HU225539B1 - Preventives or remedies for inflammatory intestinal diseases containing as the active ingredient antibody against il-6 receptor - Google Patents

Description

A találmány interleukin-6 (IL—6) receptor elleni antitest alkalmazására vonatkozik gyulladásos bélbetegség kezelésére vagy megelőzésére szolgáló, különösen Crohn-betegség vagy colitis ulcerosa kezelésére vagy megelőzésére szolgáló készítmény előállításához.

Az IL-6 egy citokin, amely B-sejt-stimuláló faktor 2-ként (BSF-2) vagy interferon p2-ként is ismert. Az IL-6-ot mint a B-limfociták aktiválásában részt vevő differenciációs faktort fedezték fel [Hirano, T. és munkatársai, Natúré (1986) 324, 73-76]. Azóta kiderült, hogy az IL-6 egy többfunkciós citokin, amely a sejtek számos működését befolyásolja [Akira, S. és munkatársai, Adv. In Immunology (1993) 54, 1-78]. Ismert továbbá, hogy az IL-6 beindítja a T-limfociták érési folyamatát [Lotz, M. és munkatársai, J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258].

Az IL-6 két sejtfelszíni fehérjén keresztül közvetíti a biológiai jeleit. Az egyikük az IL-6 receptor, amely egy körülbelül 80 kDa molekulatömegű IL—6-kötő protein [Taga, T. és munkatársai, J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981; Yamasaki, K. és munkatársai, Science (1987) 241, 825-828]. Az IL-6 receptor a sejtfelszínen transzmembrándomént expresszáló membránkötött formán kívül létezhet még oldható, javarészt extracelluláris részből álló IL-6 receptorként is. A másik sejtfelszíni fehérje a membránkötött gp130 protein, amelynek molekulatömege körülbelül 130 kDa, és amely a nemligandum-kötő jeltovábbítási rendszerben vesz részt. Az IL-6 és az IL-6 receptor összekapcsolódva az IL-6/IL—6 receptorkomplexet képezik, amely miután a gp 130-hoz kötődik, továbbítja biológiai üzenetét a sejtbe [Taga, T. és munkatársai, Cell (1989) 58, 573-581],

Az IL-6-antagonisták olyan anyagok, amelyek megakadályozzák az IL-6 biológiai üzenetének továbbítását. IL-6-antagonistaként ismert például az IL-6-ellenes antitest (anti-IL—6 antitest), IL-6 receptor ellenes antitest (anti-IL—6 receptor antitest), gp130-ellenes antitest (anti-gp130 antitest), módosított IL-6, az IL-6 vagy az IL-6 receptor részleges peptidjei és más hasonlók.

Az anti-IL-6 receptor antitestet számos szakirodalmi közleményben ismertették [például Novick D. és munkatársai, Hybridoma (1991) 10, 137-146; Huang Z. W. és munkatársai, Hybridoma (1993) 12, 621-630, WO 95/09863 számú közzétételi irat; FR 2694767 számú szabadalmi bejelentés; US 521628 számú szabadalmi leírás]. Ismert, hogy a humanizált PM-1 antitestet úgy állítják elő, hogy az egér PM-1 antitestjének komplementaritást meghatározó szakaszait (CDR-jeit) [lásd Hirata, Y. és munkatársai, J. Immunology, (1989) 143, 2900-2906] egy emberi templát antitestbe ültetik át (lásd WO 92/19759 számú közzétételi iratban).

A gyulladásos bélbetegség (IBD) egy nemspecifikus gyulladás, amelyet a colitis ulcerosa és a Crohnbetegség képvisel. A betegség kialakulásában valószínűleg immunológiai károsodások vesznek részt, de a betegség etiológiája még nem tisztázott. Feltételezik, hogy a nyálkahártya roncsolásában a károsodás helyére összegyűlt monociták és limfociták vesznek részt, és ezért a gyulladásos mediátorok, különösen a citokinek (úgymint az IL-10, TNFa és IL-6) érdemelnek különösebb figyelmet.

Ami a gyulladásos mediátorok közül az IL-6-ot illeti, a figyelem középpontjába került a betegség fokával való kapcsolata, valamint felvetődött lehetséges specifikus kórjelzőként való alkalmazása az IBD-ben. Az IL-6 szérumszintje megnő úgy a colitis ulcerosában, mint a Crohn-betegségben, és a szérumszint párhuzamosan változik a betegség előrehaladási fokával [Holtkamp, W. és munkatársai, J. Clin. Gastroenterology (1995) 20, 123-126; Niederau, C. és munkatársai, Hepato-Gastroenterology (1997) 44, 90-107], PCR-rel (polimerázláncreakció-módszerrel) lemérve a szövetek IL-6-mRNS-tartalmát, azt állapították meg, hogy úgy a colitis ulcerosában, mint a Crohn-betegségben a szövetek IL-6-mRNS-tartalma jól korrelál a betegség előrehaladási fokával [Stevens, C. és munkatársai, Dig. Dis. Sci. (1992) 37, 818-826], Az IL-6-termelődés aktív IBD alatti emelkedésének mechanizmusát vizsgálva azt találták, hogy ha a lamina propriában levő mononukleáris sejteket Pokeweed mitogénnel stimulálják, az IL-6-termelődés jól korrelál a betegség súlyosságával [Reinecker, H. C. és munkatársai, Clin. Exp. Immunoi. (1993)94, 174-181],

Ezek után az IL-6-termelődés és a betegség állapota közötti összefüggést a betegek lamina propriájából és nyálkahártyájából származó mononukleáris sejtek tenyészeteiben vizsgálták. Az utóbbi esetben az is igazolódott, hogy a nyálkahártyában levő IL-6-ot termelő sejtek száma is megnőtt. A mononukleáris sejtek közül a legfontosabb IL-6-ot termelő sejtek a makrofágok, és igazolták, hogy az aktív fázisban levő IBD-s betegek lamina propriájában nagyszámú, erőteljesen IL-6-ot termelő CD68 pozitív makrofág található [Kusugami, K. és munkatársai, Dig. Dis. Sci. (1995) 40, 949-959].

Az is igazolódott, hogy az IL-6-termelődés jól korrelál a Crohn-betegségben szenvedő betegeknél talált endoszkópos megfigyelésekkel [Reimund, J. M. és munkatársai, Gut (1996) 39, 684-689], Továbbá úgy találták, hogy nemcsak az IL-6, hanem az oldódó IL-6 receptor szérumszintje is jól korrelál a betegség előrehaladási fokával [Mitsuyama, K. és munkatársai, Gut (1995) 36, 45-49],

Az IL—6-tól eltérő más gyulladásos mediátorok vonatkozásában azt találták, hogy az IL—1 β mennyisége is korrelál a betegség előrehaladási fokával. Másrészről mindez nem mindig igaz a TNF-α esetében, amelynek a termelődése magas lehet alacsony aktivitású betegség esetén is [Reinecker, H. C. és munkatársai, Clin. Exp. Immunoi. (1993) 94, 174-181; Reimund, J. M. és munkatársai, Gut (1996) 39, 684-689],

Az IBD kezelésére jelenleg alkalmazott eljárás a diéta és a gyógyszerrel, így szalazo-szulfapiridinnel, glukokortikoiddal stb. történő kezelés kombinációjából áll. A mellékhatásaik miatt ezeket a gyógyszereket számos beteg nem viseli el, és ezért hosszú távú alkalmazásukkor problémák merülnek fel.

Másrészről jelenleg kísérletek folynak az IBD új kezelési módozatainak kifejlesztésére, amelyek a beteg2

HU 225 539 Β1 ség állapotjavulását a citokinaktivitás csökkentésén keresztül kívánják előidézni. A fő célpontok az IL-1 és a TNF-α [Van Deventer, S. J. H. Gut (1997) 40,443-448], Az IL-1-re klinikai és állatkísérleti szinten egy IL-1 receptor antagonista [Cominelli, F. és munkatársai, Gastroenterology (1992) 103, 65-71] és egy IL-1-inhibitor, a CGP47969A [CasiniRaggi és munkatársai, Gastroenterology (1995) 109, 812-818] és hasonlók állnak kivizsgálás alatt. A TNF-α esetében specifikus monoklonális antitestet adagolva Crohn-betegségben szenvedő betegeknek, a betegség intenzitásának csökkenését, valamint a fekélyek gyógyulását figyelték meg [Van Dullemen, Η. M. és munkatársai, Gastroenterology (1995) 109, 129-135]. Mindeddig ismeretlen volt az IL-6-antagonisták azon képessége, hogy az IL—6 biológiai aktivitását specifikusan gátolva gyógyítják az IBD-t.

Az IL—6 receptor elleni antitestről ismeretes továbbá, hogy az IL—6 túltermelésével összefüggő tömegvesztés (cachexia) gyógyítására alkalmazzák (HU P9701900 számú szabadalmi bejelentés).

A találmány célja a gyulladásos bélbetegség kezelésére vagy megelőzésére szolgáló olyan készítmény kifejlesztése, amely mentes a fentiekben említett hátrányoktól.

A találmány tárgya tehát IL—6 receptor elleni antitest alkalmazása gyulladásos bélbetegség kezelésére vagy megelőzésére szolgáló készítmény előállítására.

A találmány tárgya még az olyan alkalmazás, ahol gyulladásos bélbetegség kezelésére vagy megelőzésére szolgáló készítmény hatóanyagként IL—6 receptor elleni monoklonális antitestet tartalmaz.

A találmány tárgya még az olyan alkalmazás, ahol gyulladásos bélbetegség kezelésére vagy megelőzésére szolgáló készítmény hatóanyagként emberi IL—6 receptor elleni monoklonális antitestet tartalmaz. Emberi anti-IL—6 receptor monoklonális antitestként előnyösen PM-1 antitestet alkalmazunk.

A találmány tárgya még az olyan alkalmazás, ahol gyulladásos bélbetegség kezelésére vagy megelőzésére szolgáló készítmény hatóanyagként egér-IL-6-receptor elleni monoklonális antitestet tartalmaz. Egéranti-IL-6-receptor monoklonális antitestként előnyösen MR16-1 antitestet alkalmazunk.

A találmány tárgya még az olyan alkalmazás, ahol gyulladásos bélbetegség kezelésére vagy megelőzésére szolgáló készítmény hatóanyagként IL—6 receptor elleni rekombináns antitestet tartalmaz.

A találmány tárgya még az olyan alkalmazás, ahol gyulladásos bélbetegség kezelésére vagy megelőzésére szolgáló készítmény hatóanyagként IL—6 receptor elleni kiméra vagy humanizált antitestet tartalmaz.

A találmány tárgya még az olyan alkalmazás, ahol gyulladásos bélbetegség kezelésére vagy megelőzésére szolgáló készítmény hatóanyagként IL—6 receptor elleni humanizált PM-1 antitestet tartalmaz.

A találmány tárgya még az olyan alkalmazás, ahol gyulladásos bélbetegség Crohn-betegség vagy colitis ulcerosa.

A találmány tárgya még IL—6 receptor elleni antitest alkalmazása gyulladásos bélbetegség által okozott tömegvesztés csökkentésére szolgáló készítmény előállítására.

A találmány szerinti készítményben alkalmazható anti-IL-6 receptor antitesteket ismert módszerekkel poliklonális vagy monoklonális antitestekként állíthatjuk elő. A találmány szerinti készítményben anti-IL—6 antitestként előnyösen a monoklonális antitestek, különösen az emlőseredetü monoklonális antitestek alkalmazhatók. Ilyen emlőseredetű monoklonális antitestek például a hibridómák vagy a genetikai módszerekkel előállított antitestgéneket tartalmazó expressziós vektorral transzformált gazdasejtek által termelt rekombináns antitestek. Ezek az antitestek az IL-6 receptorokhoz kötődve gátolják az IL-6-nak az IL-6 receptorhoz való kötődését, és így megakadályozzák az IL—6 közvetítette biológiai jel továbbítását a sejt belsejébe.

Ilyen antitestek például az MR16-1 antitest [lásd Tamura, T. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11 924-11 928], PM-1 antitest [Hirata, és munkatársai J. Immunology (1989) 143, 2900-2906] vagy az AUK12-20 antitest, AUK64-7 antitest vagy AUK146-15 antitest (lásd WO 92/19759 számú közzétételi iratban), valamint a hasonló antitestek. Közülük a PM-1 antitest a legelőnyösebb.

A PM-1 antitestet termelő hibridóma sejtvonalat a Budapesti Egyezmény rendelkezései alapján, a National Institute of Biosience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref., Japán intézetnél, FERM BP-2998 nyilvántartási számmal, PM-1 néven, 1990. július 10-én helyezték nemzetközi letétbe. Az MR16-1 antitestet termelő hibridóma sejtvonalat a Budapesti Egyezmény rendelkezései alapján, a National Institute of Biosience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref., Japán intézetnél, FERM BP-5875 nyilvántartási számmal, MR16-1 néven, 1997. március 13-án helyezték nemzetközi letétbe.

Az anti-IL—6 receptor monoklonális antitestet termelő hibridómát az alábbi ismert eljárással lehet előállítani. A hagyományos immunizációs eljárásnak megfelelően az IL—6 receptort szenzitizálóantigénként használjuk. Az így kapott immunizált sejteket hagyományos sejtfúziós eljárással ismert szülősejtekkel fuzionáltatjuk, majd ezután a kívánt hibridóma előállítása érdekében a monoklonális antitesteket termelő sejteket hagyományos módszerrel szkríneljük.

Közelebbről az anti-IL—6 receptor antitestet a következő módon állíthatjuk elő. így például az antitest előállítására szenzitizálóantigénként szolgáló emberi IL—6 receptort az EP 325474 számú szabadalmi bejelentésben ismertetett eljárással IL—6 receptor gén/aminosavszekvencia felhasználásával állíthatjuk elő, az egér-IL-6-receptort a JP 3(1991)-155795 számú közzétételi iratban (Kokai) ismertetett eljárással állíthatjuk elő.

Az IL—6 receptor proteinek két típusa ismert: a sejtmembránon expresszált IL—6 receptor, valamint a sejtmembránról levált IL—6 receptor (oldódó IL—6 receptor) [Yasukawa, K. és munkatársai, J. Biochem. (1990)

HU 225 539 Β1

108, 673-676]. Az oldódó IL-6 receptor antitest lényegében a sejtmembránhoz kötődő IL-6 receptor extracelluláris részéből áll, és ennek megfelelően különbözik a membránhoz kötött IL-6 receptortól, mivel az utóbbinak hiányzik a transzmembránrésze, vagy a transzmembránrész mellett az intracelluláris része is hiányzik. IL-6 receptor proteinként - amennyiben a találmány szerinti készítményben alkalmazható IL-6 receptor termelődését kiváltó szenzitizálóantigénként használjuk - bármely IL-6 receptor felhasználható.

Miután a megfelelő gazdasejtet az ismert expressziós vektorrendszerbe inszertált IL-6 receptor gén szekvenciával transzformáltuk, a kívánt IL-6 receptor proteint a gazdasejtből vagy a sejttenyészet felülúszójából ismert eljárásokkal tisztíthatjuk. Az így tisztított IL-6 receptor proteint szenzitizálóantigénként használhatjuk. Más módszerként az IL-6 receptort expresszáló sejteket vagy az IL-6 receptor és egy másik protein fúziós proteinjét használhatjuk szenzitizálóantigénként.

Az emberi IL-6 receptort kódoló cDNS-t tartalmazó plBIBSF2R plazmiddal rendelkező E. coli-t a Budapesti Egyezmény rendelkezései alapján, a National Institute of Biosience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref., Japán intézetnél, FERM BP-2232 nyilvántartási számmal, HB101plBIBSF2R néven, 1989. január 9-én helyezték nemzetközi letétbe.

A találmány szerinti készítményben alkalmazható anti-gp130 antitesteket ismert módszerek segítségével, poliklonális vagy monoklonális antitestekként állíthatjuk elő. A találmány szerinti készítményben anti-gp130 antitestként előnyösen monoklonális antitestek, különösen az emlőseredetű monoklonális antitestek alkalmazhatók. A találmány szerinti készítményben emlőseredetű monoklonális antitestekként például a hibridómák vagy a genetikai módszerekkel előállított antitestgéneket tartalmazó expressziós vektorral transzformált gazdasejtek által termelt rekombináns antitestek alkalmazhatók. Ezek az antitestek a gp130 molekulákhoz kötődve gátolják az IL-6/IL-6 receptorkomplex gp130-hoz való kötődését, és így megakadályozzák az IL-6 közvetítette biológiai jel továbbítását a sejt belsejébe.

Ilyen antitestek például az AM64 antitest [lásd a JP 3(1991)-219894 számú közzétételi iratban (Kokai)], 4B11 vagy 2H4 antitest (lásd a US5571513 számú szabadalmi leírásban), B-S12 és B-P8 antitest [lásd a JP 8(1996)-291199 számú közzétételi iratban (Kokai)].

A monoklonális antitestet termelő hibridómát az alábbi ismert eljárással lehet előállítani. A hagyományos immunizációs eljárásnak megfelelően a gp130-at szenzitizálóantigénként immunizálásra használjuk. Az így kapott immunizált sejteket hagyományos sejtfúziós eljárással ismert szülősejtekkel fuzionáltatjuk, majd ezután a kívánt hibridóma előállítása érdekében a monoklonális antitesteket termelő sejteket hagyományos módszerrel szkríneljük.

Közelebbről a monoklonális antitestet a következő módon állíthatjuk elő. így például az antitest előállítására szenzitizálóantigénként szolgáló gp130-at az

EP 411946 számú szabadalmi bejelentésben ismertetett eljárással gp130 gén/aminosavszekvencia felhasználásával állíthatjuk elő.

Miután a megfelelő gazdasejtet az ismert expressziós vektorrendszerbe inszertált gp130 génszekvenciával transzformáltuk, a kívánt gp130 proteint a gazdasejtből vagy a sejttenyészet felülúszójából ismert eljárásokkal tisztíthatjuk. Az így tisztított gp130 proteint szenzitizálóantigénként használhatjuk. Más módszerként a gp130 protein és egy másik protein fúziós proteinjét használhatjuk szenzitizálóantigénként.

Annak ellenére, hogy különösebben nem korlátozott a szenzitizálóantigénnel való immunizálásra alkalmazott emlősök köre, ezeket előnyösen a sejtfúziós módszerben használt szülősejtekkel való kompatibilitásuk figyelembevételével választjuk ki. így általában rágcsálók, például egerek, patkányok, hörcsögök, valamint hasonlók választhatók.

Az állatok szenzitizálóantigénnel való immunizációját ismert módszerrel hajthatjuk végre. Például egy általános módszer szerint a szenzitizálóantigént intraperitoneálisan vagy szubkután adagoljuk egy emlősnek. Közelebbről miután a szenzitizálóantigént megfelelő mennyiségű foszfátpufferezett sóoldatban (PBS) vagy fiziológiás sóoldatban stb. hígítottuk és szuszpendáltuk, kívánt esetben megfelelő mennyiségű hagyományos adjuvánssal, például Freund-féle komplett adjuvánssal keverjük össze. Emulgeálás után a készítményt emlősnek, 4-21 naponként, több alkalommal adagoljuk. Más módszerként a szenzitizálóantigénnel történő immunizációval egyszerre egy megfelelő hordozóanyagot használhatunk.

Az immunizáció és a kívánt antitesttiter szérumbeli emelkedésének igazolása után az immunizált sejteket kivesszük az emlősből és sejtfúziónak vetjük alá. Immunizált sejtekként különösen a lépsejtek alkalmazhatók előnyösen.

A fenti immunsejtekkel sejtfúziónak alávetett másik szülősejtként alkalmazott emlős-myelomasejtek lehetnek előnyösen az alábbi ismert sejtvonalak: P3X63Ag8.653 [Kearney, J. F. és munkatársai, J. Immunoi. (1979) 123: 1548-1550], P3X63Ag8U.1 [Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81:1-7], NS-1 [Kohler, G. és Milstein, C. Eur J. Immunoi. (1976) 6:151-519], MPC-11 [Margulies, D. H. és munkatársai, Cell (1976) 8:405-415], SP2/0 [Shulman, M. és munkatársai, Natúré (1978) 276: 269-270], FO [de St. Groth, és munkatársai, J. Immunoi. Methods (1980) 35: 1-21], s194 [Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148: 303-323], R210 [Galfre, G. és munkatársai, (1979) 277: 131-133] stb.

A fenti immunizált sejtek és a myelomasejtek közötti sejtfúziót ismert módszer szerint, például Milstein és munkatársai módszerével [Id. Kohler, G. és Milstein, C. Methods Enzymol. (1981) 73:3—46], valamint más hasonló módszerrel vihetjük végbe.

Még különösebben a fenti sejtfúziót hagyományos táptalajon, egy sejtfúziót gyorsító szer jelenlétében vihetjük végbe. Sejtfúziót gyorsító szerként például polietilénglikol (PEG), Sendai-vírus (HVJ) vagy más ha4

HU 225 539 Β1 sonló alkalmazható. Továbbá a fúzió hatékonyságának fokozására kívánt esetben valamilyen adjuváns, így dimetil-szulfoxid stb. adagolható.

Az alkalmazandó immunizált sejtek és myelomasejtek aránya előnyösen például 1-10-szeres lehet. A fenti sejtfúziós eljárásban táptalajként például az RPMI1640 táptalaj, valamint a fenti myeloma-sejtvonalak növesztésére alkalmas MÉM táptalaj, továbbá az ilyen típusú sejtkultúrák esetén alkalmazott hagyományos táptalaj alkalmazható, és szérumadalék, így magzati borjúszérum (FCS) adagolható még.

A sejtfúzióban meghatározott mennyiségű fenti immunizált sejtet és myelomasejtet alaposan összekeverünk előzetesen 37 °C-ra melegített 30-60% (tömeg/térfogat) koncentrációjú PEG-oldatot, így például 1000 és 6000 közötti átlag molekulatömegű PEG-oldatot tartalmazó fenti táptalajban, majd a kívánt fúziós sejtek (hibridómák) előállítása érdekében az elegyet tovább keverjük. Ezután időszakonként ismételten adagoljuk a megfelelő táptalajt, és a felülúszót centrifugálással eltávolítjuk, így eltávolítva a hibridóma növekedése szempontjából nemkívánatos sejtfúziós szereket stb.

A fenti hibridómát hagyományos szelekciós táptalajban, így például HAT táptalajban (hipoxantint, aminopterint és timidint tartalmazó táptalaj) tenyésztve szelektáljuk. A HAT táptalajban történő tenyésztést általában a kívánt hibridómától eltérő (nem fúziós) sejtek elölésére elégséges ideig, általában néhány nap és néhány hét közötti ideig, végezzük. A hagyományos korlátozó hígítási módszert alkalmazzuk, mely szerint a kívánt antitestet termelő hibridómákat szkríneljük és klónozzuk.

Amellett, hogy a fenti hibridómát embertől eltérő emlősantigénnel történő szenzitizálásával állítjuk elő, eljárhatunk úgy is, hogy a kívánt antigénnel vagy kívánt antigént expresszáló sejtekkel emberi limfocitákat in vitro szenzitizálunk, majd a kapott szenzitizált B-limfocitákat emberi myelomasejtekkel, például U266-tal fuzionáltatjuk, és így olyan kívánt emberi antitestet kapunk, amely a kívánt antigénhez vagy a kívánt antigént expresszáló sejtekhez kapcsolódik [lásd például a JP 1(1989)-59878 számú vizsgált szabadalmi iratban (Kokoku) ismertetett eljárást]. Továbbá eljárhatunk úgy is, hogy egy, az összes emberi antitestgén repertoárjával rendelkező transzgenikus állatot egy antigénnel vagy egy antigént expresszáló sejttel immunizálunk, és így a fentiekben ismertetett módszer szerinti kívánt emberi antitesthez juthatunk (lásd például a WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/33735, WO 96/34096 számú közzétételi iratokban).

Az így előállított monoklonális antitestet termelő hibridómákat egy hagyományos táptalajban tenyésztjük, vagy egy hosszabb időszakra folyékony nitrogénben tárolhatjuk.

Monoklonális antitestnek a fenti hibridómából történő előállítására egy olyan módszer alkalmazható, amely szerint a fenti hibridómát egy hagyományos módszerrel tenyésztjük, és az antitest a felülúszóból nyerhető ki, vagy egy másik módszer szerint a hibridómát egy, a hibridómával kompatibilis emlősnek adagoljuk, majd az ott végbemenő növesztés után az antitest az emlős hasvizéből állítható elő. Az előbbi módszer alkalmas nagy tisztaságú antitestek előállítására, míg az utóbbi nagy mennyiségű antitest előállítására alkalmazható.

Közelebbről egy anti-IL—6 receptor antitestet termelő hibridómát a JP 3(1989)-139293 számú közzétételi iratban (Kokai) ismertetett eljárással állíthatunk elő. Az egyik eljárás szerint a PM-1 antitestet termelő hibridómát (amelyet a Budapesti Egyezmény rendelkezései alapján, a National Institute of Biosience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref., Japán intézetnél, FERM BP-2998 nyilvántartási számmal, 1990. július 10-én helyeztek nemzetközi letétbe) intraperitoneálisan BALB/c egerekbe injektáljuk, és a termelődő hasvízből a PM-1 antitestet tisztítjuk, vagy egy másik eljárás szerint a fenti hibridómát megfelelő táptalajban, így például 10% magzati borjúszérumot és 5% BM-Condimed H1-et (gyártó cég Boehringer Mannheim) tartalmazó RPMI1640 táptalajban, SFM hibridóma táptalajban (gyártó GIBCO-BRL), PFHM-II hibridóma táptalajban (gyártó GIBCO-BRL) vagy más hasonló táptalajokban tenyésztjük, majd a PM-1 antitestet a felülúszóból tisztítjuk.

A találmány szerinti készítményben monoklonális antitestként olyan rekombináns antitestek használhatók, amelyek génrekombinációs technológiával úgy állíthatók elő, hogy a hibridómából egy antitestgént klónozunk, majd egy megfelelő vektorba integráljuk, amellyel gazdasejteket transzformálunk [lásd például Borreback, C. A. K. és Larrick J. W. Therapeutic Monoclonal Antibodies című könyvben, Egyesült Királyságbeli MacMillan Publishers Ltd. kiadó (1990)].

Közelebbről: a kívánt antitest variábilis szakaszát (V) kódoló mRNS-t antitesttermelő sejtekből, így például valamely hibridómából izoláljuk. Az mRNS izolálását úgy végezzük, hogy a teljes RNS-t ismert módszerek segítségével, így például guanidin-ultracentrifugálás néven ismert eljárással [Chirgwin, J. M. és munkatársai, Biochemistry (1979) 18, 5294-5299] vagy az AGPC-eljárással [Chomczynski, P. és munkatársai, Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159] állítjuk elő, majd az mRNS-t mRNS-tisztító kit (gyártó cég Pharmacia) vagy más hasonló segítségével választjuk el a teljes RNS-től. Más módszerként az mRNS-t közvetlenül is előállíthatjuk Quick Prep mRNS-tisztító kit (gyártó cég Pharmacia) segítségével.

Egy antitest V szakaszának cDNS-e mRNS-ből reverz transzkriptáz segítségével állítható elő. A cDNS AMV reverz transzkriptáz első szál cDNS szintézis kittel vagy más hasonlóval állítható elő. Más módszerként a cDNS előállítására és sokszorosítására polimeráz-láncreakción alapuló (PCR) 5’-Ampli FINDER RACE Kit (gyártó cég Clontech) felhasználásával 5’-RACE módszer [Frohman, M. A. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. és munkatársai, Nucleic Acids Rés. (1989)

HU 225 539 Β1

17, 2919-2932] alkalmazható. A kívánt DNS-fragmentumot a kapott PCR-termékből választjuk el, majd DNS-vektorhoz kapcsolhatjuk. A rekombináns vektor ez utóbbiból állítható elő, majd ezután E. coli-ba vagy hasonlókba transzformálható, amelyekből a kívánt rekombináns vektor előállítása céljából kolóniák választhatók ki. A kívánt DNS nukleotidszekvenciája ismert módszerrel, így például a didezoximódszerrel igazolható.

Amint a kívánt antitest V szakaszát kódoló DNS-t megkaptuk, a kívánt antitest konstans szakaszát (C szakasz) kódoló DNS-hez kapcsoljuk, amelyet végül egy expressziós vektorba integrálunk. Más módszerként egy antitest V szakaszát kódoló DNS-t egy olyan expressziós vektorba integrálhatjuk, amely már tartalmazza a kívánt antitest C szakaszát kódoló DNS-t.

A találmány szerinti készítményben alkalmazható antitest előállítására az alábbiakban ismertetett eljárásnak megfelelően egy expressziós vektorba úgy integráljuk az antitestet kódoló gént, hogy egy, az expressziót szabályozó szakasz, így például egy promoter és/vagy egy enhancer kontrollja alatt álljon. Ezután az expressziós vektor egy gazdasejtbe transzformálható, majd abban az antitest expresszálható.

A találmány értelmében mesterségesen módosított rekombináns antitestet, így például kiméra antitestet és humanizált antitestet használhatunk az emberi szövetek elleni heterológ antigenitás csökkentésére. Ezeket a módosított antitesteket ismert módszerek segítségével állíthatjuk elő.

A kiméra antitestet úgy állíthatjuk elő, hogy a kapott antitest V szakaszát kódoló DNS-t egy emberi antitest C szakaszát kódoló DNS-hez kapcsoljuk, amelyet ezután egy expressziós vektorba integrálunk, majd a kívánt antitest termelése céljából egy gazdasejtbe transzformálunk (lásd például az EP 125023 számú szabadalmi bejelentésben vagy a WO 92/19759 számú közzétételi iratban ismertetett eljárásokat). Ennek az ismert módszernek az alkalmazásával elő lehet állítani a találmány szerinti készítményben hasznosítható kiméra antitestet.

Például a PM-1 kiméra antitest L láncának V szakaszát vagy a H láncának V szakaszát kódoló DNS-t tartalmazó plazmidokat megfelelően pPM-k3-nak, illetve pPM-h1-nek nevezték el, és a plazmidokat tartalmazó E. coli-t a Budapesti Egyezmény rendelkezései alapján, a National Collections of Industrial and Maríné Bacteria Limited intézetnél, NCIMB 40366, valamint NCIMB 40362 nyilvántartási számmal, 1991. február 11-én helyezték nemzetközi letétbe.

Az újraalakított emberi antitestként is ismert humanizált antitestet egy, az embertől eltérő emlősből, így például egérből származó antitest komplementaritást meghatározó szakaszainak (CDR-ek) emberi antitest CDR-jeibe való átültetésével állították elő. Az ilyen antitestek előállítására szolgáló általános rekombináns DNS-technológia ugyancsak ismert (lásd például az EP 125023 számú szabadalmi bejelentésben vagy a WO 92/19759 számú közzétételi iratban ismertetett eljárásokat).

Közelebbről: az egérantitestek CDR szakaszainak az emberi antitest vázszakaszaival (FR-ek) való összekötésére tervezett DNS-szekvenciákat számos, darabokra osztott, egymás végeivel átfedő szakaszokkal rendelkező oligonukleotidokból állíthatjuk elő. Az így előállított DNS az emberi antitest C szakaszát kódoló DNS-hez kapcsolható, és ezután egy expressziós vektorba integrálható, amelyet a továbbiakban antitest termelésére gazdasejtekbe transzformálunk (lásd például az EP 239400 számú szabadalmi bejelentésben vagy a WO 92/19759 számú közzétételi iratban ismertetett eljárásokat).

Egy emberi antitest CDR szakaszához kapcsolt FR szakaszokhoz olyan komplementaritást meghatározó szakaszt választunk, amely előnyös antigénkötő szerkezetet képez. Kívánt esetben az antitest variábilis szakaszának vázszakaszát felépítő aminosavak oly módon helyettesíthetők, hogy az átformált emberi antitest komplementaritást meghatározó szakasza egy megfelelő antigénkötő szerkezetet képezzen [Sato, K. és munkatársai, Cancer Rés. (1993) 53, 851-856].

Például a kiméra antitest vagy humanizált antitest esetében emberi antitest C szakaszát alkalmazhatjuk. Az emberi antitest C szakaszaként a Cy, így például a Cy1, Cy2, Cy3 és Cy4 alkalmazható. Az antitest vagy termelése stabilitásának javítása céljából az emberi antitest C szakasza módosítható.

A kiméra antitestek az embertől eltérő emlősből származó variábilis szakaszból és az emberi antitestből származó C szakaszból épülnek fel, ellenben a humanizált antitestek az embertől eltérő emlősből származó antitest komplementaritást meghatározó szakaszaiból és emberi antitestből származó vázszakaszokból, valamint C szakaszból épülnek fel. Ennek megfelelően ezeknek az emberi testben kifejeződő antigenitása csökkent, így hasznos antitestekként alkalmazhatók a találmány szerinti készítményben.

Az egyik előnyös kiviteli alakban a találmány szerinti készítményben humanizált antitestként humanizált PM-1 antitestet alkalmazunk (lásd például a WO 92/19759 számú közzétételi iratot).

A fentiek szerint felépített antitestgének expresszálhatók, és a termék ismert módszerekkel állítható elő. Az emlőssejtek esetében az expresszió véghezvihető egy hagyományos, hasznos promoter, az expresszálandó antitestgén és egy, a 3’ downstream végén egy operábilis poli-A szignállal ellátott DNS vagy ilyen DNS-t tartalmazó vektor alkalmazásával. Promoter/enhancerként például emberi citomegalovírusból származó korai promoter/enhancert alkalmazhatunk.

Továbbá a találmány szerinti készítményben alkalmazható antitest expressziójára használható promoter/enhancerként még virális promoter/enhancerek, így például a retrovírusok, poliomavirusok, adenovírusok, vagy simian 40-es vírus (SV40), valamint az emlőssejtekből származó promoter/enhancerek, így például az emberi elongációs faktor 1a (HEF1a) alkalmazható.

Például az expresszió könnyen megvalósítható Mulligan és munkatársai [Mulligan, R. C. és munkatársai, Natúré (1979) 277, 108-114] módszerével, amikor

HU 225 539 Β1

SV40 promoter/enhancert használunk, vagy Mizushima és munkatársai [Mizushima, S. és Nagata, S. Nucleíc Acids Rés. (1990) 18, 5322] módszerével, amikor HEF1a promoter/enhancert használunk.

Az E. coli esetében az expresszió úgy valósítható meg, hogy egy hagyományosan használatos promotert, az antitesttermelésre szolgáló szignálszakaszt és az expresszálandó antitestgént operábilisan összekapcsoljuk, majd mindezt követi maga az expresszió. Promoterként például lacz promoter vagy araB promoter alkalmazható. A lacz promoter alkalmazásakor Ward és munkatársai módszere használható [Ward, E. S. és munkatársai, Natúré (1989) 341, 544-546; Ward, E. S. és munkatársai, FASEB J. (1992) 6, 2422-2427], az araB promoter alkalmazásakor Better és munkatársai-féle módszer [Better, M. és munkatársai, Science (1988) 240, 1041-1043] használható.

Az E. coli periplazmájában végbemenő antitesttermeléshez szükséges szignálszekvenciaként a pe1B szignálszekvencia [Lei, S. P. és munkatársai, J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383] alkalmazható. A periplazmában felhalmozódott antitestek elválasztása után az antitestek szerkezete alkalmazás előtt megfelelően újra összehajtogatható [lásd például a WO 96/30394 számú közzétételi iratban],

A replikációs origóként az SV40 vírusból, poliomavírusból, adenovírusból, szarvasmarha-papillomavírusból (BPV) vagy hasonlókból származtatott replikációs origók használhatók. Továbbá a gazdasejtrendszerben a génmásolatok számának szaporítására az expressziós vektorok kiválasztható markerekként magukban foglalhatnak amino-glikozid-foszfotranszferáz (APH)-gént, timidin-kináz (TK)-gént, E. coli xantin-guanin-foszforibozil-transzferáz (Ecogpt)-gént, dihidrofolát-reduktáz (dhfr)-gént vagy más hasonlót.

A találmány szerinti készítményben alkalmazható antitest termelésére bármilyen termelőrendszer felhasználható. Az antitest termelésére szolgáló termelőrendszer magában foglal in vitro és in vivő termelőrendszereket. In vitro termelőrendszerekként például eukarióta sejteket vagy prokarióta sejteket felhasználó termelőrendszerek alkalmazhatók.

Az eukarióta sejtek használata esetén termelőrendszerekként állati sejteket, növényi sejteket vagy gombasejteket alkalmazhatunk. Ismert állati sejtek az (1) emlősöktől származó sejtek, így például a CHO-sejtek, COS-sejtek, myelomasejtek, hörcsögcsecsemő-vesesejtek (BHK), HeLa-sejtek vagy Vero-sejtek; (2) kétéltű állatoktól származó sejtek, így például Xenopus oocyták; vagy (3) rovaroktól származó sejtek, így például sf9, sf21 és Tn5 sejtek. Az ismert növényi sejtek például a Nicotiana tabacumból származó sejtek, amelyek kallusztenyésztésre alkalmazhatók. Ismert gombasejtek például az élesztőgombafajokból, így a Saccharomyces nemzetségből, még közelebbről a Saccharomyces cereviceae-ből származó sejtek, vagy a fonalas gombákból, így például az Aspergillus nemzetségből, még közelebbről az Aspergillus nigerből származó sejtek.

A prokarióta sejtek alkalmazása esetén a termelőrendszerekben baktériumból származó sejteket alkalmazunk. Ismert baktériumsejtek az Escherichia coli (E. coli) vagy a Bacillus subtilis.

Egy kívánt antitest génjét transzformálva ezen sejtekbe, és a transzformált sejtek in vitro tenyészésével az adott antitestet kaphatjuk meg. A tenyésztést ismert módszerekkel hajtjuk végre. így például tenyésztési közegként DMEM, MÉM, RPMI1640 vagy IMDM tápközeg használható, és szérumkiegészítőket, így például magzati borjúszérumot (FCS) lehet ezekkel kombinációban használni. Továbbá az antitesteket in vivő is elő lehet állítani az antitest génjével transzformált sejteknek egy állat vagy más hasonló hasüregébe történő injektálással.

In vivő termelési rendszerekként az állatokat vagy növényeket alkalmazó rendszerek használhatók. Állatokat alkalmazó rendszerek például az emlősöket vagy rovarokat alkalmazó termelési rendszerek.

Emlősökként kecskék, sertések, juhok, egerek vagy szarvasmarhák alkalmazhatóak (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Rovarokként selyemhernyók használhatóak.

Növények alkalmazása esetén például a dohánynövény használható.

Ezekbe az állatokba vagy növényekbe transzformáljuk az antitestgéneket, majd az antitestek ezekben termelődnek, ahonnan ezután kinyerhetők. így például fúziós gének előállítására az antitestgént egy olyan proteint kódoló gén közepébe inszertáljuk, amely protein mindenképpen termelődik a tejjel. Ilyen protein például a kecske-p-kazein. Az antitestgénnel beültetett fúziós gént tartalmazó DNS-fragmentumokat egy kecskeembrióba injektáljuk, majd ezután azt egy nőstény kecskébe helyezzük át. A kívánt antitestet az embriót befogadó kecskétől született transzgenikus kecske vagy annak leszármazottai által termelt tejből kapjuk meg. A transzgenikus kecske által termelt, antitestet tartalmazó tej mennyiségének növelésére a transzgenikus kecskének megfelelő mennyiségű hormont adhatunk [Ebért, K. M. és munkatársai, Bio/Technology (1994) 12,699-702],

Selyemhernyó alkalmazásakor a selyemhernyót olyan baculovirussal fertőzzük meg, amelybe a kívánt antitest génjét inszertáltuk, majd a kívánt antitestet a fertőzött selyemhernyó testnedveiből nyerhetjük ki [Maeda,

S. és munkatársai, Natúré (1985) 315, 592-594], Dohánynövény alkalmazásakor a kívánt antitestgén egy növény-expressziósvektorba, így például pMON 530-ba ültethető be, majd a vektorral egy baktérium, így az Agrobacterium tumefaciens fertőzhető. Ezután a baktériummal a dohánynövény, így a Nicotiana tabacum fertőzhető meg, majd a kívánt antitest a dohánynövény leveleiből nyerhető ki [Julián, K.-C. Ma és munkatársai, Eur. J. Immunoi. (1994) 24, 131-138],

Az antitestetnek a fentiek szerinti in vitro vagy in vivő termelési rendszerekben történő előállításakor az antitest nehéz lánca (H lánc) vagy könnyű lánca (L lánc) külön-külön építhető be egy-egy expressziós vektorba, majd ezekkel a gazdasejtek egyidejűleg transzformálhatok, vagy más módszerrel a H láncot és az L láncot kódoló DNS-t egyetlen expressziós vektorba

HU 225 539 Β1 építjük be, és a gazdasejtet ezzel transzformáljuk (lásd a WO 94/11523 számú közzétételi iratban).

A találmány szerinti készítményben alkalmazható antitestekként antitestfragmentumok vagy előnyösen az antitestek módosított változatai is alkalmazhatók, így például antitestfragmentumokként a Fab, F(ab')2, Fv vagy egyetlen láncú Fv (scFv) alkalmazható, ahol a H lánc és az L lánc Fv-i egy megfelelő linkerrel vannak összekötve.

Közelebbről az antitestfragmentumok úgy állíthatók elő, hogy az antitesteket enzimekkel, így például papainnal vagy pepszinnel kezeljük, vagy más módszerként ezeket az antitestfragmentumokat kódoló géneket szerkesztjük meg, majd ezeket egy expressziós vektorba építjük be, amelyet ezután a megfelelő gazdasejtben expresszálunk [lásd például Co, M. S. és munkatársai, J. Immunoi. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. és Horwitz, A. H., Methods in Enzymology, (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. és Skerra, A., Methods in Enzymology, (1989) 178, 476—496; Lamonyi, E., Methods in Enzymology, (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. és munkatársai, Methods in Enzymology, (1986) 121, 663-669; Bírd, R. E. és munkatársai, TIBTECH (1991) 9, 132-137],

Az scFv az antitest H lánca V részének és az L lánca V részének összekapcsolásával állítható elő. Az scFv-ben előnyösen a H lánc V része és az L lánc V része egy linkeren keresztül, előnyösen egy peptidlinkeren keresztül kapcsolható össze [lásd Huston, J. S. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883], Az scFv-ben a H lánc V része és az L lánc V része bármelyik fenti antitestből származhat. A V részeket összekapcsoló peptidlinkerként bármely egyetlen láncú, például 12-19 aminosavmaradékot tartalmazó peptid használható.

Az scFv-t kódoló DNS úgy állítható elő, hogy a fenti antitest H láncát vagy a H láncának V szakaszát kódoló DNS-t és a fenti antitest L láncát vagy az L láncának V szakaszát kódoló DNS-t templátként használjuk a fenti szekvenciák közüli kívánt aminosavszekvenciát kódoló DNS-szakaszok PCR-technikával történő szaporítására úgy, hogy a primer pár meghatározza mindkét véget, majd a peptidlinkerrészt és a H lánchoz, illetve az L lánchoz kapcsolandó fenti DNS mindkét végét meghatározó primer párt kódoló DNS kombinációját tovább szaporítjuk.

Az scFv-t kódoló DNS felépítése után az őket tartalmazó expressziós vektor és az előbbi expressziós vektorral transzformált gazdasejt hagyományos módszerekkel állítható elő, majd az scFv hagyományos módszerekkel, a transzformált gazdasejt felhasználásával kapható meg.

Ezek az antitestfragmentumok előállíthatok azok génjeinek előállításával a fentiekben ismertetett eljárással azonos módon eljárva, majd elősegítve ezen gének expresszálódását valamely gazdában. A leírásban használt „antitest” kifejezés ezeket az antitestfragmentumokat is magában foglalja.

Módosított antitestekként különböző molekulákkal, például polietilénglikollal (PEG) asszociált antitestek használhatók. A leírásban használt „antitest” kifejezés az ilyen módosított antitesteket is magában foglalja. Az ilyen módosított antitestek az így kapott antitestek kémiai módosításával állíthatók elő. Erre alkalmas módszerek már ismertek a szakirodalomban.

A fentiek szerint termelt és expresszált antitestek a gazdasejtek környezetéből vagy azok belsejéből elválaszthatók, majd homogenitásig tisztíthatok. A találmány szerinti készítményben alkalmazható antitest elválasztását és tisztítását affinitáskromatográfiával hajthatjuk végre. Az ilyen affinitáskromatográfiához oszlopokként a Protein A oszlop vagy a Protein G oszlop alkalmazható. A Protein A oszlopban hordozóként Hyper D, POROS, Sepharose F. F. vagy más hasonló használható. Más módszerként a proteinek elválasztására és tisztítására alkalmazott hagyományos módszerek minden korlátozás nélkül alkalmazhatók. A találmány szerinti készítményben alkalmazható antitest elválasztása és tisztítása a fenti affinitásos kromatográfiás módszertől eltérő kromatográfiás módszerekkel, szűréssel, ultraszűréssel, kisózással, dialízissel vagy más hasonlóval való kombinációjával hajtható végre. Ilyen más kromatográfiás módszer az ioncserélő, hidrofób, gélszűréses vagy más hasonló kromatográfiás módszer. Ezeket a kromatográfiás módszereket magas felbontású folyadékkromatográfiával (HPLC) alkalmazhatjuk. Más módszerként fordított fázisú HPLC használható.

A fentiekben kapott antitest koncentrációja abszorbanciamérésekkel, enzimkapcsolt immunoszorbens vizsgálattal (ELISA) vagy más hasonlóval határozható meg. Ennek megfelelően, az abszorbanciás mérés alkalmazásakor, a mintát PBS(-)-sel megfelelően hígítjuk, ezután 280 nm-en meghatározzuk az abszorbanciát, majd a koncentráció számolással állapítható meg, tudván, hogy 1 mg/ml-nél az abszorpciós koefficiens 1,35 OD. Az ELISA-módszer alkalmazásakor a mérések a következőképpen hajthatók végre. 0,1 mol/l-es hidrogén-karbonát-pufferrel (pH-értéke 9,6) 1 pg/ml-re hígított 100 pl kecske antihumán IgG-t (gyártó cég: TAGO) 96 lyukú lemezre (gyártó cég: NUNC) helyezünk, és az antitest immobilizálása érdekében egy éjszakán keresztül 4 °C-on inkubáljuk. A blokkolást követően a mintához 100 μΙ-nyi, megfelelően hígított, mindegyik találmány szerinti antitestet vagy az azt tartalmazó mintát, vagy standardként 100 μΙ-nyi emberi IgG-t (gyártó cég: Cappel) adagolunk, majd a mintát 1 óra hosszat, szobahőmérsékleten inkubáljuk.

A mosás után 100 μΙ, 5000-szeresen hígított alkalikus foszfatázzal jelzett antihumán IgG antitestet (gyártó cég: Bio Source) adagolunk, majd további 1 óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáljuk. A mosás után szubsztrátoldatot adagolunk és tovább inkubáljuk, majd ezt követően Microplate Reader Model 3550 (gyártó cég: Bio-Rad) segítségével 405 nm-en lemérjük az abszorbanciát, majd kiszámoljuk a kívánt antitest koncentrációját.

A találmány szerinti készítményben alkalmazható módosított IL—6 IL—6 receptort kötő hatással rendelkezik, de nem közvetíti az IL—6 biológiai hatását. Ennek

HU 225 539 Β1 megfelelően a módosított IL—6, annak ellenére, hogy verseng az IL—6 molekulákkal az IL—6 receptorok kötőhelyeiért, nem közvetíti az IL—6 biológiai hatását, és ezért gátolja az IL—6 közvetítette jeltovábbítást.

A módosított IL—6 mutációk létrehozásával állítható elő úgy, hogy az IL-6 aminosavszekvenciájában aminosavmaradékokat cserélünk fel. A módosított IL—6 forrása bármely eredetű IL—6 lehet, de számításba véve az antigenitást, az emberi IL—6 előnyösebb.

Közelebbről: az IL—6 szekunder szerkezete ismert molekulamodellező, például WHATIF [Vriend és munkatársai, J. Mól. Graphics (1990) 8, 52-56] program segítségével előre jelezhető, és így felmérhető egy aminosavmaradék felcserélésének általános hatása. A megfelelő aminosavmaradék meghatározása után a hagyományos polimeráz-láncreakció (PCR) segítségével mutáció indukálható, amely módszerben a módosított IL-6-ot kódoló gén előállítására az emberi IL—6 gént kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó vektort alkalmazunk. Kívánt esetben a kapott módosított IL-6-ot kódoló gén a megfelelő expressziós vektorba beépíthető, majd ebből a rekombináns antitestből expresszió, termelés és tisztítás után kinyerhetjük a módosított IL-6-ot.

A módosított IL-6-ra közelebbi példákat a Brankenhoff és munkatársai, J. Bioi. Chem. (1994) 269, 86-93; Savino és munkatársai, EMBO J. (1994) 13, 1357-1367 közleményekben, valamint a WO 96/18648 és a WO 96/17869 közzétételi iratokban ismertettek.

A találmány szerinti készítményben alkalmazható IL—6 vagy az IL—6 receptor részleges peptidjei IL—6 receptort, illetve IL-6-ot kötő hatással rendelkeznek, de nem közvetítik az IL—6 biológiai hatását. Ennek megfelelően az IL—6 vagy az IL—6 receptor részleges peptidjei megfelelően kötődhetnek az IL—6 receptorhoz, illetve az IL-6-hoz, ezáltal blokkolva azokat. Ennek eredményeképpen ezek nem közvetítik az IL—6 biológiai hatását, és blokkolják az IL—6 jeltovábbítását.

Az IL—6 vagy az IL—6 receptor részleges peptidjei olyan peptidek, amelyek részben vagy teljes egészben tartalmazzák az IL-6-ban vagy az IL—6 receptorban levő, az IL—6 receptorhoz, illetve az IL-6-hoz történő kötődésben szerepet játszó aminosavszekvenciákat. Ezek a peptidek általában 10-80, előnyösen 20-50, még előnyösebben 20-40 aminosavmaradékot tartalmaznak.

Az IL—6 vagy az IL—6 receptor részleges peptidjei előállíthatók az IL-6-ban vagy az IL—6 receptorban levő, az IL—6 receptorhoz, illetve az IL-6-hoz történő kötődésben szerepet játszó aminosavszekvenciák meghatározásával, majd ezen aminosavszekvenciák egy részének vagy egészének hagyományos módszerrel, így például genetikai előállítási technológiával vagy valamilyen peptidszintézis-módszerrel történő előállításával.

Az IL—6 vagy az IL—6 receptor részleges peptidjeinek genetikai előállítási technológiával való előállítására a kívánt peptidet kódoló DNS-szekvenciát egy expressziós vektorba építhetjük be, amelyből a kívánt peptidet expresszióval, termeléssel, majd tisztítással nyerhetjük ki.

Az IL—6 vagy IL—6 receptor részleges peptidjeinek peptidszintézis-módszerrel való előállítását a peptidszintézisben szokásosan használt módszerrel, így például szilárd fázisú szintézissel vagy folyékony fázisú szintézissel végezhetjük el.

Közelebbről a Zoku-lyakuhin no Kaihatsu (Fejlemények a gyógyszerhatóanyagok előállításában), 14. kötet, Peputido Gousei (Peptid Szintézis), Haruaki Yajima kiadó, Hirokawa Shoten, 1991-ben kiadott szakirodalmi helyen ismertetett eljárás alkalmazható. A szilárd fázisú szintézis szerint az előállítandó peptid C-terminálisának megfelelő aminosavat egy szerves oldószerekben oldhatatlan hordozóra kapcsoljuk, majd ehhez egy olyan aminosavat kapcsolunk, amelyben az a-aminocsoport vagy valamelyik oldalláncán lévő funkciós csoport megfelelő védőcsoporttal védett, így a kapcsolást a C-terminális felől az N-terminális irányába hajtottuk végre. Ezután az aminosav α-aminocsoportján levő védőcsoportot vagy a gyantához kapcsolt peptidet lehasítjuk. A peptidlánc hosszabbítása érdekében a fenti reakciók felváltva megismételhetők. A szilárd fázisú peptidszintézis-eljárások az alkalmazott védőcsoport függvényében Boc-eljárásra és Fmoc-eljárásra oszthatók.

A kívánt peptid előállítása után a védőcsoportokat eltávolítjuk, majd peptidláncot lehasítjuk a hordozóról. A védőcsoportok eltávolítására a Boc-eljárásban hidrogén-fluoridot vagy trifluor-metánszulfonsavat, az Fmoc-eljárásban általában TFA-t használhatunk. Például a Boc-eljárásban a fenti peptidgyantát anizol jelenlétében hidrogén-fluoriddal kezeljük. Ezt követően a védőcsoportot eltávolítjuk, és a peptidet a hordozóról történő lehasítással kapjuk meg. A kapott elegy liofilizálásával a nyerspeptidet kaphatjuk meg. Másrészről az Fmoc-eljárásban például TFA alkalmazható, és a védőcsoport eltávolítását, valamint a peptid hordozóról való lehasítását a fentiekkel azonos módon hajthatjuk végre.

Az így kapott nyerspeptidet HPLC segítségével elválasztjuk és tisztítjuk. Az elúciót optimális körülmények között, a proteintisztításra általánosan alkalmazott víz-acetonitril oldószerrendszerben hajtjuk végre. A kapott kromatográfiás profil csúcsának megfelelő frakciót összegyűjtjük és liofilezzük. Az így tisztított peptidfrakciót, például tömegspektroszkópiával molekulatömeg-elemzésnek alávetve, aminosav-összetételének vagy aminosavszekvenciájának elemzésével vagy más hasonló módszerekkel azonosítjuk.

Az IL—6 részleges peptidjeire közelebbi példákat a JP 2(1990)-188600 számú közzétételi iratban (Kokai), a JP 7(1995)-324097 számú közzétételi iratban (Kokai), a JP 8(1996)-311098 számú közzétételi iratban (Kokai), valamint az US 5210075 számú szabadalmi leírásban ismertettek.

A találmány szerinti készítményben alkalmazott IL-6-antagonista hatása ismert hagyományos módszerrel határozható meg. Közelebbről IL—6-függő MH60.BSF2 sejtet tenyésztünk, amelyhez IL-6-ot adagolunk, majd az aktivitást az IL—6-függő sejtek IL-6-antagonista jelenlétében felvett [³H]-timidin-mennyiségének mérésével határozhatjuk meg. Más módszerként

HU 225 539 Β1

U266-ot - amely egy IL—6 receptort expresszáló sejt tenyésztünk, amikor is egyszerre ¹²⁵l-dal jelzett IL-6-ot és egy IL-6-antagonistát adagolunk, majd ezután meghatározzuk az IL—6 receptort expresszáló sejthez kötődő ¹²⁵l-dal jelzett IL—6 mennyiségét. A fenti vizsgálati rendszerben az IL—6 receptor antagonistát tartalmazó csoport mellett egy IL-6-antagonistától mentes negatív kontrollcsoportot is felállítunk, és az IL—6 receptor antagonisták IL—6-ot gátló hatásának meghatározására az így kapott eredményeket összehasonlítjuk.

A találmány szerinti készítmény hatásának igazolására egy, a találmány szerinti készítményben alkalmazható IL-6-antagonistát adagolunk olyan állatoknak, amelyekben CD4-pozitív és CD45RB erősen pozitív sejtek (CD4⁺CD45RB^h'9^h sejtek) injektálása után gyulladásos bélbetegség fejlődött ki, majd meghatározzuk az elért tömegvesztés csökkenését és a gyulladásos bélbetegség pontszámának javulását. A találmány szerinti készítmény járulékos hatásaiként említhetők meg az étvágytalanság csökkentése, a hasi fájdalmak csökkentése, a hasmenés csökkentése vagy a gyulladásos bélbetegség kiújulásának megelőzése.

A CD4*CD45RB^hi9^h sejteket, amelyeket az IL-6-antagonisták mellett viszünk át az állatokba, például az alábbiakban ismertetett példában leírt eljárásnak megfelelően választhatjuk el. Az állatok, amelyekből a CD4⁺CD45RB^h|9^h sejtek származnak, olyan a kísérletekben általánosan használt állatok lehetnek, mint például az egerek és a patkányok.

Amint azt az alábbi példában ismertetjük, azokban az állatokban, amelyekben a gyulladásos bélbetegség kifejlődött, az IL—6 receptor antitestek adagolása a tömegvesztés csökkentését és a gyulladásos bélbetegség pontszámának javulását észleltük, így bizonyossá vált, hogy az IL-6-antagonisták, úgymint az anti-IL-6 receptor antitestek, a gyulladásos bélbetegségre terápiás hatást fejtenek ki.

A találmány szerinti készítménnyel kezelendő alanyok emlősök. Előnyösen a kezelendő alanyok emberek.

A találmány szerinti kezelésre vagy megelőzésre szolgáló szerek orálisan vagy parenterálisan, illetve szisztémásán vagy lokálisan adagolhatóak. (gy például intravénás injekció, például cseppinfúzió, intramuszkuláris injekció, intraperitoneális injekció, szubkután injekció, kúpok, bélöblitö folyadékok, szájon keresztüli enterális borítású tabletták és hasonló adagolási formák választhatóak, és az alkalmazási módszer a beteg életkorának és általános állapotának megfelelően választható ki. A hatásos adag nagysága az adagonként! 0,01 mg és 100 mg per testtömegkilogramm között lehet. Más módszerként az adag 1 és 1000 mg per beteg, előnyösen 5 és 50 mg per beteg közötti értéket vehet fel.

Az adagolási mód függvényében a találmány szerinti gyulladásos bélbetegség kezelésére vagy megelőzésére szolgáló szerek gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagokat vagy adalék anyagokat tartalmazhatnak. Ilyen hordozó- vagy adalék anyagként például víz, gyógyszerészetileg elfogadható szerves oldószer, kollagén, poli(vinil-alkohol), poli(vinil-pirrolidon), karboxi-vinil-polimer, nátrium-karboxi-metil-cellulóz, nátrium-poliakrilát, nátrium-alginát, vízben oldódó dextrán, nátrium-karboxi-metil-keményítő, pektin, metil-cellulóz, etil-cellulóz, xantángumi, gumiarábikum, kazein, zselatin, agar, diglicerin, propilénglikol, polietilénglikol, vazelin, paraffin, sztearil-alkohol, sztearinsav, emberi szérumalbumin (HSA), mannit, szorbit, laktóz, valamely gyógyszerészetileg elfogadható felületaktív anyag vagy más hasonló alkalmazható. Az adagolási formától függően adalék anyagként - de nem csak ezekre korlátozódva - bármely fenti anyag vagy ezek bármilyen kombinációja alkalmazható.

A találmány szerinti készítménnyel kezelhető betegség a gyulladásos bélbetegség. A gyulladásos bélbetegség magában foglalja a colitis ulcerosát és a Crohn-betegséget. Ezek a betegségek javarészt a 20 év körüli fiatalokat érintik, és még manapság is keveset ismerünk a betegséget okozó antigénekről, illetve a gyulladásos folyamat patológiájáról. Bárhogy is legyen, számos sejt és citokin tanulmányozásával kiterjedt kutatások folynak mindezek felderítésére.

Az elmúlt néhány évben fejlődés tapasztalható a gyulladásos bélbetegséget okozó sejtek elemzésében, így világossá vált, hogy a gyulladásos bélbetegség előidézhető tisztított CD4-pozitív és CD45RB erősen pozitív sejteknek (CD4⁺CD45RB^h'9^h) immundeficiens egerekbe (SCID egerekbe) való juttatásával [lásd például Morrissey, P. J. és munkatársai, J. Exp. Med. (1993) 178, 237-244; Leach, M. W. és munkatársai, Am. J. Pathol. (1996) 148, 1503-1515; Aranda, R. és munkatársai, J. Immunoi. (1997) 158, 3464-3473].

Másrészről igazolódott, hogy CD4-pozitív és CD45RB gyengén pozitív sejtek (CD4⁺CD45RB^low) nem képesek gyulladásos bélbetegséget kiváltani, és inkább gátolják a gyulladásos bélbetegség CD4-pozitív és CD45RB erősen pozitív sejtek általi kiváltását [Powrie, F. R. és munkatársai, J. Exp. Med. (1994) 179, 589-600]. Ismeretes, hogy a sejtek CD45RB expressziója korrelál a citokintermelési mintázattal. Ennek megfelelően feltételezik, hogy a CD4-pozitív és CD45RB erősen pozitív sejtek olyan 1-es típusú helperszerű sejtek (Th1), amelyek IFN-γ-ί és TNF-a-t termelnek, miközben a CD4-pozitív és CD45RB gyengén pozitív sejtek olyan 2-es típusú helperszerű sejtek (Th2), amelyek IL—4-et, IL-10-et és hasonlókat termelnek [Lee, W. és munkatársai, J. Immunoi. (1990) 144, 3288-3295],

Ennek megfelelően feltételezik, hogy az IBD kialakulásáért valószínűsíthetően a Th1 és Th2 sejtek közötti egyensúly felborulása tehető felelőssé, és ezt a nézetet támasztja alá az a tény is, mely szerint a géncélzásos módszerrel IL-10-deficienssé tett egérben kialakuló krónikus bélgyulladás messzemenőkig hasonlít az emberi colitis ulcerosához [Kuhn, R. és munkatársai, Cell (1993) 75, 263-274],

A példában használt modellállatok a vastagbél szövettani jellemvonásainak vonatkozásában nagyon hasonlítanak a colitis ulcerosában és Crohn-betegségben szenvedő betegekéihez [Leach, M. W. és munkatársai, Am. J. Pathol. (1996) 148, 1503-1515], A colitis ulcero10

HU 225 539 Β1 sában a károsodott részek gyakran a végbéltől felfelé összefolyóan borítják be a bélrendszert, és kiváltképp a nyálkahártya felhámja sérült. A találmány szerinti modell klinikai patológiai vonatkozásban nagyon hasonló a colitis ulcerosához abból a szempontból, hogy bár többnyire a vastagbélre lokalizálódnak, nagyobb területek érintettek, és a tüszők kiterjedése is hasonló.

Másrészről a Crohn-betegség a bélfal teljes átmérőjét érintő, nem csak a nyálkahártyára lokalizálódó gyulladás, ami az emésztőrendszerben a szájüregtől a végbélnyílásig, szétszórtan, bárhol megjelenhet. Szövettanilag nem elsajtosodó granulomatosus gyulladás jellemzi. A találmány szerinti modell nagyon hasonlít a Crohn-betegséghez abban a vonatkozásban, hogy a gyulladás nem csak a nyálkahártyára lokalizálódik, és makrofágok, limfociták és többmagvú óriássejtek csoportosulása jellemzi, valamint gyakran granulóma formáját veszi fel, ugyanakkor tüszős tályogok formájában nagyon ritkán jelentkezik.

Ennek megfelelően a klinikai kutatásban mindeddig olyan eseteket ismertettek, amelyekben a colitis ulcerosa és a Crohn-betegség tünetei egymás mellett léteznek [Tanaka, M. és munkatársai, Hepato-Gastroenterology (1990) 37, 18-31]. A gyulladásos bélbetegségben a ll-es osztályú fő hisztokompatibilitási komplex felhámbeli fokozott expresszióját találták [Trejdosiewicz, L. K. és munkatársai, Dig. Dis. Sci. (1989) 34, 1449-1456], ami a találmány szerinti modellre is jellemző. A találmány szerinti modellben a felhám szövetének jellegzetes megvastagodása jelentkezik, amely feltételezhetően a colitis ulcerosában szenvedő betegek fokozott sejtnövekedésével társul [Serafini, Ε. P. és munkatársai, Gut (1981) 22, 648-652].

A találmány szerinti modell nagyon hasonlít a klinikai gyulladásos bélbetegséghez, és súlyosabb esetekben tömegvesztést is gerjeszthet. Egy, a találmány szerinti modellt felhasználó kísérletben a szövettani károsodások határozottan csökkentek, és a tömegvesztés sem volt megfigyelhető, ami azt mutatja, hogy az IL-6-antagonista gyulladásos bélbetegségben, így például a colitis ulcerosában vagy a Crohn-betegségben terápiás hatást mutat.

A továbbiakban a találmányt kiviteli példákkal, referenciapéldákkal, valamint kísérleti példákkal részletesebben ismertetjük. Megjegyezzük, hogy az alábbiakban ismertetett példák semmilyen vonatkozásban nem korlátozzák a találmányt.

Példa

Balb/c hím egerek lépét aszeptikusán eltávolítottuk, majd homogenizálás után, többszöri pipettázással egyedülálló sejtek szuszpenzióját készítettük. Ezután a vörösvértestek eltávolítása érdekében a sejtüledéket lizálóoldattal (0,16 mol/l vizes NH₄CI-oldat és 0,17 mol/l Trisz-puffer 9:1 térfogatarányú elegye, pH-értéke 7,2) kezeltük, amelyet egérlépsejtek előállításáig még kétszer foszfátpufferezett sóoldattal mostunk.

A mosott egérlépssejteket 2% FCS-t tartalmazó RPMI1640 közegben szuszpendáltuk, majd a sejtszámot megszámlálás után 1,1*10® sejt/ml-re állítottuk be.

Ehhez 1/9 térfogatban antiegér CD4 antitestet (L3T4 Microbeads, gyártó cég: Miltenyi Biotec) adagoltunk, majd 15 percen át jégen a sejtekhez (sejtsűrűsség 1*10® sejt/ml) kapcsoltuk. Ezután a CD4-pozitív sejtfrakciót egy oszlopon Mini MACS elválasztórendszerrel (gyártó cég: Miltenyi Biotec) összegyűjtöttük. A sejtszámlálás után az egészet 2% FCS-sel kiegészített foszfátpufferezett sóoldatban szuszpendáltuk, így a sejtsűrűséget 4*10⁷ sejt/ml-re állítottuk be.

CD4-pozitív sejtek szuszpenziójához 1/100 térfogatnyi PE-vel jelzett patkány antiegér CD4 (L3T4) antitestet (0,2 mg/ml, RM4-5 klón, gyártó cég: Pharmingen) és 1/100 térfogat FITC-vel jelzett patkány antiegér CD45RB antitestet (0,5 mg/ml, 16A klón, gyártó cég: Pharmingen) adagoltunk. Az elegyet 20 percig jégen hagytuk állni, miközben végbement az antitestkapcsolás. A jelzett sejtekhez 2% FCS-sel kiegészített RPMI1640 közeget adagoltunk, amelyet centrifugálással mostunk, majd 2% FCS-sel kiegészített foszfátpufferezett sóoldatban újraszuszpendáltuk és hűvös, sötét helyen tároltuk.

A jelzett CD4-pozitív sejtek közül flow citométer (FACS Vantage, gyártó cég: Becton Dickinson) segítségével kiválasztottuk a CD4-pozitív és CD45RB erősen pozitív sejteket (CD4⁺CD45RB^h'9^h sejtek). Ez a sejtcsoport a CD4- és CD45RB-pozitív sejtek közül az erősen expresszáló CD45RB sejtek felső 50%-ának felel meg. A kapott sejteket centrifugálás után foszfátpufferezett sóoldatban szuszpendáltuk, így 4*10⁶ sejt/ml-re hígítottuk. A sejtek tisztasága a CD45RB-pozitív sejtekre vonatkoztatva 97%, és a túlélési arányuk 98% volt.

A kapott nagyon tiszta sejtoldatot 4* 10⁵ sejt/ml koncentrációban (mindegyik 4*10⁵ sejt/ml koncentrációjú mintából 100 μΙ mennyiséget) intraperitoneálisan, C.B-17 SCID egerekbe injektáltuk, kiváltva így a gyulladásos bélbetegség modellt [Leach, M. W. és munkatársai, Am. J. Pathol. (1996) 148, 1503-1515; Aranda, R. és munkatársai, J. Immunoi. (1997) 158, 3464-3473]. A kezelési eljárás alkalmazásával a kísérletet a következő három csoporton hajtottuk végre: 1. sejttranszferrel, anti-IL-6 receptor antitesttel nem kezelt csoport, 5 egér; 2. sejttranszferrel, anti-IL—6 receptor antitesttel kezelt csoport, 3 egér; 3. sejttranszfer nélküli csoport, 3 egér.

Az MR16-1 anti-IL—6 receptor antitestet a következőképpen adagoltuk. Először az antitestoldatot 20 mg/ml-re állítottuk be, majd ebből az oldatból, 15-30 perccel a fenti sejtek injektálása előtt, egerenként 100 μΙ-t adagoltunk intraperitoneálisan. Egy héttel később az oldatot foszfátpufferezett sóoldattal 10 mg/ml-re állítottuk be, és ebből egerenként 100 μΙ-t adagoltunk intraperitoneálisan. Ezt az eljárást a sejttranszfert követő nyolcadik hétig minden héten megismételtük. Az antitesttel nem kezelt csoport hasonló módon foszfátpufferezett sóoldatot kapott.

A sejttranszfer után 8-9 héttel az egereket lemértük, majd a vastagbélszövetet (a vastagbél leszálló részét) eltávolítottuk és OCT-vegyületbe mártottuk. Ezután a mintákat -80 °C-on fagyasztottuk. Egy kriosztát segit11

HU 225 539 Β1 ségével ezekből a mintadarabokból 6 pm vastagságú fagyasztott metszeteket készítettünk, amelyeket 10%-os formalinoldatban rögzítettünk. Szövettani elemzés céljából a rögzített metszeteket hematoxilin-eozin-módszerrel kétszeresen festettük.

A gyógyszer hatásosságának vizsgálatát a testtömegben változással (a sejttranszfer előtti és utáni testtömeg aránya) és a sejttranszferrel történő gyulladásos bélbetegség indukciója előtti, valamint a sejttranszfert követő 8-9. héten történő szövettani elemzés összehasonlításával határoztuk meg. A szövettani elemzés érdekében mindegyik egér szövetét kiértékeltük a gyulladásos bélbetegség súlyossági fokának (a továbbiakban gyulladásos bélbetegség pontszám) alábbi 4 stádiuma alapján [lto, H. és munkatársai, J. Autoimmunity (1997) 10,455-459],

Gyulladásos bélbetegség pontszáma:

0. fokú (nincs): nem megkülönböztethető a normális BALB/c egértől;

1. fokú (minimális): enyhe hipertrófia figyelhető meg a felhámban;

2. fokú (enyhe): az 1. fok és a 3. fok közötti átmenet;

3. fokú (súlyos): egy szélesen elterjedt gyulladásos sejtinfiltrációval és kehelysejt-hiánnyal társult jelentős felhámszövet-hipertrófia.

A testtömegbeli változások, valamint a gyulladásos bélbetegség pontszámok eredményeit az 1. táblázatban mutatjuk be.

A CD4-pozitív és CD45RB erősen pozitív sejtekkel beültetett egerekben gyulladásos bélbetegség fejlődött ki, és szövettanilag is jelentős gyulladás volt megfigyelhető. A betegség megjelenésével erőtlenség és az átlagos testtömeg 11 %-os csökkenése volt megfigyelhető. Másrészről az anti-IL-6 receptor antitesttel adagolt csoportban a testtömegcsökkenés statisztikailag szignifikáns lassulása volt megfigyelhető, és a sejttranszfer előtti testtömeg nagyjából megőrződött. Továbbá a szövettani gyulladásos bélbetegség pontszámai a gyulladásos bélbetegség enyhülését mutatták.

A testtömeg változásának statisztikai mérésére a szignifikancia bizonyítására először ANOVA (Analysis of variance, SPPS fór Windows ver. 6, SPSS Inc.) elemzést végeztünk, majd ezután a többszörös összevetésre Bonferroni-féle módszert alkalmaztuk, így 5%-os szignifikanciaszinten mért szignifikanciát figyeltünk meg.

Ez a modell nagyon hasonló az emberi gyulladásos bélbetegséghez, és így bebizonyosodott, hogy az anti-IL-6 receptor antitest hatásos gyulladásos bélbetegség, így például colitis ulcerosa vagy Crohn-betegség kezelésére vagy megelőzésére.

1. táblázat

Az anti-IL-6 receptor antitest által előidézett testtömegcsökkenés, valamint gyulladásos bélbetegség súlyosbodásának enyhülése

Injektált sejt	Kezelés	Állatok száma	Testtömeg változása (%)	Gyulladásos bélbetegség pontszáma
CD4‘CD45RBhl9tl	Foszfátpufferezett só	5	88,8±6,7	2,4
CD4+CD45RBh'9h	anti-IL-6 receptor antitest	3	100,9±4,5	1,0
Hiányzik	Foszfátpufferezett só	3	107,7±0,9	0,3

A testtömegbeli változást a csoportátlag istandard deviáció értékekben fejeztük ki. A gyulladásos bélbetegség pontszámát a csoport átlagértékeként fejeztük ki.

1. referenciapélda: Oldódó emberi IL—6 receptor előállítása

Yamasaki-féle eljárás [Yamasaki, K. és munkatársai, Science (1988) 241, 825-828] szerint eljárva IL—6 receptort kódoló cDNS-t tartalmazó pBSF2R.236 plazmid alkalmazásával PCR-módszerrel oldódó IL—6 receptort állítottunk elő. Az IL-6 receptort kódoló cDNS előállítására a pBSF2R.236 plazmidot Sph I restrikciós enzimmel emésztettük, amelyet ezután mp18-ba (gyártó cég: Amersham) építettünk be. Az IL—6 receptort kódoló cDNS-be stopkodon beépítésére tervezett szintetikus oligoprimer felhasználásával, in vitro Mutagenesis System (gyártó cég: Amersham) segítségével PCR-technikát alkalmazva az IL—6 receptort kódoló cDNS-ben mutációt hajtottunk végre. Az eljárás a 345-ös helyzetű aminosavnál egy stopkodon beépülését eredményezte, így oldódó IL—6 receptort kódoló cDNShez jutottunk.

Az oldódó IL—6 receptort kódoló cDNS CHO-sejtekben való expressziójának érdekében pSV plazmidhoz (gyártó cég: Pharmacia) kapcsoltuk, és így pSVL344 plazmidot kaptunk. Az oldódó IL—6 receptort kódoló cDNS-t, amelyet Hind lll-Sal l-gyel hasítottunk, a dhfr cDNS-ét tartalmazó pECEdhfr plazmidba építettük be, és így a CHO-sejtekben expresszálható pECEdhfr344 plazmidot kaptuk meg.

Kalcium-foszfát precipitációs módszerrel tiz pg pECEdhfr344 plazmidot transzfektáltunk a DXB-11 jelű dhfr-CHO sejtvonalba [lásd Urland és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220], A transzferált CHO-sejteket 3 hétig nukleozidmentes 1 mmol/l glutamint, 10% dializált FCS-t, 100 U/ml penicillint és 100 pg/ml streptomycint tartalmazó a MÉM szelekciós közegben tenyésztettük.

Az egyedülálló CHO-sejtklón előállítására a kiválasztott CHO-sejteket korlátozó hígítási módszerrel szkríneltük. A CHO-sejtklónt 20 nmol/l-200 nmol/l metotrexátban (MTX) szaporítottuk, és így oldódó emberi IL—6 receptort termelő 5E27 CHO-sejtvonalat kaptunk.

HU 225 539 Β1

A kapott 5E27 CHO-sejtvonalat 5% FBS-t tartalmazó Iscov-módosított Dulbecco-féle közegben (IMDM, gyártó cég: Gibco) tenyésztettük. A sejttenyészet felülúszóját összegyűjtöttük, majd az oldódó IL—6 receptor felülúszóbeli koncentrációját ELISA-módszerrel határoztuk meg. Az eredmények igazolták, hogy a sejttenyészet felülúszójában jelen volt az oldódó IL—6 receptor.

2. referenciapélda: Emberi IL-6 antitest előállítása

Freund-féle komplett adjuvánssal együtt 10 pg rekombináns IL-6-tal immunizáltunk BALB/c egereket, és ezt minden héten addig ismételtük, ameddig a szérumban anti-IL—6 antitestet nem tudtunk kimutatni. Az immunsejteket eltávolítottuk a helyi nyirokcsomókból, és ezután 1500-as polietilénglikol felhasználásával P3U1 myeloma-sejtvonallal fuzionáltattuk. A hibridómákat HAT-közeget alkalmazó Oi-féle módszer [Oi és munkatársai, Selective Methods in Cellular Immunonlogy, W. H. Freeman and Co., San Francisco (1980), 351] alkalmazásával különválasztottuk, így emberi IL-6 antitestet termelő hibridómákat kaptunk.

Az emberi IL-6 antitestet termelő hibridómát az alábbiaknak megfelelően IL—6-kötő vizsgálatnak vetettük alá. Hajlékony polivinilből (gyártó cég: Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA, USA) készült 96 lyukú mikrotiterlemezt, egy éjszakán keresztül, 4 °C-on 100 pl kecske antiegér Ig-vel (10 μΙ/ml, gyártó cég Cooper Biomedical, Inc., Maivem, PA, USA) vontuk be. Ezt követően a lemezt szobahőmérsékleten, 2 óra hosszat 1% borjúszérum-albumint (BSA) tartalmazó PBS-sel kezeltük.

PBS-sel való átmosás után minden lyukba 100 μΙ hibridóma-sejttenyészet felülúszót adagoltunk, és az egészet egy éjszakán keresztül 4 °C-on inkubáltuk. Miután a lemezt lemostuk, minden lyukba 2000 cpm/0,5 ng/lyuk koncentráció eléréséig ¹²⁵l-dal jelzett rekombináns IL—6-ot adagoltunk, majd mosás után gamma-számláló (Beckman Gamma 9000, gyártó cég: Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA) segítségével mindegyik lyuk radioaktivitását lemértük. Az IL—6-kötési vizsgálatban 216 hibridóma klón közül 32 volt pozitív. Ezekből a klónokból végül a stabil MH166.BSF2-t állítottuk elő. Az utóbbi hibridóma által termelt MH166 anti-IL—6 antitest IgGlK-altípussal rendelkezik.

Ezután az MH60.BSF2 IL—6-függö egérhibridómaklónt alkalmaztunk az MH166 antitest hibridóma növekedését semlegesítő hatásának vizsgálatára. Az MH60.BSF2 sejteket 1*10⁴/200 μΙ/lyuk koncentrációban osztottuk szét, majd mindegyikbe lyukba MH166 antitestet tartalmazó mintákat adagoltunk, 48 óra hosszat tenyésztettük, 0,5 pCi/lyuk [³H]-timidint (gyártó cég: New England Nuclear, Boston, MA, USA) adagoltunk, és a tenyésztést további 6 órán át folytattuk. A sejteket üveg szűrőpapírra helyeztük, és egy automatikus betakarítógéppel (gyártó cég: Labo Mash Science Co., Tokyo, Japán) kezeltük. Kontrollként nyúl anti-IL—6 antitestet használtunk.

Az eredmények azt mutatták, hogy az MH166 antitest dózisfüggően gátolta az IL—6-indukált MH60.BSF2 sejtek [³H]-timidin-beépülését. Mindez igazolta, hogy az MH166 antitest semlegesíti az

IL-6 aktivitását.

3. referenciapélda: Emberi anti-IL-6 receptor antitest előállítása

A Hirata-féle eljárás [Hirata, Y. és munkatársai, J. Immunoi. (1989) 143, 2900-2906] szerint előállított MT18 anti-IL-6 receptor antitestet a kapcsolási rendnek megfelelően CNBr-aktivált Sepharose 4B-hez (gyártó cég: Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ, USA) kapcsoltuk, és az IL-6 receptort [Yamasaki,

K. és munkatársai, Science (1988) 241, 825-828] tisztítottuk. U266-OS emberi myeloma-sejtvonalat 1% digitonint (gyártó cég: Wako Chemicals), 10 mmol/l trietanol-amint (pH-értéke 7,8) és 0,15 mol/l NaCI-ot (digitoninpuffer) tartalmazó 1 mmol/l p-para-amino-fenil-metánszulfonil-fluorid-hidrokloriddal (gyártó cég: Wako Chemicals) oldhatóvá tettük, majd Sepharose 4B gyöngyökhöz kapcsolt MT18 antitesttel kevertük össze. Ezután a részlegesen tisztított IL-6 receptor előállítása érdekében a gyöngyöket hatszor digitoninpufferrel mostuk.

A fenti, 3*10⁹ U266 sejtből kapott részlegesen tisztított IL-6 receptorral minden tizedik napon négy alkalommal BALB/c egereket immunizáltunk, majd ezután szabványos módszerrel egy hibridómát állítottunk elő. A növekedéspozitív lyukakban lévő hibridómatenyészetek felülúszóját a fentiekben ismertetett módszerrel vizsgáltuk az IL-6-hoz való kötődésük szempontjából. 5*10⁷ U266 sejtet [³⁵S]-metioninnal (2,5 mCi) jelöltünk meg, és a fenti digitoninpufferrel oldhatóvá tettük. Az oldhatóvá tett U266 sejteket 0,04 ml Sepharose 4B gyöngyökhöz kapcsolt MT18 antitesttel kevertünk össze, majd ezután digitoninpufferrel hatszor mostuk. A [³⁵S]-metionin-jelzett IL-6 receptort 0,25 ml digitoninpufferrel (pH-értéke 3,4) eluáltuk, és 0,025 ml, 1 mol/l Trisszel (pH-értéke 7,4) semlegesítettük.

0,05 ml hibridómatenyészet felülúszót 0,01 ml Protein G Sepharose-zal (gyártó cég: Pharmacia) kevertünk össze. Mosás után a Sepharose-t a fentiekben ismertetett eljárás szerint elkészített 0,005 ml [³⁵S]-nel jelzett IL-6 receptor oldattal inkubáltuk. Az IL-6 receptorral reagáló hibridómatenyészet felülúszó felderítése céljából az immunprecipitátumot SDS-PAGE módszerrel elemeztük. Ennek eredményképpen a PM-1-pozitív hibridómaklónt határoztuk meg. A PM-1 hibridóma által termelt antitest IgGlK-altípussal rendelkezik.

Az U266 emberi myeloma-sejtvonal alkalmazásával tanulmányoztuk a PM-1 hibridóma által termelt antitest gátlóhatását az IL-6-nak az emberi IL-6 receptorhoz való kötődésére nézve. E. coli-ból emberi rekombináns IL-6-ot állítottunk elő [Hirano és munkatársai, Immunoi. Lett. (1988) 17: 41-45], és BoltonHunter reagenssel (gyártó cég: New England Nuclear, Boston, MA, USA) ¹²⁵l-dal jelöltük [Taga, T. és munkatársai, J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981], 4*10⁵ U266 sejtet 70% (térfogat/térfogat) PM-1 hibridómatenyészet felülúszóval és 14 000 cpm ¹²⁵l-dal jelzett IL-6-tal egy óra hosszat, szobahőmérsékleten tenyésztettünk. A mintából 400 μΙ-es polietilén mikrocentrifugacsőben lévő

HU 225 539 Β1

300 μΙ FCS-re 70 μΙ-nyi réteget helyeztünk. Centrifugálás után meghatároztuk a sejtek radioaktivitását.

Az eredmények igazolták, hogy a PM-1 hibridóma által termelt antitest gátolja az IL-6-nak az IL-6 receptorhoz való kötődését.

4. referenciapélda: Egér anti-IL-6 receptor antitest előállítása

Saito-féle eljárással [Saito és munkatársai, J. Immunoi. (1993) 147, 168-173] egér IL-6 receptor ellenes monoklonális antitestet állítottunk elő.

Az oldódó egér IL-6 receptort termelő CHO-sejteket 10% FCS-t tartalmazó IMDM-közegben tenyésztettünk. A tenyészet felülúszójából RS12 oldódó egér IL-6 receptor antitest (Saito és munkatársai, lásd fent) és Affigel 10 gélhez rögzített affinitásoszlop (gyártó cég: Biorad) felhasználásával oldódó egér IL-6 receptort választottunk el.

Az oldódó egér IL-6 receptort (50 pg) Freund-féle komplett adjuvánssal kevertük össze, majd az egészet Wistar-patkányok hasüregébe injektáltuk. Az adagolást követő 2 hét után az állatokat Freund-féle inkomplett adjuvánssal töltöttük fel. A 45. napon a patkányokat leöltük, és hagyományos módszerrel, 50%-os PEG1500 (gyártó cég: Boehringer Mannheim) felhasználásával körülbelül 2*10® lépsejtet 1*10⁷ P3U1 egér-myelomasejttel fuzionáltattunk, majd HAT tenyésztési közeggel szkríneltük.

Nyúl antipatkány IgG antitesttel (gyártó cég: Cappel) bevont lemezhez adagoltuk a hibridómák tenyészeteinek felülúszóit, majd oldódó egér IL-6 receptort adagoltunk. Ezután nyúl antiegér IgG receptor antitest és alkalikus foszfatázzal jelzett juh antinyúl IgG alkalmazásával, ELISA-módszerrel az oldódó antiegér IL-6 receptor antitestet termelő hibridómákat szkríneltük. Miután a kívánt antitest termelődése bebizonyosodott, a hibridóma kiónokat kétszer újraszkríneltük, így egyedülálló hibridómaklónokat kaptunk. A kapott kiónokat MR16-1-nek neveztük el.

A hibridóma által termelt antitestnek az egér IL-6 közvetített jeltovábbítást gátló hatását MH60.BSF2 sejteket felhasználva, a [³H]-timidin-beépülés vizsgálatával határoztuk meg [Matsuda, T. és munkatársai, J. Immunoi. (1988) 18, 951-956]. Az MH60.BSF2 sejteket 96 lyukú mikrolemezen 1*10⁴ sejt/200 μΙ/lyuk sejtsűrűségben készítettük el. Mindegyik lyukba 10 pg/ml egér IL—6-ot és 12,3-1000 ng/ml koncentrációjú MR16-1 antitestet vagy RS12 antitestet adagoltunk, majd 5%-os CO₂-ot tartalmazó légtérben 44 óra hosszat 37 °C-on tenyésztettük, és ezután 1 pCi/lyuk [³H]-timidint adagoltunk. 4 óra elteltével megmértük a [³H]-timidin-beépülést. Az eredmények azt mutatták, hogy az MR 16-1 antitest gátolta az MH60.BSF2 sejtek [³H]-timidin-beépülését.

Mindez igazolta, hogy az MR16-1 hibridóma által termelt antitest gátolja az IL-6-nak az IL-6 receptorhoz való kötődését.

Ipari alkalmazhatóság

A fenti példákkal bebizonyítottuk, hogy a gyulladásos bélbetegségben bármelyik IL-6-antagonista, így például valamelyik anti-IL—6 receptor antitest terápiás hatással rendelkezik. Ennek megfelelően bebizonyítottuk, hogy a fenti IL-6-antagonista alkalmazható Crohnbetegség vagy colitis ulcerosa kezelésére vagy megelőzésére.

Claims (11)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Interleukin-6 (IL-6) receptor elleni antitest alkalmazása gyulladásos bélbetegség kezelésére vagy megelőzésére szolgáló készítmény előállítására.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol IL-6 receptor elleni antitestként IL-6 receptor elleni monoklonális antitestet alkalmazunk.
3. 3. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol IL-6 receptor elleni antitestként emberi IL-6 receptor elleni monoklonális antitestet alkalmazunk.
4. 4. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol IL-6 receptor elleni antitestként egér IL-6 receptor elleni monoklonális antitestet alkalmazunk.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol IL-6 receptor elleni antitestként rekombináns antitestet alkalmazunk.
6. 6. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, ahol emberi IL-6 receptor elleni monoklonális antitestként PM-1 antitestet alkalmazunk.
7. 7. A 4. igénypont szerinti alkalmazás, ahol egér IL-6 receptor elleni monoklonális antitestként MR16-1 antitestet alkalmazunk.
8. 8. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol IL-6 receptor elleni antitestként IL-6 receptor elleni kiméra vagy humanizált antitestet alkalmazunk.
9. 9. A 8. igénypont szerinti alkalmazás, ahol IL-6 receptor elleni humanizált antitestként humanizált PM-1 antitestet alkalmazunk.
10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyulladásos bélbetegség Crohn-betegség vagy colitis ulcerosa lehet.
11. 11. IL-6 receptor elleni antitest alkalmazása gyulladásos bélbetegség által okozott tömegvesztés csökkentésére szolgáló készítmény előállítására.