JP4273998B2 - プロテオーム解析用試料の調製方法 - Google Patents
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Description
Biosci. Biotech. Biochem., vol. 59, p430-434, 1995
(1) 生体試料からプロテオーム解析用のタンパク質試料を調製する方法であって、生体試料または生体試料の抽出液に4級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む溶液を加えて沈殿物を形成させ、該沈殿物を分離してタンパク質溶液を得ることを特徴とする方法。
(2) 前記4級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む溶液を、前記界面活性剤の最終濃度が0.05〜0.1%になるように加える、(1)の方法。
(3) 前記界面活性剤がセチルトリメチルアンモニウムブロミド(Cetyltrimethylammonium Bromide)、セチルトリメチルアンモニウムクロリド(Cetyltrimethylammonium
Chloride)、セチルピリジニウムブロミド(Cetylpyridinium bromide)、セチルピリジニウムクロリド(Cetylpyridinium chloride)及びセチルジメチルブチルアンモニウムブロミド(Cetyldimethylethylammonium Bromide)からなる群より選ばれる1又は2種類以上の界面活性剤である、(1)又は(2)の方法。
(4) 前記生体試料が植物由来試料である、(1)〜(3)のいずれかの方法。
(5) 4級アンモニウムイオン系界面活性剤を含むことを特徴とする、プロテオーム解析用試料の調製用試薬。
(6) 4級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む沈殿剤供給部、試料導入部、混合部、分離部を含む、プロテオーム解析用試料の前処理装置。
(7) (6)に記載の前処理装置を含むプロテオーム解析装置。
性剤を含む溶液を加える。
)及び酵素反応部(213)を通ってインジェクタ(220)により供給される酵素分解ペプチドが、溶離液供給部(215及び216)から微量ポンプ(217及び218)により送られミキサー部(219)内で混合された溶離液によって、カラム(221)内で展開・分離され、質量分析機(222)内で質量分析にかけられ、さらに、データ処理部(223)で解析される。カラムとしては通常の質量分析用カラムを用いることができ、データ処理部としては、通常のコンピューターなどを用いることができる。
生体試料として日本シバを用いた。該試料に3倍量のリン酸緩衝液を加えて溶解し、遠心分離を行い、不溶物を除去してタンパク質抽出液を得た。該抽出液100μLに5μLの2%CPC(塩化エキサデシルピリジニウム一水和物;ナカライテスク製)を添加して攪拌した。攪拌後、4℃で一晩放置し、沈殿物を形成させた。12,000rpm、4℃、5分間の遠心分離により沈殿物を除去し、上清を回収してタンパク質試料を得た。該試料10μLをSDS-ポリアクリルアミド電気泳動により解析した(レーン3)。対照として、CPC未処理サンプル(レーン2)及び2D Clean Up Kit (Amersham Biosciences社) (レーン4)を用いて調製したサンプルを同時に電気泳動により解析した。結果を図1に示す。レーン1及び5は分子量マーカー(ウシ血清アルブミン:66kDa,カルボニックアンヒドラーゼ:29kDa,トリプシンインヒビター:20kDa,ニワトリリゾチーム:14kDa)を示す。
生体試料として粘性の非常に高いヤマノイモのムカゴ(気根)を用いた。該試料に3倍量の0.1M酢酸緩衝液(pH4.0)を加えて溶解させた。遠心分離を行い、不溶物を除去してタンパク質抽出液を得た。該抽出液100μLに2%CPCを1/20量(5μL)加えて攪拌し、4℃で一晩放置後、遠心分離により上清画分を得た。この上清画分5μLに膨潤緩衝液(8M尿素、2%CHAPS,2%IPG緩衝液、0.3%DTT)125μLを加え、同溶液にてIPGドライストリップ(7cm、pH3−10;アマシャムファルマシア製)を一晩膨潤させた後、2次元電気泳動を行った。対照として、CPC未処理のサンプルについても電気泳動を行った。なお、電気泳動は、1次元にはIPG−IEF TypeC(アナテック製)、2次元目にはAE6500(アトー製)を用いた。結果を図2に示す。
生体試料としてアピオス(アメリカ大陸原産のイモ)を用いた。該試料に3倍量のリン酸緩衝液(pH7.0)を加えて溶解し、遠心分離を行い、不溶物を除去してタンパク質抽出液を得た。該抽出液100μLに2%CPCを1/20量(5μL)加えて攪拌し、4℃で一晩放置後、遠心分離により上清画分を得た。この上清画分5μLに膨潤緩衝液(8M尿素、2%CHAPS,2%IPG緩衝液、0.3%DTT)125μLを加え、同溶液にてI
PGドライストリップ(7cm、pH3−10;アマシャムファルマシア製)を一晩膨潤させた後、2次元電気泳動を行った(A)。対照として、CPC未処理のサンプルについても電気泳動を行った(B)。結果を図3に示す。CPC処理の方がCPC未処理に比べてタンパク質スポットの数が顕著に多いことがわかる。以上の結果から、CPC処理を行うことにより、2次元電気泳動に好適な試料が得られることがわかった。なお、実施例においてはCPCを用いた例を示したが、CTABなどの他の4級アンモニウムイオン系界面活性剤を用いることによっても、同様に2次元電気泳動に好適な試料が得られることが本発明者によって確認されている。
Claims (6)
- 生体試料から電気泳動解析用のタンパク質試料を調製する方法であって、生体試料または生体試料の抽出液に4級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む溶液を加えて沈殿物を形成させ、該沈殿物を分離してタンパク質溶液を得ることを特徴とする方法。
- 前記4級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む溶液を、前記界面活性剤の最終濃度が0.05〜0.1%になるように加える、請求項1に記載の方法。
- 前記界面活性剤がセチルトリメチルアンモニウムブロミド(Cetyltrimethylammonium Bromide)、セチルトリメチルアンモニウムクロリド(Cetyltrimethylammonium Chloride)、セチルピリジニウムブロミド(Cetylpyridinium bromide)、セチルピリジニウムクロリド(Cetylpyridinium chloride)及びセチルジメチルブチルアンモニウムブロミド(Cetyldimethylethylammonium Bromide)からなる群より選ばれる1又は2種類以上の界面活性剤である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記生体試料が植物由来試料である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 4級アンモニウムイオン系界面活性剤を含むことを特徴とする、電気泳動解析用試料の調製用試薬。
- 4級アンモニウムイオン系界面活性剤を含む沈殿剤供給部、試料導入部、混合部、分離部を含む、電気泳動解析用試料の前処理装置。
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