FI87799B - Foerfarande foer framstaellning av humaninsulinlik tillvaextfaktor (igf) - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av humaninsulinlik tillvaextfaktor (igf) Download PDFInfo
- Publication number
- FI87799B FI87799B FI841524A FI841524A FI87799B FI 87799 B FI87799 B FI 87799B FI 841524 A FI841524 A FI 841524A FI 841524 A FI841524 A FI 841524A FI 87799 B FI87799 B FI 87799B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- igf
- yeast
- host
- sequence
- gene
- Prior art date
Links
- 238000009413 insulation Methods 0.000 title 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 15
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 6
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 22
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 13
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 12
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 11
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 8
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 2
- JQEBITVYKUCBMC-SRVKXCTJSA-N Met-Arg-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JQEBITVYKUCBMC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- GBXZONVFWYCRPT-JGWLITMVSA-N [(2r,3s,4r,5r)-3,4,5,6-tetrahydroxy-1-oxohexan-2-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C=O)OP(O)(O)=O GBXZONVFWYCRPT-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JJBCTCGUOQYZHK-ZSCHJXSPSA-N 2-acetyloxybenzoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O.CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O JJBCTCGUOQYZHK-ZSCHJXSPSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101100163849 Arabidopsis thaliana ARS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 101710190529 Insulin-like peptide Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101100059658 Mus musculus Cetn4 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 102100024819 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 101100097319 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ala1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000000006 pectoral fin Anatomy 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 210000005152 placental membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 230000009576 somatic growth Effects 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
87799
MENETELMÄ IHMISEN INSULIININ KALTAISEN KASVUTEKIJÄN (IGF) TUOTTAMISEKSI
Keksinnön tausta
Pidetään mahdollisena, että somaattinen kasvu, joka seuraa kasvuhormonin antamista in vivo, välittyy mitogeenisten, insuliininkaltaisten peptidien ryhmän välityksellä, joiden seerumikonsentraatiot riippuvat kasvuhormonista. Näihin poly-peptideihin sisältyvät somatomediini-C, somatomediini-A sekä insuliinin kaltaiset kasvutekijät I ja II (IGF I sekä IGF II). IGF I ja II voidaan eristää ihmisen seerumista, ja niiden aminohapposekvenssit ovat suurin piirtein homologiset insuliinin aminohapposekvenssien kanssa. Nykyisin voidaan saada ainoastaan rajoitettuja määriä näitä kasvutekijöitä ihmisen seerumista eristämällä. Täten olisi sekä kliinisesti että tieteellisesti merkittävää pystyä valmistamaan suhteellisen suuria määriä kasvutekijöitä yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla.
Ihmisen insuliinin kaltaisten kasvutekijöiden I ja II (IGF I ja II) aminohapposekvenssit määrittivät ensiksi Rinderknecht ja Humbel (1978) J. Biol. Chem. 253:2769-2776 sekä FEBS Letters 89:283-286. IGF-reseptoreiden luonnetta ovat kuvan-··· neet Massague ja Czech (1982), julkaisussa J. Biol. Chem.
257:5038-5045. Kurjan ja Herskowitz, Cell (1982) 30:933-934, : kuvaavat oletettua oc-tekijän prekursoria, joka sisältää ____; neljä peräkkäistä kypsän <1-tekijän kopiota, ja he kuvaavat sekvenssiä ja oletettua valmistusmekanismia. Kurjan ja Herskowitz kuvaavat tiivistelmässä, Abstract of Papers, joka on esitetty 1981 Cold Opring Harbor Meeting on The Molecular Biology of Yeast, sivulla 242, otsikolla "A Putative Alpha-. : Factor Precursor Containing Four Tandem Repeats of Mature : Alpha-Factor", sekvenssiä, joka koodittaa oC-tekijää, sekä kahden tällaisen sekvenssin välialueita.
2 87799
Keksinnön yhteenveto
Keksintö koskee menetelmiä Ja koostumuksia kypsän, ihmisen insuliinin kaltaisen kasvutekijän (IGF) tehokkaaksi valmistamiseksi. Erityisesti hiivaisännässä tapahtuva "pre"-IGF Is n ja "pre"-IGF II:n ekspressio helpottaa polypeptidin erittymistä elatusaineeseen. DNA-rakenteet saadaan aikaan liittämällä yhteen eri lähteistä peräisin olevia DNA-sekvenssejä, luonnon sekä synteettisistä lähteistä saadut DNA-sekvenssit mukaanluettuina. Syntyvät DNA-rakentee't replikoituvat hiivassa jatkuvasti sekä antavat käyttöön valmistettujen "pre"-polypeptidien, jotka saatetaan eristää suurena saantona elatusaineesta, tehokkaan, korkeatasoisen tuotannon. Keksinnölle on tunnusomaista se, mitä on esitetty patenttivaatimusten tunnusmerkkiosissa.
Keksintö koskee DNA-sekvenssejä, jotka voivat ekspressoida ihmisen insuliinin kaltaisia kasvutekijöitä (IGF I ja II). Näitä DNA-sekvenssejä voidaan sisällyttää vektoreihin, ja syntyviä plasmideja käytetään herkkiä isäntiä transformoitaessa. Sellaisilla yhdistelmäplasmideilla suoritetun, herkän isännän transformoinnin tuloksena on insuliinin kaltaisen • . kasvutekijägeenin ekspressio sekä polypeptidituotteen ‘ valmistuminen.
Erityisesti keksintö koskee uusia DNA-rakenteita prekursori-polypeptidien ("pre"-IGF I sekä "preM-IGF II) valmistamiseksi hiivaisännässä, joka pystyy valmistamaan mainittuja prekursoripolypeptidejä sekä erittämään kypsän poiypeptidi-tuotteen elatusaineeseen. DNA-rakenteisiin sisältyy repli-• kointijärjestelmä, joka voi säilyä pysyvästi hiivaisännässä, :'· tehokas promoottori., rakennegeeni, johon sisältyvät joh- . . danto- ja prosessointisignaalit lukuvaiheistuksessa mainitun rakennegeenin kanssa, sekä transskription lopetussignaali rakennegeenin alapuolella.
5 87799
Valinnaisesti voidaan antaa käyttöön muita sekvenssejä trans-skription säätelyä, geenin monistumista, transskription ekso-geenistä säätelyä yms. varten. "Pre"-IGP:llä sekä "pre"-IGFrllu tarkoitetaan, että kypsää polypeptidiä koodaava DNA-sekvenssi on liitetty lukuvaiheistukseen ja lukuraamissa joh-dantojakson kanssa, joka sisältää hiivaisännän tehokkaasti tunnistamat prosessointisignaalit. Täten "pre" merkitsee hiivaisäntään kytkeytyvien eritys- ja prosessointisignaalien sisältymistä eikä mitään kyseistä polypeptidiä koodittavaan geeniin liittyneitä prosessointisignaaleja.
DNA-konstruktiota valmistettaessa on välttämätöntä liittää yhteen yksityiset sekvenssit, jotka sulkevat piiriinsä repli-kaatiojärjestelmän, promoottorin, rakennegeenin, johon sisältyvät johdanto- ja prosessointisignaalit, sekä 1 opetussignaalin, edeltä määrätyssä järjestyksessä, jotta varmistutaan siitä, että ne voivat toimia sopivasti syntyvässä plasmidis-sa. Kuten tässä yhteydessä myöhemmin kuvataan, saatetaan käyttää liittäjämolekyylejä varmistamaan sekvenssien sopiva suuntaus sekä järjestys.
IGF I- ja IGF II-geenit, joita käytetään, saattavat olla kromosomaalista DNA:a, cDNA:a, synteettistä DNA:a tai niiden yhdistelmä. Johdanto- ja prosessointisignaalit ovat normaalisti peräisin luonnostaan hiivassa esiintyvistä DNA-sekvens-seistä, jotka ylläpitävät polypeptidin erittymistä. Sellaisiin polypeptideihin, joita hiiva luonnostaan erittää, sisältyvät o(-tekija, a-tekijä, hapan fosfataasi ym.. Jäljelle jää- ..... vät sekvenssit »jotka käsittävät rakenteen johon sisältyvät replikaatiojärjestelmä, promoottori sekä lopetussignaali, ovat hyvin tunnettuja sekä kirjallisuudessa kuvattuja.
- ; Koska erilaiset DNA-sekvenssit, jotka liitetään yhteen kyseessä olevan keksinnön mukaisen DNA-rakenteen muodostami seksi, ovat peräisin erilaisista lähteistä, on tarkoituksen- 4 377S9 raukaista liittää sekvenssit yhdistäjä- tai liittäjämolekyyli-en avulla. Erityisesti voidaan käyttää liittäjiä yhdistämään johdanto- ja prosessointisignaalisekveri;'.:;ia koodaavan säikeen 3 ’ -pää IGF:a koodaavan säikeen 51-päähän yhdessä niiden vastaavien komplementaaristen DNA-säikeiden kanssa. Johdanto- ja prosessointisignaalisekvenssi saatetaan pilkkoa restriktioentsyymin avulla sisäisesti läheltä sen 3'-päätettä niin että siitä puuttuu koodittavan alueen emäsparien ennalta määrätty lukumäärä. Liittäjä voidaan sitten konstruoida siten, että kun johdanto- ja prosessointisekvenssi yhdistetään IGF:a koodittavaan säikeeseen, puuttuvat emäspa-rit annetaan käyttöön ja IGF:a koodittava säie on sopivassa lukuvaiheistuksessa johdantojakson suhteen. Synteettinen IGF:a koodittava alue ja/tai liittäjä sen ^'-päässä antaa käyttöön translationaaliset pysäytyskodonit sen seikan varmistamiseksi, että polypeptidin C-pääte on sama kuin luonnossa esiintyvä C-pääte.
Liittäjillä tulee olemaan 5-40 emästä, useammin noin 8-35 emästä, koodittavassa sekvenssissä, ja niillä voi olla joko liimautuvat tai tasapäät, liimautuvien päiden ollessa edullisia. On toivottavaa, että adaptorin päätteellä tulee olemaan liimautuvat päät, jotka liittyvät erilaisiin restriktioent-syymeihin, niin että liittäjä selektiivisesti kytkee kaksi erilaista DNA-sekvenssiä, joilla on sopivat, komlementaari-.!:* set, liimautuvat päät.
: Kyseessä olevaa keksintöä valaistaan synteettisten fragment- .-··· tien avulla, jotka koodittavat IGF I:a sekä IGF II:a, jotka liittyvät hiivan <?c-tekijän johdanto- ja prosessointisignaa-leihin. Hiivan σθ-tekijä saatetaan katkaista HindiII:11a sekä Salli:11a. Hindlll pilkkoo c<-tekijän prekursorin pro-sessointisignaalissa pilkkoen Glu-kodonin koodaussäikeessä 3'-kohdan toiseen emäkseen saakka, samalla kun HindiII:n tunnistussekvenssi täydentää Glu-kodonia, koodittaa alaninia sekä antaa käyttöön kypsän -tekijän aminoterminaalisen 5 87799 trp-kodonin ensimmäisen 5'-emäksen. & -tekijän geenin transkription suunnan johdosta Sali-kohta on paikannettu transkriptionaalisen lopetussignaalin yläpuolelle.
IGF:a koodittavi11a synteettisillä geeneillä on nukleotidi-sekvenssit, jotka perustuvat IGF I sekä IGF II polypeptidien tunnettuihin aminohapposekvensseihin. Synteettiset sekvenssit käyttävät mieluummin kodoneja, joita hiivaisäntä ensisijaisesti käyttää hyväksi, esim. hiivan glykolyyttisiä entsyymejä koodittavissa geeneissä esiintyvien kodonien taajuuden perusteella. Synteettinen sekvenssi sisältää sopivasti liimautuvia päitä pikemmin kuin tasapäitä kloonaavassa siirtäjässä sijaitsevaan restriktiokohtaan tapahtuvaa insertiota varten. Lisäksi, restriktiokohdat laaditaan synteettisiin sekvensseihin mykkiä mutaatioita käyttämällä, fragmenttien tuottamiseksi, joita saatetaan lämpökäsitellä sekvensseiksi, jotka voivat valmistaa IGF I/IGF II-hybridipeptidiraole-kyylejä.
Esimerkeissä annetaan käyttöön synteettisiä fragmentteja, joissa on EcoRI:a varten liimautuvat päät ja jotka on inser-toitu pBR328:ssa sijaitsevaan EcoRI-kohtaan. Tavallisesti synteettinen sekvenssi sisältää muita restriktiokohtia, jotka sijaitsevat proksimaalisesti polypeptidiä koodittavan alueen kunkin pään suhteen. Valitaan sellaiset sisäiset restriktiokohdat, että saadaan koodausalue tarkasti leikat-: tua kloonaavasta siirtäjästä ja liittäjiin yhdistämistä varten, niin että lopullinen DNA-rakenne, joka sisältää johdanto- ja prosessointisignaalit sekä koodittavan alueen, ovat sopivassa lukuvaiheistuksessa sekä sopivassa rinnakkals-asemassa transkription lopetussignaaliin nähden. Mieluummin . , restriktiokohdi11a tulee olla tunnistussekvenssihaara pilk- ' koutumiskohdasta, jossa pilkkoutuminen on suunnattu proksimaalisesti koodausalueeseen nähden ja tunnistuskohta on : . hävinnyt. Tämä tekee mahdolliseksi pilkkoutumisen tarkasti koodausalueen kussakin päässä nukleotidisekvenssistä huoli- 6 37799 matta. Hgal-kohdat on annettu käyttöön esimerkeissä.
Synteettistä geeniä valmistettaessa, tavanomaisin tekniikoin valmistetaan päällekkkäin menevät yksisäikeiset DNA (ssDNA)-fragmentit. Sellaiset ssDNA-fragmentit tulevat tavallisesti olemaan pituudeltaan 10-40 emästä. Vaikka saatetaan käyttää huomattavasti pitempiä fragmentteja, synteesin saanto vähenee ja tulee vaikeammaksi varmistaa, ettei sopiva sekvenssi ole tuotamuksellisesti huonontunut tai muuttunut. Sen jälkeen kun ssDNA-fragmentit on syntetisoitu, ne yhdistetään lämpökäsittelyolosuhteissa komplementaarisen eraäsparin kanssa sopivan järjestyksen varmistamiseksi. Sitten fragmenttien päät sidotaan, ja syntyvä synteettinen fragmentti kloonataan sekä suoritetaan geenin monistuminen, tavallisesti bakteeri-isännässä, kuten esim E.colissa. Kuten aiemmin on ilmaistu, synteettinen rakennegeeni saattaa olla varustettu liimautuvin päin, jotka ovat komplementaariset sopivalle restriktiokohdalle kyseessä olevassa kloonaavassa siirtäjässä (vektorissa) sekä sisäisissä tunnistuskohdissa, jotka sallivat koodaavan alueen tarkan poistamisen. Synteettisten sekvenssien kloonauksen sekä monistumisen jälkeen saatetaan poistaa sekvenssien käyttökelpoisia määriä, tavallisesti IGF:a koodaavan alueen kummassakin päässä sijaitsevissa sisäisissä restriktiokohdissa.
• · ·
Promoottori, jota käytetään, saattaa olla liitetty johdanto-\ jaksoon ja prosessontisekvenssiin. Tällä tavalla saatetaan antaa käyttöön 5'-siirrettävä tekijä, joka sisältää sekä promoottorin että johdanto jakson sopivassa avaruussuhteessa *·1·. tehokkaan transkription suhteen. Sisällyttämällä lisäksi transkriptionaalinen lopetussignaali, luodaan "kasetti", joka sisältää promoottorin/johdanto-restriktiokohdan (-koh-’· dat)-lopetussignaalin, jossa IGF:a koodaava alue saattaa • ‘ ' olla insertoitu Uittajien avulla. Tavallisesti sellaisia "kasetteja" saatetaan saada eristämällä DNA-fragmentti, joka sisältää hiivaisännästä peräisin olevan intaktin geenin sekä · * · · geenin ylä- että alapuolisen transkription säätelysekvens- sit, joissa geeni ekspressoi polypeptidin, jonka isäntä erittää.
7 37799
Vaihtoehtoisesti voidaan korvata luonnossa esiintyvä hiiva-promoottori muilla promoottoreilla, jotka ottavat huomioon transkription säätelyn. Tämä edellyttää alueen sekvenssi-ja/tai restriktiokartoitusta säätelysekvenssin yläpuolella, erilaisen promoottorin liittämiseksi. Joissakin tapauksissa saattaa olla toivottavaa säilyttää luonnossa esiintyvä hiiva-promoottori ja antaa käyttöön toinen promoottori, joka sijaitsee peräkkäin, joko ylä- tai alapuolella luonnossa esiintyvästä hiivan promoottorista.
Monia erilaisia promoottoreita on käytettävissä tai voidaan saada hiivan geeneistä. Erityisen mielenkiintoisiin promoot-toreihin sisältyvät promoottorit, jotka kytkeytyvät glyko-lyyttisen metuboliatien entsyymeihin, kuten esimerkiksi promoottorit alkoholidehydrogenaasia, glyseraldehydi-ö-fos-faattidehydrogenaasia, pyruvaattikinaasia, trioosifosfatti-isomeraasia, fosfoglukoisoraeraasia, fosfofruktoosikinaasia, jne. varten. Käyttämällä näitä promoottoreita säätelysekvens-sien, kuten esimerkiksi lisääjien operaatoreiden jne. kanssa sekä käyttämällä isäntää, jolla on koskematon säätelysekvens-si, voidaan säädellä prosessoidun "pre"-IGP:n ekspressiota. 7'·'; Täten saatetaan käyttää erilaisia, pieniä, orgaanisia : molekyylejä, esim. glukoosia, halutun polypeptidin valmistuk- -··: sen säätelyyn.
Saatetaan käyttää myös lämpötilalle herkkiä säätelymutantte-ja, jotka tekevät mahdolliseksi transkription moduloinnin - . lämpötilaa vaihtelemalla. Täten kasvattamalla solut ei-salli- vassa lämpötilassa, ne voidaan kasvattaa suureen tiheyteen, ennen kuin lämpötilaa muutetaan, jotta saadaan "pre"-polypep-: : tidien ekspressio IGF I:a ja IGF II:a varten.
8 8 7 7 9 9
Muita mahdollisuuksia voidaan myös sisällyttää rakenteeseen. Esimekiksi jotkut geenit huolehtivat monistumisesta, jolloin stressin kohdistuessa isäntään, ei ainoastaan geeni, joka vastaa stressiin, monistu, vaan myös reunustavat alueet. Sijoittamalla sellainen geeni promoottorin koodausalueen sekä muiden säätelysignaaleiden yläpuolelle, jotka antavat käyttöön "pre"-polypeptidin transkription kontrollin, saatetaan saada plasmideja, joissa on suuri määrä toistuvia sekvenssejä, joihin sisältyy "pre"-polypeptidigeeni säätelysek-vensseineen. Valaiseviin geeneihin kuuluvat metallotioniee-nit sekä dihydrofolaattireduktaasi.
Säätelysekvenssi-fragmentin lisäksi rakenne saattaa sisältää muuta, isännän perintöainekselle homologista DNA:a. Jos halutaan IGF-geenin integraatiota kromosomiin (kromosomeihin), voidaan integraatiota lisätä hankkimalla IGF-geenikonstrukti-oita reunustavia sekvenssejä, jotka ovat homologisia isännän kromosomaalisen DNA:n kanssa.
Hiivaisännän tulee tunnistaa replikaatiojärjestelmä, jota käytetään. Sen tähden on toivottavaa, että replikaatiojärjes-telmä kuuluu luonnostaan hiivaisäntään. Botstein ert a2L. , ne (1979) 8:17-24, ovat tehneet selkoa monista hiivavektoreis-ta. Erityisen mielenkiintoisia ovat YEp-plasmidit, jotka sisältävät 2 ^m-plasmidin replikaatiojärjestelmän. Näitä plasmideja säilytetään pysyvästi moninkertaisina kopioina.
• Vaihtoehtoisesti tai. lisäksi saatetaan käyttää ARS1 :n sekä ....: CEN4:n yhdistelmää pysyvää säilyttämistä varten.
Kunkin käsittelyn jälkeen rakenne saatetaan kloonata, niin että haluttu rakenne, saadaan puhtaana ja riittävässä määrin . . jatkokäsittelyä varten. Haluttaessa saatetaan käyttää sukku-lavektoria (se on vektoria, joka käsittää sekä hiiva- että ' bakteerialkuperää olevan replikation), niin että kloonaus voidaan suorittaa prokaryooteissa, erityisesti E^_ colilla.
• » 9 87799
Plasraidit saatetaan viedä hi ivaisäntään millä taliansa tavallisella keinolla, käyttämällä isäntäsoluja tai sferoplasteja sekä käyttämällä kalsiumilla saostettua DNA:ta transformaatioon tai liposomeja tai muita tavanomaisia menetelmiä. Modifioidut isännät saatetaan valita geneettisten markkerei-den mukaisesti, joita tavallisesti on vektorissa, jota käytetään ekspressioplasmidin konstruktioon. Saatetaan käyttää auksotrofista isäntää, jossa plasmidilla on geeni, joka täydentää isäntää ja saa aikaan prototrofiän. Vaihtoehtoisesti voidaan plasmidiin sisällyttää markkerina resistenssi sopivalle biosidille, esim. antibiootille, raskasmetallille, myrkylle tms. Valinta saatetaan sitten suorittaa käyttämällä elatusainetta, joka kuormittaa kantasoluja niin, että voidaan valita solut, jotka sisältävät plasmidin. Plasmidin sisältävät solut saatetaan sitten kasvattaa sopivassa elatus-aineessa, ja haluttu, eritetty polypeptidi eristetään tavanomaisin menetelmin. Polypeptidi saatetaan puhdistaa kromato-grafian, suodatuksen, uuttamisen jne. avulla. Koska polypeptidi tulee olemaan elatusaineessa kypsässä muodossa, elatus-ainetta voidaan kierrättää jatkuvasti poistamalla haluttu polypeptidi.
Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on valaista eikä rajoittaa keksintöä.
• · · : ·.* Kokeellinen osa ____: Nukleotidisekvenssit ihmisen insuliinin kaltaisia kasvuteki- joitä I ja II (IGF I ja II) varten, sisältäen edullisia hii-van kodoneita, suunniteltiin aminohapposekvenssien perusteella, joista raportoidaan Rinderknechtin ja Humbelin julkaisussa (1978), J. Biol. Ghem. 253:2769-2776 sekä Rinderknechtin - ja Humbelin julkaisussa (1978), FEBS Letters 89:283-286. 3ek- *· ' venssit (koodittavat säikeet, jotka on esitetty 5*:sta 3':iin) ovat seuraavat: 37799
IGF I
* Hood i t ta va a. J uu
AsnSc rTh rl.ruMc t GlyProGluThrLeuCy sGlyAlaGl uLcuVa lAspAl aLeuGl o 5'-AATTCGÄCGCTTATCGGTCCAGAAACCTTGTGTGGTGCTGAATTGGTCGATGCTTTGCAA GCTGCGAATACCCAG^rCTTTGGAACACACCACCACTTAACCAGCTACGAAACGTT EcoRI Hgal
PhcValCysGlyAspArgGlyPbeTyrPheAsnLysProThrGlyTyrGlySerSerSer
TTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCAACAAGCCAACCGGTTACGGTTCTTCTTCT
AAGCAAACACCACTGTCTCCAAAGATGAAGTTGTTCGGTTGGCCAATGCCAAGAAGAAGA
ArgArgAlaProGlnThrGIylleValAspGluCysCysPheArgSerCysAspLeuArg AGAAGAGCTCCACAAACCGGTATCGTTGACGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTGAGA TCTTCTCGAGGTGTTTGGCCATAGCAACTGCTTACAACAAAGTCTAGAACACTGAACTCT
HgaI EcoRI
ArgLeuGlufletTryCysAlaProLeuLysProAlaLysSerAlaOP MetArgArg AGATTGGAAATGTACTGTGCTCCATTGAAGCCAGCTAAGT CTGCTTGAATGCGTCG-3’ TCTAACCTTTACATGACACCAGGTAACTTCGGTCGATTCAGACCAACTTACGCAGCTTAA
Koodittava alue «j
IGF II
* Koodittava alue
AsnSerThrLeuMet AlaTyrArgProSerGluThrLeuCysGlyGlyGluLeuValAsp 5'-AATTCGACGCTTATCGCTTACAGACCATCCGAAACCTTGTGTGGTGGTGAATTGGTCGAC
|gctgcgaataccgaat]gtctggtaggctttggaacacaccaccacttaaccagctg
EcoRI Hgal * t* ThrLeuGloPheValCysGlyAspArgGlyPheTyrPheSerArgProAlaSerArgVal
- -.I ACCTTGCAATTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCTCCAGACCAGCTTCCAGAGTT
: TGGAACGTTAAGCAAACACCACTGTCTCCAAAGATGAAGAGGTCTGGTCGAAGGTCTCAA
SerArgArgSerArgGlylleValGluGluCysCysPheArgSerCysAspLeuAlaLeu TCTAGAAGATCCAGAGGTATCGTTGAAGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTGGCTTTG :Vt AGATCTTCTAGGTCTCCATAGCAACTTCTTACAACAAAGTCTAGAACACTGAACCGAAAC
Hgal EcoRI
’· ** LeuGluThrTyrCysAlaThrProAlaLysSerGluOP MetArgArg ' TTGGAAACCTACTGTGCTACCCCAGCTAAGT CTGAATGAATGCGTCG-3’
- AAr.CTTTGGATGArACGATGGGGTCGATTCAGACTI ACTTACGCAGCTTAA
·’ ’ _______nr
Koodittava alue ♦! " 87799 S e k v e n g n c issn on EcoRI liimautuvat päät kummassakin päässä . IGF I:n koodaus alkaa koodi ttavan säikeen emäksestä: 16 ja päättyy emäkseen 225· Hgal restriktiokohdat sijaitsevat IGF I:a koodittavan alueen kummassakin päässä. Hgal:n tunnistus-kohdat (5'-GACGC-3') sijaitsevat IGF I:a koodittavan alueen ulkopuolella, so. synteettisen sekvenssin pään ja Hgal pilk-komiskohdan välissä. IGF II synteettinen sekvsnssi on konstruoitu samalla tavalla siten, että koodittava säie alkaa emäksestä 16 ja päättyy emäksen 219 kohdalla.
Synteettinen DNA-fragmentti IGF J:a varten, jolla on sekvenssi, jota on juuri kuvattu IGF I:n suhteen, valmistettiin syntetisoimalla 20 limittäistä DNA-segmenttiä käy ttr-imäl ] ä fosforamidiittimenetelmaä (katso käsittelyn alaisena olevaa hakemusta, sarja no. 457,412, jätetty tammikuun 12 päivänä, -85)· ssDNA-sekvenssit olivat seuraavat:
Nimitys Sekvenssi
A AATTCGACGCTTATGG
B-I-l GTCCAGAAACCTTGTGTGGT
C-I-2b GCTGAATTGGTC
C-I-2a GATGCTTTGCAATTCGT
D TTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTC
i-3 aacaagccXaccggttacggttcttcttc
E-I-4 TAGAAGAGCTCCACAAACCGGTATCGTT
F-I-5 GACGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTG
.;]* G-1-6 AGAAGATTGGAAATGTACTGTGCT
1-7 CCATTGAAGCCAGCTAAGTCT
: H-1-8 GCTTGAATGCGTCG
...: J-I-9 GTTTCTGGACCCATAAGCGTCG
K-I-10 AAAGCATCGACCAATTCAGCACCACACAAG
77 L CTCTGTCACCACAAACGAATTGC
M-I-ll AACCGGTTGGCTTGTTGAAGTAGAAAC
1-12 TGGAGCTCTTCTAGAAGAAGAACCGT
1-13 GAAACAACATTCGTCAACGATACCGGTTTG
::: N-1-14 CCAATCTTCTCAAGTCACAAGATCT
Γ: 1-15 GGCTTCAATGGAGCACAGTACATTT
·*; 1-16 AATTCGACGCATTCAAGCAGACTTAGCT
12 87 799 ssDNA-segmentit yhdistettiin seuraavasti: 50 pikomoolia kutakin segmenttiä, paitsi A:a sekä 1-16:a ‘5 '-fosfo ryloi t i i n T4-polynukleotidikinaasilla. Sitten 50 pikomoolia kaikkia segmenttejä lämpokäsiteitiin yksinkertaisessa vaiheessa 18 ^ul:n yhteispanoksena jäähdyttämällä 95°C:sta 25°C:een 1,5 tunnin kuluessa. Sidonta saatiin aikaan 50pl:n reaktiotilavuudessa, joka sisälsi 1mM ATP:tä, 1OmM DTT:tä, 1OOmM tris-HCl:ää, pH 7,8, 1 OmM MgCl2:a, 1ug/ml spermidiiniä sekä T4-ligaasia. Tarkoituksenmukainen, kaksi-säikeinen fragmentti, joka syntyy kuvassa 1 esitettyjen fragmenttien ryhmityksestä ja pariutumisesta, puhdistettiin 7 ^ puhdasta polyakryyliamidia sisältävällä elektroforeesi-geelillä.
Kuva 1 IGF Iin lämpökäsittely ja sidontakaavio 5. A B-II-1 C-1 - 2b C-!-2a D 1-3 . E-1-4 · F-I-5 G-I-6 1-7 · H-I_-8 + 3·---- - ---' - - J-I-9 K-I-10 L 1-11 1-12 1-13 H-I-14 1-15 1-16 IGF II:a varten DNA-sekvenssi syntetisoitiin samalla tavalla. Valmistettiin seuraavat ssDNA-lisäfragmentit. Nimitys Sekvenssi
B-II-1 CTTACAGACCATCCGAAACCTTGTGTGGT
C-II-2 GGTGAATTGGTCGACACCTTGCAATTCGT
11-3 TCCAGACCAGCTTCCAGAGTTTCT
E-II-4 AGAAGATCCAGAGGTATCGTT
F-II-5 GAAGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTG
G-II-6 GCTTTGTTGGAAACCTACTGTGCT
H-II-7 ACCCCAGCTAAGTCTGAATGAATGCGTCG
v.: J-II-8 GTTTCGGATGGTCTGTAAGCCATAAGCGTCG
K-II-9 AAGGTGTCGACCAATTCACCACCACACAAG
M-II-10 AAGCTGGTCTGGAGAAGTAGAAAC
:- ’ 11-11 CTGGATCTTCTAGAAACTCTGG
11-12 GAAACAACATTCTTCAACGATAC CT
7' ' N-11-13 TTCCAACAAAGCCAAGTCACAAGATCT
: · · ·: 11-14 AGACTTAGCTGGGGTAGCACAGTAGGT
I'-'; 11-15 AATTCGACGCATTCATTC
i3 37799 200 pikomoolia näitä ssDNA-fragmentteja sekä fragmentteja A, D sekä L yhdistettiin samalla tavalla kuin edellä on esitetty, jolloin A ja 11-15 eivät olleet fosforyloituja ja tuloksena oli seuraava segmentt,ien järjestys ja pariutuminen.
Kuva 2 IGF II;n lämpökäsittely ja sidontakaavio c, A 8-1I-1 C-I1-2 D I1-3 E-II-4 F-II-5 G-II-6 H-II-7 i> - - - - - ---- 3 + 3’ -- ------ - - 5' J-II-8 K-Il-9 L Μ-Π-10 11-11 11-12 N-II-13 11-14 11-15
Synteettiset DNA-sekvenssit liitettiin pBR328:n EcoRI-koh-taan plasmidien p328IGF I:n ja p328IGF II:n valmistamiseksi. Kloonauksen jälkeen IGF:a koodittavat säikeet leikattiin käyttäen Hgal:a
Synteettiset oligonukleotidiliittäjät sidottiin Hgal-restrik-tiofragmentteihin. IGF I:ä varten liittäjillä oli seuraavat sekvenssit: a) 5'-AGCTGAAGCT-3' 3'-CTTCGACCAGG-5' b) 5’-CTGCTTGATAAG-3' 3 ' -ACTATTCAGCT-5 ' : Mitä tulee koodittavan säikeen suuntaukseen, ensimmäisen ____: liittäjän a) 3'-pää on komplementaarinen 5' Hgal-pilkkoutu- miskohdalle IGF I:n synteettisessä sekvenssissä, samalla kun "ä ensimmäisen liittäjän 5'-pää saa Hindlll liimautuvan pään.
‘ Toinen liittäjä b) on komplementaarinen 5'-päästään IGF I
sekvenssin 5'-päässä sijaitsevalle Hgal pilkkoraiskohdalle, '· samalla kun liittäjän 3' -pää antaa käyttöön Pali tarttuvan ·.· ' pään.
14 87799 TGF ΤΙ :11ο 1 i i ttäj 1.11 ä ori rpu rrmvat sek vonssi 1..
c) 5'-AGCTGAGAAGCT-3' 3 '-CTTCGACGAAT-5' d) 5'-CTGAATGATAAG-3' 3 '-ACTATTCAGCT-5'
Suuntauksen ollesso kuten edellä, ensimmäinen liittäjä c) on komplementaarinen 3'-päästään IGF II synteettisessä sekvenssissä sijaitsevalle 5'-Hgal pilkkoutumiskohdalle, kun taas 5'-pää antaa käyttöön Hindi11 liimautuvan pään. Toinen liit— täjä d) on ^'-päästään komplementaarinen IGF TI synteettisessä sekvenssi ssä sijaitsevalle toiselle H f,ai pi I kkoutuin i .'-.kohdalle ja antaa 3'-päässään käyttöön SalI liimautuvan pään.
Synteettiset fragmentit ja niihin yhdistetyt liittäjät puhdistettiin preparatiivisella geelielektroforeesilla sekä sidottiin 100 ng:aan pAB113:a, joka aiemmin oli uutettu täydellisesti endonukleaaseilla Hindlll sekä Sali:llä. pAB113 saatiin pAB112:sta poistamalla kolme 63 pb HindiII fragmenttia. pAB112 on plasmidi, joka sisältää 1,8 kb EcoRI-fragmen-tin hi ivan Λ-tekijägeenin kanssa, joka on kloonattu pBR322:n EcoRI kohdassa, josta HindiII sekä Sali kohdat on poistettu. pAB112 johdettiin plasmidi pAB101:stä, joka sisältää hiivan •(.-tekijän geenin osittnisenn SauöA fragmenttina, joka on kloonattu plasmidi YEp24:n Burn Hl-kohdassa. pAB1 01 saatiin ‘I". seulomalla YEp24:ssä kloonattu hiivan genomikokoelma käyttä- / .* mällä entsymaattisesti P32;na radiomerkattua, synteettistä ·** | oligonukleotidimallia, joka oli homologinen julkaistulle o(-tekijää koodittavalle alueelle (Kurjan ja Herskowitz, Abstracts 1981 Cold Spring Harbor Meeting on the Molecular Biology of Yeast, sivu 242).
Syntyviä seoksia käytettiin transformoimaan E^ coli HB 101 soluja, ja saatiin plasmidit pAB113-IGF-I sekä pAB113-IGF-II vastaavasti IGF I:a sekä IGF II:a varten.
» · * * · » · • i · • · · 15 87 799
Plasmidit pAB113-IGF-I sekä pAB113-IGF-II (5 pg kumpaakin), joissa oli vastaavasti rakonnegeenit IGF I ja IGF Tl, pilkottiin täydellisesti EcoRI: i 1 ä , ja syntyvät fragmentit, yhdistettiin ylimäärään EcoRI-BamHI liittäjiä ja uuta'tti i n BamHI:n kanssa. Syntyvät 1,8 kb BamHI fragmentit eristettiin preparatiivisen geelielektroforeesin avulla, ja noin 100 ng kutakin fragmenttia sidottiin 100 ngraan pCl/l:a, joka aiemmin oli pilkottu täydellisesti BamHI:1lä sekä käsitelty alkalisella fosfataasilla.
Plasmidi pCl/l on pJDB219:n johdannainen, Beg,gs, Nature (1978) 275:104, jossa pJDB219:ssä sijaitsevaa bakteeriperäistä plasmidia pMB9 vastaava alue on syrjäytetty pCl/l:ssä sijaitsevalla pBR322:lla. Kutakin sidontaseosta käytettiin transformoimaan coli HB 101:n soluja. Transformantit valittiin ampisilliiniresistenssin perusteella, niiden plasmidit analysoitiin restriktioendonuklsaasiuuton avulla. Valmistettiin DNA, joka oli peräisin kutakin rakennegeeniä IGF I tai IGF 11 (pYIGF-I-10/1) varten vastaavasti valitusta kloonista, ja sitä käytettiin transformoimaan hiivan AB103 soluja. Transformaatit valittiin niiden Leu+-fenotyypin perusteella.
Kaksi hiivakannan AB103 («,pep 4-3, 2-3, leu 2-112, ura . 3-52, his 4-580), jotka oli transformoitu plasmidilla • * · ——— ··· ( pYIGF-I-1 0/1 ) , viljelmää (5 ja 9 litraa) kasvatettiin " 30°C:ssa, -leu-väliaineessa, kyllästykseen asti (optinen : tiheys 650 nm:ssä 5) ja jätettiin ravistellen 30°C:een vielä 12 tunnin mittaiseksi ajaksi. Solusupernatantit koottiin *:* kustakin viljelmästä sentrifugoiden, ja IGF konsentroitiin absorboimalla ioninvaihtohartsiin (Biorex-70 on saatavissa Bio-Rad Laboratories, Inc.rltä Richmond, Kalifornia). Gon : jälkeen kun oli eluoitu 80 öiseen etanoliin valmistetulla 10 mMrlla HClrlla, IGF I-jakeet (0,4 ml ja 3 ml vastaavasti) määritettiin kokonaisproteiinikonsentraation ja IGF I ‘ konsentraati on suhteen. Protei inimääri tys suoritettiin 16 87799
Coomassie Blue:lla, jota on saatavissa Bio-Rad Laboratories, Inc.:Itä Richmond, Kalifornia. TGF I-määritys oli tavanomainen kompetitiivinen radioimmunologinen määritys, jossa käytettiin radiomerkattua TGF T:a. Tulokset olivat seuraavat:
Tilavuus konsent- Kokonais-
Tutkimus no Tilavuus roinnin jälkeen proteiini IGF I.
1 5 1 0,4 ml 5,0 mg/ml 3,75 mg/ml 2 91 3,0 ml ?,9 mg/ml 3,00 mg/ml IGF I:n biologinen määritys, joka perustuu peptidin synergis-tiseen vaikutukseen kyyhkysenkupuvasteen lisäämiseksi prolaktiinille Anderson et ai. (1983), kirjassa Somatomedins/ Insu-lin-Like Growth Factors, Spencer, E.M., Toimittaja Walter deGruter, Berliini), ilmaisee, että näiden valmisteiden IGF I tuotteella, on aktiivisuutta, joka on samanarvoista autenttisen IGF I:n kanssa, joka on eristetty ihmisen seerumista.
AB103(pYIGF-II-10/1):n viljelmät, jotka oli kasvatettu edellä kuvatulla tavalla sekä määritetty käyttämällä ihmisen istukan membraanin radioreseptorimääritystä (Spencer et ai. (1979) Act. Endocrinol. 91:36-48) IGF II:n suhteen, osoittivat 3,9 yksikköä/ml, kun ihmisen normaali seerumissa on 1 yksikkö/ml.
• « » «·· • · . *: Kyseessä oleva keksintö antaa käyttöön uusia rakenteita, jot- ' ka saatetaan liittää vektoreihin ihmisen insuliinin kaltai- : "· non kasvutekijä I:n ekspressiota varten valmistuksen ja ori t- ·; tymisen aikaansaamiseksi. Täten voidaan saada polypoptid i , ;*; jolla mi identtinen sekvenssi luonnossa esiintyvän, ihmisen insuliinin kaltaisen kasvutekijä l:n kanssa. Käyttöön saadun .·. ; erittymisen johdosta voidaan saada lisääntyneitä saantoja *..) solupopulaatioon perustuen, ja seuraavat preparatiiviset toi minnot ja puhdistus ovat yksinkertaistettuja.
• · · - I* · « · · » ·» π 87799
Vaikka edellä esitettyä keksintöä on kuvattu yksityiskohtaisesti valaisemalla sitä esimerkein, jolloin tarkoituksena on ollut selventää keksintöä, on ilmeistä, että käytännössä saatetaan toteuttaa tiettyjä muutoksia liitteenä olevien patenttivaatimusten puitteissa.
» » • » im· j · m 1 • *· m
Claims (2)
18 87799 1* Menetelmä ihmisen insuliinin kaltaisen kasvutekijän (IGF) tuottamiseksi, tunnettu siitä, että kasvatetaan hiivaa, joka sisältää toiminnallisen DNA-rakenteen, joka sisältää geenin, joka koodaa seuraavaa aminohapposekvenssiä: GlyProGluThrLeuCysGlyAlaGluLeuValAspAlaLeuGln PheValCysGlyAspArgGlyPheTyrPheAsaLysProThrGlyTycGlySerSerSer ArgArgAlaProGlnThrGlylleValAspGluCysCysPheArgSerCysAepLeuArg ArgLeuGluMetTyrCysAlaProLeuLysProAlaLysSerAla tai • · AlaTyrArgProSerGluThrLeuCysGlyGlyGluLeuValAsp ThrLeuGlnPheValCysGlyAspArgGlyPheTyrPheSerArgProAlaSerArgVal SerArgArgSerArgGlylleValGluGluCysCysPheArgSerCysAspLeuAlaLeu LeuGluThrTyrCysAlaThrProAlaLysSerGlu liitettynä sopivaan lukuvaiheistukseon hiivan tunnistamien DNA- 19 87799 sta koodaavien erityksen ohjaaja- ja prosessointisignaalisek-venssien kanssa rakennegeenin muodostamiseksi hiivan kanssa yhteensopivassa vektorissa sijaitsevan transkription aloitusalu-een alapuolelle ja transkription säätelyn alaiseksi, ja että eristetään hiivasta sen insuliinin kaltainen kasvutekijä.
2. Rekombinantti DNA, tunnettu siitä, että se koodaa insuliinin kaltaista kasvutekijää, edullisesti hiivassa, nukle-1 otidisekvenssin ollessa: 5' -GGTCCAGAAACCTTGTGTGGTGCT6AATTGGTCGATGCTTTGCAA CCAGGTCTTTGGAACACACCACGACTTAACCAGCTACGAAACGTT TTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCAACAAGCCAACCGGTTACGGTTCTTCTTCT AAGCAAACACCACTGTCTCCAAAGATGAAGTTGTTCGGTTGGCCAATGCCAAGAAGAAGA AGAAGAGCrCCACAAACCGGTATCGTTGACGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTGAGA TCTTCTCGAGGTGTTTGGCCATAGCAACTGCTTACAACAAAGTCTAGAACACTGAACTCT AGATTGGAAATGTACTGTGCTCCATTGAAGCCAGCTAAGTCTGCT-3' TCTAACCTTTACATGACACGAGGTAACTTCGGTCGATTCAGACGA - -tai 5' -GCTTACAGACCATCCGAAACCTTGTGTGGTGGTGAATTGGTCGAC CGAATGTCTGGTAGGCTTTGGAACACACCACCACTTAACCAGCTG ACCTTGCAATTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCTCCAGACCAGCTTCCAGAGIT TGGAACGTTAAGCAAACACCACTGTCTCCAAAGATGAAGAGGTCTGGTCGAAGGTCTCAA TCTAGAAGATCCAGAGGTATCGTTGAAGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTGGCTTTG ... - AGATCTTCTAGGTCTCCATAGCAACTTCTTACAACAAAGTCTAGAACACTGAACCGAAAC TTGGAAACCTACTGTGCTACCCCAGCTAAGTCTGAA-3' AACCTTTGGATGACACGATGGGGTCGATTCAGACTT 20 87799 KRAV
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US48795083A | 1983-04-25 | 1983-04-25 | |
US48795083 | 1983-04-25 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI841524A0 FI841524A0 (fi) | 1984-04-16 |
FI841524A FI841524A (fi) | 1984-10-26 |
FI87799B true FI87799B (fi) | 1992-11-13 |
FI87799C FI87799C (fi) | 1993-02-25 |
Family
ID=23937779
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI841524A FI87799C (fi) | 1983-04-25 | 1984-04-16 | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulinlik tillvaextfaktor (igf) |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6642029B1 (fi) |
EP (2) | EP0561137B1 (fi) |
JP (2) | JP2548105B2 (fi) |
AT (2) | ATE220101T1 (fi) |
AU (1) | AU576757B2 (fi) |
DE (2) | DE3486491T2 (fi) |
DK (1) | DK204584A (fi) |
ES (1) | ES8505412A1 (fi) |
FI (1) | FI87799C (fi) |
HK (1) | HK65594A (fi) |
HU (1) | HU204565B (fi) |
IE (2) | IE60228B1 (fi) |
IL (1) | IL71634A (fi) |
NO (1) | NO174302C (fi) |
NZ (1) | NZ207842A (fi) |
PT (1) | PT78484B (fi) |
ZA (1) | ZA842982B (fi) |
Families Citing this family (55)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
US7198919B1 (en) | 1983-04-25 | 2007-04-03 | Genentech, Inc. | Use of alpha factor sequences in yeast expression systems |
US4588684A (en) * | 1983-04-26 | 1986-05-13 | Chiron Corporation | a-Factor and its processing signals |
IL71991A (en) * | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
JPS60501989A (ja) * | 1983-08-10 | 1985-11-21 | アムジエン | インシュリン様成長因子の微生物発現 |
WO1985000831A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of insulin-like growth factor |
US4758512A (en) * | 1984-03-06 | 1988-07-19 | President And Fellows Of Harvard College | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
DK108685A (da) * | 1984-03-19 | 1985-09-20 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Vaekstfaktor i |
US4738921A (en) * | 1984-09-27 | 1988-04-19 | Eli Lilly And Company | Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products |
JP2549504B2 (ja) * | 1984-12-21 | 1996-10-30 | ア−ス製薬株式会社 | Dna塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 |
US5242811A (en) * | 1985-03-26 | 1993-09-07 | Biogen, Inc. | Production of human somatomedin C |
GB8507833D0 (en) * | 1985-03-26 | 1985-05-01 | Biogen Nv | Production of human somatomedin c |
US5342921A (en) * | 1985-03-28 | 1994-08-30 | Chiron Corporation | Superoxide dismutase fusion polypeptides for expression of mammalian proteins |
EP0196056B1 (en) * | 1985-03-28 | 1991-05-22 | Chiron Corporation | Improved expression using fused genes providing for protein product |
US4751180A (en) * | 1985-03-28 | 1988-06-14 | Chiron Corporation | Expression using fused genes providing for protein product |
US4783524A (en) * | 1985-09-17 | 1988-11-08 | Monsanto Company | Growth factors |
ATE67243T1 (de) * | 1985-10-21 | 1991-09-15 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Verfahren zur herstellung von insulinaehnlichem wachstumsfaktor i (igf-i) und plasmid zu dessen herstellung. |
GB8529014D0 (en) * | 1985-11-25 | 1986-01-02 | Biogen Nv | Enhanced secretion of heterologous proteins |
EP0234862A3 (en) * | 1986-02-28 | 1988-10-05 | Merck & Co. Inc. | Expression of recombinant proteins in yeast |
EP0234871A3 (en) * | 1986-02-28 | 1988-10-12 | Merck & Co. Inc. | Regulatable expression of recombinant proteins in yeast |
JPH0616716B2 (ja) * | 1986-10-14 | 1994-03-09 | 塩野義製薬株式会社 | 酵母におけるヒトpstiの製造法 |
DE3726655A1 (de) * | 1987-08-11 | 1989-02-23 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung basischer proteine aus proteingemischen, welche solche basischen proteine enthalten |
GB8723660D0 (en) * | 1987-10-08 | 1987-11-11 | British Bio Technology | Synthetic gene |
CA1340772C (en) * | 1987-12-30 | 1999-09-28 | Patricia Tekamp-Olson | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences |
US4988675A (en) * | 1988-02-05 | 1991-01-29 | Ciba-Geigy Corporation | Method for preventing secondary effects |
DE68905203T2 (de) * | 1988-02-05 | 1993-07-22 | Ciba Geigy Ag | Verwendung von igf i zur herstellung eines praeparates fuer die behandlung von nierenkrankheiten. |
GB8819826D0 (en) * | 1988-08-20 | 1988-09-21 | Kabivitrum Ab | Glycosylated igf-1 |
GB8927008D0 (en) * | 1989-11-29 | 1990-01-17 | Ciba Geigy | Novel process for the production of unfused protein in e.coli |
NZ236618A (en) * | 1990-01-03 | 1997-06-24 | Ciba Geigy Ag | Treating and preventing osteoporosis using insulin-like growth factor i (igf i) in conjunction with a bone antiresorptive active compound |
US5374620A (en) * | 1990-06-07 | 1994-12-20 | Genentech, Inc. | Growth-promoting composition and its use |
US5681814A (en) * | 1990-06-07 | 1997-10-28 | Genentech, Inc. | Formulated IGF-I Composition |
WO1992004363A1 (en) * | 1990-09-04 | 1992-03-19 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
JPH06506117A (ja) * | 1991-04-01 | 1994-07-14 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | ピキア(Pichia)蛋白質分解活性に影響する遺伝子およびその使用 |
TW267102B (fi) | 1992-03-13 | 1996-01-01 | Ciba Geigy | |
SE9201573D0 (sv) * | 1992-05-19 | 1992-05-19 | Kabi Pharmacia Ab | Use of igf-1 |
US5521086A (en) * | 1993-09-16 | 1996-05-28 | Cephalon, Inc. | Secretion sequence for the production of a heterologous protein in yeast |
SE9402370D0 (sv) | 1994-07-04 | 1994-07-04 | Pharmacia Ab | Use of IGF-I |
WO1996007744A1 (en) * | 1994-09-08 | 1996-03-14 | Chiron Corporation | A method of improved production of insulin-like growth factor |
US5712249A (en) * | 1994-09-08 | 1998-01-27 | Ciba-Geigy Corporation | Use of insulin-like growth factors I and II for inhibition of inflammatory response |
ES2224178T3 (es) | 1995-10-11 | 2005-03-01 | Chiron Corporation | Cobinacion de pdgf, kgf,igf e igfbp para la cicatrizacion de heridas. |
US5783556A (en) * | 1996-08-13 | 1998-07-21 | Genentech, Inc. | Formulated insulin-containing composition |
JP2002533124A (ja) | 1998-12-31 | 2002-10-08 | カイロン コーポレイション | Hivポリペプチドの改善された発現およびウイルス様粒子の生成 |
PT1165119E (pt) | 1999-04-08 | 2004-02-27 | Genentech Inc | Composicao baseada em polipeptidos com cargas opostas |
AU2003228751A1 (en) | 2002-05-01 | 2003-11-17 | Cell Genesys, Inc. | Lentiviral vector particles resistant to complement inactivation |
PT2274978E (pt) | 2003-09-12 | 2015-07-09 | Ipsen Biopharmaceuticals Inc | Métodos para tratamento da deficiência do fator de crescimento de tipo insulina i (igf-i) |
EP1674113A1 (en) | 2004-12-22 | 2006-06-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjugates of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and poly(ethylene glycol) |
CL2007002502A1 (es) | 2006-08-31 | 2008-05-30 | Hoffmann La Roche | Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer. |
WO2008025527A1 (en) | 2006-08-31 | 2008-03-06 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the production of insulin-like growth factor-i |
PE20090368A1 (es) | 2007-06-19 | 2009-04-28 | Boehringer Ingelheim Int | Anticuerpos anti-igf |
BRPI0923359B8 (pt) | 2008-12-12 | 2021-05-25 | Boehringer Ingelheim Int | molécula de anticorpo anti-igf, método para a produção da mesma, molécula de dna, vetor de expressão, e composição farmacêutica e método in vitro para inibir a ligação do igf-1 e do igf-2 ao receptor de igf-1 e ao receptor de insulina ir-a |
CN102471769A (zh) | 2009-07-17 | 2012-05-23 | 亚伦·T.·塔波尔 | 用于具有美容功能的细胞的遗传修饰以提高美容外观的方法和组合物 |
US20110152188A1 (en) | 2009-12-23 | 2011-06-23 | Hanns-Christian Mahler | Pharmaceutical compositions of igf/i proteins |
US20140255413A1 (en) | 2013-03-07 | 2014-09-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Combination therapy for neoplasia treatment |
US20210008172A1 (en) | 2019-07-11 | 2021-01-14 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting igf-1 or igf-1 variants and methods of producing same |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4411994A (en) * | 1978-06-08 | 1983-10-25 | The President And Fellows Of Harvard College | Protein synthesis |
US4443539A (en) | 1980-02-05 | 1984-04-17 | The Upjohn Company | Process for preparing bovine growth hormone |
CA1200773A (en) * | 1980-02-29 | 1986-02-18 | William J. Rutter | Expression linkers |
AU545912B2 (en) * | 1980-03-10 | 1985-08-08 | Cetus Corporation | Cloned heterologous jive products in bacillies |
US4350764A (en) * | 1980-03-10 | 1982-09-21 | The Regents Of The University Of California | Microbiological synthesis of beta endorphin |
US4338397A (en) | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
US4546082A (en) | 1982-06-17 | 1985-10-08 | Regents Of The Univ. Of California | E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins |
EP0116201B1 (en) * | 1983-01-12 | 1992-04-22 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
SE8300693L (sv) * | 1983-02-09 | 1984-08-10 | Sven Lofdahl | Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta |
GB8308483D0 (en) * | 1983-03-28 | 1983-05-05 | Health Lab Service Board | Secretion of gene products |
JPS60501140A (ja) * | 1983-04-22 | 1985-07-25 | アムジエン | 酵母による外因性ポリペプチドの分泌 |
AU2722184A (en) * | 1983-04-25 | 1984-11-01 | Genentech Inc. | Use of alpha sequences in yeast expression systems |
NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
IL71991A (en) * | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
WO1985000831A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of insulin-like growth factor |
US4745179A (en) * | 1984-04-02 | 1988-05-17 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | 59 Valine insulin-like growth factor I and process for production thereof |
CA1341423C (en) * | 1984-10-31 | 2003-03-04 | Paul A. Luciw | Recombinant proteins of viruses associated with lymphadenopathy syndrome and/or acquired immune deficiency syndrome |
EP0193112A3 (en) | 1985-02-22 | 1987-02-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Cdna encoding mammalian insulin-like growth factor ii |
US5084384A (en) * | 1987-04-23 | 1992-01-28 | Monsanto Company | Secretion of insulin-like growth factor-I |
CA1340772C (en) | 1987-12-30 | 1999-09-28 | Patricia Tekamp-Olson | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences |
GB8927008D0 (en) * | 1989-11-29 | 1990-01-17 | Ciba Geigy | Novel process for the production of unfused protein in e.coli |
WO1992004363A1 (en) * | 1990-09-04 | 1992-03-19 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
US5521086A (en) * | 1993-09-16 | 1996-05-28 | Cephalon, Inc. | Secretion sequence for the production of a heterologous protein in yeast |
ATE398139T1 (de) | 1996-12-13 | 2008-07-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Analyse und separation von pdgf-proteinen |
-
1984
- 1984-04-13 AT AT93101654T patent/ATE220101T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-04-13 DE DE3486491T patent/DE3486491T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-13 AT AT84104175T patent/ATE95236T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-04-13 DE DE84104175T patent/DE3486216T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1984-04-13 EP EP93101654A patent/EP0561137B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-13 EP EP84104175A patent/EP0123228B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-13 NZ NZ207842A patent/NZ207842A/en unknown
- 1984-04-16 FI FI841524A patent/FI87799C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-04-19 ZA ZA842982A patent/ZA842982B/xx unknown
- 1984-04-19 IE IE97584A patent/IE60228B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-04-19 IE IE940140A patent/IE940140L/xx unknown
- 1984-04-24 ES ES531855A patent/ES8505412A1/es not_active Expired
- 1984-04-24 NO NO841613A patent/NO174302C/no unknown
- 1984-04-24 DK DK204584A patent/DK204584A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-04-24 AU AU27233/84A patent/AU576757B2/en not_active Expired
- 1984-04-24 HU HU841572A patent/HU204565B/hu not_active IP Right Cessation
- 1984-04-24 PT PT78484A patent/PT78484B/pt not_active IP Right Cessation
- 1984-04-25 JP JP59082096A patent/JP2548105B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-25 IL IL71634A patent/IL71634A/xx not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-06-10 JP JP6128883A patent/JP2530424B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-07 HK HK65594A patent/HK65594A/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-05-17 US US08/442,800 patent/US6642029B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI87799B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulinlik tillvaextfaktor (igf) | |
DE69034091T2 (de) | Herstellung von Hämoglobin und Analogen davon in Nicht-Erythrozytzellen | |
JPH0372893A (ja) | 酵母による組換ポリペプチドの製造方法 | |
JPS63501614A (ja) | 外来タンパク質を分泌することを目的としたbar1の使用法 | |
JPH10501413A (ja) | 合成リーダーペプチド配列類 | |
JPH09135691A (ja) | 牛のプレ成長および成長ホルモンの製造方法 | |
JPS5863390A (ja) | Dna配列を微生物によつて発現する方法及びその生産物 | |
JP2733602B2 (ja) | ヒルジンをコードする発現カセット、プラスミド及び形質転換酵母 | |
JPH07503137A (ja) | 血清ヒトアルブミン,製剤及び利用 | |
US5010010A (en) | Production of human parathyroid hormone from microorganisms | |
EP1114865B1 (en) | Production of human parathyroid hormone | |
JPS59196093A (ja) | インスリンの発現方法 | |
JPH06197787A (ja) | 新規なるdna分子及び宿主 | |
US5015575A (en) | Hybrid DNA synthesis of insulin | |
WO1985005125A1 (fr) | Vecteur d'expression du facteur ix, cellules transformees par ces vecteurs et procede de preparation du facteur ix | |
JPS61500586A (ja) | インタ−ロイキン−2産生のための方法及び組成物 | |
JPS62502660A (ja) | 外来遺伝子の転写を制御するための方法及びハイブリッドプロモーター | |
JPS5951793A (ja) | 新規クロ−ニングビヒクル | |
JPH03502519A (ja) | アプロチニン相同体及び酵母におけるアプロチニン及びアプロチニン相同体の生成方法 | |
Mayne et al. | Direct expression of human growth in Escherichia coli with the lipoprotein promoter | |
DE69033772T2 (de) | Verbesserte plasmidvektoren für zelluläre schleimpilze der gattung dictyostelium | |
JP2840441B2 (ja) | 真正fgfの酵母における発現およびプロセシング | |
KR890005068B1 (ko) | 인체인슐린-유사생장인자의 제조방법 | |
JPS61502655A (ja) | 酵母クロ−ニングビヒクル |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM | Patent lapsed |
Owner name: CHIRON CORPORATION |