JP2548105B2 - ヒト−インシユリン様成長因子の製造方法 - Google Patents

ヒト−インシユリン様成長因子の製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） 1.発明の分野 成長ホルモンの生体内適用に続いて生ずる肉体的成長
が、有系***性インシュリン様ペプチドの群により介在
され、このペプチドの血清内濃度が成長ホルモンに依存
することが予想される。これらのペプチドには、ソマト
メジン−Ｃ、ソマトメジン−Ａ、並びにインシュリン様
成長因子Ｉ及びII（IGF I及びIGF II）が含まれる。IGF
I及びIIはヒト−血清から分離することができ、そして
インシュリンのアミノ酸配列に広範囲に相同なアミノ酸
配列を有する。現在、これらの成長因子の限定された量
のみがヒト−血清からの分離により得られる。従って、
組換DNA技法によって比較的大量の成長因子が製造でき
ることは、科学的、及び臨床的に非常に有利である。
2.従来技術の記載 ヒト−インシュリン様成長因子Ｉ及びII（IGF I及びI
I）のアミノ酸配列はまず、それぞれ、Rinderknecht及
びHumbel（1978）J.Biol.Chem.253:2769−2776;及びRin
derknecht及びHumbel（1978）FEBS Letters89:283−28
6,により決定された。IGF受容体の性質がMassague及びC
zech（1982）J.Biol.Chem.257:5038−5045において検討
されている。Kurjan及びHerskowitz,Cell（1982）30:93
3−934は、成熟α−ファクターの４個のタンデムコピー
を含有する推定上のα−ファクター前駆体を記載すると
共に、その配列を記載しそしてプロセシング機構を仮定
している。Kurjan及びHerskowitzは、1981年のCold Spr
ing Harbor Meeting on The Molecular Biology of Yea
stの要約書第242頁において、「A Putative Alpha−Fac
tor Preeursor Containing Four Tandem Repeats of Ma
ture Alpha−Foctor」と題して、成熟α−ファクターに
ついてコードする配列及びこれらの２個の配列間のスペ
ーサーについて記載している。
（発明の要約） 成熟ヒト−インシュリン様成長因子（IGF）を効率的
に製造するための方法及び構成物が提供される。特に、
酵母宿主中での「プレ」−IGF I及び「プレ」−IGF II
の発現が培地へのポリペプチドの分泌を促進する。異る
分離源に由来するDNA配列を連結することによりDNA構成
物を生じさせる。この分離源には天然源及び合成源の両
者が含まれる。得られたDNA構成物は酵母中で安定に複
製し、そしてプロセシングされた「プレ」−ポリペプチ
ドの効率的で高レベルの生産をもたらし、このポリペプ
チドは培地から高収量で分離することができる。
（具体的な態様の記載） ヒト−インシュリン様成長因子（IGF I及びII）を発
現することができるDNA配列が提供される。これらのDNA
配列はベクターに導入することができ、そして得られた
プラスミドを使用して感受性宿主を形質転換する。組換
プラスミドを用いる感受性宿主の形質転換により、イン
シュリン様成長因子の発現及びポリペプチド生成物の製
造がもたらされる。
特に、前駆体ポリペプチドをプロセシングしそして成
熟ポリペプチドを培地中に生産することができる酵母宿
主中で前駆体ポリペプチド（「プレ」−IGF I、及び
「プレ」−IGF II）を産生せしめるための新規なDNA構
成物が提供される。このDNA構成物は、酵母宿主中で安
定に維持され得る複製系、効果的なプロモーター、前記
構造遺伝子とリーディングフレームが一致するリーダー
及びプロセシングシグナルを含む構造遺伝子、及びこの
構造遺伝子から下流にある転写終結配列を含有する。場
合によっては、転写制御、遺伝子の増幅、転写の外部的
制御、及びこれらに類することのための他の配列を備え
ることができる。「プレ」−IGF I及び「プレ」−IGF I
Iは、成熟ポリペプチドについてコードするDNA配列が酵
母により効果的に認識されるプロセシングシグナルを含
むリーダー配列と連結されており、そしてリーディング
フレームが一致していることを意味する。そして、「プ
レ」は酵母宿主と関連する分泌及びプロセシングシグナ
ルを示し、そして目的のポリペプチドをコードする遺伝
子と関連するプロセシングシグナルを示すものではな
い。
DNA構成物の調製においては、複製系、プロモータ
ー、リーダー及びプロセシングシグナルを含む構造遺伝
子、並びにターミネーターを体現する個々の配列を、得
られたプラスミド中でこれらが適切に機能することがで
きることを保証するように所定の順序に一緒にすること
が必要である。後記のごとく、配列の適切な方向と順序
を保証するためにアダプターを使用することができる。
使用するIGF I及びIGF II遺伝子は染色体DNA、cDNA、
合成DNA、又はこれらの組合わせであってよい。リーダ
ー及びプロセシングシグナルは通常、ポリペプチドの分
泌をもたらす酵母中の天然DNA配列から誘導される。酵
母により自然に分泌されるこれらのポリペプチドにはα
−ファクター、ａ−ファクター、酸性ホスファターゼ、
及びこれらに類するものが含まれる。複製系、プロモー
ター、及びターミネータを含む構成物を構成する他の配
列はよく知られており、そして文献に記載されている。
この発明のDNA構成物を形成するために連結される種
々のDNA配列は種々の分離源から誘導されるであろうか
ら、これらの配列をコネクター分子又はアダプター分子
により連結するのが好ましい。特に、リーダー及びプロ
セシングシグナル配列のコード鎖の３′末端をIGFコー
ド鎖の５′末端にこれらのそれぞれの相補的DNA鎖と共
に連結するために、アダプターを有利に使用することが
できる。リーダー及びプロセシングシグナル配列は、コ
ード領域の所定の数の塩基対が欠失するように、３′末
端の近くで内部的に制限されてもよい。そして、リーダ
ー及びプロセシング配列がIGFコード鎖と連結される際
に欠失した塩基対が与えられそしてIGFコード鎖がリー
ダー配列に対して適切なリーディングフレーム内にある
ように、アダプターを構成することができる。ポリペプ
チドのＣ末端が天然のＣ末端と同一であることを保証す
るため、合成IGFコード領域及び／又はアダプターはそ
の３′末端に翻訳終結コドンを有するであろう。
アダプターはコード配列中に約５〜40塩基、さらに一
般には約８〜35塩基を有し、そして接着末端又は平滑末
端のいずれかを有することができ、そして接着末端が好
ましい。アダプターが適当な相補的接着末端を有する２
種類の異るDNA配列と選択的に連結するように、アダプ
ターの各末端は異る制限酵素に関連する接着末端を有す
ることが好ましい。
この発明を、酵母α−ファクター前駆体のリーダー及
びプロセシングシグナルに連結された、IGF I及びIGF I
Iについてコードする合成断片に関して説明する。酵母
−ファクター前駆体をHin d III及びSal Iにより制限
する。Hin d IIIはα−ファクター前駆体のプロセシン
グシグナル中gluコドンのコード鎖中の第２塩基の３′
を開裂せしめ、他方、Hin d III認識配列はgluコドンを
終え、alaについてコードし、そして成熟α−ファクタ
ーのアミノ末端trpコドンの第１の５′塩基を与える。S
al I部位は、α−ファクター遺伝子の転写の方向に関し
て転写ターミネーターの上流に位置する。
IGFについてコードする合成遺伝子は、IGF I及びIGF
IIポリペプチドの公知のアミノ酸配列に基礎を置くヌク
レオチド配列を有するであろう。好ましくは、この合成
配列は、例えば酵母の解糖系酵素についてコードする遺
伝子において見出されるコドンの頻度に基いて、酵母宿
主により優先的に使用されるコドンを用いるであろう。
便利には、合成配列は、クローニングベクター中の制限
部位に挿入するために平滑末端ではなくむしろ接着末端
を含有するであろう。さらに、IGF I/IGF II雑種ペプチ
ド分子を産生せしめることができる配列にアニールされ
る断片を生成せしめるために、サイレント変異を用いて
合成配列中に制限部位を予定することができよう。
例においては、合成断片にEco R I用の接着末端を設
け、そしてpBR328中のEco R I部位に挿入する。通常、
合成配列はポリペプチドコード領域の各端の内側に追加
の制限部位を有するであろう。これらの内部制限部位
は、クローニングベクターからコード領域を正確に切り
出しそしてアダプターと連結し、これによってリーダー
及びプロセシングシグナル並びにコード領域を含有する
最終DNA構成物が転写ターミネーターに対して適切なリ
ーディングフレームを有しそして適切に並置されるよう
に選択される。好ましくは、制限部位は開裂部位から離
れて認識部位を有し、開裂はコード領域の内側に向けら
れ、そして認識部位が失われる。これにより、ヌクレオ
チド配列にかかわりなくコード領域の各端における正確
な開裂が可能となる。例においてはHga Iを用いる。
合成遺伝子の調製においては、オーバーラップする単
鎖DNA（ss DNA）断片を常法に従って調製する。このss
DNA断片は通常約10〜40塩基の長さを有する。さらに相
当長い断片を使用することもできるが、この場合には合
成収量が低下し、そして適切な配列が不注意に分解され
ておらず又は変化していないことを保証するのが困難と
なる。ss DNA断片を合成した後、これらをアニーリング
条件下で、適切な順序を確保しながら相補的塩基対と連
結（Joining）する。次に断片の端を結合（ligate）せ
しめ、そして得られた合成DNA断片を、通常は細菌宿
主、例えばE.コリ（E.coli）中でクローニングし、そし
て増幅せしめる。前記のごとく、合成構造遺伝子には、
目的のクローニングベクター中の適当な制限部位に相補
的な接着末端、及びコード領域の正確な切り出しを可能
にしる内部認識部位を設ける。合成配列をクローニング
しそして増幅せしめた後、通常の量のこの配列を、通常
はIGFコード領域のいずれかの末端の内部制限部位にお
いて切り出す。
便利には、使用するプロモーターは、リーダー及びプ
ロセシング配列に関連するプロモーターである。このよ
うにして、効率的な転写のために適切な空間的関係にお
いてプロモーター及びリーダー配列を含有する５′−ポ
ータブル要素が得られる。さらに転写ターミネーターを
含有せしめることにより「プロモーター／リーダー−制
限部位−ターミネーター」から成る「カセット」が得ら
れ、IGFコード領域がアダプターを用いて挿入される。
通常、このようなカセットは、宿主により分泌されるポ
リペプチドを発現する酵母宿主由来の無傷の遺伝子及び
この遺伝子の上流及び下流の転写制御配列を含むDNA断
片を分離することにより得られる。
前記の方法に代えて、天然の酵母プロモーターの代り
に転写制御を可能にする他のプロモーターを使用するこ
とができる。この方法においては、異るプロモーターを
挿入するために、リーダー配列から上流の配列決定及び
／又は制限地図の作成が必要であろう。ある場合には、
天然の酵母プロモーターを保持し、そしてこの天然の酵
母プロモーターから上流又は下流にタンデムに第２のプ
ロモーターを設けるのが好ましいであろう。
広範囲の種類のプロモーターを入手することができ、
又は酵母遺伝子から得ることができる。特に有利なプロ
モーターには、解糖系における酵素に関するプロモータ
ー、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアル
デヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ピルベー
トキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホ
スホグルコイソメラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ等に
関するプロモーターが含まれる。これらのプロモーター
を制御配列、例えばエンハンサー、オペレーター等と共
に使用することにより、そして無傷の制御系を有する宿
主を使用することにより、プロセシングされた「プレ」
−IGFの発現を制御することができる。すなわち、種々
の小有機分子、例えばグルコースを用いて目的ポリペプ
チドの産生の制御を行うことができる。
さらに、温度の変化による転写の調節を可能にする温
度感受性制御変異株を使用することもできる。すなわ
ち、非許容（non−permissive）温度で細胞を増殖せし
めることにより細胞を高濃度に増殖せしめることがで
き、その後IGF I及びIGF IIの「プレ」−ポリペプチド
の発現をもたらすために温度を変えることができる。
構成物中に他の能力を導入することもできる。例え
ば、宿主へのストレスに際しそのストレスに応答する遺
伝子のみならずフランク領域も増幅される場合には、増
幅のために幾つかの遺伝子を用いることができる。この
ような遺伝子を、プロモーター、コード領域、及び「プ
レ」−ポリペプチドの転写制御をもたらす他の制御シグ
ナルから上流に配置し、そして酵母宿主をストレスする
ことにより、「プレ」−ポリペプチド遺伝子をその制御
配列と共に含有する多数の反復配列を有するプラスミド
が得られるであろう。代表的な遺伝子にはメタロチオネ
イン及びジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子が含ま
れる。
構成物は、リーダー配列断片に加えて、宿主ゲノムと
相同の他のDNAを含有することができる。IGF遺伝子を染
色体へ組み込むことが好ましい場合には、IGF遺伝子構
成の周縁に宿主の染色体DNAと相同の配列を設けること
により組込みを促進することができる。
使用する複製系は酵母宿主により認識されるであろ
う。従って、複製系は酵母宿主にとって本来的（nativ
e）であることが好ましい。多数の酵母ベクターがBotst
ein等,Gene（1979）８:17−24により報告されている。
特に有利なものは２μｍプラスミド複製系を含有するYE
pプラスミドである。これらのプラスミドは、多コピー
数において安定に維持される。これに代えて又はこれに
加えて、安定な維持を得るためにARS1とCEN4との組合わ
せを用いることができる。
各操作の後、ふさわしい場合には、構成物をクローニ
ングし、純粋にそしてさらに操作するのに十分な量にお
いて所望の構成物を得る。クローニングを原核性生物、
特にE.コリ中で行うことができるように、シャトルベク
ター（すなわち、酵母及び細菌の複製開始点の両者を含
有するベクターを使用することが好ましい。
プラスミドは、酵母宿主細胞又はスフェロプラストを
用い、そして形質転換のためのカルシウム沈澱DNAもし
くはリポゾーム、又は他の常用技法を用いながら、任意
の便利な手段により酵母宿主に導入することができる。
変性された宿主は、発現プラスミドを構成するために使
用されるベクター中に通常設けられている遺伝的マーカ
ーに従って選択することができる。プラスミドが、宿主
を補完（comp lement）しそしてこれに原栄養性を付与
する遺伝子を有する場合、栄養要求性宿主を用いること
ができる。他の方法として、適当な殺生物剤、例えば抗
生物質、重金属、毒素、又はこれらに類するものをマー
カーとしてプラスミドに導入することができる。次に、
親細胞をストレスすることによってプラスミド含有細胞
を選択することができる栄養培地を用いることにより選
択を行うことができる。次に、プラスミド含有細胞を適
当な栄養培地に増殖せしめ、そして目的とする分泌され
たポリペプチドを常法に従って分離する。ポリペプチド
はクロマトグラフィー、過、抽出等により精製するこ
とができる。ポリペプチドは培地中に成熟形として存在
するであろうから、目的のポリペプチドを取り出しなが
ら培地を連続的に循環することができる。
次に例によりこの発明をさらに具体的に説明する。但
しこれによりこの発明の範囲を限定するものではない。
（実験） 好ましい酵母コドンを有するヒト−インシュリン様成
長因子Ｉ及びII（IGF I及びIGF II）のヌクレオチド配
列を、それぞれ、Rinderknecht及びHumbel（1978）J.Bi
ol.Chem.253:2769−2776;及びRinderknecht及びHumbel
（1978）FEBS Letters 89:283−286において報告された
アミノ酸配列に基いて案出した。配列（コード鎖を５′
−３′で示す）を次に示す。
この配列は両端にEco R I接着末端を有する。IGF Iの
コードはコード鎖の16塩基から始まり225塩基で終わ
る。Hga I制限部位がIGF Iコード領域の両端に位置す
る。Hga I認識部位（５′−GACGC−３′）はIGF Iコー
ド領域の外側、すなわち合成配列の末端とHga I開裂部
位の間に存在する。16塩基から始まり219塩基で終わる
コード鎖を有するIGF II合成配列も同様に構成される。
IGF Iについてすぐ前に記載した配列を有するIGF Iの
ための合成DNA断片を、燐アミディト（phosphoramidite
法）（1983年１月12日に出願された係属中の出願No.45
7,412を参照のこと）を用いて20種類のオーバーラップs
s DNA断片を合成することにより調製した。ss DNAを次
に示す。
標示 配 列 Ａ AATTCGACGCTTATGG Ｂ−Ｉ−１ GTCCAGAAACCTTGTGTGGT Ｃ−Ｉ−2b GCTGAATTGGTC Ｃ−Ｉ−2a GATGCTTTGCAATTCGT Ｄ TTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTC Ｉ−３ AACAAGCCAACCGGTTACGGTTCTTCTTC Ｅ−Ｉ−４ TAGAAGAGCTCCACAAACCGGTATCGTT Ｆ−Ｉ−５ GACGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTG Ｇ−Ｉ−６ AGAAGATTGGAAATGTACTGTGCT Ｉ−７ CCATTGAAGCCAGCTAAGTCT Ｈ−Ｉ−８ GCTTGAATGCGTCG Ｊ−Ｉ−９ GTTTCTGGACCCATAAGCGTCG Ｋ−Ｉ−10 AAAGCATCGACCAATTCAGCACCACACAAG Ｌ CTCTGTCACCACAAACGAATTGC Ｍ−Ｉ−11 AACCGGTTGGCTTGTTGAAGTAGAAAC Ｉ−12 TGGAGCTCTTCTAGAAGAAGAACCGT Ｉ−13 GAAACAACATTCGTCAACGATACCGGTTTG Ｎ−Ｉ−14 CCAATCTTCTCAAGTCACAAGATCT Ｉ−15 GGCTTCAATGGAGCACAGTACATTT Ｉ−16 AATTCGACGCATTCAAGCAGACTTAGCT ss DNAを次のようにして連結する。Ａ及びＩ−16以上
の各セグメント50pモルずつをT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて５′−燐酸化した。50pモルずつのすべて
の断片を、18μのプールとして１段階で、1.5時間に
わたって95℃から25℃に冷却することによりアニーリン
グした。1mMのATP、10mMのDTT、100mMのトリス−HCl、p
H7.8、10mMのMgCl2、１μg/mlのスペルミジン及びT4リ
ガーゼを含有する30μの反応容積中で連結（ligatio
n）を行った。次の方式１に示す断片の順序及び対形成
（pairing）から得られる適切な２重鎖断片を、７％ネ
イテップポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で精製し
た。
IGF IIのDNA配列を同様にして合成した。次の追加のs
s DNA断片を調製した。
標示 配 列 Ｂ−II−１ GTTACAGACCATCCGAAACCTTGTGTGGT Ｃ−II−２ GGTGAATTGGTCGACACCTTGCAATTCGT II−３ TCCAGACCAGCTTCCAGAGTTTCT Ｅ−II−４ AGAAGATCCAGAGGTATCGTT Ｆ−II−５ GAAGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTG Ｇ−II−６ GCTTTGTTGGAAACCTACTGTGCT Ｈ−II−７ ACCCCAGCTAAGTCTGAATGAATGCGTCG Ｊ−II−８ GTTTCGGATGGTCTGTAAGCCATAAGCGTCG Ｋ−II−９ AAGGTGTCGACCAATTCACCACCACACAAG Ｍ−II−10 AAGCTGGTCTGGAGAAGTAGAAAC II−11 CTGGATCTTCTAGAAACTCTGG II−12 GAAACAACATTCTTCAACGATACCT Ｎ−II−13 TTCCAACAAAGCCAAGTCACAAGATCT II−14 AGACTTAGCTGGGGTAGCACAGTAGGT II−15 AATTCGACGCATTCATTC これらのss DNA断片の200pモル及び断片Ａ、Ｄ及びＬ
を上記の方法と同様にして連結した。この場合、Ａ及び
II−15を燐酸化せず、次のようなセグメントの順序及び
対を生成せしめた。
合成DNA配列をpBR328のEco R I部位に挿入してプラス
ミドp328IGF I及びp328IGF IIを調製した。クローニン
グした後、IGFコード鎖を、Hga Iを用いて切り出した。
次に合成オリゴヌクレオチドアダプターを、Hga I制
限断片に連結した。IGF Iのためのアダプターは次の配
列を有する。
（ａ） ５′−AGCTGAAGCT−３′ ３′−CTTCGACCAGG−５′ （ｂ） ５′−CTGCTTGATAAG−３′ ３′−ACTATTCAGCT−５′ コードの鎖の方向に関して、第１アダプター（ａ）の
３′末端はIGF I合成配列上のHga I開裂部位と相補的で
あり、他方第１アダプターの５′末端はHin d III接着
末端を供する。第２アダプター（ｂ）はその５′末端に
おいて、IGF I配列の３′末端のHga I開裂部位に相補的
であり、他方アダプターの３′末端はSal I接着末端を
供する。
IGF IIについて、アダプターは次の配列を有する。
（ｃ） ５′−AGCTGAAGCT−３′ ３′−CTTCGACGAAT−５′ （ｄ） ５′−CTGAATGATAAG−３′ ３′−ACTATTCAGCT−５′ 第１アダプターに関して上記した方向に関して、
（ｃ）はその３′末端においてIGF II合成配列中の５′
−Hga I開裂部位に相補的であり、他方５′末端はHin d
III接着末端を供する。第２アダプター（ｄ）はその
５′末端においてIGF II合成配列中の第2Hga I開裂部位
に相補的であり、そしてその３末端においてSal I接着
末端を供する。
合成断片及びそれに連結したアダプターを調製用ゲル
電気泳動により精製し、そしてエンドヌクレアーゼHin
d III及びSal Iにより前もって完全消化しておいた100n
gのpAB113に連結した。pAB113はpAB112から、３個の63b
pHind III断片を除去することにより誘導した。pAB112
は、Hin d III及びSal I部位が除去されているpBR322の
Eco R I部位中でクローニングされた酵母α−ファクタ
ー遺伝子を有する1.8kb Eco R I断片を含有するプラス
ミドである。プラスミド112は、プラスミドYEp24のBam
H I部位中でクローニングされた部分Sau3A断片として酵
母α−ファクター遺伝子を含有するプラスミドpAB101か
ら誘導した。pAB101は、公表されているα−ファクター
コード領域（Kurjan及びHerskowitz,Abstracts 1981 Co
ld Spring Harbor meeting on th Molecular Biology o
f Yeasts,242頁）と相同の酵素的にP34放射性ラベルし
た合成オリゴヌクレオチドを用いてYEp24中でクローニ
ングされた酵母ゲノムライブラリをスクリーニングする
ことにより得た。
得られた混合物を用いてE.コリHB101の細胞を形質転
換し、そしてIGF I及びIGF IIについてそれぞれプラス
ミドpAB113−IGF−Ｉ及びpAB113−IGF−IIを得た。
それぞれIGF I及びIGF II構造遺伝子を有するプラス
ミドpAB113−IGF−Ｉ及びpAB113−IGF−II（各５μｇず
つ）をEco R Iにより完全消化し、そして得られた断片
を過剰のEco R I−Bam H Iアダプターに連結し、そして
Bam H Iで消化した。得られた1.8kb Bam H I断片を調製
用ゲル電気泳動により分離し、そして約100ngの各断片
を、あらかじめBam H Iで完全消化しそしてアルカリホ
スファターゼで処理した100ngのpC1/1に連結した。
プラスミドpC1/1はpJDB219,Beggs,Nature（1978）27
5:105,の誘導体であり、この場合pJDB219における細菌
プラスミドpMB9に対応する領域はpC1/1においてはpBR32
2により置き換えられている。各連結混合物を用いてE.
コリHB101細胞を形質転換した。形質転換体をアンピシ
リン耐性により選択し、そしてそのプラスミドを制限エ
ンドヌクレアーゼ消化により分析した。各構造遺伝子IG
F I又はIGF IIについて選択したそれぞれのクローンか
らのDNA,（pYIGF−Ｉ−10/1）又は（pYIGF−II−10/1）
を調製し、そしてこれを用いて酵母AB103細胞を形質転
換した。形質転換体をそのLeu+表現型により選択した。
プラスミド（pYIGF−Ｉ−10/1）により形質転換され
た酵母株AB103（α,pep 4−3,Leu 2−112,ura 3−52,hi
s 4−580）の培養物（５及び９）をロイシン不含培
地中で30℃にて飽和（光学濃度650nmにおいて５）まで
増殖せしめ、そしてさらに12時間30℃にて振とうを継続
した。細胞上澄液を遠心分離により各培養物から集め、
そしてIGF Iをイオン交換樹脂（Bio−Rad Laboratories
社，リッチモンド，カリホルニア製Biorex−70）への吸
着により濃縮した。80％エタノール中10mM HClにより溶
出した後、IGF分画（それぞれ0.4ml及び3ml）を全蛋白
質濃度及びIGF I濃度について測定した。蛋白質は、Bio
−Rad Laboratories社，リッチモンド，カリホルニア
製，クーマシーブルー（Coomassie Blue）により測定し
た。IGF I測定は、放射性ラベルしたIGF Iを用いる常用
の競争ラジオイムノアッセイにより行った。この結果を
次に示す。
プロラクチンに対するハト−そのうの反応を促進する
ペプチドの作動性効果に基くIGF Iのバイオアッセイ〔A
nderson等（1983）Soma tome dins/Insulin−Like Grow
th Factors,Spencer E.M.編，バルター，デグルター，
ベルリン〕により、これらの標品のIGF Iはヒトの血清
から分離された真正なIGF Iと同等の活性を有すること
が示された。
AB103（pYIGF−II−10/1）を上記と同様に増殖せし
め、そしてIGF IIについてのヒト−胎盤膜ラジオリセプ
ター測定〔Spencer等，（1979）Act.Endocrinal.91:36
−48〕により、3.9ユニット/mlが示された。正常なヒト
−血清は１ユニット/mlを有する。
この発明に従えば、ヒト−インシュリン様成長因子Ｉ
を発現し、プロセシングしそして分泌するためにベクタ
ーに挿入される新規な構成物が提供される。こうして、
天然のヒト−インシュリン様成長因子Ｉと同じ配列を有
するポリペプチドが得られる。分泌により、細胞数に対
して非常に増強された収量が得られ、そしてその後の調
製操作及び精製が単純化される。
以上説明及び例によりこの発明を幾分詳細に記載した
が、この発明の範囲内において幾つかの変化及び変法が
実施できることは言うまでもない。
なお、酵母菌株S.セレビシエー（S.cerevisiae）AB10
3（pYIGF−Ｉ−10/1）及びAB103（pYIGF−II−10/1）は
1983年４月23日にアメリカン・タイプ・カルチュア・コ
レクション（A.T.C.C）に寄託され、それぞれ番号No.20
673及びNo.20674が与えられた。
フロントページの続き (72)発明者 ギイ−・ミユレンバツハ アメリカ合衆国カリフオルニア・バ−ク レイ・グロ−ブ・ストリ−ト1324 (72)発明者 ミツキ−・エス・アルデイ− アメリカ合衆国カリフオルニア・サンフ ランシスコ・ア−ビング・ストリ−ト 209 (56)参考文献 特開 昭55−19092（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−164200（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．〔253〕 （1978）Ｐ．2769−2776 Ｓｃｉｅｎｃｅ．〔198〕（1977）Ｐ. 1056−1063 Ｃｅｌｌ，〔30〕（1982）Ｐ．933− 943

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】適切な酵母宿主中でのヒト−インシュリン
    様成長因子Ｉ（IGF I）の効率的製造方法であって、該
    宿主と適合性のベクター中転写開始領域から下流であっ
    てその転写制御のもとにある構造運伝子を構成するよう
    に、適切なリーディングフレーム内に酵母α−ファクタ
    ー分泌リーダー及びプロセシングシグナル配列と連結さ
    れたヒト−インシュリン様成長因子Ｉコード遺伝子を含
    有する機能的DNA構造物を含有する酵母宿主細胞を増殖
    せしめ、そして細胞外に分泌されたヒト−インシュリン
    様成長因子Ｉを分離することを含んで成る方法。
  2. 【請求項２】ヒト−インシュリン様成長因子Ｉ遺伝子が
    宿主により優先的に使用されるコドンを有する合成遺伝
    子である特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】ヒト−インシュリン様成長因子Ｉ遺伝子が
    次のヌクレオチド配列： を有する、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】ベクターが２μｍプラスミドの誘導体であ
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】酵母中でヒト−インシュリン様成長因子Ｉ
    を発現せしめ、酵母分泌及びプロセシングシグナルによ
    り促進される前記ヒト−インシュリン様成長因子Ｉの細
    胞外分泌をもたらす方法であって： ヒト−インシュリン様成長因子Ｉをコードする第1DNA配
    列を含有する第1DNA断片を調製し； 酵母α−ファクター分泌リーダー及びプロセシングシグ
    ナル配列をコードする第2DNA配列を含有する第2DNA断片
    を調製し； 前記第1DNA断片及び第2DNA断片をアダプターにより連結
    することにより「プレ」−ヒト−インシュリン様成長因
    子Ｉ遺伝子を調製し； そして、この「プレ」−ヒト−インシュリン様成長因子
    Ｉ遺伝子を酵母中の発現ベクター中にクローニングし、
    この「プレ」−ヒト−インシュリン様成長因子Ｉの分泌
    及びプロセシングが行われることを含んで成る特許請求
    の範囲第１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記発現ベクターが細菌により認識される
    複製系を含有する特許請求の範囲第５項記載の方法。
  7. 【請求項７】前記酵母複製系が２μｍプラスミド又はそ
    の部分を含んで成る特許請求の範囲第５項記載の方法。
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