CN112980808A - 尿酸酶、及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经突变的尿酸酶，所述尿酸酶的结合位点和催化活性位点中的至少一个Y和/或至少一个M被突变，其中，所述Y被突变为H、F、S和G中的任意一种，所述M被突变为V、L和I中的任意一种。本发明的经突变的尿酸酶可抵抗因服用对乙酰氨基酚而带来的干扰。此外，本发明还涉及相关的制备方法、检测方法及用途。

Description

尿酸酶、及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及尿酸检测领域，尤其涉及一种新的、经突变的尿酸酶。
背景技术
生物体中，尿酸(Uric Acid,UA)是嘌呤的代谢产物，它在血清中的溶解度极低。若缺乏有活性的尿酸酶，人体无法代谢尿酸形成其他溶解度更高的产物(如尿囊素、尿素等)。一般情况下，人体产生的尿酸和肾脏清除的尿酸可以维持平衡。但是，当人体产生的尿酸过多或者肾脏清除尿酸的能力降低，血清中会积累尿酸。
目前，最常用的检测血清尿酸水平的方法是基于Trinder反应的尿酸酶-过氧化物酶法。这种方法的基本原理是利用其他生物(如真菌、细菌等)来源的尿酸酶将尿酸、水和氧气催化生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢。生成的过氧化氢可以与4-氨基安替比邻以及色原在过氧化物酶的催化作用下生成醌系色素和水。其中生成的醌系色素在特定波长的可见光有明显的吸收峰。可以通过检测吸光度确定生成的醌系色素的数量，进而可以推算出生成的过氧化氢以及样本中尿素的含量。
对乙酰氨基酚(又称扑热息痛，Paracetamol)是一种常见的解热镇痛药。据报道，对于服用对乙酰氨基酚的个体，存在血清尿酸检测值偏低的问题。
换句话说，对于服用对乙酰氨基酚的个体，使用基于尿酸酶-过氧化物酶法的尿酸检测项目评估其血清中尿酸含量，不能得到个体血清尿酸水平的真实数据，因而容易对后续医师的判断待来干扰。例如，对于表现出红肿、发炎等症状的个体来说，其可能服用对乙酰氨基酚以缓解红肿或者发炎导致的疼痛。而服用对乙酰氨基酚可能导致对个体尿酸水平的低估，导致影响医师后续判断。
基于此，在尿酸检测领域，存在着消除因服用对乙酰氨基酚所带来的干扰的强烈需求。
发明内容
如前所述，在检测尿酸时，存在着因服用对乙酰氨基酚而导致的尿酸检测结果低于实际值的问题。这一问题可能是由于：对乙酰氨基酚在体内于肝脏中经过氧化作用生成中间产物NAPQI(N-acetyl-p-benzoquinone)，而NAPQI在利用尿酸酶-过氧化物酶法检测血清尿酸含量时带来了负干扰。然而，该负干扰的原理目前尚不明晰。
也就是说，即使认为中间产物NAPQI是导致尿酸检测结果不准确(服用对乙酰氨基酚的情况下)的因素，目前也仍不清楚NAPQI是如何对尿酸检测的过程带来干扰，从而难以消除因服用对乙酰氨基酚所带来的尿酸检测结果不准确的缺陷。
经研究，本发明人发现：对于该尿酸检测方法中的第二步反应，即过氧化氢与4-氨基安替比邻及色原在过氧化物酶的催化作用下生成醌系色素的反应，NAPQI没有明显的干扰。实际上，NAPQI干扰集中在该尿酸检测方法第一步反应中，即利用尿酸酶将尿酸、水和氧气催化生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢中。进一步地，经大量实验分析，NAPQI对尿酸检测干扰来源于其对第一步反应中尿酸酶酶活的影响。
据此，在第一方面，本发明提供了一种经突变的尿酸酶，其特征在于，所述尿酸酶的结合位点和催化活性位点中的至少一个Y和/或至少一个M被突变，其中，所述Y被突变为H、F、S和G中的任意一种，所述M被突变为V、L和I中的任意一种。
本发明的经突变的尿酸酶可代替常规的尿酸酶，用于基于Trinder反应的尿酸检测试剂中。在这样的情况下，能够成功抵抗样本中NAPQI所带来的干扰，从而提高尿酸水平的准确性。同时，该试剂扩宽了检测试剂的应用范围，免除受试者对乙酰氨基酚的服用禁忌。
可以理解，根据尿酸酶的序列同源性分析(如图1)，尿酸酶催化活性位点上的酪氨酸(Y)，如Motif A上的首位Y，的常见天然同源残基为H；而苯丙氨酸(F)与酪氨酸(Y)在结构上相近。另一方面，甘氨酸(G)与丝氨酸(S)同为结构简单且能减少蛋白质空间位阻的氨基酸残基。另一方面，尿酸酶催化活性位点上的甲硫氨酸(M)，如Motif B上的M，的常见天然同源残基为I或V，L也是与其性质接近的氨基酸残基。
在一些的实施方式中，所述Y位于所述尿酸酶的Motif A中。
在具体的实施方式中，所述Y位于所述尿酸酶的Motif A的首位。
在一些实施方式中，所述Y被突变为H。
在另一些实施方式中，所述Y被突变为G。
在一些的实施方式中，所述M位于所述尿酸酶的Motif B中。
在具体的实施方式中，所述M位于所述尿酸酶的Motif B的第10位。
在一些实施方式中，所述M被突变为L。
在另一些实施方式中，所述M被突变为I。
在一些实施方式中，对Y的突变发生在尿酸酶的催化活性位点上。
在一些实施方式中，对M的突变发生在尿酸酶的催化活性位点上。
另外，本发明的经突变的尿酸酶可进一步包括位于非结合位点且位于非催化活性位点处的至少一个额外突变。
在一些实施方式中，所述额外突变是将选自C、M、Y和W的氨基酸残基突变为除C、M、Y和W外的其它氨基酸残基。
在又一些实施方式中，所述额外突变是使选自C、M、Y和W的氨基酸残基缺失。
在优选的实施方式中，所述额外突变发生在所述结合位点和/或催化活性位点的附近。
在一些实施方式中，所述额外突变发生在所述结合位点和/或催化活性位点中每一个的上游5个残基和/或下游5个残基以内。
通过在非结合和非催化活性位点处，尤其是它们附近(如上游5个残基和/或下游5个残基以内)，引入额外的突变，本发明进一步改善了消除NAPQI负干扰的能力。
在一些实施方式中，本发明的尿酸酶源自Aspergillus flavus、Bacillus sp.TB-90或Candida utilis。
在示例性的实施方式中，本发明的经突变的尿酸酶源自Aspergillus flavus，并且具有Y9H突变；优选地，进一步包括选自Y17F、Y47F、Y66H、M232L和Y233F所组成的组的至少一个额外突变。
在示例性的实施方式中，本发明的经突变的尿酸酶源自Bacillus sp.TB-90，并且具有Y11H和M76I突变；优选地，进一步包括选自M9Q、Y10R和Y254F所组成的组的至少一个额外突变。
在示例性的实施方式中，本发明的经突变的尿酸酶源自Candida utilis，并且具有Y10H突变；优选地，进一步包括选自Y49F、Y112V和M238L所组成的组的至少一个额外突变。
在第二方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸编码本发明的经突变的尿酸酶。
在第三方面，本发明提供了一种检测尿酸的试剂盒，其包括本发明的经突变的尿酸酶。
在具体的实施方式中，本发明的试剂盒进一步包括色原、过氧化物酶和4-AAP。
在具体的实施方式中，本发明的试剂盒可以为如下的形式：
第一试剂，含色原；和
第二试剂，含4-AAP和本发明的经突变的尿酸酶，
其中，所述试剂盒还包括存在于第一试剂和/或第二试剂中的过氧化物酶。
在一个变型中，本发明的试剂盒可以为如下的形式：
第一试剂，含4-AAP；和
第二试剂，含色原和本发明的经突变的尿酸酶，
其中，所述试剂盒还包括存在于第一试剂和/或第二试剂中的过氧化物酶。
在第四方面，本发明提供了一种制备经突变的尿酸酶的方法，包括以下步骤：
1)获得尿酸酶的编码序列；
2)对步骤1)中的编码序列进行突变，使得所述尿酸酶的结合位点和催化活性位点中的Y被突变为H、F、S和G中的任意一种，和/或使得所述尿酸酶的结合位点和催化活性位点中的M被突变V、L和I中的任意一种；
3)将步骤2)中经突变的编码序列导入表达载体中并表达。
在一些的实施方式中，所述Y位于所述尿酸酶的Motif A中。
在具体的实施方式中，所述Y位于所述尿酸酶的Motif A中的首位。
在一些实施方式中，所述Y被突变为H。
在另一些实施方式中，所述Y被突变为G。
在一些的实施方式中，所述M位于所述尿酸酶的Motif B中。
在具体的实施方式中，所述M位于所述尿酸酶的Motif B的第10位。
在一些实施方式中，所述M被突变为L。
在另一些实施方式中，所述M被突变为I。
在一些实施方式中，对Y的突变发生在尿酸酶的催化活性位点上。
在一些实施方式中，对M的突变发生在尿酸酶的催化活性位点上。
另外，所述步骤2)进一步使得所述尿酸酶包括位于非结合位点且位于非催化活性位点处的一个或多个额外突变。
在一些实施方式中，所述额外突变将选自C、M、Y和W的氨基酸残基突变为除C、M、Y和W外的氨基酸残基。
在又一些实施方式中，所述额外突变使选自C、M、Y和W的氨基酸残基缺失。
在优选的实施方式中，所述额外突变发生在所述结合位点和所述催化活性位点中每一个的上游5个残基和/或下游5个残基以内。
在具体的实施方式中，所述尿酸酶源自Aspergillus flavus、Bacillus sp.TB-90或Candida utilis。
在示例性的实施方式中，所述尿酸酶源自Aspergillus flavus，进行步骤2)以使得所述尿酸酶第9位Y突变为H；优选地，所述额外突变选自Y17F、Y47F、Y66H、M232L和Y233F所组成的组中的一种或多种。
在示例性的实施方式中，所述尿酸酶源自Bacillus sp.TB-90，进行步骤2)以使得所述尿酸酶第11位Y突变为H且第76位M突变为I；优选地，所述额外突变选自M9Q、Y10R和Y254F所组成的组中的一种或多种。
在示例性的实施方式中，所述尿酸酶源自Candida utilis，进行步骤2)以使得所述尿酸酶第10位Y突变为H；优选地，所述额外突变选自Y49F、Y112V和M238L所组成的组中的一种或多种。
在第五方面，本发明提供了一种检测尿酸的方法，其包括以下步骤：
1)将第一试剂与样本混匀并反应；
2)测定第一吸光度；
3)加入第二试剂，混匀并反应；
4)测定第二吸光度；以及
5)计算尿酸浓度，
其中，所述第一试剂含有色原，并且所述第二试剂含有4-AAP和本发明的经突变的尿酸酶，并且所述第一试剂和/或第二试剂还包括过氧化物酶。
在本发明方法的一个变型中，检测尿酸的方法包括以下步骤：
1)将第一试剂与样本混匀并反应；
2)测定第一吸光度；
3)加入第二试剂，混匀并反应；
4)测定第二吸光度；以及
5)计算尿酸浓度，
其中，所述第一试剂含有4-AAP，并且所述第二试剂含有色原和本发明的经突变的尿酸酶，并且所述第一试剂和/或第二试剂还包括过氧化物酶。
在第六方面，提供了本发明的经突变的尿酸酶、本发明的试剂盒在检测尿酸中的用途。
在第七方面，本发明提供了天然尿酸酶在尿酸检测中的用途，其中，在所述天然尿酸酶结合位点与催化活性位点中不存在C、M、Y和W中的任一种氨基酸残基。
在具体的实施方式中，基于Trinder反应进行所述尿酸检测。
在具体的实施方式中，所述天然尿酸酶源自Oryza sativa、Brachypodiumdistachyon或Elaeis guineensis。
在示例性的实施方式中，所述天然尿酸酶源自Elaeis guineensis。
通过对天然尿酸酶的特定选择，在基于尿酸检测过程中避免了因服用对乙酰氨基酚所带来的干扰，提高了检测准确性。同时，本发明扩宽了检测试剂的应用范围，免除受试者对乙酰氨基酚的服用禁忌。
附图说明
图1示出了不同来源的尿酸酶的氨基酸序列一致性比对结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
如本文所使用的，“尿酸酶”是指EC 1.7.3.3的酶，其能够将尿酸、水和氧气催化为尿囊素、二氧化碳和过氧化氢。本发明的尿酸酶可以是天然来源或人工来源的，其中，人工来源的包括人工合成的尿酸酶或经人为突变的尿酸酶。
本发明的尿酸酶可来源于哺乳动物、植物、真菌或细菌。优选其中，所述尿酸酶选自以下项组成的组：A.Globiformis；C.favigen；K.racemifer；S.usitatus；D.rosae；C.chlorophyti；A.flavus；C.utilis；C.jadinii；R.norvegicus；M.musculus；B.taurus；C.lupus；O.cuniculus；C.dromedaries；L.japonicas；C.lineata；A.conn；C.bogoriensis；Paenibacillus sp.，如Paenibacillus sp.JDR-2；Bacillus sp.，如Bacillus sp.TB-90；Ketdonobacter sp.和Sollibacter sp.。
如本文所使用的，“经突变的尿酸酶”是指按照本发明所定义的突变方式对本发明的尿酸酶进行突变后所获得的突变体。
如本文所使用的，“结合位点”是指尿酸酶上的尿酸结合位点和/或铜离子结合位点。在催化过程中，尿酸酶通过其尿酸结合位点与底物结合；而铜离子与尿酸酶上的铜离子结合位点结合，起到传递电子的作用。
如本文所使用的，“催化位点”又称保守区，是指尿酸酶上的Motif A和Motif B。尿酸酶中缺失这些保守位点将导致尿酸酶丧失催化功能。
对于不同来源的尿酸酶，本领域技术人员能够从例如NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中得它们的序列信息及编码序列。并且，本领域技术人员能够确定结合位点和催化活性位点的位置及其序列。例如，文献“Structure-basedcharacterization of canineehuman chimeric uricases and itsevolutionaryimplications”、“Molecular Cloning and Expression of Uricase Gene fromArthrobacter globiformis in Escherichia coli and Characterization of the GeneProduct”等报道了尿酸酶活性位点。可选地，结合BLASTP计算机程序(也可通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/获得)，可以很容易地查找不同来源的尿酸酶的相应位点。又例如，可以使用ClustalX对同源尿酸酶进行比对从而获得尿酸酶的结合位点和催化活性位点，图1示出了经ClustalX比对后的部分尿酸酶的位点信息。
如图1所示，对于Aspergillus flavus尿酸酶(Genbank中登录号为X61765.1)，Motif A位于其氨基酸序列的第9～14位，序列为YGKDNV；Motif B位于其氨基酸序列的第52～63位，序列为NSVIVATDSIKN；铜离子结合位点位于其氨基酸序列的第117～121位，序列为HPHSF；尿酸结合位点位于其氨基酸序列的第228～229位，序列为VQ。又例如，对于CandidaUtilis的尿酸酶(Genbank中登录号为D32043.1)，Motif A位于其氨基酸序列的第10～15位，序列为YGKDNV；Motif B位于其氨基酸序列的第54～65位，序列为NSSIVPTDTVKN；铜离子结合位点位于其氨基酸序列的第119～123位，序列为HDHSF；尿酸结合位点位于其氨基酸序列的第234～235位，序列为VQ。通过图1示例性的比对结果，可以理解，本领域技术人员能够确定不同来源尿酸酶的结合位点和催化活性位点。
另一方面，本发明的结合位点和催化活性位点通常具有以下通用序列：Motif A，Y(H)-G-K-X-X-V；Motif B，N-S-X-V(I)-V(I)-A(P)-T-D-S(T)-I(M,V)-K-N；铜离子结合位点，H-X-H-X-F；尿酸结合位点，V-Q。
在本文中，氨基酸残基的突变以“突变前残基类型+突变位置+突变后残基类型”的形式表示，例如，Y9H表示对应尿酸酶的第9位的Y被突变为H；M232L表示对应尿酸酶的第232位的M被突变为L；或者以“突变位置+突变前残基类型→突变位置+突变后残基类型”的形式表示，例如，9Y→9H表示对应尿酸酶的第9位的Y被突变为H；232M→232L表示对应尿酸酶的第232位的M被突变为L
在本文中，“非结合和非催化活性位点处”以及“位于非结合位点且位于非催化活性位点”是指尿酸酶中除“结合位点”和“催化活性位点”外的其余区域。如前所述，本领域技术人员可以通过BLASTP或ClustalX来确定这样区域。可以理解，这样的区域被认为是非核心区域，对这样的区域的进行突变，通常不会对尿酸酶的催化活性带来较大改变。
在一个优选的实施方式中，本发明的经突变的尿酸酶包括在其结合位点和催化活性位点中每一个的上游5个残基和/或下游5个残基以内的至少一个额外突变。例如，对于Aspergillus flavus来源的尿酸酶来说，其Motif A为尿酸酶的第9～14位，在其下游5个残基以内是指尿酸酶的第15～19位，其中第17位为Y。在这种情况下，可将第17位上的Y突变为除C、M、Y和W外的其它氨基酸残基(如H)，或使第17位上的Y缺失。类似地，额外突变还可以发生在Aspergillus flavus来源的尿酸酶的第47、66、232和/或233位。
在本文中，“除C、M、Y和W外的氨基酸残基”是指选自以下项的氨基酸残基：G、A、V、L、I、F、D、N、E、K、Q、S、T、P、H和R。
本发明的经突变的尿酸酶可以用于制备用于检测尿酸的试剂盒中。除尿酸酶外，本发明的试剂盒中可包括进行尿酸酶-过氧化物酶法的其他反应物，如色原(如TBHBA、TOOS)、过氧化物酶和4-AAP等。
此外，本发明的试剂盒可选地可以包括其他常见成分，包括但不限于，缓冲液，如磷酸缓冲液；亚铁***；抗坏血酸氧化酶、稳定剂；和防腐剂等。
对于试剂盒中各成分的浓度，本发明没有特别的限制，它们可以通常的浓度存在。例如，尿酸酶的浓度可以为500至10KU/L；色原的浓度可以为0.2至1.4mmol/L；过氧化物酶的浓度可以为2K至20KU/L；4-AAP的浓度可以为0.2至1.4mmol/L；缓冲液的缓冲浓度例如可以为10至300mM；缓冲液的pH为6.0至8.0；亚铁***的浓度可以为0.1至5mmol/L；抗坏血酸氧化酶的浓度可以为1K至10K U/L。
在试剂盒中，上述成分可以两个试剂的组合的形式存在。
例如，在第一试剂中包括色原和缓冲液，而在第二试剂中包括缓冲液、尿酸酶和4-AAP，其中，第一试剂和/或第二试剂中还包括过氧化物酶。又例如，在第一试剂中包括4-AAP和缓冲液；而在第二试剂中包括缓冲液、尿酸酶和色原，其中，第一试剂和/或第二试剂中还包括过氧化物酶。
进一步地，含有本发明的经突变的尿酸酶的试剂盒可以用于尿酸检测中，并因此能够抵抗因服用对乙酰氨基酚所带来的干扰，从而真实、准确地反映受试者的尿酸水平。
对于检测步骤和参数，本发明没有特别的限制，本领域技术人员可以根据试剂盒中的具体构成选择适当的检测步骤和参数。示例性的检测方法可以包括以下步骤：
1)将含有色原的第一试剂与样本混匀并在约37℃下孵育2～10min；
2)在约546nm波长(副波长700nm)下，测定第一吸光度；
3)加入含有过氧化物酶、4-AAP和尿酸酶的第二试剂，混匀并在约37℃下孵育2～10min；
4)在约546nm波长(副波长700nm)下，测定第二吸光度；以及
5)计算尿酸浓度。
以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1制备Aspergillus flavus尿酸酶突变体M1
1).合成Genbank X61765.1的编码基因外显子部分，将其中的第9位氨基酸编码序列TAC替换为CAC，并且在X61765.1编码基因***的上游和下游分别添加核酸外切酶XbaI和HindIII的识别位点TCTAGA和AAGCCT；
2).使用核酸内切酶XbaI和HindIII消化步骤1)中合成的核酸序列；琼脂糖凝胶电泳检测其酶切产物，并使用胶回收试剂盒回收其中片段大小约为900bp的DNA。回收产物记为回收产物1；
3).使用核酸内切酶XbaI和HindIII消化质粒pET-26b；琼脂糖凝胶电泳检测其酶切产物，并使用胶回收试剂盒回收其中片段大小约为5300bp的DNA。
回收产物记为回收产物2；
4).按照T4连接酶的反应要求配置反应体系，其中回收产物1与回收产物2的摩尔比约为5:1；
5).将连接产物通过化学转化的方式转化至Escherichia coli BL-21菌株中，即可得到表达突变后尿酸酶的菌株。
用所获得的菌株产生9Y→9H的Aspergillus flavus尿酸酶，记为尿酸酶M1。
实施例2制备Aspergillus flavus尿酸酶突变体M2
1).合成X61765.1的编码基因外显子部分，将其中的第9位氨基酸编码序列TAC替换为GGC，并且在X61765.1编码基因***的上游和下游分别添加核酸外切酶XbaI和HindIII的识别位点TCTAGA和AAGCCT；
步骤2)～5)与实施例1相同。
用所获得的菌株产生9Y→9G的Aspergillus flavus尿酸酶，记为尿酸酶M2。
实施例3制备Aspergillus flavus尿酸酶突变体M3
1).合成X61765.1的编码基因外显子部分，将其中的第9位氨基酸编码序列TAC替换为TTC，并且在X61765.1编码基因***的上游和下游分别添加核酸外切酶XbaI和HindIII的识别位点TCTAGA和AAGCCT；
步骤2)～5)与实施例1相同。
用所获得的菌株产生9Y→9F的Aspergillus flavus尿酸酶，记为尿酸酶M3。
实施例4制备Aspergillus flavus尿酸酶突变体M4
1).合成X61765.1的编码基因外显子部分，将其中的第9位氨基酸编码序列TAC替换为TCC，并且在X61765.1编码基因***的上游和下游分别添加核酸外切酶XbaI和HindIII的识别位点TCTAGA和AAGCCT；
步骤2)～5)与实施例1相同。
用所获得的菌株产生9Y→9S的Aspergillus flavus尿酸酶，记为尿酸酶M4。
实施例5制备Aspergillus flavus尿酸酶突变体M5
1).合成X61765.1的编码基因外显子部分，将其中的第9位氨基酸编码序列TAC替换为CAC，第17位氨基酸编码序列TAC替换为TTC，第47位氨基酸编码序列TAC替换为TTC，第66位氨基酸编码序列TAC替换为CAC，第232位氨基酸编码序列ATG替换为CTG，第233位氨基酸编码序列TAC替换为TTC，并且在X61765.1编码基因***的上游和下游分别添加核酸外切酶XbaI和HindIII的识别位点TCTAGA和AAGCCT；
步骤2)～5)与实施例1相同。
用所获得的菌株产生9Y→9H、17Y→17F、47Y→47F、66Y→66H、232M→223L且233Y→233F的Aspergillus flavus尿酸酶，记为尿酸酶M5。
实施例6 NAPQI对尿酸酶酶活的干扰的测定方法
由于检测NAPQI对尿酸检测干扰时，样本中NAPQI的最高浓度为100mg/L，样本量为5μL。尿酸检测试剂盒第一试剂的用量一般为240μL，第二试剂的用量为60μL，其中尿酸酶浓度为7.5kU/L。经换算，加入尿酸检测试剂盒的最终反应体系中尿酸酶浓度约为1.5kU/L，NAPQI的浓度最高为1.64mg/L。因此，以该浓度检测NAPQI对尿酸酶活性的影响，具体步骤为：
样本制备：
先将尿酸酶溶解到70mmol/L pH 7.8的磷酸盐缓冲液中，配置成1g/L的溶液。用迈瑞生化仪BS-800测定其酶活。若尿酸酶酶活低于1KU/L，则提高尿酸酶浓度，直至尿酸酶酶活在1.2-2.0KU/L之间；若尿酸酶酶活高于10KU/L，则用磷酸盐缓冲液稀释尿酸酶溶液，直至尿酸酶酶活在1.2-2.0KU/L之间。按上述方法分别得到样本1，样本2，样本3。
配制测定反应体系：
Figure BDA0002314746470000131
该反应体系测定尿酸酶酶活线性范围为1～10KU/L。
在迈瑞生化仪BS-800上进行测定反应，测定第20～23个反应周期吸光度，通过反应曲线斜率确定尿酸酶酶活。
实施例7 NAPQI对尿酸酶酶活的干扰的测定结果(Aspergillus flavus尿酸酶)
按照实施例6中的方法，对未突变的Aspergillus flavus尿酸酶(记为野生型)，以及实施例1、2和5所制备的Aspergillus flavus尿酸酶突变体进行测定，结果如下表1所示。
表1
Figure BDA0002314746470000141
其中，“+++”代表对酶活的绝对干扰程度大于25％、“++”代表绝对干扰程度大于15％且小于等于25％、“+”代表绝对干扰程度大于5％且小于等于15％、“-”代表绝对干扰程度小于等于5％。
实施例8 NAPQI对尿酸检测的干扰的测定方法
配制尿酸检测试剂盒：
第一试剂：
Figure BDA0002314746470000142
Figure BDA0002314746470000151
第二试剂：
Figure BDA0002314746470000152
使用经配制的试剂盒进行测定：
1)设定迈瑞生化分析仪BS-800主波长为546nm，副波长为700nm；
2)将240μl的第一试剂与5μl的空白/校准/样本混匀并在37℃下孵育5min；
2)测定吸光度A1；
3)加入60μl的第二试剂，混匀并在37℃下孵育5min；
4)测定吸光度A2；以及
5)计算尿酸浓度。
其中，ΔA＝[(A2－A1)校准品管或样本管]–[(A2－A1)空白管]；尿酸浓度＝(ΔA样本/ΔA校准品)*校准品尿酸浓度。
实施例9 NAPQI对尿酸检测的干扰的测定结果(Aspergillus flavus尿酸酶)
收集多名健康体检者的血清样本并将这些血清混合，随后血清中添加NAPQI使其终浓度分别为0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L和100mg/L。
按照实施例8中的方法，分别以未突变的Aspergillus flavus尿酸酶(记为野生型)，以及实施例1、2和5所制备的Aspergillus flavus尿酸酶突变体M1、M2和M5作为第二试剂中的尿酸酶进行测试，结果如下表2和表3所示。
表2
Figure BDA0002314746470000161
其中，“+++”代表对UA检测的绝对干扰程度大于40％、“++”代表绝对干扰程度大于20％且小于等于40％、“+”代表绝对干扰程度大于10％且小于等于20％、“-”代表绝对干扰程度小于等于10％。
表3
Figure BDA0002314746470000162
Figure BDA0002314746470000171
实施例10制备Bacillus sp.TB-90尿酸酶突变体
按照实施例1中的方法，以Genbank D49974.1为野生型序列，制备得到11Y→11H且76M→76I的Bacillus sp.TB-90尿酸酶，记为M11。
按照实施例1中的方法，以Genbank D49974.1为野生型序列，制备得到9M→9Q、10Y→10R、11Y→11H、76M→76I且254Y→254F的Bacillus sp.TB-90尿酸酶，记为M12。
实施例11 NAPQI对尿酸酶酶活的干扰的测定结果(Bacillus sp.TB-90尿酸酶)
按照实施例6中的方法，对未突变的Bacillus sp.TB-90尿酸酶(记为野生型)，以及实施例10所制备的Bacillus sp.TB-90尿酸酶突变体进行测定，结果如下表4所示。
表4
Figure BDA0002314746470000172
Figure BDA0002314746470000181
其中，“+++”代表对酶活的绝对干扰程度大于25％、“++”代表绝对干扰程度大于15％且小于等于25％、“+”代表绝对干扰程度大于5％且小于等于15％、“-”代表绝对干扰程度小于等于5％。
实施例12 NAPQI对尿酸检测的干扰的测定结果(Bacillus sp.TB-90尿酸酶)
收集多名健康体检者的血清样本并将这些血清混合，随后血清中添加NAPQI使其终浓度分别为0mg/L和100mg/L。
按照实施例8中的方法，分别以未突变的Bacillus sp.TB-90尿酸酶(记为野生型)，以及实施例10所制备的Bacillus sp.TB-90尿酸酶突变体M11和M12作为第二试剂中的尿酸酶进行测试，结果如下表5所示。
表5
Figure BDA0002314746470000182
Figure BDA0002314746470000191
其中，“+++”代表对UA检测的绝对干扰程度大于40％、“++”代表绝对干扰程度大于20％且小于等于40％、“+”代表绝对干扰程度大于10％且小于等于20％、“-”代表绝对干扰程度小于等于10％。
实施例13制备Candida Utilis尿酸酶突变体
参照实施例1中的方法，以Genbank D32043.1为野生型序列，制备得到10Y→10H的Candida Utilis尿酸酶，记为M21。
参照实施例1中的方法，以Genbank D32043.1为野生型序列，制备得到10Y→10H、49Y→49F、112Y→112V且238M→238L的Candida Utilis尿酸酶，记为M22。
实施例14 NAPQI对尿酸酶酶活的干扰的测定结果(Candida Utilis尿酸酶)
按照实施例6中的方法，对未突变的Candida Utilis尿酸酶(记为野生型)，以及实施例13所制备的Candida Utilis尿酸酶突变体进行测定，结果如下表6所示。
表6
Figure BDA0002314746470000192
Figure BDA0002314746470000201
其中，“+++”代表对酶活的绝对干扰程度大于25％、“++”代表绝对干扰程度大于15％且小于等于25％、“+”代表绝对干扰程度大于5％且小于等于15％、“-”代表绝对干扰程度小于等于5％。
实施例15 NAPQI对尿酸检测的干扰的测定结果(Candida Utilis尿酸酶)
按照实施例8中的方法，分别以未突变的Candida Utilis尿酸酶(记为野生型)，以及实施例13所制备的Candida Utilis尿酸酶突变体M21和M22作为第二试剂中的尿酸酶进行测试，结果如下表7所示。
表7
Figure BDA0002314746470000202
Figure BDA0002314746470000211
其中，“+++”代表对UA检测的绝对干扰程度大于40％、“++”代表绝对干扰程度大于20％且小于等于40％、“+”代表绝对干扰程度大于10％且小于等于20％、“-”代表绝对干扰程度小于等于10％。
实施例16其他抗NAPQI的尿酸酶的分析与测定
根据上述实验数据，我们推测，在四个活性位点中不含有C、M、Y和W残基是尿酸酶抵抗NAPQI干扰的关键。据此，我们认为符合上述条件的野生型尿酸酶对于抗NAPQI干扰是特别有利的。根据已经收集的尿酸酶序列信息(例如，参见图1)，推测以下来源的尿酸酶也具有抗NAQPI干扰的能力，它们分别是Oryza sativa的尿酸酶(Genbank.XM_015766705.2)，Brachypodium distachyon(Genbank.XM_003564633.4)的尿酸酶和Elaeis guineensis的尿酸酶(Genbank.XM_010909500.3)。
此处以Elaeis guineensis的尿酸酶为例，测试对抗NAPQI干扰的能力。
首先，按照实施例6中的方法，对Elaeis guineensis尿酸酶(Genbank.XM_010909500.3)进行测定，结果如下表8所示。
表8
Figure BDA0002314746470000212
Figure BDA0002314746470000221
接下来，按照实施例8中的方法，以Elaeis guineensis尿酸酶(Genbank.XM_010909500.3)作为第二试剂中的尿酸酶进行测试，结果如下表9所示。
表9
Figure BDA0002314746470000222
由表8和表9的结果可知，与我们的推测相符，Elaeis guineensis尿酸酶及在四个活性位点中不含有C、M、Y和W残基的其他尿酸酶具有抗NAPQI干扰的能力。

Claims (20)

1.一种经突变的尿酸酶，其特征在于，所述尿酸酶的结合位点和催化活性位点中的至少一个Y和/或至少一个M被突变，其中，所述Y被突变为H、F、S和G中的任意一种，所述M被突变为V、L和I中的任意一种。
2.权利要求1所述的经突变的尿酸酶，其中，所述Y位于所述尿酸酶的Motif A中，如Motif A的第1位，所述M位于所述尿酸酶的Motif B中，如Motif B的第10位。
3.权利要求1或2所述的经突变的尿酸酶，其中，所述Y被突变为H或G。
4.权利要求1或2所述的经突变的尿酸酶，其中，所述经突变的尿酸酶进一步包括位于非结合位点且位于非催化活性位点处的至少一个额外突变。
5.权利要求4所述的经突变的尿酸酶，其中，所述额外突变是将选自C、M、Y和W的氨基酸残基突变为除C、M、Y和W外的氨基酸残基，和/或使选自C、M、Y和W的氨基酸残基缺失。
6.权利要求4或5所述的经突变的尿酸酶，其中，所述额外突变发生在所述结合位点和/或催化活性位点附近，例如所述结合位点和/或催化活性位点中每一个的上游5个残基和/或下游5个残基以内。
7.权利要求1、2和5任一项中所述的经突变的尿酸酶，其中，所述尿酸酶源自Aspergillus flavus、Bacillus sp.TB-90或Candida utilis。
8.权利要求7所述的经突变的尿酸酶，其中，所述尿酸酶源自Aspergillus flavus并存在Y9H突变；可选的，额外突变选自Y17F、Y47F、Y66H、M232L和Y233F所组成的组。
9.权利要求7所述的经突变的尿酸酶，其中，所述尿酸酶源自Bacillus sp.TB-90并存在Y11H和M76I突变；可选的，额外突变选自M9Q、Y10R和Y254F所组成的组。
10.权利要求7所述的经突变的尿酸酶，其中，所述尿酸酶源自Candida utilis并存在Y10H突变；可选的，额外突变选自Y49F、Y112V和M238L所组成的组。
11.一种核酸，其编码权利要求1～10中任一项所述的经突变的尿酸酶。
12.一种尿酸检测试剂盒，其包括权利要求1～10中任一项所述的经突变的尿酸酶。
13.权利要求12所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括色原、过氧化物酶和4-AAP。
14.权利要求13所述的试剂盒，其中，
所述试剂盒包括：
第一试剂，含所述色原；和
第二试剂，所述4-AAP和所述经突变的尿酸酶，
其中，所述试剂盒还包括存在于第一试剂和/或第二试剂中的过氧化物酶，
或者，
所述试剂盒包括：
第一试剂，含所述4-AAP；和
第二试剂，所述色原和所述经突变的尿酸酶，
其中，所述试剂盒还包括存在于第一试剂和/或第二试剂中的过氧化物酶。
15.一种制备经突变的尿酸酶的方法，包括以下步骤：
1)获得尿酸酶的编码序列；
2)对步骤1)中的编码序列进行突变，使得所述尿酸酶的结合位点和催化活性位点中的Y被突变为H、F、S和G中的任意一种，和/或使得所述尿酸酶的结合位点和催化活性位点中的M被突变V、L和I中的任意一种；
3)将步骤2)中经突变的编码序列导入表达载体中并表达。
16.一种检测尿酸的方法，包括以下步骤：
1)将第一试剂与样本混匀并反应；
2)测定第一吸光度；
3)加入第二试剂，混匀并反应；
4)测定第二吸光度；以及
5)根据所述第一吸光度和第二吸光度计算尿酸浓度，
其中，所述第一试剂和所述第二试剂如权利要求14所定义。
17.权利要求1～10任一项所述的尿素酶或者权利要求12至14任一项中所述的试剂盒在尿酸检测中的用途。
18.尿酸酶在尿酸检测中的用途，其中，在所述尿酸酶结合位点与催化活性位点中不存在C、M、Y和W中的任一种氨基酸残基。
19.权利要求17或18所述的用途，其中，基于Trinder反应进行所述尿酸检测。
20.权利要求18所述的用途，其中，所述尿酸酶源自Oryza sativa、Brachypodiumdistachyon或Elaeis guineensis。
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