DE3486216T2

DE3486216T2 - Hybrid-DNS-Synthesis von reifen insulinähnlichen Wachstumsfaktoren.

Info

Publication number: DE3486216T2
Application number: DE84104175T
Authority: DE
Inventors: Philip J Barr; James P Merryweather; Guy Mullenbach; Mickey S Urdea
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1983-04-25
Filing date: 1984-04-13
Publication date: 1994-02-17
Anticipated expiration: 2004-04-14
Also published as: AU2723384A; NO841613L; DE3486491T2; FI841524A0; US6642029B1; FI87799B; JP2530424B2; NZ207842A; HU204565B; DE3486491D1; ES8505412A1; FI841524A; IE60228B1; DK204584A; EP0561137A1; JPH07143886A; DK204584D0; PT78484A; NO174302C; IE940140L

Description

Gebiet der Erfindung

Es wird vermutet, daß das somatische Wachstum in der Folge einer in-vivo-Verabreichung von Wachstumshormonen durch eine Familie von mitogenen, insulinartigen Peptiden vermittelt wird, deren Serumkonzentration von dem Wachstumshormon abhängen. Diese Polypeptide schließen Somatomedin-C, Somatomedin-A und die insulinartigen Wachstumsfaktoren I und II (IGF I und IGF II) ein. IGF I und IGF II können aus menschlichem Serum isoliert werden und weisen Aminosäuresequenzen auf, die weitgehend homolog zu derjenigen von Insulin sind. Gegenwärtig können lediglich begrenzte Mengen dieser Wachstumsfaktoren durch Abtrennung aus menschlichem Serum erhalten werden. Es wäre daher von größtem wissenschaftlichen und medizinischen Interesse, relativ große Mengen der Wachstumsfaktoren mittels rekombinanter-DNA-Techniken herstellen zu können.

Beschreibung des Standes der Technik

Die Aminosäuresequenzen für die menschlichen insulinartigen Wachstumsfaktoren I und II (IGF I und IGF II) wurden zuerst von Rinderknecht und Humbel, (1978) J. Biol. Chem. 253 : 2769-2776, und Rinderknecht und Humbel (1978) FEBS Letters 89 : 283-286, bestimmt. Die Natur der IGF-Rezeptoren wird in Massague und Czech (1982) J. Biol. Chem. 257 : 5038-5045 diskutiert. Kurjan und Herskowitz, Cell (1982) 30 : 933-934, beschreiben einen mutmaßlichen alpha-Faktorvorläufer, der vier Tandemkopien des reifen alpha-Faktors enthält; sie beschreiben die Sequenz und schlagen einen Mechanismus der
Weiterverarbeitung vor. Kurjan und Herskowitz beschreiben in einem Abstract von Beiträgen, vorgestellt bei dem "Meeting on The Molecular Biology of Yeast" in Cold Spring Harbor im Jahre 1981, Seite 242, und zwar in einem Abstract mit dem Titel "Ein mutmaßlicher alpha-Faktorvorläufer mit vier Tandemwiederholungen eines reifen alpha-Faktors" diese Sequenz, die für den alpha-Faktor kodiert, sowie Spacer zwischen zwei derartigen Sequenzen.
Weiterhin offenbart Science Vol. 219, Seite 620-625, die Expression von IFN in Hefe, die jedoch nicht bei IGF anwendbar ist.

Zusammenfassungen der Erfindung

Es werden Verfahren und Zusammensetzungen für die wirksame Herstellung von reifem humaninsulinartigen Wachstumsfaktor (IGF) zur Verfügung gestellt. Insbesondere erleichtert die Expression eines "pre"-IGF I und "pre"-IGF II in einem Hefewirt die Sekretion der Polypeptide in das Nährmedium. Es werden DNA-Konstrukte erzeugt, indem man DNA-Sequenzen aus verschiedenen Quellen, welche sowohl natürliche als auch synthetische Quellen einschließen, verbindet. Die erhaltenen DNA-Konstrukte werden stabil in der Hefe repliziert und gestatten eine wirksame Bildung auf hohem Niveau von verarbeiteten "pre"-Polypeptiden, die in hohen Ausbeuten aus dem Nährmedium isoliert werden können.
Die Merkmale des Verfahrens der Erfindung sowie der DNA-Konstrukte, die für IGF I und II kodieren, ergeben sich aus den Ansprüchen.

Beschreibungen spezifischer Ausführungsformen

Es werden DNA-Sequenzen zur Verfügung gestellt, die humaninsulinartige Wachstumsfaktoren (IGF I und II) exprimieren können. Diese DNA-Sequenzen können in Vektoren eingesetzt und die erhaltenen Plasmide zur Transformierung hierfür geeigneter erhaltene verwendet werden. Die Transformation eines geeigneten Wirte mit derartigen rekombinanten Plasmiden führt zu einer Expression des insulinartigen Wachstumsfaktorgens und der Bildung des Polypeptidproduktes.
Es werden insbesondere neue DNA-Konstrukte zur Herstellung der Vorläufer-Polypeptide ("pre"-IGF I und "pre"-IGF II) in einem Hefewirt zur Verfügung gestellt, der die genannten Vorläuferpolypeptide verarbeiten und das reife Polypeptidprodukt in das Nährmedium sekretieren kann. Die DNA-Konstrukte schließen ein Replikationssystem, das in einem Hefewirt stabil erhalten bleiben kann, einen wirksamen Promoter, ein Leader- und Verarbeitungssignale im Leseraster mit diesem einschließendes Strukturgen und eine Transkriptions-Terminatorsequenz stromab von dem Strukturgen ein.
Gegebenenfalls können andere Sequenzen vorhanden sein, z. B. für die Regulation der Transkription, der Amplifikation des Gens, der exogenen Regulation der Transkription und dergleichen. Unter "pre"-IGF I und "pre"-IGF II ist zu verstehen, daß die für das reife Polypeptid kodierende DNA-Sequenz mit einer Leadersequenz verknüpft und im Leseraster mit dieser befindlich ist, welche Verarbeitungssignale einschließt, die wirksam von dem Hefewirt erkannt werden. Somit bezeichnet "pre" den Einschluß von Sekretions- und Verarbeitungssignalen, die mit einem Hefewirt produziert sind, und nicht irgendwelche Verarbeitungssignale, die mit dem das hier interessierende Polypeptid kodierenden Gen assoziiert sind.
Für die Herstellung des DNA-Konstruktes ist es erforderlich, die einzelnen Sequenzen, die das Replikationssystem, den Promoter, das Leader- und Verarbeitungssignale einschließende Strukturgen und den Terminator zusammen enthalten, in eine vorbestimmte Reihenfolge zu bringen, um zu gewährleisten, daß diese in dem erhaltenen Plasmid ordnungsgemäß funktionieren. Wie im Folgendem beschrieben wird, können Adaptermoleküle verwendet werden, um die geeignete Orientierung und Reihenfolge der Sequenzen zu gewährleisten.
Die verwendbaren IGF I und IGF II -Gene können chromosomale DNA, cDNA, synthetische DNA oder Kombinationen derselben sein. Die Leader- und Verarbeitungssignale können normalerweise von natürlich vorkommenden DNA-Sequenzen in Hefe abgeleitet sein, welche eine Sekretion eines Polypeptids ergeben. Derartige Polypeptide, die natürlich von Hefe sekretiert werden, schließen alpha-Faktor, a-Faktor, Säurephosphatase und dergleichen ein. Die verbleibenden Sequenzen, die in dem das Replikationssystem, den Promoter und den Terminator einschließenden Konstrukt auftreten, sind bekannt und in der Literatur beschrieben.
Wenn die verschiedenen DNA-Sequenzen, die zur Ausbildung des DNA-Konstruktes der vorliegenden Erfindung verbunden sind, von unterschiedlichen Quellen abgeleitet sind, ist es zweckmäßig, die Sequenzen mittels Verbinder- oder Adaptermolekülen zu verknüpfen. Es können insbesondere Adapter in vorteilhafter Weise eingesetzt werden, um das 3'-Ende des Kodierungsstranges der Leader- und Verarbeitungssignalsequenz an das 5'-Ende des IGF-Kodierungsstranges zusammen mit den jeweiligen komplementären DNA-Strängen derselben zu verknüpfen. Die Leader- und Verarbeitungssignalsequenz kann intern in der Nähe ihres 3'-endes zurückgeschnitten sein, so daß ihr eine vorbestimmte Anzahl von Basenpaaren der Kodierungsregion fehlt. Anschließend kann ein Adapter konstruiert werden, so daß bei der Kopplung der Leader- und Verarbeitungssequenz an den IGF-Kodierungsstrang die fehlenden Basenpaare zur Verfügung gestellt werden und der IGF-Kodierungsstrang sich in geeignetem Leseraster relativ zu der Leadersequenz befindet. Die synthetische IGF-Kodierungsregion und/oder der Adapter an ihrem 3'-Ende liefern Translations-Stopcodons, damit gewährleistet ist, daß das C-Ende des Polypeptids das gleiche wie das natürlich auftretende C-Ende ist.
Die Adapter weisen etwa 5 bis 40 Basen, insbesondere etwa 8 bis 35 Basen, in der Kodierungssequenz auf und können entweder kohäsive oder stumpfe Enden tragen, wobei kohäsive Enden bevorzugt sind. Es ist erwünscht, daß die Termini des Adapters kohäsive Enden aufweisen, welche mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen assoziiert sind, so daß der Adapter selektiv zwei verschiedene DNA-Sequenzen mit den geeigneten komplementären kohäsiven Enden verknüpft.
Die Erfindung wird mit synthetischen Fragmenten erläutert, die für IGF I und IGF II kodieren, welche mit den Leader- und Verarbeitungssignalen des Hefe-alpha-Faktors verknüpft sind. Der Hefe-alpha-Faktor kann mit HindIII und SalI zurückgeschnitten sein. HindIII spaltet in dem Verarbeitungssignal des alpha-Faktorvorläufers, und zwar bei 3' an der zweiten Base in dem Kodierungsstrang des glu-Kodons, wogegen die HindIII-Erkennungssequenz das glu-Kodon komplettiert, für ala kodiert und die erste 5'-Base des aminoterminalen trp-Kodons des reifen alpha-Faktors liefert. Bezüglich der Richtung der Transkription des alpha-Faktorgens ist der SalI-Ort stromauf des Transkriptionsterminators angeordnet.
Die für IGF kodierenden synthetischen Gene weisen Nukleotidsequenzen auf, die auf den bekannten Aminosäuresequenzen der IGF I und IGF II -Polypeptide basieren. Bevorzugt verwenden die synthetischen Sequenzen Kodons, die bevorzugt von dem Hefewirt gebraucht werden, z. B. auf Basis der Häufigkeit, mit der die Kodons in den für die glykolytischen Enzyme der Hefe kodierenden Genen gefunden werden. Zweckmäßigerweise schließt die synthetische Sequenz eher kohäsive als stumpfe Enden für die Insertion in einen Restriktionsort eines Klonierungsvehikels ein. Weiterhin werden Restriktionsorte in die synthetischen Sequenzen unter Verwendung stiller Mutationen eingebaut, um Fragmente zu erzeugen, die in Sequenzen eingesetzt werden können, welche IGF I/IGF II -Hybrid-Peptidmoleküle bilden.
In dem Beispiel werden die synthetischen Fragmente mit kohäsiven Enden für EcoRI versehen und in den EcoRI-Ort von pBR328 eingesetzt. Gewöhnlich schließen die synthetischen Sequenzen zusätzliche Restriktionsorte, benachbart zu jedem Ende der Polypeptid-Kodierungsregion, ein. Derartige innere Restriktionsorte werden ausgewählt, um eine präzise Exzision der Kodierungsregion aus dem Klonierungsvehikel und zur Verknüpfung mit Adaptern zu ermöglichen, so daß das fertige DNA-Konstrukt einschließlich der Leader- und Verarbeitungssignale und der Kodierungsregion sich in geeignetem Leseraster und in geeigneter Weise in Nachbarschaft zu einem Transkriptionsterminator angeordnet befinden. Bevorzugt weisen die Restriktionsorte die Erkennungssequenz abgesetzt von dem Spaltungsort auf, wo die Spaltung proximal zu der Kodierungsregion gerichtet wird und der Erkennungsort verloren geht. Dies gestattet die Spaltung genau an jedem Ende der Kodierungsregion, unabhängig von der Nukleotidsequenz. In den Beispielen sind HgaI-Orte vorgesehen.
Bei der Herstellung der synthetischen Gene werden überlappende, einzelsträngige DNA (ssDNA)-Fragmente mittels üblicher Methoden hergestellt. Derartige ssDNA-Fragmente weisen gewöhnlich eine Länge von etwa 10 bis 40 Basen auf. Obwohl man erheblich längere Fragmente verwenden kann, nimmt die Syntheseausbeute ab und es wird zunehmend schwieriger, zu gewährleisten, daß die eigentliche Sequenz nicht unbeabsichtigt abgebaut oder verändert worden ist. Nach der Synthese der ssDNA- Fragmente werden diese unter Verknüpfungsbedingungen unter komplementärer Basenpaarung unter Sicherstellung der richtigen Ordnung verbunden. Die Enden der Fragmente werden anschließlich ligiert, und das erhaltene synthetische DNA-Fragment wird kloniert und amplifiziert, gewöhnlich in einem bakteriellen Wirt wie E. coli. Wie bereits ausgeführt wurde, kann das synthetische Strukturgen mit kohäsiven Enden versehen werden, die komplementär zu einer geeigneten Restriktionsstelle in dem interessierenden Klonierungsvehikel und zu internen Erkennungsorten sind, welche das präzise Ausschneiden der Kodierungsregion gestatten. Nach dem Klonieren und der Amplifikation der synthetischen Sequenzen können brauchbare Mengen der Sequenzen ausgeschnitten werden, gewöhnlich an den internen Restriktionsorten an dem jeweiligen Ende der IGF-Kodierungsregion.
Zweckmäßigerweise kann der angewendete Promoter derjenige Promoter sein, der mit der Leader- und Verarbeitungssequenz assoziiert ist. Auf diese Weise kann ein 5'-Transportelement, das sowohl den Promoter als auch die Leadersequenz in geeigneter räumlicher Anordnung für eine effiziente Transskription enthält, zur Verfügung gestellt werden.
Weiterhin kann durch Einschluß eines Transkriptionsterminators eine "Kassette", die aus Promoter/Leader-Restriktionsort (e)-Terminator besteht, erzeugt werden, wobei die IGF-Kodierungsregion mit Hilfe von Adaptern eingeführt sein kann. Gewöhnlich können solche Kassetten erhalten werden, in dem man ein DNA-Fragment isoliert, das ein intaktes Gen von einem Hefewirt und die stromauf- und stromabgelegenen Transkriptions-Regulations-Sequenzen des Gens einschließt, wobei das Gen ein Polypeptid exprimiert, das von dem Wirt ausgeschieden wird.
Alternativ kann man den natürlich auftretenden Hefepromoter durch andere Promoter ersetzen, die die transkriptionelle Regulation erlauben. Dies erfordert Sequenz- und/oder Restriktionsmapping der stromauf von der Leadersequenz gelegenen Regionen, um die Einführung eines abweichenden Promoters zu ermöglichen. In einigen Fällen kann es erwünscht sein, den natürlich auftretenden Hefepromoter zu behalten und einen zweiten Promoter im Tandem vorzusehen, entweder stromauf oder stromab von dem natürlich auftretenden Hefepromoter.
Eine breite Vielfalt von Promotern ist verfügbar oder kann aus Hefegenen erhalten werden. Promoter von besonderem Interesse schließen diejenigen ein, die mit Enzymen in dem glykolytischen Abbau in Beziehung stehen, wie Promoter für Alkoholdehydrogenase. Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase,
Pyruvatkinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglycoisomerase, Phosphofructokinase oder dergleichen. Durch Verwendung dieser Promoter mit Regulationssequenzen wie Verstärkern, Operatoren und dergleichen, und unter Verwendung eines Wirts mit einem intakten Regulationssystem kann man die Expression des verarbeiteten "pre"-IGF regulieren. Somit können kleine organische Moleküle, z. B. Glukose, für die Regulation der Produktion des gewünschten Polypeptids verwendet werden.
Man kann weiterhin auch temperaturempfindliche Regulationsmutanten verwenden, die die Modulation der Transkription durch Veränderung der Temperatur gestatten. Somit kann man durch Züchtung der Zellen bei der "verbotenen" Temperatur die Zellen auf eine hohe Dichte züchten, bevor man die Temperatur verändert, um die Expression der "pre"-Polypeptide für IGF I und IGF II zu verändern.
In das Konstrukt können weiterhin auch andere Fähigkeiten eingebaut werden. So liefern einige Gene eine Amplifikation, wobei bei Streßeinwirkung auf den Wirt nicht nur das auf den Streb reagierende Gen, sondern auch Flankierungsregionen amplifiziert werden. Durch Anordnung eines derartigen Gens stromauf von dem Promoter, der Kodierungsregion und den anderen Regulationssignalen, die eine transkriptionelle Kontrolle des "pre"-Polypeptids gestatten, und Einwirkung von Streß auf den Hefewirt können Plasmide erhalten werden, die eine Vielzahl von Wiederholungssequenzen aufweisen, welche das "pre"-Polypeptidgen mit seinen Regulationssequenzen einschließen. Beispielhafte Gene schließen Metallothioneine und Dihydrofolat-Reduktase ein.
Die Konstrukte können zusätzlich zu dem Leadersequenz-Fragment andere, zu dem Wirtsgenom homologe DNA enthalten. Wenn es erwünscht ist, daß eine Integration des IGF-Gens in dem Chromosom bzw. den Chromosomen vorliegt, kann die Integration gefördert werden, indem das IGF-Genkonstrukt flankierende Sequenzen bereitgestellt werden, die zu der chromosomalen DNA des Wirts homolog sind.
Das zu verwendende Replikationssystem wird von dem Hefewirt erkannt. Es ist daher erwünscht, daß das Replikationssystem für den Hefewirt nativ ist. Eine Anzahl von Hefevektoren sind von Botstein et al. , Gene (1979) 8 : 17-24 beschrieben worden. Von besonderem Interesse sind die YEp-Plasmide, die das 2um-Plasmidreplikationssystem enthalten. Diese Plasmide werden bei einer Vielzahl von Kopienzahlen stabil gespeichert. Alternativ oder zusätzlich kann man eine Kombination von ARSI und CEN4 verwenden, um eine stabile Speicherung zu erreichen.
Nach jedem Handhabungsschritt kann, wenn dies geeignet ist, das Konstrukt kloniert werden, so daß das gewünschte Konstrukt in reiner Form und in ausreichender Menge für weitere Handhabungen erhalten wird. Bevorzugt kann ein Shuttlevektor (d. h. mit einem Gehalt sowohl eines Hefe- als auch eines bakteriellen Ursprungs der Replikation) verwendet werden, so daß das Klonen in Prokaryonten, insbesondere E. coli., durchgeführt werden kann.
Die Plasmide können in den Hefewirt mittels eines beliebigen geeigneten Mittels eingeführt werden, und zwar unter der Verwendung von Hefewirtszellen oder Sphäroplasten und unter Verwendung von Kalzium-ausgefällter DNA für die Transformation oder von Liposomen oder anderen üblichen Methoden. Die modifizierten Wirte werden entsprechend den genetischen Markern ausgewählt, die gewöhnlich in einem Vektor zur Konstruktion des Expressionsplasmids vorgesehen sind. Es kann ein auxotropher Wirt verwendet werden, wenn das Plasmid ein Gen aufweist, welches den Wirt komplementiert und eine Prototrophie gewährleistet. Alternativ kann die Resistenz gegenüber einem geeigneten Biozid, z. B. einem Antibiotikum, einem Schwermetall, einem Toxin oder dgl., als Marker in das Plasmid eingesetzt werden. Die Selektion kann dann dadurch erreicht werden, daß man ein Nährmedium verwendet, das die Elternzellen unter Streß setzt, so daß die das Plasmid enthaltenden Zellen ausgewählt werden können. Die das Plasmid enthaltenden Zellen können anschließend in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet und das gewünschte sekretierte Polypeptid gemäß üblichen Methoden isoliert werden. Das Polypeptid kann mittels Chromatographie, Filtration, Extraktion oder dgl. gereinigt werden. Da das Polypeptid in der reifen Form in dem Nährmedium vorliegt, kann man das Nährmedium kontinuierlich unter Entfernung des gewünschten Polypeptids umlaufen lassen.
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung und sind nicht im Sinne einer Einschränkung zu verstehen.

Versuchsteil

Nukleotidsequenzen für humaninsulinartige Wachstumsfaktoren I und II (IGF I und II), enthaltend bevorzugte Hefekodons, wurden auf der Basis der Aminosäuresequenzen entworfen, welche in Rinderknecht und Humbel (1978) J.Biol.Chem. 253 : 2769-2776, und in Rinderknecht und Humbel (1978) FEBS Letters 89 : 283-286 beschrieben wurden. Die Sequenzen (mit den von 5' bis 3' gezeigten Kodierungssträngen) sind die folgenden.
Die Sequenzen werden mit EcoRI-kohäsiven Enden an beiden Enden versehen. Die Kodierung für IGF I beginnt bei der Base 16 des Kodierungsstranges und endet bei der Base 225. An jedem Ende der IGF I-kodierenden Region sind HgaI-Restriktionsorte angeordnet. Die HgaI-Erkennungsorte (5'-GACGC-3') liegen außerhalb der IGF I-Kodierungsregion, d. h. zwischen dem Ende der synthetischen Sequenz und dem HgaI-Spaltungsort. Die IGF II-synthetische Sequenz ist ähnlich konstruiert, wobei der Kodierungsstrang bei der Base 16 beginnt und bei der Base 219 endet.
Ein synthetisches DNA-Fragment für IGF I mit der soeben beschriebenen Sequenz für IGF I wurde hergestellt, indem 20 überlappende ssDNA-Segmente unter Verwendung der Phosphoramiditmethode synthetisiert wurden (vgl. anhängige Patentanmeldungen Ser. No. 457,412, vom 12. Januar 1983). Die ssDNA-Sequenzen waren die folgenden:
Bezeichnung Sequenz U
Bezeichnung Sequenz
N-I-14 CCAATCTTCTCAAGTCACAAGATCT
I-15 GCTTCAATGGAGCACAGTACATTT
I-16 AATTCGACGATTCAAGCAGACTTAGCT
Die ssDNA-Segmente wurden wie folgt verbunden:
50 pMol von jedem Segment mit der Ausnahme von A und I-16 wurden mit T4-Polynukleotidkinase 5'-phosphoryliert. 50 pMol sämtlicher Segmente wurden anschließend in einem einzigen Schritt in Form eines 18 ul-Pools unter Kühlung von 950 auf 250 über 1,5 Stunden verknüpft. Die Ligierung erfolgte
in einem Reaktionsvolumen von 30 ul, enthaltend 1 mM ATP, 10 mM DTT, 100 mM tris-HCl, pH 7.8, 10 mM MgCl&sub2;, 1 ug/ml Spermidin und T4-Ligase. Das geeignete doppelsträngige Fragment, das sich aus der Reihenfolge und der Paarung von Fragmenten wie in Fig. 1 gezeigt ergab, wurde auf einem 7% nativen Polyacrylamid-Elektrophorese-Gel gereinigt.

Fig. 1

IGF I Verknüpfungs- und Ligationsschema

Die DNA-Sequenz für IGF II wurde in ähnlicher Weise hergestellt. Die folgenden zusätzlichen ssDNA-Fragmente wurden hergestellt.
200 pMol dieser ssDNA-Fragmente und der Fragmente A, I und L wurden in ähnlicher Weise wie oben verknüpft, wobei A und II-15 nicht phosphoryliert waren und sich die folgende Zuordnung und Paarung von Segmenten ergab.

Fig. 2

IGF II Verknüpfungs- und Ligationsschema

Die synthetischen DNA-Sequenzen wurden in den EcoRI-Ort von pBR328 insertiert, wobei die Plasmide p328IGF I und p328IGF II erhalten wurden. Nach dem Klonieren wurden die IGF-Kodierungsstränge unter Verwendung von HgaI ausgeschnitten.
Anschließend wurden synthetische Oligonukleotidadapter an die HgaI-Restriktionsfragmente ligiert. Für IGF I hatten die Adapter die folgenden Sequenzen:
a) 5'-AGCTGAAGCT-3'
3 '-CTTCGACCAGG-5'
b) 5' -CTGCTTGATAAG-3'
3 '-ACTATTCAGCT-5'
Bei einer Orientierung in Bezug auf den Kodierungsstrang ist das 3'-Ende des ersten Adapters, a), komplementär zu dem 5'-HgaI-Spaltungsort auf der IGF I-synthetischen Sequenz, während das 5'-Ende des ersten Adapters ein HindIII-kohäsives Ende liefert. Der-zweite Adapter, b), ist an seinem 5'-Ende komplementär zu dem HgaI-Spaltungsort am 3'-Ende der IGF I-Sequenz, während das 3'-Ende des Adapters ein SalI-kohäsives Ende liefert.
Für IGF II weisen die Adapter die folgenden Sequenzen auf:
c) 5 '-AGCTGAAGCT-3'
3 '-CTTCGACGAAT-5'
d) 5' -CTGAATGATAAG-3'
3 '-ACTATTCAGCT-5'
Bei einer wie oben angegebenen Orientierung ist der erste Adapter, c), komplementär an seinem 3'-Ende mit dem 5'-HgaI-Spaltungsort in der IGF II -synthetischen Sequenz, während das 5'-Ende ein HindIII-kohäsives Ende liefert. Der zweite Adapter, d), ist an seinem 5'-Ende komplementär zu dem zweiten HgaI-Spaltungsort in der IGF II -synthetischen Sequenz und liefert ein SalI-kohäsives Ende an seinem 3'-Ende.
Die synthetischen Fragmente und mit diesen verknüpften Adapter wurden durch präparative Gelelektrophorese gereinigt und an 100 ng pAB113 ligiert, welches zuvor vollständig mit den Endonukleasen HindIII und SalI verdaut wurde. pAB113 wurde von pAB112 durch Deletion der drei 63 bp HindIII-Fragmente derivatisiert. pAB112 ist ein Plasmid, das ein 1,8 kb EcoRI-Fragment mit dem Hefe-alpha-Faktorgen, kloniert in den EcoRI-Ort von pBR322, in dem die HindIII- und SalI-Orte deletiert wurden, enthielt. pAB112 ist von dem Plasmid pAB101 abgeleitet, welches das Hefe-alpha-Faktorgen als ein partielles Sau3A-Fragment, kloniert in den BamHI-Ort des Plasmids YEp24, enthielt. pAB101 wurde erhalten, indem man eine Hefegenombibliothek, kloniert in YEp24, screente, und zwar unter Verwendung einer enzymatisch P³²-radiomarkierten synthetischen Oligonukleotidsonde, die homolog zu der veröffentlichten alpha-Faktor-Kodierungsregion ist (Kurjan und Herskowitz, Abstracts 1981 Cold Spring Harbor meeting on the Molecular Biology of Yeast, Seite 242).
Die erhaltenen Gemische wurden verwendet, um E. coli HB101- Zellen zu transformieren; man erhielt die Plasmide pAB113-IGF-I und pAB113-IGF-II für IGF I bzw. IGF II.
Die Plasmide pAB113-IGF-I und pAB113-IGF-II (jeweils 5 ug), die die IGF I- bzw. IGF II -Strukturgene enthielten, wurden vollständig mit EcoRI verdaut, und die erhaltenen Fragmente wurden an einen Überschuß von EcoRI-BamHI-Adapter ligiert und mit BamHI verdaut. Die erhaltenen 1.8 kb- BamHI-Fragmente wurden mit präparativer Gelelektrophorese isoliert, und ca. 100 ng eines jeden Fragments wurden an 100 ng pCl/1 ligiert, das zuvor vollständig mit BamHI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt wurde.
Das Plasmid pCl/1 ist ein Derivat von pJDB219, Beggs, Nature (1978) 275 : 104, in dem die dem bakteriellen Plasmid pMB9 in pJDB219 entsprechende Region durch pBR322 in pCl/1 ersetzt wurde. Es wurde jedes Ligationsgemisch zu Transformierung von E. coli HB101-Zellen verwendet. Die Transformanten wurden durch Ampicillinresistenz selektiert, und ihre Plasmide wurden durch Verdauung mit Restriktionsendonuklease analysiert. DNA von einem ausgewählten Klon für jedes Strukturgen, IGF I oder IGF II, (pYIGF-I-10/1) bzw. (pYIGF-II-10/1) wurde zur Verwendung von Hefe AB103-Zellen hergestellt und eingesetzt. Die Transformanten wurden durch ihren Leu&spplus;-Phänotyp selektiert.
Zwei Kulturen (5 und 9 l) des Hefestammes AB103 (alpha, pep 4-3, leu 2-3, leu 2-112, ura 3-52, his 4-580), transformiert fit dem Plasmid (pYIGF-I-10/1), wurden bei 30ºC in -leu-Medium zur Sättigung gezüchtet (optische Dichte bei 650 nm 5) und unter Schütteln bei 30ºC für eine weitere Zeitspanne von 12 Stunden belassen. Von jeder Kultur wurde der Zellüberstand durch Zentrifugieren gesammelt und das IGF I durch Absorption auf einem Ionenaustauscherharz konzentriert (Biorex-70, erhältlich von Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Kalifornien). Nach der Elution mit 101 mM HCl in 80% Ethanol wurden die IGF I -Fraktionen (0.4 ml bzw. 3 ml) auf die Gesamtproteinkonzentration und die IGF I -Konzentration untersucht. Der Proteinassay war der Coomassie Blau-Assay , erhältlich von Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Kalifornien. Der IGF I -Assay war ein üblicher kompetitiver Radioimmunassay unter Verwendung von radiomarkiertem IGF I. Die Ergebnisse waren wie folgt: Versuch-No. Vol. Vol. nach Konzentration Gesamtprotein
Ein Bioassay von IGF I auf der Basis des synergistischen Effekts des Peptids zur Förderung der Reaktion des Kropfes von Tauben auf Prolactin (Anderson et al. (1983) in Somatomedins/Insulin-Like Growth Factors, Spencer, E.M. , Hrgs., Walter deGruyter, Berlin) zeigte, daß das IGF I -Produkt dieser Zubereitungen eine Aktivität aufweist, die derjenigen von authentischem IGF I, isoliert aus Humanserum, äquivalent ist.
Kulturen von AB103(pYIGF-II-10/1) wurden in ähnlicher Weise wie oben gezüchtet und unter Verwendung eines Radiorezeptorassays auf Basis einer menschlichen Plazentamembran (Spencer et al. (1979) Act. Endocrinol. 91 : 36-48) auf IGF II untersucht, wobei sie 3,9 Einheiten/ml ergaben, während normales Humanserum 1 Einheit/ml aufweist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue Konstrukte zur Verfügung gestellt, die in Vektoren insertiert werden können, um die Expression von menschlichem insulinartigen Wachstumsfaktor I zu ergeben, wobei sich eine Verarbeitung und Sekretion einstellt. Somit kann man ein Polypeptid erhalten, das die identische Sequenz zu dem natürlich auftretenden menschlichen insulinartigen Wachstumsfaktor I aufweist. Da die Sekretion möglich ist, werden enorm vergrößerte Ausbeuten, bezogen auf die Zellpopulation, erhalten, und anschließende präparative Maßnahmen und die Reinigung sind vereinfacht.
Obwohl die obige Erfindung anhand einiger Einzelheiten in beispielhafter Form zum Zwecke der Klarheit beschrieben wurde, ist es für den Fachmann offensichtlich, daß bestimmte Änderungen möglich sind, ohne daß dabei der Umfang der Ansprüche verlassen wird.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von menschlichen insulinartigen Wachstumsfaktoren I oder II (IGF I oder II) in einzelligen Wirtszellen mit den Schritten

Bereitstellen eines funktionellen DNA-Konstruktes, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für IGF I oder II kodiert, wobei die für IGF I kodierende DNA-Sequenz

und die für IGF II kodierende DNA-Sequenz

ist und in einem geeigneten Leseraster mit von den Wirtszellen erkannten Sekretionsleader- und -processingsequenzen vereint sind, und zwar unter Bildung eines strukturellen Gens stromabwärts von und unter transkriptioneller Regulationskontrolle einer transkriptionellen Initiationsregion in einem mit den Wirtszellen kompatiblen Vektor;

Einführen des Vektors in die Wirtszellen;

Züchten der den Vektor enthaltenden Wirtszellen und

Isolieren des ausgeschiedenen menschlichen IGF I oder II.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die IGF I oder II -DNA-Sequenzen synthetische Gene mit von dem Wirt verwendeten Codons sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Wirt eine Hefe ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der Vektor ein Derivat des 2 um-Plasmids ist.

5. Verfahren zur Expression von menschlichen insulinartigen Wachstumsfaktoren I und II (IGF I oder II) in Hefe mit dem Ergebnis einer von Wirtsekretions- und -processingsignalen geförderten Sekretion von IGF I oder II, mit den Schritten

Herstellen von ersten DNA-Fragmenten, die erste, für IGF I und IGF II kodierende Sequenzen enthalten, wobei die für

und die für IGF II kodierende DNA-Sequenz

ist und den 5'-Terminus der Kodierungsstränge bei oder stromabwärts von den ersten Basen dieser DNA-Sequenzen - aufweisen;

Herstellen von zweiten DNA-Fragmenten, die für Hefe erkennbare Sekretions- und Processingsignale kodierende zweite DNA-Sequenzen enthalten und den 3'-Terminus der Kodierungsstränge bei oder stromaufwärts von der terminalen Base der Processingsignale aufweisen, wobei mindestens eines der genannten ersten und zweiten Fragmente seinen Terminus innerhalb der Kodierungssequenzen und als Ergebnis fehlende Basenpaare aufweist;

Verbinden der ersten und zweiten DNA-Fragmente mittels eines für die fehlenden Basenpaare der ersten und zweiten DNA-Fragmente kodierenden Adapters, wobei sich die ersten und zweiten DNA-Fragmente in dem gleichen Leseraster befinden;

Bereitstellen von Terminationscodons stromabwärts von und benachbart zu den ersten Fragmenten zur Schaffung von "pre"-IGF I oder II-Genen; und Klonieren der "pre"-IGF I oder II-Gene in Expressionsvektoren in Hefe, wobei "pre"-IGF I oder II ausgeschieden und verarbeitet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der Expressionsvektor ein von Bakterien erkanntes Replikationssystem einschließt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Hefeexpressionsvektor das 2 um-Plasmid oder einen Teil desselben umfaßt.

8. DNA-Konstrukt, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für menschlichen insulinartigen Wachstumsfaktor I oder II (IGF I oder II) kodiert, wobei die für IGF I kodierende DNA-Sequenz

ist, unter transkriptioneller Regulation von von Hefe verwendeten Regulationssignalen.

9. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, enthaltend ein von Hefe erkanntes Replikationssystem.

10. DNA-Konstrukt nach Anspruch 8, bei dem die DNA-Sequenz von Hefe verwendete Codons aufweist, die sich von humanen Codons unterscheiden.

11. DNA-Konstrukt nach Anspruch 8, bei dem das Konstrukt ein von Bakterien verwendetes Replikationssystem einschließt.

12. DNA-Konstrukt nach Anspruch 9, bei dem das Hefereplikationssystem das 2 um-Plasmid oder einen Teil desselben umfaßt.

13. DNA-Konstrukt nach Anspruch 8, enthaltend die DNA-Sequenz

14. DNA-Konstrukt nach Anspruch 8, enthaltend die DNA-Sequenz

15. DNA-Konstrukt, enthaltend eine für menschlichen insulinartigen Wachstumsfaktor I oder II kodierende DNA-Sequenz, wobei DNA-Sequenz von und die für IGF I kodierende Sequenz

und die für IGF II kodierende DNA-Sequenz

ist, verbunden mit Transkriptions- und Translations-Regulationssequenzen für die Expression eines einzelligen Wirts in einer Kultur.

16. Einzellige Wirtszelle, enthaltend die DNA-Konstrukte gemäß Anspruch 15.

17. Verfahren zur Herstellung von menschlichen insulinartigen Wachstumsfaktoren I oder II (IGF I oder II) mit den Schritten

Bereitstellung einer einzelligen Wirtszelle gemäß Anspruch 16 und

Kultivierung der einzelligen Wirtszelle unter Bedingungen, bei denen IGF I oder II exprimiert wird.