HU204565B - Process for the synthesis of hybride dns of ripe insuline-like growth factor - Google Patents
Process for the synthesis of hybride dns of ripe insuline-like growth factor Download PDFInfo
- Publication number
- HU204565B HU204565B HU841572A HU157284A HU204565B HU 204565 B HU204565 B HU 204565B HU 841572 A HU841572 A HU 841572A HU 157284 A HU157284 A HU 157284A HU 204565 B HU204565 B HU 204565B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- igf
- yeast
- host
- gene
- dna
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 21
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 title claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 36
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 25
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 claims description 20
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 claims description 15
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 14
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 6
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 2
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- OBTCMSPFOITUIJ-FSPLSTOPSA-N Val-Asp Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O OBTCMSPFOITUIJ-FSPLSTOPSA-N 0.000 claims 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims 1
- 101150118163 h gene Proteins 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 abstract description 76
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 abstract description 68
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 abstract description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 abstract 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 12
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101100163849 Arabidopsis thaliana ARS1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010026624 GTCGAC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 101710190529 Insulin-like peptide Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101100059658 Mus musculus Cetn4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037591 Neuroserpin Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100024819 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 101100097319 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ala1 gene Proteins 0.000 description 1
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 108091061763 Triple-stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 208000002925 dental caries Diseases 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 108010080874 neuroserpin Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- -1 pH 7.8 Chemical compound 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 210000005152 placental membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás érett inzulínszerir növekedési hormonokat meghatározó hibrid DNS szintézisére.
Felteszik, hogy a növekedési hormon in vivő adagolását követő szomatikus (testi) növekedés olyan mitogén, inzulinszeru peptidcsalád szabályozása révén jön létre, amelyek szérumkoncentrációja növekedési hormon függő. Ezek a polipeptidek például a szomatomedin-C, szomatomedin-A és az I és H inzulinszeru növekedési faktorok (IGF I és IGF Π). Az IGF I és IGF H a humán szérűmből izolálható, aminosavszekvenciájuk nagymértékben homológ az inzulinéval. Jelenleg csak korlátozott mennyiségben nyerhetők a humán szérumból ezek a növekedési faktorok. Ezért nagy tudományos és klinikai érdek fűződik ahhoz, hogy rekombináns DNS-technikákkal viszonylag nagy mennyiségűnövekedési faktorokat állíthassunk elő.
Az I és H humán inzulinszerű növekedési faktorok (IGF I és H) aminosavszekvenciáját elsőként Rinderknecht és Humbel határozta meg [J. Bioi. Chem., 253, 2Ί69-2Τ16. (1978)]; továbbá Rinderknecht és Humbel, 1 FEBS Letters, 89,283-286. (1978). AzIGF-receptorok tulajdonságait Massague és Czech tárgyalják [J. Bioi. Chem., 257, 5038-5045. (1982)]. Kurjan és Herskowitz [Cell, 30,933-934. (1982)] egy olyan feltételezett α-faktoiprekurzort írnak le, amely az érett α-faktor (az í élesztő által természetes úton kiválasztott fehérje) négy tandem másolatát tartalmazza, leírják a szekvenciát is, és feltehető keletkezési mechanizmusát. Kurjan és Herskowitz (Abstracts of Papers, Cold Spring Harbor Meeting on The Molecular Biology of Yeast, 242. 2 oldal, „A Putative AIpha-Factor Precursor Containing Four Tandem Repeats of Mature Alpha-Factor”) leírják az α-faktort meghatározó és két ilyen szakasz között elhelyezkedő nukleotid szekvenciáját.
A találmány olyan módszerekre és készítményekre 3 vonatkozik, amelyekkel hatékonyan állíthatjuk elő az érett humán inzulinszerű növekedési faktort (IGF). Részletesebben, a pre-IGF I és a pre-IGF H kifejezés éleszőgazdasejtben a polipeptidek tápközegbe való szekretálődásával jár együtt. Az eljárás során különbő- 4i ző forrásból származó, természetes és szintetikus eredetű DNS-szekvenciákat összekapcsolva DNS-moIekulákat hozunk létre. Az előállított DNS-molekulák élsztosejtekben stabilan replikáidnak, és hatékonyan, nagy koncentrációban termelik a prepolípeptídeket, 4í amelyek a tápközegből jó kitermeléssel Izolálhatok.
A találmány olyan DNS-szekvenciák előállítására vonatkozik, amelyek humán, inzulinszerű növekedési faktorok (IGF I és H) kifejezésére képesek. Ezeket a dezoxiribonukleinsav-szekvencíákat vektorokba épít- 5C hetjűk be, és a kapott plazmidokkal a megfelelő gazdasejteket transzformáljuk. A megfelelő gazdasejtek ilyen rekombináns plazmidokkal történő transzformációja az inzulinszerű növekedési faktor génjének kifejeződését eredményezi, és a polipeptidtermék termelését. Részle- 55 tezve, a találmány tárgya eljárás prekurzor polipeptidek (pre-IGF lés pre-IGF Π) termelését meghatározó új DNS-szekvenciák kifejezésére olyan élesztőgazdasejtben, amely képes szintetizálni a fenti prekurzor polipeptideket, és az érett polipeptidterméket a tápkő- 60 zegbe szekretálja. A DNS-molekula hordoz egy replikációs rendszert, amely a DNS-t képes stabilan fenntartani élesztőgazdasejtben, tartalmaz továbbá egy hatékony promotort, egy struktúrgént, ideértve az ezzel azonos leolvasási fázisban lévő vezér- és processzorszignálokat, tartalmaz továbbá a struktúrgéntől 3’ irányban egy transzkripciós terminátorszekvenciáL Adott esetben a transzkripció szabályozására, a gén sokszorosítására, és a transzkripció exogén szabályozására más szekvenciákat is beépíthetünk.
A pre-IGF I és a pre-IGF H kifejezés azt jelenti, hogy az érett polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát leolvasási fázisban kapcsoltuk hozzá a vezérszekvenciához és a processzorszignálokhoz, amelyeket hatéko15 nyan felismer az élesztőgazdasejt. így a pre szócska azt jelzi, hogy az élesztősejt szekréciós és processzorszignáljai jelen vannak, de nem jelenti azt, hogy a szóban forgó polipeptidet kódoló gén bármely processzorszignálja jelen van.
A DNS-készítmény előállításakor lényeges, hogy a replikáciős rendszert, promotort, a vezér- és proceszszorszignálokat hordozó struktúrgént és a terminátort előre meghatározott sorrendben kapcsoljuk, azért, hogy a kapott plazmidban megfelelően funkcionálja25 nak. Ahogy azt a későbbiekben megadjuk, a szekvenciák megfelelő orientációját és sorrendjét adaptormolekulák használatával alakíthatjuk ki. A felhasznált IGF I és IGF H gének lehetnek kromoszomális DNS-ek, cDNS-molekulák, szintetikus DNS-ek vagy ezek komΌ binációi. A vezér- és proeesszorszignálokat az élesztőben levő természetesen előforduló DNS-szekvenciákból izoláljuk, ezek biztosítják egy polipeptid szekretálódását. Az élesztő által természetesen szekretált polipeptidek közül megemlítjük az α-faktort, a-faktort, savas foszfatázt stb.
A konstrukciót felépítő további szekvenciák a replikációs rendszer, promotor és tenninátor jól ismertek, az irodalomban megadottak.
Mivel a találmány szerinti DNS-molekula összeál0 Iításakor különböző DNS-szekvenciákat használunk, amelyek különböző forrásból származnak, kényelmi okokból összekötő vagy adaptermolekulákat használunk. Részletesebben szólva, az adaptermolekulákat előnyösen használhatjuk a vezér és processzor szígi nálszekvenciákat hordozó kódolószál 3’-végének kapcsolására az IGF-kódoIószál 5’-végéhez, a kapcsolást a megfe-lelő kiegészítő DNS-szálakkal együtt végezzük. A vezér- és processzorszignálokat hordozó szekvenciát közel, ennek 3'-végéhez hasíthatjuk úgy, ) hogy kódolórégiőjából előre meghatározott számú bázispár kiessen. Ezután adaptermolekula állítható elő úgy, hogy ha a vezér és processzor szignálszekvenciát áz IGF-kődolószekvenciához kapcsoljuk, a hiányzó bázispárok beépülnek, és a vezérszekvenciái hoz képest az IGF-kódolőszál megfelelő leolvasási fázisban, helyezkedik el, A szintetikus IGF-kődolószekvencia és/vagy az adaptermolekula 3’-végén transzlációs stopkodonokat hordoz, ily módon elérjük, hogy a polipeptid C-terminális vége azonos legyen a természetes polipeptid C-terminálisával.
HU 204565 Β
Az adaptermolekula 5-40 bázisból állhat, általában 8-35 bázisból, a kódolószekvenciában helyezkedik el, és kohéziv vagy tompa végű lehet. Előnyös, ha az adaptermolekula végei tapadós (kohéziv) végűek, mivel így az adapter szelektíve kapcsolódik a különböző restrikciós enzimekkel kapott két különböző DNSszekvenciához, amelyek a megfelelő komplementer kohéziv végekkel rendelkeznek.
A találmányt az élesztő α-faktorának vezér- és processzorszignáljaihoz kapcsolt IGF I és IGF H polipeptideket kódoló szintetikus fragmenssel szemléltetjük. Az élesztő α-faktora Hindin és Sáli restrikciós endonukleázokkal hasítható ki. A HindlH hasítja az a-faktor prekurzorának processzorszignálját, hasítja a 3’-véget a kódolószál Glu-kodonjának második bázisáig, ugyanakkor a HindlH felismerő szekvencia teljessé teszi a Glu-kodont, kódolja az alanint, és létrehozza az első 5’-bázist az érett α-faktor aminoterminális trp-kodonjában. Az α-faktor génjének átírási irányához képest a Sáli hely a transzkripciós terminátortól 5’ irányban helyezkedik el.
Az IGF-polipeptidet kódoló szintetikus gén nukleotidszekvenciáját az IGF I és IGF Π polipeptidek ismert aminosavszekvenciája határozza meg. A szintetikus szekvenciát előnyösen úgy tervezzük, hogy abban az élesztőgazdasejt által szívesen használt kodonok legyenek, például az élesztő glikolitikus enzimjeinek kodonfelhasználási frekvenciájára alapozunk. A szintetikus szekvencia előnyösen nem tompa, hanem kohéziv végeket tartalmaz abból a célból, hogy egy klónozó vektor megfelelő restrikciós helyébe beépíthessük. Ezenkívül a szintetikus szekvenciákba restrikciós helyeket építhetünk be néma mutációkat használva, így olyan fragmensek keletkezhetnek, amelyeket beépítve hibrid IGF I vagy IGF II peptidmolekulák keletkezhetnek.
A példákban megadott eljárás során a szintetikus fragmenseket EcoRI kohéziv végekkel látjuk el, és a pBR328 plazmid EcoRI helyére építjük be. A szintetikus szekvencia általában a polipeptidet meghatározó régió mindkét végének közelében további restrikciós helyeket is tartalmaz. Ezeket a belső restrikciós helyeket úgy választjuk meg, hogy a klónozó vektorból pontosan kihasíthassuk a kódolószekvenciát, és úgy köthessük be az adaptermolekulát, hogy a végső DNSmolekula tartalmazza a vezér- és processzorszignálokat, és a kódolórégiót egymáshoz képest megfelelő leolvasási fázisban és megfelelő távolságra egy transzkripciós terminátortól. Előnyös, ha a restrikciós hely felismerőszekvenciája távolabbra esik a hasítási helytől, ebben az esetben a hasítás a kódolórégiótól 3’ irányba esik, és a felismerési hely eltűnik. Ez lehetővé teszi a kódolószál mindkét végén a pontos hasítást, a nukleotidszekvenciától függetlenül. A példákban Hgal helyeket ismertetünk.
A szintetikus gén előállítására ismert technikákkal átfedő egyszálú dezoxiribonukleinsav (ssDNS) fragmenseket állítunk elő. Ezek az ssDNS-fragmensek általában 10-40 bázis hosszúak. Bár jelentősen hosszabb fragmenseket is használhatunk, a szintézis hozama ekkor csökken, és nehéz megjósolni, hogy a megfelelő szekvencia degradálódik-e vagy megváltozik. Miután előállítottuk az ssDNS-fragmenseket, összekapcsoljuk azokat olyan kapcsolási reakciókörülmények között, ahol a komplementer bázisok párosodása megfelelő sorrendben következik be. A fragmensek végeit ezután ligáljuk, és a kapott szintetikus DNS-fragmenst klónozzuk és sokszorosítjuk, általában E.coli baktériumgazdasejtben. Ahogy előzőleg jeleztük, a szintetikus struktúrgént az adott klónozó vektor megfelelő restrikciós helyével komplementer kohéziv végekkel látjuk el, és egy olyan belső felismerési hellyel, amely a kódolószakasz pontos kimetszését lehetővé teszi. A szintetikus szekvenciák klónozása és sokszorosítása után megfelelő mennyiségű terméket kihasítunk, általában az IGF-kódolórégió egyik végénél elhelyezkedő belső restrikciós helyet használva.
A használt promotor kényelmi okokból a vezér- és processzorszekvenciákhoz kötött promotor lehet. Ilyen módon előállíthatunk egy olyan 5’ eredetű szekvenciát, amely tartalmazza a promotort is és a vezérszekvenciát, mégpedig egymáshoz képest olyan kapcsolatban, hogy hatékony transzkripció legyen várható. Transzkripciós terminátor beépítésével ezután egy olyan „kazettát” állítunk elő, amely hordozza a promotor/vezérszekvencia restrikciós hely (helyek), terminátorszekvenciákat, és ahová adaptermolekulák segítségével beépíthetjük az IGF-polipeptidet meghatározó kódolószakaszt. Uyen kazettákat általában úgy állíthatunk elő, hogy izolálunk egy érintetlen élesztőgént és 3’, illetve 5’ irányban a gén transzkripciós szabályozószekvenciáit hordozó dezoxiribonukleinsav-fragmenst, ez a gén kifejezi és szekretálja az adott polipeptidet.
Eljárhatunk oly módon is, hogy a természetesen előforduló élesztőpromotort transzkripciós szabályozást megengedő más promotorokkal helyettesítjük. Ebben az esetben a vezérszekvenciától 5’ irányban eső régiót szekvenálnunk kell és/vagy meg kell állapítanunk restrikciós térképét. Némely esetben kívánatos lehet az, hogy megtartva a természetes élesztőpromotort, amellé 3’ vagy 5’ irányban egy másik promotort építsünk be.
Élesztőgénekből több különböző promotort izolálhatunk. Különösen előnyösek azok a promotorok, amelyek a glükolízis folyamatának enzimeivel kapcsolatosak, ilyen promotorok az alkohol- dehidrogenáz, a glicerin-aldehid-3-foszfát-dehidrogenáz, piruvát-kináz, trióz-foszfát-izomeráz, foszfoglüko-izomeráz, foszfofrukto-kináz stb. promotor. Ezeket a promotorokat regulálószekvenciákkal, például erősítőkkel, operátorokkal stb. együtt használva, ép regulálórendszerrel rendelkező gazdasejttel szabályozhatjuk a pre-IGF expresszióját. így különböző kisméretű, szerves molekulákat, például glükózt használhatunk az adott polipeptid termelésének szabályozására.
Használhatunk hőmérsékletérzékeny regulációs mutánsokat, így a hőmérséklet változtatásával befolyásolhatjuk a transzkripciót. Ha a sejteket kedvezőtlen hőmérsékleten növesztjük, igen sűrű tenyészetet kaphatunk, mielőtt megváltoztatjuk a hőmérsékletet abból a célból, hogy az IGF I és IGF II prepolipeptideket kifejezzük. A találmány szerinti molekulába más ké3
HU 204565 Β pességeket is bevihetünk. Például egyes gének felelősek a sokszoroződásért, a gazdasejtet ért stressz hatására nem. csupán a stresszre válaszoló gén sokszoroződik, de a határos régiók is. Ha a promotor, a kódolörégiő és más, a prepolipeptid transzkripciós szabályozásáért felelős regulációs szignálok elé egy ilyen gént helyezünk, és az élesztő gazdasejtet stresszállapotba hozzuk, úgy olyan plazmidokat kaphatunk, amelyekben több ismétlődő szekvencia van, ezek a szekvenciák pedig tartalmazzák a prepolipeptidgént a regulációs szekvenciákkal együtt A jelen leírásban a metallo-tíonein és a dihidrofolát reduktázgéneket használjuk.
A találmány szerinti molekula a vezérszekvenciát hordozó fiagmensen kívül a gazdasejt genomjával homológ más dezoxiribonukleinsav-fragmenseket is tartalmazhat. Szükség esetén integrálhatjuk az IGF-gént a kromoszómába, ezt úgy érhetjük el, hogy az IGF-gént a gazdasejt kromoszomális dezoxiribonukleinsavával homológ szekvenciák határolják.
A használt replikációs rendszert az élesztőgazdasejt felismeri. így előnyös, ha a replikációs rendszer természetes az élesztőgazdasejt számára. Botstein és munkatársai [Gene, 8, 17-24. (1979)] több élesztővektort ismertetnek. Különösen érdekesek az YEp-plazmidok, amelyek tartalmazzák az élesztő két mikronos plazmidjának replikációs rendszerét. Ezek a plazmidok stabilan fennmaradnak, sejtenként több másolatban. Használhatjuk az ARS1 és CEN4 kombinációkat a stabil fenntartáshoz (ARS: autonóm replikálódő szekvencia; CEN: kromoszóma centomer szakasz). Amolekulák manipulációját követően, szükség szerint, klónozzuk azt, úgy, hogy tisztán és megfelelő mennyiségben kapjuk meg a további kísérletekhez. Előnyösen használhatunk úgynevezett ingázó vektort (élesztő és bakteriális eredetűreplikáciős origót is tartalmaz), úgy, I hogy a klónozást prokariőtasejtekben, különösen E.coliban is elvégezhetjük.
A plazmidokat bármely megfelelő módszerrel bejuttathatjuk az élesztősejtbe, használhatunk élesztősejteket vagy szferoplasztokat, és kalciumionokkal kicsapott dezoxiribonukleinsavat vagy liposzómákat, vagy [lásd például Hitzemann és munkatársa: Natúré 293: 717-720 (1981), Beggs: Natúré 275: 104-109 (1978) és Hinen és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933 (1978)] más, ismert technikákat. A módosított gazdasejteket az expressziós plazmid előállítására használt vektorban általában jelen lévő genetikai markerek segítségével szelektáljuk. Használhatunk auxotróf gazdasejtet, ebben az esetben a plazmid egy olyan gént hordoz, amely kiegészíti a gazdasejt kromoszomális hiányát és prototrófiát okoz. Egy megfelelő biológiailag aktív anyaggal, például antibiotikummal, nehézfémmel, toxinnal vagy más, hasonlóval szembeni rezisztenciát biztosító, és a plazmidban jelen lévő markért is használhatunk. A szelekciót ekkor úgy végezzük, hogy a szülői sejtek növekedését meg nem engedő táptalajon tenyésztünk, így szelektáljuk a plazmidot hordozó sejteket A plazmidot tartalmazó sejtek megfe0 Ielőén kiegészített táptalajon növekednek, és az adott, szekretált polipeptid ismert technikákkal, például kromatográfiával, szűréssel, extrahálással stb. izolálható. Mivel a polipeptid a tápközegben érett alakban van jelen, az adott polipeptid folyamatos eltávolítása után a tápközeg recirkuláltatható.
Az alábbi példákban szemléltetjük a találmányt, a példák szemléltető jellegűek, a leírás oltalmi körét nem szűkítik.
) Példa
A humán inzulinszerű növekedési faktorokat (IGF I és IGF Π) meghatározó nukleotidszekvenciákat Rindefknecht és Humbel [J. Bioi. Chem., 253,27692776. (1978)] és Rinderknecht és Humbel [FEBS » Letters, 89, 283-286. (1978)] által közölt aminosavszekvenciák alapján terveztük úgy, hogy az élesztő szempontjából előnyös kodonok legyének jelen. Az 5-3’ irányú (a kódolőszálak iránya) szekvencia a következő:
A s n S erThrLeuMet
IGFI kódolószakasz
GlyProGluThrLeuCysGlyAlaGluLeuValAspAlaLeuGln
5’-|AArTCGACGCTTATGj3GTCCAGAAACCTrGTGTGGTGCTGAArTGGTCGATGCTTrGCAA jGCTGCGAATACCCAG^rClíTTGGAACACACCACGACrTAACCAGCTACGAAACGTT
EcoRI
Hgal
PheValCysGlyAspArgGlyPheTyrP he AsnLysProThrGlyTyrGly SerSer Ser TTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCAACAAGCCAACCGGTTACGGTTCTTCTTCT AAGCAAACACCACTGTCTCCAAAGATGAAGTTGTrCGGITGGCCAATGCCAAGAAGAAGA
ArgArgAlaProGInThrGlylleValAspGluCysCysPheArgSerCysAspLeuArg
AGAAGAGCTCCACAAACCGGTATCGTrGACGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTGAGA
TCTTCTCGAGGTGTTTGGCCATAGCAÁCrGCTTACAACAAAGTCTAGAACACTGAACTCT
Hgal EcoRI
ArgLeuGluMetTryCysAlaProLeuLysProAlaLysSlerAlaOP MetArgAi AGATTGGAAATGTACTGTGCTCCATTGAAGCCAGCTAAG'IICTGCTTGAATGCGTCC
Yrlg :g£3L
TCTAACCTTTACATGACACGAGGTAACTTCGGTCGATTCAGACGA\CTTACGCAQCTTAA kódolószakasz *
HU 204 565 Β
IGF II kódolószakasz
5’AsnSerThrLeuMet AlaTyrArgProSerGluThrLeuCy sGlyGlyGluLeu Val Asp AATTCGÁCGCTTATGbcTrACAGACCATCCGAAACCTTGTGTGGTGGTGAATrGGTCGAC iGCTGCGAATACCGAAltaTCTGGTAGGCTTTGGAACACACCACCACITAACCAGCTG EcoRI Hgal
ThrLeuGlnPheValCysGlyAspArgGlyPheTyrPheSerArgProAlaSerArgVal
ACCTTGCAATTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCTCCAGACCAGCTTCCAGAGTT
TGGAACGTTAAGCAAACACCACTGTCTCCAAAGATGAAGAGGTCTGGTCGAAGGTCTCAA
SerArgArgSerArgGlylleValGluGluCysCysPheArgSerCysAspLeuAlaLeu
TCTAGAAGATCCAGAGGTATCGTTGAAGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTGGCTTTG
AGATCTTCTAGGTCTCCATAGCAACITCTTACAACAAAGTCTAGAACACTGAACCGAAAC
Hgal EcoRI
LeuGluThrTyrCysAlaThrProAlaLysSsrGluOP Met Arg Árig TTGGAAACCTACTGTGCTACCCCAGCTAAG1CTGAATGAATGCGTCCÍ3’ aacctttggatgacacgatggggtcgattcagactiacttacgcagcttaai kódolószakasz
A szekvencia mindkét végén EcoRI kohéziv végeket tartalmaz. Az IGF I kódja a kódolószál 16. nukleotidjánál kezdődik, és a 225-nél fejeződik be. Az IGF I szekvenciát kódoló régió mindkét végén Hgal restrik- 25 ciós helyek vannak. A Hgal felismerőhelyek (5*GACGC-3’) az IGF I kódolórégióján kívül helyezkednek el, azaz a szintetikus szekvencia vége és a Hgal hasítási hely között. Az IGF Π szintetikus szekvenciát hasonlóképpen szerkesztettük, a kódolőszál a 16. bázisnál kezdődik, és a 219-nél fejeződik be.
Az előzőekben megadott IGF I szekvenciát meghatározó szintetikus DNS-fragmenst úgy állítjuk elő, hogy a foszfor-amitid-módszerrel [lásd Urdea és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7461-7465. (1983)] húsz, egymást átfedő ssDNS-szegmenst szintetizálunk.
Az alábbiakban megadjuk az ssDNS-szekvenciákat:
Jelzés
Szekvencia
A
B-I-l
C-I-2b
C-I-2a
D
1-3
E-I-4
F-I-5
G-I-6
1-7
H-I-8
J-I-9
K-I-10
L
M-I-ll
1-12
1-13
N-I-14
1-15
1-16
AATTCGACGCTTATGG
GTCCAGAAACCTTGTGTGGT
GCTGAATTGGTC
GATGCTTTGCAATTCGT
TTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTC
AACAAGCCAACCGGTTACGGTTCTTCTTC
TAGAAGAGCTCCACAAACCGGTATCGTT
GACGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTG
AGAAGATTGGAAATGTACTGTGCT
CCATTGAAGCCAGCTAAGTCT
GCTTGAATGCGTCG
GTTTCTGGACCCATAAGCGTCG
AAAGCATCGACCAATTCAGCACCACACAAG
CTCTGTCACCACAAACGAATTGC
AACCGGTTGGCTTGTTGAAGTAGAAAC
TGGAGCTCTTCTAGAAGAAGAACCGT
GAAACAACATTCGTCAACGATACCGGTTTG
CCAATCTTCTCAAGTCACAAGATCT
GGCTTCAATGGAGCACAGTACATTT
AATTCGACGCATTCAAGCAGACTTAGCT
Az ssDNS-szegmenseket az alábbiak szerint eljárva kapcsoljuk össze:
T4 polinukleotid-kinázzal 5 ’-foszforilezünk 50 pmól- 55 nyi mennyiségi szegmenst, mindegyiket, kivéve az A és 1-16 jelűt. Ezután 18 pl reakcióelegyben 50-50 pmólnyi szegmenseket egyetlen lépésben összekapcsolunk úgy, hogy 1,5 óra alatt 95 °C hőmérsékletről 25 °C-ra hűtjük a reakcióelegyet. A ligálást 30 pl reakcióelegyben végezzük, amely az alábbi összetételű:
mmól adenozin-trifoszfát, mmól ditiotreitol,
100 mmól triszhidrogén-klorid, pH-7,8, mmól magnézium-diklorid, pg/ml spermidin és T4 ligáz.
HU 204565 Β
Az 1. ábrán, mutatjuk be a megfelelő sorrendben párosodott fragmensekből előállított kétszálű fragmenst, amit 7% natív poliakrilamidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítunk.
1. ábra
Az IGF I összekapcsolásának és ligálásának reak ciósémája
5’ A B-H-l C-I-2b C-I-2a D 1-3 E-l-4 F-I-5 G-I-6 Γ-7 HU-8 +
3’ OT ίΟϊΰσ L~ ΐ4ΐ IÜ2 FII N-I-14 ÜJ M6
Hasonlóképpen szintetizáljuk az IGF H DNS-szek- 10 vencíáját. Ehhez az alábbi, további ssDNS-fragmen-
seket állítjuk elő: | |
Jelzés | Szekvencia |
B-H-l | C1TACAGACCATCCGAAACCTTGTGTGGT |
C-H-2 | GGTGAATTGGTCGACACCTTGCAATTCGT |
Π-3 | TCCAGACCAGCTTCCAGAGTTTCT |
E-H-4 | AGAAGATCCAGAGGTATCGTT |
F-H-5 | GAAGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTG |
G-H-6 | GCITTGTTGGAAACCTACTGTGCT |
Η-Π-7 | ACCCCAGCTAAGTCTGAATGAATGCGTCG |
J-H-8 | GTTTCGGÁIGGTCTGTAAGCCATAAGCGTCG |
Κ-Π-9 | AAGGTGTCGACCAATTCACCACCACACAAG |
Μ-Π-10 | AAGCTGGTCTGGAGAAGTAGAAAC |
H-ll | CTGGATCTTCTAGAAACTCTGG |
Π-12 | GAÁACAACATTCTTCAACGATACCT |
Ν-Π-Ι3 | TfCCAACAAAGCCAAGTCACAAGATCT |
H-14 | AGACTl'AGCTGGGGTAGCACAGTAGGT |
H-15 | AÁTTCGACGCATTCATTC |
200 pmól fenti ssDNS-fragmenseket és az A-, D- és L-fragmenseket az előzőekben megadott módon összekapcsolunk, azzal a különbséggel, hogy az A és H-15 fragmenseket T4 polinukleotid-kinázzal nem foszforiIezzük. Ekkor a 2. ábrán megadott sorrendű és pároso- 35 dásű szegmenseket kapjuk.
2. ábra
Áz IGF H összekapcsolásának és ligálásának reakci· ósémája
G-H-7 3’
5’ A B-H-l C-H-2 D H3 E-H-4 F-H-5 G-H-6 +
3r ÜÜ? KÜÜ9 “L- M-II-10 ΗΪΓ HÜ2 NÜÜÍ3 HÜ4 ΪΗ5 5’
A szintetikus DNS-szekvenciákat a pBR328 plazmid EcoRI restrikciós helyére építjük be, miután megkapjuk a p328IGFI és p328IGF II plazmidokat. Klónozás után az IGF-kődolószálakat Hgal endonuklezázzal 45 kihasítjuk. A fenti általános módszert részletesen ismertetik Urdea és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 80:7461-7465 (1983).
A Hgal restrikciós fragmensekhez ezután szintetikus oligonukleotid adaptermolekulákat ligálunk, ugyan- 50 csak Urdea szerinti Az IGF I esetén az alábbi adapterszekvenciákat használjuk:
a) 5’-AGCTGAAGCT-3’
3’-CTTCGACCAGG-5’ 55
b) 5’-CTGCTTGATAAG-3’
3r-ACTATTCAGCT-5’. .
A kődolőszál irányultságához képest az a)-val jelölt első adaptermolekula 3’-vége komplementer az IGF I szintetikus szekvencia 5’-végén elhelyezkedő Hgal hasítási hellyel, míg az első adapter 5’-vége Hindin kohéziv véget eredményez.
A b) jellel jelzett második adaptermolekula 5’-végén komplementer az IGF I szekvencia 3’-végén elhelyezkedő Hgal hasítási hellyel, míg az adapter 3 ’-vége Sáli kohéziv véget eredményez.
Az IGF H klónozásakor az alábbi adapterszekvenciákat használjuk:
c) 5’-AGCTGAÁGCT-3’
3’-CTTCGACGAAT-5’
d) 5’-CTGAATGAIAAG-3’
3’-ACTATTCAGCT-5’.
Az orientációt tekintve, az első adaptermolekula c) 3’-végén komplementer az IGF II szintetikus szekvencián levő 5’-végen elhelyezkedő Hgal hasítási hellyel, 60 míg az adapter 5’-vége HíndHI kohéziv véget eredmé6
HU 204 565 Β nyez. A d) betűvel jelzett második adaptermolekula 5’-végén komplementer az IGF II szintetikus szekvencia második Hgal hasítási helyével, és Sáli kohéziv véget alakít ki annak 3’-végén.
A szintetikus fragmenseket és a hozzájuk kapcsolt adaptermolekulákat preparatív gélelektroforézissel tisztítjuk, és HindíII és Sáli endonukleázokkal előzőleg teljesen emésztett 100 ng mennyiségű pAB113 plazmidhoz ligáljuk. ApAB113 a pAB112 plazmidból származik a három 63 bázispár nagyságú HindíII fragmens deléciójával. A pAB112 egy 1,8 kb nagyságú EcoRl fragmenst tartalmaz az élesztő a-faktor génjével, amit a pBR322 plazmid EcoRl helyére klónoztunk, amely pBR322-ből a HindíII és Sáli helyeket kivágtuk. A pAB112 a pABlOl plazmidból származik, amely utóbbi részleges Sau3A fragmensen hordozza az élesztő α-faktor génjét; a fragmenst az YEp24 plazmid BamHl helyére kiónoztuk. A pABlOl plazmidot úgy kaptuk, hogy YEp24 plazmiddal élesztő genomiális könyvtárat (génbankot) állítottunk elő, majd enzimatikusan 32P radioaktívan jelzett szintetikus oligonukleotid-próbával szkríneltünk. A próba homológ a publikált α-faktor kódolórégióval [Kurjan és Herskowitz, Abstracts (1981), Cold Spring Harbor meeting on the Molecular Biology of Yeasts, 242. oldal]. A fenti műveleteket ugyancsak Urdea ismertetett módszerével végezzük.
A kapott keverékkel E.coli HB101 sejteket transzformálunk, és izoláljuk az IGF I és IGF H szekvenciát hordozó pAB113-IGF-I pAB113-IGF-II plazmidokat. Az IGF I és IGF Π struktúrgéneket hordozó pAB113-IGF-I és pAB 113-IGF-II plazmidokat EcoRl enzimmel teljesen emésztjük, és a kapott fragmenseket fölös mennyiségben jelen levő EcoRI-BamHI adapteimolekulákkal ligáljuk, végül BamHl restrikciós endonukleázzal emésztjük.
A reakcióelegyben 5-5 pg plazmid DNS-t használunk. A kapott 1,8 kb nagyságú BamHl fragmenseket preparatív gélelektroforézissel izoláljuk, és a közelítőleg 100 ng-nyi mennyiségű fragmenseket 100 ng pCl/1 plazmidhoz ligáljuk, amely plazmidot előzőleg BamHl endonukleázzal teljesen emésztünk, és alkalikus foszfatázzal kezelünk.
A pCl/1 plazmid a pJDB219 egy származéka [Beggs, Natúré, 275, 104. (1978)], a plazmidban a pMB9 (pJDB219) bakteriális plazmidnak megfelelő szakaszt a pBR322-vel helyettesítettük. Mindegyik ligációs eleggyel E.coli HB101 sejteket transzformálunk. A transzformánsokat ampicillin-rezisztenciájuk alapján szelektáljuk, és a bennük levő plazmidokat restrikciós endonuklezázos kezeléssel analizáljuk. Az IGF I vagy IGF II struktúrgént hordozó egy-egy szelektált klónból (pYIGF-I-10/1 és pYIGF-II-10/1) DNS-t izolálunk, és ezzel AB 103 élesztősejteket transzformálunk. A transzformánsokat leucin pozitív fe'notípus alapján szelektáljuk. A fenti transzformációs lépéseket Beggs előző cikke, valamint Maniatis: Molecular Cloning, Larboratory Mamel, Cold Spring Harbor Press, (1982) szerint végezzük.
A pYIGF-I-10/1 plazmiddal transzformált AB103 (a,pép 4-3, leu 2-3, leu 2-112, ura 3-52, his 4-580) élesztőtörzset 5 és 9 literes tenyészetben 30 °C hőmérsékleten növesztjük -leu-táptalajban addig, míg a tenyészet optikai sűrűsége 650 nm-en 5 lesz, majd ezután további 12 órán át tenyésztünk 30 °C hőmérsékleten. Centrifugálással mindkét tenyészetből összegyűjtjük a sejtfelülúszót, és az IGF I polipeptidet ioncserélő oszlopon (Biorex-70, Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Califomia) abszorbeálva koncentráljuk. A terméket 10 mmól hidrogén-kloridot tartalmazó, 80%-os etanollal eluáljuk, a 0,4 ml és 3 ml térfogatú IGF I frakciókat teljes proteintartalomxa és IGF I koncentrációra vizsgáljuk. A proteintartalmat Coomassie Blue módszerrel határozzuk meg (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Califomia).
Az IGF I koncentrációt az ismert kompetitív radioimmunassay-vel mérjük, radioaktívan jelzett IGF I-et használva. Az eredményeket az alábbiakban közöljük:
Vizsg. | Térfogat | Koncent- Ossz- | IGF-I |
száma | rálás utáni protein | ||
térfogat | |||
1. | 5 liter | 0,4 ml 5,0 mg/ml | 3,75 mg/ml |
2. | 9 liter | 3,0 ml 2,9 mg/ml | 3,00 mg/ml |
A mérést Zapf és munkatársai: J. Cím. Invest. 68: 1321-1330 (1981) szerint végezzük.
Az IGF I mérés azon alapszik, hogy a peptid szinergista hatású a galambbegy-prolaktinra adott válaszának erősítésében [Anderson és munkatársai, Somatomedins/Insulin-Like Growth Factors, Spencer szerkesztése, Walter deGruter, Berlin (1983)]. A biológiai mérés alátámasztja, hogy a készítményekben levő IGF I termék azonos hatású a humán szérumból izolált autentikus IGF I termékkel.
A fentiekhez hasonlóan tenyésztve az AB 103 (pYIGE-H-10/1) törzset, és humán placentamembrán radioreceptorassay-vel meghatározva az IGF II koncentrációt [Spencer és munkatársai, Act. Endocrinol., 91, 36-48. (1979)], úgy találtuk, hogy a tenyészetekben 3,9 egység/ml, míg a normál humán szérumban 1 egység/ml IGF II aktivitás van.
A találmány szerinti eljárással új DNS-molekulákat állítunk elő, ezek a humán inzulinszerű növekedési faktor (I) kifejezésére, termelésére és szekréciójára használhatók. Tehát olyan polipeptidet állíthatunk elő, amely azonos szekvenciájú a természetesen előforduló humán I inzulinszerű növekedési faktorral. A szekréció biztosításával adott sejtpopulációból nagymértékben megnövekedett hozamot biztosíthatunk, és az ezután következő izolálási és tisztítási lépések egyszerűsödnek.
Bár a találmányt annak szemléltetése során részletesen ismertettük, és példát adtunk meg a világos érthetőség kedvéért, nyilvánvaló, hogy a találmány oltalmi körének szőkítése nélkül bizonyos változtatásokat és módosításokat eszközölhetünk.
Claims (11)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOKI. Eljárás humán inzulinszení I vagy Π növekedési faktorok (IGF) hatékony előállítására megfelelő gazdamikrooiganizmusban, azzal jellemezve, hogy i) egy IGF I vagy IGF Π polipeptidet kódoló DNSszekvenciát állítunk elő, ezt az IGF I vagy IGF H polipeptidet kódoló DNS-szekvencíát megfelelő leolvasási fázisban összekapcsoljuk egy olyan DNS-szekvenciával, amely az adott gazdaszervezet által felismert szekréciós vezér és processzor szignálszekvencíákat határoz meg, ezek 3’ irányban helyezkednek el az őket transzkripciós szinten szabályozó, a gazdaszervezet által felismerhető transzkripciós régiótól; az így kapott DNS-molekulával gazdaszervezetet transzformálunk;xi) a transzformált sejteket tenyésztjük; és 5 iii) a transzformált gazdasejtek tenyészetéből izoláljuk a szekretált humán IGF I vagy IGF H polipeptideket.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezet által előnyben részesített kodo10 nokat tartalmazó szintetikus IGF-gént alkalmazunk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán IGF-génként egy alábbi nukleoíidszekvenciájú szintetikus IGFI gént alkalmazunk:GlyProGluThrLeuCysGIyAlaGluLeuValAspAIaLeuGIn5’-GGTCCAGAAACCTTGTGTGGTGCTGAATTGGTCGATGCTTTGCAACCAGGTCTTTGGAACACACCACGACTTAACCAGCTACGAAACGTTPheValCysGlyAspArgGlyPheTyrPheÁsnLysProThrGlyTyrGlySerSerSerTTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCAACAÁGCCAACCGGTTACGGTTCTTCTTCTAAGCAAACACCACrGTCTCCAAAGATGAAGTTGTTCGGTTGGCCAATGCCAAGAAGAAGAArgArgAlaProGlnThrGlylleValAspGluCysCysPheArgSerCysAspLeuArgAGAAGAGCTCCACAAACCGGTATCGTTGACGAATGTTGTTTCAGATCrTGTGACTTGAGATCTTCTCGAGGTGTTTGGCCÁTAGCÁACTGCTTACAACAAAGTCTAGAACACTGAACTCTArgLeuGluMetTyrCysAlaProLeuLysProAlaLysSerAlaAGArTGGÁAATGTACTGTGCrCCATTGAAGCCAGCTAAGTCTGCT-3’TCTAACCTTTACATGACACGAGGTAACTTCGGTCGATTCAGACGA
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán IGF-génként egy alábbi nukleotidszekvenciájú szintetikus IGF H gént alkalmazunk:AlaTyrArgProSerGluThrLeuCysGlyGlyGluLeu ValAsp 5’-GCTTACAGACCArCCGAAACCTTGTGTGGTGGTGAATTGGTCGACCGAATGTCTGGTAGGCTTTGGAACACACCACCACITAACCAGCTGThrLeuGInPheValCysGlyAspArgGlyPheTyrPheSerArgProAlaSerArgValACCTTGCAATTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCTCCAGACCAGCTTCCAGAGTTTGGAACGTTAAGCAAACACCACTGTCTCCAAAGATGAAGAGGTCTGGTCGAAGGTCTCAASerArgArgSerArgGIylIeValGIuGIuCysCysPheArgSerCysAspLeuAlaLeuTCTAGAAGATCCAGAGGTATCGTTGAAGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTGGCTTTGAGATCTTCrAGGTCrCCATAGCAACTTCrTACAACAAAGTCTAGAACACTGAACCGAAACLeuGluThrTyrCysAlaThrProAlaLysS erGlu TTGGAAACCTACTGTGCTACCCCAGCrAAGTCTGAA-3 ’ AACCTTTGGATGACACGATGGGGTCGATTCAGACrr
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként élesztősejtet használunk.
- 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként élesztősejtet, és hordozó DNS-ként az élesztőkét mikronos plazmidjának egy származékát használjuk.
- 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás a humán inzulinszén! növekedési faktor (JGF) előállítására élesztőben, azzal jellemezve, hogy előállítunk egy olyan első DNS-fragmenst, amely tartalmaz egy IGF-poIipeptidet meghatározó elsőDNSszekvenciát, és ennek kódolószálának 5’-vége a nevezett DNS-szekvencia első bázisa mellett, vagy attól 3’ irányban helyezkedik el;egy olyan második DNS-fragmenst állítunk elő, amely egy második, az élesztősejtek által felismerhető szekréciós és processzorszignálokat kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, és kódolószálának 3’-vége a nevezettHU 204565 Β processzorszignál utolsó bázisa mellett, vagy ettől 5’ irányban található, és a nevezett első és második fragmens legalább egyikének vége a kódolószekvencián belül helyezkedik el, aminek eredményeképpen bázispárok esnek ki;a nevezett első és második DNS-fragmenseket a nevezett első és második DNS-fragmensek hiányzó bázispárjait kódoló adaptermolekulával összekapcsoljuk, amikor a nevezett első és második DNS-fragmens azonos leolvasási fázisba kerül;az első fragmenstől 3’ irányba és annak szomszédságába egy terminációs kodont építünk be, majd a kapott gént élesztő expressziós vektorba klónozzuk és kifejezzük.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás IGF előállítására, azzal jellemezve, hogy IGF-ként IGF I-et fejezünk ki.
- 9. A 7. igénypont szerinti eljárás IGF előállítására, azzal jellemezve, hogy IGF-ként IGF H-t fejezünk ki.
- 10. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a baktériumok által felismerhető replikációs rendszert tartalmazó expressziós vektort alkalmazunk.
- 11. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az élesztő 2 mikronos plazmidjából, vagy annak egy részéből álló élesztő replikációs rendszert tartalmazó expressziós vektort alkalmazunk.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US48795083A | 1983-04-25 | 1983-04-25 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUT34236A HUT34236A (en) | 1985-02-28 |
HU204565B true HU204565B (en) | 1992-01-28 |
Family
ID=23937779
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU841572A HU204565B (en) | 1983-04-25 | 1984-04-24 | Process for the synthesis of hybride dns of ripe insuline-like growth factor |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6642029B1 (hu) |
EP (2) | EP0561137B1 (hu) |
JP (2) | JP2548105B2 (hu) |
AT (2) | ATE220101T1 (hu) |
AU (1) | AU576757B2 (hu) |
DE (2) | DE3486491T2 (hu) |
DK (1) | DK204584A (hu) |
ES (1) | ES8505412A1 (hu) |
FI (1) | FI87799C (hu) |
HK (1) | HK65594A (hu) |
HU (1) | HU204565B (hu) |
IE (2) | IE60228B1 (hu) |
IL (1) | IL71634A (hu) |
NO (1) | NO174302C (hu) |
NZ (1) | NZ207842A (hu) |
PT (1) | PT78484B (hu) |
ZA (1) | ZA842982B (hu) |
Families Citing this family (55)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
US7198919B1 (en) | 1983-04-25 | 2007-04-03 | Genentech, Inc. | Use of alpha factor sequences in yeast expression systems |
US4588684A (en) * | 1983-04-26 | 1986-05-13 | Chiron Corporation | a-Factor and its processing signals |
IL71991A (en) * | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
JPS60501989A (ja) * | 1983-08-10 | 1985-11-21 | アムジエン | インシュリン様成長因子の微生物発現 |
WO1985000831A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of insulin-like growth factor |
US4758512A (en) * | 1984-03-06 | 1988-07-19 | President And Fellows Of Harvard College | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
DK108685A (da) * | 1984-03-19 | 1985-09-20 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Vaekstfaktor i |
US4738921A (en) * | 1984-09-27 | 1988-04-19 | Eli Lilly And Company | Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products |
JP2549504B2 (ja) * | 1984-12-21 | 1996-10-30 | ア−ス製薬株式会社 | Dna塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 |
US5242811A (en) * | 1985-03-26 | 1993-09-07 | Biogen, Inc. | Production of human somatomedin C |
GB8507833D0 (en) * | 1985-03-26 | 1985-05-01 | Biogen Nv | Production of human somatomedin c |
US5342921A (en) * | 1985-03-28 | 1994-08-30 | Chiron Corporation | Superoxide dismutase fusion polypeptides for expression of mammalian proteins |
EP0196056B1 (en) * | 1985-03-28 | 1991-05-22 | Chiron Corporation | Improved expression using fused genes providing for protein product |
US4751180A (en) * | 1985-03-28 | 1988-06-14 | Chiron Corporation | Expression using fused genes providing for protein product |
US4783524A (en) * | 1985-09-17 | 1988-11-08 | Monsanto Company | Growth factors |
ATE67243T1 (de) * | 1985-10-21 | 1991-09-15 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Verfahren zur herstellung von insulinaehnlichem wachstumsfaktor i (igf-i) und plasmid zu dessen herstellung. |
GB8529014D0 (en) * | 1985-11-25 | 1986-01-02 | Biogen Nv | Enhanced secretion of heterologous proteins |
EP0234862A3 (en) * | 1986-02-28 | 1988-10-05 | Merck & Co. Inc. | Expression of recombinant proteins in yeast |
EP0234871A3 (en) * | 1986-02-28 | 1988-10-12 | Merck & Co. Inc. | Regulatable expression of recombinant proteins in yeast |
JPH0616716B2 (ja) * | 1986-10-14 | 1994-03-09 | 塩野義製薬株式会社 | 酵母におけるヒトpstiの製造法 |
DE3726655A1 (de) * | 1987-08-11 | 1989-02-23 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung basischer proteine aus proteingemischen, welche solche basischen proteine enthalten |
GB8723660D0 (en) * | 1987-10-08 | 1987-11-11 | British Bio Technology | Synthetic gene |
CA1340772C (en) * | 1987-12-30 | 1999-09-28 | Patricia Tekamp-Olson | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences |
US4988675A (en) * | 1988-02-05 | 1991-01-29 | Ciba-Geigy Corporation | Method for preventing secondary effects |
DE68905203T2 (de) * | 1988-02-05 | 1993-07-22 | Ciba Geigy Ag | Verwendung von igf i zur herstellung eines praeparates fuer die behandlung von nierenkrankheiten. |
GB8819826D0 (en) * | 1988-08-20 | 1988-09-21 | Kabivitrum Ab | Glycosylated igf-1 |
GB8927008D0 (en) * | 1989-11-29 | 1990-01-17 | Ciba Geigy | Novel process for the production of unfused protein in e.coli |
NZ236618A (en) * | 1990-01-03 | 1997-06-24 | Ciba Geigy Ag | Treating and preventing osteoporosis using insulin-like growth factor i (igf i) in conjunction with a bone antiresorptive active compound |
US5374620A (en) * | 1990-06-07 | 1994-12-20 | Genentech, Inc. | Growth-promoting composition and its use |
US5681814A (en) * | 1990-06-07 | 1997-10-28 | Genentech, Inc. | Formulated IGF-I Composition |
WO1992004363A1 (en) * | 1990-09-04 | 1992-03-19 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
JPH06506117A (ja) * | 1991-04-01 | 1994-07-14 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | ピキア(Pichia)蛋白質分解活性に影響する遺伝子およびその使用 |
TW267102B (hu) | 1992-03-13 | 1996-01-01 | Ciba Geigy | |
SE9201573D0 (sv) * | 1992-05-19 | 1992-05-19 | Kabi Pharmacia Ab | Use of igf-1 |
US5521086A (en) * | 1993-09-16 | 1996-05-28 | Cephalon, Inc. | Secretion sequence for the production of a heterologous protein in yeast |
SE9402370D0 (sv) | 1994-07-04 | 1994-07-04 | Pharmacia Ab | Use of IGF-I |
WO1996007744A1 (en) * | 1994-09-08 | 1996-03-14 | Chiron Corporation | A method of improved production of insulin-like growth factor |
US5712249A (en) * | 1994-09-08 | 1998-01-27 | Ciba-Geigy Corporation | Use of insulin-like growth factors I and II for inhibition of inflammatory response |
ES2224178T3 (es) | 1995-10-11 | 2005-03-01 | Chiron Corporation | Cobinacion de pdgf, kgf,igf e igfbp para la cicatrizacion de heridas. |
US5783556A (en) * | 1996-08-13 | 1998-07-21 | Genentech, Inc. | Formulated insulin-containing composition |
JP2002533124A (ja) | 1998-12-31 | 2002-10-08 | カイロン コーポレイション | Hivポリペプチドの改善された発現およびウイルス様粒子の生成 |
PT1165119E (pt) | 1999-04-08 | 2004-02-27 | Genentech Inc | Composicao baseada em polipeptidos com cargas opostas |
AU2003228751A1 (en) | 2002-05-01 | 2003-11-17 | Cell Genesys, Inc. | Lentiviral vector particles resistant to complement inactivation |
PT2274978E (pt) | 2003-09-12 | 2015-07-09 | Ipsen Biopharmaceuticals Inc | Métodos para tratamento da deficiência do fator de crescimento de tipo insulina i (igf-i) |
EP1674113A1 (en) | 2004-12-22 | 2006-06-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjugates of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and poly(ethylene glycol) |
CL2007002502A1 (es) | 2006-08-31 | 2008-05-30 | Hoffmann La Roche | Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer. |
WO2008025527A1 (en) | 2006-08-31 | 2008-03-06 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the production of insulin-like growth factor-i |
PE20090368A1 (es) | 2007-06-19 | 2009-04-28 | Boehringer Ingelheim Int | Anticuerpos anti-igf |
BRPI0923359B8 (pt) | 2008-12-12 | 2021-05-25 | Boehringer Ingelheim Int | molécula de anticorpo anti-igf, método para a produção da mesma, molécula de dna, vetor de expressão, e composição farmacêutica e método in vitro para inibir a ligação do igf-1 e do igf-2 ao receptor de igf-1 e ao receptor de insulina ir-a |
CN102471769A (zh) | 2009-07-17 | 2012-05-23 | 亚伦·T.·塔波尔 | 用于具有美容功能的细胞的遗传修饰以提高美容外观的方法和组合物 |
US20110152188A1 (en) | 2009-12-23 | 2011-06-23 | Hanns-Christian Mahler | Pharmaceutical compositions of igf/i proteins |
US20140255413A1 (en) | 2013-03-07 | 2014-09-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Combination therapy for neoplasia treatment |
US20210008172A1 (en) | 2019-07-11 | 2021-01-14 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting igf-1 or igf-1 variants and methods of producing same |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4411994A (en) * | 1978-06-08 | 1983-10-25 | The President And Fellows Of Harvard College | Protein synthesis |
US4443539A (en) | 1980-02-05 | 1984-04-17 | The Upjohn Company | Process for preparing bovine growth hormone |
CA1200773A (en) * | 1980-02-29 | 1986-02-18 | William J. Rutter | Expression linkers |
AU545912B2 (en) * | 1980-03-10 | 1985-08-08 | Cetus Corporation | Cloned heterologous jive products in bacillies |
US4350764A (en) * | 1980-03-10 | 1982-09-21 | The Regents Of The University Of California | Microbiological synthesis of beta endorphin |
US4338397A (en) | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
US4546082A (en) | 1982-06-17 | 1985-10-08 | Regents Of The Univ. Of California | E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins |
EP0116201B1 (en) * | 1983-01-12 | 1992-04-22 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
SE8300693L (sv) * | 1983-02-09 | 1984-08-10 | Sven Lofdahl | Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta |
GB8308483D0 (en) * | 1983-03-28 | 1983-05-05 | Health Lab Service Board | Secretion of gene products |
JPS60501140A (ja) * | 1983-04-22 | 1985-07-25 | アムジエン | 酵母による外因性ポリペプチドの分泌 |
AU2722184A (en) * | 1983-04-25 | 1984-11-01 | Genentech Inc. | Use of alpha sequences in yeast expression systems |
NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
IL71991A (en) * | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
WO1985000831A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of insulin-like growth factor |
US4745179A (en) * | 1984-04-02 | 1988-05-17 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | 59 Valine insulin-like growth factor I and process for production thereof |
CA1341423C (en) * | 1984-10-31 | 2003-03-04 | Paul A. Luciw | Recombinant proteins of viruses associated with lymphadenopathy syndrome and/or acquired immune deficiency syndrome |
EP0193112A3 (en) | 1985-02-22 | 1987-02-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Cdna encoding mammalian insulin-like growth factor ii |
US5084384A (en) * | 1987-04-23 | 1992-01-28 | Monsanto Company | Secretion of insulin-like growth factor-I |
CA1340772C (en) | 1987-12-30 | 1999-09-28 | Patricia Tekamp-Olson | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences |
GB8927008D0 (en) * | 1989-11-29 | 1990-01-17 | Ciba Geigy | Novel process for the production of unfused protein in e.coli |
WO1992004363A1 (en) * | 1990-09-04 | 1992-03-19 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
US5521086A (en) * | 1993-09-16 | 1996-05-28 | Cephalon, Inc. | Secretion sequence for the production of a heterologous protein in yeast |
ATE398139T1 (de) | 1996-12-13 | 2008-07-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Analyse und separation von pdgf-proteinen |
-
1984
- 1984-04-13 AT AT93101654T patent/ATE220101T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-04-13 DE DE3486491T patent/DE3486491T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-13 AT AT84104175T patent/ATE95236T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-04-13 DE DE84104175T patent/DE3486216T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1984-04-13 EP EP93101654A patent/EP0561137B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-13 EP EP84104175A patent/EP0123228B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-13 NZ NZ207842A patent/NZ207842A/en unknown
- 1984-04-16 FI FI841524A patent/FI87799C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-04-19 ZA ZA842982A patent/ZA842982B/xx unknown
- 1984-04-19 IE IE97584A patent/IE60228B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-04-19 IE IE940140A patent/IE940140L/xx unknown
- 1984-04-24 ES ES531855A patent/ES8505412A1/es not_active Expired
- 1984-04-24 NO NO841613A patent/NO174302C/no unknown
- 1984-04-24 DK DK204584A patent/DK204584A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-04-24 AU AU27233/84A patent/AU576757B2/en not_active Expired
- 1984-04-24 HU HU841572A patent/HU204565B/hu not_active IP Right Cessation
- 1984-04-24 PT PT78484A patent/PT78484B/pt not_active IP Right Cessation
- 1984-04-25 JP JP59082096A patent/JP2548105B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-25 IL IL71634A patent/IL71634A/xx not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-06-10 JP JP6128883A patent/JP2530424B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-07 HK HK65594A patent/HK65594A/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-05-17 US US08/442,800 patent/US6642029B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU204565B (en) | Process for the synthesis of hybride dns of ripe insuline-like growth factor | |
CA1340772C (en) | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences | |
JP2641457B2 (ja) | 酵母プロモーター | |
US5162498A (en) | Synthetic yeast leader peptides | |
KR100251054B1 (ko) | 합성 리더 펩티드 서열 | |
JP2733602B2 (ja) | ヒルジンをコードする発現カセット、プラスミド及び形質転換酵母 | |
Elliott et al. | Secretion of glycosylated human erythropoietin from yeast directed by the α-factor leader region | |
JP2634193B2 (ja) | ヒトプロアポリポタンパク質a−1の発現 | |
US4914027A (en) | Process for the microbiological preparation of human serum albumin | |
KR100316347B1 (ko) | 대장균엔테로톡신ⅱ신호펩티드의변형체와인체성장호르몬의융합단백질을발현하는재조합미생물및그를이용한인체성장호르몬의제조방법 | |
US5187261A (en) | Process for the preparation of mature human serum albumin | |
JPH03500370A (ja) | ペプチドおよびdna配列 | |
JPS63501614A (ja) | 外来タンパク質を分泌することを目的としたbar1の使用法 | |
US5010010A (en) | Production of human parathyroid hormone from microorganisms | |
JPH04211391A (ja) | ヒルジン誘導体、その取得法、組換えdna及び組換えベクター | |
EP1114865B1 (en) | Production of human parathyroid hormone | |
CA2155451A1 (en) | Dna sequences encoding novel biosynthetic insulin precursors and process for preparation of insulin | |
JP2840441B2 (ja) | 真正fgfの酵母における発現およびプロセシング | |
PT716705E (pt) | Processo para a preparacao por recombinacao de proteinas na levedura hansenula | |
KR920003664B1 (ko) | 합성유전자에 의한 효모세포로부터 소성장호르몬의 대량 제조방법 | |
WO1986000637A1 (en) | Yeast cloning vehicle | |
KR890005068B1 (ko) | 인체인슐린-유사생장인자의 제조방법 | |
JP2002534074A (ja) | メチロトローフ酵母発現系を使用する組換えモネリンの産生 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |