NO174302B - Fremgangsmaate for produksjon av en human-insulin-lignende vekstfaktor - Google Patents
Fremgangsmaate for produksjon av en human-insulin-lignende vekstfaktor Download PDFInfo
- Publication number
- NO174302B NO174302B NO841613A NO841613A NO174302B NO 174302 B NO174302 B NO 174302B NO 841613 A NO841613 A NO 841613A NO 841613 A NO841613 A NO 841613A NO 174302 B NO174302 B NO 174302B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- igf
- host
- yeast
- gene
- sequence
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 10
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 title description 3
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 20
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 claims description 16
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims description 11
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 claims description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 abstract description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 25
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 abstract description 14
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 25
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 5
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 5
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101100163849 Arabidopsis thaliana ARS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101710190529 Insulin-like peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 101100059658 Mus musculus Cetn4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 102100024819 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 101100097319 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ala1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 230000009576 somatic growth Effects 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av
en human-insulin-lignende vekstfaktor-I (IGF-I), som beskrevet i krav 1.
Det antas at den somatiske vekst som etterfølger administre-ringen av veksthormon in vivo tilveiebringes gjennom en gruppe mitogene, insulin-lignende peptider hvis serum-konsentrasjoner er veksthormon-avhengig. Disse polypeptidene omfatter somatomedin-C, somatomedin-A og insulin-lignende vekstfaktorer I og II (IGF I og IGF II). IGF I og II kan isoleres fra menneske-serum og har aminosyresekvenser som stort sett er homologe med sekvensene til insulin. For tiden kan bare begrensede mengder av disse vekstfaktorer fås ved separasjon fra menneskeserum. Det vil derfor være av stor vitenskapelig og klinisk interesse å bli i stand til å produsere forholdvis store mengder av vekstfaktorene ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker.
Aminosyresekvensen til human-insulin-lignende vekstfaktorer I og II (IGF I og II) ble først bestemt av henholdvis Rinderknecht - og Humbel (1978) J. Biol. Chem. 253:2769-2776 og Rinderknecht og Humbel (1978) FEBS Letters 89:283-286. Egenskapene til IGF-mot-takerne er diskutert i Massague og Czech (1982) J. Biol. Chem. 257:5038-5045. Kurjan og Herskowitz, Cell(1982) 30:933-934 beskriver en antatt a-faktor-forløper som inneholder fire etter hverandre liggende kopier av fullt utviklet a-faktor, idet sekvensen beskrives og en fremstillingsmekanisme postuleres. Kurjan og Hertskowitz, Abstracts of Papers presented at the 1981 Cold Spring Harbor Meeting on the Molecular Biology of Yeast,
s. 242, beskriver i et sammendrag med tittelen "A Putative Alpha-Factor Precursor Containing Four Tandem Repeats of Mature Alpha-Factor" sekvensen som koder for a-faktoren og deler som ligger mellom to slike sekvenser.
Det tilveiebringes fremgangsmåter for effektiv fremstilling av fullt utviklet human-insulin-lignende vekstfaktor (IGF). Spesielt letter ekspresjon av en "pre"-IGF I i en gjærvert utskil-lelsen av polypeptidene i næringsmediet. Det frembringes DNA-oppbygninger ved å knytte sammen DNA-sekvenser fra forskjellige kilder, både naturlige og syntetiske kilder. De resulterende DNA-oppbygninger replikeres stabilt i gjæren og gir effektiv produksjon på et høyt nivå av fremstilte "pre"-polypeptider som kan isoleres i høyt utbytte fra næringsmediet.
DNA-sekvenser som er i stand til å uttrykke human-insulin-lignende vekstfaktorer (IGF-I) tilveiebringes. Disse DNA-sekvensene kan innlemmes i vektorer og de resulterende plasmider brukes til å transformere mottagelige verter. Transformasjon av en mottagelig vert med slike rekombinante plasmider resulterer i ekspresjon av det insulin-lignende vekstfaktorgenet og produksjon av polypeptid-produktet.
Nærmere bestemt tilveiebringes nye DNA-oppbygninger for fremstilling av forløper-polypeptidene ("pre"-IGF I) i en gjærvert som er i stand til å fremstille forløper-polypeptidene og utskille det fullt utviklede polypeptidproduktet i næringsmediet. DNA-oppbyg-ningene omfatter et replikasjonssystem som er i stand til å opprettholdes stabilt i en gjærvert, en effektiv promoter, et struk-turelt gen som omfatter leder- og fremstillingssignaler i avled-ningsramme med det strukturelle genet, og en transkripsjonen avslutningssekvens som ligger etter det strukturelle genet. Eventuelt kan det tilveiebringes andre sekvenser for transkripsjonen regulering, forsterkning av genet, eksogen regulering av transkripsjon og lignende. Med "pre"-IGF-I menes at DNA-sekvensen som koder for det fullt utviklede polypeptidet er knyttet til og foreligger i avlesningsramme med en ledersekvens som omfatter fremstillingssignaler som effektivt gjenkjennes av gjærverten. Følgelig betegner "pre" innlemmingen av utskillelse- og fremstillingssignaler forbundet med en gjærvert og ikke noen fremstillingssignaler forbundet med genet som koder for polypeptidet av interesse.
Ved fremstilling av DNA-oppbyggingen er det nødvendig å bringe de enkelte sekvensene som utformer replikasjonssystemet, promoteren, det strukturelle genet inkludert leder- og fremstillingssignaler, og terminatoren sammen i en på forhånd fastlagt rekkefølge for å sikre at de er i stand til å virke korrekt i det resulterende plasmid. Som beskrevet nedenunder, kan det anvendes tilpasningsmolekyler for å sikre den korrekte orientering av og rekkefølge for sekvensene.
IGF-I-genene som anvendes kan være kromosomal DNA, cDNA, syntetisk DNA eller kombinasjoner derav. Leder- og fremstillingssignaler vil normalt være avledet fra naturlig forekommende DNA-sekvenser i gjær som sørger for utskillelse av et polypeptid. Slike polypeptider som utskilles naturlig av gjær omfatter a-faktor, a-faktor, syrefosfatase og lignende. De gjenværende sekvensene som utgjør oppbygningen omfattende replikasjonssystemet, promoteren og terminatoren, er velkjente og beskrevet
i 1itteraturen.
Ettersom de forskjellige DNA-sekvensene som knyttes sammen for å danne DNA-oppbyggingen ifølge foreliggende oppfinnelse, avledes fra forskjellige kilder, vil det være bekvemt å knytte sekvensene sammen ved hjelp av koplings- eller tilpasnings-molekyler. Spesielt kan tilpasningsmolekyler anvendes med
fordel for å kople 3'-enden i den kodende kjeden hos leder-
og fremstillings(prosesserings-)signalsekvensen til 5<1->enden
i den IGF-kodende kjede, sammen med deres respektive komplementære DNA-kjeder. Leder- og fremstillingssignalsekvensen kan spaltes internt nær sin 3<1->ende slik at den mangler et på forhånd bestemt antall basepar av det kodende område. Et tilpasningsmolekyl kan så konstrueres slik at, når man knytter leder- og fremstillingssekvensen til den IGF-kodende kjede, tilveiebringes de manglende basepar og den IGF-kodende kjede
er i den korrekte leseramme i forhold til ledersekvensen.
Det syntetiske IGF-kodende område og/eller tilpasnings-molekyler vil ved sin 3'-ende tilveiebringe translasjonene stoppsignaler for å sikre at C-enden av polypeptidet er den samme som den naturlig forekommende C-ende.
Tilpasningsmolekylene har fra ca. 5 til 40 baser, vanligvis fra ca. 8 til 3 5 baser, i den kodende sekvensen og kan ha enten kohesive eller butte ender, idet kohesive ender er foretrukket. Det er ønskelig at endene til tilpasningsmolkekylet har kohesive ender med tilknytning til forskjellige restriksjonsenzymer slik at tilpasningsmolekylet selektivt vil knytte sammen to forskjellige DNA-sekvenser som har de passende komplementære kohesive endene.
Foreliggende oppfinnelse illustreres med syntetiske fragmenter som koder for IGF-I knyttet til leder- og fremstillingssignalene for gjær-a-faktor. Gjær-a-faktoren kan spaltes med Hindlll og Sali. Hindlll spalter i fremstillingssignalet for a-faktor-forløperen, idet den spalter 3' hos den andre basen i den kodende kjede for glu-kodonet, mens Hindlll gjenkjenningssekvensen kompletterer glu-kodonet, idet det koder for ala og tilveiebringer den første 5<1->basen i aminoende-trp-kodonet til fullt utviklet a-faktor. Når det gjelder transkripsjonsretningen for a-faktor-genet, er Sall-setet lokalisert foran den transkripsjonene terminatoren.
De syntetiske genene som koder for IGF har nukleotidsekvenser basert på de kjente aminosyresekvensene til IGF-I-polypeptidene. De syntetiske sekvensene benytter seg helst av kodoner som fortrinnsvis utnyttes av gjærverten, f.eks. basert på kodonenes hyppighet i genene som koder for de glykolytiske gjærenzymene. Vanligvis omfatter den syntetiske sekvensen heller kohesive ender enn butte ender for innføring i et restriksjonssete i et klonings-hjelpemiddel. Videre utformes restriksjonsseter i de syntetiske sekvensene ved å bruke "hvilende" mutasjoner for å frembringe fragmenter som kan bli ført inn i sekvenser som er i stand til å produsere IGF I-hybridpeptidmolekyler.
I eksemplene er de syntetiske fragmentene forsynt med kohesive ender for EcoRI og innført i EcoRI-setet i pBR328. Den syntetiske sekvensen omfatter vanligvis ytterligere restriksjonsseter nær hver ende i det polypeptidkodende område. Slike indre restriksjonsseter velges for å gi nøyaktig fjerning av det kodende område fra kloningshjelpemidlet og for tilknytning til tilpasnings-molekyler slik at den endelige DNA-oppbygningen, inkludert leder-og fremstillingssignalene og det kodende område, er i korrekt leseramme, og i korrekt sammenstilling med en transkripsjons-terminator. Restriksjonssetene har helst gjenkjenningssekvensen forskjøvet fra spaltningssetet, hvor spalting styres nært opp til det kodende område og gjenkjenningssetet tapes. Dette tillater spalting nøyaktig ved hver ende av det kodende område uansett nukleotid-sekvens. Hqal-seter tilveiebringes i eksemplene.
Ved fremstilling av det syntetiske genet fremstilles det overlappende fragmenter med énkjedet DNA (ssDNA) ved hjelp av vanlig kjente teknikker. Slike ssDNA-fragmenter vil vanligvis ha en lengde fra ca. 10 til 4 0 baser. Selv om det kan anvendes betydelig lengre fragmenter, avtar syntese-utbyttet, og det blir mer vanskelig å forsikre seg mot at den korrekte sekvensen ikke er blitt utilsiktet brutt ned eller endret. Etter at ssDNA-fragmentene er blitt syntetisert, knyttes de sammen under sammenføyningsbetingelser med komplementær base-parring som sikrer den korrekte rekkefølge. Endene av fragmentene bindes så sammen og det resulterende syntetiske DNA-fragment klones og forøkes i antall, vanligvis i en bakteriell vert slik som E. coli. Som tidligere angitt, kan det syntetiske strukturelle genet være forsynt med kohesive ender komplementært til et egnet restriksjonssete i kloningshjelpemidlet av interesse og indre gjenkjenningsseter som tillater nøyaktig fjerning av det kodende område. Etter kloning og forøkelse av de syntetiske sekvensene, kan anvendelige mengder av sekvensene tas ut, vanligvis ved de indre restriksjonssetene ved hvilken som helst ende av det IGF-kodende område.
Vanligvis kan promoteren som anvendes være promoteren som er forbundet med leder- og fremstillingssekvensen. På denne måten kan det tilveiebringes et 5<1->transportabelt element som inneholder både promoteren og ledersekvensen i korrekt rommelig forhold for effektiv transkripsjon. Ved videre å innlemme en transkripsjonen terminator, fremstilles det en "kasett" som består av promoter/ leder-restriksjonssete(r)-terminator hvor det IGF-kodende område kan innføres ved hjelp av tilpasningsmolekyler. Slike "kasetter" kan vanligvis tilveiebringes ved å isolere et DNA-fragment som omfatter et intakt gen fra en gjærvert og de foranliggende og etterfølgende transkripsjonene regulatorsekvensene til genet, idet genet uttrykker et polypeptid som utskilles av verten.
Eventuelt kan man erstatte den naturlig forekommende gjærpromoteren med andre promotere.; som tillater transkripsjonen regulering. Dette vil kreve sekvensering og/eller restriksjons-kartlegging av området foran ledersekvensen for å sørge for innføringen av en ulik promoter. I noen tilfeller kan det være ønskelig å beholde den naturlig forekommende gjærpromoteren og tilveiebringe en andre promoter slik at de blir liggende etter hverandre, den andre promoteren enten foran eller etter den naturlig forekommende gjærpromoteren.
En lang rekke promotere er tilgjengelige eller kan oppnås fra gjærgener. Promoterer av spesiell interesse omfatter de promoterene som er forbundet med enzymer i glykolysesporet, slik som promoterer for alkoholdehydrogenase, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, pyruviat-kinase, triose-fosfat-isomerase, fosfo-glukoisomerase, fosfofruktokinase, etc. Ved å anvende disse promoterne sammen med reguler ingssekvenser, slik som f remittere, operatorer, etc., og ved å bruke en vert med et intakt regule-ringssystem, kan man regulere ekspresjonen av den fremstilte "pre"-IGF. Således kan forskjellige små organiske molekyler, f.eks. glukose, anvendes til reguleringen av fremstilling av det ønskede polypeptidet.
Man kan også anvende temperaturfølsomme regulatormutanter som tillater modulering av transkripsjon ved å variere temperaturen. Ved å dyrke cellene ved den ikke-tillatelige temperaturen kan må således dyrke opp cellene til høy tetthet før man endrer temperaturen for å tilveiebringe ekspresjon av "pre"-polypeptidene for
IGF-I.
Andre egenskaper kan også innføres i oppbyggingen. For eksempel sørger noen gener for forøkelse hvor, etter påvirkning av verten, ikke bare genet som svarer på påvirkningen forøkes, men også tilgrensende områder. Ved å plassere et slikt gen foran promoteren, det kodende område og de øvrige reguleringssignaler som tilveiebringer transkripsjonen kontroll av "pre"-polypeptidet, og påvirke gjærverten, kan det fås plasmider som har en rekke gjentatte sekvenser, som omfatter "pre"-polypeptidgenet med sine reguleringssekvenser. Illustrerende gener omfatter metallo-tioneiner og dihydrofolat-reduktase.
I tillegg til ledersekvensfragmentet kan oppbyggingen omfatte annen DNA som er homolog til vertgenomet. Dersom det er ønskelig at IGF-genet skal integreres i kromosomet eller kromosomene, kan integrering fremmes ved å tilveiebringe sekvensene som ligger opp til IGF-gjenoppbyggingen og som er homologe med kromosomal DNA fra verten.
Det anvendte replikasjonssystemet vil bli gjenkjent av gjærverten. Det er derfor ønskelig at replikasjonssystemet er naturlig for gjærverten. Et antall gjærvektorer er rapporter av Botstein et al.. Gene (1979) 8:17-24. Av spesiell interesse er YEp-plasmidene som inneholder 2 jum plasmidreplikasjonssystemet. Disse plasmidene opprettholdes stabilt i et stort antall kopier. Istedet eller i tillegg kan man bruke en kombinasjon av ARS1 og CEN4 for å tilveiebringe stabil bevaring.
Etter hver manipulering kan, når det er formålstjenlig, oppbyggingen klones slik at den ønskede oppbygging fås i ren tilstand og i tilstrekkelig mengde for videre manipulering. Fortrinnsvis kan det anvendes en skyttel-vektor (dvs. som inneholder både et opphav for replikasjon fra gjær og et fra bakterie) slik at kloning kan utføres i prokaryoter, særlig E. coli.
Plasmidene kan innføres i gjærverten på en hvilken som helst vanlig måte, idet det anvendes gjærvertceller eller sferoplastere og brukes kalsium-utfelt DNA for transformasjon eller liposomer eller andre vanlig kjente teknikker. De modifiserte vertene kan velges i overensstemmelse med de genetiske markørene som vanligvis tilveiebringes i en vektor som brukes til å konstruere ekspresjons-plasmidet. Det kan anvendes en auksotrof vert hvor plasmidet har et gen som fullstendiggjør verten og gir prototrofi. Eventuelt kan resistens mot et passende biocid, f.eks. antibiotikum, tung-metall, toksin eller lignende, innføres som en markør i plasmidet. Seleksjon kan så oppnås ved å anvende et næringsmedium som påvirker foreldrecellene på en slik måte at det selekteres for cellene som inneholder plasmidet. Cellene som inneholder plasmidet kan så dyrkes i et passende næringsmedium og det ønskede utskilte polypeptidet isoleres i henhold til vanlig kjente teknikker. Polypeptidet kan renses ved hjelp av kromatografering, filtrering, ekstraksjon, etc. Etter som polypeptidet vil være til stede i fullstendig utviklet form i næringsmediet, kan man sende næringsmediet i et kretsløp, idet man kontinuerlig fjerner det ønskede polypeptidet.
EKSPERIMENTELT
Nukleotidsekvenser for human-insulin-lignende vekstfaktor I (IGF I) som omfatter foretrukkede gjær-kodoner ble konstruert baserte på aminosyresekvensen rapportert i henholdsvis Rinderknecht og Humbel (1978), J. Biol. Chem. 253:2769-2776 og Rinderknecht og Humbel (1978) FEBS Letters 89:283-286. Sekvensene (med de kodende kjeder vist fra 5' til 3') er som følger:
Sekvensene tilveiebringes med kohesive EcoRI-ender i begge endene. Koding for IGF I begynner ved base 16 i den kodende kjede og ender ved base 225. Hgal-restriksjonsseter er lokalisert til hver ende av det kodende område for IGF I. Hgal-gjenkjennings-setene (5'-GACGC-3<1>) ligger utenfor det kodende område for IGF I, dvs. mellom enden av den syntetiske sekvensen og H<g>al-spaltningssetet. Den syntetiske IGF II-sekvensen konstrueres på lignende måte med oppstarting for den kodende kjede ved base 16 og avslut-ning ved base 219.
Et syntetisk DNA-fragment for IGF I som har den nylig beskrevne sekvensen for IGF I, ble fremstilt ved å syntetisere 20 overlappende ssDNA-segmenter ved å bruke fosforamidit-fremgangs-måten (se US-patentsøknad nr. 457.412, innlevert 12. januar 1983).
ssDNA-sekvensene var som følger:
ssDNA-segmentene ble knyttet sammen på følgende måte:
50 pmol av hvert segment med unntak av A og 1-16 ble 5'-fosforylert med T4 polynukleotidkinase. 50 pmol av alle segmentene ble så ført sammen i et enkelt trinn som en 18 /txl blanding ved avkjøling fra 95°C til 25°C i løpet av 1,5 timer. Binding ble oppnådd i et reaksjonsvolum på 3 0 /xl som inneholdt ImM ATP, lOmM DTT, lOOmM tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 1 jug/ml spermidin og T4 ligase. Det passende dobbeltkjedete fragmentet som oppsto fra rekkefølgen og pardannelse av fragmenter vist i figur 1, ble renset på en 7% elektroforesegel av naturlig forekommende polyakrylamid.
Figur 1
Skjema for sammenføring og binding av IGF I
De følgende ytterligere ssDNA-fragmenter ble fremstilt.
200 pmol av disse ssDNA-fragmentene og fragmentene A, D og L ble knyttet sammen på en lignende måte som ovenfor, hvor A og II-15 ikke ble fosforylert, noe som resulterte i den følgende rekke-følge og pardannelse av segmenter.
De syntetiske DNA-sekvensene ble innført i EcoRI-setet i pBR328 hvorved plasmidene p328IGF I og p328IGF II ble fremstilt. Etter kloning ble de IGF-kodende kjeder fjernet ved å bruke Hgal.
Syntetiske oligonukleotid-tilpasningsmolekyler ble så bundet til Hgal-restriksj onsfragmentene.
For IGF I hadde tilpasnings-molekylene de følgende sekvenser:
Med orientering med hensyn til den kodende kjede, er 3'-enden av det første tilpasningsmolekylet a) komplementært til 5<1> Hera I - spaltingssetet på den syntetiske IGF I-sekvensen, mens 5<1->enden til det første tilpasningsmolekylet gir en kohesiv Hindlll-ende. Det andre tilpasningsmolekylet, b), er i sin 5<1->ende komplementært til H<g>al-spaltingssetet i 3'-enden av IGF I-sekvensen, mens 3'-enden i tilpasningsmolekylet tilveiebringer en kohesiv Sall-ende.
Med orientering som ovenfor, er det første tilpasningsmolekylet, c), komplementært i sin 3<1->ende til 5•-Hgal-spaltings-setet i den syntetiske IGF II-sekvensen, mens 5'-enden tilveiebringer en kohesiv Hindlll-ende. Det andre tilpasningsmolekylet,
d), er komplementært i sin 5<1->ende til det andre Hgal-spaltings-setet i den syntetiske IGF II-sekvensen og tilveiebringer en
kohesiv Sall-ende i sin 3'-ende.
De syntetiske fragmentene og tilpasningsmolekylene som er bundet til disse, ble renset ved preparativ gel-elektroforese og bundet til lOOng pAB113 som tidligere var blitt utsatt for fullført spalting med endonukleasene Hindlll og Sali. pAB113
var avledet fra pAB112 ved fjerning av de tre 63 bp Hindlll-fragmentene. pAB112 er et plasmid som inneholder et l,8kb EcoRI-fragment med gjær-a-faktor-genet klonet i EcoRI-setet til pBR322 hvor Hindlll- og Sall-setene er blitt fjernet. pAB112 ble avledet fra plasmid pABlOl som inneholder gjær-a-faktor-genet som et partielt Sau3A-fragment klonet i BamHI-setet til plasmid YEp24. pABlOl ble erholdt ved å gjennomsøke en gjær-genomsamling klonet i YEp24 under anvendelse av en enzymatisk p<32->radioaktivt merket,
syntetisk oligonukleotid-probe som er homolog med det publiserte a-faktor-kodende område (Kurjan og Herskowitz, Abstracts 1981 Cold Spring Harbor Meeting on the Molecular Biology of Yeasts, s. 242).
De resulterende blandinger ble brukt til å transformere
E. coli HBlOl-celler, og plasmidet pAB113-IGF-I ble oppnådd for
IGF I.
Plasmid pAB113-IGF-I (5 /Lig) med de strukturelle genene for IGF I ble utsatt for fullført spalting med EcoRI og de resulterende fragmenter ble bundet til et overskudd av EcoRI- BamHI-tilpasningsmolekyler og spaltet med BamHI. De resulterende l,8kb BamHI-fragmentene ble isolert ved preparativ gelelektroforese og omtrent 100 ng av hvert fragment ble bundet til lOOng pCl/1, som tidligere var blitt utsatt for fullført spalting med BamHI og behandlet med alkalisk fosfatase.
Plasmid pCl/1 er et derivat av pJDB 219, Beggs, Nature
(1978) 275:104, hvor området som svarer til bakterielt plasmid pMB9 i pJDB219 er blitt erstattet av pBR32 2 i pCl/1. Hver lige-ringsblanding ble brukt til å transformere E. coli HBlOl-celler. Transformanter ble valgt ut ved hjelp av ampicillinresistens og deres plasmider analysert ved hjelp av restriksjonsendonuklease-spalting. Det ble fremstilt DNA fra én utvalgt klon for det strukturelle gen, (pYIGF-I-10/1) for IGF I og brukt til å transformere gjær AB103-celler. Transformanter ble valgt ut etter sin Leu<+->fenotype.
To kulturer (5 og 9 liter) av gjærstamme AB103 (a, pe<p> 4- 3, leu 2- 3, leu 2- 112, ura 3- 52, his 4- 580) som var transformert med plasmid (pYIGF-I-10/1), ble dyrket ved 30°C i -leu-medium til metning (optisk tetthet ved 650nm på 5) og hensatt under rysting ved 30°C i en periode på ytterligere 12 timer. Cellesupernatenter ble samlet opp fra hver kultur ved sentrifugering og IGF I konsen-trert ved absorbsjon på en ionebytteharpiks, "Biorex-70®11. Etter eluering med lOmM HC1 i 80% etanole, ble IGF I-fraksjonene (henholdsvis 0,4 ml og 3 ml) analysert med hensyn på total protein-konsentrasjon og konsentrasjon av IGF I. Proteinanalysen var "Coomassie Blue"-analysen. Analysen av IGF I var en vanlig kjent, konkurrerende radioimmunoanalyse hvor det anvendes radioaktivt merket IGF I.
Resultatene var som følger:
En bioanalyse av IGF I basert på den synergistiske virkningen hvorved peptidet fremmer responsen på prolaktin i mavesekken til duer (Anderson et al., (1983) i Somatomedins/Insulin-Like Growth Factors, Spencer, E.M., ed., Walter deGruter, Berlin) avslører at IGF I-produktet i disse fremstillinger har en virkning som svarer til autentisk IGF I isolert fra menneskeserum.
I henhold til den foreliggende oppfinnelse er det tilveie-bragt nye konstruksjoner som kan innføres i vektorer og gi ekspresjon av human-insulin-lignende vekstfaktor I som sørger for fremstilling og utskillelse. Man kan således få et polypeptid som har en sekvens som er identisk med den som naturlig forekommer i human-insulin-lignende vekstfaktor I. Ved det at det sørges for utskillelse, kan det oppnås svært økte utbytter basert på celle-populasjon, og derpå følgende preparative operasjoner og rensing forenkles.
Claims (3)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av en human-insulin-lignende vekstfaktor-I (IGF-I), karakterisert ved å transformere Saccharomyces cerevisiåe med en gjærekspresjonsvektor som inneholder en DNA-sekvens som koder for insulinlignende vekstfaktor I (IGF-I) med følgende aminosyresekvens:
i riktig leseramme med a-faktor-sekretoriske leder- og prosess-seringssekvens som effektivt gjenkjennes i Saccharomyces cerevisiåe.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvensen som koder for insulinlignende vekstfaktor I (IGF-I) er som følger:
3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at gjærekspresjonsvektoren er pYIGF-I-10/1 (ATCC adgangsnummer 20673).
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US48795083A | 1983-04-25 | 1983-04-25 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO841613L NO841613L (no) | 1984-10-26 |
NO174302B true NO174302B (no) | 1994-01-03 |
NO174302C NO174302C (no) | 1994-04-13 |
Family
ID=23937779
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO841613A NO174302C (no) | 1983-04-25 | 1984-04-24 | Fremgangsmåte for produksjon av en human-insulin-lignende vekstfaktor |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6642029B1 (no) |
EP (2) | EP0561137B1 (no) |
JP (2) | JP2548105B2 (no) |
AT (2) | ATE220101T1 (no) |
AU (1) | AU576757B2 (no) |
DE (2) | DE3486491T2 (no) |
DK (1) | DK204584A (no) |
ES (1) | ES8505412A1 (no) |
FI (1) | FI87799C (no) |
HK (1) | HK65594A (no) |
HU (1) | HU204565B (no) |
IE (2) | IE60228B1 (no) |
IL (1) | IL71634A (no) |
NO (1) | NO174302C (no) |
NZ (1) | NZ207842A (no) |
PT (1) | PT78484B (no) |
ZA (1) | ZA842982B (no) |
Families Citing this family (55)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
US7198919B1 (en) | 1983-04-25 | 2007-04-03 | Genentech, Inc. | Use of alpha factor sequences in yeast expression systems |
US4588684A (en) * | 1983-04-26 | 1986-05-13 | Chiron Corporation | a-Factor and its processing signals |
IL71991A (en) * | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
JPS60501989A (ja) * | 1983-08-10 | 1985-11-21 | アムジエン | インシュリン様成長因子の微生物発現 |
WO1985000831A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of insulin-like growth factor |
US4758512A (en) * | 1984-03-06 | 1988-07-19 | President And Fellows Of Harvard College | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
DK108685A (da) * | 1984-03-19 | 1985-09-20 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Vaekstfaktor i |
US4738921A (en) * | 1984-09-27 | 1988-04-19 | Eli Lilly And Company | Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products |
JP2549504B2 (ja) * | 1984-12-21 | 1996-10-30 | ア−ス製薬株式会社 | Dna塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 |
US5242811A (en) * | 1985-03-26 | 1993-09-07 | Biogen, Inc. | Production of human somatomedin C |
GB8507833D0 (en) * | 1985-03-26 | 1985-05-01 | Biogen Nv | Production of human somatomedin c |
US5342921A (en) * | 1985-03-28 | 1994-08-30 | Chiron Corporation | Superoxide dismutase fusion polypeptides for expression of mammalian proteins |
EP0196056B1 (en) * | 1985-03-28 | 1991-05-22 | Chiron Corporation | Improved expression using fused genes providing for protein product |
US4751180A (en) * | 1985-03-28 | 1988-06-14 | Chiron Corporation | Expression using fused genes providing for protein product |
US4783524A (en) * | 1985-09-17 | 1988-11-08 | Monsanto Company | Growth factors |
ATE67243T1 (de) * | 1985-10-21 | 1991-09-15 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Verfahren zur herstellung von insulinaehnlichem wachstumsfaktor i (igf-i) und plasmid zu dessen herstellung. |
GB8529014D0 (en) * | 1985-11-25 | 1986-01-02 | Biogen Nv | Enhanced secretion of heterologous proteins |
EP0234862A3 (en) * | 1986-02-28 | 1988-10-05 | Merck & Co. Inc. | Expression of recombinant proteins in yeast |
EP0234871A3 (en) * | 1986-02-28 | 1988-10-12 | Merck & Co. Inc. | Regulatable expression of recombinant proteins in yeast |
JPH0616716B2 (ja) * | 1986-10-14 | 1994-03-09 | 塩野義製薬株式会社 | 酵母におけるヒトpstiの製造法 |
DE3726655A1 (de) * | 1987-08-11 | 1989-02-23 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung basischer proteine aus proteingemischen, welche solche basischen proteine enthalten |
GB8723660D0 (en) * | 1987-10-08 | 1987-11-11 | British Bio Technology | Synthetic gene |
CA1340772C (en) * | 1987-12-30 | 1999-09-28 | Patricia Tekamp-Olson | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences |
US4988675A (en) * | 1988-02-05 | 1991-01-29 | Ciba-Geigy Corporation | Method for preventing secondary effects |
DE68905203T2 (de) * | 1988-02-05 | 1993-07-22 | Ciba Geigy Ag | Verwendung von igf i zur herstellung eines praeparates fuer die behandlung von nierenkrankheiten. |
GB8819826D0 (en) * | 1988-08-20 | 1988-09-21 | Kabivitrum Ab | Glycosylated igf-1 |
GB8927008D0 (en) * | 1989-11-29 | 1990-01-17 | Ciba Geigy | Novel process for the production of unfused protein in e.coli |
NZ236618A (en) * | 1990-01-03 | 1997-06-24 | Ciba Geigy Ag | Treating and preventing osteoporosis using insulin-like growth factor i (igf i) in conjunction with a bone antiresorptive active compound |
US5374620A (en) * | 1990-06-07 | 1994-12-20 | Genentech, Inc. | Growth-promoting composition and its use |
US5681814A (en) * | 1990-06-07 | 1997-10-28 | Genentech, Inc. | Formulated IGF-I Composition |
WO1992004363A1 (en) * | 1990-09-04 | 1992-03-19 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
JPH06506117A (ja) * | 1991-04-01 | 1994-07-14 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | ピキア(Pichia)蛋白質分解活性に影響する遺伝子およびその使用 |
TW267102B (no) | 1992-03-13 | 1996-01-01 | Ciba Geigy | |
SE9201573D0 (sv) * | 1992-05-19 | 1992-05-19 | Kabi Pharmacia Ab | Use of igf-1 |
US5521086A (en) * | 1993-09-16 | 1996-05-28 | Cephalon, Inc. | Secretion sequence for the production of a heterologous protein in yeast |
SE9402370D0 (sv) | 1994-07-04 | 1994-07-04 | Pharmacia Ab | Use of IGF-I |
WO1996007744A1 (en) * | 1994-09-08 | 1996-03-14 | Chiron Corporation | A method of improved production of insulin-like growth factor |
US5712249A (en) * | 1994-09-08 | 1998-01-27 | Ciba-Geigy Corporation | Use of insulin-like growth factors I and II for inhibition of inflammatory response |
ES2224178T3 (es) | 1995-10-11 | 2005-03-01 | Chiron Corporation | Cobinacion de pdgf, kgf,igf e igfbp para la cicatrizacion de heridas. |
US5783556A (en) * | 1996-08-13 | 1998-07-21 | Genentech, Inc. | Formulated insulin-containing composition |
JP2002533124A (ja) | 1998-12-31 | 2002-10-08 | カイロン コーポレイション | Hivポリペプチドの改善された発現およびウイルス様粒子の生成 |
PT1165119E (pt) | 1999-04-08 | 2004-02-27 | Genentech Inc | Composicao baseada em polipeptidos com cargas opostas |
AU2003228751A1 (en) | 2002-05-01 | 2003-11-17 | Cell Genesys, Inc. | Lentiviral vector particles resistant to complement inactivation |
PT2274978E (pt) | 2003-09-12 | 2015-07-09 | Ipsen Biopharmaceuticals Inc | Métodos para tratamento da deficiência do fator de crescimento de tipo insulina i (igf-i) |
EP1674113A1 (en) | 2004-12-22 | 2006-06-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjugates of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and poly(ethylene glycol) |
CL2007002502A1 (es) | 2006-08-31 | 2008-05-30 | Hoffmann La Roche | Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer. |
WO2008025527A1 (en) | 2006-08-31 | 2008-03-06 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the production of insulin-like growth factor-i |
PE20090368A1 (es) | 2007-06-19 | 2009-04-28 | Boehringer Ingelheim Int | Anticuerpos anti-igf |
BRPI0923359B8 (pt) | 2008-12-12 | 2021-05-25 | Boehringer Ingelheim Int | molécula de anticorpo anti-igf, método para a produção da mesma, molécula de dna, vetor de expressão, e composição farmacêutica e método in vitro para inibir a ligação do igf-1 e do igf-2 ao receptor de igf-1 e ao receptor de insulina ir-a |
CN102471769A (zh) | 2009-07-17 | 2012-05-23 | 亚伦·T.·塔波尔 | 用于具有美容功能的细胞的遗传修饰以提高美容外观的方法和组合物 |
US20110152188A1 (en) | 2009-12-23 | 2011-06-23 | Hanns-Christian Mahler | Pharmaceutical compositions of igf/i proteins |
US20140255413A1 (en) | 2013-03-07 | 2014-09-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Combination therapy for neoplasia treatment |
US20210008172A1 (en) | 2019-07-11 | 2021-01-14 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting igf-1 or igf-1 variants and methods of producing same |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4411994A (en) * | 1978-06-08 | 1983-10-25 | The President And Fellows Of Harvard College | Protein synthesis |
US4443539A (en) | 1980-02-05 | 1984-04-17 | The Upjohn Company | Process for preparing bovine growth hormone |
CA1200773A (en) * | 1980-02-29 | 1986-02-18 | William J. Rutter | Expression linkers |
AU545912B2 (en) * | 1980-03-10 | 1985-08-08 | Cetus Corporation | Cloned heterologous jive products in bacillies |
US4350764A (en) * | 1980-03-10 | 1982-09-21 | The Regents Of The University Of California | Microbiological synthesis of beta endorphin |
US4338397A (en) | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
US4546082A (en) | 1982-06-17 | 1985-10-08 | Regents Of The Univ. Of California | E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins |
EP0116201B1 (en) * | 1983-01-12 | 1992-04-22 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
SE8300693L (sv) * | 1983-02-09 | 1984-08-10 | Sven Lofdahl | Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta |
GB8308483D0 (en) * | 1983-03-28 | 1983-05-05 | Health Lab Service Board | Secretion of gene products |
JPS60501140A (ja) * | 1983-04-22 | 1985-07-25 | アムジエン | 酵母による外因性ポリペプチドの分泌 |
AU2722184A (en) * | 1983-04-25 | 1984-11-01 | Genentech Inc. | Use of alpha sequences in yeast expression systems |
NZ207926A (en) * | 1983-04-25 | 1988-04-29 | Genentech Inc | Use of yeast #a#-factor to assist in expression of proteins heterologus to yeast |
IL71991A (en) * | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
WO1985000831A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of insulin-like growth factor |
US4745179A (en) * | 1984-04-02 | 1988-05-17 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | 59 Valine insulin-like growth factor I and process for production thereof |
CA1341423C (en) * | 1984-10-31 | 2003-03-04 | Paul A. Luciw | Recombinant proteins of viruses associated with lymphadenopathy syndrome and/or acquired immune deficiency syndrome |
EP0193112A3 (en) | 1985-02-22 | 1987-02-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Cdna encoding mammalian insulin-like growth factor ii |
US5084384A (en) * | 1987-04-23 | 1992-01-28 | Monsanto Company | Secretion of insulin-like growth factor-I |
CA1340772C (en) | 1987-12-30 | 1999-09-28 | Patricia Tekamp-Olson | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences |
GB8927008D0 (en) * | 1989-11-29 | 1990-01-17 | Ciba Geigy | Novel process for the production of unfused protein in e.coli |
WO1992004363A1 (en) * | 1990-09-04 | 1992-03-19 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
US5521086A (en) * | 1993-09-16 | 1996-05-28 | Cephalon, Inc. | Secretion sequence for the production of a heterologous protein in yeast |
ATE398139T1 (de) | 1996-12-13 | 2008-07-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Analyse und separation von pdgf-proteinen |
-
1984
- 1984-04-13 AT AT93101654T patent/ATE220101T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-04-13 DE DE3486491T patent/DE3486491T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-13 AT AT84104175T patent/ATE95236T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-04-13 DE DE84104175T patent/DE3486216T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1984-04-13 EP EP93101654A patent/EP0561137B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-13 EP EP84104175A patent/EP0123228B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-13 NZ NZ207842A patent/NZ207842A/en unknown
- 1984-04-16 FI FI841524A patent/FI87799C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-04-19 ZA ZA842982A patent/ZA842982B/xx unknown
- 1984-04-19 IE IE97584A patent/IE60228B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-04-19 IE IE940140A patent/IE940140L/xx unknown
- 1984-04-24 ES ES531855A patent/ES8505412A1/es not_active Expired
- 1984-04-24 NO NO841613A patent/NO174302C/no unknown
- 1984-04-24 DK DK204584A patent/DK204584A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-04-24 AU AU27233/84A patent/AU576757B2/en not_active Expired
- 1984-04-24 HU HU841572A patent/HU204565B/hu not_active IP Right Cessation
- 1984-04-24 PT PT78484A patent/PT78484B/pt not_active IP Right Cessation
- 1984-04-25 JP JP59082096A patent/JP2548105B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-04-25 IL IL71634A patent/IL71634A/xx not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-06-10 JP JP6128883A patent/JP2530424B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-07 HK HK65594A patent/HK65594A/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-05-17 US US08/442,800 patent/US6642029B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO174302B (no) | Fremgangsmaate for produksjon av en human-insulin-lignende vekstfaktor | |
EP0763117B1 (en) | Synthetic leader peptide sequences | |
US5162498A (en) | Synthetic yeast leader peptides | |
JPH10501695A (ja) | イーストにおいて発現されたn末端に伸長した蛋白質 | |
EP0176341A1 (en) | An improved derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products | |
JPH0779699B2 (ja) | 真核生物における分泌発現遺伝子 | |
JPH08512202A (ja) | Yap3シグナルペプチドをコードするdna構築体 | |
EP0121884B1 (en) | Hybrid dna synthesis of insulin | |
US4914026A (en) | Alpha factor leader sequence directed secretion of insulin | |
WO1988009795A1 (en) | Yeast expression vector | |
EP0329684A1 (en) | Composite yeast vectors | |
US6861237B2 (en) | Production of heterologous polypeptides in yeast | |
Cartwright et al. | Use of β‐lactamase as a secreted reporter of promoter function in yeast | |
US5015575A (en) | Hybrid DNA synthesis of insulin | |
EP0129073A1 (en) | Hybrid DNA synthesis of mature growth hormone releasing factor | |
WO1985002200A1 (en) | Interleukin-2 production using cloned genes for interleukin-2 and yeast alpha-factor | |
US5741674A (en) | Recombinant production of proteins in yeast | |
AU621277B2 (en) | Shortened phosphoglycerate kinase promoter | |
KR890005068B1 (ko) | 인체인슐린-유사생장인자의 제조방법 | |
JP2004514450A (ja) | 酵母における異種ポリペチドの産生 |