KR100838862B1 - 아이엘-6 안타고니스트를 유효성분으로 함유하는 감작 티 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제 - Google Patents

아이엘-6 안타고니스트를 유효성분으로 함유하는 감작 티 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제 Download PDF

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Abstract

유효성분으로서 인터루킨-6(IL-6) 안타고니스트, 예를 들면, IL-6 수용체에 대한 항체, IL-6에 대한 항체, gp130에 대한 항체 등으로 이루어지는 감작 T 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제.
인터루킨-6(IL-6) 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는 감작 T 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제

Description

아이엘-6 안타고니스트를 유효성분으로 함유하는 감작 티 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제{Preventives or remedies for sensitized T cell-related diseases containing IL-6 antagonists as the active ingredient}
본 발명은 인터루킨-6(IL-6) 안타고니스트를 유효성분으로 함유하는 감작(感作) T 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인터루킨-6(IL-6) 안타고니스트를 유효성분으로 함유하는 감작 T 세포 억제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 IL-6 수용체에 대한 항체를 유효성분으로 함유하는 감작 T 세포 억제제에 관한 것이다.
IL-6은 소위 B 세포 자극인자 2(BSF2) 또는 인터페론 β2라고 불리워지는 사이토카인이다. IL-6은 B-임파구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자(分化因子)로서 발견되고(Hirano, T. et al., Nature(1986) 324, 73-76). 그 후, 각종 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 사이토카인이라는 것이 밝혀졌다(Akira, S. et al., Adv. in Immunology(1993) 54, 1-78). IL-6은 T 임파구계 세포의 성숙화를 유도하는 것이 보고되어 있다(Lotz et al., J. Exp. Immunol. 18: 1253-1258, 1988).
IL-6은 세포상에서 2종류의 단백질을 통해서 그의 생물학적 활성을 전달한다. 하나는 IL-6이 결합하는 분자량이 약 80 kD의 리간드 결합성 단백질의 IL-6 수용체이다. IL-6 수용체는 세포막을 관통하여 세포막상에서 발현하는 막 결합형 외에, 주로 그의 세포외 영역으로 이루어진 가용성 IL-6 수용체로서도 존재한다.
다른 하나는 비리간드 결합성의 시그날 전달에 관여하는 분자량이 약 130 kD의 막 결합 단백질 gp130이다. IL-6과 IL-6 수용체는 IL-6/IL-6 수용체 복합체를 형성하고, 이어서 gp130과 결합함으로써, IL-6의 생물학적 활성이 세포내로 전달된다(Taga, T. et al., J. Exp. Med.(1987) 166, 967).
IL-6 안타고니스트는 IL-6의 생물학적 활성의 전달을 저해하는 물질이고, 지금까지 IL-6에 대한 항체(항 IL-6 항체), IL-6 수용체에 대한 항체(항 IL-6 수용체 항체) 및 gp130에 대한 항체(항 gp130 항체)가 알려져 있다. 그 외에, 국제특허출원 공개번호 WO95-00852, WO95-11303, WO96-34104, WO96-18648, WO96-17869, 일본특허공개 제1995-324097호, 동 제1996-311098호에 기재된 IL-6 안타고니스트가 알려져 있다.
항 IL-6 수용체 항체에 관해서는 몇개의 보고가 있다[Novick D. et al., Hybridoma(1991) 10, 137-146, Huang, Y. W. et al., Hybridoma(1993) 12, 621-630, 국제특허출원 공개번호 WO95-09873, 프랑스특허출원 공개번호 제 2694767호, 미국특허 제 521628호]. 그 중의 하나인 마우스 항체 PM-1(Hirata et al., J.Immunology(1989) 143, 2900-2906)의 상보성 결정영역(CDRs)을 인간 항체에 이식함으로써 얻어진 인간형화 PM-1 항체가 알려져 있다(국제특허출원 공개번호 WO92-19759).
한편, 많은 자기면역질환이나 알레르기 질환에 있어서, 특정 항원을 인식하는 T 세포(감작 T 세포)가 존재하고, 이 감작 T 세포가 이러한 질환의 병태에 관여하고 있는 것이 알려져 있다. 예를 들면, 다발성 경화증에서는 미엘린(myelin) 염기성 단백질(Zhang, J. et al., J. Exp. Med(1994) 179, 973-984), 포도막염에서는 S 항원(Nussenblatt, R. B. et al., Am. J. Ophthalmol(1980) 89, 173-179), 만성갑상선염에서는 티로글로블린(thyroglobulin), 아토피성 피부염에서는 진드기 등 (Kubota, Y. et al., J. Dermatol(1993) 20, 85-87, Kondo, N. et al., J. Allergy Clin. Immunol(1993) 91, 658-668), 지연성 과민증에서는 세균, 바이러스, 버섯 등 및 접촉성 피부염에서는 금속, 일본식 래커(lacquer) 등을 항원으로 하는 감작 T 세포의 존재가 알려져 있다.
또한, 이들 항원을 동물에 면역시키거나, 항원-특이적 감작 T 세포를 비면역 동물에 도입시키는 것에 의해 인간과 유사한 병태를 유도하는 것도 가능하다. 이러한 사실로부터, 감작 T 세포가 상기 질환에서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 생각된다. 현재, 이러한 질환의 치료에는 스테로이드제 및/또는 면역 억제제가 사용되고 있으나, 이들은 대증요법(symptomatic treatment)이고, 또한 장기간의 투여가 필요하며, 결국에는 부작용의 문제를 갖게 된다.
지금까지, 상기한 바와 같은 IL-6 안타고니스트가 감작 T 세포 억제 효과를 나타내고, 감작 T 세포가 관여하는 질환에 대해서 치료 효과를 갖는 것은 알려져 있지 않았다.
본 발명은 상기 결점을 갖지 않는 감작 T 세포 관여 질환에 대한 치료제를 제공하는데 그 목적이 있다.
즉, 본 발명은 IL-6 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는 감작 T 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 IL-6 수용체에 대한 항체를 유효성분으로서 함유하는 감작 T 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체를 유효성분으로서 함유하는 감작 T 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체를 유효성분으로서 함유하는 감작 T 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체를 유효성분으로서 함유하는 감작 T 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 PM-1 항체를 유효성분으로서 함유하는 감작 T 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 MR16-1 항체를 유효성분으로서 함유하는 감작 T 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 인간 항체 정상 영역(C 영역)을 갖는 IL-6 수용체에 대한 항체를 유효성분으로서 함유하는 감작 T 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 IL-6 수용체에 대한 키메라 항체 또는 인간형화 항체를 유효성분으로서 함유하는 감작 T 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 인간형화 PM-1 항체를 유효성분으로서 함유하는 감작 T 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 IL-6 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는, 다발성 경화증, 포도막염, 만성 갑상선염, 지연성 과민증, 접촉성 피부염 또는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 IL-6 안타고니스트를 유효성분으로서 함유하는 감작 T 세포 억제제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 IL-6 수용체에 대한 항체를 유효성분으로서 함유하는 감작 T 세포 억제제에 관한 것이다.
도 1은 결핵균 감작과 동시에 MR16-1을 투여한 후 MR16-1의 마우스 지연형 발바닥 부종 반응 억제 작용을 나타낸 것이다.
1. IL-6 안타고니스트
본 발명에서 사용하는 IL-6 안타고니스트는 감작 T 세포의 억제 효과, 또는 감작 T 세포가 관여하는 질환의 예방 또는 치료효과를 나타내는 것이라면, 그 유래, 종류 및 형태는 문제되지 않는다.
IL-6 안타고니스트는 IL-6에 의한 정보 전달을 차단하고, IL-6의 생물학적 활성을 저해하는 물질이다. IL-6 안타고니스트로서는 항 IL-6 항체, 항 IL-6 수용체 항체, 항 gp130 항체, IL-6 개변체, 또는 IL-6 또는 IL-6 수용체의 부분 펩티드 등을 들 수 있다.
1-1. 항 IL-6 항체
본 발명에서 사용되는 항 IL-6 항체는 공지의 수단을 이용해서 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항 IL-6 항체로서는, 특히, 포유 동물로부터 유래된 모노클로날 항체가 바람직하다. 포유동물로부터 유래된 모노클로날 항체로는 하이브리도마에서 생산되는 것, 유전자 공학적 방법에 의해서 항체 유전자를 함유하는 발현 벡타로 형질 전환한 숙주에서 생산되는 것이 있다. 이들 항체는 IL-6와 결합함으로써, IL-6의 IL-6 수용체에 대한 결합을 저해하여 IL-6의 생물학적 활성의 세포내로의 전달을 차단하는 항체이다.
이와 같은 항체로서는 MH166(Matsuda et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956) 및 SK2 항체(Sato, K. et al., 제 21회 일본면역학회총회학술기록(1991) 21, 166) 등을 들 수 있다.
1-1-1. IL-6의 조제
항 IL-6 항체 생산 하이브리도마는 기본적으로는 공지된 기술을 사용하여 다음과 같이 제작할 수 있다. 즉, IL-6을 감작 항원으로 사용해서, 이것을 통상의 면역 방법에 따라서 면역하여, 얻어지는 면역 세포를 통상의 세포 융합법에 의해서 공지의 모세포와 융합시키고, 통상의 스크린법에 의해서 모노클로날 항체 생산 세포를 스크린함으로써 제작할 수 있다.
구체적으로는, 항 IL-6 항체는 다음과 같은 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들면, 항체 취득의 감작 항원으로서 사용되는 인간 IL-6은, Eur. J. Biochem(1987) 168, 543, J. Immunol. (1988) 140, 1534 또는 Argic. Biol. (1990) 54, 2685에 기재되어 있는 IL-6 유전자/아미노산 서열을 이용함으로써 얻을 수 있다.
IL-6 유전자 서열을 공지의 발현 벡타계에 삽입하여 적당한 숙주 세포를 형질전환시킨 후, 그의 숙주 세포 중 또는 배양 상청액 중에서 목적하는 IL-6 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제된 IL-6 단백질을 감작 항원으로서 사용할 수 있다. 또한, IL-6 단백질과 다른 단백질과의 융합 단백질을 감작 항원으로서 사용할 수도 있다.
1-2. 항 IL-6 수용체 항체
본 발명에서 사용하는 항 IL-6 수용체 항체는 공지의 방법을 사용하여 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항 IL-6 수용체 항체로서, 특히 포유동물에서 유래된 모노클로날 항체가 바람직하다. 포유동물에서 유래된 모노클로날 항체로서는 하이브리도마에 의해서 생산되는 것, 및 유전자 공학적 방법에 의해 항체 유전자를 함유하는 발현 벡타로 형질전환된 숙주에 의해서 생산되는 것이 있다. 이 항체는 IL-6 수용체와 결합함으로써 IL-6의 IL-6 수용체로의 결합을 저해하여 IL-6의 생물학적 활성의 세포내로의 전달을 차단하는 항체이다.
이와 같은 항체로서는 MR16-1 항체(Saito, et al., J. Immunology (1993) 147, 163-178), PM-1 항체(Hirata, et al., J. Immunology (1989) 143, 2900 - 2906), 또는 AUK12-20 항체, AUK64-7 항체 또는 AUK146-15 항체(국제특허출원 공개번호 WO92-19759) 등을 들 수 있다. 이들 중에서, PM-1 항체가 가장 바람직하다.
또한, PM-1 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주는, PM-1으로서, 일본국, 이바라키껭, 츠쿠바시, 히가시 1쵸메, 1반 3고에 위치한 공업기술원생명공학공업기술연구소에 1989년 7월 12일자로 기탁번호 FERM BP-2998로 부다페스트 조약의 규정에 기초해서 국제기탁되었다. 또한, MR16-1 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주는 Rat-mouse hybridoma MR16-1으로서, 일본국, 이바라키껭, 츠쿠바시, 히가시 1쵸메, 1반 3고에 위치한 공업기술원생명공학공업기술연구소에 1997년 3월 13일자로 기탁번호 FERM BP-5875로 부다페스트 조약의 규정에 기초해서 국제기탁되었다.
1-2-1. IL-6 수용체의 조제
모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 기본적으로는 공지 기술을 이용하여 다음에 기재하는 바와 같이 제조할 수 있다. 즉, IL-6 수용체를 감작 항원으로 사용하고, 이것을 통상의 면역 방법에 따라서 면역시키고, 얻어지는 면역 세포를 통상의 세포융합법에 의해서 공지의 모세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의해 모노클로날 항체 생산 세포를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다.
구체적으로는, 항 IL-6 수용체 항체를 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 항체를 취득하기 위한 감작 항원으로 사용되는 인간 IL-6 수용체는 유럽특허출원 공개번호 EP 325474에 기재되어 있는 IL-6 수용체 유전자/아미노산 서열을 이용해서 얻을 수 있으며, 마우스 IL-6 수용체는 일본특허공개 제 1991-155795호에 기재되어 있는 IL-6 수용체 유전자/아미노산 서열을 이용해서 얻을 수 있다.
IL-6 수용체 단백질은 세포막상에서 발현하고 있는 IL-6 수용체와 세포막에서 이탈하고 있는 IL-6 수용체(가용성 IL-6 수용체)(Yasukawa et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676)와 같은 2가지 종류가 있다. 가용성 IL-6 수용체 항체는 세포막에 결합되어 있는 IL-6 수용체의 실질적으로 세포외 영역으로 구성되어 있으며, 세포막 관통 영역 또는 세포막 관통 영역과 세포내 영역 모두가 부족하다는 점에서 막결합형 IL-6 수용체와는 다르다.
IL-6 수용체의 유전자 서열을 공지의 발현 벡타계에 삽입하여 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그의 숙주 세포 중에서 또는 그의 배양 상청액 중에서 목적으로 하는 IL-6 수용체 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제한 IL-6 수용체 단백질을 감작 항원으로 사용할 수 있다. 또한, IL-6 수용체 단백질을 발현하는 세포 또는 IL-6 수용체 단백질과 다른 단백질과의 융합 단백질을 감작 항원으로 사용할 수도 있다.
인간 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA를 함유하는 플라스미드 pIBIBSF2R을 함유하는 대장균(E.Coil)은 HB101-pIBIBSF2R로서 일본국, 이바라키껭, 츠쿠바시, 히가시 1쵸메, 1반 3고에 위치한 공업기술원생명공학공업기술연구소에 1989년 1월 9일자로 기탁번호 FERM BP-2232로 부다페스트 조약의 규정에 기초해서 국제기탁되었다.
1-3. 항 gp130 항체
본 발명에서 사용하는 항 gp130 항체는 공지의 방법을 사용해서 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용하는 항 gp130 항체로서는, 특히 포유동물에서 유래된 모노클로날 항체가 바람직하다. 포유동물에서 유래된 모노클로날 항체로서는 하이브리도마에 의해서 생산되는 것, 및 유전자 공학적 방법에 의해 항체 유전자를 함유하는 발현 벡타로 형질전환한 숙주에 의해서 생산된 것이 있다. 이 항체는 gp130와 결합함으로써, IL-6/IL-6 수용체 복합체의 gp130의 결합을 저해하여 IL-6의 생물학적 활성의 세포내로의 전달을 차단하는 항체이다.
이와 같은 항체로서는 AM64 항체(일본특허공개 제 1991-219894호), 4B11 항체 및 2H4 항체(미국특허 제 5,571,513호), B-S12 항체 및 B-P8 항체(일본특허공개 제 1996-291199호) 등을 들 수 있다.
1-3-1. gp130의 조제
모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 기본적으로는 공지 기술을 이용하여 다음에 기재하는 바와 같이 제조할 수 있다. 즉, gp130를 감작 항원으로 사용하고, 이것을 통상의 면역 방법에 따라 면역시키고, 얻어지는 면역 세포를 통상의 세포 융합방법으로 공지의 모세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의해 모노클로날 항체 생산 세포를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다.
구체적으로는, 모노클로날 항체를 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 항체취득의 감작 항원으로 사용되는 gp130는 유럽특허출원 공개번호 EP 411946에 기재되어 있는 IL-6 수용체 유전자/아미노산 서열을 사용함으로써 얻어진다.
gp130의 유전자 서열을 공지의 발현 벡타계에 삽입하여 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그의 숙주 세포 중에서 또는 그의 배양 상청액 중에서 목적으로 하는 gp130 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제한 gp130 단백질을 감작 항원으로 사용할 수 있다. 또한, gp130을 발현하고 있는 세포, 또는 gp130 단백질과 다른 단백질과의 융합 단백질을 감작 항원으로 사용할 수도 있다.
1-4. 항체 생산 하이브리도마의 제조
감작 항원으로 면역되어지는 포유동물로서는, 특히 한정하는 것은 아니지만, 세포융합에 사용하는 모세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로는, 여기에 한정하는 것은 아니지만, 설치류 동물, 예를 들면 마우스, 래트(rats), 햄스터(hamsters) 등이 사용된다.
감작 항원을 동물에 면역시키는 것은 공지의 방법으로 수행한다. 예를 들면, 일반적인 방법으로서, 감작항원을 포유동물의 복강내 또는 피하에 주사함으로써 행한다. 구체적으로는, 감작항원을 PBS(phosphate buffered saline) 또는 생리식염수의 적당량으로 희석 및 현탁시킨 것을 원하는 바에 따라 통상의 보조제(adjuvant), 예를 들면 프로인드의 완전 보조제(Freund's complete adjuvant)를 적당량 혼합하고, 유화시킨 후에, 포유동물에 4 내지 21일 마다 수회 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 감작 항원 면역시에 적당한 담체를 사용할 수 있다.
이와 같이 면역하고, 혈청 중에서 원하는 항체 레벨이 상승하는 것을 확인한 후, 포유 동물에서 면역 세포를 끄집어 내고, 세포 융합 처리한다. 세포 융합 처리하기에 바람직한 면역 세포로서는, 특히 비장(脾臟) 세포를 들 수 있다.
상기 면역 세포와 융합되는 다른 모세포로서의 포유 동물의 골수종 세포는 공지의 각종 세포, 예를 들면 P3X63Ag8.653(J. Immunol. (1979) 123 : 1548-1550), P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978) 81: 1 - 7), NS-1(Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6 : 511-519), MPC-11(Margulies, D.H. et al., Cell(1976) 8 : 405-415), SP2/0(Shulman, M. et al., Nature(1978) 276 : 269-270), FO(de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods(1980) 35 : 1 - 21), S194(Trowbridge, I.S., J. Exp. Med.(1978) 148 : 313 - 323), R210(Galfre, G. et al., Nature(1979) 277 : 131 - 133) 등이 바람직하게 사용된다.
상기 면역 세포와 골수종 세포의 세포 융합은 기본적으로 공지의 방법, 예를 들면 밀스테인 등(Milstein et al.)의 방법(Kohler, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73 : 3 - 46)에 기재된 것에 따라서 수행할 수 있다.
더욱 구체적으로는, 상기 세포 융합은 예를 들면, 세포 융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양 배양액 중에서 수행한다. 세포 융합 촉진제로서는, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 센다이 바이러스(Sendai virus)(HVJ) 등이 사용될 수 있으며, 경우에 따라서는 융합 효율을 높이기 위해서 디메틸설폭사이드 등의 보조제가 사용될 수도 있다.
면역 세포와 골수종 세포의 사용 비율은, 예를 들면 골수종 세포에 대해서 면역 세포를 1 내지 10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포 융합에 사용하는 배양액으로서는, 예를 들면, 상기 골수종 세포주의 증식에 적합한 RPMI 1640 배양액과 MEM 배양액, 그 외에 이러한 종류의 세포 배양에 사용하는 통상의 배양액이 사용 가능하며, 또한 소태아혈청(FCS) 등의 혈청 보조액을 병용할 수도 있다.
세포융합은 상기 면역 세포와 골수종 세포의 소정량을 상기 배양액에 잘 혼합하고, 미리 약 37℃로 가열한 PEG 용액, 예를 들면 평균 분자량이 1000 내지 6000정도의 PEG 용액을 통상 30 내지 60％(w/v)의 농도로 첨가하고, 혼합함으로써 목적으로하는 융합 세포(하이브리도마)를 형성한다. 계속해서, 적당한 배양액을 연속적으로 첨가하고, 원심분리하여 상청액를 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 좋지 않은 세포융합제 등을 제거할 수 있다.
상기 하이브리도마는 통상적으로 선택한 배양액, 예를 들면 HAT 배양액(히포크산틴, 아미놉테린 및 티미딘을 함유하는 배양액)으로 배양하는 것에 의해 선택된다. 상기 HAT 배양액에서의 배양은 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하는데 충분한 시간, 일반적으로 수일 내지 수주 동안 계속한다. 이어서, 통상의 한계희석법을 실시하여 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일클로닝을 행한다.
또한, 인간 이외의 동물에 항원을 면역하여 상기 하이브리도마를 얻는 것 외에, 인간 임파구를 in vitro에서 원하는 항원 단백질 또는 항원 발현 세포로 감작하고, 감작 B 임파구를 인간 골수종 세포, 예를 들면 U266과 융합시켜 목적으로 하는 항원 또는 항원 발현 세포의 결합활성을 갖는 원하는 인간 항체를 얻을 수 있다(일본특허공고 제 1989-59878호). 또한, 인간항체 유전자의 전체 레퍼토리를 갖는 트랜스제닉 동물에 항원 또는 항원 발현 세포를 투여하고, 상기 방법에 따라 원하는 인간 항체를 얻을 수도 있다(국제특허출원 공개번호 WO93-12227, WO92-03918, WO94-02602, WO94-25585, WO96-34096 및 WO96-33735).
이와 같이 하여 제조된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대배양하는 것이 가능하며, 또한, 액체 질소 중에서 장기간 동안 보존하는 것이 가능하다.
상기 하이브리도마에서 모노클로날 항체를 취득하기 위해서는, 상기 하이브리도마를 통상의 방법으로 배양하여, 항체를 배양 상청액으로 얻는 방법, 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시키고 그의 복수(腹水)로서 항체를 얻는 방법 등이 채용될 수 있다. 전자의 방법은 고순도 항체를 얻는데 적합한 반면에 후자의 방법은 항체의 대량 생산에 적합하다.
예를 들어, 항 IL-6 수용체 항체를 생산하는 하이브리도마는 일본특허공개 제 1991-139293호에 기재되어 있는 방법을 사용해서 제조할 수 있다. 일본국, 이바라키껭, 츠쿠바시, 히가시 1쵸메, 1반 3고에 위치한 공업기술원생명공학공업기술연구소에 1990년 7월 10일자로 기탁번호 FERM BP-2998로 부다페스트 조약의 규정에 기초해 국제기탁된 PM-1 항체를 생산하는 하이브리도마를 BALB/c 마우스(일본 CLEA 제)의 복강내에 주입하여 복수를 얻고 이 복수에서 PM-1 항체를 정제하는 방법, 또는 상기 하이브리도마를 적당한 배지, 예를 들면, 10％ 소 태아혈청, 5％ BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim 제)을 함유하는 RPMI 1640 배지, 하이브리도마 SFM 배지(GIBCO-BRL 제), PFHM-II 배지(GIBCO-BRL 제) 등에서 배양하고 그의 배양 상청액에서 PM-1 항체를 정제하는 방법으로 수행할 수 있다.
1-5 재조합형 항체
본 발명은 모노클로날로서 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하고, 적당한 벡타에 통합시켜서 이 것을 숙주에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 사용해서 생산되는 재조합 항체를 사용할 수 있다(예를 들면, Carl, A.K., Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD. 1990 참조).
구체적으로는, 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마에서 항체의 가변(V) 영역을 코드하는 mRNA를 단리한다. mRNA의 단리는, 공지의 방법, 예를 들면, 구아니딘 초원심법(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry(1979) 18, 5294 - 5299), AGPC 법(Chmczynski, P. et al., (1987) 162, 156 - 159) 등에 의한 전체 RNA을 조제하고, mRNA Purification Kit(Pharmacia 제) 등을 사용해서 mRNA를 조제한다. 또한, QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia 제)를 사용해서 mRNA를 직접 제조할 수 있다.
얻어진 mRNA에서 역전사효소를 사용해서 항체 V 영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit 등을 사용해서 실시할 수 있다. 또한, cDNA의 합성과 증폭을 행하기 위해서는 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech 제)와 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)을 채용하는 5'-RACE 법(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1988) 85, 8998 - 9002 : Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919 - 2932) 등을 사용할 수 있다. 얻어진 PCR 생산물로부터 목적하는 DNA 단편을 정제하고, 벡타 DNA와 연결한다. 또한, 이것으로부터 재조합 벡타를 제조하고, 대장균 등에 도입하여 클로니를 선택하여 목적으로하는 재조합 벡타를 제조한다. 목적하는 DNA 염기서열은 공지의 방법, 예를 들면, 디데옥시법(dideoxy method)에 의해서 확인할 수 있다.
목적하는 항체의 V 영역을 코드하는 DNA가 얻어지면, 이것을 원하는 항체의 정상영역(C 영역)을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡타에 통합시킨다. 또는, 항체의 V영역을 코드하는 DNA를 항체 C 영역을 코드하는 DNA를 함유하는 발현 벡타에 통합시킬 수 있다.
본 발명에서 사용하는 항체를 생산하기 위해서는, 후술하는 바와 같이, 항체 유전자를 발현제어영역, 예를 들면, 인핸서(enhancer) 및/또는 프로모터(promoter)의 제어하에서 발현하도록 발현벡터에 통합시킨다. 다음에, 이 발현벡터에 의해 숙주 세포를 형질 전환시키고, 항체를 발현시킬 수 있다.
1-6 개변 항체
본 발명에 따르면, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것을 목적으로 해서 인위적으로 개변(改變)한 유전자 재조합형 항체, 예를 들면 키메라(Chimeric) 항체, 인간형화(Humanized) 항체를 사용할 수 있다. 이들 개변 항체는 공지 방법을 이용해서 제조할 수 있다.
키메라 항체는, 상기와 같이 하여서 얻어진 항체의 V 영역을 코드하는 DNA를 인간 항체의 C 영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현벡터에 통합시키고, 숙주에 도입하여서 항체를 생산하는 것에 의해 제조될 수 있다(유럽특허출원 공개번호 EP 125023, 국제특허출원 공개번호 WO96-02576 참조). 이 공지의 방법을 이용하여, 본 발명에 유용한 키메라 항체를 얻을 수 있다.
예를 들어, 키메라 PM-1 항체의 L쇄 또는 H쇄의 V 영역을 코드하는 DNA를 함유하는 플라스미드는, 각각 pPM-k3 또는 pPM-h1으로 명명되며, 이 플라스미드를 가지는 대장균은 National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited에 1991년 2월 11일자로 각각 NCIMB 40366과 NCIMB 40362로 부다페스트 조약의 기초해서 국제 기탁되었다(국제특허출원 공개번호 WO92-19759 참조).
인간형화 항체는 재구성(reshaped) 인간항체로도 불리우며, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDRs)을 인간항체의 CDR로 이식시켜서 만들 수 있다. 이러한 항체를 제조하는 일반적인 유전자 재조합 방법도 알려져 있다(유럽특허출원 공개번호 EP 125023 및 국제특허출원 공개번호 WO96-02576 참조).
구체적으로는, 마우스 항체의 CDR와 인간항체의 프레임워크 영역(framework region : FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열은 그의 말단부에서 서로 중첩되는 부분을 갖도록 제작한 여러개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해서 합성된다. 얻어진 DNA를 인간항체 C 영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 다음에 발현벡터에 통합시키고, 이 것을 숙주에 도입하여 항체를 생산한다(유럽특허출원 공개번호 EP 239400 및 국제특허출원 공개번호 92-19759).
CDR을 통해서 연결되어 있는 인간항체의 FR는, 상보성 결정영역이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라서는, 재구성 인간항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체 가변 영역의 프레임워크 영역에 있는 아미노산을 치환시켜도 좋다(Sato, K. et al., Cancer Res.(1993) 53, 851-856).
키메라 항체, 인간형화 항체에는 인간항체의 C 영역이 사용된다. 인간 항체 C 영역으로서는 C
Figure 112003006484683-pct00001
를 들 수 있으며, 예를 들면, C
Figure 112003006484683-pct00002
1, C
Figure 112003006484683-pct00003
2, C
Figure 112003006484683-pct00004
3 및 C
Figure 112003006484683-pct00005
4 이 사용될 수 있다. 또한, 항체 또는 그의 생산의 안정성을 개선시키기 위해서, 인간항체의 C 영역을 수식해도 좋다.
키메라 항체는 인간 이외의 포유동물에서 유래된 항체의 가변영역과 인간 항체로부터 유래된 C 영역으로 이루어진 반면에, 인간형화 항체는 인간 이외의 포유동물에서 유래된 항체의 상보성 결정영역과 인간항체로부터 유래된 프레임워크 영역(FR)과 항체의 C 영역으로 이루어지고, 인간 체내에서 항원성이 저하하기 때문에, 본 발명의 치료제의 유효 성분으로서 유용하다.
본 발명에서 사용하는 인간형화 항체의 바람직한 구체예로는, 인간형화 PM-1 항체를 들 수 있다(국제특허출원 공개번호 WO92/19759 참조).
1-7. 발현 및 생산
상기한 바와 같이 구축한 항체 유전자는 공지의 방법으로 발현시켜서 얻을 수 있다. 포유류 세포의 경우에, 통상적으로 사용되고 있는 유용한 프로모터, 발현되는 항체 유전자, 그의 3'측 하류에 폴리 A 시그날을 기능적으로 결합시킨 DNA 또는 상기 DNA를 함유하는 벡터를 사용해서 발현시킬 수 있다. 프로모터/인핸서의 예로서는 인간 사이토메갈로바이러스 전기 프로모터/인핸서(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer) 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용하기 위한 항체의 발현에 사용될 수 있는 프로모터/인핸서로서, 바이러스성의 프로모터/인핸서, 예를 들면, 레트로바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 유인원의 바이러스 40 (SV40) 등이 있으며, 인간신장인자 1α(HEF1α)와 같은 포유류 세포에서 유래된 프로모터/인핸서가 있다.
예를 들면, SV40 프로모터/인핸서를 사용할 경우, Mulligan 등의 방법(Nature (1979) 277, 108) 또는 HEF1α 프로모터/인핸서를 사용할 경우, Mizushima 등의 방법(Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)에 의해서 용이하게 실시할 수 있다.
대장균의 경우, 통상적으로 사용되는 유용한 프로모터, 항체분비를 위한 시그날 서열, 및 발현시키는 항체 유전자를 기능적으로 결합시켜서 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 프로모터로서 lacz 프로모터와 araB 프로모터 등을 들 수 있다. lacz 프로모터를 사용할 경우, Ward 등의 방법(Nature(1098) 341, 544 - 546; FASEB J.(1992) 6, 2422 - 2427)을 사용할 수 있으며, araB 프로모터를 사용할 경우, Better 등의 방법(Science (1988) 240, 1041 - 1043)을 사용할 수 있다.
항체 분비를 위한 시그날 서열로서, 대장균의 페리플라즘(periplasm)에서 생산할 경우, pelB 시그날 서열(Lei, S.P. et al., J.Bacteriol. (1987) 169, 4379)을 사용할 수 있다. 페리플라즘에서 생산된 항체를 분리한 후, 항체의 구조를 사용전에 적절하게 리폴드(refold)한다(예를 들면, WO96-30394 참조).
복제기원으로서는, SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스, 보빈 파필로마 바이러스(BPV) 등으로부터 유래된 것을 사용할 수 있다. 또한, 숙주 세포계에서 유전자 복사수의 증폭을 위해서, 발현벡터는 선택 마커로서, 아미노글리코시드 트랜스퍼라제(APH) 유전자, 티미딘 키나제(TK) 유전자, 대장균 크산틴 구아닌포스포리보실 트랜스퍼라제(Ecogpt) 유전자, 디히드로엽산환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 항체의 생산을 위해서, 임의의 생산계를 사용할 수 있다. 항체 제조 생산계는 in vitro 또는 in vivo 생산계이다. in vitro 생산계로서는 진핵세포를 사용하는 생산계나 원핵세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다.
진핵세포를 사용할 경우, 동물 세포, 식물 세포 및 진균 세포를 사용하는 생산계가 있다. 동물 세포로서는 (1) 포유류 세포, 예를 들면, CHO 세포, COS 세포, 골수종 세포, 어린 햄스터 신장(BHK) 세포, HeLa 세포 및 Vero 세포, (2)양생류 세포, 예를 들면, Xenopus 난모 세포, 또는 (3)곤충 세포, 예를 들면, sf9, sf21 및 Tn5가 알려져 있다. 식물 세포로서는 예를 들면, Nicotiana tabacum에서 유래된 세포가 알려져 있으며, 이것을 켈러스(callus) 배양 처리하면 좋다. 진균 세포로서는 효모, 예를 들면, Saccharomyces 속, 특히 Saccharomyces cerevisiae 또는 사상균, 예를 들면, Aspergillus 속, 특히, Aspergillus niger 등이 알려져 있다.
원핵 세포를 사용하는 경우에, 세균 세포를 사용하는 생산계가 있다. 세균 세포로는 Escherichia coli(E. coli)와 Bacillus subtilis가 알려져 있다.
이들의 세포에 목적하는 항체 유전자를 형질전환시켜서 도입하고, 형질전환시킨 세포를 in vitro에서 배양시켜서 항체를 얻을 수 있다. 상기 배양은 공지의 방법으로 수행한다. 예를 들어, 배양액으로서, DMEM, MEM, RPMI 1640 및 IMDM을 사용할 수 있으며, 소 태아혈청(FCS) 등의 혈청 보조액을 병용할 수도 있다. 또한, 항체 유전자를 도입한 세포를 동물의 복강 등에 이식시켜서 in vivo에서 항체를 생산할 수 있다.
한편, in vivo 생산계로서는, 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수 있다. 동물을 사용하는 경우, 포유류 동물, 곤충을 사용하는 생산계가 있다.
포유류 동물로는, 염소, 돼지, 양, 마우스 및 소를 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또한, 곤충으로서는 누에를 사용할 수 있다.
식물을 사용할 경우, 예를 들면, 담배를 사용할 수 있다.
이러한 동물 또는 식물에 항체 유전자를 도입하고, 동물 또는 식물의 체내에서 항체를 생산하여 회수한다. 예를 들어, 항체 유전자를 염소 β 카세인과 같은 우유 중에서 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자의 도중에 삽입시켜 융합 유전자로서 제조한다. 항체 유전자가 삽입되어 있는 융합 유전자를 함유하는 DNA 단편을 염소 배(胚)에 주입하고, 이 배를 암컷 염소에 도입시킨다. 배를 수태한 염소에서 태어난 트랜스제닉 염소 또는 그의 새끼가 생산하는 우유에서 목적하는 항체를 얻는다. 트랜스제닉 염소로부터 생산된 목적하는 항체를 함유하는 유즙량을 증가시키기 위해서, 적당량의 호르몬을 트랜스제닉 염소에게 사용해도 좋다(Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699 - 702).
또, 누에를 사용할 경우, 목적하는 항체 유전자를 삽입한 바큘로바이러스 (baculovirus)를 누에에 감염시키고, 이 누에의 체액으로부터 목적하는 항체를 얻을 수 있다(Susumu, M. et al., Nature(1985) 315, 592 - 594). 또한, 담배를 사용할 경우, 목적하는 항체 유전자를 식물 발현용 벡터, 예를 들면, pMON 530에 삽입하고, 이 벡터를 Agrobacterium tumefaciens와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테 리아를 담배, 예를 들면, Nicotiana tabacum에 감염시켜 담배잎으로부터 목적하는 항체를 얻는다(Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131 - 138).
상술한 바와 같이, 항체를 in vitro 또는 in vivo 생산계에서 생산할 경우, 항체 중쇄(H 쇄) 또는 경쇄(L 쇄)를 코드하는 DNA를 따로 따로 발현벡터에 통합시키고, 숙주를 동시에 형질 전환시키거나, 또는 H 쇄와 L 쇄를 코드하는 DNA를 단일 발현벡터에 통합해서, 숙주를 형질 전환시킬 수 있다(국제특허출원 공개번호 WO94-11523 참조).
1-8. 항체 수식물
본 발명에서 사용하는 항체는 이들이 바람직하게 사용될 수 있는 한, 항체 단편 또는 그의 수식물일 수 있다. 예를 들어, 항체 단편으로서는 Fab, F(ab')2, Fv 또는 H 쇄와 L 쇄의 Fv를 적당한 링커(linker)로 연결시킨 단일쇄 Fv(scFv)를 들 수 있다. 구체적으로는, 항체를 효소, 예를 들면, 파파인(papain) 또는 펩신(pepsin)으로 처리하여 항체 단편을 생산시키거나, 또는 이 항체 단편을 코드하는 유전자를 구성하고, 이것을 발현벡터에 도입한 후, 적당한 숙주 세포에서 발현시킨다(예를 들면, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968 - 2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods in Emzymology(1989) 178, 476 - 496, Academic Press, Inc.; Plueckthun, A. and Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 476 - 496), Academic Press, Inc.; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652 - 663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663 - 669; Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132 - 137 참조).
scFv는 항체의 H 쇄 V 영역 및 L 쇄 V 영역을 연결시켜서 얻을 수 있다. 이 scFv에서 H 쇄 V 영역과 L 쇄 V 영역은 링커, 바람직하기는 펩티드 링커를 통해서 연결된다(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879 - 5883). 상기 scFv에서의 H 쇄 V 영역과 L 쇄 V 영역은 상기 항체 중 어느 것으로부터 유래되어도 좋다. V 영역을 연결하기 위한 펩티드 링커로서는, 예를 들면, 아미노산 12 ∼ 19 잔기로 이루어진 임의의 단일쇄가 사용될 수 있다.
ScFv를 코드하는 DNA는 상기 항체의 H 쇄 또는 H 쇄 V 영역을 코드하는 DNA 및 상기 항체의 L 쇄 또는 L 쇄 V 영역을 코드하는 DNA를 주형(鑄型)으로 하고, 상기 서열 중 목적하는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 부분을 그의 양쪽 단부를 규정하는 프라이머 쌍을 사용하여 PCR법에 따라 증폭하고, 이어서 또한 펩티드 링커 부분을 코드하는 DNA 및 그의 양쪽 단부가 각각 H 쇄 및 L 쇄와 연결되도록 규정한 프라이머 쌍을 조합시켜서 증폭시켜서 얻을 수 있다.
또한, 일단 scFv를 코드하는 DNA가 제작되면, 이들을 함유하는 발현벡터와 상기 발현벡터에 의해 형질 전환된 숙주는 통상의 방법으로 얻을 수 있고, 또한, 이 숙주를 사용하여 통상의 방법으로 scFv를 얻을 수 있다.
이들 항체 단편은 상기 방식과 동일하게 하여 그의 유전자를 취득하여 발현시키고, 숙주에 의해서 생산할 수 있다. 본 발명의 특허청구범위에서 사용된 “항체”는 이들 항체의 단편도 포함한다.
항체의 수식물로서, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수도 있다. 본 발명의 특허청구범위에서 사용된 “항체”는 이들 항체 수식물도 포함한다. 이들 항체 수식물을 얻기 위해서는, 얻어진 항체를 화학적으로 수식시켜서 얻을 수 있다. 이 방법은 이미 종래 기술로 확립되어 있다.
1-9. 항체의 분리 및 정제
1-9-1. 항체의 분리 및 정제
상기와 같이, 발현 및 생산된 항체를 숙주 세포 내외에서 분리하여, 균일하게 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 항체의 분리 및 정제는 어피니티 크로마토그라피에 의해서 행할수 있다. 이러한 어피니티 크로마토그라피에 사용하는 컬럼으로서는, 프로테인 A 컬럼과 프로테인 G 컬럼을 들 수 있다. 프로테인 A 컬럼에 사용하는 담체로서는, 예를 들면, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. 등이 있다. 그 외에, 통상의 단백질에 사용되고 있는 분리 및 정제 방법을 어떤 한정 없이 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 항체의 분리 및 정제는 상기 어피니티 크로마토그라피 이외에, 크로마토그라피, 여과, 한외 여과, 염석, 투석 등을 적절히 선택 조합시켜서 수행할 수 있다. 크로마토그라피는 예를 들면, 이온 교환 크로마토그라피, 소수 크로마토그라피, 겔여과 등을 들 수 있다. 이러한 크로마토그라피들은 HPLC에 사용할 수 있고, 또한 역상 HPLC를 사용할 수도 있다.
1-9-2. 항체의 농도 측정
상기 2-1에서 얻어진 항체의 농도는 흡광도 측정 또는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)로 측정할 수 있다. 즉, 흡광도 측정을 사용할 경우에는, 본 발명에서 사용하는 항체 또는 항체를 함유하는 샘플은 PBS(-)로 적당히 희석한 후, 280 nm의 흡광도를 측정하고, 1 mg/ml에서 1.35 OD의 흡수 계수를 사용해서 산출한다. 또한, ELISA 방법을 사용할 경우에는, 다음과 같은 방법으로 측정할 수 있다. 즉, pH가 9.6인 0.1 M 중탄산완충액에서 1 ㎍/㎖로 희석시킨 염소 항-인간 IgG(TAGO사 제) 100 ㎕를 96-구멍 플레이트(Nunc 제)에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 동안 배양하여 항체를 고층화한다.
블록킹 후, 적당히 희석시킨 본 발명에서 사용하는 항체, 또는 항체를 함유하는 샘플 각각 100 ㎕ 또는 표준품으로서 인간 IgG(CAPPEL 제) 100 ㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양한다. 세정 후, 5000배 희석한 알카리 포스파타아제-표지 항인간 IgG 항체(BIO SOURCE 제) 100 ㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양한다. 세정 후, 기질 용액을 첨가하여, 배양한 다음, MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad 제)을 사용하여 405 nm에서의 흡광도를 측정하여, 목적하는 항체 농도를 산출한다.
1-10. 항체 이외의 IL-6 안타고니스트
항체 이외의 본 발명에서 사용하는 IL-6 개변체는 IL-6 수용체에 대한 결합 활성을 가지며, IL-6 의 생물학적 활성을 전달하지 않는 물질이다. 즉, IL-6 개변체는, IL-6 수용체에 대해서 IL-6와 경합적으로 결합하지만, IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않기 때문에, IL-6에 의한 시그날 전달을 차단한다.
IL-6 개변체는 IL-6의 아미노산 서열 중에 아미노산 잔기를 치환하여 변이 도입을 통해서 제작된다. IL-6 개변체의 기원으로 되는 IL-6은 그의 유래를 불문하지만, 항원성 등을 고려할 경우, 인간 IL-6가 바람직하다. 구체적으로는, IL-6의 아미노산 서열을 공지의 분자 모델링 프로그램, 예를 들면, WHATIF(Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990), 8, 52 - 56)을 사용하여 그의 2차 구조를 예측하고, 치환된 아미노산 잔기의 전체에 미치는 영향을 평가한다. 적당한 치환 아미노산 잔기를 결정한 후, 인간 IL-6 유전자를 코드하는 염기 서열을 함유하는 벡터를 주형으로 하여, 통상적으로 사용되는 PCR(polymerase chain reaction) 방법에 의해 아미노산이 치환되도록 변이를 도입함으로써, IL-6 개변체를 코드하는 유전자가 얻어진다. 이 것을 필요에 따라서, 적당한 발현벡터에 통합하고, 상기 재조합형 항체의 발현, 생산 및 정제에 따라 IL-6 개변체를 얻을 수 있다. IL-6 개변체의 구체적인 예는 Brakenhoff et al., J.Biol. Chem. (1994) 269, 86 - 93, 및 Savino et al., EMBO J.(1994) 13, 1357 - 1367, 및 WO96-18648과 WO96-17869에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용하는 IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는 각각 IL-6 수용체 또는 IL-6에 대한 결합 활성을 가지고 있으며, 또한 IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않는 물질이다. 즉, IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는 각각 IL-6 수용체 또는 IL-6에 결합하여, 이 것을 포착함으로써 IL-6의 IL-6 수용체으로의 결합을 특이적으로 저해한다. 그 결과, IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않기 때문에, IL-6에 의한 시그날 전달을 차단한다.
IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는 IL-6 또는 IL-6 수용체의 아미노산 서열에서 IL-6와 IL-6 수용체와의 결합에 포함되어 있는 영역의 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 이루고 있는 펩티드이다. 이러한 펩티드는 일반적으로 10 - 80, 바람직하기는 20 - 50, 더욱 바람직하기는 20 - 40개의 아미노산 잔기로 이루어져 있다.
IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는 IL-6 또는 IL-6 수용체의 아미노산 서열에서 IL-6 와 IL-6 수용체와의 결합에 포함되어 있는 영역을 특정화하고, 통상의 방법, 예를 들면, 유전자 공학적 방법 또는 펩티드 합성법을 이용하여 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 제작할 수 있다.
유전자 공학적 방법을 이용하여 IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드를 제조하기 위해서, 목적하는 펩티드를 코드하는 DNA 서열을 발현벡터에 통합시키고, 상기 재조합형 항체의 발현, 생산 및 정제에 따라 펩티드를 얻을 수 있다.
펩티드 합성 방법에 의한 IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드의 제조는 펩티드 합성에서 통상적으로 사용되고 있는 방법, 예를 들면 고상 합성법 또는 액상 합성법을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 속의약품의 개발(續醫藥品의 開發) 제 14권, 펩티드합성, 야지마 하루아끼(矢島治明)감수, 히로까와쇼뗑(廣川書店)(1991)에 개시된 방법을 사용할 수 있다. 고상 합성 방법은, 예를 들면, 합성되는 펩티드의 C-말단에 대응하는 아미노산을 유기용매에 불용성인 지지체에 결합하고, α-아미노기 및 측쇄 관능기를 적당한 보호기로 보호시킨 아미노산을 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 차례로 1 아미노산씩 축합시키는 반응과 수지상에 결합한 아미노산 또는 펩티드의 α-아미노기의 이 보호기를 제거시키는 반응을 교대로 반복함으로써, 펩티드쇄를 연장시키는 방법에 사용된다. 고상 펩티드 합성 방법은 사용되는 보호기의 형태에 따라 Boc법과 Fmoc법으로 나누어진다.
이와 같이해서 목적하는 펩티드를 합성한 후에, 펩티드 사슬을 탈보호 반응을 통해서 지지체로부터 절단시킨다. 펩티드 사슬로부터의 절단을 위해, Boc법에서는 불화수소 또는 트리플루오로메탄 설포네이트를, 또한 Fmoc법에서는 TFA를 일반적으로 사용한다. Boc법에서는, 예를 들면, 상기 펩티드 수지는 아니솔(anisole)의 존재하에 불화수소 중에서 처리한다. 이어서, 보호기를 제거하고, 펩티드를 지지체로부터 절단시켜서 회수한다. 이것을 동결건조해서, 조 펩티드를 얻을 수 있다. 한편으로, Fmoc법에서는, 예를 들면, TFA를 상기와 동일한 방식으로, 펩티드의 탈보호 반응과 지지체로부터 절단 반응을 행할 수 있다.
이와 같이하여 얻어진 조 펩티드를 HPLC에 적용해서 분리, 정제할 수 있다. 펩티드의 용출은 최적 조건하에서 단백질 정제에 통상적으로 사용되는 물-아세토니트릴 용매계 중에서 행할 수 있다. 얻어진 크로마토그라피의 프로필의 피이크에 해당하는 획분을 모아서 동결건조시킨다. 이와 같이 정제한 펩티드 획분을 질량 분광 분석, 아미노산 조성 분석 또는 아미노산 서열 분석 등에 의한 분자량의 분석을 통해서 동정한다.
IL-6 부분 펩티드 및 IL-6 수용체 부분 펩티드의 구체적인 예들은 일본특허공개 제 1990-188600호, 동 제 1995-324097호, 동 제 1996-311098호 및 미국특허 제 5,210,075호에 개시되어 있다.
2. IL-6 안타고니스트 활성의 확인
본 발명에서 사용하는 IL-6 안타고니스트의 활성은 통상적으로 알려진 방법을 사용하여 평가한다. 예를 들면, IL-6 의존성 세포 MH60.BSF2에 IL-6를 첨가하고, IL-6 안타고니스트를 공존시키는 것에 의해 IL-6 의존성 세포로의 3H-티미딘의 혼입을 지표로 하여 평가한다. 또한, IL-6 수용체 발현 세포인 U266에 대하여 125I-표지 IL-6과 과잉량의 비표지 IL-6 을 첨가하고, 동시에 IL-6 안타고니스트를 첨가하여, IL-6 수용체 발현 세포에 결합시킨 125I-표지 IL-6를 측정함으로써 평가를 할 수 있다.
3. 치료 효과의 확인
본 발명에 의해 달성되는 효과를 확인하기 위해, 본 발명에서 사용되는 IL-6 안타고니스트를 항원 투여등으로 T 세포가 감작된 상태의 동물 또는 감작 T 세포를 도입한 동물에 투여하고, 감작 T 세포의 억제효과를 평가함으로써 실행할 수 있다.
동물에 투여되는 감작 항원으로서는, 예를 들면, 결핵균을 이용할 수 있다.
또한, 면역되는 동물로는, 통상의 실험에 이용되는 동물로서, 예를 들면, 마우스, 쥐, 토끼 등을 이용할 수 있다. 평가하는 본 발명의 효과의 확인은 항원을 면역시킨 동물에 동일한 항원을 챌린징(challenging)함으로써 유도된 지연형 염증 반응을 관찰하여서 확인할 수 있다.
후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 항 IL-6 수용체 항체의 투여에 의해, 마우스 지연형 발바닥 부종 반응에서, 지연형 염증 반응의 억제가 확인되었다. 지연형 발바닥 부종 반응에는 감작 T 세포가 관여하는 것으로 알려져 있으므로, 항 IL-6 수용체 항체 등의 IL-6 안타고니스트는 감작 T 세포에 대하여 억제 효과를 갖는 것으로 나타났다.
4. 투여경로 및 제제
본 발명의 감작 T 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제는 비경구적으로, 전신 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 점적 등의 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사를 선택할 수 있고, 환자의 연령과 증상에 따라 적절한 투여 방법을 선택할 수 있다. 유효 투여량은 1회 투여당 체중 1 Kg에 대해 0.01 mg내지 100㎎을 선택할 수 있다. 또는, 바람직하기는 1 내지 1000 mg, 더욱 바람직하기는 5 내지 50 mg의 투여량을 선택할 수 있다.
본 발명의 감작 T 세포 관여 질환의 예방 또는 치료제는, 투여 경로에 따라 약학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가물을 함께 함유할 수도 있다. 이러한 담체 또는 첨가물로서는 물, 약학적으로 허용 가능한 유기 용매, 콜라겐, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리딘, 카복실비닐 폴리머, 카복시메틸셀루로스 나트륨, 폴리아크릴산 나트륨, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카복시메틸 스타치 나트륨, 펙틴, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 크산탄검, 아라비아 고무, 카세인, 젤라틴, 한천, 디글리세린, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 바세린, 파라핀, 스테아릴 알콜, 스테아르산, 인간 혈청 알부민(HSA), 만니톨, 솔비톨, 락토스, 약학적으로 허용가능한 계면활성제 등을 들 수 있다.
사용되는 첨가물은 제형에 따라 상기한 것 적당한 것 또는 이들을 조합한 것을 선택할 수 있으나, 여기에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 예방 또는 치료 대상 질환은 감작 T 세포가 관여하는 질환이다. 구체적으로는 지연성 과민증, 만성 갑상선염, 포도막염, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염 또는 다발성 경화증 등을 들 수 있다. 본 발명의 예방 또는 치료제는 이러한 감작 T 세포가 관여하는 질환의 예방 또는 치료제로서 유용하다.
실시예
이하에서, 실시예, 참고예 및 실험예에 의해서 본 발명을 구체적으로 설명하겠으나, 본 발명은 여기에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1.
지연형 발바닥 반응 억제 작용
프로인드의 완전 보조제에 Mycobacterium butyricum의 건조사균을 2. 5 mg/ml첨가하여 유제를 만든 후에, C57BL/6계 수컷 마우스에 0.2 ml를 피하주사하여 항원감작을 행하였다. 14일 후에, 생리적 식염수에 현탁시킨 10 mg의 Mycobacterium butyricum의 건조사균을 우측 발바닥에 피하주사하여 반응을 야기시켰다. 24시간 후에 좌우 발바닥 중량을 측정하여 중량차를 반응강도의 지표로 사용하였다.
MR16-1 항체는 항원감작과 동시에 1회만 0.125 mg, 0.5 mg 또는 2 mg을 복강내 투여하였다. 대조군에는 이소타입이 동일한 쥐 IgG(KH-5)를, 또한 감작하지 않은 마우스군에는 생리식염수를 같은 방식으로 투여하였다. 그 결과는 도 1에 나타낸 바와 같다.
항원감작일에 1회 MR16-1을 투여함으로써, 지연형 발바닥 부종 반응은 용량 의존적으로 억제되었다.
참고예 1. 인간 가용성 IL-6 수용체의 제조
야마사끼 등의 방법 Science(1988) 241, 825-828의 방법에 따라 얻어진 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA를 함유하는 플라스미드 pBSF2R.236을 사용하여 PCR 방법에 의해서 가용성 IL-6 수용체를 제조하였다. 플라스미드 pBSF2R.236을 제한효소 Sph I로 소화하여 IL-6 수용체 cDNA를 얻고, 이것을 mp18(Amersham 제)에 삽입하였다. IL-6 수용체의 cDNA에 스톱 코돈(stop codon)을 도입하도록 디자인한 합성 올리고프라이머를 사용하여 in vitro 무타젠시스 시스템(Mutagenesis system)(Amersham 제)을 사용하는 PCR 방법으로 IL-6 수용체 cDNA에 변이를 도입하였다. 이 조작에 의해 스톱 코돈이 아미노산 345 위치에 도입되어, 가용성 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA가 얻어졌다.
가용성 IL-6 수용체 cDNA를 CHO세포에서 발현시키기 위해, 플라스미드 pSV(Pharmacia 제)와 연결시켜 플라스미드 pSVL344를 얻었다. dhfr의 cDNA를 함유하는 플라스미드 pECEdhfr에 Hind III-Sal I로 절단한 가용성 IL-6 수용체 cDNA를 삽입하여 CHO 세포 발현 플라스미드 pECEdhfr344를 얻었다.
10 ㎍의 플라스미드 pECEdhfr344를 dhfr-CHO 세포주 DXB-11(Urland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1980) 77, 4216-4220)에 칼슘 포스페이트 침강법(Chen et al., Mol. Cell. Biol. (1987) 7, 2745 - 2751)에 의해 형질전환시켰다. 형질전환된 CHO 세포를 1 mM 글루타민, 10％ 투석 FCS, 100 U/ml의 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 뉴클레오시드를 함유하지 않는 α MEM 선택 배지에서 3주 동안 배양하였다.
선택된 CHO 세포를 한계 희석법으로 스크리닝하여, 단일 CHO 세포 클론을 얻었다. 이 CHO 세포 클론을 20 nM 내지 200 nM 메토트렉세이트(methotrexote)(MTX)로 증폭시켜서 인간 가용성 IL-6 수용체를 생산하는 CHO 세포주 5E27을 얻었다. CHO 세포주 5E27을 5 ％ FBS를 함유하는 이소코프-개변 둘베코 배지(Iscov-modified Dulbecco's medium)(IMDM, Gibco 제)에서, 배양하였다. 배양 상청액을 회수하고, 상기 배양 상청액 중에서 가용성 IL-6 수용체의 농도를 ELISA로 측정하였다.
참고예 2. 인간 항 IL-6 항체의 제조
10 ㎍의 재조합형 IL-6(Hirano et al., Immunol. Lett., 17:41, 1988)을 프로인드의 완전 보조제와 함께 BALB/c 마우스에 면역시키고, 이것을 혈청 중에서 항 IL-6 항체가 검출될 때까지 일주마다 반복하였다. 국부 림프 마디에서 면역세포를 적출하고, 폴리에틸렌 글리콜 1500을 이용하여 골수종 세포주 P3U1와 융합시켰다. 하이브리도마를 HAT 배양액을 이용한 Oi 등의 방법(Selective Methods in Cellular Immunolgy, W. H. Freeman and Co., San Francisco, 351, 1980)의 방법에 따라 선택하여, 인간 항 IL-6 항체를 생산하는 하이브리도마를 수립하였다.
인간 항 IL-6 항체를 생산하는 하이브리도마는 다음과 같이해서 해서 IL-6 결합을 분석했다. 즉, 유연한 폴리비닐로 만든 96 구멍 마이크로티터 플레이트(microtiter plate) Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA사 제)를 0.1 M의 탄산염-탄산수소(carbonate-hydrogen carbonate buffer) 완충액(pH 9.6) 중에서 100 ㎕의 염소 항마우스 Ig(10 ㎕/㎖, Cooper Biochemical, Inc., Malvern, PA 제)에 의해 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 이어서, 상기 플레이트를 1％ 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 PBS로 실온에서 2시간 동안 처리했다.
이것을 PBS로 세정한 후에, 하이브리도마 배양 상청액 100㎕를 각각의 구멍에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 상기 플레이트를 세정하고, 각각의 구멍에 2000 cpm/0.5 ng/well로 되도록 125I-표지 재조합형 IL-6을 첨가하고, 세정후에 각각의 구멍의 방사활성을 감마 계수기(Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA)로 측정하였다. 216개의 하이브리도마 클론 중에서, 32개는 IL-6 결합 에세이에서 양성이었다. 이들 클론중에서 안정한 MH166.BSF2를 최종적으로 얻었다. 상기 하이브리도마에 의해서 생산된 항 IL-6 항체 MH166는 IgGI κ의 서브타입을 갖는다.
이어서, IL-6 의존성 마우스 하이브리도마 클론 MH166.BSF2를 이용하여 MH166에 의한 하이브리도마의 증식에 관한 중화활성을 조사하였다. MH166.BSF2 세포를 1×104/200㎕/well이 되도록 분주하고, 여기에 MH166 항체를 함유하는 샘플을 첨가한 후, 48시간 동안 배양하고, 15.1 Ci/mM의 3H-티미딘(New England Nuclear, Boston, MA)을 첨가한 후, 추가로 6시간 동안 배양을 게속하였다. 세포를 유리 필터 종이 위에 놓고 자동 하베스터(automatic harvester)(Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan)로 처리하였다. 대조로서, 토끼 항 IL-6 항체를 사용하였다.
그 결과, MH166 항체는 IL-6에 의해 유도된 MH166.BSF2 세포의 3H-티미딘의 혼입을 용양 의존적으로 저해하였다. 이것에 의해, MH166 항체는 IL-6의 활성을 중화시키는 것으로 밝혀졌다.
참고예 3. 인간 항 IL-6 수용체 항체의 제조
히라타 등의 방법(J. Immunol., 143, 2900-2906, 1989)에 의해 제조한 항 IL-6 항체 MT18을 CNBr에 의해 활성화시킨 세파로스 4B(Pharmacia Fine Chemicals 제, Piscataway, NJ)를 첨부한 처방에 따라 결합시키고, IL-6 수용체(Science (1988) 241, 825-828)를 정제하였다. 인간 골수종 세포주 U266을 1％ 디기토닌(digitonin)(Wako Chemicals 제), 10 mM 트리에탄올아민(pH 7.8) 및 0.15 M NaCl을 함유하는 1 mM p-파라-아미노페닐 메탄 설포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드(Wako Chemical 제)(디기토닌 완충액)를 가용화해서, 세파로스 4B 비즈(beads)와 결합시킨 MT18 항체와 혼합하였다. 다음에, 비즈를 디기토닌 완충액으로 6회 세정하여 부분적으로 정제된 IL-6 수용체를 제조하였다.
BALB/c 마우스를 3 ×109 U266 세포로 부터 얻은 상기 부분적으로 정제된 IL-6 수용체로 10일 마다 4회씩 면역시키고, 그 후에, 통상적인 방법에 따라 하이브리도마를 제조하였다, 성장 양성 구멍에서 하이브리도마 배양 상청액을 다음에 기재하는 방법에 따라 IL-6 수용체에 대한 결합 활성을 조사하였다. 5×107 개의 U266 세포를 35S-메티오닌(2.5 mCi)으로 표지하고, 상기 디기토닌 완충액으로 가용화시켰다. 가용화된 U266 세포를 0.04 ㎖ 용량의 세파로스 4B 비즈에 결합시킨 MT18 항체와 혼합하고, 그 후에 디기토닌 완충액으로 6회 세정하였다. 0.25 ㎖의 디기토닌 완충액(pH 3.4)에 의해 35S-메티오닌-표지 IL-6 수용체를 유출하고, 0.025 ㎖의 1M 트리스(pH 7.4)로 중화시켰다.
하이브리도마 배양 상청액 0.05 ㎖를 프로테인 G 세파로스(Pharmacia 제) 0.01 ㎖와 혼합하였다. 세정 후에, 세파로즈를 상기한 바와 같이 제조한 35S-표지 IL-6 수용체 용액 0.005㎖과 함께 배양하였다. 면역 침강 물질을 SDS-PAGE 로 분석하여 IL-6과 반응하는 하이브리도마 배양 상청액을 조사하였다. 그 결과, 반응 양성 하이브리도마 클론 PM-1을 수립하였다. 하이브리도마 PM-1에서 생산된 항체는 IgGlκ형의 서브타입을 갖는다.
하이브리도마 PM-1에 의해서 생산되는 항체의 인간 IL-6 수용체에 대한 IL-6 결합저해활성을 인간 골수종 세포주 U266을 사용하여 조사하였다. 인간 재조합형 IL-6을 대장균에 의해 제조하고(Hirano et al., Immunol. Lett., 17:41, 1988), 볼톤-헌터시약(Bolton-Hunter reagent)(New England Nuclear, Boston, MA)을 사용하여 125I로 표지했다(Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967). 4×105개의 U266 세포를 100배 과잉량의 비표지 IL-6의 존재하에, 실온에서, 1시간 동안, 70％(v/v) 하이브리도마 PM-1의 배양 상청액을 14,000 cpm의 125I-표지 IL-6과 함께 배양하였다. 70 ㎕의 샘플을 400 ㎖의 마이크로퓨즈 폴리에틸렌 튜브에 300 ㎕의 FCS 위에 적층하고, 원심 분리 후에, 세포의 방사활성을 측정하였다.
그 결과, 하이브리도마 PM-1에 의해서 생산되는 항체는 IL-6의 IL-6 수용체에 대한 결합을 저해하는 것으로 밝혀졌다.
참고예 4. 마우스 항 IL-6 수용체 항체의 제조
Saito, et al., J. Immunol. (1993) 147, 168-173에 기재된 방법에 따라 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체를 제조하였다. 마우스 가용성 IL-6 수용체를 생산하는 CHO 세포를 10％ FCS를 함유하는 IMDM 배양액으로 배양하고, 이 배양 상청액에서 마우스 가용성 IL-6 수용체 RS12(상기 Saito. et al., 참조)와 Affigel 10 겔(Biorad)에 고정된 어피니티 칼럼을 이용하여 가용성 IL-6 수용체를 정제하였다.
이로부터 얻어진 마우스 가용성 IL-6 수용체(50 ㎍)를 프로인드의 완전 보조제와 혼합하고, 위스타 쥐(Wistar rats)(일본 Charles River)의 복부에 주사하였다. 2주 후에, 프로인드의 불완전 보조제로 추가 면역하였다. 45일째에, 쥐를 도살하고, 그의 비장세포 약 2×108개를 1×107개의 마우스 골수종 세포 P3U1과 50％의 PEG1500(Boehringer Mannheim)을 사용해서 통상의 방법으로 세포융합시킨 후, HAT 배지로 스크리닝 하였다.
상기 배양 상청액을 토끼 항 쥐 IgG 항체(Cappel)로 코팅한 플레이트에 첨가한 후, 마우스 가용성 IL-6 수용체와 반응시켰다. 이어서, 토끼 항 마우스 IL-6 수용체 항체와 알칼리 포스파타아제 표지 양 항 토끼 IgG를 사용하여 마우스 가용성 IL-6 수용체에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 ELISA로 스크리닝하였다. 항체 생산을 확인한 후, 하이브리도마 클론을 2회 서브 스크리닝을 하여 단일 하이브리도마 클론을 얻었다. 이 클론을 MR16-1로 명명하였다.
하이브리도마에 의해서 생산된 항체의 마우스 IL-6의 정보 전달에서의 중화 활성을 MH60.BSF2 세포(Matsuda et al., J. Immunol. (1988) 18, 951-956)를 사용한 3H-티미딘 혼입으로 조사하였다. 96 구멍 플레이트에 MH60.BSF2 세포를 1×104 개/200㎕/well이 되도록 제조하였다. 이 플레이트에 10pg/㎖의 마우스 IL-6와 MR16-1 항체 또는 RS12 항체를 12.3 - 1000 ng/㎖로 첨가하고, 37℃ 및 5％ CO2 에서 44시간 동안 배양한 후, 1μCi/well의 3H-티미딘을 첨가하였다. 4시간 후에, 3H-티미딘의 혼입을 측정하였다. 그 결과, MR16-1 항체는 MH60.BSF2 세포의 3H-티미딘의 혼입을 억제하였다.
따라서, 하이브리도마 MR16-1에 의해서 생산되는 항체는 IL-6의 IL-6 수용체에 대한 결합을 저해하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 의하면, IL-6 수용체 항체 등의 IL-6 안타고니스트는 감작 T 세포의 억제 효과를 갖는 것으로 나타났다. 따라서, IL-6 안타고니스트는 다발성 경화증, 포도막염, 만성 갑상선염, 지연성 과민증, 접촉성 피부염 또는 아토피성 피부염의 치료제로서 유용한 것으로 밝혀졌다.
부다페스트 조약 제 13-2조에 의거하여 기탁된 미생물 기탁 기관에 대한 참고
기탁기관
명칭 : 공업기술원생명공학공업기술연구소
주소 : 일본국, 이바라키껭, 츠쿠바시, 히가시 1쵸메, 1반 3고
미생물(1)
표시 : 래트-마우스 하이브리도마 MR16-1
기탁번호 : FERM BP-5875
기탁일자 : 1997. 3.13
미생물(2)
표시 : HB 101-pIBIBSF2R
기탁번호 : FERM BP-2232
기탁일자 : 1989. 1. 9
미생물(3)
표시 : PM1
기탁번호 : FERM BP-2998
기탁일자 : 1989. 7.12
기탁기관
명칭 : 내쇼날 콜렉션 오브 인더스트리얼 앤드 마린 박테리아
리미티드
주소 : 에이비2, 이라이, 에버딘, 23 스트리트 마차 드리이브
미생물(4)
표시 : 대장균 DH5α-pPM-k3
기탁번호 : NCIMB 40366
기탁일자 : 1991. 2.12
미생물(5)
표시 : 대장균 DH5α-pPM-h1
기탁번호 : NCIMB 40362
기탁일자 : 1991. 2.12

Claims (13)

  1. 인터루킨-6 수용체에 대한 항체 (항 IL-6 수용체 항체)를 유효성분으로서 함유하는 다발성 경화증, 포도막염, 만성 갑상선염, 지연성 과민증, 접촉성 피부염 또는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료제.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료제.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료제.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료제.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료제.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 MR16-1 항체인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료제.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 인간 항체의 정상영역을 가지는 IL-6 수용체에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료제.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 IL-6 수용체에 대한 키메라 항체 또는 인간형화 항체인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료제.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 인간형화 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료제.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
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Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10324639A (ja) 1997-03-21 1998-12-08 Chugai Pharmaceut Co Ltd Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分として含有する感作ｔ細胞関与疾患の予防・治療剤
AU2000279624A1 (en) 2000-10-27 2002-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Blooe vegf level-lowering agent containing il-6 antagonist as the active ingredient
JP4889187B2 (ja) * 2000-10-27 2012-03-07 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分として含有する血中ｍｍｐ−３濃度低下剤
UA80091C2 (en) 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
KR101080021B1 (ko) * 2002-02-14 2011-11-04 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체함유 용액제제
GB2401040A (en) 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
WO2005028514A1 (en) * 2003-09-22 2005-03-31 Biovation Gmbh & Co. Kg. Use of a compound for reducing the biological effectiveness of il-6
US8617550B2 (en) 2003-12-19 2013-12-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Treatment of vasculitis with IL-6 antagonist
AR048210A1 (es) * 2003-12-19 2006-04-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Un agente preventivo para la vasculitis.
US8398980B2 (en) * 2004-03-24 2013-03-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Subtypes of humanized antibody against interleuken-6 receptor
AR048335A1 (es) 2004-03-24 2006-04-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes terapeuticos para trastornos del oido interno que contienen un antagonista de il- 6 como un ingrediente activo
PE20061324A1 (es) 2005-04-29 2007-01-15 Centocor Inc Anticuerpos anti-il-6, composiciones, metodos y usos
JP5191235B2 (ja) 2005-10-21 2013-05-08 中外製薬株式会社 心疾患治療剤
CN101356194B (zh) * 2005-12-09 2013-06-12 Ucb医药有限公司 对人il-6具有特异性的抗体分子
ES2568436T3 (es) 2006-03-31 2016-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procedimiento para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos
CN101495146B (zh) 2006-04-07 2012-10-17 国立大学法人大阪大学 肌肉再生促进剂
WO2008019061A2 (en) 2006-08-03 2008-02-14 Vaccinex, Inc. Anti-il-6 monoclonal antibodies and uses thereof
US8414897B1 (en) * 2006-10-02 2013-04-09 The Uab Research Foundation Pathway for Th-17 cell development and methods utilizing same
JP2010095445A (ja) * 2006-12-27 2010-04-30 Tokyo Medical & Dental Univ Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分とする炎症性筋疾患治療剤
MX2009007830A (es) 2007-01-23 2009-10-07 Univ Shinshu Inhibidor de rechazo cronico.
US8178101B2 (en) * 2007-05-21 2012-05-15 Alderbio Holdings Inc. Use of anti-IL-6 antibodies having specific binding properties to treat cachexia
US8404235B2 (en) 2007-05-21 2013-03-26 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
US8062864B2 (en) 2007-05-21 2011-11-22 Alderbio Holdings Llc Nucleic acids encoding antibodies to IL-6, and recombinant production of anti-IL-6 antibodies
US20090238825A1 (en) * 2007-05-21 2009-09-24 Kovacevich Brian R Novel rabbit antibody humanization methods and humanized rabbit antibodies
EP2162469A4 (en) * 2007-05-21 2012-08-01 Alderbio Holdings Llc NEW METHODS OF HUMANIZING RABBIT ANTIBODIES AND HUMANIZED RABBIT ANTIBODIES
US7906117B2 (en) 2007-05-21 2011-03-15 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat cachexia, weakness, fatigue, and/or fever
HUE043782T2 (hu) 2007-05-21 2019-09-30 Alderbio Holdings Llc IL-6 elleni antitestek és alkalmazásuk
US8252286B2 (en) 2007-05-21 2012-08-28 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
US9701747B2 (en) 2007-05-21 2017-07-11 Alderbio Holdings Llc Method of improving patient survivability and quality of life by anti-IL-6 antibody administration
WO2009014263A1 (ja) * 2007-07-26 2009-01-29 Osaka University インターロイキン６受容体阻害剤を有効成分とする眼炎症疾患治療剤
EP3689912A1 (en) 2007-09-26 2020-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
SG10201605394SA (en) 2007-09-26 2016-08-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified Antibody Constant Region
PE20091174A1 (es) * 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
EP4238993A3 (en) 2008-04-11 2023-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
EP2297202B1 (en) 2008-05-13 2016-01-13 NovImmune SA Anti-il-6/il-6r antibodies and methods of use thereof
CN102256623A (zh) 2008-06-05 2011-11-23 独立行政法人国立癌症研究中心 神经浸润抑制剂
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
US8992920B2 (en) 2008-11-25 2015-03-31 Alderbio Holdings Llc Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis
US8337847B2 (en) 2008-11-25 2012-12-25 Alderbio Holdings Llc Methods of treating anemia using anti-IL-6 antibodies
US8420089B2 (en) 2008-11-25 2013-04-16 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP
US8323649B2 (en) 2008-11-25 2012-12-04 Alderbio Holdings Llc Antibodies to IL-6 and use thereof
US9212223B2 (en) 2008-11-25 2015-12-15 Alderbio Holdings Llc Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis
US9452227B2 (en) * 2008-11-25 2016-09-27 Alderbio Holdings Llc Methods of treating or diagnosing conditions associated with elevated IL-6 using anti-IL-6 antibodies or fragments
BR112012009828B8 (pt) 2009-10-26 2022-10-25 Hoffmann La Roche Método para a produção de uma imunoglobulina glicosilada e seu uso
US9775921B2 (en) 2009-11-24 2017-10-03 Alderbio Holdings Llc Subcutaneously administrable composition containing anti-IL-6 antibody
WO2011066374A2 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antagonists of il-6 to prevent or treat cachexia, weakness, fatigue, and/or fever
JP5904552B2 (ja) 2010-05-28 2016-04-13 国立研究開発法人国立がん研究センター 膵癌治療剤
DK2578231T3 (da) 2010-05-28 2022-12-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antitumor-t-celle-reaktionsforstærker
KR101372721B1 (ko) 2010-06-18 2014-03-14 이화여자대학교 산학협력단 Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ―６ 억제 작용을 갖는 신규한 벤즈옥사졸 유도체, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 약학적 조성물
MX2013005024A (es) 2010-11-08 2013-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-il-6 receptor administrado subcutaneamente.
ES2847891T3 (es) 2010-11-23 2021-08-04 Vitaeris Inc Anticuerpos anti-IL-6 para el tratamiento de la mucositis oral
SG190727A1 (en) 2010-11-30 2013-07-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
JP4987117B2 (ja) * 2010-12-27 2012-07-25 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分として含有する血中ｍｍｐ−３濃度低下剤
CN104349787B (zh) 2012-05-21 2019-02-15 韩国生命工学研究院 含有荔枝草提取物或其馏分作为活性成分的预防或治疗stat-3介导疾病的药物组合物
WO2014200018A1 (ja) * 2013-06-11 2014-12-18 独立行政法人 国立精神・神経医療研究センター 再発寛解型多発性硬化症（ｒｒｍｓ）患者の治療予後予測方法、及び新規治療適応判断方法
JP6563910B2 (ja) 2013-07-04 2019-08-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 血清サンプル中の抗薬物抗体を検出するための干渉抑制イムノアッセイ
TW202339800A (zh) 2015-02-27 2023-10-16 日商中外製藥股份有限公司 Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途
US10697883B2 (en) 2015-05-19 2020-06-30 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for determining application of therapy to multiple sclerosis (MS) patient
JP7128460B2 (ja) 2015-06-04 2022-08-31 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６阻害剤を有効成分とする精神疾患治療剤
WO2017147169A1 (en) 2016-02-22 2017-08-31 Ohio State Innovation Foundation Chemoprevention using controlled-release formulations of anti-interleukin 6 agents, synthetic vitamin a analogues or metabolites, and estradiol metabolites
US11033496B2 (en) 2017-03-17 2021-06-15 The Regents Of The University Of Michigan Nanoparticles for delivery of chemopreventive agents
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
US11692037B2 (en) 2017-10-20 2023-07-04 Hyogo College Of Medicine Anti-IL-6 receptor antibody-containing medicinal composition for preventing post-surgical adhesion
WO2019175332A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Imba - Institut Für Molekulare Biotechnologie Gmbh Bh4 pathway inhibition and use thereof for treating t-cell mediated autoimmune diseases or hypersensitivity
EP3947737A2 (en) 2019-04-02 2022-02-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US521628A (en) 1894-06-19 Housekeeping-cabinet
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
CA1341152C (en) 1988-01-22 2000-12-12 Tadamitsu Kishimoto Receptor protein for human b cell stimulatory factor-2
US5670373A (en) 1988-01-22 1997-09-23 Kishimoto; Tadamitsu Antibody to human interleukin-6 receptor
US6428979B1 (en) 1988-01-22 2002-08-06 Tadamitsu Kishimoto Receptor protein for human B cell stimulatory factor-2
DK603988D0 (da) 1988-10-28 1988-10-28 Klaus Bendtzen Farmaceutisk praeparat
US5216128A (en) 1989-06-01 1993-06-01 Yeda Research And Development Co., Ltd. IFN-β2/IL-6 receptor its preparation and pharmaceutical compositions containing it
JP2898064B2 (ja) 1989-08-03 1999-05-31 忠三 岸本 ヒトｇｐ１３０蛋白質
PH27357A (en) 1989-09-22 1993-06-21 Fujisawa Pharmaceutical Co Pyrazole derivatives and pharmaceutical compositions comprising the same
DE3939706C1 (ko) 1989-12-01 1991-03-21 Centre Regional De Transfusion Sanguine, Besancon, Fr
US5210075A (en) * 1990-02-16 1993-05-11 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Interleukin 6 antagonist peptides
JP2930362B2 (ja) * 1990-04-09 1999-08-03 東ソー株式会社 感作ｔ細胞関与疾患の治療剤
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
JPH04169538A (ja) 1990-11-01 1992-06-17 Chuzo Kishimoto インターロイキン―６作用抑制剤
JP3047926B2 (ja) 1991-01-28 2000-06-05 忠三 岸本 マウスインターロイキン−６レセプターに対する抗体及びその使用
WO1992019759A1 (en) 1991-04-25 1992-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
WO1992021367A1 (en) 1991-05-31 1992-12-10 Arthur Allen Vandenbark T cell receptor peptides as therapeutics for immune-related disease
US5605930A (en) 1991-10-21 1997-02-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Compositions and methods for treating and preventing pathologies including cancer
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JPH05304986A (ja) * 1992-04-28 1993-11-19 Tosoh Corp ｇｐ１３０蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体
CA2140638C (en) 1992-07-24 2010-05-04 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
FR2694767B1 (fr) 1992-08-13 1994-10-21 Innotherapie Lab Sa Anticorps monoclonaux anti-IL6R, et leurs applications.
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
US6045796A (en) 1992-12-17 2000-04-04 Anergen, Inc. Vaccination with peptide of MHC class II molecules for treatment of autoimmune disease
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
IT1261787B (it) 1993-06-23 1996-06-03 Angeletti P Ist Richerche Bio Metodologia per la selezione di superagonisti, antagonisti e super- antagonisti di ormoni del cui complesso recettoriale fa parte gp 130.
WO1996011020A1 (fr) * 1994-10-07 1996-04-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Medicament contre la polyarthrite rhumatoide contenant un antagoniste d'interleukine 6 comme principe actif
US5888510A (en) 1993-07-21 1999-03-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
WO1995009873A1 (en) 1993-10-06 1995-04-13 Board Of Regents, The University Of Texas System A monoclonal anti-human il-6 receptor antibody
US5470952A (en) 1993-10-20 1995-11-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. CNTF and IL-6 antagonists
WO1995027499A1 (en) 1994-04-08 1995-10-19 Brigham And Women's Hospital Treatment of autoimmune disease using oral tolerization and/or type i interferon
JPH07324097A (ja) 1994-05-30 1995-12-12 Daicel Chem Ind Ltd インターロイキン６拮抗剤、及びペプチド類または医薬として許容されるその塩類
US8017121B2 (en) 1994-06-30 2011-09-13 Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
EP0770628B9 (en) 1994-07-13 2007-02-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin-8
US5948820A (en) 1994-08-22 1999-09-07 Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. Benzene compound and pharmaceutical use thereof
PT778263E (pt) 1994-08-22 2002-06-28 Mitsubishi Pharma Corp Composto de benzeno e sua utilizacao farmaceutica
JP3630453B2 (ja) 1994-09-30 2005-03-16 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６レセプター抗体を有効成分とする未熟型骨髄腫細胞治療剤
WO1996012503A1 (fr) 1994-10-21 1996-05-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remede contre des maladies provoquees par la production d'il-6
IT1274350B (it) 1994-12-06 1997-07-17 Angeletti P Ist Richerche Bio Antagonisti di interleuchina-6(il-6) che consistono di forme solubili del ricettore alfa di il-6, mutate nell'interfaccia che si lega a gp 130
IT1274782B (it) 1994-12-14 1997-07-24 Angeletti P Ist Richerche Bio Metodo per selezionare superagonisti, antagonisti e superantagonisti di ormoni del cui complesso recettoriale fa parte gp 130
DE69525971T3 (de) 1994-12-29 2013-01-10 Chugai Seiyaku K.K. Verwendung eines pm-1 antikörpers oder eines mh 166 antikörpers zur verstärkung des anti-tumor-effektes von cisplatin oder carboplatin
ES2264135T3 (es) 1995-02-13 2006-12-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Inhibidor de la descomposicion de proteinas musculares que contienen anticuerpos frente al receptor de il-6.
EP0817794A1 (en) 1995-03-31 1998-01-14 Jakob Bohr Method for protein folding
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
IT1276555B1 (it) 1995-04-28 1997-11-03 Angeletti P Ist Richerche Bio Antagonisti di interluchina-6 umana del tutto incapaci di formare un legame con gp 130, e loro uso per la preparazione di composizioni
US5571513A (en) 1995-05-31 1996-11-05 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Anti-gp130 monoclonal antibodies
WO1997024340A1 (en) * 1995-12-27 1997-07-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Oxazole derivatives, their production and use
PT923941E (pt) 1996-06-27 2006-09-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Medicamentos para mieloma a serem utilizados com agentes antitumorais de mostarda nitrogenada
JPH10324639A (ja) 1997-03-21 1998-12-08 Chugai Pharmaceut Co Ltd Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分として含有する感作ｔ細胞関与疾患の予防・治療剤
US20020187150A1 (en) 1997-08-15 2002-12-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventive and/or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus comprising anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient
EP1074268B1 (en) 1998-03-17 2008-01-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventives or remedies for inflammatory intestinal diseases containing il-6 receptor antagonist antibodies
US6537782B1 (en) 1998-06-01 2003-03-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Media for culturing animal cells and process for producing protein by using the same
US6406909B1 (en) 1998-07-10 2002-06-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Serum-free medium for culturing animal cells
CA2341239C (en) 1998-08-24 2011-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A preventive or therapeutic agent for pancreatitis comprising il-6 antagonist as an active ingredient
WO2002013859A1 (fr) 2000-08-10 2002-02-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methode permettant d'inhiber la coagulation ou la turbidite d'une solution contenant des anticorps
PT1314437E (pt) 2000-08-11 2014-08-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Preparações estabilizadas contendo anticorpo
US8703126B2 (en) 2000-10-12 2014-04-22 Genentech, Inc. Reduced-viscosity concentrated protein formulations
IL155002A0 (en) 2000-10-12 2003-10-31 Genentech Inc Reduced-viscosity concentrated protein formulations
KR100824824B1 (ko) 2000-10-25 2008-04-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 아이엘-6 안타고니스트를 유효 성분으로서 함유하는건선의 예방 또는 치료제
JP4889187B2 (ja) 2000-10-27 2012-03-07 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分として含有する血中ｍｍｐ−３濃度低下剤
AU2000279624A1 (en) 2000-10-27 2002-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Blooe vegf level-lowering agent containing il-6 antagonist as the active ingredient
US7332289B2 (en) 2001-03-09 2008-02-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of purifying protein
UA80091C2 (en) 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
KR101080021B1 (ko) 2002-02-14 2011-11-04 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체함유 용액제제
JP3822137B2 (ja) 2002-05-20 2006-09-13 中外製薬株式会社 動物細胞培養用培地の添加剤およびそれを用いたタンパク質の製造方法
ES2626268T3 (es) 2002-09-11 2017-07-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método de purificación de proteínas
DE10255508A1 (de) 2002-11-27 2004-06-17 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Kultivierung von Zellen zur Produktion von Substanzen
NZ541928A (en) 2003-02-24 2009-06-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedy for spinal injury containing interleukin-6 antagonist
RU2332986C2 (ru) 2003-04-04 2008-09-10 Дженентек, Инк. Высококонцентрированные композиции антител и белков
US20050158303A1 (en) 2003-04-04 2005-07-21 Genentech, Inc. Methods of treating IgE-mediated disorders comprising the administration of high concentration anti-IgE antibody formulations
GB2401040A (en) 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
BRPI0415505A (pt) 2003-10-17 2006-12-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd agente terapêutico para mesotelioma
US8617550B2 (en) 2003-12-19 2013-12-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Treatment of vasculitis with IL-6 antagonist
AR048210A1 (es) 2003-12-19 2006-04-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Un agente preventivo para la vasculitis.
US8398980B2 (en) 2004-03-24 2013-03-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Subtypes of humanized antibody against interleuken-6 receptor
AR048335A1 (es) 2004-03-24 2006-04-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes terapeuticos para trastornos del oido interno que contienen un antagonista de il- 6 como un ingrediente activo
EP1835022B1 (en) 2005-01-05 2015-02-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell culture method and utilization of the same
CA2625773C (en) 2005-10-14 2015-05-12 Fukuoka University Inhibition of interleukin-6 (il-6) receptor promotes pancreatic islet transplantation
JP5191235B2 (ja) 2005-10-21 2013-05-08 中外製薬株式会社 心疾患治療剤
AR057582A1 (es) 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
AR057941A1 (es) 2005-11-25 2007-12-26 Univ Keio Agentes terapeuticos para el cancer de prostata
EP1977763A4 (en) 2005-12-28 2010-06-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd STABILIZER PREPARATION CONTAINING ANTIBODIES
AR059213A1 (es) 2006-01-27 2008-03-19 Univ Keio Agentes terapeuticos para enfermedades que involucran neovascularizacion coroidal
US20090061466A1 (en) 2006-03-09 2009-03-05 Wolfgang Hoesel Anti-drug antibody assay
CN101495146B (zh) 2006-04-07 2012-10-17 国立大学法人大阪大学 肌肉再生促进剂
WO2008016134A1 (fr) 2006-08-04 2008-02-07 Norihiro Nishimoto PROCÉDÉ POUR PRÉDIRE LE PRONOSTIC DES PATIENTS ATTEINTS DE POLYARTHRITE rhumatoïde
JP2010095445A (ja) 2006-12-27 2010-04-30 Tokyo Medical & Dental Univ Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分とする炎症性筋疾患治療剤
MX2009007830A (es) 2007-01-23 2009-10-07 Univ Shinshu Inhibidor de rechazo cronico.
WO2009014263A1 (ja) 2007-07-26 2009-01-29 Osaka University インターロイキン６受容体阻害剤を有効成分とする眼炎症疾患治療剤
CN101939425B (zh) 2007-09-26 2014-05-14 中外制药株式会社 抗il-6受体抗体
CA2701155C (en) 2007-10-02 2016-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic agents for graft-versus-host disease comprising interleukin 6 receptor inhibitor as active ingredient
JP2009092508A (ja) 2007-10-09 2009-04-30 Norihiro Nishimoto リウマチ治療剤の効果の予測方法
CN103399145B (zh) 2007-12-15 2015-06-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 区分测定
PE20091174A1 (es) 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
CN102256623A (zh) 2008-06-05 2011-11-23 独立行政法人国立癌症研究中心 神经浸润抑制剂
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
NZ598127A (en) 2009-07-31 2014-03-28 Shin Maeda Cancer metastasis inhibitor
BR112012009828B8 (pt) 2009-10-26 2022-10-25 Hoffmann La Roche Método para a produção de uma imunoglobulina glicosilada e seu uso
WO2011128096A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Roche Diagnostics Gmbh Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment
DK2578231T3 (da) 2010-05-28 2022-12-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antitumor-t-celle-reaktionsforstærker
JP5904552B2 (ja) 2010-05-28 2016-04-13 国立研究開発法人国立がん研究センター 膵癌治療剤
JP2013529089A (ja) 2010-06-07 2013-07-18 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー インターロイキン−６受容体を阻害するモノクローナル抗体による薬剤治療に対する応答を予測するための遺伝子発現マーカー
MX2013005024A (es) 2010-11-08 2013-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-il-6 receptor administrado subcutaneamente.
SG11201400260TA (en) 2011-09-01 2014-03-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for preparing a composition comprising highly concentrated antibodies by ultrafiltration

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cancer Res., 1993, Vol.53, pp851-856.
J. Invest. Dermatol., 1993, Vol. 3, pp299-304.
J. Rheumatol., 1993, Vol. 20, pp259-262.

Also Published As

Publication number Publication date
EP2322216A1 (en) 2011-05-18
ES2312184T3 (es) 2009-02-16
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AU736282B2 (en) 2001-07-26
US20170022278A1 (en) 2017-01-26
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JPH10324639A (ja) 1998-12-08
WO1998042377A1 (en) 1998-10-01
CA2284271C (en) 2012-05-08
EP0983767B1 (en) 2008-09-10
US9017677B2 (en) 2015-04-28
ATE407696T1 (de) 2008-09-15
ATE547119T1 (de) 2012-03-15
EP2011514A1 (en) 2009-01-07
CA2284271A1 (en) 1998-10-01
EP0983767A1 (en) 2000-03-08
EP2011514B1 (en) 2012-02-29
KR20010005602A (ko) 2001-01-15
ES2382488T3 (es) 2012-06-08
AU6420798A (en) 1998-10-20
US20060134113A1 (en) 2006-06-22

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