお、この濃度は試料が含有する粘性多糖の量に影響されるので、適宜調整することも必要である。

４級アンモニウムイオン系界面活性剤は生体試料中の粘性多糖などと不溶性の複合体を形成する。この複合体を含む沈殿物を遠心分離などにより除去することによってプロテオーム解析用試料を得ることができる。粘性多糖などの不純物を効率よく除くためには、４級アンモニウムイオン系界面活性剤を加えた後、懸濁又は攪拌し、さらに、懸濁及び攪拌の後に、しばらく放置することが好ましい。タンパク質を含む放置する条件は特に制限されないが、低温で放置することが好ましく、例えば、４℃で０．５〜１２時間、放置する条件を例示することができる。放置により、十分に形成された沈殿物を遠心分離などにより除去することにより、プロテオーム解析用タンパク質試料を得ることができる。なお、４級アンモニウムイオン系界面活性剤はDNAなどの核酸を除去する効果も有しているため、本発明の方法によって核酸も同時に除去するができる。本発明の方法によって調製される試料は、粘性が低くプロテオーム解析に好適に用いることができる。

本発明はまた、４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含むプロテオーム解析用試料の調製用試薬を提供する。本発明の試薬は、さらに、タンパク質抽出液を含むものであってもよい。このような試薬としては、例えば、４級アンモニウムイオン系界面活性剤溶液およびタンパク質抽出用リン酸緩衝液を含むプロテオーム解析用試料の調製用試薬等が挙げられる。

本発明はまた、プロテオーム解析用試料の前処理装置を提供する。本発明の前処理装置は、試料導入部、４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む沈殿剤供給部、混合部、分離部を含む、前処理装置である。

このような前処理装置としては、例えば、図４の「前処理部」に示すような装置を挙げることができる。この装置においては、試料は試料供給部（２０３）からインジェクタ（２０４）により注入され、溶媒供給部（２０１）から微量ポンプ（２０２）を通って供給される溶媒によりミキサー部（２０７）に送られる。沈殿剤は沈殿剤供給部（２０５）から微量ポンプ（２０６）によりミキサー部（２０７）に送られる。ミキサー部において試料と沈殿剤が混合され、反応部（２０８）において沈殿形成反応が進行する。反応部（２０９）において充分反応させた後、混合液は分離部（２１０）に送られ、沈殿物とタンパク質溶液に分離される。微量ポンプ、インジェクタ、ミキサーなどは通常のものを組み込むことができる。分離部としては、ろ過装置や遠心分離装置などが挙げられるが、試料の粘性が高い場合は遠心分離装置が好ましい。

本発明は、さらに、このような前処理装置を含むプロテオーム解析装置であってもよい。例えば、図４に示すような液体クロマトグラフィー／質量分析装置（LC-MASS）装置を挙げることができる。この装置においては、前処理部（２１１）から修飾反応部（２１２
）及び酵素反応部（２１３）を通ってインジェクタ（２２０）により供給される酵素分解ペプチドが、溶離液供給部（２１５及び２１６）から微量ポンプ（２１７及び２１８）により送られミキサー部（２１９）内で混合された溶離液によって、カラム（２２１）内で展開・分離され、質量分析機（２２２）内で質量分析にかけられ、さらに、データ処理部（２２３）で解析される。カラムとしては通常の質量分析用カラムを用いることができ、データ処理部としては、通常のコンピューターなどを用いることができる。

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。

［実施例１］SDS電気泳動による評価
生体試料として日本シバを用いた。該試料に３倍量のリン酸緩衝液を加えて溶解し、遠心分離を行い、不溶物を除去してタンパク質抽出液を得た。該抽出液100μＬに5μＬの２％CPC（塩化エキサデシルピリジニウム一水和物；ナカライテスク製）を添加して攪拌した。攪拌後、４℃で一晩放置し、沈殿物を形成させた。12,000rpm、4℃、5分間の遠心分離により沈殿物を除去し、上清を回収してタンパク質試料を得た。該試料10μＬをSDS-ポリアクリルアミド電気泳動により解析した（レーン３）。対照として、CPC未処理サンプル（レーン２）及び2D Clean Up Kit (Amersham Biosciences社) （レーン４）を用いて調製したサンプルを同時に電気泳動により解析した。結果を図１に示す。レーン１及び５は分子量マーカー（ウシ血清アルブミン：６６ｋＤａ，カルボニックアンヒドラーゼ：２９ｋＤａ，トリプシンインヒビター：２０ｋＤａ，ニワトリリゾチーム：１４ｋＤａ）を示す。

CPC未処理サンプルに比べて高分子のバンドがより多く検出できた。これにより、CPCを用いてタンパク質試料を調製することにより電気泳動の分離度及び解像度が著しく向上することがわかった。なお、2D Clean Up Kitによって調製された試料についても高分子バンドは検出されたが、バックグラウンドが上昇しバンドのコントラストが低下した。

［実施例２］２次元電気泳動による評価（１）
生体試料として粘性の非常に高いヤマノイモのムカゴ（気根）を用いた。該試料に3倍量の0.1M酢酸緩衝液（pH4.0）を加えて溶解させた。遠心分離を行い、不溶物を除去してタンパク質抽出液を得た。該抽出液100μＬに２％CPCを１／２０量（５μＬ）加えて攪拌し、４℃で一晩放置後、遠心分離により上清画分を得た。この上清画分５μＬに膨潤緩衝液（８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ，２％ＩＰＧ緩衝液、０．３％ＤＴＴ）１２５μＬを加え、同溶液にてＩＰＧドライストリップ（７ｃｍ、ｐＨ３−１０；アマシャムファルマシア製）を一晩膨潤させた後、２次元電気泳動を行った。対照として、CPC未処理のサンプルについても電気泳動を行った。なお、電気泳動は、１次元にはＩＰＧ−ＩＥＦＴｙｐｅＣ（アナテック製）、２次元目にはＡＥ６５００（アトー製）を用いた。結果を図２に示す。

CPC未処理の試料（B）では、ほとんどタンパク質のスポットが検出されなかったが、CPC処理を行った試料（A）においては、多数のタンパク質のスポットが検出された。

［実施例３］２次元電気泳動による評価（２）
生体試料としてアピオス（アメリカ大陸原産のイモ）を用いた。該試料に3倍量のリン酸緩衝液（pH7.0）を加えて溶解し、遠心分離を行い、不溶物を除去してタンパク質抽出液を得た。該抽出液100μＬに２％CPCを１／２０量（５μＬ）加えて攪拌し、４℃で一晩放置後、遠心分離により上清画分を得た。この上清画分５μＬに膨潤緩衝液（８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ，２％ＩＰＧ緩衝液、０．３％ＤＴＴ）１２５μＬを加え、同溶液にてＩ
ＰＧドライストリップ（７ｃｍ、ｐＨ３−１０；アマシャムファルマシア製）を一晩膨潤させた後、２次元電気泳動を行った（A）。対照として、CPC未処理のサンプルについても電気泳動を行った（B）。結果を図３に示す。CPC処理の方がCPC未処理に比べてタンパク質スポットの数が顕著に多いことがわかる。以上の結果から、CPC処理を行うことにより、２次元電気泳動に好適な試料が得られることがわかった。なお、実施例においてはCPCを用いた例を示したが、CTABなどの他の4級アンモニウムイオン系界面活性剤を用いることによっても、同様に２次元電気泳動に好適な試料が得られることが本発明者によって確認されている。

本発明により、高分離度及び高感度でのプロテオーム解析が可能になった。

本発明の方法及び従来法により得られた試料を用いたSDS-PAGEの結果を示す図（写真）。本発明の方法（A）及び従来法（B）によりヤマノイモから調製されたタンパク質試料を用いた２次元電気泳動の結果を示す図（写真）。本発明の方法（A）及び従来法（B）によりアピオスから調製されたタンパク質試料を用いた２次元電気泳動の結果を示す図（写真）。本発明の前処理装置を含むプロテオーム解析装置の模式図。

Claims

生体試料から電気泳動解析用のタンパク質試料を調製する方法であって、生体試料または生体試料の抽出液に４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む溶液を加えて沈殿物を形成させ、該沈殿物を分離してタンパク質溶液を得ることを特徴とする方法。
前記４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む溶液を、前記界面活性剤の最終濃度が０．０５〜０．１％になるように加える、請求項１に記載の方法。
前記界面活性剤がセチルトリメチルアンモニウムブロミド（Cetyltrimethylammonium Bromide）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（Cetyltrimethylammonium Chloride）、セチルピリジニウムブロミド（Cetylpyridinium bromide）、セチルピリジニウムクロリド（Cetylpyridinium chloride）及びセチルジメチルブチルアンモニウムブロミド（Cetyldimethylethylammonium Bromide）からなる群より選ばれる１又は２種類以上の界面活性剤である、請求項１又は２に記載の方法。
前記生体試料が植物由来試料である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含むことを特徴とする、電気泳動解析用試料の調製用試薬。
４級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む沈殿剤供給部、試料導入部、混合部、分離部を含む、電気泳動解析用試料の前処理装置。