BRPI0612941A2

BRPI0612941A2 - formas variantes de oxidase urato e uso do mesmo

Info

Publication number: BRPI0612941A2
Application number: BRPI0612941-2A
Authority: BR
Inventors: Jacob Hartman; Simona Mendelovitz
Original assignee: Savient Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2005-04-11
Filing date: 2006-04-11
Publication date: 2012-10-02
Also published as: US20170313993A1; ES2856881T3; CN101198693A; PL3321359T3; HK1112021A1; NZ562292A; HUP0700730A2; MX2007012547A; IL186510A0; US10160958B2; US9926537B2; US20170321193A1; US20150197732A1; RU2610680C9; CZ2007695A3; RU2012106150A; CN101198693B; PL215285B1; JP2013135676A; JP2016171819A

Abstract

FORMAS VARIANTES DE OXIDASE URATO E USO DO MESMO. A presente invenção relata proteínas geneticamente modificadas com atividade uricolítica. Mais especificamente, a invenção relata proteínas compreendendo oxidases urato truncados e métodos para produzi-los, incluindo proteínas PEGilatadas compreendendo oxidases urato truncados.

Description

"FORMAS VARIANTES DE OXIDASE URATO E USO DO MESMO"

A presente invenção reivindica a prioridade e os benefícios do Pedido de Patente Norte-Americano Provisional No. 60/670.653 requerido em 11 de abril de 2005, cuja revelação é incorporada a presente para referência. A presente invenção refere-se a proteínas geneticamente modificadas com atividade uricolítica. Mais especificamente, a invenção relata proteínas compreendendo oxidases de urato truncados e métodos para produzi-los. Os termos oxidase de urato e uricase serão usados alternadamente. Os oxidases de urato (uricases; E.C. 1.7.3.3) são enzimas que catalisam a oxidação do ácido úrico para um produto mais solúvel, alantoína, um metabólito purina que é mais adequadamente excretado. Humanos não produzem uricase ativa enzimática, como um resultado de várias mutações no gene para a uricase adquirida durante a evolução dos maiores primatas, Wu, X et al., (1992) j Mol Evol 34: 78-84, incorporado aqui por referência em sua integridade. Como uma conseqüência, mas suscetibilidades individuais, excessivas concentrações de ácido úrico no sangue (hiperuricemia) poderá conduzir a dolorosas artrites (gota), desfigurando depósitos de urato e disfunções renais. Em alguns efeitos individuais, viáveis medicamentos como alopurinol (um inibidor de síntese de ácido úrico) que produz efeitos adversos limitando o tratamento ou não aliviando essas condições adequadamente. Hande, KR, et al., (1984) Am J Med 76:47-56; Fam, AG, (1990) BaiIIiere1S Clin Rheumatol 4:177-192, cada um deles sendo aqui incorporado por referência em sua integridade. Injeções de uricase poderão diminuir a hiperuricimia e a hiperuricosuria, ao menos transitoriamente. Uma vez que a uricase é uma proteína estranha em humanos, mesmo a primeira injeção da proteína não modificada de Aspergillus flavus tem induzido à reações anafiláticas em um grande percentual de pacientes tratados (Pui, C-H, et al, (1997) Leukemia 11:1813-1816, incorporado aqui por referência em sua integridade) e limitando as respostas imunológicas para tratamentos crônicos ou intermitentes. Donadio, D., et al (1981) Nouv Presse Méd 10:711-712; Laustic, M. et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-554, cada deles aqui incorporado por referência em sua integridade. A performance sub- optimal dos tratamentos viáveis para hiperuricemia tem sido reconhecida por várias décadas. Kissel, P, et al., (1968) Nature 217:72-74, incorporado aqui por referência em sua integridade. Similarmente, a possibilidade que determinados grupos de pacientes com severa gota poderão beneficiar-se a partir de uma segurao e efetiva forma de uricase injetável que tem sido reconhecida por muitos anos. Davis, FF1 et ai., (1978) in GB Broun, et. al., (Eds.) Enzyme Engineering, Vol. 4 (pp. 169-173) New York, Plenum Press; Nishimura, H, et ai., (1979) Enzyme 24:261-264; Nishimura, H, et al., (1981) Enzyme 26:49-53; Davis, S, et al., (1981) Lancet 2(8241 ):281:283; Abuchowski, A. et al., (1981) J Pharmacol Exp Ther 219: 352-354; Chen, RH-L, et al., (1981) Biochim Biophys Acta 660: 293-298; Chua; CC, et al., (1988) Ann Int Med 109:114-117; Greenberg, ML1 et al., (1989) Anal Biochem 176:290-293, cada um deles ora incorporado à presente em sua integridade. As uricases derivadas de órgãos de animais são mais proximamente insolúveis em solventes do que aquelas compatíveis com segura administração por injeção. A Patente Norte-Americana No. 3.616.231, aqui incorporada por referência em sua integridade. Certas uricases derivadas de plantas ou de microorganismos são mais solúveis em solventes medicinais aceitáveis. Entretanto, a injeção de enzimas microbiais rapidamente induzem respostas imunológicas que podem levar a reações alérgicas com risco de vida, ou inativação e/ou clara aceleração da uricase da circulação. Donadio, et. Al., (1981); Leaustic, et. Al., (1983). Enzimas baseadas em seqüências de aminoácido deduzidas de uricases de animais, incluindo suíno e babuíno, ou de insetos, como por exemplo, Drosophila melanogaster ou Drosophila pseudobscura (Wallrath, LL, et. Al., (1990) Mol Celi Biol 10:5114-5127, incorporado à presente por referência em sua integridade) não tem sido apropriados candidatos para uso clínico, devido a problemas imunogenéticos e insolubilidade ao pH fisiológico. Previamente, investigadores tem usado uricase injetada para catalisar a conversão do ácido úricio para alantoína in vivo. Ver Pui, et al., (1997). Isto é a base para o uso na França e Itália de uricase de fungos Aspergillus flacus (Uricozyme™) para previnir ou temporariamente corrigir a hiperuricemia associada com terapia citotóxica para malignidades hematológicas e para transitoriamente reduzir severa hiperuricemia em pacientes com gota. Potaux, L, et Al., (1975), Nov Presse Med 4:1109-1112; Legoux, R. Et Al., (1992) J Biol. Chem 267:8565:8570: Patentes Norte- Americanas No. 5.382.518 e No. 5.541.098, cada uma delas ora incorporada por referência em sua integridade. Face à sua curta tempo de vida de circulação, Uricozyme™ requer injeções diárias. Além disso, não é muito adequado terapia de longo tempo em função da sua imunogenicidade. Determinadas uricases para preparar conjugados com poli(glicol etileno) ou poli (óxido de etileno) (ambos referidos como PEG) para produzirem formas de eficácia terapêuticas da uricase tendo aumentada proteína meia-vida e reduzida imunogenicidade. As Patentes Norte-Americanas Nos. 4.179.337; 4.776.106; 4.847.325 e 6;576.235; e Pedido de Patente Publicado No US2003/008276A1, cada uma incorporada aqui por referência em sua integridade. Conjugados de uricase com polímeros outros do que PEG tem também sido descritos. A Patente Norte-Amerícana No. 4.460.683. ora incorporada aqui por referência em sua integridade. Próximo de todas as tentativas com uricase PEGiIato (ou seja, união covalente de PEG para uricase) o PEG é anexado primariamente a grupos amina, incluído amina-terminal, resíduo e viáveis resíduos lisinas. Nas uricases comumente usadas, o número total de lisinas em cada uma das quatro idênticas sub-unidades está entre 25 (Aspergillus flavus (Patente Norte-Americana No. 5.382.518, incorporada à presente por referência em sua integridade) e 29 (suíno (Wu, Χ, X, et ai., (1989) Proc Natl Acad Sci USA; 86:941209516, ora incorporado à presente por referência em sua integridade)). Algumas dessas lisinas são inviávie para PEGilação na conformação nativa da enzima. A mais comum aproximação para reduzir a imunogenicidade da uricase tem sido acoplar grande números de filamentos de baixo peso molecular PEG. Isto tem resultado invariavelmente em grandes decréscimos na atividade enzimática dos conjugados resultantes. Uma única injeção intravenosa de uma preparação de uricase Cândida utilis acoplada ao soro urato 5 kDa PEG reduzido à níveis indetectáveis em cinco pessoas humanas cuja média da pré-injeção da concentração do soro de urato foi de 6.2 mg/dl, que está dentro de um limite normal. Davis et Al., (1981). As pessoas receberam uma injeção adicional quatro semanas depois, mas suas respostas não foram reportadas. Nenhum anti-corpo para uricase foi detectado seguindo o segundo ( e última) injeção, usando relativamente testes de difusão com gel não sensitivo. Esta referência reportada não trouxe qualquer resultado nos tratamentos crônicos e sub-crônicos e pacientes humanos ou experimentos em animais. Uma preparação de uricase de protoformia Arthrobacter acoplada è 5 kDa PEG foi usada para temporariamente controlar a hiperuricemia em um único paciente com linfoma, cuja pré-injeção de concentração de soro de urato foi de .15 mg/dL. Chua, et al., (1988). Face às críticas condições do paciente e a curta duração do tratamento (quatro injeções durante 14 dias), não foi possível avaliar a eficácia e segurança do conjugado a longo prazo. Aperfeiçoada proteção do reconhecimento imune é possibilitado pela modificação de cada sub-unidade de uricase com 2-10 filamentos de alto peso molecular PEG (>5kD - 120kD) Saifer, et al., (Patente Norte-Americana No. 6.576.235. (1994) Adv. Exp Med Biol .366:377-387, cada uma incorporada à presente por referência em sua integridade). Esta estratégia possibilitou a retenção de >75% de atividade enzimática da uricase de várias espécies, seguindo a PEGilação , acentuando a circulação da vida da uricase, e possibilitando repetidas injeções de enzima sem anti-corpos induzidos em camundongos e coelhos. Hershfiled e Kelly (Publicação da Patente Internacional WO 00/08196; o Pedido de Patente Norte-Americano No. 60/095.489 incorporados à presente por referência em sua integridade) desenvolveram meios para prover proteínas de recombinação de uricase de espécies mamíferas com números ideais de locais PEGilação. Eles usaram técnicas PCR para aumentar o número de resíduos de lisina viáveis em selecionados pontos na enzima que foi designada para possibilitar o reduzido reconhecimento pelo sistema imune, após subseqüente PEGilação, enquanto substancialmente era retido a atividade uricolítica da enzima. Algumas das proteínas da uricase são truncadas em amina terminal e/ou carboxila. Elas não provêm o direcionamento de outras alterações específicas geneticamente induzidas na proteína. Neste pedido o termo "imunogenicidade" se refere à indução de uma resposta imune por uma preparação injetada da uricase PEG modificada ou não modificada (o antígeno), enquanto "antigenicidade" se refere à reação de um antígeno com anti-corpos preexistentes. Coletivamente, a antigenicidade e a imunogenicidade são referidas como "imunoreatividade". Em estudos prévios de uricase-PEGm a imunoreatividade é acessada por uma variedade de métodos, incluindo: 1) a reação in vitro da uricase-PEG com anti- corpos pré-formados; 2) medições de sínteses de anti-corpos induzidos; e 3) aceleradas taxas de desobstrução após repetidas injeções. Prévias tentativas para eliminar a imunogenicidade de uricases de várias fontes pelo acoplamento de vários números de filamentos de PEG através de vários Iigadores tem sido 5/42

encontrados com limitado sucesso. As uricases-PEG forma primeiramente reveladas por FF Davis e Y Inada e seus colegas. Davis et al., (1978); a Patente Norte-Americana No. 4.147.337; Níshimura et al., (1979); Patentes Japonesas Nos 55-99189 e 62-55079, cada uma delas sendo incorporada à presente por referência em sua integridade. O conjugado revelado na Patente Norte- Americana No. 4.179.337 é sintetizado pela reação da uricase de origem não especificada com 2.000 de excesso de desdobramento molar de PEG de 750 daltons, indicando que um grande número de moléculas de polímero são igualmente anexadas à cada sub-unidade de uricase. A Patente Norte- Americana No. 4.179.337 revela o acoplamento do PEG ou poly (propileno glicol) com pesos moleculares de 500 à 20.000 daltons, preferivelmente entre 500 à 5.000 daltons, para prover ativo, água solúvel, conjugados não imunogênicos de vários hormônios polipeptídios e enzimas incluindo oxidorredutase, dos quais a uricas é uma dos três exemplos. Em adição, a Patente Norte-Americana No. 4.179.337 enfatiza o acoplamento de 10 à 100 filamentos de polímero por molécula de enzima, e a retenção de ao menos 40% da atividade enzimática. Nenhum resultado foi reportado nos testes realizados para estender o acoplamento do PEG ao grupo de aminas viáveis de uricase, a atividade uricolítica específica residual, ou a imunoreatividade do conjugado. Em prévias publicações, significantes decréscimos na atividade uricolítica medida in vitro foram causadas pelo acoplamento de vários números de filamentos de PEG para uricase de Cândida utilis. Acoplando um grande número de filamentos de PEG 5 kDa para uricase de fígado suíno, obtiveram-se similares resultados, como descrito tanto na publicação de Chen como no simpósio reportado pelo mesmo grupo Chen et al;, (1981); Davis et al., (1978). Em sete estudos prévios, a imunoreatividade da uricase é reportada para ser diminuída pela PEGilação e foi eliminada em cinco outros estudos. Em três dos cinco últimos estudos, a eliminação da imunoreatividade é associada com profundos decréscimos na atividade uricolítica para mais de 15%, 28%, 45% da atividade inicial. Nishimura et al., (1979) (15% de atividade); Chen et al., (1981) (28% de atividade), Nishimura et al., (1979) (45% de atividade). No quarto relato, o PEG é reportado para ser acoplado para 61% dos resíduos de Iisina viáveis, mas a atividade específica residual não foi estabelecida. Abuchowsli et al., (1981). Entretanto, uma equipe de pesquisa que incluiu dois dos mesmos cientistas e usando os mesmos métodos reportados em qualquer lugar, que esta extensão de acoplamento deixou a atividade residual para somente 23-28%. Chen, et al., (1981). As publicações e 1981 de Abuchowski et al., e Chen et al., indicam que para reduzir a imunogenicidade da uricase substancialmente, o PEG deve ser acoplado à aproximadamente 60% dos resíduos da Iisina viáveis. A quinta publicação na qual a imunoreatividade da uricase é reportada para ter sido eliminada, não revela a extensão do acoplamento PEG, a atividade uricolítica residual, ou a natureza da ligação da proteína-PEG. Veronese, FM et a!., (1997) em JM Harris, et al., (Eds), Poli (etileno glicol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series (pp. 182-192) Washington, DC: American Chemical Society, incorporados aqui por referência em sua integridade. A conjugação do PEG para uma menor fração dos resíduos da Iisina na uricase, reduz, mas não elimina sua imunoreatividade em experimentos animais. Tsuji3 J, et al., (1985) Int. J Immunopharmacol 7:725-730, incorporado à presente por referência em sua integridade (28-45% dos grupos amina acoplados). Yasuda, Y, et al., (1990), Chem Pharm Bull 38: 2053-2056, ora incorporado à presente por referência em sua integridade (38% dos grupos amina acoplados). As atividades uricolíticas residuais dos correspondentes adutores abrangem de <33% (Tsuji et al., ) à 60% (Yasuda et al.,) de seus valores iniciais. Tsuji et al., conjugados de uricase-PEG sintetizados com 7.5 kDa e 10 kDa PEGs, em adição à 5 kDa PEG, Todos os conjugados resultantes são um tanto quanto imunogênicos e antigênicos, enquanto demonstrando reduzidas atividades enzimáticas. A preparação da uricase PEGiIatado de Candida utilis é seguramente administrada duas vezes para cada cinco humanos para ter retida apenas 11% de sua inicial atividade. Davis, et al., (1981). Vários anos depois, a uricase-PEG modificada a partir de protoformia Arthrobacter foi administrada quatro vezes em um paciente com avançado Iinfoma e severa hiperuricemia. Chua, et al., (1988), Enquanto a atividade residual daquela preparação d enzima que não foi medida, Chua et al., demonstraram a ausência de anti-corpos anti-uricase em soros de pacientes em .26 dias após a primeira injeção de uricase-PEG usando uma enzima ligada à análise imunossorvente (ELISA). Prévios estudos da uricase PEGiIatada mostram que a atividade catalisadora é notadamente deprimida pelo acoplamento de um suficiente número de filamentos de PEG para decrescer sua imunoreatividade substancialmente. Além disso, as mais recentes preparações de uricase-PEG são sintetizadas usando PEG ativado com cloreto cianúrico, um derivativo de triazina (2,4,6-tricloro-1 ,3,5-triazina) que tem sido mostrado para introduzir novos determinantes antigênicos e para induzir a formação de anti- corpos em coelhos, Tsuji5 et al., (1985). A Patente Japonesa No. 3-148298 de A Sano et al., incorporada à presente por referência em sua integridade, revela modiciadas proteínas, incluindo uricase, derivada com PEG tendo um peso molecular de 1-12 kDa que mostrou reduzida antigenicidade e "aperfeiçoada e prolongada ação", e métodos para preparar os referidos derivativos peptídios. Entretanto, não há qualquer revelação com relação à contagem de filamentos, análises de enzima, testes biológicos ou do significado "aperfeiçoado e prolongado". As Patentes Japonesas Nos. 44-99189 e 62-55079, cada uma delas incorporada à presente por referência em sua integridade, e ainda para Y Inada, revela conjugados de uricase preparados com triazina-PEG ou bis- triazina-PEG (denotada como PEG2), respectivamente. Ver Nishimura, et al., (1979 e 1981). No primeiro tipo de conjugado, os pesos moleculares dos PEGs são 2kDa e 5kDa, enquanto no segundo, somente 5 kDa PEG é usado. Nishimura et al., (1979) reportou a recuperação de 15% da atividade uricolítica após a modificação de 43% das iisinas viáveis com linear 5 kDa PEG, enquanto Nishimura et, al., (1981) reportou a recuperação de 31% ou 45% da atividade uricolítica após a modificação de 46% u 36% das Iisinas, respectivamente, com PEG2. Proteínas de uricase previamente estudadas, eram proteínas naturais ou proteínas recombinadoras. Entretanto, estudos usando técnicas SDS-PAGE e/ou Western revelaram a presença de peptídeos de não esperado peso molecular que parecem ser produtos de degradação e aumentam na freqüência todo o tempo. A presente invenção é relativa à proteínas de uricase recombinadoras mutantes tendo mutilações e acentuada estabilidade estrutural. A presente invenção provê novidade em proteínas recombinadoras de uricase. Em uma incorporação, as proteínas da invenção são mutiladas e aminoácidos modificados para naturalmente se tornarem proteínas uricase. Em particular incorporações, as mutações são ou estão por volta das áreas de aminoácidos 7, .46, 19 e 301. Quaisquer mutações conservativas no peptídio são também contempladas como parte da invenção. O objetivo da invenção provê uma uricase recombinadora mutante, caracterizada por a uricase ter sido truncada ou mutilada por 1-20 aminoácidos, retendo a atividade uricolítica da ocorrida natural uricase. As mutilações estão na ou por volta da sequencia terminal de modo que a proteína possa conter o resultado final dos aminoácidos. Essas mutações e mutilações podem intensificar a estabilidade da proteína compreendendo as referidas mutações. Em outra incorporação, a presente invenção provê um meio para metabolizar o ácido úrico compreendendo uma nova proteína uricase recombinadora tendo atividade uricolítica. A atividade uricolítica é usada aqui para referir-se à conversão enzimática do ácido úrico para alantoína. O objetivo da invenção ainda prevê uma célula hospedeira para produzir uma uricase que tenha sido truncada por 1 -20 aminoácidos, e tendo aminoácidos modificados retém a atividade uricolítica. EM uma incorporação, uma isolada uricase mamífera mutilada é provida compreendendo uma seqüência de aminoácido de uricase mamífera truncada em amina terminal ou carboxila terminal ou ambas a amina e carboxila terminal por aproximadamente 1-13 aminoácidos e ainda compreendendo uma substituição de aminoácido na posição aproximada 46. Em particulares incorporações, a uricase compreende um aminoácido de amina terminal, onde o aminoácido de aminda terminal é alanina, glicina, prolina, serina ou treonina. Também e provida uma uricase onde ua substituição na aproximada posição 46 com treonina ou alanina. Em uma incorporação, a uricase compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO. 8. Em uma incorporação, a uricase é conjugada com um polímero para formar, por exemplo, um glicol polietileno - uricase conjugada. Em particulares incorporações, em cada sub-unidade da uricase, preferivelmente 3 à 10 moléculas de glicol de polietileno por sub-unidade de uricase. Em particulares incorporações, cada molécula de glicol de polietileno do glicol de polietileno - uricase conjugada tem um peso molecular entre aproximadamente 1 kD e 100 kD; aproximadamente .1kD e 50kD; aproximadamente 5kD e 20 kD ou aproximadamente 10 kD. Além disso são providas composições farmacêuticas compreendendo a uricase da invenção, incljuindo glicol de polietileno - uricase conjugada. Em uma incorporação, a composição farmacêutica é apropriada para repetida administração. Também é 'provido um método de redução dos níveis de ácido 9/42

úrico em um fluído biológico de uma pessoa humana na necessidade do mesmo, compreendendo a administração da composição farmacêutica compreendendo a uricase da invenção. Em uma particular incorporação, o fluído biológico é sangue. Em uma incorporação, a uricase compreende um peptídio tendo a seqüência da posição 44 à posição 56 do Porco-KS-ΔΝ (SEQ ID NO. 14). Em uma incorporação, a proteína uricase compreende um terminal-N metionina. Em uma particular incorporação, a uricase compreende a seqüência de aminoácido SEQ ID NO. 7. Tamém são providos ácidos nucléicos isolados compreendendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica a uricase da invenção, por exemplo, uricases tendo ou compreendendo seqüências de aminoácido de SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ. ID NO. 12 ou SEQ ID NO. 13. Em uma incorporação, ρ ácido nucléico isolado é operativamente ligado à um promotor heterólogo, por exemplo, o promotor osmB. Ainda são providos vetores compreendendo uricase codificando ácidos nucléicos da SEQ ID NO. 7. É ainda provido um método para a produção de uma uricase compreendendo as etapas de cultura como uma célula hospedeira sob condições em qie a uricase é expressa pela célula hospedeira isolando a expressa uricase. A invenção será melhor compreendida fazendo-se referência aos desenhos em anexo, apresentados em caráter exemplificativo, mas não limitativo, nos quais: - A Figura 1 ilustra a estrutura do plasmídio pOUR-P-AN-ks-1. Números próximos aos locais de restrição indicam a posição nucleotídeo para o local Haell, designado como 1. Os locais de restrição são perdidos durante colonagem que são marcadas entre parênteses;

-A Figura 2 representa o DNA e as seqüencias de aminoácido deduzidas da uricase do Porco-KS-ΔΝ (SEQ ID NO. 9 e SEQ ID NO. 7, respectivamente). A numeração do aminoácido da Figura 2 é relativa à completa seqüência da uricase do porco. Seguindo o resíduo iniciador metionina, uma treonina substitui o ácido aspártico 7 da seqüência da uricase do porco. Os locais de restrição que são usados para as várias etapas de sub-clonagem são indicados. A seqüência 30 3' não transportada é mostrada em letras reduzidas. O códon de parada do transporte é indicado por um asterísco;

-A Figura 3 mostra o relativo alinhamento das seqüencias de aminoácidodeduzidas dos vários recombinadores das seqüências uricase do porco (SEQ ID NO. 11), PBC-ANC (SEQ ID NO. 12), e do porco KS-ΔΝ (SEQ ID NO. 7). Os asteríscos indicam as posições nas quais se encontram as diferenças nos aminoácidos no porco KS-ΔΝ quando comparados aos publicados na seqüência da uricase do porco;os círculos indicam as posições nas quais existem as diferenças nos aminoácidos no porco KS-ΔΝ quando comparados com PBC-ΔΝ. Linhas traçadas indicam a anulação dos aminoácidos;

- A Figura 4 representa a uricase do porco SDS-PAGE e uricases variantes altamente purificadas produzidas de acordo com os Exemplos 1 - 3. A data de produção (mês/ano) e o número de rota relavante para cada amostra é indicado na chave abaixo. O eixo Y pe rotulado com os marcadores dos pesos moleculares, e o topo da figura é rotulado com os números das rotas. As rotas são as seguintes: Rota 1 - Marcadores de peso molecular; Rota 2 - Porco KS- ΔΝ (7/98); Rota 3 - Porco (9/98); Rota 4 - Porco KS (6/99); Rota 5 - Porco KS (6/99); Rota 6 - Porco ΔΝ (6/99); Rota 7 - Porco KS-ΔΝ (7/99); Rota 8 - Porco KS-ΔΝ (8/99);

- A Figura 5 representa os perfis farmocinéticos do PEGiiatado (9x10 kD) uricase do Porco-KS-ΔΝ nas seguintes taxas de injeções IM (Intramuscuiar), SC(subcutânea), e IV (intra-venosa), como determinado peío monitoramento da atividade enzimática em amostras de sangue. A atividade da uricase em amostras de plasma, que são coletadas nos pontos de tempo indicados, é determinada usando análise colorimétrica, Valores de atividades (mAU = unidades de absorção mili) representam a taxa da reação enzimática por μΙ de amostra de plasma. A bio-viabilidade (quantidade da droga alcançando a relativa circulação para uma injeção IV) da uricase injetada foi calculada a partir da área sob a curva do gráfico;

- A Figura 6 representa o perfis farmacocinéticos do PEGiiatado (9x10 kD) da uricase do porco KS-ΔΝ e coelhos seguindo injeções IM(intra-muscular), SC (subcutânea), e IV (intra-venosa), como determinado pelo monitoramento da atividade enzimática nas amostras de sangue. A atividade da uricase nas amostras de plasma coletadas nos pontos de tempo indicados é determinada usando uma análise colorimétrica. Os valores de atividade (mAU = unidades de absorção mili) representam a taxa da reação enzimática por 1 μΙ de amostra de plasma. A bio-viabilidade (quantidade da droga alcançando a circulação relativa à uma injeção IV) da uricase injetada foi calculada a partir da área sob a curva do gráfico;

- A Figura 7 representa os perfis farmacocinéticos do PEGiIatado (9x10 k) da uricas do Porco KS-ΔΝ e em cães seguindo injeções IM (intra-muscular), SC (subcutânea), e IV (intra-venosa), como determinado pelo monitoramento da atividade enzimática em amostras de sangue. A atividade da uricase em amostras de plasma, que são coletadas nos pontos de tempo indicados, é determinada usando a análise colorimétrica. Os valores da atividade (mAU = unidades de absorção mili) representam a taxa da reação enzimática por 1 μΙ de amostra da plasma. A bio-viabilidade (quantidade da droga alcançando a relativa circulação para um injeção IV) da uricase injetada foi calculada a partir de uma área sob a curva do gráfico;

- A Figura 8 representa os perfis farmacocinéticos do PEGiIatado (9x10 kD) da uricase do Porco KS-ΔΝ em porcos seguindo as injeções IM (intra-muscular), SC (subcutânea), e IV (intra-venosa), como determinado pelo monitoramento da atividade enzimática em amostras de sangue. A atividade da uricase em amostras de plasma, que são coletadas como os pontos de tempo indicados, é determinada usando a análise colorimétrica. Os valores da atividade (mAU = unidades de absorção mili) representam a taxa da reação enzimática por 1 μΙ da amostra de plasma. A bio-viabilidade (quantidade da droga alcançando a curva do gráfico.

Prévios estudos ensinam que quando uma significante redução na imunogenicidade e/ou antigenicidade da uricase é atingida pela PEGilação, ela á invariavelmente associada com uma substancial perda da atividade uricolítica. A segurança, conveniência e custo-benefício dos bio-farmacêuticos são adversamente impactados pelo decréscimo de suas potências e a necessidade resultante para aumentar a dose administrada. Então, há a necessidade para um seguro e efetivo meio alternativo para baixar os elevados níveis de ácido úrico nos fluídos do corpo, incluindo sangue. A presente invenção provê uma uricase recombinadora mutante, onde a uricase tenha sido mutilada por 1 -20 aminoácidos em amina terminal ou carboxila terminal, ou ambas, e substancialmente retendo a atividade uricolítica da uricase ocorrida 12/42

naturalmente. A uricase, como aqui usada, compreende individuais sub- unidades, bem como os tetrâmeros, a menos que contrariamente indicado. A uricase mutante, como aqui usada, se refere à moléculas de uricase tendo aminoácidos alterados com outros aminoácidos. Uma mutação conservante, como aqui usada, é uma mutação de um ou mais aminoácidos, em ou em torno de uma posição, que não altera substancialmente o comportamento da proteína. Em uma preferida incorporação, a uricase compreendendo ao menos uma mutação conservante tem a mesma atividade uricase como a uricase sem a mutação. Em incorporação alternada, a uricase compreendendo ao menos uma mutação conservante tem substancialmente a mesma ativadade uricas, dentro de 5% da atividade, dentro de 10% de atividade, ou dentro de 30% da atividade da uricase sem a referida mutação. A substituição do aminoácido conservante é definida como uma alteração na composição do aminoácido pelo meoi de alteração dos aminoácidos de um peptídio, polipeptídio, ou proteína, ou fragmento dos mesmos. Em particulares incorporações, a uricase tem uma, duas, três ou quatro mutações conservantes. A substituição dos aminoácidos com propriedades geralmente similares (por exemplo, acídico, básico, aromático, tamanho, positivamente ou negativamente carregado, polar, não polar) de modo que as substituições não alterem substancialmente o peptídio, polipeptídio, ou características da proteína (como por exemplo, carga, IEF, afinidade, avidez, conformação, solubilidade) ou atividade. Típicas substituições que poderão ser realizadas para cada substituição de aminoácido conservante poderá ser entre os grupos de aminoácidos, a saber:

-glicina (G), alanina (A), valina (V) Ieucina (L) e isoleucina (l); - ácido aspártico (D) e ácido glutâmico (E);

-alanina (A), serina (S) e treonina (T);

-histidina (H), Iisina (K) e arginina (H);

-asparagina (N) e glutamina (Q);

-fenilalanina (F), tirosina (Y) etriptofano (W).

A proteína tendo um ou mais substituinte conservante retém sua estabilidade estrutural podendo catalisar a reação mesmo apesar de sua seqüência de DNA nçao for a mesma daquela da proteína original. A uricase mutilada, como aqui usada, refere-se à moléculas de uricase tendo curtas seqüências primárias de arninoácidos. Entre as mutilações possíveis estão as mutilações de ou por volta de amina e/ou carboxila terminal. Específicas mutilações desse tipo devem ocorrer de modo que o resultado final dos arninoácidos (aqueles da amina ou carboxila terminal) da proteína ocorrida naturalmente estejam presentes na proteína mutilada. As mutilações da amina terminal devem ser iniciadas nas posições 1, 2, 3, 4 5 ou 6. Preferivelmente, as mutilações da amina terminal iniciam-se na posição 2, tornando a amina terminal metionina. Este metionina poderá ser removido pela modificação pós translação. Em particulares incorporações, a amina terminal metionina é removida após a uricase ser produzida. Em uma particular incorporação, a metionina é removida aminopeptidases bacterial endógena. Uma uricase mutilada com relação à completa extensão da seqüência, tem uma ou mais seqüências de aminoácido excluídas. Uma proteína compreendendo uma uricase mutilada poderá incluir qualquer seqüência de aminoácido em adição à seqüência de uricase mutilada, mas não inclui uma proteína compreendendo uma seqüência de uricase contendo qualquer adicional tipo seqüencial não cultivado de seqüência de aminoácido. Em outras palavras, uma proteína compreendendo uma uricase mutilada once a mutilação inicia-se na posição 6 (ou seja, a uricase mutilada inicia-se na posição 7) não tem, imediatamente acima da uricase mutilada, qualquer tipo de aminoácido contendo a uricase não cultivada na posição 6. A menos que contrariamente indicado por específica referência à outra seqüência ou uma particular SEQ ID NO., referem-se às posições numeradas dos arninoácidos das uricases descritas aqui que é feita com relação à numeração de arninoácidos da seqüência da uricase do porco. A seqüência do aminoácido da uricase do porco e as posições numeradas dos arninoácidos compreendendo a seqüência poderá ser encontrada na Figura 3. Como aqui usado, referência aos arninoácidos ou ácidos nucléicos "a partir da posição X à posição Y" significa a seqüência contínua se iniciando na posição X e terminando na posição Y, incluindo os arninoácidos ou ous ácidos nucléicos em ambas posições X e Y. Os genes da uricase e proteínas tem sido identificados em várias espécies mamíferas, por exemplo, porco, babuíno, rato, coelho, camundongo e macaco rhesus. As seqüências das várias proteínad uricase serão descritas aqui para referência aos números de acesso da base de dados de seu público, como se demonstra a

seguir:gi/50403728/sp/P25689;gi/20513634/dbj/BAB91555.1;gi/176610/gb/AAA3 5395.1 ;gi/2053654/dbj/BAB91557.1 ;gi/47523606/ref/NP_999435.1 ;gi/6678509/ref /NP_033500.1 ;gi/57463/emb/CAA31490.1 ;gi/20127395/ref/NP_446220.1 ;gi/1371 07/sp/P11645 ;g i/514866/ref/XP_497688.1 ;gi/gb/AAA42318.1 ;gi/26340770/dbj/BA C34047.1; e gi/57459/emb/CAA30378. Cada uma dessas seqüências e suas anotações na base de dados pública acessível através do National Center of Bitotechnology Information (NCBI) é incoporada à presente por referência em sua integridade. Em uma incorporação da presente invenção, a uricase é mutilada por 4 - 13 aminoácidos em sua amina terminal. Em uma incorporação da invenção, a uricase é mutilada por 4-13 aminoácidos em sua carboxila terminal. Em uma incorporação da invenção, a uricase é mutilada por 4 - 13 aminoácidos ambos em suas caboxila e amina terminal. Em uma incorporação da invenção, a uricase é mutilada por 6 aminoácidos em sua amina termial. Em uma incorporação da invenção, a uricase é mutilada por 6 aminoácidos em sua carboxila terminal. Em uma incorporação da invenção, a uricase é mutilada por 6 aminoácidos suas ambas carboxila e amina terminal. Em uma particular incorporação, a proteína uricase compreende a seqüência de aminoácido da posição 13 para a posição 292 da seqüência do aminoácido da uricase do porco (SEQ ÍD NO. 11). Em uma particular incorporação, a proteína uricase compreende a seqüência de aminoácido da posição 8 para a posição 287 da seqüência de aminoácido de PBC-ANC(SEQ ID NO. 12). Em uma particular incorporação, a proteína uricase compreende a seqüência de aminoácido da posição 8 para a posição 287 da seqüência de aminoácido do Porco- KS- AN(SEQ ID NO. 7). Em uma incorporação a proteína uricase compreende a seqüência de aminoácido da posição 44 para a posição 56 do Porco-KS-ΔΝ (SEQ ID NO. 14). Esta região da uricase tem homologia para seqüências dentro do domínio do túnel desdobrado (T-dobra) da uricase, e tem internamente uma mutação na posição 46 com relação à seqüência uricase do porco nativo. Esta mutação surpreendentemente são altera significantemente a atividade uricase da protéina. Em uma incorporação da invenção, os aminoácidos em ou ao redor do aminoácidos 6, 46, 291 e 301 são alterados. Em uma preferida incorporação da invenção, os aminoácidos 7, 46, 291 e 301, eles próprios se alteram. Em particulares incorporações, a proteína é codificada por um ácido nucléico que codifica uma metionina terminal-N. Preferivelmente, a metionina terminal-N é seguida porum códon que permite a remoção desta metionina terminal-N pela aminopeptidase metionina bacterial (MAP). (Ben-Bassat e Bauer (1987) Nature .326:315; incorporada á presente por referência em sua integridade). Os aminoácidos que permite, a mais completa remoção da metionina terminal-N são a alanina, glicina, prolina, serina e treonina. Em uma incorporação da presente invenção, os aminoácidos da ou ao redor da posição 7 e/ou 46 são substituídos por treonina. Surpreendentemente, a atividade enzimática da uricase mutilada preparada com essas mutações é similar aquelas da enzima não mutilada. Em uma adicional incorporação da invenção, as mutações compreendem treonina, treonina, Iisina e seria nas posições 7, 46, 291 e 301 respectivamente. As uricases mamíferas mutiladas reveladas aqui podem ainda compreender uma metionina na amina terminal. O penúltimo amicoácido poderá permitir a remoção da metionina terminal-N pela aminopeptidase metionina bacterial (MAP). Aminoácidos que permitem a mais completa remoção da metionina terminal-N são a alanina, glicina, prolina, serina e treonina. Em uma particular incorporação, a uricase compreende dois aminoácidos de amina terminal onde os dois aminoácidos da amina terminal são uma metionina seguida de uma minoácido selecionado de um grupo consistindo de alanina, glicin, prolina, serina, e treonina. Em outra incorporação da invenção, os substituídos aminoácidos tem sido substituídos pela treonina. Em uma incorporação da invenção, a uricase é uma uricase mamífera. Em uma incorporação da invenção, a uricase mamífera compreende a seqüência de suino, bovino, ovino, ou uricase de fígado de babuíno. Em uma incorporação da invenção, a urica é uma uricase quimérica de duas ou mais uricases mamíferas. Em uma incorporação da invenção, as uricases mamíferas são selecionadas de suíno, bovino, ovino, ou uricase de fígado de babuíno. Em uma incorporação da invenção, a uricase compreende a seqüência de SEQ ID NO. 8. Em uma incorporação da invenção, a uricase compreende a seqüência de SEQ ID NO. 13. A referida invenção provê uricase codificando ácidos nucléicos compreendendo a seqüência de SEQ ID NO. 10. Em uma incorporação da invenção, a uricase compreende uricase fungai ou microbial. Em uma incorporação da invenção, a uricase fungai ou microbial é 16/42

Apergillus flavus, Arthrobacter globiformis ou uricase Candida utilis. Em uma incorporação da invenção, a uricase compreende uma uricase invertebrada. Em uma incorporação da invenção, a uricase invertebrada é a uricase Drosofila melanogaster ou Drosofila pseudo-obscura. Em uma incorporação da invenção, a uricase compreende uricase planta. Em uma incorporação da invenção, a uricase planta pe uma uricase Glicina max de raízes de nódulos. A referida invenção provê uma seqüência de ácido nucléico codificando a uricase. A referida invenção provê um vetor compreendendo a seqüência de ácido nucléuico. Em uma incorporação da invenção, a uricase é isolada. Em uma particular incorporação, a uricase é purificada. Em particulares incorporações a uricase isolada é purificada. A referida invenção provê uma célula hospedeira compreendendo um vetor. A referida invenção provê um método para a produção de seqüência de ácido nucléico, comprendendo modificação por técnicas PCR (reação da cadeia polimerase) de uma seqüência de ácido nucléico codificando uma uricase não mutilada. Um técnico no assunto sabe que a desejada seqüência de ácido nucléico é preparada por PCR por via de escorvadores oligonucleotídeo sintético, que são complementares para regiões do DNA alvo (um para cada filamento) para ser amplificado. Os escorvadores são adicionados ao DNA alvo (que não necessitam ser puros), na presença do excesso de deoxinucleotídeos e Taq polimerase, um polimerase DNA estável quente. Em uma série (tipicamente 30) de ciclos de temperatura, o DNA alvo é repetidamente desnaturado (por volta de 90°C), fortalecido com os escorvadores (tipicamente à 50-60°C) e um filamento filho estendido a partir dos escorvadores (72°C). Como os filamentos filhos agem por eles memsmo como gabaritos para subseqüentes ciclos, os fragmentos de DNA comparados aos escorvadoeres são amplicados exponencialmente, ou melhor linearmente. A referida invenção provê um método para a produção de uma uricase recombinadora mutante compreendendo a transferência de uma célula hospedeira ao vetor, onde a célula hospedeira expressa a uricase, isolando a uricase recombinadora mutante da célua hospedeira, isolando a uricase recombinadora mutante purificada, usando por exemplo, técnicas cromatográficas, e purificando a uricase recombinadora mutante. Por exemplo, a uricase pode ser feita de acordo com os métodos descritos na Publicação da Patente Internacional No. WO 00/080196. incorporada à presente por referência, em sua integridade. A uricase poderá ser isolada e;ou purificada por qualquer método conhecido pelo estado da técnica.Expressos poliptídios desta invenção são geralmente isolados de forma substancialmente pura. Preferivelmente, os poliptídios isolados à uma pureza de ao menos 80% pelo peso, mais preferivelmente de pelo menos 95% pelo peso, e mais preferivelmente ainda ao menos 99& pelo peso. Em geral, a referida purificação poderá ser alcançada usando, por exemplo, as técnicas padrão de fracionamento do sulfato de amônia, eletroforese SDS-PAGE e afinidade cromatográfica. A uricase é preferivelmente isolada usando um surfactante catiônico, por exemplo, cloreto de piridina cetila (CPC) de acordo com o método descrito na Pedido de Patente Norte-Americano requerido em 11 de abril de .2005, No. 60/670.520, sob título "Purificação de Proteínas com Surfactante Catiônico", incorporado à presente por referência em sua integridade. Em uma incorporação da invenção, a célula hospedeira é tratada de modo a causar a expressão da uricase combinadora mutante. Um técnico na matéria sabe que a transferência de células com um vetor é usualmente acompanhada usando DNA precipitado com íons de cálcio, além de uma variedade de outros métodos que poderão ser usados (por exemplo, eletroporação). Em uma incorporação da invenção, o vetor está sob o controle de um promotor osmótico sensitivo de pressão. Um promotor é uma região do DNA na qual a polimerase RNA se liga anter a iniciação da transferência do DNA em RNA. Um promotor osmótico sensitivo de pressão inicia a transferência com um resultado da elavada pressão osmótica sentida pela célula. Em uma incorporação da invenção, o promotor é um promotor osmB modificado. Em preferidas incorporações, a uricase da invenção é uma uricase conjugada com um polímero. Em uma incorporação da invenção, a composição farmacêutica compreendendo a uricase é provida. Em uma incorporação da invenção, a composição pe uma solução da uricase. Em uma incorporação da invenção, a solução é estéril e adequada para injeção. Em uma incorporação da invenção, referida composição compreende a uricase como uma solução na salina isoladora do fosfato, Em uma incorporação da invenção, a composição é provida em um frasco, opcionalmente tendi uma tampa de injeção de borracha. Em particular incorporação, a composição comprende a uricase em solução em uma concentração de 2 à 16 miligramas de uricase por mililitro de solução, de 4 à 12 miligramas por mililitro ou de 6 à 10 miligramas por mililitro. Em uma incorporação da invenção, a composição compreende a uricase em concentração de 9 miligramas por mililitro. Preferivelmente1 a massa da uricase é medida com relação à massa da proteína. Efetivos regimes de administração das composições da invenção, poderão ser determinados por um especialista no assunto. Adequados indicadores para acessarem a efetividade de um determinado regime são conhecidos por um especialista na matéria. Exemplos dos referidos indicadores incluem a normalização ou diminuição nos níveis de ácido úrico plasma (PUA) e a dimunuição na manutenção do PUA para 6.8 mg/dL ou menos, preferível mente 6 mg/dL ou menos. Em uma preferida incorporação, o indivíduo sendo tratado com a composição da invenção tem um PUA de 6 mg/ml ou menos por ao menos 70%, ao menos 80%, ao menos 90% do total do período do tratamento. Por exemplo, para um tratamento de 24 semanas, ou seja, pelo menos um tempo igual à quntidade do tempo em 134,4 dias (24 semanas X 7 dias/semana X 0.8 = 134.4 dias). Em particulares incorporações, 0.5 à 24 mg de uricase em solução é administrada uma vez a cada 2 à 4 semanas. A uricase pode ser administrada de forma apropriada conhecida pelo estado da técnica, por exemplo, intra-venosa, intra-muscular ou subcutaneamente. Preferivelmente1 quando a administração é intra-venosa, 0.5 mg à 12 mg de uricase é administrada. Preferivelmente, quando a administração é subcutânea, 4 à 24 mg de uricase é administrada. Em uma preferida incorporação da invenção, a uricase é administrada por infusão intra-venosa através de um período de 30 à 240 minutos. Em uma incorporação da presente invenção, 8 mg de uricase foram administradas uma vez a cada duas semanas. Em uma incorporação da presente invenção, a infusção poderá ser realizada usando 100 à 500 mL de solução de salina. Em uma incorporação da presente invenção, 8 mg de uricase em solução é administrada durante um perído de 120 minutos uma vez a cada 2 semanas ou uma vez a cada quatro semanas; preferivelmente a uricase é dissolvida em 250mL de solução de salina para infusão. Em uma incorporação da presente invenção, as administrações de uricase ocorreram em um período de tratamento de 3 meses, 6 meses, 8 meses ou 12 meses. Em outra incorporação, o período de tratamento é de 12 semanas, 19/42

24semanas, 36 semanas ou 48 semanas. Em uma incorporação da presente invenção,

Operíodo de tratamento é por um período de tempo mais Iingo1 ou seja, 2 anos ou mais, para a vida do indivíduo ser tratada. Em adição, múltiplos períodos de tratamento poderão ser utilizados intercalados com as vezes de nenhum tratamento, por exemplo, 6 meses de tratamento seguido por 3 meses sem tratamento, seguido por 6 meses adicionais de tratamento, etc. Em certas incorporações, compostos anti-inflamatórios poderão ser profilaticamente administrados para eliminar ou reduzir a ocorrência de reações da infusão devido à administração da uricase. Em uma incorporação da presente invenção, ao menos um corticosteróide, ao menos um anti-histanímico, ao menos um NSAID, ou combinaçõs dos mesmos poderão ser administradas. Adequados corticosteróides incluem betametasona, butesonida, cortisona, dexametasona, hidro-cortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, e triancilona. Adequados NSAIDs incluem ibuprofeno, indometacina, naproxeno, aspirina, acetimonopeno, celecóxibo e valdecóbixo. Adequados anti-histanímicos incluem azatadina, bronfeniramina, cetrizina, clorfeniramina, clemastina, ciproheptadina, desloratidina, dexclorfeniramina, dimenidrinato, doxilamina, fexofenadina, hidroxizina, Ioratadina e fenindamina. Em uma incorporação da presente invenção, o anti-histamínico é fexofenadina, o NSAID é a acetominofeno e o corticosteróide á a hidro-cortisona e/ou prednisona. Preferentemente, uma combinação de todos os três ( não necessariamente concomitante) são administrados antes da infusçõ da solução uricase. Em uma incorporação da presente invenção, o NSAID e o anti-histanímico são administrados oralmente 1 à 4 horas antes da infusão da uricase. Uma adequada dose de fexofenadina inclui aproximadamente 30 à 180 mg, aproximadamente 40 à 150 mg, aproximadamente 50 à 120 mg, aproximadamente 60 à 90 mg, aproximadamente 60 mg, preferivelmente 60 mg. Uma adequada dose de acetominofeno inclui aproximadamente 500 à 1500 mg, aproximadamente 700 à 1200 mg, aproximadamente 800 à 1100 mg, aproximadamente 100 mg, preferivelmente 1000 mg. Uma adequada dose de hidro-cortisona inclui aproximadamente 100 à 500 mg, aproximadamente 150 à 300 mg, aproximadamente 200 mg, preferivelmente 200 mg. Em uma incorporação da presente invenção, o anti-histanímico não é difeniframina. Em uma incorporação da presente invenção, o NSAID não é acetaminofeno. Em uma incorporação da presente invenção, 60 mg de foxofenadina é administrada oralmente à noite antes da infusão da uricase; 60 mg de fexofenadina e 1000 mg de acetominofeno são administrados oralmente na próxima manhã, e finalmente .200 mg de hidro-cortisona é administrada antes da infusão da solução uricase. Em uma incorporação da presente invenção, prednisona é administrada ao dia, preferivelmente à noite antes da administração da uricase. Uma apropriada dosagem de prednisona inclui 5 à 50 mg, preferivelmente 20 mg. Em determinadas incorporações, esses tratamentod profiláticos para eliminar ou reduzir a ocorrência de reações da infusão são utilizados para induvíduos receptores de uricase, incluindo uricase PEGiIatado e uricase não PEGilatado. Em uma incorporação da presente invenção, esses tratamento profiláticos são utilizados por indivíduos receptores de peptídios terapêuticos outros que uricase, onde os peptídios são PEGIitado e não PEGilatado. Em uma incorporação da presente invenção, a composição farmacêutica compreende uma uricase que tenha sido modificada pela conjugação com um polímero, e a uricase modificada retendo a atividade uricolítica. Em uma incorporação da presente invenção, a uricase-polímero conjugados são preparados como descrito na Publicação do Pedido Internacional No. WO 01/59078 e Pedido de Patente Norte-Americano No. 09/501.730 , incorporados à presente por referência em sua integridade. Em uma incorporação da presente invenção, o polímero é selecionado a partir de um grupo compreendendo glicol polietileno, dextrana, glicol polipropileno. Celulose hidroxipropilmetila, celulose carboximetila, pirolidona polivinil e álcool polivinil. Em uma incorporação da presente invenção, a composição compreende 2-12 moléculas de polímero em cada sub-unidade de uricase, preferivelmente 3 à 10 moléculas por sub-unidade de uricase. Em uma incorporação da presente invenção, cada polímero tem um peso molecular entre 1 kD e 100 kD. Em uma incorporação da presente invenção, cada molécula de polímero tem um peso molecular entre 1 kD e 50 kD. Em uma outra preferida incorporação, cada molécula de polímero tem um peso molecular entre 5 kD e 20k D , entre 5 kD e entre 15 kD, aproximadamente entre 10 kD e 12 kD, e mais preferivelmente 10 kD. Em uma incorporação da presente invenção, cada molécula de polímero tem um peso molecular entre 5 kD e 20 kD. Em uma especial incorporação da invenção, cada molécula de polímero tem um peso molecular de 10 kD. Misturas de diferentes pesos moleculares são também contempladas. Em uma incorporação da presente invenção, a composição é apropriada para repitida administração da composição. Em uma incorporação da presente invenção, a conjunção da uricase ao polímero compreende uma articulação selecionada de um grupo consistindo de ligações de uretano, ligações de amina secundárias, e ligações de amida. A referida invenção provê uma célula com capacidade para a produção de uricase contendo uma seqüência de aminoácido de uricase recombinadora, caracterizada por a uricase ter sido mutilada por 1 - 20 aminoácidos em aminoácidos modificados e atividade uricolítica. A referida invenção provê um meio para a metabolização do ácido úrico usando a uricase. A invenção provê ainda o uso de uma composição de uricase para reduzr os níveis de ácido úrico em um fluído biológico. Em uma incorporação da presente invenção, a composição de uricase é usada para a redução de ácido úrico em um fluído biológico compreendendo sangue. Também são providos como elementos inovadores, moléculas de ácido nucléico codificando poliptídios de uricase. As manipulações que resultam na sua produção, são conhecidas pelo estado da técnica. Por exemplo, as seqüências de ácido nucléuco poderão ser modificadas por quaisquer das estratégias conhecidas pelo estado da técnica (Maniatis, Tm 1990, Molecular Cloningm A Laboratoty Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). A seqüência que pode ser penetrada em apropriados locais com restrição endonuclease(s), seguida por modificação residual se desejada, isolada e ligada in vitro. Na produção do gene codificando uma uricase, cuidados deverão ser tomados para assegurar que o gene modificado permanece dentro da apropriada estrutura de leitura de interpretação, não interrompida por sinais de paralisação da interpretação. Adicionalmente, a uricase codificando a seqüencia de ácido nucléico poderá ser modificada in vitro ou in vivo, para criar e/ou destruir a interpretação, iniciação, e/ou término das seqüências, ou criar variações nas regiões codificadas e/ou formar novas restrições para os locais endonuclease ou destruir os mesmo pré- existentes para facilitar ainda a modificação in vitro. Qualquer técnica para mutagênese conhecida pelo estado da técnica poderá ser usada, incluindo, mas não se limitando à mutagêneses direcionadas a locais in vito (Hutchinson, C. et aí., 1978, J. BioL Chem 253:6551), uso dos iigadores TAB® (Farmacia), etc. A seqüência de nucleotídeo para a proteína uricase poderá ser inserida em um apropriado expresso vetor, ou seja, um vetor que contenha elementos necessários para a transcrição e interpretação e transporte da seqüência codificando proteína inserida. Uma variedade de sistemas de vetores hospedeiros poderão ser utilizados para expressar a seqüência codificando proteína. Isto inclui, mas não limita aos sistema de células mamíferas infectadas com vírus (como por exemplo, vírus vacínia, andenovírus, etc); sistemas de células de inseto infectadas com vírus (como por exemplo, baculovírus); microorganismos como germes contendo vetores germinais, ou bactéria transformada com bacteriofagia DNA, plasmídio DNA1 ou cosmídio DNA. Os elementos expressos desses vetores variam em suas resistências e especificações. Dependendo do sistema vetor hospedeiro utilizado, qualquer um de um número de adequada dos elementos de transcrição, interpretação e transporte poderão ser usados. Quaisquer dos métodos conhecidos para a inserção de fragmentos de DNA em vetor poderão ser usados para construir vetores expressos contendo um gene quimérico consistindo de apropriados sinais de controle de transcrição/interpretação/transporte e as seqüências codificando proteína. Esses métodos poderão incluir DNA recombinador in vitro e técnicas sintéticas e recombinações in vivo (recombinação genética). A expressão da seqüência do ácido nucléico codificando proteína uricase poderá ser regulada por uma segunda seqüência de ácido nucléico de modo que a proteína uricase possa ser expressada em uma célula hospedeira com a molécula DNA recombinadora. Por exemplo, a expressão da uricase poderá ser controlada por qualquer elemento promotor/acentuador conhecido no estado da técnica. Promotores que poderão ser usados para controlar a expressão da uricase incluem, mas não se limitam à região promotora precoce SV40 (Bernoist e Ghambon, 1981, Nature 290:304-310), o promotor contido no terminal longo 3' repete o vírus sarcoma Rous (Yamamoto et aL, 1980, Cell 22:787-797), o promotor quinase timidida herpes (Wagner et aL, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78: 144-1445), as seqüências regulatórias do gene metalotionina (Brinster et aL, 1982, Nature 296: 39-42), vetores de expressão procariótica como o promotor β- Iactamase (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75:3727- .3731), o promotor tac (DeBoer, et aí., 1983, Proc. Natl. Acad, Sei. U.S.A. 80:21- .25) e o promotor osmB. Em uma incorporação da presente invenção, o ácido nucléico compreende uma seqüência de ácido nucléico codificando a uricase operativamente ligada ao promotor heterólogo. Uma vez que uma molécula DNA recombinadora compreendendo uma seqüência de ácido nucléico é preparada e isolada, vários métodos conhecidos no estado da técnica poderão ser usados para propagá-la. Uma vez que um sistema hospedeiro e condições de crescimento são estabelecidas, os vetores expressos recombinadores que poderão ser usados incluem, mas não se limitam, aos seguintes vetores ou seus derivados: viroses humana ou animal como o vírus vacínia ou adenovírus, viroses inseticidas como baculovírus, vetores germinais; vetores bacteriopagia (por exemplo, lâmbda), e vetores DNA plasmídio e cosmida para nomeá-los sumariamente. Em adição, a tensão da célula hospedeira poderá ser escolhida de maneira a modular a expressão das seqüências inseridas, ou modificadas e processar o produto da gene na maneira específica desejada. A expressão de certos promotores podem ser elevadas na presença de certos indutores, então a expressão da proteína uricase contruída geneticamente poderá ser controlada. Além disso, diferentes células hospedeiras tem características e mecanismos específicos para o processamento de interpretação/transporte e modificação (por exemplo, gíicosilação, clivagem) das proteínas. Apropriadas iinhas de células ou sistemas hospedeiros poderão ser escolhidos para assegurarem a desejada modificação e processamento da expressa proteína alienígena. Diferentes sistemas de expressão de vetores hospedeiros poderão efetuar o processamento de reações como clivagem proteolítica para diferentes extensões. Em uma incorporação da presente invenção, a expressão da uricase em E. coii é preferivelmente realizada usando vetores que compreendem o promotor omsB. EXEMPLOS:

Exemplo 1. Construção do Gene e Expressão Plasmídeo Para Expressão Uricase.

A uricase suína recombinadora (oxidase de urato), uricase Porco-KS-ΔΝ (proteína uricase de porco mutilada com amina terminal substituindo os aminoácidos 291 e 301 com Iisina e serina, respectivamente), foi expressada em E. coli extenuação W3110F-A da séris de plasmídios que foi construído culminando em pOUR-P-AN-ks-1, que na transformação das células hospedeiras E. coli foram capazes de direcionar eficientemene a expressão da uricase. Isolamento e Sub-clonage da Uricase cDNA do Porco e do Fígado de Babuíno

As uricases cDNAa foram preparadas de porcos e fígados de babuínos pelo isolamento e sub-clonagem do relevane RNA. O RNA total celular foi extraído de porcos e fígados de babuínos (Erlich, H.A. (1989). PCR Technology;Principles and Application for DNA Amplification;Sambrool, J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd editton; Asunel. F. M. et al (1989). Correntes protocoloos em biologia molecular, então transcreveram contrariamente a Primeira Síntese do Kit Filamento cDNA (Pharmacia Biotech). A amplificação do PCR foi realizada usando polimerase DNA Taq (Gibco BRL, Life Technologies). Os escorvadores oligonucleotídeo sintéticos usados para a amplificação do PCR do porco e do fígado de babuíno forams oxidases de urato (uricase) como mostrados na Tabela 1.

Tabela 1. Escorvadores Para Amplificação PCR da Uricase cDNA

<table>table see original document page 25</column></row><table> As seqiiencias de restrição da enzima, introduzidas nas extremidades dos escorvadores e mostrado em letras minúsculas na Tabela 1, foram senso EcoRI e Ncol (porco e babuíno) e anti-senso Ncol, Hindlll e Xbal (porco), Xbal e Ncol (babuíno), No senso do escorvador do babuíno, o terceiro códon GAC (ácido aspártico) presente na uricase do babuíno foi substituída com CAC (histidina), o códon que está presente na posição da seqüência codificada do pseudogene oxidase de ureto humano. A uricase do babuíno recombinadora construída geneticamente usando esses escorvadores é nomeada Uricase de babuíno D3H. A uricase do porco PCR foi digerida com EcoRI e Hindlll e clonada no pUC18 para criar pUC18 - Uricase de Porco. A Uricase do babuíno D3H do produto PCR foi clonada diretamente no vetor pCR™Il, usando Clonagem TA™ (Invitrogen, Carlsnad, CA), criando pCR™ll-Uricase de babuíno D3H. Os DNAs ligados foram usados para transformar E. coli resistente XLI-AzuI (Stratagene, La Jolia3 CA), DNA plasmídeo contendo uricase cDNA clonada, foi preparada, e os clones que sossuiam a uricase publicada com seqüências DNA codificadas (excetp para a substituição da uricase de babuíno D3H, mostrado na Tabela 1) foram selecionadas e isoladas. No pCR™IIO clone escolhido da Uricase do Babuíno D3H, as seqüências pCR™ll ficaram próximas do códon de paralisação da uricase, resultando na deleção das seqüências introduzidas pelo PCR. Como uma conseqüência, os locais de restrição Xbal e Ncol da região não interpretada 3' foram eliminadas, e assim permitindo o uso da clonagem direcional Ncol na extremidade 5' do produto PCR e Bamll que é derivada do vetor pCR™ll. Sub-cionagem da Uricase cDNA na Expressão dos Vetores pET Sub-clonagem da Uricase do babuíno O cDNA do babuíno 3DH contendo completa dimensão da uricase da seqüência codificada foi introduzida na expressão do vetor pRT-3d (Novagen, Madison, Wl). O pCR™ll da Uricase de Babuíno D3H foi digerida com Ncol e BamHIm e 960 bp de fragmento foi isolado. A expressão do plasmídeo pET-3d foi digerida com Ncol e BamHIj e 4600 bp de fragmento foi isolado. Os dois primeiros fragementos foram ligados para criar pET-3d-BabuínoD3H. Sub-clonagem da Uricase Quimérica Porco-Babuino

A uricase quimérica porco-babuíno (PCB) foi construída mo sentido de ganhar alta estabilidade de expressão isolando o fragmento 4936 bp Bcol-Apal do clone do babuíno pRT-3d-D3H e ligando o isolado fragmento com o fragmento 624 bp Ncol-Apal islolado da Uricase do Proco pUC-18, resultando na formação do pET- 3d-PBC. O cDNA uricase PBC consiste de códons de uricase de porco 1-225 formada em estruturas oara os códons da uricase do babuíno 226-304. Sub-clonagem da Uricase do Porco-KS 26/42

A uricase do Porco-KS foi construída no sentido de adicionar um resíduo de íisina, que poderá prover um adicional local de PEGilação. KS se refere à aminoácido inserido da Iisina da uricase do porco, na posição 291, em lugar da arginina (R291K). Em adição, a treonina na posição 301 foi substituída com serina (T301S). O plasmídeo da uricase do Porco-KS foi construída pelo isolamento do fragmento 4969 bp N-col-Ndel do Babuíno pET-3d-D3H, e então ele foi ligado com fragmento 864 Ncol-Ndel isolado da Uricase do Porco pUC-18, resultando na formação do pET-3d-Porco-KS. A resultante seqüência da uricase PorcoKS consiste de códons de uricase de porco 1-288 formadas na estrutura dos códons 289-304 da uricase do babuíno.

Sub-clonagem da Seqüência da Uricase Sob a Regulação do Promotor osmB

O gene da uricase foi sub-clonado em vetor de expressão contendo o promotor osmB (seguindo o ensinamento da Patente Norte-Americana No. 5.795.776, incorporada aqui por referência em sua integridade). Esse vetor possibilitou a indução da expressão da proteína em resposta à alta pressão osmótica ou na envelhecida cultura. A expressão plasmídeo pMFOA-18 contido no promotor osmB, uma seqüêncida do local de ligação ribosomal (rbs) e a transcrição da seqüência terminadora (ter). Ela confere resistência à ampicilina (AmoR) e expressa a esterease acetilkcolina humana recombinadora (AChE).

Sub-clonagem da Uricase de Babuíno D3H

O plasmídeo pMFOA-18 foi diferido com Ncol e BamHI, e o grande fragmento foi isolado. A construção do Babuíno pET-3d-D#H foi digerida com Ncol e BamHI e o fragmento 960 bp que incluiu o gene da uricase do Babuíno D3H que foi isolado. Esses dois fragmentos ligados para criar pMF0U18. A expressão do plasmídeo pMFXT133 contida no promotor osmB, um rbs (E. coli deo operon), ter (E. coli TrypA), o fator recombiandoir Xa poliptídio inibidor (Fxal), e ele conferiram o gene de resistência tetraciclina (TetR). O gene da uricase do babuíno foi inserida no seu plasmídeo no sentido de alterar os genes de resistência antibiótica. O plasmídeo pMFOU19 foi digerido com Ncol, preenchido, e então diferido com Xhol, e um fragmento 1030 bp foi isolado.O plasmídeo pMFXT133 foi digerido com Ndel, preenchido, e então ele foi digerido com Xhol, e o grande fragmento foi isolado. Os dois fragmentos foram ligados para criar o vetor de expressão da uricase do babuíno, pURBA16. Sub-clonage da Uricase Quimérica do Porco Babuíno

O plasmídeo pURBA16 foi digerido com Apal e AiwNI, e o fragmento 2320 bp foi isolado. O plasmídeo pMFXT133 foi diferido com Ndel, preencho, e então foi digerido com AiwNI, e o fragmento 620 bp foi isolado. A construção pET-3d-PBC foi digerida com Xbal, preenchida, e então ela foi digerida com Apal, e o fragmento 71 Obp foi isolado. Os três fragmentos foram ligados para criar o pUR- PB, uma plasmídeo que a uricase expressa PBC sob o controle do promotor osmB e rbe bem como o rbs 17, foi derivada do vetor pET-3d. O rbs T7 foi imposto em uma etapa adicional, o pUR-PB foi digerido com Ncol, preenchido, e então digerido com AiwNI, e o fragmento 3000 bp foi isolado. O plasmídeo pMFXTI33 foi digerido com AiwNI, e o fragmento 620 bp foi isolado, Os dois fragmentos foram ligados para formar pDUR-PR que expressa o PBC sob o controle do promotor osmB.

Construção do pOUR-PBCANC

Várias alterações foram introduzidas na uricase cDNA, que resultou em um substancial aumento na estabilidade da enzima recombinadora. O plasmídeo pOUR-PBC-ANC foi construídono qual o peptídio de maturação do resíduo seis terminal-N e o tri-peptídio no terminal-C, que funciona in vivo como sinal rotulante peroximal, foram todos removidos. Isto foi realizado pela utilização da seqüência PBC no plasmído pDRU-PB e os escorvadores oligonucleotídeos específicos listados na Tabela 2, usando a amplificação do PCR Tabela 2 - Escorvadores para a Amplificação PCR da Uricase PBC-ANC

<table>table see original document page 28</column></row><table>

As seqüências de restrição da enzima introduzidas nas extremidades dis escorvadores mostradas em negrito, e as regiões não codificadas são mostrada 28/42

em letras minúsculas da Tabela 2. Ndel é o sendo e Xbal é o ant-senso. O escorvador anti-senso foi também usado para eliminar um local de restrição interna Bdel pela introdução de um ponto de mutação (sublinhado) que não afetou a seqüência do aminoácido, e então, facilitando a sub-clonagem pelo uso do Ndel. O fragmento base-par 900 gerado pela amplificação do pDUR-PB foi elevado com Ndel e Xbal e isolado. O fragmento obtido foi então inserido em uma expressão deo-plasmídeo pDBAST-RAT-N, que ancora o promotor deo- P1P2 e o rbs derivado de E. coli e constitutivamente expressa o precursos de insulina recombinadora humana. O plasmídeo foi digerido com Ndel e Xbal e o fragmento 4035 bp foi isolado e ligado ao produto da uricase PCB. A construção resultante, pDUR-PBANC, foi usada para transformar E. coli K-12S<t>733 (F-cytR strA) que expressou um alto nível de uricase mutilada ativa. A seqüência duplamente mutilada PBC-ANC foi também expressada sob o controle do promotor osmB,0 plasmídio pDUR-PB-ANC foi digerido com AlwNI-Ndel,e o fragmento 3459 bp foim isolado. O plasmídeo pMFXT133, descrito acima, foi diferido com Ndel-AwiNI, e o fragmento 660 bp foi isolado. Os fragmentos foram então ligados para criar o pOUR-PB-ANC, que foi introduzido no E. coli e deslocado para W3100 e expressando o alto nível da uricase mutilada ativa. Construção da Expressão da Uricase Plasmídeo pOUR-P-AN-ks-1 Este plasmídio foi construído no sentido de aperfeiçoar a atividade e a estabilidade da enzima recombinadora. A uricase Porco-KS-ΔΝ foi mutilada no terminal-N (ΔΝ) onde o peptídio de maturação seis-residual terminal-N foi removido, e contendo as mutações S46T, R291K e T301S. Na posição 46, havia um resíduo de treonia ao invés de serina devido à mutação conservante que ocorreu durantre a aplificação do PCR e clonagem. Na posição 291, a Iisina substituiu a arginina 301, a serina foi introduzida ao invés da treonina. Ambas foram derivadas da seqüência da uricase do babuíno. As modificações R291K e T301S são designadas KS1 e discutidas acima, O resíduo extra-lisina provido em adicional local potencial de PEGilação. Para construir pOUR-P-AN-ks-1 (Figura 1), o plasmídeo pOUR-PB-ANC foi digerido com Apal -Xbal, e o fragmento 3873 bp foi isolado. O plasmídeo pRT-3d-PKS (construção mostrada na Figura 4) foi digerida com Apal - Spel, e o fragmento 270 bp foi isolado. A clivagem Spel deixada na extensão 5'CTAG que foi eficientemente ligada aos fragmentos DNA gerados por Xbal. Os dois fragmentos foram ligados para criar pOUR-P-AN-ks-1. Após a ligação, os locais de reconhecimento Spel e Xbal foram perdidos (seu locai é mostrado entre parenteses na Figura 9). O construído pOUR-P-AN-ks-1 foi introduzido no E. coli K-12 deslocado para W3110F1 prototrófico ATCC#27235. A resultante uricase Porco-KS-ΔΝ, expressada sob o controle do promotor osmB, germinado com altos níveis de enzima recombinadora tendo superior atividade e estabilidade. A Figura 1 ilustra a estrutura do plasmídeo pOUR-P-AN-ks-1, Números próximos aos locais de restrição indicam a posição nucleotídeo, relativa ao local Haell, designado como 1; locais de restrição que foram perdidos durante a clonagem e sçao maracados entre parênteses. O plasmídio pOUR-P-AN-ks-1, codificando a uricase Porco-KS-ΔΝ é a base de pares (bp) 4143 longa e compreendida pelos seguintes elementos:

1. Um fragmento de DNA, longo 113 bp, espanado do nucleotídeo número 1 para o local Ndel (na posição 113), que inclui o promotor osmB e o ribossoma ligando o local (rbs).

2. Um fragemento de DNA, longo 932 bp, espanado do Ndel (na posição .113) para a junção Spel/Xbal (na posição 1045), que inclui: 900 bp do Porco-KS- ΔΝ (seqüência de ácido nucléico da proteína uricase mutiliada da amina termina!, na qualo os aminoácidos 291 e 301 com Iisina e seria, respectivamente são substituídos) codificando a região e flanqueando a seqüência derivada do pCR™ll, do local acima da clonagem TA para o local de restrição Spel/Xbal.

3. A seqüência 25 bp de locais de múltiplas clonagens (MCS) da junção Spel/Xbal (na posição 1045) para HindIII (na posição 1070).

4. Um nucleotídeo sintéticp 40 bp contendo um terminal de transcrição TrpA (ter) com Hindlll (na posição 1070) e terminando em Aatll (na posição 1110).

5. Um fragmento de DNA, 1519 bp longo, espanado da Aatll (na posição .1110) para os locais Mscl/Scal (na posição 2629) em pE3R322 que inclui o gene de resistência tetraciclina (TetR).

6. Um fragmento de DNA, longo 1514 bp, espanado do Scal (na posição .2629) para os locais Haell (na posição 4143) em pBR322 que inclui a origem da

replicação do Dna.

A Figura 2 mostra o DNA e as seqüências de aminoácido deduzidas da uricase do Porco-KS-ΔΝ. Nesta Figura, a numeração do aminoácido é de acordo com a 30/42

completa seqüência da uricase do porco. Seguindo o resíduo de metionina iniciador, uma treonina foi inserida em lugar do ácido aspártico da seqüência da uricase do porco. Este resíduo de treonina possibilitou a remoção da metionina por aminopeptidase baterial. O intervalo na seqüência do aminoácido ilustra o peptídio de maturação do terminal-N deletado. Os locais de restrição que foram usados para as várias etapas de sub-cionagem das diferentes seqüências da uricase (Apal, BamHI, EcoRI e Spel) são indicadas. A seqüência não transportada 3', mostrada em letras minúsculas, que foi derivada da seqüência pCR™ll. O códon de paralisação da interpretação é indicado por um asterisco. A Figura 3 mostra o alinhamento das seqüências de aminoácido das várias seqüencias da uricase recombinadora. A linha superior representa a uricase do porco, que incluiu a completa seqüência do aminoácido. A segunda linha é a seqüência da uricase quimérica do porco-babuíno duplamente mutilada (PBC- ANC). A terceira linha mostra a seqüência da uricase Porco-KS-ΔΝ, que é somente mutilada no terminal-N e contendo as mutações S46Y e as alterações do aminoácido R291K e T301S, ambas refletindo a origem dom babuíno do terminal carboxilka da uricase codificando a seqüência. Os asteriscos indicam as posições mas quais existem diferenças nos aminoácidos no Porco-KS-ΔΝ quando comparado à seqüência de uricase de porco publicada, os círculos indicam posições nas quais existem diferenças nos aminoácidos no Porco-KS- ΔΝ comparados ao PCB-ΔΝ, a quimérica porco-babuíno, e as linhas traçadas indicam a deleção dos aminoácidos. O cDNA para a uricase de babuíno nativo, porco, coelho com mutação Y97Hm e a quimérica porco/babuíno (PBC) foram construídas por clonagem no E. coli expressando altos níveis de uricases variantes que foram construídas e selecionadas todas sendo W3110 F E. coli, e a expressão sendo regulada pelo osmB. Os DNAs plasmídeos foram isolados, verificados pelo DNA seqüencial a pelas análises de restrição da enzima, e as células foram cultivadas. A construção das uricase mutiladas, incluindo Porco- ΔΝ, e Peoco-KS-ΔΝ foi feita pela ligação cruzada entre PCB-ΔΝ, seguindo de clivagem com restrição endonuclease Apal e Xbal, e Apal mais Spel , respectivamente. Será razoável que esses mutantes variáveis retenham atividade, uma term que os resíduso do seus terminais-M , o peptídio de maturação" (1-2) e o tri-peptídio terminal-C, "sinal rotulador peroxisomal" (3-5) 31/42

não tem funções que significantemente afetem a atividade enzimática, e será possível que essas seqüências possam ser imunogênicas. Clones expressando níveis muito altos de uricases foram selecionados.

Exemplo 2. Transformação da Expressão Plasmídeo em Uma Célula Hospedeira Bacterial

A expressão plasmídia, pOUR-P-AN-ks-1, foi intruduzida no E. coli K-12 deslocada gpara W3110 F. As células bacteriais foram preparadas para transformação envolvendo crescimento oara etapa meio logo no caldo Luria (LB) sendo então as células colhidas pela centrifugação, lavadas em água fria e suspensas em 10% de glicerol em água em um concentração de aproximadamente 3 χ 1010 células por ml. As células foram armazenadas em alíquotas, à 70° C. O DNA plasmídeo foi precipitado em etanoí e dissolvido em água. Células bactérias de DNA plasmídeo foram misturas e a transformação foi feita pelo método de eletroporação de alta voltagem usando Pulsador de Gene Il de BIO-RAD (Trevors et al (1992). A eletro-transformação da bactéria pelo DNA plasmídeo, no Guia para Eletroporação e Eletrofusão (D.C. Chang, B.M. Chassy, J.A. Saunders e A. E. Sowers, eds). Pp. 265-290, Academic Press lnc, San Diego1 Hanahan et al (1991) Meth. Enzymol., 204, 63-113). A células transformadas foram suspensas em uma média de SOC (2% de triptona, 0.5% de extrato de levedura, 10mM NaC1, 2.5mM KC1, 10 mM Mg C12, 10mM Mg SO4, 20 mM de glicose), incubadas, à 37° C, por 1 hora e selecionada para resistência tetraciclina. Um alto clone foi selecionado. Exemplo 3. Preparação da Uricase Recombinadora,

Bactéria como aquelas transformadas (ver acima) foram cultivadas contendo glicose; o pH foi mantido à 7.2+ 0.2 à aproximadamente 37° C. Próximo das últimas 5-6 horas de cultivação, a média foi suplementada com KS1 para uma final concentração de 0.3M. A cultivação foi continuada para permitir a acumulação da uricase. A uricase recombinadora acumulada, foi lavada por centrifugação e suspensa em 50mM de isolante Tris, pH 8.0 e 10mm EDTA e trazida para um volume fional de aproximadamente 40 vezes o peso da célula sêca. As uricases recombinadoras contendo Ibs, foram isoladas pela centrifugação seguindo do rompimento das célulass bactérias usando Iisossoma e alta pressão. O tratamento com Iisossoma (2000-3000 unidades/ml) foi feito 32/42

por 16-20 horas no pH 8.0 e 7+ 3o C, enquanto se misturava. O grânulo foi lavado com água e armazenado à 20° C até o uso. Os enriquecidos !Bs foram ainda processados após a suspensão em 50nm no isolante NaHCO3 com pH 10.3+0.1. A suspensão foi incubada por toda a noite, em temperatura ambiente, para permitir a solubilização da uricase derivada-IB, e subseqüentemente clarificada pela centrifugação. A uricase foi ainda purificada por várias etapas de cromatografia. Inicialmente, a cromatografia foi feita em uma coluna Q-Sefarose FF. A coluna carregada foi lavada com um isolante de bicarbonato contendo 150 nM Nacl, e uricase foi eluída com o isolante de bicarbonato, contendo 250 mM NaC1. Então, a resina Xantina-agarose (Sigma) foi usada para remover as menores impurezas na preparação da uricase. O Q-Sefarose FF foi diluído com 50mM de isolante de gíicina, pH 10.3+0.1, para uma concentração de proteína de aproximadamente 0.25 mg/ml e carregada. A coluna foi lavada com isolante de bicarbonato, pH 10.3+0.1, contendo 100 mM NaC1, e a uricase foi eluída com o mesmo isolante suplementadod com 60 μΜ de xantina. Neste estágio, a uricase foi purificada pela cromatografia Q-Sefarose para remover formas agregadas. A pureza de cada preparação de uricase é maior do que 95%, como determinado pelo tamanho da exclusão cromatográfica. Menos do que 0.5 das formas agregadas são detectadas em cada preparação usando uma coluna Superdex 200. A Tabele 3 resume a purificação da uricase Porco-KSAN dos derivados IBs de 25 L de caldo fermentado.

Tabela 3. Purificação da Uricase Porco-KSAN

<table>table see original document page 33</column></row><table> Exemplo 4. Características das Uricases Recombinadoras SDS-PAGE

A análise de SDS-PAGE da uricase variante altamente purificada (Figura 4) revelou

Melhores padrões distintivos. As amostras foram armazenadas à 4o C, no isolanate de bicarbonato, pH 10.3 por até vários meses. O completo tamanho das variantes, Porco, Porco-KS, e PBC, mostram o acúmulo de dois produtos com maior degradação tendo pesos moleculares de aproximadamente 20 e 15kD. Esta observação sugere que ao menos um único entalhe é encontrado na molécula da sub-unidade da uricase. Um diferente padrão de degradação é detectado nos clones encurtados de amina terminal e também na uricase do coelho, mas em baixa proporção. A amina terminal do coelho assemelha-se àquela dos clones encurtados. As seqüências da amina terminal dos fragmentos da uricase gerados durante a purificação e armazenados foram determinados. Peptídio Seqüencial

As preparações da uricase de grande quantidade seqüenciais terminais-N foram feitas pelo método de degradaçao Edman. Dez ciclos foram realizados. A uricade de porco recombinadora (clone de completa dimensão) gerou uma grande abundância de fragmentos comparados ao Porco-KS-ΔΝ. Os locais de clivagem deduzidos conduziram os fragmentos da degradação da seguinte forma:

1) Local maior na posição 168 tendo a seqüência: --WSGjFEGI-

2) Local menor na posição 142 tendo a seqüência: -IRNjGPPVI—

As seqüências acioma não sugerem nenhuma conhecida clivagem proteolítica. Todavia a clivagem poderá aparecer de outras proteolíticas ou alguma reação química. As uricases de amina mutiladas são supreendentemente mais estáveis dos que as uricas contendo nenhum amina mutiladas. O PBC-ANC também tinham similar estabilidade às outras moléculas ΔΝ e menos dod que o PCB de não amina mutilado. A atividade da uricase foi medida por um método UV. A taxa da reação enzimática foi determinada pela medição do decréscimo na absorção em 292 nm resultante da oxidação do ácico úrico para alantoína. Uma unidade de atividade é definida como uma quantidade da uricase requerida para oxidiar um pmole de ácido úrico por minuto, à 25° C, nas condições especificadas. A potência da uricase é expressada nas unidades da atividade por mg de proteína (U/mg). O coeficiente de extinção de 1 nM de ácido úrico em 292 nm é 12.2 nM .1cm"1. Assim sendo, a oxidação de 1 μιτιοΐβ de ácido úrico por ml da reação da mistura resuitada em um decréscimo na absorção de 12.2mA292· A alteração da absorção com tempo (ΔΑ292 por minuto) foi derivada a partir da parte linear da curva. A concentração da protéina foi determinada usando um método modificado Bradford (Macart e Gerbaut (1982) Clin Chim Acta 122:93-10). A atividade específica (potência) da uricase foi calculada pela divisão da atividade em U/ml com concentração de proteína em mg/ml. A atividade enzimática resulta de várias uricases recombinadoras que são sumarizadas na Tabela 4. Os resultados das preparações comerciais são incluídas como valores de referência. Se torna aparente desses resultados que a mutilação das proteínas uricas não tem significante efeito em sua atividade enzimática. Tabela 4. Sumário dos Parâmetros Cinéticos de Uricases Nativas e Recombinadoras

<table>table see original document page 35</column></row><table>

Tabela 4: Notas (1) A concentração da proteína foi determinada pela absorção medida em 278 nm, usando um Coeficiente de Extinção de 11.3 para uma solução de uricase de 10 mg/ml (Mahier1 1963).

(2) 1 unidade da atividade uricase é definida pela quantidade das enzimas que oxidam 1 Mmole de ácido úrico para alantoína por minuto à 25° C.

(3) Os valores específicos da atividade foram derivados dos gráficos Lineweaver- Burk, em uma concentração de substrato equivalente à 60 μΜ.

(4) As misturas das reação foram compostas de várias combinações do seguinte estoque de soluções

100 nM de isolante de borato de sódio, pH 9.2

300 μΜ de ácido úrico em 50mM de isolante de borato de sódio, pH 9.2 1 mg/ml de BSA em 50 nM de isolante de borato de sódio, pH 9.2

(5) Kcat foi calculado pela divisção do Vmas ( calculado a partir do gráfico Lineweaver-Burk) pela concentração da uricase na mistura da reação

(expressada em mol equivalentes baseados no pesos moleculares tetraméricos das uricaseO.

Exemplo 5. Conjugação da Uricase Com m-PEG (PEGilação)

A Uricase Porco-KS-ΔΝ foi conjugada usando (monometoxila-poli(glicol etileno)- carbonato de nitrofenila). A condições resultaram em 2 - 12 filamentos de 5, 10 ou 20 kD PEG por sub-unidade de uricase que foi estabelecida. O m-PEG-NPC foi gradualmente adicionado à solução da proteína. Após a adoção do PEG ter sido concluída, a mistura da reação m-PEG-NPC/uricase foi então encubada à 2- 8o C por 16-18 horas, até os máximos filamentos não ligados foram conugados à uricase. O número de filamentos PEG por monômero uricase-PEG foi determinado pela exclusção cromatográfica tamanho 6 Superose (SEC), usando PEG e uricases padrões. O número de filamentos PEG ligados por sub-unidade foi determinado pela seguinte equação:

PEG 3.42 χ Quantidade de PEG em Amostra Injetada

íugl

Filamentos/sub-unidade = Quantidade da proteína na Amostra Injetada (pg) A concentração do PEG e meias-proteínas de amostra de uricase-PEG foi determinada pelo tamanho excluso cromatográfico (SEC) usando ultravioleta (UV) e índice refrativo (RI) dos detectores harmonizados em série (como 36/42

desenvolvido por Kunitani et al.f 1991). Três curvas de calibragem são geradas: uma curva de proteína (absorção medida em 220 nm); uma curva de proteína (medida por Rl):e curva PEG (medidad pela pressão RI). Assim, as amostras de uricase-PEG foram analisadas usando o mesmo sistema.

O resultante UV e os valores da área de pico Ri das amostras experimentais foram usadas para calcular a concentração do PEG e proteína relativa das curvas de calibragem. O índicce de 3.42 no quociente entre o meso molecular do monômero da uricase (34.192 Daltons) àqueles do 10 jD PEG. O aperfeiçoado PEG anexado à solubilidade da uricase em soluções tendi valores 10 fisiológicos pH. A Tabela 5 prove uma indicação da variação entre lotes do produto da uricase PEGiIatada Porco-KS-ΔΝ. Em geral há uma relação inversa entre o número dos filamentos PEG e a atividade específica retida (SA) da enzima.

Tabela 5. Atividade Enzimática dos Conjugados da Uricase PEGiIatada 15 Porco-KS-ΔΝ

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Exemplo 6: PEGilação da Uricase com 1000 D e 100.000 D PEG

A uricase Porco-KS-ΔΝ foi conjugada usando 1000 D e 100.000 D m-PEG-NC como descrito no Exemplo 5. As condições resultantes nos filamentos 2-11 do PEG por sub-unidade de uricase foram usadas. Após a adição do PEG ter sido concluída, a mistura da reação m-PEG-NPC/uricase foi então incubada à 2-8° C por 16-18 horas, até os máximos filamentos nâo ligados PEG serem conjugados à uriease, O número dos filamentos PEEG por monômetro uricase-PEG Iot determinado como acima descrito. O aperfeiçoado PEG anexado da sotubilidade da uriease nas soluções tendo valores fisiológicos pH.

Exemplo 7. farmacocinéticos d« Uriease Porco-KS-AN Conjugados com PEG

Experêricias biológicas foram empreendidas para determinar a extensão ideal e tamanho do PEG necessários para prover benefícios terapêuticos. Estudos farmacocinéticos em ratos, usando injeções i.v. de 0.4 mg (211) por peso do kilo do corpo da uriease não modificada, administrada em 1 dia e 8 dias, produtiva à circulação meia vida de aproximadamente 10 minutos. Entretanto, estudos da taxa de desobstrução em ratos com uriease 2-ttx10kD PEG-Porco- KS-ΔΝ. após aproximadamente 9 semanas de injeções, indicaram que a desobstrução nâo dependeu do número de filamentos PEG (dentro deste Iimitej permanecendo relativamente constante através de todo o período de estudo (ver Tabela 6, com meia vida de aproximadamente 30 horas). As diferenças de semana a semana estão dentro do estabelecido em erros experimentais, O mesmo padrão á aparente após nove injeções de uricases IOxSkDPEG e 10>c20kDPEG conjugadas, Os resultados indicaram que a nâo ser a extensão da uriease PEQIiação, nesse limite, similares efeitos bioléflicos foram observados no rato modelo. Tabela 6. Meias Vidas da Uricase PEGiIatada Porco-KS-ΔΝ PARA PREPARAÇÃO EM RATOS

<table>table see original document page 39</column></row><table>

Tabela 6 Nota: Resultados são indicados em horas ± padrão de erro do meio. Números em parênteses indicam o número de animais testados. Ratos que receberam semanalmente injeções i.v de 0.4 mg por quilo/peso do corpo da uricase modificada Porco-KS-ΔΝ como indicado na Tabela. Cada grupo inicialmente compreende 15 ratos, que foram alternativamente combinados em sub-grupos de 5. Vários ratos morreram durante o estudo devido à anestesia. Meias-vidas foram determinadas pela medição da atividade da uricase (análise colimétrica) em amostras de plasma coletadas em 5 minutos, e 6, 24 e 48 pós injeção. A Tabela 5 descreve os lotes da uricase PEGiIatada usados no estudo. Estudos de bioviabilidade com uricase 6x5 kD PEG-Porco-KS-ΔΝ em coelhos indicam que, após a primeira injeção, a circulação meia-vida é 98.2^1.8 horas (i.v) e a bioviabilidade após injeções i.m e subcutânea (s.c.) foram 71% e 52% respectivamente. Entretanto, significantes padrões de concentração anti-corpo anti-uricase foram detectadas, após as segundas injeções i.m. e s.c., em todos os coelhos e a desobstrução foi acelerada seguindo as subseqüentes injeções. As injeções dos ratos com o mesmo conjugado resultaram em meia-vida de .26+1.6 horas (i.v), e a bio-viabilidade após as injeções i.v. e s.c. foram 33% e .22% respectivamente. Estudos em ratos, com uricase 9x10 kD PEG-Porco-KS- ΔΝ indicam que a circulação meia-vida após a primeira injeção pe de 42.4 horas (i.v.) e a bio-viabilidade, após as injeções i.v. e s.c., foram de 28.9% e 14.5% respectivamente (ver Figura 5 e Tabela 7).

Após a quarta injeção, a circulação meia-vida foi de 32.1+2.4 horas e a bio- viabilidade, após as injeções i.m. e s.c. foram de 26.1% e 14.9% respectivamente. Similares estudos farmacocinéticos, em coelhos, com a uricase .9x10 kD PEG-Porco-SK-ΔΝ indicam que nenhuma desobstrução acelerada foi observada seguindo a injeção deste conjugado (4 injeções bi-semanais foram injetadas). Nesses animais, a circulação meia-vida após a primeira injeção foi de .88.5 horas (i.v) e a bio-viabilidade, após as injeções i.m. e s.c. foram de 98.3% e .84.8%> respectivamente) ver Figura 6 e Tabela 7).

Após a quarta injeção a circulação meia-vida foi de 14.1+15.4 horas e a bio- viabilidade, após as injeções i.m e s.c foram ded 85% e 83% respectivamente. Similares estudos com uricase 9x10 kD PEG-Porco-KS-ΔΝ foram feitas para acessar a bio-viabilidade em cães beagles (2 machos e 2 fêmeas em cada grupo). Uma circulação meia-vida de 70+11.7 horas foi gravada após a primeira injeção i.v. e a bio-viabilidade após as injeções i.m e s.c foram de 69.5% e .50.4%, respectivamente (ver Figura 7 e Tabela 7). 40/42

Estudos com preparações 9x10 kD PEG-Porco-KS-ΔΝ foram feitas usando porcos. Três animais por grupo foram usados para administração via rotas i.v., s.c. e i.m.. Uma circulação meia-vida de 178+24 horas foi gravada após a primeira injeção i.v. e a bio-viabilidade, a pós as injeções i.m. e s.c. foram de 5 71.6% e 76.8% respectivamente (ver Figura 8 e Tabela 7).

Tabela 7. Estudos Farmacocinéticos com Uricase 9x10 kD PEG Porco-KS- ΔΝ

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Os estudos de absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) foram feitos após a iodinização da uricase 9x1 OkD PEG-Porco-KS-ΔΝ pelo método Bolton & Hunter com 125I. O conjugado rotulado foi inhetado em 7 grupos de 4 ratos cada (2 machos e 2 fêmeas). A distribuição da radio-atividade foi analisada após 1 hora e a cada 24 horas por 7 dias (exceto no 5o dia). Cada grupo, em seu turno, foi sacrificado e os diferentes órgãos foram extirpados e analisados. O sétimo grupo foi mantidoem uma gaiola metabólica, na qual a urina e as fezes foram coletadas. A distribuição do todo o material do corpo do animal foi avaliado pela medição da total radio-atividade de cada órgão, e a fração da contagem (rim, fígado, pulmão e baço) que foram viabilizados por precipitação com TCA (ou seja, proteína unida, normalizada e dimensão do órgão). Dos órgãos que foram extirpados, nenhum tinha uma mais alta radio-atividade do que os outros, e assim, nenhum significante acúmulo foi visto por exemplo no fígado ou rim. .70% da radio-atividade foi expelida pelo 7o dia.

Exempio 8. Resultados dos Testes Clínicos

Um aleatório, aberto, multi-central ou paralelo grupo de estudi foi realizado para acessar a resposta da urato, e os perfis farmacocinéticos e de seguranão da uricase PEG (Puricase®, Savient Farmacêutico) em pacientes humanos com hiperuricemia e severa gota não respoderam ou foram intolerantes à convencional terapia. A duração média da doença foi de 14 anos e 70% da população estudada tinha um ou mais tofos (depósito de uratos). No estudo, 41 pacientes (idade média de 58.1 anos) foram tratatos aleatoriamente por 12 semanas com uricase-PEG intra-venosa em uma das quatro doses do regime: 4 mg cada duas semanas (7 pacientes); 8 mg cada duas semanas (8 pacientes), 8 mg cada quatro semanas (13 pacientes), ou 12 mg cada quatro semanas (13 pacientes). A atividade da uricase plasma e níveis de urato foram medidos em definidos intervalos. Parâmetros farmacocinéticos, média concentração de urato plasma e a percentagem do tempo do urato plasma foi inferior do que ou igual à .6 mg/dL que foram derivados das análises das atividades da uricase e dos níveis de urato. Pacientes que receberam 8 mg de uricase-PEG cada duas semanas tiveram melhor redução no PUA com níveis abaixo de 6mg/dL 92 por cento do tempo de tratamento (pré-tratamento do urato do plasma de 9.1 mg/dL urato plasma médio de 1.4 mg sobre 12 semanas). Substanciais e favorecidos níveis baixos de urato de plasma foram também observados em outros grupos dosados com o tratamento de uricase-PEG: PUA abaixo de 6 mg/ml em 86 por cento do tempo do tratamento em 8 mg para cada quatro semanas por grupo (pré- tratamento de 9.1 mg/dL de urato de plasma contra 2.6 mg/dL de urato de plasma em12 semanas de tratamento): PUA abaixo de 6 mg/ml em 84 por cento do tempo do tratamento em 12 mg a cada quatro semanas por grupo (pré- tratamento do urato de plasma de 8.5 mg/dL contra 2.6 mg/dL de urato de plasma durante 12 semanas); PUA abaixo de 6 mg/ml em 73 por cento do tempo do tratamento mg a cada duas semanas por grupo (pré-tratamento de urato de plasma de 7;6 mg/dL contra 4.2 mg/dL durante 12 semanas). O decréscimo 42/42

máximo percentual no ácido-úrico plasma da linha de base dentro das primeiras 24 horas dão dosagem da uricase-PEG foi de 72% para indivíduos recebendo 4 mg/2 semanas ( p. igua! .0002); 94% para indivíduos recebendo 9 8 mg/2 semanas (p. menos do que .0001); 87% para indivíduos recebendo 8 mg/4 semanas (menos do que .0001). e 93% para indivíduos recebendo 12 mg/4 semanas (p. menos do que .0001). O percentual de decréscimo no ácido úrico plasma da linha de base sobre 12 semanas de tratamento foi de 38% para indivíduos recebendo 4mg/2 semanas (p. igual à 0.0002); 86% para indivíduos recebendo 8 mg /2 semanas (p. menos do que .0001); 58% para indivíduo recebendo 9 mg/ 4 semanas (p. igual à .0003); e 67% para indivíduos recebendo 12 mg/ 4 semanas (p. menos do que .0001). Surpreendentemente, alguns indivíduos recebendo uricase-PEG experimentaram um incidente adverso com relação à infusão, ou seja, uma reação na infusão. Essas reações ocorreram em 14% das infusões. Todas as referências citadas aqui são incorporadas ao presente pedido por referência em sua integridade e para todas as finalidades na mesma extensão para cada individual patente ou pedido de patente que foi especificada ou individualmente indicada para ser incorporada como referências para todos os propósitos. Muitas modificações e variações na presente invenção poderão ser feitas sem fugir ao espírito e escopo da invenção que poderão ser aparentes ao conhecido pelo estado da técnica. As específicas incorporações descritas na presente são oferecidas somente como exemplos, e a invenção será limitada somente aos termos da reivindicações em anexo. Listagem de Seqüência

<110> savient Pharniaceuticais, inc. Hartman, Dacob Mendelovitzj Simona

<120> FORMAS VARIANTES DE OXIDASE URATO E USO DO MESMO

<130> 103864-146638

<150> US 60/670,573 <151> 2005-04-11

<160> 16

<170> Patentin Versão 3.3.

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Uricase de Figado de porco (senso)

<400> 1

gegegaattc catggcteat taeegtaatg aetaea 36

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Uncase de Fígado de porco (antisenso)

<400> 2

gcgctctaga agcttccatg gtcacagcct tgaagtcage 40

<210> 3

<211> 3.5

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Babuino (D3H) Uricasede Figado (senso)

<400> 3

gegegaattc catggcccac taecataaca actat 35

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Babuino (D3H) Uricase de Fígado (antisenso)

<400> 4

gcgcccatgg tctagatcae agtcttgaag aeaacttcet 40 2/1.2

<210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Uricase PBC-DeltaNC <400> 5

gcgcatatga cttacaaaaa gaatgatgag gtagag 36

<210> 6

<211> 54

<212> . DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Uricase PBC-DeltaNC (antisenso) <400> 6

ccgtctagat taagacaact tcctcttgac tgtaccagta atttttccgt atgg 54

<210> 7

<211> 299

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Porco-KS-DeltaN <400> 7

Met Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu vai Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr 1 5 10 15

Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr 20 25 30 His ser lie Lys Glu vai Ala Thr Thr Val Gln Leu Thr Leu Ser Ser 35 40 45

Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp Val Ile Pro Thr Asp 50 55 60

Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn vai Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys 65 70 75 80

Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser ser 85 90 95

Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp 100 105 110 3/12

Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe Ile Tyr

115 120 125

Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Ile Arg Asn Gly 130 135 140

Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr

145 150 155 160

Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu

165 170 175

Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln Val Tyr Cys Lys Trp 180 185 190

Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr

195 200 205

Val Arg ser Ile vai Leu Gln Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly

210 215 220

Glu Tyr ser Pro ser vai Gln Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gln Val Leu

225 230 235 240

Thr Leu Gly Gln Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro

245 250 255

Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn

260 265 270

Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr

275 280 285

Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 290 295

<210> 8

<211> 298

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Pig-KS-DeltaN without starting Met

<400> 8

Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr Gly 1 5 10 15 Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His lie Gln Arg Asp Gly Lys Tyr His

20 25 30

Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Thr Val Gln Leu Thr Leu Ser Ser Lys

3 5 40 45

Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn ser Asp Val Ile Pro Thr Asp Thr

50 55 60

lie Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys Ser

65 70 75 80

Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile cys Glu His Phe Leu ser ser Phe

85 90 95

Lys His Val lie Arg Ala Gln Val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp Lys 100 105 110

Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe Ile Tyr Thr

115 120 125

Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln lie Arg Asn Gly Pro

130 135 140

Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr 145 150 155 160

Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu Pro

165 170 175

Glu vai Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln Val Tyr Cys Lys Trp Arg

180 185 190

Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr Val

195 200 205

Arg ser lie vai Leu Gln Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu

210 215 220

Tyr ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gln Val Leu Thr

225 230 235 240

Leu Gly Gln vai Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn 245 250 255

lie His Tyr Leu Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys 260 265 270 Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly 275 280 285

Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 290 295

<210> 9

<211> 897

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<22 3> Pig-KS-DeltaNA <400> 9

atgacttaca aaaagaatga tgaggtagag tttgtccgaa ctggctatgg gaaggatatg 60 ataaaagttc tccatattca gcgagatgga aaatatcaca gcattaaaga ggtggcaact 120 acagtgcaac tgactttgag ctccaaaaaa gattacctgc atggagacaa ttcagatgtc 180 atccctacag acaccatcaa gaacacagtt aatgtcctgg cgaagttcaa aggcatcaaa 240 agcatagaaa cttttgctgt gactatctgt gagcatttcc tttcttcctt caagcatgtc 300 atcagagctc aagtctatgt ggaagaagtt ccttggaagc gttttgaaaa gaatggagtt 360 aagcatgtcc atgcatttat ttatactcct actggaacgc acttctgtga ggttgaacag 420 ataaggaatg gacctccagt cattcattct ggaatcaaag acctaaaagt cttgaaaaca 480 acccagtctg gctttgaagg attcatcaag gaccagttca ccaccctccc tgaggtgaag 540 gaccggtgct ttgccaccca agtgtactgc aaatggcgct accaccaggg cagagatgtg 600 gactttgagg ccacctggga cactgttagg agcattgtcc tgcagaaatt tgctgggccc 660 tatgacaaag gcgagtactc gccctctgtc cagaagacac tctatgacat ccaggtgctc 720 accctgggcc aggttcctga gatagaagat atggaaatca gcctgccaaa tattcactac 780 ttaaacatag acatgtccaa aatgggactg atcaacaagg aagaggtctt gctaccttta 840 gacaatccat atggaaaaat tactggtaca gtcaagagga agttgtcttc aagactg 897

<210> 10

<211> 894

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Pig-KS-DeltaN without starting ATG

<400> 10

acttacaaaa agaatgatga ggtagagttt gtccgaactg gctatgggaa ggatatgata 60 aaagttctcc atattcagcg agatggaaaa tatcacagca ttaaagaggt ggcaactaca 120 gtgcaactga ctttgagctc caaaaaagat tacctgcatg gagacaattc agatgtcatc 180 cctacagaca ccatcaagaa atagaaactt ttgctgtgac agagctcaag tctatgtgga catgtccatg catttattta aggaatggac ctccagtcat cagtctggct ttgaaggatt cggtgctttg ccacccaagt tttgaggcca cctgggacac gacaaaggcg agtactcgcc ctgggccagg ttcctgagat aacatagaca tgtccaaaat aatccatatg gaaaaattac

<210> 11

<211> 304

<212> PRT

<213> Sus scrofa

<400> 11

Met Ala His Tyr Arg Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe 15 10 15

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln

20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln 35 40 45

Leu Thr Leu Ser ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp

50 55 60

Val Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys 65 70 75 80

Phe Lys Gly Ile Lys ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu

85 90 95

His Phe Leu Ser Ser Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gln vai Tyr Val 100 105 110

cacagttaat gtcctggcga agttcaaagg catcaaaagc 240 tatctgtgag catttccttt cttccttcaa gcatgtcatc 300 agaagttcct tggaagcgtt ttgaaaagaa tggagttaag 360 tactcctact ggaacgcact tctgtgaggt tgaacagata 420 tcattctgga atcaaagacc taaaagtctt gaaaacaacc 480 catcaaggac cagttcacca ccctccctga ggtgaaggac 540 gtactgcaaa tggcgctacc accagggcag agatgtggac 600 tgttaggagc attgtcctgc agaaatttgc tgggccctat 660 ctctgtccag aagacactct atgacatcca ggtgctcacc 720 agaagatatg gaaatcagcc tgccaaatat tcactactta 780 gggactgatc aacaaggaag aggtcttgct acctttagac 840 tggtacagtc aagaggaagt tgtcttcaag actg 894

Glu Glu vai Pro Trp Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val 115 120 125 His Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu

130 135 140

Gln Ile Arg Asn Gly Pro Pro Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu

150 155 160

Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp

165 170 175

Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln

180 185 190

Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu 195 200 205

Ala Thr Trp Asp Thr Val Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly

210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr 225 230 235 240

Asp Ile Gln Val Leu Thr Leu Gly Gln Val Pro Glu lie Glu Asp Met

245 250 255

Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Leu Asn Ile Asp Met ser Lys

260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro

275 280 285

Tyr Gly Arg Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Thr ser Arg Leu

290 295 300

<210> 12

<211> 296

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> PBC-DeltaNC <400> 12

Met Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr

1 5 10 15

Gly Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr 20 25 30 His ser He Lys Glu Val Ala Thr Thr vai Gln Leu Thr Leu ser ser

35 40 45

Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn ser Asp Val Ile Pro Thr Asp

50 55 60

Thr lie Lys Asn Thr Val Asn Val Leu Ala Lys Phe Lvs Gly Ile Lys

65 70 75 * 80

Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile cys Glu His Phe Leu Ser Ser

85 90 95

Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp 100 105 110

Lys Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe Ile Tyr

115 120 125

Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Ile Arg Asn Gly 130 135 140

Pro Pro Val lie His Ser Gly Ile Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr

145 150 155 160

Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu

165 170 175

Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln Val Tyr Cys Lys Trp 180 185 190

Arg Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr

195 200 205

Val Arg Ser lie Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly

210 215 220

Glu Tyr ser Pro ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gln Val Leu

225 230 235 240

ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile ser Leu Pro

245 250 255

Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn 260 265 270

Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr 275 280 285 Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser

290 295

<210> 13

<211> 295

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> PBC-DeItaNC without starting Met <400> 13

Thr Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe Val Arg Thr Gly Tyr Gly 15 10 15

Lys Asp Met Ile Lys Val Leu His Ile Gln Arg Asp Gly Lys Tyr His

20 25 30

Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Thr Val Gln Leu Thr Leu Ser Ser Lys 35 40 45

Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn ser Asp Val Ile Pro Thr Asp Thr 50 55 60

lie Lys Asn Thr Val Asn vai Leu Ala Lys Phe Lys Gly Ile Lys Ser

65 70 75 80

Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr Ile Cys Glu His Phe Leu Ser Ser Phe

85 90 95

Lys His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val Glu Glu Val Pro Trp Lys 100 105 110

Arg Phe Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val His Ala Phe Ile Tyr Thr

115 120 125

Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu Gln Ile Arg Asn Gly Pro 130 135 140

Pro Val lie His Ser Gly lie Lys Asp Leu Lys Val Leu Lys Thr Thr

145 150 155 160

Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp Gln Phe Thr Thr Leu Pro

165 170 175

Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln Val Tyr cys Lys Trp Arg 180 185 190 Tyr His Gln Gly Arg Asp Val Asp Phe Glu Ala Thr Trp Asp Thr Val 195 200 205

Arg Ser Ile Val Leu Gln Lys Phe Ala Gly Pro Tyr Asp Lys Gly Glu 210 215 220

Tyr ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr Asp Ile Gln Val Leu ser 225 230 235 240

Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met Glu Ile Ser Leu Pro Asn 245 250 255

Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys Met Gly Leu Ile Asn Lys 260 265 270

Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro Tyr Gly Lys Ile Thr Gly 275 280 285

Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser 290 295

<210> 14 <211> 13 <212> PRT

<213> .Seqüência Artificial <220>

<223> PBC-DeltaNC (Fragmento 44-56 do PBC-DeItaNC)

<400> 14

Ala Thr Thr Val Gln Leu Thr Leu ser Ser Lys Lys Asp 1 5 10

<210> 15 <211> 936 <2.12> DNA

<213> Papio hamadryas (hamadryas babuino ) <400> 15

ccagaagaaa atggccgact accataacaa ctataaaaag aatgatgaat tggagtttgt 60 ccgaactggc tatgggaagg atatggtaaa agttctccat attcagcgag atggaaaata 120 tcacagcatt aaagaggtgg caacttcagt gcaacttact ctgagttcca aaaaagatta 180 cctgcatgga gataattcag atatcatccc tacagacacc atcaagaaca cagttcatgt 240 cttggcaaag tttaagggaa tcaaaagcat agaagccttt ggtgtgaata tttgtgagta 300 ttttctttct tcttttaacc atgtaatccg agctcaagtc tacgtggaag aaatcccttg 360 gaagcgtctt gaaaagaatg gagttaagca tgtccatgca tttattcaca ctcccactgg 420 aacacacttc tgtgaagttg aacaactgag aagtggaccc cccgtcatta cttctggaat 480

caaagacctc aaggtcttga aaacaacaca gtctggattt gaaggtttca tcaaggacca 540

gttcaccacc ctccctgagg tgaaggaccg atgctttgcc acccaagtgt actgcaagtg 600

gcgctaccac cagtgcaggg atgtggactt cgaggctacc tggggcacca ttcgggacct 660

tgtcctggag aaatttgctg ggccctatga caaaggcgag tactcaccct ctgtgcagaa 720

gaccctctat gatatccagg tgctctccct gagccgagtt cctgagatag aagatatgga 780

aatcagcctg ccaaacattc actacttcaa tatagacatg tccaaaatgg gtctgatcaa 840

caaggaagag gtcttgctgc cattagacaa tccatatgga aaaattactg gtacagtcaa 900

gaggaagttg tcttcaagac tgtgacattg tggcca 936

<210> 16 <211> 304 <212> PRT

<213> Papio hamadryas (hamadryas babuíno )

<400> 16

Met Ala Asp Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Leu Glu Phe

Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Asp Met Val Lys Val Leu His Ile Gln 20 25 30

Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln 35 40 45

Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp 50 55 60

Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys 65 70 75 80

Phe Lys Gly Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu 85 90 95

Tyr Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Val 100 105 110

Glu Glu Ile Pro Trp Lys Arg Leu Glu Lys Asn Gly Val Lys His Val 115 120 125

His Ala Phe Ile His Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu 130 135 140

Gln Leu Arg Ser Gly Pro Pro Val Ile Thr Ser Gly Ile Lys Asp Leu 145 150 155 160

Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp

165 170 175

Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln

180 185 190

Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Cys Arg Asp Val Asp Phe Glu

195 200 205

Ala Thr Trp Gly Thr Ile Arg Asp Leu Val Leu Glu Lys Phe Ala Gly

210 215 220

Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Pro Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Glu Ile Glu Asp Met

245 250 255

Glu lie Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met ser Lys

260 265 270

Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro

275 280 285

Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu Ser Ser Arg Leu 290 295 300

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. iURICASE MAMÍFERO TRUNCADA ISOLADA", caracterizada por compreender uma truncada seqüência de aminoácido amina uricase mamífero no término do amino ou no término do carboxila ou ambos terminais amino e carboxila por aproximadamente 1-13 aminoácidos e ainda compreendendo uma substituição de aminoácido de posição aproximada 46.

2."URICASE", compreendendo ainda uma aminoácido terminal amino, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por aminoácido terminal amino ser alanina, glicina, prolina, serina ou treonina.

3."URICASE", de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o aminoácido terminal amino ser treonina.

4."URICASE", de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a substituição ser feita com treonina ou alanina.

5."URICASE", de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por a substituição ser feita com treonina.

6."URICASE", de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por compreender a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO. 8.

7."URICASE", de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 e 6, caracterizada por a uricase ser conjugada com um polímero.

8."CONJUGADO DE URICASE - GLICOL POLIETILENO", caracterizado por compreender a uricase contida nas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 e 6.

9."CONJUGADO", de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender de 2 à12 moléculas de glicol de polietileno em cada sub-unidade de uricase.

10."CONJUGADO", de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por compreender de 3 à 10 moléculas de glicol de polietileno por cada sub-unidade de uricase.

11."CONJUGADO", de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por cada molécula de glicol de polietileno ter um peso molecular entre 1 kD e 10OkD.

12."CONJUGADO", de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a molécula de glicol de polietileno ter um peso molecular entre 1 kD e 50kD.

13."CONJUGADO", de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por cada molécula de glicol de polietileno ter peso molecular entre 5kD e 20kD.

14."CONJUGADO", de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por cada molécula de glicol de polietileno ter um peso molecular de aproximadamente 10kD.

15."COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA", caracterizada por compreender uma uricase de quaisquer das reivindicações 1, 2, 3, 4 e 5.

16."COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA", de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por compreender um conjugado da reivindicação 8.

17."COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA", de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por ser adequada para repetida administração.

18."COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA", de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por ser adequada para repetida administração.

19."MÉTODO DE REDUÇÃO DOS NÍVEIS DE ÁCIDO ÚRICO EM UM FLUÍDO BIOLÓGIO DE UM DEPENDENTE DO MESMO", caracterizado por compreender a administração da composição da reivindicação 15 ao dependente.

20."MÉTODO DE REDUÇÃO DOS NÍVEIS DE ÁCIDO ÚRICO EM UM FLUÍDO BIOLÓGIO DE UM DEPENDENTE DO MESMO", de acordo com a reivindicação caracterizado por compreender a administração da composição da reivindicação 16 ao dependente.

21."MÉTODO", de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o fluído biológico ser sangue.

22."MÉTODO", de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o fluído biológico ser sangue.

23."URICASE ISOLADA", caracterizada por compreender a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO. 14.

24."PROTEÍNA URICASE MAMÍFERA TRUNCADA ISOLADA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o aminoácido terminal-N ser metionina.

25."URICASE", de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por compreender a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO. 7.

26."ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO", caracterizado por compreender uma seqüência de ácido nucléico que codifica a proteína das reivindicações 1, 3, 6, 24 e 25.

27."ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO", de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por a seqüência do ácido nucléico ser operativamente ligada à um promotor heteroíógo.

28."ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO", de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por o promotor ser um promotor osmB.

29."VETOR DE ÁCIDO NUCLÉICO", caracterizado por compreender o ácido nucléico da reivindicação 27.

30."CÉLULA HOSPEDEIRA", caracterizada por compreender o vetor da reivindicação 24.

31."ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO", de acordo com a reivindicações 26, 27 e 28, caracterizado por compreender uma seqüência de ácido nucléico codificando uma uricase compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO. 7 ou SEQ ID NO.8.

32."ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO", de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a seqüência de ácido nucléico compreender SEQ ID NO. 9 ou SEQ ID NO. 10.

33."ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO", de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a seqüência de ácido nucléico ser operativamente ligada à um promotor heterólogo.

34."ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO", de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por o promotor ser um promotor osmB.

35."VETOR DE ÁCIDO NUCLÉICO", de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por compreende ρ ácido nucléico da reivindicação 33.

36."CÉLULA HOSPEDEIRA", de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por compreender o vetor da reivindicação 35.

37."MÉTODO PARA PROUZIR UMA URICASE", caracterizado por compreender as etapas de cultura de uma célula hospedeira da reivindicação 30 ou 36 sob condições de modo que a seqüência do ácido nucléico seja expressada pela célula hospedeira e isolando a expressada uricase.