FI93743C - Transskriptioon perustuvia nukleiinihappoamplifikaatio-/detektointijärjestelmiä - Google Patents

Transskriptioon perustuvia nukleiinihappoamplifikaatio-/detektointijärjestelmiä Download PDF

Info

Publication number
FI93743C
FI93743C FI896077A FI896077A FI93743C FI 93743 C FI93743 C FI 93743C FI 896077 A FI896077 A FI 896077A FI 896077 A FI896077 A FI 896077A FI 93743 C FI93743 C FI 93743C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
segment
sub
sequence
dna
primer
Prior art date
Application number
FI896077A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI93743B (fi
FI896077A0 (fi
Inventor
Deborah Yantis Kwoh
Raymond Thomas Gingeras
Ulrich Merten
Original Assignee
Siska Diagnostics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26744190&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI93743(C) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Siska Diagnostics Inc filed Critical Siska Diagnostics Inc
Publication of FI896077A0 publication Critical patent/FI896077A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI93743B publication Critical patent/FI93743B/fi
Publication of FI93743C publication Critical patent/FI93743C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6867—Replicase-based amplification, e.g. using Q-beta replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Radar Systems Or Details Thereof (AREA)
  • Indicating And Signalling Devices For Elevators (AREA)
  • Air Bags (AREA)

Description

93743
Transskriptioon perustuvia nukleiinihappoamplifikaa-tio-/detektointij är j estelmiä Tämä on 35 U.S.C 120/121:n alainen jatkohakemus 5 hakemukselle USSN 07/064141, joka on jätetty 19.6.1987, jonka sisältö mainitaan täten viitteenä.
Keksinnön kenttä Tämä keksintö koskee yleisesti ilmaistuna edistysaskelia molekyylibiologian ja molekyyligenetiikan alal-10 la.
Tarkemmin määriteltynä tämä keksintö koskee uusia menetelmiä ja välineistöjä, jotka sisältävät tarvittavat reagenssit ja välineet, vähintään yhden valitun nuk-leiinihapposegmentin (sekvenssin) tai sen komplementin tai 15 hybridisoituvan homologisen segmentin in vitro tai ex vivo -kopioluvun lisäämiseksi, ts. amplifoimiseksi näytteessä, joka sisältää yhtä tai useampaa nukleiinihappoa, joiden piiriin voi kuulua RNA, DNA tai molemmat.
Sovellutuksiin, joissa tämän keksinnön mukaisille 20 menetelmille ja välineistöille löytyy käyttöä, kuuluvat 1) elimistön nesteiden ja kudosten analysointi geneettiselle tai patogeeniselle sairaudelle tunnusmerkillisten tiettyjen nukleiinihapposekvenssien detektoimiseksi in vitro tai ex vivo -nukleiinihappokoetinhybridisaatiomäärityksin .25 ja 2) yhtenä kopiona esiintyvien tai harvinaisten tai heikosti ilmentyvin geenien selektiivinen kloonaus.
Keksinnön tausta
Suureen osaan molekyylibiologiassa, molekyyligenetiikassa ja niiden sovellutuksissa tehtävästä työstä, ku-30 ten esimerkiksi veressä olevien patogeenien tai viallisten *: geenien nukleiinihappokoetinhybridisaatiomäärityksiin, « * “ liittyy tietyn nukleiinihapposekvenssin detektointi tai eristäminen. Eräs tällaisen työn perusongelma on kiinnostuksen kohteena olevan nukleiinihapposekvenssin detektoin-35 ti tai eristäminen ja sitten kvantitatiivinen määrittämi- 2 93743 nen. Tämä ongelma on ollut vaikea, koska biologiset materiaalit, kuten soluviljelmät, kudosnäytteet ja verinäytteet, koostuvat tyypillisesti RNA- ja DNA-ko-konaisuuksien, joista enintään hyvin pienellä osalla on 5 kiinnostuksen kohteena oleva sekvenssi, monimutkaisesta seoksesta.
Nukleiinihappokoetinhybridisaatiomääritysten käytännön sovellutukset ovat itse asiassa olleet rajoitettuja, koska rutiinikäyttöön soveltuvien reagenssien 10 avulla ja hyväksyttävän lyhyessä ajassa tehtävien määritysten herkkyys on liian pieni kiinnostuksen kohteena olevien sekvenssien detektoimiseksi todellisissa näytteissä esiintyvänä pienenä pitoisuutena.
On käytetty kahta pohjimmiltaan erilaista lä-15 hestymistapaa ongelman kohtaamiseksi, joka koskee mo nimutkaisessa nukleiinihapposeoksessa pienenä pitoisuutena esiintyvän kiinnostuksen kohteena olevan nuk-leiinihapposekvenssin ("kohdesegmentin") detektointia.
Ensimmäisen lähestymistavan ollessa kyseessä ei 20 muuteta nukleiinihapon (mukaan luettuna kohdesegmentti) määrää näytteessä; sen sijaan liitetään kohdesegmenttiin signaalinmuodostusjärjestelmä, ja se tuottaa de-tektoitavissa olevan signaalin, joka edustaa koh-desegmenttimolekyylien lukumäärää. Menetellään esimerkiksi 25 siten, että nukleiinihappokoetin, jonka sekvenssi on komplementaarinen kohdesegmentin jonkin alasegmentin sekvenssille, kytketään entsyymiin, kuten alkaliseen fos-fataasiin, ja sekoitetaan näytteen kanssa hybridisaatio-olosuhteissa, jotka saavat aikaan hybridisaation koettimen 30 ja kohdesegmentin välillä (mutta ei mainittavasti koettimen ja näytteessä olevien muiden nuk- «· leiinihapposekvenssien välillä). Kun entsyymiin kytketty koetin, joka on jäänyt hybridisoitumatta, on poistettu, lisätään alkalisen fosfataasin kromogeenista substraattia 35 sopivissa olosuhteissa, ja periaatteessa syntyy nopeasti « 3 93743 suuri määrä detektoitavissa olevia värillisiä molekyylejä kutakin kohdesegmentin kanssa hybridisoitunutta koe-tinmolekyyliä kohden.
Alalla tunnetaan lukuisia muita järjestelmiä nuk-5 leiinihapposekvenssien detektoimiseksi muuttamatta koh- denukleiinihapon määrää näytteessä. Eräs esimerkki on nuk-leiinihappokoettimen tavanomainen leimaaminen radioaktiivisilla atomeilla, kuten 32P:lla, ja kohteen kans-sahybridisoituneen koettimen detektointi sitten ra-10 dioaktiivisten ytimien hajoamisen aikaansaaman vahvistetun signaalin kautta. Eräs muu esimerkki on kohdesegmenttiä vastaavan koettimen kytkeminen toiseen nukleiinihappoon, jolla on sellainen replikaatiokyky, että se on helposti detektoitavissa tunnetuin menetelmin. Tunnetaan tiettyjä 15 RNA:itä, jotka ovat alttiita replikaasin (autokatalyyt- tisesti) indusoimaan replikaatioon tiettyjen polymeraa-sien, kuten bakteriofagin RNA:sta riippuvan RNA-polyme-raasin, kuten Q-replikaasin ja kattaramosaiikkiviruksen (brome mosaic virus, BMV) replikaasin, vaikutuksesta. Täl-20 laisessa järjestelmässä sekä RNA että sekvenssiltään komplementaarinen RNA ovat templaatteja RNA-polymeraasin aikaansaamalle replikaatiolle; niinpä replikoituneen RNA:n määrä kasvaa eksponentiaalisesti ajan mittaan (niin kauan kun RNA-templaatiomolekyylien lukumäärä ei ylitä RNA-po-. 25 lymeraasimolekyylien lukumäärää järjestelmässä). Katso
Miele et ai., J. Mol. Biol. 171 (1983) 281. Järjestelmää, jossa kohdesegmentille tarkoitettu koetin kytketään RNA:hän, jolla on kyky replikoitua Q8-replikaasin vaikutuksesta, kuvaavat Chu et ai. [Nucl. Acids Res. 14 (1986) 30 5591], ja järjestelmää, jossa replikaatio tapahtuu BMV- :* replikaasin vaikutuksesta kuvaavat Marsh et ai. (Positive
Strand RNA Viruses, Proceedings of UCLA Symposium, 1986, Alan R. Liss pubi.. New York 1987).
Tällä ensimmäisellä lähestymistavalla on kaksi va-35 kavaa haittapuolta. Ensinnäkin monissa tapauksissa käytän- • · 4 93743 nöllisen kokoisessa näytteessä kohdesegmentin kopiomäärä on niin pieni, että jopa kohtuullisen nopeiden signaa-linmuodostusjär jestelmien ollessa kyseessä detektoitavissa olevan, merkittävästi taustan yläpuolelle kohoavan sig-5 naalin muodostamisen vaatima aika on epäkäytännöllisen pitkä. Toiseksi signaalinmuodostusta tapahtuu suurin piirtein samanaikaisesti "taustan" signaaleja muodostavista molekyyleistä ja kohteeseen liittyvistä signaaleja muodostavista molekyyleistä. "Taustan" aiheuttama signaali on 10 väistämätön kaikissa kohdesegmentin määrityksissä; ts.
poikkeuksetta esiintyy jonkin verran signaalia, jonka aiheuttaa suodattamiin tai muihin kiinteisiin kantajiin epä-spesifisesti tarttuva tai kohdesegmenttiä läheisesti muistuttavien segmenttien kanssa hybridisoituva koetin. Jos 15 kohteen kopiomäärä on liian alhainen, kohteesta ynnä taustasta tulevan signaalin (ts. "signaalin") ja taustasta tuleva signaalin (ts. "kohinan") aikavakiosuhde on liian alhainen tausta yläpuolelle selvästi kohoavan signaalin havaitsemiseksi. Nämä ja muut epäkohdat ovat johtaneet 20 alalla toiseen lähestymistapaan ongelman ratkaisemiseksi, jotka koskee monimutkaisessa nukleiinihapposeoksessa pienenä pitoisuutena esiintyvän kohdesegmentin detektointia.
Tämä toinen lähestymistapa on peruslähtökohdiltaan erilainen, ja siinä suurennetaan itse kohdesegmentin ko- ··/ 25 piolukua, edullisesti suuremmassa määrin kuin näytteessä » olevien muiden segmenttien, erityisesti sellaisten, jotka saatettaisiin virheellisesti detektoida kohdesegmenttinä sekvenssien samankaltaisuuksien vuoksi, kopiolukua. Esimerkkeihin tästä toisesta lähestymistavasta kuuluvat eri-30 laiset viljelymenetelmät, joissa aiheutetaan kohdeseg- mentin sisältävien solujen lukumäärän lisääntyminen, jos- « « kus nopeammin kuin muiden solujen lukumäärä, tai joissa niiden sisältämät tietyt nukleiinihapot (esimerkiksi plas-midit, RNA:t), joissa kohdesekvenssi sijaitsee, saatetaan 35 lisääntymään lukumäärältään.
5 93743 Tällaisten viljelymenetelmien epäkohtana on se, että ne ovat työläitä, ongelmallisia ja aikaavieviä ja niissä esiintyy se väistämätön ilmiö, että muutkin nukleiinihapot kuin kohdesegmentin sisältävät lisääntyvät 5 kopiomäärältään samanaikaisesti ja vahvistavat siten mahdollisesti "taustaa". Eräs haittapuoli on tuloksena oleva mahdollisesti vaarallisten organismien kasvu välttämättömänä vaiheena amplifikaation saavuttamiseksi.
Eräs esimerkki tästä toisesta lähestymistavasta on 10 DNA-kohdesegmentin amplifikaatio niin kutsutussa "polymeraasiketjureaktiossa" ("polymerase chain reaction, PCR"). Tämä menetelmä on lainattu sovellutus tunnetuista, luonnossa esiintyvistä prosesseista, joita esiintyy esimerkiksi tiettyjen virusyksiköiden yksisäikeisten DNA-ge-15 nomien replikaatioprosessissa, ja edustaa kaikissa tapauksissa sovellutusta, joka on sukua cDNA:n valmistukselle, jota kuvaavat Hong [Bioscience Reports 1 (1981) 243],
Cooke et ai. [J. Biol. Chemn. 255 (1980) 6502] ja Zoller et ai. [Methods in Enzymology 100 (1983) 468 - 500]. Tätä 20 menetelmää käytettäessä tietyn segmentin kopioluku kasvaa eksponentiaalisesti syklien lukumäärän funktiona, joista sykleistä kussakin (1) hybridisoidaan DNA-aluke kunkin kohdesegmentin ja sen komplementin (ts. segmentin, jonka sekvenssi on komplementaarinen kohdesegmentin sek-·. 25 venssille) 3'-terminaalisen alasegmentin kanssa, (2) laajennetaan kutakin aluketta DNA-polymeraasilla ja (3) muutetaan vaiheen (2) seurauksena muodostuneet kaksoissäikeet yksisäikeisiksi termisellä denaturaatiolla. Tätä menetelmää kuvaavat Saiki et ai. [Science 230 (1985) 1350] ja 30 Mullis et ai. (EP-hakemusjulkaisut 200 362 ja 201 184). Katso myös US-patenttijulkaisut 4 683 195 ja 4 683 202. Raporttien mukaan toteutettaessa tällä menetelmällä 20 sykliä 3 tunnin aikana voidaan kohdesegmentin kopioluku kasvattaa noin 105-kertaiseksi. Vain ne segmentin, joiden 35 kanssa spesifinen aluke hybridisoituu riittävän stabii- 6 93743 listi ketjulaajennuksen initioimiseksi polymeraasin vaikutuksesta, jolloin muodostuu komplementti, ja joilla on komplementti, jonka kanssa jokin toinen spesifinen aluke hybridisoituu vastaavasti, jolloin saadaan kohdesegmentti 5 ketjunlaajennuksessa, lisäävät eksponentiaalisesti ko- piolukuansa, kun taas muiden, ei-kohdesegmenttien, jotka eivät virheellisesti hybridisoidu käytetyn alukkeen kanssa, kopioluku kasvaa korkeintaan lineaarisesti, jos ollenkaan, ajan funktiona. Polymeraasiketjureaktiomenetel-10 mällä voidaan kasvattaa suuresti kohdesegmentin kopioluvun lisäksi myös kohdesegmentin määrän suhdetta näytteessä olevien taustaa aiheuttavien segmenttin määrään.
Seurauksena on luonnollisesti, että tätä toista lähestymistapaa voidaan soveltaa näytteeseen amplifioidul-15 le kohdesegmentille käytetyn ensimmäisen lähestymistavan yhteydessä, jolloin saadaan jopa vahvempi detektointisig-naali.
Tämän keksinnön eräänä päämääränä on ratkaista tekniikan tasoa vastaavien menetelmien ongelmat ja voittaa 20 epäkohdat, joita on lueteltu aiempien tutkijoiden yrityk sissä ratkaista mainitut ongelmat. Tämän keksinnön eräänä lisäpäämääränä on saada aikaan yksinkertainen menetelmä, jota voidaan käyttää hyväksyttävän lyhyessä ajassa, jossa käytetään tunnettuja reagensseja ja jolla on riittävä 25 tarkkuus yhtäpitävien tieteellisten tulosten saavut tamiseksi; menetelmä, jota voidaan käyttää toistettavissa olevassa määritysmenettelyssä ja joka soveltuu käytettäväksi laboratorio-/kliinisiin analyyseihin tarkoitetuissa välineistöissä.
30 Tämän keksinnön eräänä päämääränä on siten parantaa tiettyjen nukleiinihapposekvenssien (kohdesegmenttien) detektoitavuutta amplifioimalla mainittuja kohdesek-venssejä in vitro tai ex vivo -järjestelmässä ilman tekniikan tasoa vastaavien yritysten yhteydessä lueteltuja 35 haittapuolia.
• 7 93743 Tämä keksintö koskee uutta menetelmää toteuttaa toinen lähestymistapa monimutkaisessa nukleiinihapposeok-sessa pienenä pitoisuutena läsnä olevan kohdesegmentin detektoimiseksi. Siinä käytetään täydellisenä syklinä uut-5 ta RNA-transskriptin tuotantovaihetta kohdesekvenssin syn tetisoidun kaksisäikeisen cDNA-kopion yhteydessä ja johdoksena. Voidaan käyttää useita syklejä. Koska transskrip-tiovaihe on uutuuden hallitseva puoli, menetelmää on kätevä kutsua tässä yhteydessä transskriptioon perustuvaksi 10 aplifikaatiojärjestelmäksi (TAS, transcription-base ampli fication system). Tämän TAS-keksinnön mukainen uusi menetelmä johtaa valitun kohdesegmentin kopioluvun nopeaan kasvuun käyttämällä hyväksi DNA:sta riippuvan RNA-polyme-raasin kahta ominaisuutta: (1) transskription huomattavaa 15 initiaatiota lähtien vain pienestä määrästä kullekin poly-meraasille spesifisiä sekvenssejä [katso esimerkiksi Brown et ai., Nucl. Acids Res. 14 (1986) 3521]; ja (2) suuren transskriptimäärän nopeaa syntymistä (tyypillisesti 102 -104 tunnissa) kustakin RNA-polymeraasin tunnistamasta 20 promoottorikopiosta. Katso Milligan et ai., Nucl. Acids.
Res. 15 (1987) 8783. Keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan hyödyntää myös sekvenssiltään tietynlaisten RNAriden kykyä replikoitua (autokatalyyttisesti) nopeasti RNA:sta riippuvien RNA-replikaasien vaikutuksesta. Katso .25 myös Miele et ai., supra. Lisäksi se tarjoaa käyttöön standardointimenetelmän, joka mahdollistaa näytteessä olevan kohde-DNA:n määrän yksiselitteisen mittaamisen.
Tämä keksintö johtaa [ellei käytetä indusoitua (au-tokatalyyttistä) replikaatiota] yksisäikeiseen RNA-trans-30 skriptiin tai siitä muodostuneeseen RNA-DNA-kak-soissäikeeseen, ellei ryhdytä toimenpiteisiin sen muodostumisen estämiseksi, jossa on alasegmentti, jolla on kohdesegmentin sekvenssi tai kohdesegmentin sekvenssille komplementaarinen sekvenssi ja jota on läsnä suuri ylimää-35 rä suhteessa nukleiinihappoon, joka sisältää sek- 95743 8 venssiltään komplementaarisen alasegmentin. Tämä alussa vallitseva yksisäikeisen RNA-transskriptin ylimäärä on edullista tietyissä menetelmissä amplifioidun tuotteen detektoimiseksi leimatun nukleiinihappokoettimen avulla, 5 koska läsnä on vähän sekvenssiltään komplementaarista segmenttiä kilpailemassa koettimen kanssa hybridisoitumisesta amplifioituun tuotteeseen. Keksinnön mukaista yksisäi-keistä RNA-transskriptiotuotetta kopioituu myös enemmän tai vähemmän jatkuvasti, ja se mahdollistaa kohdesegmentin 10 suoraan detektoinnin tarvitsematta työläitä, virheille alttiita toistettuja PCR-syklejä ja säikeiden erottamista. Tällaisia etuja ei tarjota PCR-menetelmä, jossa syntyy kaksisäikeinen DNA (jonka toinen säie on kohdesegmentti ja toinen koostuu kohdesegmentin komplementista), joka täytyy 15 erottaa ennen detektointia ja vasta lukuisten toistettujen syklien jälkeen, jotka ovat välttämättömiä hyväksyttävien amplifikaatiotasojen saavuttamiseksi.
Tämän keksinnön mukaisilla menetelmillä saadaan aikaan valitun kohdesegmentin amplifikaatio vähintään yhtä 20 suuressa määrin kuin PCR-menetelmässä suunnilleen samassa ajassa mutta paljon yksinkertaisemmalla, paremmin toistettavissa olevalla ja luonnollisista tai muunlaisista prosesseista eroavalla tavalla.
Yhteenveto keksinnöstä 25 Olemme keksineet, miten bakteriofagin DNA:sta riip puvaa RNA-polymeraasia voidaan käyttää nukleiinihappo-näytteessä läsnä olevan kohdenukleiinihapposekvenssin (kohdesekvenssin tai -segmentin) nopeaan amplifiointiin (ts. kopioluvun lisäämiseen). Lisäksi olemme keksineet, 30 miten bakteriofagin DNA:sta riippuvaa RNA-polymeraasia voidaan käyttää yhdessä bakteriofagin RNA:sta riippuvan RNA-polymeraasin kanssa saman tuloksen saavuttamiseen. Tätä ennen ei ole ymmärretty, että tällaista bakteriofagin RNA-polymeraasia voitaisiin käyttää mainittuun tarkoituk-3"5 seen.
9 93743
Keksintö koskee näihin havaintoihin perustuvia menetelmiä ja välineistöjä menetelmien toteuttamiseksi.
Näitä menetelmiä ja välineistöjä on erityisen hyödyllistä käyttää nukleiinihapon, joka sisältää keksinnön 5 mukaisesti amplifioidun kohdesegmentin, nukleiinihap- pokoetinhybridisaatiomääritysten yhteydessä. Niinpä tämä keksintö koskee myös menetelmiä ja välineistöjä segmentin läsnä- tai poissaolon detektoimiseksi tiettyä segmenttiä sisältävässä nukleiinihapponäytteessä mainittuun seg-10 menttiin keksinnön mukaisen amplifikaation jälkeen hybri-disoidun koettimen avulla.
Tässä keksinnössä ovat uutta tietyt RNA-transskrip-tit ja niiden valmistus, mahdollinen replikaatio ja käyttö (sekvenssiltään) vastaavan kohdenukleiinihapposekvenssin 15 halutun amplifikaation ja detektoinnin aikaansaamiseksi.
Keksintö toteutetaan in vitro tai ex vivo -järjestelynä ja sitä käytetään yhdistettynä kohdesekvenssin kaksisäikeisen cDNA-kopion synteesiin, jonka tarkoituksena on valmistaa kaksisäikeinen nukleiinihappotemplaatti, jota puolestaan 20 käytetään mainittujen RNA-transskriptien tuotantoon. Tämä prosessi, jossa tehdään kaksisäikeisen cDNA:n synteesi ja RNA-transskriptio, muodostaa keksinnön mukaisen transkriptioon perustuvan amplifikaatiojärjestemän (TAS) yhden syklin. Tätä sykliä voidaan haluttaessa toistaa vielä kor-..25 keampien amplifikaatiotasojen saavuttamiseksi. Valmistus-ja (ja kopiointi-)menetelmänsä ansiosta transskriptit vastaavat (identtisesti tai komplementaarisesti) sekvenssiltään kohdenukleiinihapposekvenssiä, jota on alkuperäisessä näytteessä nukleiinihappojen seoksessa, ja siksi 30 amplifioidussa muodossa olevien transskriptien läsnäolo mahdollistaa niiden detektoinnin ja vastaavasti kohdenukleiinihapposekvenssin läsnä- tai poissaolon detektoinnin näytteessä in vitro tai ex vivo.
Niinpä tämä keksintö käsittää vähintään yhden tie-35 tyn nukleiinihapposekvenssin (kohdesekvenssin eli -segmen- « 10 93743 tin) detektoinnin nuklellnlhappopltoisessa näytteessä In vitro tai ex vivo. Keksintö on pelkistetyssä muodossa menetelmä, jossa valmistetaan kaksisäikeinen nukleiinihappo, joka sisältää kohdesekvenssiä vastaavan sekvenssin kytket-5 tynä toimivalla tavalla promoottoriinsa, käytetään mainittua kaksisäikeistä nukleiinihappoa kaksisäikeisenä nuk-leiinihappotemplaattina lukuisten RNA-transskriptien valmistamiseksi, joista kukin sisältää mainittua kohdesekvenssiä vastaavan RNA-sekvenssin, ja detektoidaan mainitun 10 RNA-sekvenssin läsnäolo ja analogisesti kohdesekvenssin läsnäolo.
Tämä keksintö koskee kaikkia menetelmiä ja välineitä, jotka liittyvät tällaisten RNA-transskriptien valmistukseen ja käyttöön. Niinpä tämä keksintö koskee mahdol-15 lisesti toistuvasti käytettävää edellä määriteltyä mene telmää mainitun kaksisäikeisen nukleiinihappotemplaatin valmistamiseksi, jossa hankitaan ensimmäinen nukleiinihap-poaluke, joka sisältää promoottorisekvenssin kytkettynä toimivalla tavalla edellä määriteltyyn kohdesekvenssin 20 jotakin segmenttiä vastaavaan sekvenssiin, hybridisoidaan sopivissa olosuhteissa mainittu ensimmäinen nukleiinihap-poaluke kohdesekvenssin kanssa nukleiinihappopitoisessa näytteessä, laajennetaan mainittua hybridisoitua ensimmäistä nukleiinihappoaluketta polymeraasilaajennusreak-25 tiossa komplementaarisesti kohdesekvenssiin nähden, jol loin muodostuu vastaava kaksisäikeinen nukleiinihappo, erotetaan mainitun kaksoissäikeen säikeet, hybridisoidaan erotettuun promoottorin sisältävään sekvenssisäikeeseen sopivissa olosuhteissa toinen nukleiinihappoaluke vastak-30 kaiseen päähän mainittuun promoottorisekvenssiin nähden, ja laajennetaan mainittua hybridisoitua toista nukleiinihappoaluketta polymeraasilaajennusreaktiossa komplementaarisesti mainittuun promoottorin sisältävään sekvenssiin nähden.
11 93743 Tämä keksintö koskee lisäksi multa ja vaihtoehtoisia menetelmiä ja välineitä mainitun kaksisäikelsen nuklelinlhappotemplaatin (supra) valmistamiseksi, esimerkiksi olennaisilta osiltaan yhdessä astiassa toteutettavaa 5 reaktiota, jossa hankitaan ensimmäinen nukleiinihap-poaluke, joka sisältää kohdesekvenssin jollekin segmentille komplementaariseen sekvenssiin toimivasti liitetyn promoottorisekvenssin, ja toinen nukleiinihappoaluke, jolla on kohdesekvenssin jonkin segmentin kanssa identtinen 10 sekvenssi, jotka alukkeet vastaavat mainitun kohdesekvenssin eri alueita, mutta eivät ole ollenkaan tai olennaisesti päälleikkäisiä kohdetta vastaavilta osiltaan, ja valitaan siten, että toisen laajennustuote voi komplementistaan erotettuna toimia toisen alukkeen laajennustuot-15 teen templaattina, ja saatetaan nukleiinihappopitoinen näyte, joka sisältää kohdesekvenssiä, kosketukseen mainittujen alukkeiden kanssa olosuhteissa, joissa tapahtuu peräkkäinen hybridisaatio ja säikeiden erottuminen, niin että syntyy puolestaan mainittujen alukkeiden laajennus-20 tuotteita.
Tämä keksintö koskee lisäksi menetelmiä ja välineitä detektoidun kohdesekvenssin määrän (detektoidun RNA-transskriptin määrän vastaavuuden kautta) standardoimiseksi korreloimalla se lisäksi sisäisenä standardina käytetyn *· 25 tunnetun nukleiinihapon läsnäoloon. Standardin kopioluku on ennalta määrätty, standardi kokee tämän keksinnön toteuttamisen aikana samat olosuhteet ja siten saman kohtalon kuin kohdesekvenssi ja siksi se toimii arviointivälineenä määritettäessä suhteellisia transskrip-30 timääriä, joita syntyy rinnakkain sille ja kohdesek-venssille.
• a Tämä keksintö koskee lisäksi saatujen edellä määriteltyjen RNA-transskriptien replikoitumista edelleen sen ansiosta että niissä on läsnä replikaasin tunnistuskohtia.
35 Tämä saadaan kätevästi aikaan hankkimalla edellä määritel- i 12 93743 ty ensimmäinen nukleiinihappoaluke, joka lisäksi sisältää replikaasin tunnistuskohtasekvenssin, edullisesti promoot-torisekvenssin ja kohdesekvenssiä vastaavan sekvenssin välissä, ja/tai lisäksi sisällyttämällä replikaasin tun-5 nistuskohta edellä määriteltyyn toiseen nukleiinihap-poalukkeeseen. Myöhemmässä transskriptiossa tuloksena olevat transskriptit sisältävät yhden tai useampia replikaasin tunnistuskohtia, niin että replikaasin läsnäolo (esimerkiksi reaktio tapahtumispaikassa tai välineistössä in-10 dusoi (autokatalyyttisesti) transskriptien replikaation, jossa syntyy lisää kopioita, detektoinnin helpottamiseksi edelleen.
Tämä keksintö koskee lisäksi välineistöjä, jotka sisältävät tarvittavat reagenssit ja niihin liittyvät vä-15 lineet, jotka ovat käyttökelpoisia vähintään yhden määrätyn nukleiinihapposekvenssin (kohdesekvenssin) detektoin-nissa in vitro tai ex vivo nukleiinihappopitoisesta näytteestä käyttämällä tässä määriteltyjä menetelmiä ja välineitä.
20 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 1. Piirrosten lyhyt kuvaus
Kuviot IA, IB ja 1C valaisevat keksinnön mukaista menetelmää nukleiinihapon (nukleiinihappo A), joka on DNA tai RNA, kohdesegmentin amplifioimiseksi valmistamalla - 25 useita kopioita ensimmäisestä RNA:sta (RNA I), jossa on segmentti, jonka sekvenssi on komplementaarinen kohdeseg-mentin sekvenssille.
Kuviot 2A, 2B ja 2C valaisevat kuvioissa IA, IB ja 1C valaistulla tavalla valmistetun RNA I:n segmentin kek-30 sinnön mukaista edelleenamplifointia, jolloin syntyy useita kopioita toisesta RNArsta (RNA II), jossa on segmentti, jonka sekvenssi on sama kuin RNA I:n valmistamiseksi amp-lifioidun kohdesegmentin osasegmentin.
Kuvio 3 esittää autoradiogrammeja, joissa näkyy 35 erilaisia HIV-RNA-pitoisuuksia amplifioituina TAS:lla sa- 4 13 93743 manaikaisesti vakiopitoisuutena läsnä olevan ihmisen β-globiinin nukleiinihapon kanssa.
Kuvio 4 esittää yleistä strategiaa, jolla DNA:sta riippuvan RNA-polymeraasin kautta tuotettu RNA johtaa RNA-5 molekyyliin, joka voi toimia templaattina RNA:sta riippuvalle replikaasille.
2. Yleiset menetelmät ja määritelmät Viittaamme tavanomaisiin molekyylibiologian oppikirjoihin, jotka sisältävät määritelmiä ja menetelmiä ja 10 välineitä tämän keksinnön yhteydessä käytettyjen perusmenetelmien toteuttamiseksi, kuten esimerkiksi DNA-koettimen tai alukkeen valmistus mukaan luettuna DNA-synteesi; hyb-ridisaatiomenetelmät mukaan luettuina ankaruusolosuhteiden vaihtelut suuremman tai pienenmmän hybridisaatiovarmuuden 15 aikaansaamiseksi alukkeen ja kohde-DNA-sekvenssin välisen homologia-asteen mukaan; promoottorien, tai tarkemmin määriteltynä promoottorien tai kohtien, joita tunnistavat bakteriofagin DNA:sta riippuva RNA-polymeraasi ja bakteriofagin RNA:sta riippuva RNA-polymeraasi tai käytettäessä 20 eukaryoottisia järjestelmiä viruksen DNA:sta ja RNA:sta riippuvat RNA-polymeraasit, esimerkiksi adenoviruksen koodi ttama RNA-polymeraasi ja kattaramosaiikkiviruksen RNA-polymeraasi, identifiointi, eristäminen tai valmistus; olosuhteet, jotka johtavat RNA-transskriptien, mukaan lu-- 25 ettuina niin kutsutut transskriptionedistyssekvenssit, tuotantoon; (indusoidun) replikaation mekanismi ja sen yhteydessä käytettävät menetelmät; polymeraasiketjureak-tiomenetelmät mukaan luettuina niissä käytettävät reagens-sit; jne. Katso esimerkiksi Maniatis et ai., Molecular 30 Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1982 ja siinä mainitut erilaiset viitteet; US-patenttijulkaisu 4 683 195; US-patenttijulkaisu 4 683 202; Hong, Bioscience Reports 1 (1981) 243; Cooke et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 6502; Zoller et ai., 35 Methods in Enzymology 100 (1983) 468 - 500; Crea et ai., 14 93743
Nucleic Acids Res. 8 (1980) 2331; Narang et al., Meth. Enzym. 68 (1979) 90; Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859; Brown et al., Meth. Enzym. 68 (1979) 109; Caruthers et al., Meth. Enzym. 154 (1985) 287; Hitzeman et 5 al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 2073; Lee et al., Science 239 (1988) 1288; Milligan et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987) 8783; Miller et al., Virology 125 (1983) 236;
Ahlguist et al., J. Mol. Biol. 153 (1981) 23; Miller et al., Nature 313 (1985) 68; Ahlquist et al., J. Mol. Biol.
10 172 (1984) 369; Ahlquist et al., Plant Mol. Biol. 3 (1984) 37; Ou et al., PNAS 79 (1982) 5235; Chu et al., Nucl. Acids Res. 14 (1986) 5591; EP-hakemusjulksisu 194 809; Marsh et al., Positive Strand RNA Viruses (Proceedings of UCLA Symposium 1986), Alan R. Liss, New York 1987, s.
15 327 - 336; Miller et al., J. Mol. Biol. 187 (1986) 537;
Stoflet et al., Science 239 (1988) 491; Murakawa et al., DNA 7 (1988) 287.
Kaikki edellä mainitut julkaisut mainitaan täten viitteinä.
20 Termillä "promoottori" tarkoitetaan nukleiinihap- posekvenssiä (luonnossa esiintyvää, synteettisesti valmistettua tai restriktiopilkkomistuotetta), jonka tunnistaa spesifisesti RNA-polymeraasi, joka sitoutuu tunnistettuun sekvenssiin ja initioi transskriptioprosessin, jossa syn-25 tyy RNA-transskripti. Se voi mahdollisesti sisältää varsinaisen tunnistuskohdan ulkopuolisia nukleotidiemäksiä, joiden ajatellaan antavan lisästabiiliutta hajoamista vastaan. Periaatteessa voidaan käyttää mitä tahansa promoottoria, jolle on olemassa tunnettu ja saatavissa oleva po-30 lymeraasi, jolla on kyky tunnistaa initaatiosekvenssi. Tyypillisiä, tunnettuja ja käyttökelpoisia promoottoreja ovat ne, joita tunnistavat tietyt bak-teriofagipolymeraasit, kuten bakteriofagin T3, T7 tai SP6 polymeraasit. Katso Siebenlist et al.. Cell 20 (1980) 269.
35 Nämä ovat ainoastaan esimerkkejä polymeraaseista, joita 15 93743 voidaan käyttää niihin liittyvien promoottorisekvenssien yhteydessä toteutettaessa käytännössä tätä keksintöä.
Keksinnön mukaiset "RNA-transskripti" on ribonuk-leiinihapposekvenssi, joka syntyy transskription initaa-5 tion jälkeen, joka tapahtuu RNA-polymeraasin tunnistettua promoottorisekvenssin (katso supra). Tällaisten transs-kriptien tuotanto on enemmän tai vähemmän jatkuvaa riippuen osittain läsnä olevan polymeraasin määrästä.
Termillä "aluke" tarkoitetaan tässä yhteydessä nuk-10 leiinihapposekvenssiä (luonnossa esiintyvää, synteettisesti valmistettua tai restriktiopilkontatuotetta), jolla on riittävä homologia kohdesekvenssin kanssa, niin että sillä on sopivissa hybridisaatio-olosuhteissa kyky hybridisoi-tua, ts. sitoutua kohdesekvenssiin. Tyypillinen aluke on 15 pituudeltaan vähintään noin 10 nukleotidia ja edullisimmin vähintään noin 35 nukleotidia ja edullisimmissa suoritusmuodoissaan se on identtinen tai hyvin homologinen kohdesekvenssin kanssa. Katso esimerkiksi EP-hakemusjulkaisu 128 042 (julkaistu 12. joulukuuta 1984).
20 Termi "toimivasti kytketty" tarkoittaa erityisesti promoottorisekvenssin alukesekvenssin sisäisen kytkennän yhteydessä lopullisen keksinnön mukaisen "kaksisäikeisen nukleiinihappotemplaatin" funktionaalisuutta, niin että templaatilla on kyky tuottaa vastaavia RNA-transskriptejä, • 25 kun sopiva polymeraasi tunnistaa promoottorin - katso sup ra.
Alukelaajennusreaktio kaksoissäikeen tuottamiseksi on sinänsä tunnettu. Katso viitteet supra. Tähän tarkoitukseen soveltuviin polymeraaseihin kuuluvat E. colin DNA-30 polymeraasi I, E. colin DNA-polymeraasin I:n Klenow-fragmentti, T4:n DNA-polymeraasi, käänteistransskriptaasi jne.
Menetelmä detektointisignaalin muodostamiseksi, kuten radioaktiivinen leimaaminen tai kromogeeniset keinot, joissa käytetään kromogeenisesti herkkää entsyymiä, 16 93743 ovat samoin alalla hyvin tunnettuja ja dokumentoituja. Katso supra.
"Replikaasin" käyttö keksinnön mukaisten RNA-trans-skriptien replikaation (autokatalyyttiseen) indusointiin 5 on alalla yleisesti tunnettua. Soveltuvia esimerkkejä tämän keksinnön yhteydessä käyttökelpoisista replikaaseista kuuluvat niin kutsuttu QB-virusreplikaasi, joka tunnistaa tiettyjä nukleiinihapposekvenssikohtia kyseisen RNA-trans-skriptin sekä 3'- että 5'-päästä, ja niin kutsutun kat-10 taramosaiikkiviruksen (BMV) samoin kuin alfa-viruksen rep-likaasit, joiden ajatellaan tunnistavan nukleiinihapposekvenssikohtia kyseisen RNA-transskriptin 3’-päästä. Näiden replikaasien tehtävänä on saada aikaan RNA-transskriptien ja niiden komplementtien replikaatio, ts. monistuminen, 15 niiden kopiomäärän monikertaistamiseksi. Kun tällaista entsyymiä on läsnä reaktiokohdassa transskriptioprosessin aikana, on ennalta nähtävissä, että useille transskrip-teille, joita syntyy transskription aikana, voi itselleen tapahtua replikaatio, jolloin RNA-transskriptiotuotteen 20 määrä kasvaa eksponentiaalisesti.
Sisäinen standardointi määritellään menetelmäksi, jota käytetään a) takaamaan, että TAS-amplifikaatio ei ole epäonnistunut menettelyvirheen vuoksi ja b) mittamaan koh-denukleiinihappopitoisuuksia suhteessa ennalta määrättyyn 25 määrään nukleiinihappoa, joka aina liittyy kiinostuksen kohteena olevaan näytteeseen. Tällainen sisäinen standardointi tehdään amplifioimalla rinnakkain osaa kohdesek-venssistä ja endogeenista sekvenssiä samassa reaktiossa. Tunnettessa biologisessa näytteessä läsnä oleva soluluku-30 määrä voitaisiin käyttää esimerkiksi yhtenä kopiona esiin-• tyvää geeniä (esimerkiksi β-globiinigeeniä) sisäisenä standardina, sillä se ei ilmenny RNA:n muodossa ja sen alkuperäinen kopioluku on kaksi kertaa solujen kokonaislukumäärä näytteessä. Amplifioimalla rinnakkain B-globii-35 nisekvenssejä ja kiinnostuksen kohteena olevia kohdesek- 17 93743 venssejä voidaan verrata ampllfloltuja signaaleja kiinnostuksen kohteena olevan kohdesekvenssln määrittämiseksi kvantitatiivisesti. Koska kussakin solussa (diploidisissa soluissa) on tätä sisäistä standardia kahtena kopiona 5 riippumatta siitä, sisältääkö biologinen näyte erillisiä kohdesekvenssejä (esimerkiksi HIV-sekvenssejä), odotetaan kunkin näytteen tuottavan postiiivisen amplifikaatiosig-naalin, jonka aiheuttaa sisäinen standari. Katso Groudine et ai., Nucleic Acids Research 12 (1984) 1427 ja McKnigt, 10 Cell 31 (1982) 355. Katso myös GB-hakemusjulkaisu 2 187 283 A (julkaistu 3. syyskuuta 1987).
3. Edullisten puolten yksityiskohtainen kuvaus Keksinnön eräs puoli on menetelmä kohdenuk-leiinihapposegmentin amplifioimiseksi, jolla segmentillä 15 on kaava I, 3'-(ensimmäinen alasegmentti )t-( toinen alasegmentti )t-( kolmas alasegmentti)t-5' (I) 20 jossa (ensimmäinen alasegmentti),. on vähintään 10 nukleotidista koostuva sekvenssiltään tunnettu nukleiini-happosegmentti, joka liittyy (toisen alasegmentin)t 3'-päähän, (toinen alasegmentti)t on 0 tai useammasta nuk-... 25 leotidista koostuva nukleiinihapposegmentti ja kolmas ala-segmentti)t on vähintään 10 nukleotidista koostuva sekvenssiltään tunnettu nukleiinihapposegmentti, joka liittyy (toisen alasegmentin)t 5'-päähän, jossa menetelmässä (1) hybridisoidaan mainitun kohdesegmentin (en-30 simmäiseen alasegmenttiin)t ensimmäinen aluke, joka on yk- sisäikeinen DNA, joka sisältää 3'-terminaalisen alasegmen- tin, jolla on kaava II, 5' - (promoottori)x- (vaihteleva alasegmentti)x- (3' -alukeala-35 segmentti )x-3' (II) 18 93743 jossa (promoottori)! on yksisäikeinen DNA-segmentti, jolla on bakteriofagin DNA:sta riippuvalle RNA-polymeraasille spesifisen promoottorin plus-säikeen sekvenssi, (vaih-televa alasegmentti)x on 0 - 100 nukleotidista koostuva 5 yksisäikeinen DNA-segmentti, joka liittyy (promoottorin)! 3*-terminaaliseen nukleotidiin ja (3'-alukealasegmentin)! 5'-terminaaliseen nukleotidiin, ja (3'-alukealasegmentti)x on vähintään 10 nukleotidista koostuva yksisäikeinen DNA-segmentti, jossa on sekvenssi, joka on komplementaarinen 10 (ensimmäisen alasegmentin)t alasegmentin, joka päättyy (ensimmäisen alasegmentin)t 3'-terminaalisella nukleotidilla, sekvenssille, jolloin mainittu (promoottori)! liittyy mainitun (31-alukealasegmentin)! 5'-päähän, jos mainittu (vaihteleva alasegmentti)! sisältää 0 nukleotidia; 15 (2) laajennetaan mainittua vaiheen (1) mukaisesti hybridisoitua ensimmäistä aluketta ensimmäisen DNA-polyme-raasin katalysoimassa reaktiossa, jolloin muodostuu ensimmäinen komplementaarinen DNA-segmentti, joka sisältää alasegmentin, jolla on kaava III, 20 5? - (promoottori) (vaihteleva alasegmentti )j-(ensimmäinen alasegmentti) tc- (toinen alasegmentti) tc- (kolmas alaseg mentti )tc-3 ' (III) 25 jossa (ensimmäinen alasegmentti)tc on DNA-segmentti, jossa on (ensimmäisen alasegmentin)t sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, (toinen alasegmentti)tc on DNA-seg-30 mentti, jossa on (toisen alasegmentin)t sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, ja (kolmas alasegmentti)tc on DNA-segmentti, jossa on (kolmannen alasegmentin),. sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, sillä edellytyksellä, että jos kohdesegmentti on RNA-segmentti, mainittu ensimmäinen '35 DNA-polymeraasi on käänteistransskriptaasi; 19 93743 (3) muutetaan yksisäikeiseksi valheen (2) reaktiossa muodostunut kaksoissäle; (4) hybrldlsoldaan mainitun, kaavan III mukaisen ensimmäisen komplementaarisen DNA:n (kolmanteen osaseg-
5 menttiin)tc toinen aluke, joka on vähintään 10 nukleotidista koostuva yksisäikeinen DNA, jolla on kaava IV
3' - (5' -alukealasegmentti) 2- (vaihteleva alasegmentt 1) 2- 5' (IV) 10 jossa (5'-alukealasegmentillä)2 on (kolmannen alasegmen-tin)t alasegmentin, joka päättyy (kolmannen alasegmentin)t 5'-terminaalisella nukleotidilla, sekvenssi ja jossa (vaihteleva alasegmentt!)2 on 0 - 100 nukleotidista koos-15 tuva segmentti, joka liittyy (5'-alukealasegmentin)2 5'-päähän; (5) laajennetaan mainittua vaiheen (4) mukaisesti hybridisoitua toista alukesegmenttiä toisen DNA-polymeraasin katalysoimassa reaktiossa, jolloin muodostuu toinen 20 komplementaarinen DNA-segmentti, joka sisältää alasegmen tin, jolla on kaava V, 5'-(vaihteleva alasegmentt!)2-(kolmas alasegmentt! )t-(toinen alasegmentti)t-( ensimmäinen alasegmentti) t- (vaihteleva .. 25 alasegmentt!)lc-(promoottori)lc-3' (V) jossa (vaihteleva alasegmentti)lc on DNA-segmentti, jossa on (vaihtelevan alasegmentin)! sekvenssille komplemen-30 taarinen sekvenssi, ja (promoottori)lc on DNA-segmentti, jossa on (promoottorin)! sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, sillä edellytyksellä, että mainittu toinen DNA-polymeraasi on sama tai eri kuin mainittu ensimmäinen DNA-polymeraasi; ja 93743 20 (6) käytetään vaiheen (5) kaksisäikeistä tuotetta templaattina reaktiossa, jota katalysoi ensimmäinen bakteriofagin DNA:sta riippuva RNA-polymeraasi, joka tunnistaa promoottorin, jonka toinen säie on (promoottori)!, jol-5 loin saadaan ensimmäinen RNA-tuote, jolla on kaava VI, 5'-(vaihteleva alasegmentti)lr -(ensimmäinen alaseg- mentti) tcr- (toinen alasegmentti) trc- (kolmas alasegmentti) tcr-(vaihteleva alasegmentti) 2cr-3' 10 (VI) jossa (vaihteleva alasegmentti)lr on RNA-segmentti, jossa on (vaihtelevan alasegmentin)! sekvenssi, (ensimmäinen ala-segmentti) tcr on RNA-segmentti, jossa on (ensimmäisen ala-15 segmentin)t sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, (toinen alasegmentti)tcr on RNA-segmentti, jossa on (toisen ala-segmentin )t sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, (kolmas alasegmentti)tcr on RNA-segmentti, jossa on (kolmannen alasegmentin)t sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, ja 20 (vaihteleva alasegmentti )2cr on RNA-segmentti, jossa on (vaihtelevan alasegmentin)2 sekvenssille komplementaarinen sekvenssi.
Eräänä puolenaan keksintö koskee menetelmää, jossa (ensimmäinen alasegmentti),. on pituudeltaan vähintään 10 25 nukleotidia ja sillä on kaava XIII
3'-(ensimmäinen alasegmentti)t2-(ensimmäinen alaseg mentti )tl- 5 ' (XIII) 30 jossa (ensimmäinen alasegmentti)t2 sisältää 0 tai useampia nukleotideja ja, jos niitä on enemmän kuin 0, liittyy (ensimmäisen alasegmentin)tl 3'-päähän ja (ensimmäinen alasegmentti )tl on pituudeltaan vähintään 10 nukleotidia; jossa 35 (kolmannella alasegmentillä)t on kaava XIV, • 21 93743 3'-(kolmas alasegmentti )tl-(kolmas alasegmentti )t2-5 ’ (XIV) jossa (kolmas alasegmentti)t2 sisältää 0 tai useampia nuk-5 leotideja ja, jos niitä on enemmän kuin 0, liittyy (kolmannen alasegmentin)tl 5'-päähän ja (kolmas alasegmentti)tl on pituudeltaan vähintään 10 nukleotidia; jossa (3’-aluke-alasegmentin)1 sekvenssi on komplementaarinen kohdesegmen-tin, joka koostuu koko (ensimmäisestä alasegmentistä)t2 ja 10 (ensimmäisen alasegmentin)tl 0 tai useammasta nukleotidista, jonkin alasegmentin sekvenssille; jossa (5'-alukeala-segmentti)2 on alasegmentti, joka koostuu koko (kolmannesta alasegmentistä)t2 ja (kolmannen alasegmentin)tl 0 tai useammasta nukleotidista; ja jossa vaiheiden 1-6 (supra) jäl-15 keen RNA-alasegmenttiä, jolla on kaava VII, 5 ' - (ensimmäinen alasegmentti) tlcr- (toinen alasegmentti) tcr-(kolmas alasegmentti) tlcr-3' (VII) 20 jossa (ensimmäinen alasegmentti)tlcr on RNA-segmentti, jossa on (ensimmäisen alasegmentin)tl sekvenssille komplementaarinen sekvenssi ja (kolmas alasegmentti)tlcr on RNA-segmentti, jossa on (kolmannen alasegmentin)tl sekvenssille ;· 25 komplementaarinen sekvenssi, amplifioidaan edelleen menetelmällä, jossa (7) hybridisoidaan mainittuun kaavan VI mukaiseen ensimmäiseen RNA-tuotteeseen kolmas aluke, joka on yk-sisäikeinen DNA, joka sisältää 3-terminaalisen alasegmen-30 tin, jolla on kaava VIII, • · • · 5' - (promoottori )3- (vaihteleva alasegmentti )3- (3 ’ -alukeala-segmentti )3-3' 35 * (VIII) 22 93743 jossa (promoottori)3 on yksisäikeinen DNA-segmentti, jossa on bakteriofagin DNA:sta riippuvalle RNA-polymeraasille spesifisen promoottorin plus-säikeen sekvenssi, jolloin mainittu (promoottorin)3 sekvenssi on sama tai eri kuin 5 (promoottorin)! sekvenssi, (vaihteleva alasegmentti)3 on yksisäikeinen 0 - 100 nukleotidista koostuva DNA-seg- mentti, joka liittyy (promoottorin)3 3'-terminaaliseen nukleotidiin ja (3' -alukealasegmentin)3 5'-terminaaliseen nukleotidiin, ja (3'-alukealasegmentti)3 on yksisäikeinen DNA-10 segmentti, jolla on sama sekvenssi kuin (kolmannella ala-segmentillä )tl ja joka liittyy (promoottorin)3 3'-ter minaaliseen nukleotidiin, jos (vaihteleva alasegmentti)3 sisältää 0 nukleotidia; (8) laajennetaan mainittua vaiheen 7 mukaisesti 15 hybridisoitua kolmatta aluketta kolmannen DNA-polymeraa- sin, joka on käänteistransskriptaasi ja sama tai eri kuin mainitut ensimmäinen ja toinen DNA-polymeraasi, katalysoimassa reaktiossa, jolloin muodostuu kolmas komplementaarinen DNA-segmentti, joka sisältää 3'-terminaalisen 20 alasegmentin, jolla on kaava IX, 5 ' — (promoottori ) 3- (vaihteleva alasegmentti) 3-kolmas alasegmentti )tl-( toinen alasegmentti )t-( ensimmäinen alasegmentti )tl-( ensimmäinen alasegmentti )t2-( vaihteleva alaseg-25 mentti)lc-3' (IX) jossa (vaihteleva alasegmentti)lc on DNA, jossa on (vaih-televan alasegmentin)! sekvenssille komplementaarinen sek-30 venssi; (9) muutetaan yksisäikeiseksi vaiheen 8 reaktiossa muodostunut kaksoissäie; (10) hybridisoidaan reaktiovaiheessa 8 valmistettuun kolmanteen komplementaariseen DNA:hän neljäs aluke, 35 jolla on kaava X, • 23 93743 5' — (vaihteleva alasegmentti )4- (5-alukealasegmentti )4 (X) jossa (vaihteleva alasegmentti)4 on 0 - 100 nukleotidista 5 koostuva segmentti ja (5'-alukealasegmentti)4 on sekvenssiltään tunnettu alasegmentti, joka liittyy (vaih-televan alasegmentin)4 3'-nukleotidiin, jos (vaihteleva alasegmentti)4 sisältää enemmän kuin 0 nukleotidia, ja joka sisältää vähintään 10 nukleotidia segmentistä, jolla on 10 kaava XX, 5 ’ -(vaihteleva alasegmentti )2-(ensimmäinen alasegmentti )t2c-(ensimmäinen alasegmentti) tlc-3' (XX) 15 jossa (ensimmäinen alasegmentti)t2c on DNA-segmentti, jossa on (ensimmäinen alasegmentin)t2 sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, ja (ensimmäinen alasegmentti)tlc on DNA-segmentti, jossa on (ensimmäisen alasegmentin)tl sek-20 venssille komplementaarinen sekvenssi, sillä edellytyk sellä, että vähintään yksi mainituista vähintään 10 nukleotidista (ensimmäisen alasegmentin)tlc 5'-terminaalisen nukleotidin kohdalla tai 5'-suuntaan siitä; (11) laajennetaan mainittua vaiheen 10 mukaisesti .. 25 hybridisoitua neljättä aluketta neljännen DNA-polymeraa- sin, joka on sama tai eri kuin mainitut ensimmäinen, toinen ja kolmas DNA-polymeraasi, katalysoimassa reaktiossa, jolloin muodostuu neljäs komplementaarinen DNA, joka sisältää segmentin, jolla on kaava XI, 30 5'-(ensimmäinen alasegmentti)tlc-(toinen segmentti)tc-(kolmas alasegmentti )tlc-( vaihteleva alasegmentti )3c-( promoottori )3c-3* 35 9 L l 9 (XI) 24 93743 jossa (toinen segmentti )tc on DNA-segmentti, jossa on (toisen alasegmentin),. sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, (kolmas alasegmentti)tlc on DNA-segmentti, jossa on (kolmannen alasegmentin)tl sekvenssille komplementaarinen 5 sekvenssi, (vaihteleva alasegmentti)3c on DNA-segmentti, jossa on (vaihtelevan alasegmentin)3 sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, ja (promoottori)3c on DNA-segmentti, jossa on (promoottori)3:n sekvenssille komplementaarinen sekvenssi; ja 10 (12) käytetään vaiheen 11 kaksisäikeistä tuotetta templaattina reaktiossa, jota katalysoi toinen bakteriofagin DNA;sta riippuva RNA-polymeraasi, joka on sama tai eri kuin mainittu ensimmäinen bakteriofagin DNA:sta riippuva RNA-polymeraasi ja joka tunnistaa promoottorin, 15 jonka toinen säie on (promoottori)3, jolloin saadaan toinen RNA-tuote, jossa on 5'-terminaalinen alasegmentti, jolla on kaava XII, 5' - (vaihteleva alasegmentti )3r-( kolmas alasegmentti )tlr-20 (toinen alasegmentti )tr-( ensimmäinen alasegmentti )tlr-X12-(vaihteleva alasegmentti )4rc-3' (XII) jossa (vaihteleva alasegmentti)3r on RNA-segmentti, jossa 25 on (vaihtelevan alasegmentin)3 sekvenssi, (kolmas alasegmentti )tlr on RNA-segmentti, jossa on (kolmannen alasegmen-tin)tl sekvenssi, (toinen alasegmentti)tr on RNA-segmentti, jossa on (toisen alasegmentin)t sekvenssi, (ensimmäinen alasegmentti)tlr on RNA-segmentti, jossa on (ensimmäisen 30 alasegmentin)tl sekvenssi, (vaihteleva alasegmentti )4cr on RNA-segmentti, jossa on (vaihtelevan alasegmentin)4 sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, ja X12 on RNA-segmentti, jossa on (5'-alukealasegmentin)4 alasegmentin, joka on 5'-suuntaan (ensimmäisen alasegmentin)tlc 5'-päästä, sek-35 venssille komplementaarinen sekvenssi.
25 93743
Kuten mainittiin (supra) keksintö koskee myös välineistöjä keksinnön mukaisten amplifikaatiomenetelmien toteuttamiseksi. Keksinnön mukainen menetelmä, jossa valmistetaan ensimmäinen RNA-tuote, ollessa kyseessä keksinnön 5 mukainen välineistö sisältää mainitut kaksi aluketta, vastaavan bakteriofagin DNA:sta riippuvan RNA-polymeraasin ja DNA-polymeraasin. Välineistö keksinnön mukaisen menetelmän, jossa valmistetaan sekä ensimmäinen että toinen RNA-tuote, toteuttamiseksi sisältää neljä sopivaa aluketta 10 (kaksi kahden alukkeen yhdistelmää) ja vastaavat tarvittavat polymeraasit.
Keksinnön mukaiset menetelmät ja välineistöt nuk-leiinihappohybridisaatiokoetinmääritysten tekemiseksi, joissa amplifioidaan kohde segmenttiä keksinnön mukaisesti, 15 sisältävät amplifikaatiomenetelmien vaiheiden ja amplifi-kaatiovälineistöjen komponenttien lisäksi vaiheet ja komponentit, jotka tarvitaan keksinnön mukaisesta amplifikaa-tiosta seuraavan RNA-tuotteen detektointiin. Ammattimiehet tuntevat erilaiset lisävaiheet ja vastaavat komponentit, 20 joita tarvitaan amplifikaatioprosessista saatavan RNA:n detektointiin millä tahansa lukuisista alalla tunnetuista nukleiinihappokoetinhybridisaatiomääritysmenetelmistä. Erästä edullista n u k 1 e i i n i h a p p o k o e t i n -hybridisaatiomääritysmenetelmää, jossa sidotaan helmille 25 leimattu RNA-amplifikaatiotuote, valaistaan jäljempänä esimerkissä II.
(3' -alukealasegmentti)lf (5' -alukealasegmentti )2, (3'-alukealasegmentti)3 ja ( 5'-alukealasegmentti)4 sisältävät edullisesti 20 - 40 nukleotidia ja edullisemmin noin 30 30 nukleotidia, jotta saadaan parannetuksi spesifisyyttä, ·; jolla eri alukkeet sitoutuvat kohdesegmenttien, joita py ritään amplifioimaan, päihin.
On myös edullista, että kiinnostuksen kohteena olevan nukleiinihapon kohdesegmentti, joka valitaan ampli-35 fioitavaksi, valitaan [(ensimmäisen alasegmentin)t ja (koi- 26 93743 mannen alasegmentin)t valinnan kautta] siten, että (toinen alasegmentti)tr sisältää vähintään 30, ja edullisemmin vähintään noin 50, nukleotidia. Tämä mahdollistaa (toisen alasegmentin)tcr tai (toisen alasegmentin)tr käytön amplifi-5 oidussa RNA-tuotteessa kohteina nukleiinihappokoettimille, joissa ei ole minkään alukealasegmentin sekvenssin kanssa päälleikkäisiä sekvenssejä.
Vaikka bakteriofagin DNA:sta riippuvan RNA-polyme-raasin yhteydessä voidaan käyttää yli 1 000 emäsparin (ep) 10 pituisia templaatteja, niiden transskriptioteho heikkenee templaatin pidentyessä. Niinpä suositaan alle 1 000 emäksen pituisia kohdesegmenttejä.
On edullista käyttää RNA-synteesissä käytetyn alu-keyhdistelmän kanssa identtistä yhdistelmää RNA:n tuotan-15 toon toisessa TAS-syklissä. Kuten RNA:n tuotantoa kuvaavassa osassa mainittiin, alukepari ei saisi olla päällekkäinen. Toteutettaessa keksinnön mukaista menetelmää, jossa RNA:n tuotanto on toivottua, on mahdollista, että koh-desegmentin alasegmentti, jonka segmentti on komplemen-20 taarinen (5'-alukealasegmentin)4 sekvenssille, on 5'-suuntaan kohdesegmentin alasegmentistä, jonka sekvenssi on komplementaarinen (3' alukealasegmentin)L sekvenssille, eikä mene päällekkäin sen kanssa. Samoin on edullista, että kohdesegmentin alasegmentti, jolla on sama sekvenssi kuin 25 (3’-alukealasegmentillä)3, on 3'-suuntaan kohdesegmentin alasegmentistä, jolla on sama sekvenssi kuin (5'-aluke-alasegmentillä)2, eikä mene päällekkäin sen kanssa. Tämä strategia voi olla edullinen, koska se vähentää eri aluk-keiden välistä kilpailua samoista kohdista ja voi siten 30 parantaa merkittävästi keksinnön mukaisen amplifikaation . tehoa. Jos alukeparit ovat keskenään jonkin verran pääl lekkäisiä, on edullista poistaa mahdollinen käytännön ensimmäinen alukepari ennen toisen parin käyttöä.
Tämän keksinnön yhteydessä ovat tärkeässä asemassa 35 bakteriofagin DNA:sta riippuvat RNA-polymeraasit, koska ne 27 93743 ovat hyvin spesifisiä tietyille promoottoreille. Muitakin polymeraaseja, jotka ovat samoin voimakkaasti spesifisiä tietyille promoottoreille, voitaisiin käyttää tämän keksinnön mukaisesti bakteriofagipolymeraasien sijasta, ja 5 tämän keksinnön tarkoituksena on kattaa myös tällaiset muut polymeraasit.
Bakteriofagien DNA:sta riippuvista RNA-polymeraa-seista ovat edullisia T7:stä, T3:sta ja SP6:sta saatavat. Edullisia näiden polymeraasien yhteydessä käytettäviksi 10 soveltuvia promoottoreja kuvataan esimerkeissä ja patenttivaatimuksissa, mutta alalla tunnetaan lukuisia muita näiden polymeraasien tunnistamia promoottoreja ja niitä voidaan käyttää yhtä hyvin.
Keksinnön mukaisesti voidaan lisäksi käyttää muista 15 bakteriofageista kuin näistä kolmesta edullisesta saatavia polymeraaseja ja tällaisten muiden polymeraasien tunnistamia promoottoreja.
Tämän keksinnön mukaisissa menetelmissä on edullista käyttää DNA-polymeraaseina käänteistransskriptaaseja ja 20 DNA-polymeraaseja, joilta puuttuu 5’-*4'-eksonukleaasi-aktiivisuus. Edullisinta on käyttää yhtä DNA-polymeraasia menetelmien kaikissa vaiheissa. Edullisempia DNA-polymeraaseja ovat AMV-käänteistransskriptaasi ja yhdistelmä-MMLV-käänteistransskriptaasi. Muutkin polymeraasit ovat :* 25 kuitenkin hyväksyttäviä, kuten lämpöstabiili Thermus aquatigusin DNA-polymeraasi [katso Chien et ai., J. Bac-teriol. 127 (1976) 1550], yhdistelmä-T7-DNA-polymeraasi
Sequenase™ (valmistaja U.S. Biochemicals Corp., Cleveland, Ohio, USA), hyvin tunnettu E. colin DNA-polymeraasi I:n 30 Klenow-fragmentti ja vasikan kateenkorvan DNA-polymeraasi .*. alfa.
Erilaisten alukkeiden mahdollisesti sisältämillä "vaihtelevilla alasegmenteillä" on kolme tehtävää. Itse asiassa niitä voitaisiin oikeammin kutsua "monitoimiala-35 segmenteiksi". Ensinnäkin, promoottoreja sisältävien en- 28 93743 simmäisen ja kolmannen alukkeen ollessa kyseessä, promoot-torialasegmentit sisältävät edullisesti transskrip-tionaloitussekvenssejä, jotka ovat promoottoria vastaavan RNA-polymeraasin suosimia. Toiseksi, kaikkien alukkeiden 5 ollessa kyseessä, vaihteleva alasegmentti voi mahdollisesti sisältää määrätyn segmentin, jolla amplifikaatiosta saatava RNA-tuote voidaan detektoida nukleiinihappokoetin-hybridisaatiomäärityskessä. Amplifikaatio (ja määritys) voi itse asiassa tapahtua samanaikaisesti muutaman erilai-10 sen kohdesegmentin kohdalla käytettäessä alukeyhdistelmiä, joissa alukkeet sisältävät erilaisen tunnistussegmentin [esimerkiksi (3'-alukealasegmentti)x] mutta yhteisen vaih-televan alasegmentin. Vaihteleva alasegmentti voi sisältää myös polykytkijäsekvenssin, joka sisältää kätevästi useita 15 restriktiokohtia myöhemmän kloonaamisen helpottamiseksi.
Lopuksi mainittakoon, että vaihtelevia alasegmenttejä voidaan käyttää sisällyttämään RNA-amplifikaatiotuotteeseen sekvenssejä, joita tarvitaan mahdollistamaan RNA-tuotteen (autokatalyyttinen) replikaatio bakteriofagin RNA-spesifi-20 sen RNA-polymeraasin, kuten QB-replikaasin (Miele et ai., supra) ja vaippa-mRNA:n synteesiä edistävä kasviviruksen RNA-3-kromosomin BMV-sekvenssien vaikutuksesta. Katso Ahlquist et ai., J. Mol. Biol. 172 (1984) 369; Ahlquist et ai.. Plant Mol. Biol. 3 (1984) 37; Ahlquist et ai., J.
.· 25 Mol. Biol. 153 (1981) 23; Miller et ai., Nature 313 (1985) 68; Miller et ai., Virology 125 (1983) 236; Ou et ai., PNAS 79 (1982) 5235.
Alalla tunnetun Q6-replikaasin ollessa kyseessä tämä tehdään edullisesti sisällyttämällä (vaihtelevaan 30 alasegmenttiin)2 sekvenssi 5’-CGCGCTCTCCCA-. GGTGACGCCTCGAGAAGAGGCGCGACCTTCGTGC-3' ja vaihtelevaan ala- segmenttiin )j sekvenssi 5 *-TGGGGAACCCCCCTTCGGGGG- TCACCTCGCGCAGC-3’ tai sisällyttämällä (vaihtelevaan ala-segmenttiin )4 sekvenssi 5'-CGCGCTCTCCCAGGTGACGCCTCGAGAAG-35 AGGCGCGACCTTCGTGC-3' ja (vaihtelevaan alasegmenttiin)3 sek- 29 93743 venssi 5'-TGGGGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3' ja replikoimalla sitten (autokatalyyttisesti) toinen RNA-tuote (ts. RNA II kuviossa 1; katso myös kuvio 4).
Samoin tunnetuin BMV-replikaasin käytön yhteydessä 5 tämä tehdään edullisesti sisällyttämällä vaihtelevaan sekvenssiin 2 BMV:tä varten seuraava sekvenssi (emäkset 1 -25) (HIV-esimerkin, infra, mukaisen käytön yhteydessä): BMV-promoottori TCS 87 - 29 (HIV-spesifinen) 10 10 20 30 40
I I I I
5'-AAGATCTATGTCCTAATTCAGCGTA|ACAGCATATGTATGTTCAGGGA 50
15 I
AAGCTA-3* (54 emästä) ydinsekvenssiksi; AU-rikasta sekvenssiä 5'-suuntaan siitä voidaan lisäksi käyttää edistämään BMV-peräisen replikaasin aktiivisuutta. Tätä oligo-nukleotidia on määrä käyttää toisena alukkeena. Tämän toi-20 sen alukkeen yhteydessä käytettävä ensimmäinen aluke on T7-pohjainen, HIV-spesifinen aluke.
BMV-promoottori TCS =87-34
25 +1S
10 20 30 40 50
I . I , I I I
TAATACGACTCACTATA|GGGA|CACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAATAAGG (52 emästä).
30 Seuraavissa esimerkeissä esitetään lisää keksintöä rajoittamattomia yksityiskohtia sen ymmärtämisen helpottamiseksi.
93743 30 4. Esimerkit
Esimerkki I
10 ml verta, joka on peräisin potilaasta, jonka epäillään olevan tyypin 1 ihmisen immuunikatoviruksen 5 (HIV-l:n) infektoima, fraktioidaan SepracellTM-laitteella (Sepratech Corp., Oklahoma City, Oklahoma, USA) tai vaihtoehtoisesti Ficoll-gradientilla lymfosyyttien eristämiseksi. Sitten lymfosyytit hajotetaan ja niistä eristetään nukleiinihappo uuttolaitteella (Molecular Biosystems, 10 Inc., San Diego, Kalifornia, USA) tai hajotetaan vaihtoehtoisesti lymfosyytit tavanomaisella natriumdodekyylisul-faatti(SDS)-entsyymikäsittelyllä ja eristetään nukleiinihappo DEAE-selluloosakäänteisfaasikromatografiällä. Tämä tehdään seuraavasti: 15 Laskeutetaan solut sentrifugoimalla kierros- nopeudella 5 000 min*1 4 min Tris-puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa (TBS), pH 7,5. Imetään pois super-natantti. Suspendoidaan pelletti uudelleen seuraavaan seokseen: 20 500 μΐ 0,3 mol/1 NaCl:a/20 mmol/1 Tris:iä, pH 7,5 100 μΐ 2-%:ista SDS-liuosta 200 μΐ proteinaasi K -liuosta (5 mg/ml) 200 μΐ 0,25 mol/1 EDTA-liuosta, joka sekoitetaan hyvin ja lisätään sitten pellettiin.
25 Pyörösekoitetaan voimakkaasti ja inkuboidaan lämpö tilassa 50 eC 45 min pyörittäen 10 - 15 s 10 min:n väliajoin. Laitetaan kuiviin valutetulle uuttolaitteen kolonnille ja annetaan imeytyä. Pestään kolonni 0,3 mol/1 NaCl:a ja 20 mmol/1 Tris:iä sisältävällä liuoksella, pH 30 7,5 (1 x 4 ml). Eluoidaan DNA/RNA 0,5 mol/1 NaCl:a ja 20 ·< mmol/1 Tris:iä sisältävällä liuoksella, pH 7,5 (4 ml).
Lisätään eluaattiin: 5 μΐ glykogeeniä 400 μΐ 3 mol/1 NaOAc-liuosta 35 9,0 ml jääkylmää Et0H:a sekoitetaan hyvin.
31 93743
Seostetaan lämpötilassa -20 °C yön yli. Voidaan käyttää tunnin ajan hiilihappojää-etanolihaudetta. Laskeutetaan DNA/RNA sentrifugoimalla 15 min kierrosnopeudella 10 000 min'1 keinukoriroottorissa; kaadetaan pois EtOH ja 5 valutetaan 2 min kuivaksi Kimwipellä. Kylmäkuivataan 10 min. Suspendoidaan pelletti uudelleen TE-liuokseen (170 μΐ). Inkuboidaan lämpötilassa 37 °C 5 min. Valmistetaan 1 ml:n sentrifugikolonni seuraavasti: Suljetaan 1 ml:n ruisku pienellä määrällä (autoklavoitua) lasivil-10 laa. Täytetään ruisku TE-(Tris-EDTA-)liuoksella, joka on käsitelty dietyylipyrokarbonaatilla (DEPC). Lisätään nopeasti hienojakoista Ephadex G-50:ä (TE:ssä, autok-lavoitu). Jatketaan lisäämistä, kunnes kiinteä matriksi nousee ruiskun yläreunan yli. Sentrifugoidaan 30 s kier-15 rosnopeudella 1 000 min"1 IEC-pöytäsentrifugissa. Pestään TE:llä (100 μΐ), sentrifugoidaan 1 min keskinkertaisella nopeudella (noin 1 000 min"1). Heitetään pesuliuos pois. Laitetaan uute kolonnille. Sentrifugoidaan jälleen 1 min. Huuhdotaan TE:llä (150 μΐ), sentrifugoidaan kierros-20 nopeudella 1 000 min"1 1 min. Yhdistetään huuhteluliuos ja ensimmäinen fraktio. Näytteet voidaan jakaa tässä vaiheessa useiden reaktioiden tekemistä varten. Lisätään 1/10 tilavuudesta 8 mol/1 LiCl-liuosta. Sekoitetaan joukkoon 2,5-kertainen tilavuus 100-%:ista EtOH:a. Pyörösekoitetaan :· 25 hyvin. Saostetaan hiilihappojää-EtOH-hautteessa 30 min.
Laskeutetaan sentrifugoimalla 15 min huippunopeudella mik-rosentrifugissa lämpötilassa 4 °C. Kuivataan pelletti.
Eristämisen jälkeen näytteestä saatu kokonaisnuk-leiinihappo liuotetaan TE-puskuriin (10 mmol/1 Tris Cl:a, 30 1 mmol/1 EDTA:a, pH 8; 100 μΐ). 10 μΐ kokonaisnuk- leiinihappoannoksesta (100 μΐ) liuotetaan, siten että lop-pupitoisuudeksi tulee lOOul, seuraavaan seokseen: 40 mmol/1 Tris Cl:a, pH 8 25 mmol/1 NaCl:a 35 10 mmol/1 MgCl2:a 32 93743 10 mmol/1 ditiotreitolia (DTT) 2 mmol/1 spermidiiniä 100 pg/ml naudan seerumialbumiinia 400 mmol/1 dATPrtä, dCTP:tä, dGTP:tä ja TTP:tä kutakin.
5 Lisätään pitoisuudeksi 30 nmol/1 101 emäksestä koostuvaa yksisäikeistä DNA:ta, jonka sekvenssi on 51-GAA-CGCGGCT ACAATTAATA CATAACCTTA TGTATGATAC ACATACGATT TAGGT-GACAC TATA GAATAC TTTCGTAACA CTAGGCAAAG GTGGCTTTAT C-3' (aluke A). Lisätään pitoisuudeksi 30 nmol/1 29 emäksestä 10 koostuvaa DNA:ta, jonka sekvenssi on 5'-ACACCATATG TATGTT- TCAG GGAAAGCTA-3' (aluke B). Alukkeella B, joka on toinen aluke, on HIV-l:n SQR-geenin emässekvenssi 5151 - 5179. Eräällä vaihtoehtoisella toisella alukesekvenssillä, joka vastaa HIV-l:n SQR-geenin emäsaluetta 5357 -5387, on 15 sekvenssi 5'-GCACACAAGT AGACCCTGAA CTAGCAGACC A-3', ja jos sitä käytetään, sitä on myös pitoisuutena läsnä 30 nmol/1. Aluke A on ensimmäinen aluke; sen 64 5'-pään nukleotidia muodostavat SP6:n DNA:sta riippuvan RNA-polymeraasin promoottorin plus-säikeen. Sen segmentti, jonka sekvenssi on 20 5'-GAATAC-3', on (vaihtoehtoinen alasegmentti)lf joka si sällyttää transkription aloituskohdan (5'-G) ja muita SP6-RNA-polymeraasin ilmeisesti suosimia emäksiä kopioimiensa sekvenssien 5'-päähän. Lopuksi mainittakoon, että 31 3’-terminaalista nukleotidia muodostavat (alukealasegmentin)1 25 ja niillä on erään eristetyn HIV-l:n SOR-geenin emässek-venssille 5577 - 5547 komplementaarinen sekvenssi. [Koko sekvenssiä kuvaavat Ratner et ai., Nature 313 (1985) 277.] (Tätä eristettyä HIV:tä kutsutaan näissä esimerkeissä "HIV-1:ksi".) 30 Huomaa, että kaikki näissä esimerkeissä käytettävät oligonukleotidit valmistetaan kiinteäfaasisynteesillä automaattisella syntetisoijalla (Model No. 380A, Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornia, USA) ja puhdistetaan kromatografisesti suurin piirtein homogeenisiksi 35 C8-käänteisfaasi-HPLC-kolonnilla. Oligonukleotiden valmis- 33 93743 tamiseen voitaisiin vaihtoehtoisesti käyttää muita kaupallisesti saatavissa olevia syntetisoijia ja tavanomaisia puhdistusmenettelyjä.
Liuosta (100 μΐ) pidetään lämpötilassa 65 *C 2 min 5 ja jäähdytetään se sitten lämpötilaan 42 °C 1 min:ssa. Tämä kuumennus ja sitä seuraava pitäminen vähintään lämpötilassa 42 °C yhdistettyinä liuoksen koostumukseen muodostavat riittävän ankarat olosuhteet, jotta saadaan aikaan (3'-alukealasegmentin)1 DNA-synteesin alullepanon kannalta 10 riittävän stabiili ja hyvin spesifinen hybridisoituminen (3,-alukealasegmentin)1 sekvenssille komplementaariseen sekvenssiin.
Sitten liuokseen lisätään 10 yksikköä linnun myo-blastoosiviruksen (AMV) käänteistransskriptaasia tai 500 15 yksikköä yhdistelmä-Moloney-hiirileukemiaviruksen (MMLV) käänteistransskriptaasia, joita myy Life Aciences, Inc., St. Petersbur, Florida, USA, ja liuosta inkuboidaan 10 min lämpötilassa 42 eC. [Houtsin et ai., J. Virol. 29 (1979) 517, määritelmän mukaan yksi yksikkö sisällyttää 1 nmol 20 TTP:tä hapolla saostettavissa olevaan muotoon 10 min:ssa lämpötilassa 37 °C käytettäessä poly(A) oligo(T)12.18:a templaattina/alukkeena.] 10 min kestäneen inkuboinnin jälkeen liuos laitetaan 1 niiniksi kiehuvaan vesihauteeseen. Tämä aiheuttaa käänteistransskriptaasin vaikutuksesta muo-25 dostuneen kaksoissäikeen säikeiden erottumisen.
Sitten liuos jäähdytetään 1 minissa lämpötilaan 42 °C. Tämän jäähdyttämisen aikaan toinen aluke hybridisoituu käänteistransskriptaasin katalysoimassa reaktiossa muodostuneen kohdesegmentin komplementin 3'-terminaaliseen seg-30 menttiin. Myös tällöin hybridisaatio-olosuhteet ovat riittävän ankarat, jotta tapahtuu riittävän spesifinen hybridisaatio toisen alukkeen ja toiselle alukkeelle komplementaarisen sekvenssin välillä.
Jäähdytyksen jälkeen lisätään vielä 10 yksikköä 35 AMV-käänteistransskriptaasia tai 500 yksikköä kloonattua 93743 34 MMLV-käänteistransskriptaasia ja Inkuboidaan vielä 10 min lämpötilassa 42 aC.
Sitten lisätään (mahdollisesti) ribonukleaasi-in-hibiittoria RNasin* (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, 5 USA) pitoisuudeksi 1 yksikkö/ml. [1 yksikkö on inhibiit-torimäärä, joka tarvitaan inhiboimaan 50 % ribonukleaasi A:n (5 ng) aktiivisuudesta; Roth, Meth. Cancer Res. 3 (1976) 151.] Lisäksi kutakin ribonukleosidi-5 ’-trifosfaat-tia, ATP:tä, GTP:tä, CTP:tä ja UTP:tä, lisätään pitoisuu-10 deksi 400 mmol/1. Lopuksi lisätään 10 - 20 yksikköä SP6:n DNA:sta riippuvaa RNA-polymeraasia (Promega Biotec) ja tuloksena olevaan liuosta inkuboidaan lämpötilassa 42 °C 30 - 60 min. [1 yksikkö on RNA-polymeraasimäärä, joka tarvitaan katalysoimaan 1 nmol:n ribonukleaasitrifosfaattia 15 sisällyttäminen happoon liukenemattomaan tuotteeseen 60 min:ssa lämpötilassa 37 °C standardireaktio-olosuhteis-sa (40 mmol/1 Tris Cl:a, pH 7,9, 6 mmol/1 MgCl2:a, 10 mmol/1 DTT:tä, 2 mmol/1 spermidiiniä, 0,5 mmol/1 ATP:tä, GTP:tä, CTP:tä ja UTP:tä kutakin, 0,5 Ci 3H-CTP:tä, 1 g 20 SP6NA:ta ja entsyymiä kokonaistilavuudessa 50 yl).]
Sitten lisätään kutakin seuraavista oligonuk-leotideista pitoisuudeksi 30 nmol/1: kolmas aluke 5'-GAACGCGGCT ACAATTAATA CATAACCTTA TGTATCATAC ACATACGATT ?5 TAGGTGACAC TATA GAATAC ACTAATTCAT CTGTATTACT TTGACTGTTT TTC-3' neljäs aluke 5'-TTTTTTGGTG TTATTAATGC TGCTAGTGCC-3 * 30 Kolmannessa alukkeessa, samoin kuin en- simmäisessäkin, 64 5 *-terminaalista emästä muodostavat promoottorisegmentin ja seuraavat 6 emästä vaihtelevan segmentin. Vaihteleva segmentti on 6 ensimmäistä emästä, jotka kopioituvat promoottorista lähtien SP6-RNA-polyme-35 raasin vaikutuksesta, ja nämä emäkset valitaan tällaisen 35 93743 transskription tason edistämiseksi. Lopuksi mainittakoon, että kolmannen alukkeen (3' -alukealasegmentti )3-osa koostuu 33 3’-terminaalisesta emäksestä, jotka muodostavat saman sekvenssin kuin emäkset 5388 - 5420 HIV-l:n lyhyessä luku-5 kehykseltään avoimessa geenissä (SOR-geenissä). Neljännessä alukkeessa on sekvenssi, joka on komplementaarinen HIV-l:n SOR-geenin emäsjaksolle 5546 - 5517.
Kolmannen ja neljännen alukkeen lisäämisen jälkeen liuosta inkuboidaan lämpötilassa 42 °C 1 min. Tämän ajan-10 jakson aikana tapahtuu hybridisaatio kolmannen alukkeen (3' -alukealasegmentin)3 ja SP6-RNA-polymeraasin katalysoimassa reaktiossa muodostuneen ensimmäisen RNA:n välillä. Hybridisaatio-olosuhteiden ankaruuden ansiosta (3'-alukealasegmentti )3 hybridisoituu DNA-synteesin alullepanon kan-15 naita riittävän stabiilisti ja hyvin spesifisesti sekvenssiltään komplementaariseen ensimmäisen RNA:n segmenttiin.
Inkuboinnin jälkeen lisätään 10 yksikköä AMV-kään-teistranssikriptaasia tai 500 yksikköä kloonattua MMLV-20 käänteistransskriptaasia ja liuosta inkuboidaan 10 min lämpötilassa 42 °C, jolloin muodostuu kolmas komplementaarinen DNA.
Sitten liuosta suspendoidaan 1 min kiehuvassa vesi- hauteessa ja jäähdytetään se 1 min:ssa lämpötilaan 42 °C, , , 25 jolloin ensinnäkin kolmannen komplementaarisen DNA:n ja • « ensimmäisen RNA:n välinen kaksoissäie muuttuu yk-sisäikeiseksi ja toiseksi mahdollistetaan hybridisaatio neljännen alukkeen ja kolmannen komplementaarisen DNA:n välillä. Samoin kuin muidenkin hybridisaatioiden yh-30 teydessä olosuhteet ovat riittävän ankarat, jotta tapahtuu neljännen alukkeen hybridisaatio riittävän stabiilisti DNA-synteesin aloittamiseksi ja hyvin spesifisesti kolmannen komplementaarisen DNA:n segmenttiin, jonka sekvenssi on komplementaarinen neljännen alukkeen sekvenssille.
36 93743
Sitten lisätään jälleen 10 yksikköä AMV-käänteis-transskriptaasia tai 500 yksikköä kloonattua MMLV-kään-teistransskriptaasia ja liuosta inkuboidaan 10 min lämpötilassa 42 °C.
5 Sitten lisätään (mahdollisesti) ribonukleaasi-in hibiittoria RNasin* pitoisuudeksi 1 yksikkö/ml ja sen jälkeen 10 - 20 yksikköä SP6-RNA-polymeraasia ja liuosta inkuboidaan 30 min 1 tunti lämpötilassa 42 °C.
Tuloksena oleva toinen RNA voidaan sitten detek-10 toida nukleiinihappokoetinhybridisaatiomenetelmällä.
Esimerkki II
Noudatetaan esimerkin I mukaista menettelyä jäljempänä mainittavin muutoksin kolmelle näytteelle: (A) 10 ml ihmisverta, jonka tiedetään olevan vapaa HIV:stä, (B) 15 10 ml viljelmää, jonka tiedetään sisältävän noin 103 HIV- l:n infektoimaa solua/ml, ja (C) 10 ml verta henkilöstä, jolla epäillään olevan HIV-l-infektio. Menettelyä muutetaan siten, että sisällytetään alfa-32P-leimattua ribonukleaasi tri fosfaattia substraatiksi SP6-RNA-polymeraasin 20 katalysoimaan reaktioon, jossa valmistetaan toinen RNA.
Toinen RNA on siten 32P-leimattu.
Makrohuokoisista Sephacryl-S500™-helmistä valmistetaan johdannainen karboksyyliryhmään päättyvällä kytkijällä (jonka kaava on -C( =NH)NH(CH2)5C02-) ja sitten oli-25 gonukleotidin 5'-(6-aminoheksyylifosforamidaatti)-johdan naisella, jossa oligonukleotidilla on sekvenssi 5'-TGGTCT-GCTA GTTCAGGTC TACTTGTGTG C-3', joka on HIV-l:n SOR-geenin emässekvenssille 5356 - 5387 komplementaarinen sekvenssi. (SOR-geenin emässekvenssi 4901 - 4932 esiintyy missä ta-30 hansa RNA:ssa, joka syntyy amplifioitaessa näytteestä peräisin olevaa nukleiinihappoa.) Helmien preparoinnissa noudatettiin menettelyjä, joita kuvataan tämän hakijan nimissä olevassa US-patenttihakemuksessa nro 895 756, joka on jätetty 11. elokuuta 1986 ja mainitaan täten viitteenä.
35 Lyhyesti kuvattuna kantajamateriaalina on huokoinen sili- 37 93743 kaattilasi tai makrohuokoinen silloitettu dekstraani, josta on valmistettu johdannainen aminoterminaalisen kytkijän avulla ja jossa suurin piirtein kaikki aminoryhmät, jotka eivät liity kovalenttisesti fosforamidaattiryhmän kautta 5 sitorniskoettimen terminaaliseen nukleosidiin, on esitetty pääsemästä epäspesifiseen vuorovaikutukseen alifaattisen asyyliryhmän sisältävän nukleiinihapon kanssa; syanogeeni-bromidilla aktivoitu makrohuokoinen dekstraani, joka reagoi amiinien kanssa, niin että se kytkeytyy olinuk-10 leotidien aminoalkyylifosforamidaattijohdannaisiin; tai huokoinen silikaattilasi, makrohuokoinen silloitettu dekstraani tai divinyylibentseenillä silloitettu polystyreeni, josta on valmistettu johdannainen karboksiterminaalisen tai sukkinimiditerminaalisen kytkijän avulla, jolloin osa 15 karboksyyliryhmistä liittyy amidisidoksella diaminoalkaa-nin toiseen aminoryhmään toisen aminoryhmän ollessa osa fosforamidaatista, joka puolestaan sitoutuu suoraan sito-miskoettimen terminaaliseen nukleosidiin. Edullisia kanta jamateriaaleja ovat säädellyn huokoslasin (pitkäketjui-20 nen alkyyliamiini)-johdannainen ja karboksyylijohdan nainen, joita myy Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA tuotenumeroilla 24875 ja vastaavasti 23735 helmiä, joiden nimellinen huokoosläpimitta on 5 000 nm ja hiuk-kasläpimitta noin 125 - 177 pm, ja Sphhacryl -500, jota : 25 myy Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey, US koodinume rolla 17-0475-01 helminä, joiden läpimitta märkänä on noin 40 - 105 pm ja eksluusiotilavuusraja dekstraanien suhteen suunnilleen molekyylimassan 2 x 107 daltonia kohdalla, ja josta Sephacrylistä on tarkoitus muodostaa johdannainen 30 syanogeenibromidin tai amino- tai karboksyyliterminaalisen kytkijän avulla. Keksinnön erään puolen mukaisesti kiinteä kantaja on jokin seuraavista: (A) huokoinen silikaattilasi, josta on valmistettu johdannainen piiatomien kohdalla olevilla 38 93743 (1) ryhmillä, joilla on kaava ~(CH2)n(NH) (CO) (CH2)cCH3 ja - (CH2 )„( NH) (P02 )0-(oligo), jolloin piiatomeihin ei ole liitetty juuri ollenkaan ami-5 noryhmään päättyviä ryhmiä, joissa kaavoissa c on 0 - 5, n on 2 - 8, -0-(oligo) on oligonukleotidikoetin ja ryhmään (oligo) liittynyt happiatomi on koettimen 5'-nukleosidin 5'-happi tai 3'-nukleosidin 3'-happi; tai (2) ryhmillä, joilla on kaava 10 -(CH2 )n( NH ) (CO ) (CH2 )„C02H ja -(CH2 )n( NH) (CO) (CH2 )B(CO) (NH) (CH2 )pNH( P02 )0-Oligo), joissa m, n ja p ovat samoja tai eri lukuja ja kukin niistä on 2 - 8; tai (B) makrohuokoinen silloitettu dekstraanimateriaa-15 li, joka on derivatisoitu hydroksyylihappien kohdalta, jotka ovat sokeriryhmittymien sellaisissa hiilissä, joiden vieressä on vähintään yksi derivatiosoimattoman hydrok-syyliryhmän sisältävä hiili, (1) ryhmillä, joilla on kaava 20 -C(=NH)NH(CH2)q(NH)(CO)(CH2)cCH3 ja -C(=NH)NH(CH2)p(NH)(P2)0-( Oligo), jolloin juuri yhdessäkään hydroksyylihapessa ei ole amino-ryhmään päättyvää johdannaisryhmää, tai (2) ryhmillä, joilla on kaava 25 -C( =NH)NH(CH2)qC02H ja -C( =NH )NH( CH2 )q(CO) (NH) (CH2 )pNH( P2 )0-( oligo), joissa kaavoissa c, q ja p ovat samoja tai eri lukuja ja q on 2 - 10; ja (C) divinyylibentseenillä silloitettu polystyreeni, 30 joka on derivatisoitu fenyyliryhmien kohdalta ryhmillä, joilla on kaava -(CH2).C02H ja - (CH2).(CO) (NH) (CH2 )pNH( P02 )0-(oligo), joissa s ja p ovat samoja tai eri lukuja ja s on 2 - 10. 35 Katso Ghosh et ai., Nucleic Acids Research 15 (1987) 5353.
39 93743
Kutakin kolmesta erästä, joista kukin sisältää 50 mg edellä kuvatulla tavalla derivatisoituja Sephacryl-helmiä, liuotetaan 15 min lämpötilassa 37 °C esihybridi-saatioliuoksessa (250 μΐ), joka sisältää 0,1 % SDS:a, 10 % 5 dekstraanisulfaattia, 1 mg/ml lohenmaiti-DNA:ta ja 5 x
SSPE-liuosta (0,75 mol/1 NaCl:a, 50 mmol/1 NaH2P04:a, pH
7,4, 5 mmol/1 EDTA:a). Liotuksen jälkeen helmimateriaali pelletoidaan sentrifugoimalla ja poistetaan esihybridisaa-tioliuos imemällä.
10 Kunkin kolmen näytteen amplifikaatiomenettelystä tuloksena olevan nukleiinihappo eristetään etanolisaostuk-sella ja liuotetaan sitten liuokseen (250 μΐ), joka on sama kuin esihybridisaatioliuos, mutta ilman lohenmaiti-DNA: ta. Kukin tuloksena olevista nukleiinihappoliuoksista 15 yhdistetään sitten yhteen annokseen esihybridisoituja Sep-hacryl-helmien oligonukleotidijohdannaista ja tuloksena olevaa seosta inkuboidaan varovasti sekoittaen lämpötilassa 42 °C 90 min.
Sitten Sephacryl-helmet pelletoidaan sentrifugoi-20 maila, poistetaan hybridisaatioliuos imemällä ja pestään sitten helmet kolmesti, 10 min lämpötilassa 37 °C kullakin pesukerralla, 1 mlrssa 2 x SSC -liuosta (0,30 mol/1 NaCl:a, 0,03 mol/1 Na-sitraattia, pH 7,0). Kunkin pesun jälkeen helmet pelletoidaan sentrifugoimalla ja poistetaan : 25 liuos imemällä.
•
Helmille tehdään välittömästi kolmannen pesun jälkeen Cerenkov-laskenta.
Näytteestä A peräisin olevaa amplifioitua nukleiinihappoa sisältävät helmet antavat pieniä pulssimää-30 riä, jotka ovat hädin tuskin pelkästä skintillaationes-teestä tulevien taustapulssimäärien yläpuolella. Näytteestä B peräisin olevaa amplifioitua nukleiinihappoa sisältävät helmet antavat paljon suurempia pulssimääriä kuin näytteeseen A liittyvät helmet. Jos näytteestä C peräisin 35 olevaan nukleiinihappoa sisältävät helmet antavat merkit- 40 93743 sevästi suurempia pulssimääriä kuin näytteeseen A liittyvät helmet, ne osoittavat, että henkilö, jonka verestä näyte C on valmistettu, on HIV-l:n infektoima.
Esimerkki III
5 Toteutetaan esimerkkien I ja II mukaiset menettelyt käyttämällä T7-RNA-polymeraasia (Promega Biotec) SP6-RNA-polymeraasin sijasta; kullakin ensimmäisen alukkeen ala-segmentillä 5'-(promoottori )j-( vaihteleva alasegmentti)L-3' ja kolmannen alukkeen alasegmentillä 5'-(promoottori)3-10 (vaihteleva alasegmentti)3-3' on sekvenssi 5'-TAATACGACT CACTATA GGGA-3', jossa 17 5'-terminaalista emästä muodostavat promoottorialasegmentin ja 4 3'-terminaalista emästä vaihtelevan alasegmentin. Vaihteleva segmentti vastaa promoottorista lähtien muodostuneen transskriptin 4 5'-ter-15 minaalista emästä. Tämän menetelmän missään vaiheessa ei käytetä ribonukleaasi-inhibiittoria, ainakaan Promega Biotecin polymeraasivalmisteen yhteydessä.
Esimerkki IV
Toteutetaan esimerkkien I ja II mukaiset menettelyt 20 käyttämällä T3-RNA-polymeraasia (Stratagene, San Diego, Kalifornia) SP6-RNA-polymeraasin tilalla ja ensimmäisen alukkeen (promoottori )j-( vaihteleva alasegmentti ^-alaseg-menttinä ja kolmannen alukkeen (promoottori )3-( vaihteleva alasegmentti )3-alasegmenttinä segmenttiä 5' -TATTAACCCT CAC-. 25 TAAA GGGA-3', jossa 17 5'-terminaalista emästä ovat pro-
moottorisegmentti ja 4 3'-terminaalista emästä vaihteleva segmentti, joka sisältää promoottorista lähtien muodostuneiden transskriptien 4 5'-terminaalista emästä. Esimerkki V
30 Käyttämällä esimerkin III mukaista T7-RNA-polyme- raasia amplifioidaan ihmisverinäytteistä saadun HIV-geno-min kohdesegmenttiä käyttämällä esimerkissä I esitettyjen alukkeiden tilalla seuraavia alukkeita: ensimmäinen aluke: 5'-TAATACGACT CACTATA GGGA TCTA-35 ATTACT ACCTCTTCTT CTGCTAGACT-3’, jossa 30 3'-terminaalista 41 93743 emästä ovat sekvenssiltään komplementaarisia HIV-l:n ENV-geenin emäksille 7076 - 7047: toinen aluke: 5'-ACAAGTTGTA ACACCTCAGT CATTACACAG-3', joka sisältää HIV-l:n ENV-geenin emässekvenssin 6838 -5 6866; kolmas aluke: samat 21 5'-terminaalista emästä kuin tämän esimerkin ensimmäisessä alukkeessa liitettyinä seu-raaviin 27 3'-terminaaliseen emäkseen: 5'-AAAGGTATCC TTTG-AGCCAA TTCCCATA-3', joka on HIV-l:n ENV-geenin emässek-10 venssi 6875 - 6902; neljäs aluke: 5'-AGTTGATACTACTGGCCTAATT-3', j ossa HIV-l:n ENV-geenin emäsekvenssille 7033 - 7007 komplementaarinen sekvenssi.
Esimerkki VI
15 Käyttämällä esimerkin III mukaista T7-RNA-polyme- raasia amplifioidaan ihmisverinäytteistä saadun HIV-geno- min kohdesegmenttiä käyttämällä esimerkissä I esitettyjen alukkeiden tilalla seuraavia alukkeita: ensimmäinen aluke: samat 21 5*-terminaalista nuk-20 leotidia kuin esimerkin V mukaisissa ensimmäisessä ja kolmannessa alukkeessa liitettyinä seuraaviin 31 3'-ter minaaliseen nukleotidiin: 5'-CACCTAGGGC TAACTATGTG TCCTAA-TAAG G-3', joiden sekvenssi on komplementaarinen HIV-l:n SOR-geenin emässekvenssille 5471 - 5441; V 25 toinen aluke: 5'-ACACCATATG TATGTTTCAG GGAAAGCTA- 3', jolla on sama sekvenssi kuin HIV-l:n SOR-geenin emäksillä 5151 - 5179; kolmas aluke; samat 21 5'-terminaalista nukleotidia kuin esimerkin V mukaisissa ensimmäisessä ja kolmannessa 30 alukkeessa liitettyinä seuraaviin 31 3'-terminaaliseen nukleotidiin: 5'-AAGAATAAGTTCAGAAGTACACATCCCACT-3', joilla on sama sekvenssi kuin HIV:n SOR-geenin emäksillä 5220 -5249; 42 93743 neljäs aluke: 5'-TGGTCTGCTAGTTCAGGGTCTACTTGTGTC-3', jolla on HIV-l:n SOR-geenin emässekvenssille 5387 - 5357 komplementaarinen sekvenssi.
Esimerkki VII
5 Noudatetaan esimerkin 1 mukaista menettelyä nuk
leiinihapon eristämiseksi 1) näytteestä, joka sisältää 103 HIV-infektoitua CEM-solua seoksena 106 infektoimattoman CEM-solun kanssa (Cancer Center Research Foundation; CCRF-CEM; ATCC-nro CCL 119) ja 2) näytteestä, joka sisältää 106 10 invektoimatonta CEM-solua. Nämä näytteet suspendoidaan uudelleen TE-liuokseen (100 μΐ, 10 mmol/1 Tris-HCl:a, pH
7,4, 1 mmol/1 EDTA:a) etanolisaostusvaiheen jälkeen
Extractor™-kolonnista (MBI) saadun näytteen kosentroimi-seksi. Uudelleensuspendoidut näytteet fraktioidaan hieno-15 jakoista Sephadex G-50:ä sisältävässä sentrifugikolonnissa (Maniatis, supra) eluoiden TE-liuoksella. Eluoidut näytteet konsentroidaan etanolisaostuksella (0,8 mol/1 LiCl;a, kolminkertainen tilavuus etanolia, hiilihappojää-etanoli-hauteessa 15 min). Seostettu näyte pelletoidaan sentrifu-20 goimalla. Pelletti valutetaan, kuivaan ja suspendoidaan sitten uudelleen liuokseen (100 μΐ), joka sisältää 40 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 8,1, 8 mmol/1 MgCl2, 25 mmol/1
NaCl:a, 2 mmol/1 spermidiiniä, 5 mmol/1 ditiotreitolia, 10 umol/1 dATP:tä, dGTP:tä, dCTP:tä ja dTTP:tä kutakin, 1 ; 25 mmol/1 rATPrtä, rCTPttä, rGTP:tä ja rUTP:tä kutakin, 100 pg/ml BSA:ta (nukleaasitonta) ja 250 nmol/1 sekä DNA-oligonukleotidialuketta A (5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGA-CACCTAGGGCTAACTATGTCCTAATAAGG-3') että aluketta B (5'-ACA-CCATATGTATGTTTCAGGGGAAAGCTA-3').
30 Vertailunäytteiksi suspendoitiin kaksi rinnakkais- näytettä puhdistettua HIV-RNA:ta pitoisuudeksi 0,01 fmol/1 edellä kuvattuun puskuriin (100 μΐ). Lopuksi suspendoitiin HindIII:lla linearisoidun plasmidin H 19A sisältämää B-globiinisekvenssiä [Wallace et ai., Nucl. Acids Res. 9 35 (1981) 3647] pitoisuudeksi 10 fmol/1 edellä kuvattuun pus- 43 93743 kuriin (100 μΐ), joka ei kuitenkaan sisältänyt oligonuk-leotidialukkeita.
OligonukleotidialukettaD(5'-ACATTGCTTCTGACACAACT-GTGTTCA-3') ja aluketta C (5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGAAAGG-5 ACTCAAA-3' ), jotka ovat spesifisiä B-globiinisekvenssille, lisättiin β-globiinireaktioseokseen kumpaakin pitoisuudeksi 250 nmol/1.
B-globiininäytettä lukuun ottamatta reaktioseoksia pidetään 1 min lämpötilassa 65 °C. β-globiininäytettä kei-10 tetään 1 min. Kaikki näytteet jäähdytetään lämpötilaan 42 eC 1 mintssa ja lisätään sitten 10 yksikköä AMV-käänteis-transskriptaasia. Reaktioseoksia inkuboidaan 15 min lämpötilassa 42 °C, keitetään 1 min ja jäähdytetään sitten lämpötilassa 42 °C 1 min. Lisätään vielä 10 yksikköä AMV-15 käänteistransskriptaasia ja inkuboidaan 15 min lämpötilassa 42 eC. Reaktioseoksiin lisätään 100 yksikköä T7-RNA-polymeraasia ja inkuboidaan 30 min lämpötilassa 37 °C.
Näytteitä keitetään 1 min ja jäähdytetään lämpötilassa 42 “C 1 min, minkä jälkeen lisätään 10 yksikköä AMV-20 käänteistransskriptaasia. Reaktioseoksia inkuboidaan lämpötilassa 42 eC 15 min, keitetään 1 min ja jäähdytetään lämpötilaan 42 °C 1 minrssa. Lisätään vielä 10 yksikköä käänteistransskriptaasia ja inkuboidaan sitten 15 min lämpötilassa 42 °C. Lisätään 100 yksikköä T7-RNA-polymeraasia . 25 ja inkuboidaan 30 min lämpötilassa 37 "C. Tämä sykli tois-» * · tetaan vielä kahdesta.
Amplifioitu kohde detektoidaan sitten käyttämällä 01igo-Beads™-valmistetta jäljempänä kuvattavalla tavalla.
HIV-1-spesifisiä oligonukleotideja sisältävät 30 Sephacryl-helmet valmistettiin edellä kuvatulla tavalla ja säilytettiin TE-liuoksessa lämpötilassa 4 °C sellaisena pitoisuutena, että 250 μΐ suspensiota sisältää 50 mg Sephacryl-helmiä. Oligonukleotidit syntetisoitiin ja puhdistettiin HPLC:llä edellä kuvatulla tavalla.
Λ 44 93743
Sekä helmiin kiinnittämiseen että detektointiin käytettävät oligonukleotidit ovat homologisia HIV-1-geno-min SOR-alueelle. Näissä tutkimuksissa käytetyt oligonukleotidit olivat 86 - 31 (detektointioligonukleotidi (5'-5 GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3') ja 87 - 83 (helmellä oleva sitomisoligonukleotidi: 5'-ATGCTAGATTGGTAATAACAACAT-ATT-3'), jotka ovat homologisia SOR-alueen koodittamatto-malle säikeelle ja joiden välissä on noin 100 nukleotidia. Detektointia varten oligonukleotidit leimattiin päistään 10 32P:lla tavanomaisella tavalla. Ylimääräinen merkkiaine poistettiin tekemällä geelisuodatus hienojakoista Sphadex G-50:ä sisältämällä kolonnilla ja oligonukleotidi säilytettiin lämpötilassa -20 °C.
Tyypillisessä helmiin perustuvassa ker-15 roshybridisaatiojärjestelmä(BBSHS-)kokeessa kohde ja 32P- leimattu detektointioligonukleotidi denaturoidaan TE-liuoksessa (10 μΐ), joka sisältää 0,2 % SDS:a, lämpötilassa 65 eC 5 min Eppendorf-putkessa. Tähän seokseen lisätään 10 μΐ 2 X liuoshybridisaatioseos -liuosta (10 x SSPE/10 % 20 dekstraanisulfaattia). Liuos sekoitetaan, sentrifugoidaan 2 s ja inkuboidaan lämpötilassa 42 °C 1 tunti.
Tänä aikana esihybridisoidaan Sephacryl-helmet. Helmien varastosuspensio sekoitetaan hyvin ja siirretään 250 μ1:η annoksina (50 mg helmiä) Eppendorf-putkiin se-25 koittaen kunkin poiston jälkeen yhtenäisen suspension ylläpitämiseksi. Annoksia sentrifugoidaan 10 s ja TE-liuos poistetaan Pasteur-pipetillä. Kun on lisätty 250 μΐ hybri-disaatioliuosta [5 x SSPE -liuos (0,9 mol/1 NaClra, 50 mmol/1 NaH2P04:a, pH 7,4, 1 mmol/1 EDTA:a), 10 % dekstraa-30 nisulfaattia, 0,1 % SDS:a], helmet suspendoidaan varovasti ravistelemalla ja niitä inkuboidaan lämpötilassa 37 °C 30 - 60 min välillä sekoittaen. Helmiä sentrifugoidaan 10 s välittömästi ennen sitomisvaihetta, poistetaan esi-hybridisaatioliuos, lisätään 80 μΐ hybridisaatioliuosta 45 93743 lämpötilassa 37 °C ja helmet palautetaan lämpötilaan 37 °C.
Liuoshybridisaatioseosta sentrifugoidaan 2 s ja se siirretään helmien ja hybridisaatioliuoksen joukkoon. Hel-5 met suspendoidaan ja niitä inkuboidaan lämpötilassa 37 eC sekoittaen usein suspension ylläpitämiseksi.
Sitomisen jälkeen helmiä sentrifugoidaan 10 s ja hybridisaatioliuos, joka sisältää sitoutumattoman kohteen ja detektointioligonukleotidin, siirretään tuikelasken-10 tapulloon. Helmet pestään sitten viidesti 2 X SSC -liuoksella lämpötilassa 37 °C. Ensimmäiset 3 pesua tehdään nopeasti; lisätään 1 ml pesuliuosta, helmet sekoitetaan hyvin ja sentrifugoidaan niitä 10 s ja siirretään pesuliuos laskentapulloon. Kahdessa viimeisessä pesussa lisätään 15 1 ml pesuliuosta ja helmiä sekoitetaan ja inkuboidaan läm pötilassa 37 °C 5 min ennen sentrifugointia. Kullekin pe-suliuokselle tehdään erillinen laskenta menettelyn seuraamiseksi.
Mitataan hybridisaatioliuoksen, 5 pesuliuoksen ja 20 helmien Crenkov-pulssimääriä 5-10 min:n ajan. Laskurin tausta vähennetään kaikkien näytteiden pulssimääristä. Kohteen määrä (femtomooleina, fmol) lasketaan seuraavasti:
Helmien pulssimäärä (min^J/kokonaispulssimäärä (min'1) x • 25 oligonukleotidin määrä (fmol), • · jossa kokonaispulssimäärä on hybridisaatiliuoksen, 5 pesu-liuoksen ja helmien pulssimäärien summa.
« .
46 93743
Amplifioitujen kohteiden detektointi BBSHS:llä Käytetty Detektoitu 5 määrä määrä
Kohde (μΐ) (fmol, 10'15 mol) 103 HIV:n infektoimaa solua 0,33 0,06 106 infektoimatonta CEM-solua 0,66 0,13 106 infektoimatonta CEM-solua 0,07 0,01 10 0,14 0,015 0,7 0,01 10 0,008 0,01 fmol 1HIV-RNA:ta 0,007 0,14 0,014 0,29 15 10 fmol β-glubiini-DNA:ta 10 0,014
Esimerkki VIII
Noudatetaan esimerkin I mukaista menettelyä nuk-20 leiinihappojen eristämiseksi kahdesta näytteestä: a) 103HlV:n infektoimaa CEM-solua ja 106 infektoimatonta CEM-solua; ja b) 106 infektoimatonta viljeltyä CEM-solua, joihin lisätään 0,01 fmol puhdistettua HIV:tä uuton jälkeen. Menettelyä muutetaan sitten tekemällä lisäpuhdistus hieno-25 jakoista Sephadex 6-50:ä sisältävässä sentrifugikolonnissa (Maniatis, supra) eluoiden TE-liuoksella uuttokolon-nivaiheen jälkeen. Tätä seuraa nukleiinihapon etanolisaos-tus (0,8 mol/1 LiCl:a, 2,5-kertainen tilavuus Et0H:a). Sitten nukleiinihappo suspendoidaan uudelleen seuraavaan 30 liuokseen (100 μΐ): 40 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 8,1 i 8 mmol/1 MgCl2:a 25 mmol/1 NaCl:a 2 mmol/1 spermidiiniä 35 5 mmol/1 DTT:tä (ditiotreitolia) 47 93743 100 pmol/l dATPrtä, dTTP:tä, dCTPrtä ja dGTP:tä kutakin 1 nunol/1 rATP:tä, rCTP:tä, rGTP:tä ja rUTP:tä 100 pg/ml nukleaasitonta BSA:ta 250 nmol/1 29 emäsparin pituista DNA-oligonukleotidia, 5 jonka sekvenssi on 5'-ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3' (aluke B) 250 nmol/1 56 emäsparin DNA-oligonukleotidia, jonka sekvenssi on 5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGT-GTCCTAATAAGG-3' (aluke A).
10 100 μΐ liuosta pidetään lämpötilassa 65 eC 1 min ja jäähdytetään lämpötilaan 42 eC 1 minrssa. Tämä kuumennus ja sitä seuraava pitäminen vähintään lämpötilassa 42 °C yhdistettynä liuoksen koostumukseen muodostaa riittävän ankarat olosuhteet (3'-alukealasegmentin)1 (katso kuvio 1) 15 hybridisoimiseksi riittävän stabiilisti (3'-alukealaseg- mentinJi sekvenssille komplementaariseen sekvnessiin kohde-HIV-RNA:ssa hyvin spesifisesti.
Sitten liuokseen lisätään 10 yksikköä linnun myo-blastoosiviruksen (AMV) käänteistransskriptaasia (Life 20 Sciences, Inc.) ja liuosta inkuboidaan 10 min lämpötilassa 42 °C. [Yksi yksikkö sisällyttää 1 nmol TTP:tä hapolla saostettavissa olevaan muotoon 10 min:ssa lämpötilassa 37 °C käytettäessä poly(A)-oligo(T)12-18:a templaat-tina/alukkeena, Houts, et ai., J. Virol. 29 (1979) 517.] ‘25 10 min kestäneen inkuboinnin jälkeen liuos laitetaan kie huvaan vesihauteeseen 1 minrksi. Tämä kuumennus saa aikaan käänteistransskriptaasin vaikutuksesta muodostuneen kak-soissäikeen säikeiden erottumisen ja käänteistransskriptaasin inaktivoitumisen.
30 Sitten liuos jäähdytetään lämpötilaan 42 °C
·: 1 min:ssa. Tämän jäähdytyksen aikana toinen aluke, aluke B, hybridisoituu edellisessä vaiheessa käänteistransskriptaasin katalysoimassa reaktiossa muodostuneen DNA-säikeen kohdekomplementin 3'-terminaaliseen päähän [(kolmas ala-35 segmentti )t2c, katso kuvio 1]. Tälläkin kertaa hybridisaa- 48 93743 tio-olosuhteet ovat riittävän ankarat spesifisen hybridi-saation tapahtumiseksi toisen alukkeen ja toisen alukkeen sekvenssille komplementaarisen sekvenssin välillä.
Jäähdytyksen jälkeen lisätään vielä 10 yksikköä 5 AMV-käänteistransskriptaasia ja inkuboidaan vielä 10 min lämpötilassa 42 eC.
Reaktioseokseen lisätään 100 yksikköä T7-polymeraa-sia. Sitten reaktioseosta inkuboidaan lämpötilassa 37 °C 30 min. Syntetisoidaan alkuperäiselle kohde-HIV-RNA:lie 10 komplementaarinen RNA-transskripti lähtien T7-promoot-torista, joka sijaitsee edellä käänteistransskriptaasin avulla syntetisoidun kaksisäikeisen DNA-templaatin 5' -päässä. Transskriptissa on sekvenssi 5'-GGGA, ja se jatkuu sitten sekvenssillä, joka on komplementaarinen kohdesek-15 venssin toiselle alasegmentille (ts. toiselle alasegmen-tilletcr, katso kuvio 1). Koska käänteistransskriptaasia ei ole inaktivoitu ennen tätä vaihetta ja läsnä on aluketta B samoin kuin deoksinukleotiditrifosfaatteja, tapahtuu tässä vaiheessa sekundaarinen synteesi. Aluke B hybridisoituu 20 juuri syntetisoidun RNA-transskriptin 3'-alueelle [(kolmas alasegmentti )t.cr, katso kuvio 1)], joka on komplementaarinen alukkeelle B. Käänteistransskriptaasi (jota oli lisätty edellisessä vaiheessa) saa aikaan DNA-säikeen syntetisoi tumisen käyttämällä juuri syntetisoitua RNA-trans-25 skriptiä (valmistettu T7-polymeraasin avulla) templaattina ja oligonukleotidia B alukkeena 5'-päässä.
Reaktioseosta keitetään sitten 1 min RNA:DNA-kak-soissäikeen denaturoimiseksi. Sitten reaktioseos jäähdytetään lämpötilaan 42 °C 1 min:ssa. Tämän jäähdytysvaiheen 30 aikana kohteelle komplementaarinen alukkeen A segmentti [ hybridisoituu edellisessä vaiheessa syntetisoituun DNA- säikeeseen. Samalla aluke B hybridisoituu aiemmassa vaiheessa syntetisoidussa RNA-transskriptissä olevaan komplementaariseen sekvenssiin.
49 93743 Jäähdytyksen jälkeen lisätään vielä 10 yksikköä AMV-käänteistransskriptaasia ja inkuboidaan vielä 10 min lämpötilassa 42 "C. Käänteistransskriptaasi syntetisoi HIV-kohteelle komplementaarista DNA:ta käyttämällä oligo-5 nukleotidia A 5'-pään alukkeena ja aiemmin valmistettua DNA:ta templaattina. Toinen DNA-säie syntetisoidaan käyttämällä alukkeena oligonukleotidia B ja aiemmin valmistettua RNA-transskriptiä templaattina.
Reaktioseosta keitetään 1 min DNA-kaksoissäikeen ja 10 RNA:DNA-kaksoissäikeen denaturoimiseksi. Reaktioseos jääh dytetään lämpötilaan 42 eC 1 min:ssa. Aluke A hybridisoi-tuu cDNA:han, joka on valmistettu aiemmin käyttämällä templaattina RNA-transskriptiä. (Jos templaattisäikeen 3'-päätä käytetään myös käänteistransskriptaasin alukkeena, 15 muodostuu seuraavan reaktion lopputuotteen kanssa identtinen tuote.) Aluke B hybridisoituu DNA-säikeeseen, joka on komplementaarinen kohde-HIV-RNA:lie. Tässä toisessa synteesissä saadaan tuote, joka on kaksisäikeinen DNA, joka sisältää T7-promoottorisekvenssin 5'-päässään samoin kuin 20 4 emäsparin "vaihtelevan" segmentin 5'-GGGA-3'.
Reaktioseokseen lisätään 100 yksikköä T7-polymeraa-sia. Seosta inkuboidaan 30 min lämpötilassa 37 eC. T7-RNA-polymeraasi käyttää kaksisäikeistä DNA:ta, joka sisältää kaksisäikeisen T7-promoottorin, templaattina kopioidessaan * 1 25 RNA:ta, joka on komplementaarinen kohteen toiselle alaseg- mentille, joka sisältää ylimääräisen sekvenssin 5'-GGGA-3' 5'-päässään.
Tämä sykli (keitto 1 min, 1 min lämpötilassa 42 °C, huoneen lämpötila, 10 min lämpötilassa 42 °C, huoneen läm-30 pötila, 10 min lämpötilassa 42 °C, T7-polymeraasi, 30 min J· lämpötilassa 37 eC) voidaan toistaa niin monta kertaa, kuin tarvitaan kohdesekvenssin halutun amplifikaation saavuttamiseksi. Saatu tuote voidaan sitten detektoida nuk-leiinihappokoetinhybridisaatiomenetelmällä.
50 93743
Esimerkki IX
Puhdistettua HIV-RNA:ta suspendoitiin pitoisuudeksi 1 fmol/1 seuraavaan seokseen: 40 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 8,1 5 8 mmol/1 MgCl2:a 25 mmol/1 NaCl:a 2 mmol/1 spermidiiniä 5 mmol/ditiotreitolia 100 pmol/l dATP:tä, dTTP:tä, dCTP:tä ja dGTP:tä kutakin 10 1 mmol/1 rATP:tä, rCTPrtä, rGTP:tä ja RUTP:tä kutakin 100 pg/ml nukleaasitonta BSA:ta 250 nmol/1 20 emäsparin DNA-oligonukleotidia, jonka sekvenssi on 5'-ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3' (aluke B) 250 nmol/1 56 emäsparin DNA-oligonukleotidia, jonka sek-15 venssi on 5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATG-TGTCCTAATAAGG-3' (aluke A).
Liuosta (100 μΐ) pidetään 2 min lämpötilassa 65 °C ja jäähdytetään se sitten lämpötilaan 42 eC 1 minrssa. Tämä kuumennus- ja jäähdytysvaihe yhdistettynä liuoksen 20 koostumukseen muodostaa riittävän ankarat olosuhteet aluk-keen A hybridisoimiseksi riittävän stabiilisti ja hyvin spesifisesti kohden-HIV-RNA:n aluke A -alueen sekvenssille komplementaariseen sekvenssiin [(ensimmäinen alaseg-mentti)t2 kuviossa 1].
; 25 Sitten liuokseen lisätään 10 yksikköä linnun myo- blastoosiviruksen (AMV) käänteistransskriptaasia (Life Science, Inc.) ja liuosta inkuboidaan 10 min lämpötilassa 42 eC. Kun on inkuboitu 10 min, liuos laitetaan kiehuvaan vesihauteeseen 1 min:ksi. Tämä kuumennus aiheuttaa kään-30 teistransskriptaasin muodostaman kaksoissäikeen säikeiden .* erottumisen ja käänteistransskriptaasin inaktivoitumisen.
Liuos jäähdytetään lämpötilaan 42 °C 1 min:ssa. Tämän jäähdytyksen aikana toinen aluke B hybridisoituu juuri syntetisoidun kohteelle komplementaarisen säikeen 35 3'-päähän [(kolmas alasegmentti)t2c kuviossa 1]. Tälläkin 51 93743 kertaa hybridisaatio-olosuhteet ovat riittävän ankarat spesifisen hybridisaation tapahtumiseksi toisen alukkeen ja sille komplementaarisen sekvenssin välillä.
Jäähdytyksen jälkeen lisätään vielä 10 yksikköä 5 AMV-käänteistransskriptaasia ja inkuboidaan vielä 10 min lämpötilassa 42 °C.
Reaktioseokseen lisätään 100 yksikköä T7-RNA-poly-meraasia (New England Biolabs). Sitten reaktiosesta inkuboidaan 30 min lämpötilassa 37 °C. Syntetisoituu alkupe-10 räiselle kohde-HIV-RNA:lle komplementaarinen RNA-trans-skripti alkaen T7-promoottorista, joka on käänteistrans-skriptaasilla syntetisoidun kaksisäikeisen DNA-templaatin 5’-päässä. RNA-transskriptissä on sekvenssi 5'-GGA ja se jatkuu sitten sekvenssillä, joka on komplementaarinen koh-15 desekvenssin toiselle alasegmentille [ts. (toinen alaseg-mentti)tcr, kuvio 1]. Koska käänteistransskriptaasia ei ole inaktivoitu ennen tätä vaihetta ja läsnä on aluketta B samoin kuin deoksinukleotiditrifosfaatteja, tapahtuu tässä vaiheessa sekundaarinen synteesi. Aluke B hybridisoituu 20 juuri syntetisoidun RNA-transskriptin 3'-alueelle [(kolmas alasegmentti )t2cr, kuvio 1], joka on komplementaarinen aluk-keelle B. Käänteistransskriptaasi (jota lisättiin edellisessä vaiheessa) syntetisoi DNA-säiettä käyttämällä juuri syntetisoitua RNA-transskriptiä (valmistettu T7-RBA-25 polymeraasilla) templaattina ja oligonukleotidia B 5'-pään alukkeena.
Sitten reaktiosesta keitetään 1 min RNA:DNA-kak-soissäikeen denaturoimiseksi. Sitten reaktioseos jäähdytetään lämpötilaan 42 °C 1 min:ssa. Tämän jäähdytysvaiheen 30 aikana alukkeen A kohteelle komplementarinen segmentti :* hybridisoituu edellisessä vaiheessa syntetisoituun DNA- säikeeseen. Samalla aluke B hybridisoituu komplementaariseen sekvenssiinsä, joka on edellisessä vaiheessa syntetisoidussa RNA-transskriptissä.
52 93743 Jäähdytyksen jälkeen lisätään 10 yksikköä AMV-kään-teistransskriptaasia ja inkuboidaan vielä 10 min lämpötilassa 42 °C. Käänteistransskriptaasi syntetisoi HIV-koh-teelle komplementaarista DNA:ta käyttämällä oligonuk-5 leotidia A 5'-pään alukkeena ja edellisessä vaiheessa valmistettua DNA:ta templaattina. Templaattisäikeen 3'-päätä käytetään alukkeena lopullisen kaksisäikeisen DNA:n valmistamiseksi, jossa on kaksisäikeinen T7-promoottorikohta 5'-päässään. Toinen DNA-säie syntetisoidaan käyttämällä 10 oligonukleotidia B alukkeena ja edellisessä vaiheessa valmistettua RNA:ta templaattina.
Reaktioseokseen lisätään 100 yksikköä T7-polymeraa-sia. Reaktioseosta inkuboidaan 30 min lämpötilassa 37 °C. T7-RNA-polymeraasi syntetisoi RNA-transskriptiä käyttämäl-15 lä templaattina kaksisäikeistä DNA:ta, joka sisältää poly-meraasin sitoutumiskohdan (T7-promoottorin) 5'-päässään. RNA-transskripti on komplementaarinen kohteen toiselle alasegmentille (kuvio 1), joka sisältää lisäjakson 5'-GGGA-3' 5'-päässään. Amplifikaation voimistamiseksi voi-20 daan toteuttaa lisäsyklejä. Tuotteet voidaan detektoida nukleiinihappohybridisaatiomenetelmällä.
Esimerkki X
Menettely TAS-amplifioidun tuotteen leimaamiseksi viimeisessä syklissä -.25 A. Pylväs sisällyttämättä jääneiden "kylmien" nuk leotidien poistamiseksi 1. Otetaan TAS-reaktioseosta (100 μΐ), viimeisessä TAS-syklissä tehdyn cDNA-synteesin jälkeen. Lisätään 400 μΐ reagenssia A (0,1 mol/1 Tris-HCl:a, pH 7,7, 10 30 mmol/1 trietyyliamiinia, 1 mmol/1 dinatrium-EDTA:a) reak-tioseokseen.
2. Tasapainotetaan valmiiksi pakattu NENSORB20™-ko-lonni (DuPont) kostuttamalla kolonnimateriaali 100-%:isella metanolilla (HPLC-laatua) ja tekemällä sitten 35 tasapainotus reagenssi A:11a (2 ml).
53 93743 3. Laitetaan näyte kolonnille.
4. Huuhdotaan kolonni kolmesti 1 ml:11a reagenssia A.
5. Huuhdotaan kolonni kolmesti 1 ml:11a vettä.
5 6. Eluoidaan nukleiinihapot 50-%:isella metanolilla keräten 250 - 300 μ1:η fraktioita, kunnes kokonaistilavuus on 1 ml.
(Kaksi ensimmäistä fraktiota sisältävät pääosan nukleiinihaposta. ) 10 7. Kuivataan fraktiot Speed-vac-laitteessa tai kyl- mäkuivaimessa.
B. Menettely amplifioidun tuotteen leimaamiseksi 1. Suspendoidaan NENSORB20™-kolonnista saadut fraktiot (kaksi ensimmäistä fraktiota voidaan yhdistää) liuok- 15 seen, joka sisältää 40 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 8,1, 8 mmol/1 MgCl2:a, 25 mmol/1 NaCl:a, 2 mmol/1 spermidiini-(HCl)3:a, 5 mmol/1 ditiotreitolia, 400 pmol/l rATP:tä, rCTP:tä ja rGTP:tä kutakin, 12 pmol/l rUTP:tä ja 25 pCi a-32p-rUTP:tä (800 Ci/mmol).
20 2. Lisätään 50 yksikköä T7-RNA-polymeraasia (New
England Biolabs)/50 μΐ näytettä. Inkuboidaan lämpötilassa 37 eC 30 min.
3. Kiinnittymätön merkkiaine voidaan poistaa G-50-sentrifugikolonnilla (Maniatis, supra).
25 4. Laimennetulle näytteelle voidaan tehdä käsittely sekvenstoivalla polyakryyliamidigeelillä amplifioidun tuotteen koon määrittämiseksi. Leimattu tuote voidaan de-tektoida myös käyttämällä Oligo-Beads™-tuotetta.
Esimerkki XI
30 Sisäisen standardin käyttö TAS-amplifikaation ai- I* kana
Valmistettiin näytteet, jotka sisälsivät: 1) 0,1 fmol HIV-RNA:ta ja 0,1 fmol 8-globiini-DNA-sekvenssejä (PstI:llä pilkottu H 19A); 2) 0,01 fmol HIV-RNA:ta ja 0,1 35 fmol β-globiini-DNA:ta (PstI:llä pilkottu H 19A); 3) 0,1 93743 54 f mol HIV-RNA:ta; ja 4) 0,1 fmol β-globiini-DNA;ta (PstI:Llä pilkottua H819A liuoksessa (100 μΐ), joka sisältää 40 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 8,1, 8 mmol/1 MgCl2:a 25 nunol/1 NaCl:a, 2 mmol/1 spermidiini-(HCl )3;a, 5 mmol/1 di-5 tiotreitolia, 100 μΐ dATP:tä, dTTP:tä, dCTP;tä ja dGTP:tä kutakin, 1 mmol/1 rATP:tä, rUTP:tä, rCTP:tä ja rGTP:tä, 100 μg/ml BSA:ta (nukleaasitonta) ja 250 nmol/1 aluketta A (5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAAT-AAGG-3'), 250 nmol/1 aluketta B (5'-ACACCATATGTATGTTTCAGG-10 GAAAGCTA-3'), 250 nmol/1 aluketta C (5'-TAATACGACTCACTATA-GGGAACTAAAGGCACCGAGCACTTTCTTGCC-3') ja 250 nmol/1 aluketta D (5-ACATTGCTTCTGACACAACTGTGTTCA-3'). Näyte, joka sisälsi 1/20 alkuperäisistä nukleiinihaposta, laitettiin denatu-rointiliuokseen [7,4 % formaldehydiä, 10 x SSC -liuos (1,5 15 mol/1 NaClra, 0,15 mol/1 Na-sitraattia), pH 7,4] ajan-hetkeä 0 vastaaviksi näytteiksi.
Näytteitä keitettiin 1 min ja jäähdytettiin lämpötilassa 42 °C 1 min, minkä jälkeen lisättiin 10 yksikköä AMV-käänteistransskriptaasia. Reaktioseoksia inkuboidaan 20 lämpötilassa 42 °C 15 min, keitetään 1 min ja jäähdytetään lämpötilassa 42 "C 1 min. Lisätään vielä 10 yksikköä AMV-käänteistransskriptaasia ja inkuboidaan sitten 15 min lämpötilassa 42 °C. Lisätään 100 yksikköä T7-RNA-polymeraasia ja inkuboidaan 30 min lämpötilassa 37 °C. Tämä sykli tois-·. 25 tetaan. (Voidaan toteuttaa useampia syklejä tarvittavan amplifikaation mukaan.) Kaksi näytettä, jotka sisälsivät 1/20 alkuperäisestä kohdenukleoiinihaposta, laitettiin denatrointiliuokseen toisen transskription ajankohtaa vastaaviksi näytteiksi.
30 Kaikkia näytteitä pidettiin lämpötilassa 55 eC
30 min ennen suodattimista kahdelle nitroselluloosakal-volle. Nukleiinihapot kiinnitettiin kalvoon säteilyttämäl-lä 4 min UV-valolla (254 nm) Vertailunäytteiksi denaturoitiin 1, 0,1 ja 0,01 fmol plasmidia pARV7/2 [Luciw et ai., 35 Nature 312 (1984) 760], joka sisältää koko HIV-genomi- 55 93743 cDNA:n, sekä plasmidia HS19A [Wallage et al., Nucl. Acids res. 9 (1981) 3647] 0,2 mol/1 NaOHra sisältävässä liuoksessa, joka oli neutraloitu yhtä suurella tilavuudella 2 m ammoniumasetaattiliuosta, ja suodatettiin vertailunäytteet 5 sitten nitroselluloosakalvolle. Toinen kalvo hybridisoi- tiin 32P-leimatun oligonukleotidi 86-31l:n kanssa, joka on spesifinen amplifioidulle HIV-tuotteelle. Toinen kalvo hybridisoitiin 32P-leimattuun oligonukleotidi in 87-4592 :een, joka hybridisoituu amplifioituun β-globiinituotteeseen 10 samoin kuin kohde-8-globiiniplasmidiin.
Hybridisaatiot tehtiin pitämällä näytteitä liuoksessa, joka sisälsi 1 % SDS:a, 0,9 mol/1 NaCl:a, 50 nmol/1 NaH2P04:a (pH 7,4), 5 mmol/1 EDTA:a (pH 7,4) ja 106 pulssi-a(min 32P-leimattua oligonukleotidia, 1 tunti lämpötilassa 15 55 °C. Kalvot pestiin kolmesti huoneen lämpötilassa liuok sella, joka sisälsi 1 % SDS:a, 0,18 mol/1 NaCl:a, 10 mmol/1 NaH2P04:a (pH 7,4) ja 1 mmol/1 EDTA:a, minkä jälkeen tehtiin yksi pesu samassa puskurissa lämpötilassa 55 °C.
Kalvoille tehtiin 16 tuntia kestänyt autoradio-20 grafia Kodak XAR -filmille lämpötilassa -70 °C käyttämällä yhtä kuvanvahvistuslevyä.
Huomautuksia 1. 86-31: 5'-CGACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3' 2. 87-459: 5'-AGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACT-3' 25 Kuviossa 3 oleva autoradiogrammi osoittaa detek- toidun HIV- ja β-globiinisekvenssien määrän kahden TAS-syklin jälkeen, jotka tehtiin samanaikaisesti HIV- ja 8-globiininukleiinihapolle. 6-globiinilähtömäärä pidettiin vakiona, kun taas HIV-kohteen määrää vaihdeltiin.
30 Vaikka tätä keksintöä on kuvattu tässä selityksessä jonkin verran spesifisesti, kyseistä alaa normaalisti hallitsevat havainnevat kuvatun keksinnön variaatioita ja muunnoksia, jotka ovat keksinnön hengen mukaisia. Tällaiset variaatiot ja muunnokset kuuluvat myös tässä kuvatun 35 ja patenttivaatimuksissa määritellyn keksinnön suoja-alan piiriin.

Claims (41)

93743
1. Menetelmä kaksisäikeisen nukleiinihapon, joka sisältää kohdesekvenssiä vastaavan sekvenssin kytkettynä 5 toimivalla tavalla promoottorina, valmistamiseksi, tunnettu siitä, että hankitaan ensimmäinen nukleiinihappoaluke, joka sisältää promoottorisekvenssin kytkettynä toimivalla tavalla kohdesekvenssin jotakin segmenttiä vastaavaan sek-10 venssiin, hybridisoidaan sopivissa olosuhteissa mainittu ensimmäinen nukleiinihappoaluke nukleiinihappopitoisessa näytteessä olevan kohdesekvenssin kanssa, laajennetaan mainittua hybridisoitua ensimmäistä 15 nukleiinihappoaluketta polymeraasilaajennusreaktiossa komplementaarisesti kohdesekvenssiin nähden, jolloin muodostuu vastaava kaksisäikeinen nukleiinihappo, erotetaan mainitun kaksoissäikeen säikeet, hybridi soidaan erotettuun sekvenssisäikeen sisältä-20 vään promoottoriin sopivissa olosuhteissa toinen nukleii nihappoaluke vastakkaiseen päähän mainittuun promoottorisekvenssin sisältävään säikeeseen nähden ja laajennetaan mainittua hybridisoitua toista nukleiinihappoaluketta polymeraasilaajennusreaktiossa komple-25 mentaarisesti mainittuun promoottorisekvenssin sisältävään säikeeseen nähden.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toistetaan ainakin yhden kerran.
3. Menetelmä, joka on käyttökelpoinen nukleiinihap- '· popitoisessa näytteessä olevan vähintään yhden määrätyn nukleiinihappokohdesekvenssin detektointiin tunnet-t u siitä, että käytetään patenttivaatimuksen 1 mukaista kaksisäikeistä nukleiinihappoa kaksisäikeisenä nukleiini-35 happotemplaattina useiden RNA-transskriptien valmistami- 93743 seksi, joista kukin sisältää mainittua kohdesekvenssiä vastaavan RNA-sekvenssin, ja detektoidaan mainitun RNA-sekvenssin läsnäolo.
4. Menetelmä kaksisäikeisen nukleiinihapon, joka 5 sisältää kohdesekvenssiä vastaavan sekvenssin kytkettynä toimivalla tavalla promoottoriinsa, valmistamiseksi, tunnettu siitä, että hankitaan ensimmäinen nukle-iinihappoaluke, joka sisältää promoottorisekvenssin kytkettynä toimivalla tavalla kohdesekvenssin jollekin seg-10 mentille komplementaariseen sekvenssiin, ja toinen nukle-iinihappoaluke, jossa on kohdesekvenssin jonkin segmentin kanssa identtinen sekvenssi, jolloin mainitut alukkeet vastaavat mainitun kohdesekvenssin eri alueita, mutta eivät ole ollenkaan tai ainakaan olennaisesti päällekkäisiä 15 kohdetta vastaavilta osiltaan, ja valitaan siten, että toisen alukkeen laajennustuote erotettuna komplementistaan voi toimia tempiaattina toisen alukkeen laajennustuotteel-le, saatetaan nukleiinihappopitoinen kohdesekvenssiä sisältävä näyte kosketukseen mainittujen alukkeiden kanssa 20 olosuhteissa, joissa tapahtuu peräkkäinen hybridisaatio ja säikeiden erottuminen, jolloin muodostuu puolestaan mainittujen alukkeiden laajennustuotteita.
5. Menetelmä, RNA-transskriptien määrittämiseksi, tunnettu siitä, että käytetään patenttivaatimuksen 25. tai 4 mukaista kaksisäikeistä nukleiinihappoa templaat- tina useiden RNA-transskriptien valmistamiseksi siitä reaktiosta, jota katalysoi polymeraasi, joka tunnistaa sen promoottorin, ja detektoidaan mainittujen RNA-transskriptien läsnäolo. ;; 30
6. Patenttivaatimuksen 3 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut transskriptit sisältävät replikaasitunnistuskohdan mainittujen transskriptien replikaasin indusoiman replikaation aikaansaamiseksi.
7. Patenttivaatimuksen 3, 5 tai 6 mukainen menetel-35 mä, tunnettu siitä, että mainittujen RNA-trans- 93743 skriptien detektoitu RNA-sekvenssi mitataan standardisoidulla tavalla kohdesekvenssin määrän mittaamiseksi nukle-iinihapponäytteestä, jota käytetään kaksisäikeisen nuke-liinihappotemplaatin valmistuksessa.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittujen RNA-transskrip-tien detektoitu RNA-sekvenssi mitataan käyttämällä sisäisenä standardina mainitun näytteen myös sisältämää nukleiinihappoa, jonka kopioluku tunnetaan.
9. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu kohdesekvenssi sisältyy nukleiinihapposekvenssiin, joka liittyy geneettisen tai patogeenisen sairauden tai tilan luonteenomaisiin piirteisiin.
10 DNA:n alasegmentti, joka sisältää (3' -alukealasegmentin)! sekvenssille komplementaarisen sekvenssin, on 5'-suuntaan kolmannen komplementaarisen DNA:n alasegmentistä, joka sisältää ( 5'-alukealasegmentin)4 sekvenssille komplementaarisen sekvenssin, eikä mene päällekäin tämän kanssa ja 15 kohdesegmentin alasegmentti, joka sisältää (5'-alukeala-segmentin)2 sekvenssin, ei mene päällekkäin kohdesegmentin alasegmentin kanssa, jossa on (3'-alukealasegmentin)3 sekvenssi .
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu nukleiinihapposek-venssi on ihmisen immuunikatoviruksen segmentti.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, # tunnettu siitä, että jossa mainittu nukleiinihap- 20 posekvenssi on viallisen geenin segmentti.
12. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että joko a) promoottori on bakteriofagi T7-promoottori ja RNA-transskriptit tuotetaan käyttämällä T7:n RNA-polymeraasia tai b) promoottori on * 25 SP6-promoottori ja RNA-transskriptit tuotetaan käyttämällä SP6:n RNA-polymeraasia.
13. Patenttivaatimuksen 1 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että laajennusreaktiota katalysoi E. colin DNA-polymeraasi I, E. colin DNA-polymeraasi I:n
14. Patenttivaatimuksen 3 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut RNA-transskriptit leimataan ennen detektointia. 93743
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut RNA-transskriptit leimataan radioaktiivisesti tai kromoforilla.
16. Välineistö, joka on käyttökelpoinen vähintään 5 yhden määrätyn nukleiinihappokohdesekvenssin detektointiin nukleiinihappopitoisesta näytteestä tunnettu siitä, että se sisältää ensimmäistä nukleiinihappoaluketta, joka sisältää ensimmäisen promoottori sekvenssin kytkettynä toimivalla tavalla kohdesekvenssin jollekin segmentille 10 komplementaariseen sekvenssiin, ja toista nukleiinihappoaluketta, jossa on kohdesekvenssin jonkin segmentin kanssa identtinen sekvenssi, jolloin mainitut alukkeet vastaavat mainitun kohdesekvenssin eri alueita, mutta eivät ole ollenkaan tai ainakaan olennaisesti päällekkäisiä kohdesek-15 venssiä vastaavilta osiltaan, ja valitaan siten, että toisen alukkeen laajennustuote erotettuna komplementistaan voi toimia templaattina toisen alukkeen laajennustuotteel-le, ja välineet mainitun ensimmäisen alukkeen hybridisoi-miseksi mainitun kohdesekvenssin kanssa, hybridisoidun 20 alukkeen ketjun laajentamiseksi, tuloksena olevan kaksois-säikeen säikeiden erottamiseksi, mainitun toisen nukleii-nihappoalukkeen hybridisoimiseksi promoottorin sisältävän erottetun säikeen kanssa, hybridisoidun alukkeen ketjun laajentamiseksi, siten valmistetun, promoottorisekvenssin 25 sisältävän kaksisäikeisen nukleiinihapon saattamiseksi tuottamaan transskriptejä ja mainittujen transskriptien detektoimiseksi.
17. Menetelmä kohdenukleiinihapposegmentin ampli-fioimiseksi, jolla segmentillä on kaava I, 30 3' - (ensimmäinen alasegmentti) t- (toinen alasegmentt i) t- (koi -mas alasegmentti) t- 5' (I) jossa (ensimmäinen alasegmentti),. on vähintään 10 nukleoti-35 dista koostuva sekvenssiltään tunnettu nukleiinihapposeg- 93743 mentti, joka liittyy (toisen alasegmentin)t 3'-päähän, (toinen alasegmentti)t on 0 tai useammasta nukleotidista koostuva nukleiinihapposegmentti ja kolmas alasegmentti)t on vähintään 10 nukleotidista koostuva sekvenssiltään tun-5 nettu nukleiinihapposegmentti, joka liittyy (toisen ala-segmentin )t 5'-päähän, joka menetelmä on tunnettu siitä, että (1) hybridisoidaan mainitun kohdesegmentin (ensimmäiseen alasegmenttiin)t ensimmäinen aluke, joka on yksisäikeinen DNA, joka sisältää 3'-terminaalisen alaseg-10 mentin, jolla on kaava II, 5'-(promoottori )i~( vaihteleva alasegmentti )j-( 3' -alukeala-segmentti )x-3' (II) 15 jossa (promoottori)! on yksisäikeinen DNA-segmentti, jolla on bakteriofagin DNA:sta riippuvalle RNA-polymeraasille spesifisen promoottorin plus-säikeen sekvenssi, (vaih-:·, televa alasegmentti)! on yksisäikeinen 0 - 100 nukleotidis- 20 ta koostuva yksisäikeinen DNA-segmentti, joka liittyy (promoottorin)! 3'-terminaaliseen nukleotidiin ja (3'-alu-kealasegmentin)! 5'-terminaaliseen nukleotidiin, ja (3'-alukealasegmentti)x on yksisäikeinen, vähintään 10 nukleotidista koostuva DNA-segmentti, jossa on sekvenssi,joka • · : 25 on komplementaarinen (ensimmäisen alasegmentin)t alasegmen tin, joka päättyy (ensimmäisen alasegmentin),. 3'-terminaalisella nukleotidilla, sekvenssille; (2) laajennetaan mainittua kohdan (1) mukaisesti hybridisoitua ensimmäistä aluketta ensimmäisen DNA-polyme-30 raasin katalysoimassa reaktiossa, jolloin muodostuu en-simmäinen komplementaarinen DNA-segmentti, joka sisältää alasegmentin, jolla on kaava III, 93743 5' -(promoottori ^-(vaihteleva alasegmentti )2-( ensimmäinen alasegmentti)te- (toinen alasegmentti )te- (kolmas alaseg mentti )tc-3 ’ (III) 5 jossa (ensimmäinen alasegmentti)tc on DNA-segmentti, jossa on (ensimmäisen alasegmentin)t sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, (toinen alasegmentti)tc on DNA-segmentti, jossa on (toisen alasegmentin)t sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, ja (kolmas alasegmentti)tc on DNA-segment-10 ti, jossa on (kolmannen alasegmentin)t sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, sillä edellytyksellä, että jos koh-desegmentti on RNA-segmentti, mainittu ensimmäinen DNA-po-lymeraasi on käänteistransskriptaasi; (3) muutetaan yksisäikeiseksi vaiheen ( 2) reaktios-15 sa muodostunut kaksoissäie; (4) hybridisoidaan mainitun, kaavan III mukaisen ensimmäisen komplementaarisen DNA:n (kolmanteen osaseg-menttiin)tc toinen aluke, joka on vähintään 10 nukleotidista koostuva yksisäikeinen DNA, jolla on kaava IV 20 3 ' - ( 5 ' -alukealasegmentti )2-( vaihteleva alasegmentti )2-5 ’ (IV) jossa (5'-alukealasegmentillä)2 on (kolmannen alasegmen-25 tin)t alasegmentin, joka päättyy (kolmannen alasegmentin)t 5'-terminaalisella nukleotidilla, sekvenssi ja jossa (vaihteleva alasegmentti)2 on 0 - 100 nukleotidista koostuva segmentti, joka liittyy (5'-alukealasegmentin)2 5’-päähän; . ; 30 (5) laajennetaan mainittua vaiheen (4) mukaisesti Λ » . hybridisoitua toista alukesegmenttiä toisen DNA-polymeraa- sin katalysoimassa reaktiossa, jolloin muodostuu toinen komplementaarinen DNA-segmentti, joka sisältää alasegmentin, jolla on kaava V, 93743 5' -(vaihteleva alasegmentti )2-(kolmas alasegmentti )t-(toinen alasegmentti) t- (ensimmäinen alasegmentti) t- (vaihteleva alasegmentti )lc-( promoottori )lc-3' (V) 5 jossa (vaihteleva alasegmentti)lc on DNA-segmentti, jossa on (vaihtelevan alasegmentin^ sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, ja (promoottori)lc on DNA-segmentti, jossa on (promoottorin)! sekvenssille komplementaarinen 10 sekvenssi, sillä edellytyksellä, että mainittu toinen DNA-polymeraasi on sama tai eri kuin mainittu ensimmäinen DNA-polymeraasi; ja (6) käytetään vaiheen (5) kaksisäikeistä tuotetta templaattina reaktiossa, jota katalysoi ensimmäinen bak-15 teriofagin DNA:sta riippuva RNA-polymeraasi, joka tunnistaa promoottorin, jonka toinen säie on (promoottori)!, jolloin saadaan ensimmäinen RNA-tuote, jolla on kaava VI, 5'-(vaihteleva alasegmentti) lr -(ensimmäinen alaseg- 20 mentti ) tcr- (toinen alasegmentti) tcr- (kolmas alasegmentti) tcr-(vaihteleva alasegmentti) 2cr-3' (VI) jossa (vaihteleva alasegmentt i)lr on RNA-segmentti, jossa : 25 on (vaihtelevan alasegmentin)i sekvenssi, (ensimmäinen ala- segmentti )tcr on RNA-segmentti, jossa on (ensimmäisen ala-segmentin),. sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, (toinen alasegmentti)tcr on RNA-segmentti, jossa on (toisen ala-segmentin )t sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, (kol-30 mas alasegmentti)tcr on RNA-segmentti, jossa on (kolmannen V . alasegmentin)t sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, ja (vaihteleva alasegmentti )2cr on RNA-segmentti, jossa on (vaihtelevan alasegmentin)2 sekvenssille komplementaarinen sekvenssi. il 93743
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (ensimmäinen alasegmentti),. on pituudeltaan vähintään 10 nukleotidia ja sillä on kaavan XIII 5 3' - (ensimmäinen alasegmentt i )t2“( ensimmäinen alaseg mentti )tl-5' (XIII) jossa (ensimmäinen alasegmentti)t2 sisältää 0 tai useampia 10 nukleotideja ja, jos niitä on enemmän kuin 0, liittyy (ensimmäisen alasegmentin)tl 3'-päähän ja (ensimmäinen alasegmentti )tl on pituudeltaan vähintään 10 nukleotidia; jossa (kolmannella alasegmentillä)t on kaava XIV, 15 3'-(kolmas alasegmentti)tl-(kolmas alasegmentti)t2-5' (XIV) jossa (kolmas alasegmentti)t2 sisältää 0 tai useampia nukleotideja ja, jos niitä on enemmän kuin 0, liittyy (kol-20 mannen alasegmentin)tl 5'-päähän ja (kolmas alasegmentti)tl on pituudeltaan vähintään 10 nukleotidia; jossa (3'-aluke-alasegmentin)x sekvenssi on komplementaarinen kohdesegmen-tin, joka koostuu koko (ensimmäisestä alasegmentistä)t2 ja (ensimmäisen alasegmentin)tl 0 tai useammasta nukleotidis-25 ta, jonkin alasegmentin sekvenssille; jossa (5'-alukeala-segmentti)2 on alasegmentti, joka koostuu koko (kolmannesta alasegmentistä)t2 ja (kolmannen alasegmentin)tl 0 tai useammasta nukleotidista; ja jossa vaiheiden 1-6 (supra) jälkeen RNA-alasegmenttiä, jolla on kaava VII, 30 5'-(vaihteleva alasegmentti)lr-(ensimmäinen alasegmentti )t2cr-( ensimmäinen alasegmentti) tlcr-(toinen alasegmentti )tcr- (kolmas alasegmentti )tlcr-3' (VII) 93743 jossa (ensimmäinen alasegmentti)tlcr on RNA-segmentti, jossa on (ensimmäisen alasegmentin)tl sekvenssille komplementaarinen sekvenssi ja (kolmas alasegmentti)tlcr on RNA-segmentti, jossa on (kolmannen alasegmentin)tl sekvenssille komp-5 lementaarinen sekvenssi, amplifioidaan edelleen menetel mällä, jossa (7) hybridisoidaan mainittuun kaavan VI mukaiseen ensimmäiseen RNA-tuotteeseen kolmas aluke, joka on yksi-säikeinen DNA, joka sisältää 3-terminaalisen alasegmentin, 10 jolla on kaava VIII, 5'-(promoottori )3-( vaihteleva alasegmentti )3-( 3 ' -alukeala-segmentti )3-3' (VIII) 15 jossa (promoottori)3 on yksisäikeinen DNA-segmentti, jossa on bakteriofagin DNA:sta riippuvalle RNA-polymeraasille spesifisen promoottorin plus-säikeen sekvenssi, jolloin mainittu (promoottorin)3 sekvenssi on sama tai eri kuin 20 (promoottorin)! sekvenssi, (vaihteleva alasegmentti )3 on yksisäikeinen 0 - 100 nukleotidista koostuva DNA-seg- mentti, joka liittyy (promoottorin)3 3'-terminaaliseen nukleotidiin ja (3'-alukealasegmentin)3 5'-terminaaliseen nukleotidiin, ja (3'-alukealasegmentti)3 on yksisäikeinen DNA-25 segmentti, jolla on sama sekvenssi kuin (kolmannella ala-segmentillä )tl ja joka liittyy (promoottorin)3 3'-terminaaliseen nukleotidiin, jos (vaihteleva alasegmentti)3 sisältää 0 nukleotidia; (8) laajennetaan mainittua vaiheen 7 mukaisesti 30 hybridisoitua kolmatta aluketta kolmannen DNA-polymeraa- sin, joka on käänteistransskriptaasi ja sama tai eri kuin mainitut ensimmäinen ja toinen DNA-polymeraasi, katalysoimassa reaktiossa, jolloin muodostuu kolmas komplementaarinen DNA-segmentti, joka sisältää 3'-terminaalisen alaseg-35 mentin, jolla on kaava IX, 93743 5' - (promoottori )3- (vaihteleva alasegmentti )3-kolmas alasegmentti )tl-( toinen alasegmentti )t-( ensimmäinen alasegmentti )tl-( ensimmäinen alasegmentti )t2-( vaihteleva alasegmentti)^' 5 (IX) jossa (vaihteleva alasegmentti)lc on DNA, jossa on (vaih-televan alasegmentin)1 sekvenssille komplementaarinen sekvenssi ; 10 (9) muutetaan yksisäikeiseksi vaiheen 8 reaktiossa muodostunut kaksoissäie; (10) hybridisoidaan reaktiovaiheessa 8 valmistettuun kolmanteen komplementaariseen DNA:hän neljäs aluke, jolla on kaava X, 15 5 ’ - (vaihteleva alasegmentti )4- (5' -alukealasegmentti )4-3 ’ (X) jossa (vaihteleva alasegmentti)4 on 0 - 100 nukleotidista 20 koostuva segmentti ja (5’-alukealasegmentti)4 on sekvenssiltään tunnettu alasegmentti, joka liittyy (vaihtelevan alasegmentin)4 3'-nukleotidiin, jos (vaihteleva alasegmentti )4 sisältää enemmän kuin 0 nukleotidia, ja joka sisältää vähintään 10 nukleotidia segmentistä, jolla on kaava XX, ·* 25 5' - (vaihteleva alasegmentti) 2- (ensimmäinen alasegmentti) t2c-(ensimmäinen alasegmentti )tlc-3' (XX) 30 jossa (ensimmäinen alasegmentti)t2c on DNA-segmentti, jossa on (ensimmäinen alasegmentin)t2 sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, ja (ensimmäinen alasegmentti)tlc on DNA-segmentti, jossa on (ensimmäisen alasegmentin)tl sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, sillä edellytyk-35 sellä, että vähintään yksi mainituista vähintään 10 nuk- 93743 leotidista (ensimmäisen alasegmentin)tlc 5'-terminaalisen nukleotidin kohdalla tai 5'-suuntaan siitä; (11) laajennetaan mainittua vaiheen 10 mukaisesti hybridisoitua neljättä aluketta neljännen DNA-polymeraa- 5 sin, joka on sama tai eri kuin mainitut ensimmäinen, toinen ja kolmas DNA-polymeraasi, katalysoimassa reaktiossa, jolloin muodostuu neljäs komplementaarinen DNA, joka sisältää segmentin, jolla on kaava XI, 10 5'-(ensimmäinen alasegmentti)tlc-(toinen segmentti)tc-(kol mas alasegmentt i) tlc- (vaihteleva alasegmentti) 3c- (promoottori )3c-3 ' (XI) 15 jossa (toinen segmentti)tc on DNA-segmentti, jossa on (toisen alasegmentin)t sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, (kolmas alasegmentti)tlc on DNA-segmentti, jossa on (kolmannen alasegmentin)tl sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, (vaihteleva alasegmentti)3c on DNA-segmentti, 20 jossa on (vaihtelevan alasegmentin)3 sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, ja (promoottori)3c on DNA-segmentti, jossa on (promoottori)3:n sekvenssille komplementaarinen sekvenssi; ja (12) käytetään vaiheen 11 kaksisäikeistä tuotetta 25 templaattina reaktiossa, jota katalysoi toinen bakteriofagin DNA:sta riippuva RNA-polymeraasi, joka on sama tai eri kuin mainittu ensimmäinen bakteriofagin DNA:sta riippuva RNA-polymeraasi ja joka tunnistaa promoottorin, jonka toinen säie on (promoottori)3, jolloin saadaan toinen RNA-tuo- 30 te, jossa on 5'-terminaalinen alasegmentti, jolla on kaava « XII, 5'-(vaihteleva alasegmentti)3r-(kolmas alasegmentti) taitoinen alasegmentti )tr-( ensimmäinen alasegmentti )tlr-X12-(vaihteleva alasegmentti )4cr-3' 35 (XII) 93743 jossa (vaihteleva alasegmentti)3r on RNA-segmentti, jossa on (vaihtelevan alasegmentin)3 sekvenssi, (kolmas alasegmentti )tlr on RNA-segmentti, jossa on (kolmannen alasegmen-tin)tl sekvenssi, (toinen alasegmentti )tr on RNA-segmentti, 5 jossa on (toisen alasegmentin)t sekvenssi, (ensimmäinen alasegmentti)tlr on RNA-segmentti, jossa on (ensimmäisen alasegmentin )tl sekvenssi, (vaihteleva alasegmentti)4cr on RNA-segmentti, jossa on (vaihtelevan alasegmentin)4 sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, ja X12 on RNA-seg-10 mentti, jossa on (5'-alukealasegmentin)4 alasegmentin, joka on 5'-suuntaan (ensimmäisen alasegmentin )tlc 5'-päästä, sekvenssille komplementaarinen sekvenssi.
19. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (vaihteleva alasegmentti)! ja 15 (vaihteleva alasegmentti)2 sisältävät kumpikin 0-60 nukleotidia, (3'-alukealasegmentti)x ja (5'-alukealasegment-ti)2 sisältävät kumpikin 15 - 45 nukleotidia, (toinen ala-segmentti )t sisältää vähintään 30 nukleotidia ja kohdeseg-mentti sisältää korkeintaan 1000 nukleotidia.
20 HIV-1-viruksen genomin segmentti ja (1) (3'-alukealaseg-mentti)i sisältää sekvenssin 5' -TCTAATTACTACCTCTTCTTCTGCTA-GACT-3', (5'-alukealasegmentti)2 sisältää sekvenssin 5'- ACAAGTTGTAACACCTCAGTCATTACACAG-3', (3'-alukealasegmentti)3 sisältää sekvenssin 5'-AAAGGTATCCTTTGAGCCAATTCCCATA-3' ja 25 neljäs aluke sisältää sekvenssin 5'-AGTTGATACTACTGGCC-TAATT-3'; tai (2) (3'-alukealasegmentti)i sisältää sekvenssin 5'-TTTCGTAACACTAGGCAAAGGTGGCTTTATC-31, (5'-alukeala segmentti )2 sisältää sekvenssin 5'-GCACACAAGTAGACCCTGAAC-TAGCAGACCA-3' tai 5'-ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3', 30 (3'-alukealasegmentti)3 sisältää sekvenssin 5'-ACTAATT- CATCTGTATTACTTTGACTGTTTTTC-3' ja neljäs aluke sisältää sekvenssin 5-TTTTTTGGTGTTATTAATGCTGCTAGTGCC-3'.
20. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdesegmentti on DNA-seg-mentti, vaiheen 2 tuote muutetaan yksisäikeiseksi termisesti denaturoimalla, (vaihteleva alasegmentti)2 sisältää 0 nukleotidia, ensimmäinen ja toinen DNA-polymeraasi vali-: 25 taan joukosta, johon kuuluvat E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentti, AMV-käänteistransskriptaasi, kloonattu MMLV-käänteistransskriptaasi, vasikan kateenkorvan DNA-polymeraasi alfa, Thermus aguaticusin lämpöstabiili DNA-polymeraasi ja kloonattu T7-DNA-polymeraasi Sequenase™, ja 30 bakteriofagin DNAzsta riippuva RNA-polymeraasi valitaan joukosta, johon kuuluvat T7-polymeraasi, T3-RNA-polymeraa-si ja SP6-RNA-polymeraasi.
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen DNA-35 polymeraasi valitaan kumpikin joukosta, johon kuuluvat E. 93743 colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentti, AMV-käänteistransskriptaasi ja kloonattu MMLV-käänteistransskriptaasi.
22. Patenttivaatimksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdesegmentti on RNA-seg- 5 mentti, vaiheen 2 tuote muutetaan yksisäikeiseksi termisellä denaturaatiolla, (vaihteleva alasegmentti)2 sisältää 0 nukleotidia, ensimmäinen DNA-polymeraasi valitaan joukosta, johon kuuluvat AMV-käänteistransskriptaasi ja kloonattu MMLV-käänteistransskriptaasi, toinen DNA-polymeraasi 10 valitaan joukosta, johon kuuluvat E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentti, AMV-käänteisstransskriptaasi, kloonattu MMLV-käänteistransskriptaasi, vasikan kateenkorvan DNA-polymeraasi alfa, Thermus aquaticusin lämpöstabiili DNA-polymeraasi ja kloonattu T7-DNA-polymeraasi Sequenase' 15 ™, ja bakterifagin DNA:sta riippuva RNA-polyraeraasi vali taan joukosta, johon kuuluvat T7-RNA-polymeraasi, T3-RNA-polymeraasi ja SP6-RNA-polymeraasi.
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen DNA-polymeraasi vali- 20 taan joukosta, johon kuuluvat E. colin DNA-polymeraasi Iin Klenow-fragmentti, AMV-käänteistransskriptaasi ja kloonattu MMLV-käänteistransskriptaasi.
24. Patenttivaatimuksen 21 tai 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (1) bakteriofagin DNA:- 25 sta riippuva RNA-polymeraasi on T7-RNA-polymeraasi, (promoottori)! on 5'-TAATACGACTCACTATA-3' ja (vaihteleva ala-segmentti)! sisältää dinukleotidin, jonka sekvenssi on 5'-GG-3', 5'-päässään; tai (2) bakteriofagin DNA:sta riippuva RNA-polymeraasi on T3-RNA-polymeraasi, (promoottori)! on 30 5'-TATTAACCCTCACTAAA-3'- (vaihteleva alasegmentti)! sisäl tää tetranukleotidin, jonka sekvenssi on 5'-GGGA-3', 5'-päässään; tai (3) bakteriofagin DNA:sta riippuva RNA-polymeraasi on SP6-RNA-polymeraasi, (promoottori)! on 5'-GAACG-CGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTA-35 TA-3* ja (vaihteleva alasegmentti)! sisältää heksanukleoti- 93743 din, jonka sekvenssi on 5'-GAATAC-3', 5'-päässään.
25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisen alukkeen 5'-pää on (promoottorin) 1 5'-nukleotidi.
26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen DNA-polymeraasi valitaan kumpikin AMV-käänteistransskriptaasin ja kloonatun MMLV-käänteistransskriptaasin joukosta.
27. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että jos bakteriofagin DNA:sta riippuva RNA-polymeraasi on T7- tai T3-RNA-polymeraasi, (vaihteleva alasegmentti )x sisältää sekvenssin 5' -GGGATGGG-GAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3'- ja jos bakteriofagin DNA:sta riippuva RNA-polymeraasi on SP6-RNA-polymeraasi, 15 (vaihteleva alasegmentti^ sisältää sekvenssin 5'GAATACTGG- GGAACCCCCCTTCGGGGGTCACCTCGCGCAGC-3'.
28. Patenttivaatimuksen 22, 23, 24, 25, 26 tai 27 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koh-desegmentti on ihmisen immuunikatoviruksen, ts. HIV-1-vi- 20 ruksen genomin segmentti ja (1) (3’-alukealasegmentti^ Sisältää sekvenssin 5'-TCTAATTACTACCTCTTCTTCTGCTAGACT-3' ja (5'-aluke CCTCTTCTTCTGCTAGACT-3' ja (5'-alukealasegmentti )2 sisältää sekvenssin 5’-AGAAGTTGTAACACCTCAGTCATTA-CACAG-3' tai (2) (3'-alukealasegmentti)3 sisältää sekvens-: 25 sin 5'-TTTCGTAACACTAGGCAAAGGTGGCTTTATC-3’ ja (5’-alukeala segmentti )2 sisältää sekvenssin 5’-GCACACAAGTAGACCCTGAAC-TAGCAGACCA-3’- tai 5'-ACACCATATGTATGTTTCAGGGAAAGCTA-3'.
29. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (vaihteleva alasegmentti)! ja 30 vaihteleva alasegmentti )3 sisältävät kumpikin 0-60 nukleotidia, (3'-alukealasegmentti)3 ja (5'-alukealasegmentti)2, 3’-alukealasegmentti)3 ja (5'-alukealasegmentti)4 sisältävät kukin 15 - 45 nukleotidia, (toinen alasegmentti)t sisältää vähintään 30 nukleotidia ja kohdesegmentti sisältää 35 korkeintaan 1 000 nukleotidia. 93743
30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (A) jos kohdesegmentti on DNA-segmentti, vaiheen 2 tuote muutetaan yksisäikeiseksi termisellä denaturaatiolla ja vaiheen 8 tuote muutetaan 5 yksisäikeiseksi termisellä denaturaatiolla; ensimmäinen, toinen ja neljäs DNA-polymeraasi valitaan kukin joukosta, johon kuuluvat E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-frag-mentti, AMV-käänteistransskriptaasi, kloonattu MMLV-kään-teistransskriptaasi, vasikan kateenkorvan DNA-polymeraasi 10 alfa, Thermus aquqticusin lämpöstabiili DNA-polymeraasi ja kloonattu T7-DNA-polymeraasi Sequenase™; kolmas DNA-polymeraasi valitaan joukosta johon kuuluvat AMV-käänteis-transskriptaasi ja kloonattu MMLV-käänteistransskriptaasi; ja ensimmäinen ja toinen bakteriofagin DNA:sta riippuva 15 RNA-polymeraasi valitaan kumpikin joukosta, johon kuuluvat T7-RNA-polymeraasi, T3-RNA-polymeraasi ja SP6-RNA-polyme-raasi; ja (B) jos kohdesegmentti on RNA-segmentti, muutetaan vaiheen 2 ja vaiheen 8 tuote kumpikin yksisäikeiseksi termisellä denaturaatiolla; toinen ja neljäs DNA-polyme-20 raasi valitaan kumpikin joukosta, johon kuuluvat E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentti, AMV-käänteistransskriptaasi, kloonattu MMLV-käänteistransskriptaasi, vasikan kateenkorvan DNA-polymeraasi alfa, Thermus aquaticusin lämpöstabiili DNA-polymeraasi ja kloonattu T7-DNA-polyme-25 raasi Sequenase™; ensimmäinen ja kolmas DNA-polymeraasi valitaan kumpikin joukosta, johon kuuluvat AMV-käänteis-transskriptaasi ja kloonattu MMLV-käänteistransskriptaasi; ja ensimmäinen ja toinen bakteriosfagista riippuva RNA-polymeraasi valitaan kumpikin joukosta, johon kuuluvat T7-30 RNA-polymeraasi, T3-RBA-polymeraasi ja SP6-RNA-polymeraa-si.
30 Klenow-fragmentti, T4:n DNA-polymeraasi tai käänteis- stransskriptaasi.
31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdesegmentti on RNA-segmentti ja toinen ja neljäs DNA-polymeraasi valitaan kumpi- 35 kin joukosta, johon kuuluvat E. colin DNA-polymeraasi I:n 93743 Klenow-fragmentti, AMV-käänteistransskriptaasi ja kloonattu MMLV-käänteistransskriptaasi, ja ensimmäinen ja kolmas DNA-polymeraasi valitaan kumpikin joukosta, johon kuuluvat AMV-käänteistransskriptaasi ja kloonattu MMLV-käänteis-5 transskriptaasi.
32. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdesegmentin alasegmentti, joka sisältää (3'-alukealasegmentin^ sekvenssille komplementaarisen sekvenssin, on 3'-suuntaan kohdesegmentin ala- 10 segmentistä, joka sisältää (5'-alukealasegmentin)4 sekvens sille komplementaarisen sekvenssin, eikä mene päällekkäin tämän kanssa ja kohdesegmentin alasegmentti, joka sisältää (5'-alukealasegmentin)2 sekvenssin ei mene päällekkäin kohdesegmentin alasegmentin kanssa, joka sisältää (3'-alu- 15 kealasegmentin)3 sekvenssin.
33. Patenttivaatimuksen 32 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kolmannen komplementaarisen DNA:n alasegmentti, joka sisältää (3'-alukealasegmentin)! sekvenssille komplementaarisen sekvenssin, on 5'-suuntaan 20 kolmannen komplementaarisen DNA:n alasegmentistä, jolla on (5 ' -alukealasegmentin)4 sekvenssille komplementaarinen sekvenssi, eikä mene päällekkäin tämän kanssa ja kohdesegmentin alasegmentti, joka sisältää (5'-alukealasegmentin)2 sekvenssin, ei mene päällekkäin kohdesegmentin alasegmen- 25 tin kanssa, jossa on (3,-alukealasegmentin)3 sekvenssi.
34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kolmannessa komplementaarisessa DNA:ssa (vaihteleva alasegmentti)lc sisältää useampi kuin 0 nukleotidia ja (5'-alukealasegmentin)4 ja kolmannen 30 komplementaarisen DNA:n välisessä kaksoissäikeessä ainakin • * * (5'-alukealasegmentin)4 alasegmentti on hybridisoituneena (vaihtelevaan alasegmenttiin)lc.
35 DNA-segmentti, vaiheen 2 tuote muutetaan yksisäikeiseksi 93743 termisellä denaturaatiolla; ensimmäinen ja toinen DNA-po-lymeraasi valitaan kumpikin joukosta, johon kuuluvat E. colin DNA-polymeraasi I:N Klenow-fragmentti, AMV-käänteis-transskriptaasi, kloonattu MMLV-käänteistransskriptaasi, 5 vasikan kateenkorvan DNA-polymeraasi alfa, Thermus aquati-cusin lämpöstabiili DNA-polymeraasi ja kloonattu T7-DNA-polymeraasi Sequenase™; ja ensimmäinen bakteriofagin DNA:-sta riippuva RNA-polymeraasi valitaan joukosta, johon kuuluvat T7-RNA-polymeraasi, T3-RNA-polymeraasi ja SP6-RNA-10 polymeraasi; ja (B) jos kohdesegmentti on RNA-segmentti, vaiheen 2 tuote muutetaan yksisäikeiseksi termisellä denaturaatiolla; toinen DNA-polymeraasi valitaan joukosta, johon kuuluvat E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-frag-mentti, AMV-käänteistransskriptaasi, kloonattu MMLV-kään-15 teistransskriptaasi, vasikan kateenkorvan DNA-polymeraasi alfa, Thermus aquaticusin 1 lämpöstabiili DNA-polymeraasi ja kloonattu T7-DNA-polymeraasi Sequenase™; : ensimmäinen DNA-polymeraasi valitaan joukosta, johon kuuluvat AMV-käänteistransskriptaasi, ja kloonattu MMLV-käänteistrans-20 skriptaasi; ja ensimmäinen bakteriofagin DNA;sta riippuva RNA-polymeraasi valitaan joukosta, johon kuuluvat T7-RNA-polymeraasi , T3-RNA-polymeraasi ja SP6-RNA-polymeraasi.
35. Patenttivaatimuksen 33 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdesegmentin alasegmentti, 35 joka sisältää (3'-alukealasegmentin)1 sekvenssille komple- « 93743 mentaarisen sekvenssin, on 3'-suuntaan kohdesegmentin ala-segmentistä, joka sisältää (5'-alukealasegmentin)4 sekvenssille komplementaarisen sekvenssin, eikä mene päällekkäin tämän kanssa ja kohdesegmentin alasegmentti, joka sisältää 5 (5'-alukealasegmentin)2 sekvenssin, ei mene päällekkäin kohdesegmentin alasegmentin kanssa, jossa on (3'-alukeala-segmentin)3 sekvenssi.
36. Patenttivaatimuksen 33 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kolmannen komplementaarisen
37. Patenttivaatimuksen 36 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että kolmannessa komplementaari sessa DNA:ssa (vaihteleva alasegmentt ^ )lc sisältää useampia kuin 0 nukleotidia ja (5'-alukealasegmentin)4 ja komplementaarisen kolmannen DNA:n välisessä kaksoissäikeessä ainakin (5'-alukealasegmentin)4 alasegmentti on hybridisoitune-25 ena (vaihtelevaan alasegmenttiin)lc.
38. Patenttivaatimuksen 32, 33, 34, 35, 36 tai 37 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (1) jos vaiheessa 6 tai vaiheessa 12 käytetään T7-RNA-polymeraa-sia, tämän vaiheen ollessa vaihe 6 (promoottori)! tai tämän 30 vaiheen ollessa vaihe 12 (promoottori)3 sisältää sekvenssin ' 5'-TAATACGACTCACTATA-3' ja tämän vaiheen ollessa vaihe 6 (vaihteleva alasegmentti)! tai tämän vaiheen ollessa vaihe 12 (vaihteleva alasegmentti)3 sisältää dinukleotidin, jonka sekvenssi on 5'-GG-3', 5'-päässään; tai (2) jos vaiheessa 35 6 tai vaiheessa 12 käytetään T3-RNAk-polymeraasia, tämän 93743 vaiheen ollessa vaihe 6 (promoottori)! tai tämän vaiheen ollessa vaihe 12 (promoottori)3 sisältää sekvenssin 5'-TAT-TAACCCTCACTAAA-3' ja tämän vaiheen ollessa vaihe 6 (vaih-televa alasegmentti)i tai tämän vaiheen ollessa vaihe 12 5 (vaihteleva alasegmentti )3 sisältää tetranukleotidin, jonka sekvenssi on 5'-GGGA-3', 5'-päässään; tai (3) jos vaiheessa 6 tai vaiheessa 12 käytetään SP6-RNA-polymeraasia, tämän vaiheen ollessa vaihe 6 (promoottori)x tai tämän vaiheen ollessa vaihe 12 (promoottori)3 sisältää sekvenssin 10 5 ’ -GAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATT- TAGGTGACACTATA-3' ja tämän vaiheen ollessa vaihe 6 (vaihteleva alasegmentti)! tai tämän vaiheen ollessa vaihe 12 (vaihteleva alasegmentti)3 sisältää heksanukleotidin, jonka sekvenssi on 5'-GAATAC-3', 5'-päässään; ja jossa ensimmäi-15 sen alukkeen 5'-pää on (promoottorin)! 5'-nukleotidi ja kolmannen alukkeen 5' -pää on (promoottorin) 3 5' -nukleotidi.
39. Patenttivaatimuksen 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 tai 37 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdesegmentti on ihmisen immuunikatoviruksen, ts.
40. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että (A) jos kohdesegmentti on
41. Patenttivaatimuksen 40 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen DNA-25 polymeraasi valitaan kumpikin joukosta, johon kuuluvat AMV-käänteistransskriptaasi ja kloonattu MMLV-käänteistransskriptaasi . 93743
FI896077A 1987-06-19 1989-12-19 Transskriptioon perustuvia nukleiinihappoamplifikaatio-/detektointijärjestelmiä FI93743C (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6414187A 1987-06-19 1987-06-19
US6414187 1987-06-19
US20297888A 1988-06-06 1988-06-06
US20297888 1988-06-06
PCT/US1988/002108 WO1988010315A1 (en) 1987-06-19 1988-06-17 Transcription-based nucleic acid amplification/detection systems
US8802108 1988-06-17

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI896077A0 FI896077A0 (fi) 1989-12-19
FI93743B FI93743B (fi) 1995-02-15
FI93743C true FI93743C (fi) 1995-05-26

Family

ID=26744190

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI896077A FI93743C (fi) 1987-06-19 1989-12-19 Transskriptioon perustuvia nukleiinihappoamplifikaatio-/detektointijärjestelmiä

Country Status (17)

Country Link
EP (2) EP0623683B1 (fi)
JP (1) JP2843586B2 (fi)
KR (1) KR960014107B1 (fi)
AT (2) ATE114335T1 (fi)
BR (1) BR8807097A (fi)
DE (2) DE3852177T3 (fi)
DK (1) DK175614B1 (fi)
ES (1) ES2009286A6 (fi)
FI (1) FI93743C (fi)
GR (1) GR880100396A (fi)
HU (1) HU216317B (fi)
IE (1) IE65089B1 (fi)
IL (1) IL86724A (fi)
NO (1) NO303068B1 (fi)
NZ (1) NZ225077A (fi)
PT (1) PT87769B (fi)
WO (1) WO1988010315A1 (fi)

Families Citing this family (423)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5356774A (en) * 1986-04-16 1994-10-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Replicative RNA-based amplification/detection systems
JP2774121B2 (ja) * 1987-07-31 1998-07-09 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅
JP2846018B2 (ja) * 1988-01-21 1999-01-13 ジェネンテク，インコーポレイテッド 核酸配列の増幅および検出
EP0358737A4 (en) * 1988-01-28 1992-04-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research Genomic amplification with direct sequencing
CA1340807C (en) * 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
US5130238A (en) * 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
CA1339991C (en) * 1988-09-08 1998-08-11 The Trustees Of Columbia University Replicative rna-based amplification/detection system
JP2939485B2 (ja) * 1988-09-08 1999-08-25 ザ・ソーク・インスチュート・フォーバイオロジカル・スタディーズ 複製ｒｎａに基づく増幅／検出系
EP0446305B1 (en) * 1988-12-05 1996-05-08 The Salk Institute For Biological Studies Systems for amplification/detection of target nucleic acids
CA2005589C (en) 1988-12-16 2001-02-06 Thomas Raymond Gingeras Self-sustained, sequence replication system
US5237016A (en) * 1989-01-05 1993-08-17 Siska Diagnostics, Inc. End-attachment of oligonucleotides to polyacrylamide solid supports for capture and detection of nucleic acids
CA2046919A1 (en) * 1989-02-14 1990-08-15 Mark P. Pasek Oligonucleotide primer pairs for sequence independent gene amplification and methods which employ them
IE66597B1 (en) * 1989-05-10 1996-01-24 Akzo Nv Method for the synthesis of ribonucleic acid (RNA)
US5112734A (en) * 1989-05-26 1992-05-12 Gene-Trak Systems Target-dependent synthesis of an artificial gene for the synthesis of a replicatable rna
US5683896A (en) 1989-06-01 1997-11-04 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
ATE282716T1 (de) * 1989-07-11 2004-12-15 Gen Probe Inc Verfahren zur amplifikation von nukleinsäuresequenzen
US7009041B1 (en) 1989-07-11 2006-03-07 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides for nucleic acid amplification and for the detection of Mycobacterium tuberculosis
CA2020958C (en) * 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5766849A (en) * 1989-07-11 1998-06-16 Gen-Probe Incorporated Methods of amplifying nucleic acids using promoter-containing primer sequence
US6589734B1 (en) 1989-07-11 2003-07-08 Gen-Probe Incorporated Detection of HIV
US5219727A (en) * 1989-08-21 1993-06-15 Hoffmann-Laroche Inc. Quantitation of nucleic acids using the polymerase chain reaction
DE3929030A1 (de) * 1989-09-01 1991-03-07 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur vermehrung von nukleinsaeuren
US7049102B1 (en) 1989-09-22 2006-05-23 Board Of Trustees Of Leland Stanford University Multi-gene expression profile
US5545522A (en) * 1989-09-22 1996-08-13 Van Gelder; Russell N. Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex
US5215899A (en) * 1989-11-09 1993-06-01 Miles Inc. Nucleic acid amplification employing ligatable hairpin probe and transcription
US7585512B1 (en) 1990-05-08 2009-09-08 Thomas Jefferson University Composition and method of using tumor cells
US5194370A (en) * 1990-05-16 1993-03-16 Life Technologies, Inc. Promoter ligation activated transcription amplification of nucleic acid sequences
US5645994A (en) * 1990-07-05 1997-07-08 University Of Utah Research Foundation Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences
JPH04141098A (ja) * 1990-09-29 1992-05-14 Shimadzu Corp Ｒｎａ検出用試薬及びそれを用いたｒｎａの検出方法
JPH06502766A (ja) * 1990-11-14 1994-03-31 アクゾ・ノベル・ナムローゼ・フェンノートシャップ ポリスチレン支持体ベース−サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ法を用いる核酸の非同位体検出およびそれに用いる組成物
DE69128077T2 (de) * 1990-12-31 1998-02-26 Promega Corp., Madison, Wis. Nuklein-säure amplifikation mit dns abhängigen rns polymerasen aktivität von rns-replikasen
US5518900A (en) * 1993-01-15 1996-05-21 Molecular Tool, Inc. Method for generating single-stranded DNA molecules
WO1992020820A1 (en) * 1991-05-15 1992-11-26 Vanderbilt University Method to determine metastatic potential of tumor cells
US5169766A (en) * 1991-06-14 1992-12-08 Life Technologies, Inc. Amplification of nucleic acid molecules
DE69214243T2 (de) * 1991-09-23 1997-02-06 Pfizer Verfahren für die Detektion von spezifische mRNS und DNS in Zellen
DE4213029A1 (de) * 1991-09-26 1993-04-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen vervielfaeltigung von nukleins aeuresequenzen
DE4132133A1 (de) * 1991-09-26 1993-04-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen herstellung von ribonukleinsaeuren
US5981179A (en) * 1991-11-14 1999-11-09 Digene Diagnostics, Inc. Continuous amplification reaction
CA2135073C (en) * 1992-05-06 2002-11-19 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit
WO1994003624A1 (en) * 1992-08-04 1994-02-17 Auerbach Jeffrey I Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
US5733733A (en) * 1992-08-04 1998-03-31 Replicon, Inc. Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
US5834202A (en) 1992-08-04 1998-11-10 Replicon, Inc. Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
US5614389A (en) * 1992-08-04 1997-03-25 Replicon, Inc. Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
WO1994003472A1 (en) * 1992-08-04 1994-02-17 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence amplification
US6261808B1 (en) 1992-08-04 2001-07-17 Replicon, Inc. Amplification of nucleic acid molecules via circular replicons
JP4108118B2 (ja) 1993-03-26 2008-06-25 ジェン−プローブ・インコーポレイテッド ヒト・免疫不全ウイルス１型の検出
JP3026843B2 (ja) * 1993-07-23 2000-03-27 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 核酸増幅の促進法
EP0682121B1 (en) * 1993-12-01 2002-08-28 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Method of amplifying and detecting target nucleic acid sequence by using thermostable enzymes
FR2714062B1 (fr) * 1993-12-22 1996-02-16 Bio Merieux Promoteur modifié pour ARN polymérase, sa préparation et ses applications.
WO1995025180A1 (en) * 1994-03-16 1995-09-21 Gen-Probe Incorporated Isothermal strand displacement nucleic acid amplification
US5863724A (en) * 1994-04-13 1999-01-26 Baylor College Of Medicine Methods of screening for persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy
FR2724934B1 (fr) * 1994-09-26 1997-01-24 Bio Merieux Oligonucleotide chimere et son utilisation dans l'obtention de transcrits d'un acide nucleique
US5514551A (en) * 1994-10-14 1996-05-07 Gen-Probe Incorporated Compositions for the detection of Chlamydia trachomatis
FR2726277B1 (fr) 1994-10-28 1996-12-27 Bio Merieux Oligonucleotide utilisable comme amorce dans une methode d'amplification basee sur une replication avec deplacement de brin
US5789169A (en) * 1994-11-03 1998-08-04 Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5606043A (en) * 1994-11-03 1997-02-25 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5849879A (en) * 1994-11-03 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5654141A (en) * 1994-11-18 1997-08-05 Thomas Jefferson University Amplification based detection of bacterial infection
US6001610A (en) * 1994-11-23 1999-12-14 Roche Diagnostics, Gmbh Method for the particularly sensitive detection of nucleic acids
DE4441626A1 (de) * 1994-11-23 1996-05-30 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum besonders sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren
US5916777A (en) * 1995-06-07 1999-06-29 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using 3'-ribonucleotide primers
US5652126A (en) * 1995-06-07 1997-07-29 Gen-Probe Incorporated Use of restriction endonuclease sequences for cleaving phosphorothioate oligonucleotides
US5932450A (en) * 1995-06-07 1999-08-03 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using digestible templates
US5739311A (en) * 1995-06-07 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases
CA2255624C (en) 1996-05-22 2007-09-04 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for the detection of mycobacterium kansasii
US5914229A (en) * 1996-06-14 1999-06-22 Sarnoff Corporation Method for amplifying a polynucleotide
JPH1028585A (ja) * 1996-07-16 1998-02-03 Toyobo Co Ltd 耐熱性リボヌクレアーゼｈを用いる核酸増幅法
US6132954A (en) * 1996-08-20 2000-10-17 Baylor College Of Medicine Methods of screening for agents that delay a cell cycle and compositions comprising era and an analogue of wild-type era
US6043283A (en) * 1996-09-20 2000-03-28 Baylor College Of Medicine Tyramine compounds and their neuronal effects
US6071493A (en) * 1996-09-20 2000-06-06 Baylor College Of Medicine Method of screening for an agent that inhibits mononuclear phagocyte-plaque component complex formation
EP0946749A1 (en) 1996-11-20 1999-10-06 The Regents Of The University Of Michigan Microfabricated isothermal nucleic acid amplification devices and methods
US6025133A (en) * 1996-12-30 2000-02-15 Gen-Probe Incorporated Promoter-sequestered oligonucleoside and method of use
JP3968810B2 (ja) * 1997-01-24 2007-08-29 東ソー株式会社 核酸配列分析方法
US6171788B1 (en) 1997-01-28 2001-01-09 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders
US7138511B1 (en) 1997-01-28 2006-11-21 The Regents Of The University Of California Nucleic acids, kits and methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders
US6475724B1 (en) 1997-01-28 2002-11-05 The Regents Of The University Of California Nucleic acids, kits, and methods for the diagnosis, prognosis and treatment of glaucoma and related disorders
US6262242B1 (en) 1997-01-30 2001-07-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Tumor suppressor designated TS10Q23.3
US6482795B1 (en) 1997-01-30 2002-11-19 Myriad Genetics, Inc. Tumor suppressor designated TS10q23.3
GB9703146D0 (en) 1997-02-14 1997-04-02 Innes John Centre Innov Ltd Methods and means for gene silencing in transgenic plants
US6713300B1 (en) 1997-02-27 2004-03-30 University Of Utah Research Foundation Nucleic acid and amino acid sequences for ATP-binding cassette transporter and methods of screening for agents that modify ATP-binding cassette transporter
ATE545710T1 (de) 1997-04-01 2012-03-15 Illumina Cambridge Ltd Verfahren zur vervielfältigung von nukleinsäuren
US6534273B2 (en) 1997-05-02 2003-03-18 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
AU738708B2 (en) 1997-05-02 2001-09-27 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
DE69804464T2 (de) 1997-08-08 2005-09-08 bioMérieux B.V. Nukleinsäuresequenzen als primer und sonden zur amplifizierung und erkennung von allen hiv-1 subtypen
EP1749834B1 (en) 1997-12-18 2012-04-25 Monsanto Technology LLC Insect-resistant transgenic plants and methods for improving delta-endotoxin activity against target insects
US6673914B1 (en) 1998-01-22 2004-01-06 John Wayne Cancer Institute Human tumor-associated gene
JP2002510464A (ja) * 1998-01-27 2002-04-09 サイトセル・リミテッド Ｒｎａプロモーターからのインビトロ転写を伴う核酸標的配列の検出方法
US20020147143A1 (en) 1998-03-18 2002-10-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
CA2754182A1 (en) 1998-05-01 1999-11-11 Gen-Probe Incorporated Automated diagnostic analyzer and method
DE19834948A1 (de) * 1998-08-03 2000-02-17 Monika Jecht Verfahren zur spezifischen Detektion von RNA
US6207379B1 (en) 1998-09-11 2001-03-27 One Lambda Method for amplification of DNA
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
WO2000029008A2 (en) 1998-11-16 2000-05-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Hiv-specific t-cell induction
US6156515A (en) 1999-02-09 2000-12-05 Urocor, Inc. Prostate-specific gene for diagnosis, prognosis and management of prostate cancer
CA2368194A1 (en) 1999-04-30 2000-11-09 University Of Florida Adeno-associated virus-delivered ribozyme compositions and methods of use
PT1471926E (pt) 1999-06-01 2011-03-11 Baylor College Medicine Composições e métodos para a utilização terapêutica de uma sequência associada a atonal
JP2003510017A (ja) 1999-06-22 2003-03-18 インビトロジェン コーポレイション 核酸の検出および識別のために改良されたプライマーおよび方法
US6830902B1 (en) 1999-07-02 2004-12-14 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis
CA2384838C (en) 1999-09-13 2006-07-18 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
US6692918B2 (en) 1999-09-13 2004-02-17 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
US6902891B2 (en) 1999-12-17 2005-06-07 Bio Merieux Process for labeling a nucleic acid
US6489114B2 (en) 1999-12-17 2002-12-03 Bio Merieux Process for labeling a ribonucleic acid, and labeled RNA fragments which are obtained thereby
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
EP2192128A3 (en) 2000-04-21 2010-09-22 Corixa Corporation Compounds and methods for treatment and diagnosis of chlamydial infection
CN1498274A (zh) 2000-06-26 2004-05-19 Ŧب������˾ 基于转录的核酸扩增方法和组合物
US7846733B2 (en) 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
JP2004513615A (ja) 2000-06-28 2004-05-13 コリクサ　コーポレイション 肺癌の治療および診断のための組成物および方法
CA2835978C (en) 2000-09-01 2016-10-11 Gen-Probe Incorporated Amplification of hiv-1 sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations
AU2002230545B2 (en) 2000-10-23 2006-09-21 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting human immunodeficiency virus 2 (HIV-2)
AR031640A1 (es) 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
EP1427847B1 (en) 2000-12-13 2010-07-28 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof
EP1366179A2 (en) * 2001-03-07 2003-12-03 bioMerieux B.V Method for the amplification and detection of dna using a transcription based amplification
CA2416963C (en) 2001-03-09 2012-01-10 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for amplification of rna sequences
CA2446788A1 (en) 2001-05-09 2002-11-14 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
EP1399541A4 (en) 2001-05-22 2005-04-13 Univ Chicago RNA POLYMERASE DEPENDENT ON SINGLE VIBRATION N4 DNA
EP2135960A1 (en) 2001-09-19 2009-12-23 Intergenetics Incorporated Genetic analysis for stratification of cancer risk by determining the allelic profile of the VDR-ApaI and CYP11B2 genes
EP1908851A3 (en) 2001-09-19 2008-06-25 Intergenetics Incorporated Genetic analysis for stratification of cancer risk
JP2005504281A (ja) 2001-09-24 2005-02-10 ワン ラムダ 診断用プローブ検出システム
US20030165859A1 (en) 2001-10-23 2003-09-04 Invitrogen Corporation Primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
DK2224012T3 (da) 2001-12-17 2013-05-13 Corixa Corp Sammensætninger og fremgangsmåder til terapi og diagnose af inflammatoriske tarmsygdomme
CA2474910A1 (en) 2002-02-01 2003-08-07 Sequitur, Inc. Oligonucleotide compositions with enhanced efficiency
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
MXPA04011083A (es) 2002-05-17 2005-02-14 Becton Dickinson Co Sistema automatizado para aislar, amplificar y detectar una secuencia de acido nucleico de meta.
EP1513958B1 (en) 2002-06-14 2011-08-10 Gen-Probe Incorporated Compositions for detecting hepatitis b virus
US7504215B2 (en) 2002-07-12 2009-03-17 Affymetrix, Inc. Nucleic acid labeling methods
CA2501188C (en) 2002-07-15 2012-05-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial protein library screening by periplasmic expression
AU2003258168B2 (en) 2002-08-12 2009-10-29 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions concerning poxviruses and cancer
AU2002951411A0 (en) 2002-09-16 2002-09-26 The University Of Sydney Genotype screen
EP1583949B1 (en) 2002-10-16 2015-06-17 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting west nile virus
US7074561B2 (en) 2002-10-22 2006-07-11 Biomerieux, Inc. Isothermal amplification based assay for the detection and quantitation of alpha-fetoprotein mRNA
US7960522B2 (en) 2003-01-06 2011-06-14 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
EP2940028B8 (en) 2003-01-06 2017-09-27 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
US6852494B2 (en) 2003-01-10 2005-02-08 Linden Technologies, Inc. Nucleic acid amplification
CA2727850C (en) 2003-01-29 2013-04-30 454 Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
DK2374900T3 (en) 2003-03-07 2016-10-17 Rubicon Genomics Inc Polynucleotides for amplification and analysis of the total genomic and total transcription libraries generated by a DNA polymerization
EP2390352A1 (en) 2003-03-18 2011-11-30 Quantum Genetics Ireland Limited Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds
JP2006523465A (ja) 2003-04-14 2006-10-19 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド ランダムにプライミングされる複合プライマーを用いる大規模増幅
CA2528572C (en) 2003-06-10 2020-08-25 The Trustees Of Boston University Gene expression analysis of airway epithelial cells for diagnosing lung cancer
US20050059024A1 (en) 2003-07-25 2005-03-17 Ambion, Inc. Methods and compositions for isolating small RNA molecules
EP1654361B2 (en) 2003-07-25 2023-01-18 Life Technologies Corporation Methods and compositions for preparing rna from a fixed sample
AU2004263896A1 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Genenews Inc. Osteoarthritis biomarkers and uses thereof
AU2004272102A1 (en) 2003-09-12 2005-03-24 University Of Cincinnati Methods for risk assessment, survival prediction and treatment of heart failure and other conditions based on adrenergic receptor polymorphisms
WO2005054516A2 (en) 2003-11-26 2005-06-16 Advandx, Inc. Peptide nucleic acid probes for analysis of certain staphylococcus species
ATE549421T1 (de) 2003-12-19 2012-03-15 Gen Probe Inc Zusammensetzungen, verfahren und kits zum nachweis der nukleinsäuren von hiv-1 und hiv-2
EP1564306B1 (en) 2004-02-17 2013-08-07 Affymetrix, Inc. Methods for fragmenting and labeling DNA
CA2556911C (en) 2004-02-19 2013-07-30 The Governors Of The University Of Alberta Leptin promoter polymorphisms and uses thereof
EP1598428A1 (en) 2004-05-18 2005-11-23 Georg Dewald Methods and kits to detect Hereditary angioedema type III
CN101133157A (zh) 2004-06-03 2008-02-27 阿什洛米克斯控股有限公司 诊断应激的药物和方法
US7544792B2 (en) 2004-07-13 2009-06-09 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detection of hepatitis A virus nucleic acid
EP1786916B1 (en) 2004-08-27 2013-05-08 Gen-Probe Incorporated Single-primer nucleic acid amplification methods
US7713697B2 (en) 2004-08-27 2010-05-11 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for amplifying DNA
EP1630236A3 (de) 2004-08-30 2006-05-03 FBF- Förderverein Biologieforschung der Deutschen Schweineproduktion e.V. Hernia inguinalis/scrotalis assozieerte Genomregionen
WO2006031955A2 (en) 2004-09-14 2006-03-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Method for treatment with bucindolol based on genetic targeting
US20060073506A1 (en) 2004-09-17 2006-04-06 Affymetrix, Inc. Methods for identifying biological samples
DK2975139T3 (da) 2004-09-30 2019-12-09 Gen Probe Inc Assay til at detektere og kvantificere hiv-1
EP1645640B1 (en) 2004-10-05 2013-08-21 Affymetrix, Inc. Method for detecting chromosomal translocations
CA2524964A1 (en) 2004-10-29 2006-04-29 Affymetrix, Inc. Automated method of manufacturing polymer arrays
US7682782B2 (en) 2004-10-29 2010-03-23 Affymetrix, Inc. System, method, and product for multiple wavelength detection using single source excitation
ES2391744T3 (es) 2004-11-01 2012-11-29 George Mason University Composiciones y procedimientos para el diagnóstico de trastornos del colon
AU2005333163B2 (en) 2004-11-09 2011-06-16 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting Group A streptococci
CN103497993A (zh) 2005-02-07 2014-01-08 基因信息公司 轻度骨关节炎生物标志物及其用途
CA2592179C (en) 2005-02-07 2012-04-03 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group b streptococci
WO2006089154A1 (en) 2005-02-18 2006-08-24 Gen-Probe Incorporated Sample preparation method incorporating an alkaline shock
US9127305B2 (en) 2005-02-28 2015-09-08 Bioquest, Inc. Methods for performing direct enzymatic reactions involving nucleic acid molecules
WO2006095941A1 (en) 2005-03-05 2006-09-14 Seegene, Inc. Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
KR100977186B1 (ko) 2005-03-05 2010-08-23 주식회사 씨젠 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 사용한 방법 및 이중특이성 올리고뉴클레오타이드
EP1712557A1 (en) 2005-04-14 2006-10-18 RWTH Aachen New s-adenosyl-L-methionine analogues with extended activated groups for transfer by methyltransferases
AU2006236621B2 (en) 2005-04-14 2011-10-06 The Trustees Of Boston University Diagnostic for lung disorders using class prediction
JP4773513B2 (ja) 2005-05-06 2011-09-14 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド Ａ型及びｂ型インフルエンザウイルスの核酸を検出するための組成物及びアッセイ
EP2623596B1 (en) 2005-05-13 2014-10-08 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Primer and probe for use in detection of Mycobacterium kansasii and method for detection of Mycobacterium kansasii using the same
US8202727B2 (en) 2005-05-17 2012-06-19 Ozgene Pty Ltd. Sequential cloning system
EP2476761A3 (en) 2005-07-07 2012-10-17 Athlomics Pty Ltd Polynucleotide marker genes and their expression, for diagnosis of endotoxemia
US7494788B2 (en) 2005-07-11 2009-02-24 Molecular Kinetics, Inc. Entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production
US7838646B2 (en) 2005-08-18 2010-11-23 Quest Diagnostics Investments Incorporated Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
WO2007030759A2 (en) 2005-09-07 2007-03-15 Nugen Technologies, Inc. Improved nucleic acid amplification procedure
JP2009511086A (ja) 2005-10-17 2009-03-19 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド レジオネラ・ニューモフィラ核酸を検出するための組成物及び方法
US8249814B2 (en) 2005-10-21 2012-08-21 Genenews Inc. Method, computer readable medium, and system for determining a probability of colorectal cancer in a test subject
EP1940755A2 (en) 2005-10-28 2008-07-09 Praecis Pharmaceuticals Inc. Methods for identifying compounds of interest using encoded libraries
EP1785434A1 (en) 2005-11-11 2007-05-16 Ludwig-Maximilians-Universität München Targeting and tracing of antigens in living cells
WO2007059179A1 (en) 2005-11-14 2007-05-24 Gen-Probe Incorporated Parametric calibration method
US8014957B2 (en) 2005-12-15 2011-09-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Genes associated with progression and response in chronic myeloid leukemia and uses thereof
CA2645310A1 (en) 2006-03-09 2007-09-13 The Trustees Of Boston University Diagnostic and prognostic methods for lung disorders using gene expression profiles from nose epithelial cells
EP1992703B1 (en) 2006-03-13 2012-04-11 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Method for detection of mutant gene
WO2007106580A2 (en) 2006-03-15 2007-09-20 Micronics, Inc. Rapid magnetic flow assays
WO2007129628A1 (ja) 2006-05-02 2007-11-15 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. マイコバクテリウム・イントラセルラーレ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・イントラセルラーレの検出方法
US7588897B2 (en) 2006-05-12 2009-09-15 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect Enterococci nucleic acid
CA2740812C (en) 2006-05-25 2016-01-12 Monsanto Technology Llc A method to identify disease resistant quantitative trait loci in soybean and compositions thereof
JP2009539404A (ja) 2006-06-12 2009-11-19 オンコメチローム サイエンシズ エス．エイ． 大腸癌の早期検出および予後のためのメチル化マーカー
EP2057465A4 (en) 2006-08-09 2010-04-21 Homestead Clinical Corp SPECIFIC ORGAN PROTEINS AND METHODS OF USE
ES2551892T3 (es) 2006-09-15 2015-11-24 Ottawa Health Research Institute Rhabdovirus oncolítico
US9845494B2 (en) 2006-10-18 2017-12-19 Affymetrix, Inc. Enzymatic methods for genotyping on arrays
AU2007325931A1 (en) 2006-11-02 2008-06-05 Yale University Assessment of oocyte competence
US8293684B2 (en) 2006-11-29 2012-10-23 Exiqon Locked nucleic acid reagents for labelling nucleic acids
DK2102239T3 (da) 2006-11-30 2012-05-29 Res Dev Foundation Forbedrede immunoglobulin-biblioteker
EP2479273A3 (en) 2006-12-18 2012-10-10 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Primer and probe for detection of mycobacterium avium and method for detection of mycobacterium avium using the same
EP2134677B1 (en) 2006-12-20 2011-10-12 Bayer HealthCare LLC 4-{4-[({3-tert-butyl-1-[3-(hydroxymethyl)phenyl]-1h-pyrazol-5-yl}carbamoyl)-amino]-3-chlorophenoxy}-n-methylpyridine-2-carboxamide as an inhibitor of the vegfr kinase for the treatment of cancer
CA2673017C (en) * 2006-12-21 2015-08-04 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
US7794937B2 (en) 2006-12-22 2010-09-14 Quest Diagnostics Investments Incorporated Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene mutations
GB0701253D0 (en) 2007-01-23 2007-02-28 Diagnostics For The Real World Nucleic acid amplification and testing
EP2121983A2 (en) 2007-02-02 2009-11-25 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
US8183359B2 (en) 2007-03-01 2012-05-22 Gen-Probe Incorporated Kits for amplifying DNA
US8445267B2 (en) 2007-04-09 2013-05-21 University Of Florida Research Foundation, Inc. Tyrosine-modified recombinant rAAV vector compositions and methods for use
ES2529790T3 (es) 2007-04-13 2015-02-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Métodos de tratamiento de cáncer resistente a agentes terapéuticos de ERBB
EP2155789B1 (en) 2007-05-01 2013-07-24 Research Development Foundation Immunoglobulin fc libraries
AU2008343380B2 (en) 2007-12-26 2012-07-12 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect Candida albicans nucleic acid
JPWO2009099037A1 (ja) 2008-02-08 2011-05-26 和光純薬工業株式会社 クラミドフィラ・キャビエ検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたクラミドフィラ・キャビエの検出方法
US8034568B2 (en) 2008-02-12 2011-10-11 Nugen Technologies, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions
EP2677041A3 (en) 2008-02-19 2014-04-09 MDxHealth SA Detection and prognosis of lung cancer
US7846666B2 (en) 2008-03-21 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods of RNA amplification in the presence of DNA
EP2626435B1 (en) 2008-03-21 2016-06-01 MDxHealth S.A. Detection and prognosis of cervical cancer
JP5646455B2 (ja) 2008-04-21 2014-12-24 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド チクングニヤウイルスを検出するための方法
US10359424B2 (en) 2008-05-28 2019-07-23 Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation Primer and probe for detection of Mycobacterium intracellulare, and method for detection of Mycobacterium intracellulare using the primer or the probe
EP2151502A1 (en) 2008-07-30 2010-02-10 Lohmann Tierzucht GmbH Genetic variations associated with feather pecking behaviour in avians
CA2679750A1 (en) 2008-09-23 2010-03-23 Nexus Dx, Inc. Methods for detecting nucleic acids in a sample
WO2010038042A1 (en) 2008-10-02 2010-04-08 Illumina Cambridge Ltd. Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications
EP2210944A1 (en) 2009-01-22 2010-07-28 ATG:biosynthetics GmbH Methods for generation of RNA and (poly)peptide libraries and their use
JP2012517238A (ja) 2009-02-11 2012-08-02 カリス エムピーアイ インコーポレイテッド 腫瘍の分子プロファイリング法
EP2401287B3 (en) 2009-02-26 2018-09-26 Gen-Probe Incorporated Assay for detection of human parvovirus nucleic acid
ES2618881T3 (es) 2009-04-22 2017-06-22 Indiana University Research And Technology Corporation Colágeno V para su uso en el tratamiento del asma
WO2010126913A1 (en) 2009-04-27 2010-11-04 Gen-Probe Incorporated Methods and kits for use in the selective amplification of target sequences
CA3128851A1 (en) 2009-06-23 2010-12-29 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acid from mollicutes
JP5785942B2 (ja) 2009-06-29 2015-09-30 ルミネックス コーポレーション ヘアピンコンフォメーションを有するキメラプライマーおよびその使用法
CA2766391C (en) 2009-07-01 2021-04-20 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for multiplex nucleic acid amplification
US9409983B2 (en) 2009-07-23 2016-08-09 The Board Of Trustess Of The University Of Illinois Methods and compositions involving PBEF inhibitors for lung inflammation conditions and diseases
CN102858995B (zh) 2009-09-10 2016-10-26 森特瑞隆技术控股公司 靶向测序方法
US10174368B2 (en) 2009-09-10 2019-01-08 Centrillion Technology Holdings Corporation Methods and systems for sequencing long nucleic acids
WO2011032088A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Arca Biopharma, Inc. Polymorphisms in the pde3a gene
JP5879266B2 (ja) 2009-09-14 2016-03-08 シラジェン バイオセラピューティクス インコーポレイテッド 腫瘍崩壊性ワクシニアウイルスの併用癌療法
US8182994B2 (en) 2009-09-15 2012-05-22 Illumina Cambridge Limited Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing
WO2011036173A1 (en) 2009-09-24 2011-03-31 Oncomethylome Sciences S.A. Detection and prognosis of cervical cancer
AU2010315400B2 (en) 2009-10-27 2016-07-21 Caris Mpi, Inc. Molecular profiling for personalized medicine
KR20110050327A (ko) 2009-11-07 2011-05-13 주식회사 씨젠 Ｔｈｄ 프라이머 타겟 검출
US8501122B2 (en) 2009-12-08 2013-08-06 Affymetrix, Inc. Manufacturing and processing polymer arrays
CA2836117C (en) 2009-12-10 2017-08-15 Ottawa Hospital Research Institute Oncolytic rhabdovirus
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
AU2010336137B2 (en) 2009-12-21 2015-08-06 Seegene, Inc. TSG primer target detection
EP2515899B1 (en) 2009-12-23 2016-05-25 ARCA biopharma, Inc. Methods and compositions for cardiovascular diseases and conditions
CN102725424B (zh) 2010-01-25 2014-07-09 Rd生物科技公司 靶核酸的自折叠扩增
JP5791634B2 (ja) 2010-01-29 2015-10-07 マイクロニクス， インコーポレイテッド サンプル−回答型のマイクロ流体カートリッジ
EP3040425B1 (en) 2010-02-17 2019-08-28 Gen-Probe Incorporated Compostions and methods to detect atopobium vaginae nucleic acid
US9458513B2 (en) 2010-03-23 2016-10-04 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Primer and probe for detecting chlamydia trachomatis, and method for detecting chlamydia trachomatis using same
SI2558577T1 (sl) 2010-04-16 2019-05-31 Nuevolution A/S Bifunkcionalni kompleksi in metode za pripravo in uporabo takšnih kompleksov
CN103079567A (zh) 2010-04-17 2013-05-01 拜尔健康护理有限责任公司 用于疾病和病症的治疗和预防的氟取代的ω-羧基芳基二苯脲的合成代谢产物
EP2561094B1 (en) 2010-04-21 2017-03-29 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits to detect herpes simplex virus nucleic acid
JP5454338B2 (ja) 2010-04-28 2014-03-26 株式会社島津製作所 液滴操作によるリアルタイム核酸増幅法
KR101223660B1 (ko) 2010-05-20 2013-01-17 광주과학기술원 ＨＩＦ－２α 억제제를 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
KR101176139B1 (ko) 2010-05-20 2012-08-22 광주과학기술원 관절염 동물모델로서 연골 특이적 ＨＩＦ?２α 형질전환 마우스 및 이의 용도
EP3305920B1 (en) 2010-07-12 2020-02-12 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to detect seasonal h3 influenza a virus nucleic acid
CN103589627B (zh) 2010-07-23 2015-11-18 贝克曼考尔特公司 用于在pcr反应容器内进行实时pcr的热循环器模块和***
WO2012030856A2 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and reaction mixtures for the detection of xenotropic murine leukemia virus-related virus
JP5904501B2 (ja) 2010-09-02 2016-04-13 国立研究開発法人理化学研究所 ２型糖尿病の検出方法
GB2497495B (en) 2010-10-04 2018-06-06 Gen Probe Prodesse Inc Compositions, methods and kits to detect adenovirus nucleic acids
BR112013010952B1 (pt) 2010-10-22 2020-08-25 T2 Biosystems, Inc. métodos para detectar a presença de um analito de ácido nucleico e uma espécie de candida em uma amostra líquida, para detectar a presença de um patógeno, um vírus e um ácido nucleico alvo em uma amostra de sangue total, e para amplificação de um ácido nucleico de patógeno alvo em uma amostra de sangue total, bem como sistema para a detecção de um ou mais analitos e cartucho removível dimensionado para facilitar inserção e remoção de um sistema
US8563298B2 (en) 2010-10-22 2013-10-22 T2 Biosystems, Inc. NMR systems and methods for the rapid detection of analytes
CN105772122B (zh) 2010-12-21 2017-11-03 株式会社岛津制作所 用于在管内操作对象成分的器件和方法
WO2012090073A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 The Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting chemotherapy sensitivity
JP6121910B2 (ja) 2011-01-04 2017-04-26 シラジェン バイオセラピューティクス インコーポレイテッド 腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与による腫瘍抗原に対する抗体の生成および腫瘍特異的補体依存性細胞傷害の生成
JP6228014B2 (ja) 2011-02-07 2017-11-08 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション 操作された免疫グロブリンＦｃポリペプチド
EP3483285B1 (en) 2011-02-09 2021-07-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Analysis of nucleic acids
CA2827200A1 (en) 2011-02-24 2012-08-30 Hill's Pet Nutrition, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating kidney disorders in a feline
WO2012158238A2 (en) 2011-02-28 2012-11-22 University Of Iowa Research Foundation Anti-müllerian hormone changes in pregnancy and prediction ofadverse pregnancy outcomes and gender
WO2012120377A2 (en) 2011-03-08 2012-09-13 King Abdullah University Of Science And Technology Molecular biomarker set for early detection of ovarian cancer
EP2683833B1 (en) 2011-03-10 2018-09-26 Gen-Probe Incorporated Methods for the selection and optimization of oligonucleotide tag sequences
US20120252682A1 (en) 2011-04-01 2012-10-04 Maples Corporate Services Limited Methods and systems for sequencing nucleic acids
WO2012138789A2 (en) 2011-04-04 2012-10-11 Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment
AU2012240240A1 (en) 2011-04-04 2013-05-09 Netherlands Cancer Institute Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment with protein kinase inhibitors
KR101291668B1 (ko) 2011-04-21 2013-08-01 서울대학교산학협력단 미코박테리아―대장균용 셔틀 벡터 및 이의 용도
EP2702166B1 (en) 2011-04-25 2018-06-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bv-associated bacterial nucleic acid
AP2013007180A0 (en) 2011-04-25 2013-10-31 Advanced Bioscience Lab Inc Truncated HIV envelope proteins (ENV), methods andcompositions related thereto
US9364532B2 (en) 2011-06-08 2016-06-14 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions and methods for glioblastoma treatment
JP5930556B2 (ja) 2011-06-15 2016-06-08 ヒルズ・ペット・ニュートリシャン・インコーポレーテッド ネコ科動物における甲状腺機能亢進症を診断および監視する組成物および方法
JP2014526882A (ja) 2011-06-21 2014-10-09 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 対象中の治療剤の活性を判定するアッセイおよび方法
EP2723365A1 (en) 2011-06-21 2014-04-30 Oncofactor Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of cancer
US9752201B2 (en) 2011-07-15 2017-09-05 Gen-Probe Incorporated Compositions and method for detecting human parvovirus nucleic acid and for detecting hepatitis A virus nucleic acids in single-plex or multiplex assays
WO2013024173A1 (en) 2011-08-17 2013-02-21 Technische Universität München Computer implemented method for identifying regulatory regions or regulatory variations
AU2012304327B2 (en) 2011-09-08 2015-07-09 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting BV-associated bacterial nucleic acid
WO2013036799A2 (en) 2011-09-09 2013-03-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions involving nkg2d inhibitors and cancer
FR2981088B1 (fr) 2011-10-06 2013-11-29 Biomerieux Sa Arn polymerases mutees
WO2013064163A1 (en) 2011-11-01 2013-05-10 Academisch Medisch Centrum Methylation markers for colorectal cancer
EP3373015A1 (en) 2011-11-07 2018-09-12 Beckman Coulter Inc. Aliquotter system and workflow
EP2776847A1 (en) 2011-11-07 2014-09-17 Beckman Coulter, Inc. Magnetic damping for specimen transport system
KR102040996B1 (ko) 2011-11-07 2019-11-05 베크만 컬터, 인코포레이티드 로봇식 아암
US9910054B2 (en) 2011-11-07 2018-03-06 Beckman Coulter, Inc. System and method for processing samples
EP2776844B1 (en) 2011-11-07 2020-09-30 Beckman Coulter, Inc. Specimen container detection
US9482684B2 (en) 2011-11-07 2016-11-01 Beckman Coulter, Inc. Centrifuge system and workflow
CN104053785A (zh) 2011-11-14 2014-09-17 综合医院公司 为患有抑郁症的受试者选择治疗方案的测定法和方法
DE102011120550B4 (de) 2011-12-05 2013-11-07 Gen-Probe Prodesse, Inc. Zusammensetzungen, Verfahren und Kits zur Detektion von Adenovirusnukleinsäuren
RU2612901C2 (ru) 2011-12-19 2017-03-13 Хилл'С Пет Ньютришн, Инк. Композиции и способы диагностики и лечения гипертиреоза у животных-компаньонов
WO2013093629A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Netherlands Cancer Institute Modular vaccines, methods and compositions related thereto
US20140349858A1 (en) 2011-12-22 2014-11-27 Ibis Bioscience, Inc. Amplification of a sequence from a ribonucleic acid
JP5807542B2 (ja) 2011-12-22 2015-11-10 株式会社島津製作所 対象成分を操作するためのチップデバイス及びそれを用いた方法
EP2809783A2 (en) 2012-02-02 2014-12-10 Invenra, Inc. High throughput screen for biologically active polypeptides
CA2865281C (en) 2012-02-24 2021-11-23 Gen-Probe Prodesse, Inc. Detection of shiga toxin genes in bacteria
CA3218231A1 (en) 2012-02-27 2013-09-06 Becton, Dickinson And Company Compositions and kits for molecular counting
WO2013130512A2 (en) 2012-02-27 2013-09-06 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and uses for molecular tags
US9879314B2 (en) 2012-02-29 2018-01-30 Riken Method for detecting HLA-A*31:01 allele
EP3461910B1 (en) 2012-04-19 2020-08-26 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
SG11201406717RA (en) 2012-04-19 2014-11-27 Life Technologies Corp Nucleic acid amplification
AU2013205110B2 (en) 2012-04-24 2016-10-13 Gen-Probe Incorporated Compositions, Methods and Kits to Detect Herpes Simplex Virus Nucleic Acids
AU2013205064B2 (en) 2012-06-04 2015-07-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Amplifying and Characterizing HCV Nucleic Acid
AU2013205087B2 (en) 2012-07-13 2016-03-03 Gen-Probe Incorporated Method for detecting a minority genotype
EP2877952B1 (en) 2012-07-27 2023-04-12 Gen-Probe Incorporated Dual reference calibration method and system for quantifying polynucleotides
AU2013202808B2 (en) 2012-07-31 2014-11-13 Gen-Probe Incorporated System and method for performing multiplex thermal melt analysis
DK2890814T3 (da) 2012-08-30 2019-12-16 Gen Probe Inc Flerfaset nukleinsyreamplificering
EP3257952B1 (en) 2012-09-11 2020-02-12 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
WO2014043143A1 (en) 2012-09-11 2014-03-20 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
EP2904120B1 (en) 2012-10-04 2018-01-10 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Methods and reagents for detection, quantitation, and serotyping of dengue viruses
AU2013205122B2 (en) 2012-10-11 2016-11-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Human Papillomavirus Nucleic Acid
ES2730690T3 (es) 2012-12-07 2019-11-12 Suppremol Gmbh Estratificación y tratamiento de pacientes que padecen púrpura trombocitopénica idiopática
AU2013205090B2 (en) 2012-12-07 2016-07-28 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Gastrointestinal Pathogen Nucleic Acid
KR20150096788A (ko) 2012-12-21 2015-08-25 마이크로닉스 인코포레이티드. 마이크로 유체공학 용도를 위한 저탄성 막
KR20150097764A (ko) 2012-12-21 2015-08-26 마이크로닉스 인코포레이티드. 휴대형 형광 검출 시스템 및 미량분석 카트리지
JP6498125B2 (ja) 2012-12-21 2019-04-10 マイクロニクス， インコーポレイテッド 流体回路および関連する製造方法
WO2014116721A1 (en) 2013-01-22 2014-07-31 The Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Geminiviral vector for expression of rituximab
US10077475B2 (en) 2013-01-24 2018-09-18 California Institute Of Technology FRET-based analytes detection and related methods and systems
WO2014116884A1 (en) 2013-01-24 2014-07-31 California Institute Of Technology Chromophore-based characterization and detection methods
EP2958994B1 (en) 2013-02-21 2019-05-29 Turnstone Limited Partnership Vaccine composition
AU2013202805B2 (en) 2013-03-14 2015-07-16 Gen-Probe Incorporated System and method for extending the capabilities of a diagnostic analyzer
JP6463332B2 (ja) 2013-03-15 2019-01-30 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 較正の方法、装置およびコンピュータプログラム製品
US9255265B2 (en) 2013-03-15 2016-02-09 Illumina, Inc. Methods for producing stranded cDNA libraries
KR101403507B1 (ko) 2013-03-21 2014-06-09 주식회사 현일바이오 결핵균 및 비결핵 마이코박테리아의 선택적 검출 방법, 그리고 이를 이용한 키트
JP2016517687A (ja) 2013-03-27 2016-06-20 サンプル テクノロジーズ，インコーポレイティド 組換えファージ及び細菌検出方法
KR101507505B1 (ko) 2013-04-18 2015-04-07 사회복지법인 삼성생명공익재단 제 1 형 근긴장성 이영양증의 진단 방법
CA2911303C (en) 2013-05-07 2021-02-16 Micronics, Inc. Methods for preparation of nucleic acid-containing samples using clay minerals and alkaline solutions
JP6484222B2 (ja) 2013-05-07 2019-03-13 マイクロニクス， インコーポレイテッド 核酸の調製および分析のためのデバイス
WO2014182844A1 (en) 2013-05-07 2014-11-13 Micronics, Inc. Microfluidic devices and methods for performing serum separation and blood cross-matching
US20160186263A1 (en) 2013-05-09 2016-06-30 Trustees Of Boston University Using plexin-a4 as a biomarker and therapeutic target for alzheimer's disease
CA2915820A1 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Michael Sandor Koeris Phage-based bacterial detection assay
US9547006B2 (en) 2013-08-08 2017-01-17 Institut Pasteur Correlation of disease activity with clonal expansions of human papillomavirus 16-specific CD8+ T-cells in patients with severe erosive oral lichen planus
AU2014306512C1 (en) 2013-08-14 2021-07-08 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting HEV nucleic acid
CN110964796B (zh) 2013-08-28 2024-04-05 贝克顿迪金森公司 大规模平行单细胞分析
AU2014329535B2 (en) 2013-10-03 2017-09-07 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers for systemic lupus erythematosus disease activity, and intensity and flare
ES2720728T3 (es) 2013-11-15 2019-07-24 Pasteur Institut Un marcador molecular de Plasmodium falciparum de resistencia a artemisinina
EP3102691B1 (en) 2014-02-03 2019-09-11 Thermo Fisher Scientific Baltics UAB Method for controlled dna fragmentation
EP3154693B1 (en) 2014-06-11 2021-11-03 PerkinElmer Health Sciences, Inc. Method for performing a sample assay with a microfluidic cartridges with integrated assay controls
GB201415349D0 (en) 2014-08-29 2014-10-15 Univ Leuven Kath Cofactor analogues for methyltransferases
EP3224362A4 (en) 2014-11-26 2018-06-06 The Regents of The University of California Therapeutic compositions comprising transcription factors and methods of making and using the same
SG10202012249YA (en) 2014-12-08 2021-01-28 Berg Llc Use of markers including filamin a in the diagnosis and treatment of prostate cancer
AU2016205179B2 (en) 2015-01-09 2021-06-17 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for diagnosing bacterial vaginosis
EP3248011A4 (en) 2015-01-21 2018-11-14 T2 Biosystems, Inc. Nmr methods and systems for the rapid detection of tick-borne pathogens
KR101718800B1 (ko) 2015-01-21 2017-03-24 주식회사 디알나노 약물 및 ｓｉＲＮＡ의 공동―운반용 나노복합체 및 이의 용도
EP3256490A1 (en) 2015-02-09 2017-12-20 Research Development Foundation Engineered immunoglobulin fc polypeptides displaying improved complement activation
EP3064592A1 (en) 2015-03-06 2016-09-07 Brigitte König Methods for the qualitative and quantitative detection of microbes in a sample
US10550438B2 (en) 2015-03-16 2020-02-04 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for detecting bacterial nucleic acid
EP3307908B1 (en) 2015-06-09 2019-09-11 Life Technologies Corporation Methods for molecular tagging
CN108026575B (zh) 2015-07-17 2022-08-19 哈佛学院董事及会员团体 扩增核酸序列的方法
WO2017040380A2 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Research Development Foundation Engineered antibody fc variants
US20180305748A1 (en) 2015-10-18 2018-10-25 Affymetrix, Inc. Multiallelic Genotyping of Single Nucleotide Polymorphisms and Indels
KR101651817B1 (ko) 2015-10-28 2016-08-29 대한민국 Ngs 라이브러리 제작용 프라이머 세트 및 이를 이용한 ngs 라이브러리 제작방법 및 키트
EP3387147A1 (en) 2015-12-09 2018-10-17 Life Technologies Corporation Detection and quantification of nucleic acid molecules associated with a surface
US11111549B2 (en) 2016-01-04 2021-09-07 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for detecting Candida species
EP3402880B1 (en) 2016-01-15 2024-01-03 Thermo Fisher Scientific Baltics UAB Thermophilic dna polymerase mutants
WO2017127727A1 (en) 2016-01-21 2017-07-27 T2 Biosystems, Inc. Rapid antimicrobial susceptibility testing using high-sensitivity direct detection methods
KR101845957B1 (ko) 2016-02-23 2018-04-05 전남대학교기술지주회사(주) 프로히비틴 유전자 타깃 백혈병 진단용 키트 및 이를 이용한 진단 방법
WO2017180745A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 T2 Biosystems, Inc. Methods and systems for amplification in complex samples
AU2017278261A1 (en) 2016-06-05 2019-01-31 Berg Llc Systems and methods for patient stratification and identification of potential biomarkers
EP3469103B1 (en) 2016-06-10 2021-10-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting zika virus nucleic acid
EP3497237B1 (en) 2016-08-10 2022-05-04 Institut Pasteur Methods and reagents for detecting piperaquine-resistant plasmodium falciparum malaria
WO2018071522A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Life Technologies Corporation Rapid amplification of nucleic acids
JP7167013B2 (ja) 2016-10-19 2022-11-08 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド Ｃ型肝炎ウイルスを検出または定量するための組成物および方法
JP7125395B2 (ja) 2016-11-21 2022-08-24 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド Ｂ型肝炎ウイルスを検出または定量化するための組成物および方法
CN110168103B (zh) 2016-12-29 2023-09-08 Seegene株式会社 降低引物二聚体形成且提高扩增效率的方法
KR101936799B1 (ko) 2017-01-09 2019-01-11 주식회사 엠이티라이프사이언스 구강전암의 치료용 약학 조성물 및 구강전암 또는 구강암의 예측 또는 진단 방법
AU2018213315A1 (en) 2017-01-26 2019-07-25 Oklahoma Medical Research Foundation Biomarkers for systemic lupus erythematosus disease activity, and intensity and flare
WO2018146162A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Academisch Medisch Centrum Molecular biomarker for prognosis of sepsis patients
EP4219770A3 (en) 2017-03-24 2023-08-16 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detection of rsv b in samples
JP7299839B2 (ja) 2017-03-24 2023-06-28 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド パラインフルエンザウイルスを検出または定量化するための組成物および方法
US11441174B2 (en) 2017-06-02 2022-09-13 Affymetrix, Inc. Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes
US11603557B2 (en) 2017-06-02 2023-03-14 Affymetrix, Inc. Array-based methods for analysing mixed samples using differently labelled allele-specific probes
WO2018226798A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Gen-Probe Incorporated Detecting babesia species nucleic acid in a sample
US11542540B2 (en) 2017-06-16 2023-01-03 Life Technologies Corporation Control nucleic acids, and compositions, kits, and uses thereof
US11618891B2 (en) 2017-06-26 2023-04-04 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Thermophilic DNA polymerase mutants
CA3156539A1 (en) 2017-07-10 2019-01-17 Gen-Probe Incorporated Analytical systems and methods for nucleic acid amplification using sample assigning parameters
WO2019017680A2 (ko) 2017-07-19 2019-01-24 국민대학교 산학협력단 파킨슨병 바이오마커로서의 miRNA 및 이를 이용한 진단키트
KR101956315B1 (ko) 2017-07-19 2019-03-08 국민대학교 산학협력단 파킨슨병 바이오마커로서의 miR494 및 이를 이용한 진단키트
US11859257B2 (en) 2017-08-11 2024-01-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting Staphylococcus aureus
EP3707278A1 (en) 2017-11-09 2020-09-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Assays and methods for determining expression of the lect2 gene
AU2018369872B2 (en) 2017-11-17 2022-11-24 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting C1orf43 nucleic acid
CA3089078A1 (en) 2018-01-29 2019-08-01 Gen-Probe Incorporated Analytical systems and methods
AU2019286648B2 (en) 2018-06-13 2023-11-23 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting group B Streptococcus nucleic acid
US20210317515A1 (en) 2018-07-10 2021-10-14 Gen-Probe Incorporated Methods and systems for detecting and quantifying nucleic acids
EP3830302B1 (en) 2018-08-01 2022-10-05 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acids of epstein-barr virus
CN109306376B (zh) * 2018-08-03 2022-06-24 国家卫生计生委科学技术研究所 检验核酸扩增均一性的质量控制标准品及其制备方法
US20210310059A1 (en) 2018-08-08 2021-10-07 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting mycoplasma genitalium
US20220074002A1 (en) 2018-08-21 2022-03-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human cytomegalovirus
KR20210063347A (ko) 2018-08-24 2021-06-01 젠-프로브 인코포레이티드 세균성 핵산을 검출하고 세균성 질염을 진단하기 위한 조성물 및 방법
WO2020053808A1 (en) 2018-09-12 2020-03-19 Georg Dewald Method of diagnosing vasoregulatory disorders
AU2019350777A1 (en) 2018-09-27 2021-05-20 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting Bordetella pertussis and Bordetellaparapertussis nucleic acid
CA3116895A1 (en) 2018-10-22 2020-04-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human polyomavirus bk virus
CN113614535B (zh) 2018-10-31 2024-08-16 亚利桑那大学评议会 用于辐射诱导的肺损伤的生物标志物和使用方法
EP4369356A3 (en) 2018-11-30 2024-07-24 Caris MPI, Inc. Next-generation molecular profiling
TW202030333A (zh) 2018-12-20 2020-08-16 美商簡 探針公司 用於檢測瘧原蟲物種核酸之組成物及方法
WO2020142347A2 (en) 2018-12-31 2020-07-09 Gen-Probe Incorporated Systems and methods for filling multi-well cartridges with solid reagents
US20220220564A1 (en) 2019-04-17 2022-07-14 Igenomix, S.L. Improved methods for the early diagnosis of uterine leiomyomas and leiomyosarcomas
CA3138566A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for determining effectiveness of frataxin replacement therapy
CN118125056A (zh) 2019-05-03 2024-06-04 简·探针公司 用于分析***的容器输送***
WO2020251306A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Seegene, Inc. Computer-implemented method for collaborative development of reagents for detection of target nucleic acids
US20220307093A1 (en) 2019-07-03 2022-09-29 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides for use in determining the presence of trichomonas vaginalis in a sample
EP4018004A1 (en) 2019-08-23 2022-06-29 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting treponema pallidum
CA3153514A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Gen-Probe Incorporated Detection of chlamydia trachomatis nucleic acid variants
AU2020397802A1 (en) 2019-12-02 2022-06-16 Caris Mpi, Inc. Pan-cancer platinum response predictor
JP2023503946A (ja) 2019-12-09 2023-02-01 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド 乾燥試料からのポリヌクレオチド分析物の定量化
CA3174532A1 (en) 2020-03-04 2021-09-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting sars-cov-2 nucleic acid
CN115698325A (zh) 2020-05-07 2023-02-03 盖立复诊断解决方案公司 用于检测SARS-CoV-2核酸的方法和组合物
EP4163397A4 (en) 2020-06-05 2024-08-28 Seegene Inc SAMPLE TRANSPORT KIT FOR THE DETECTION OF RESPIRATORY PATHOGENS AND METHODS FOR THE DETECTION OF RESPIRATORY PATHOGENS THEREOF
WO2022006286A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Lunglife Ai Methods for detecting lung cancer
WO2022047359A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Berg Llc Protein biomarkers for pancreatic cancer
CN116323440A (zh) 2020-10-21 2023-06-23 简·探针公司 流体容器管理***
CA3214819A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Guisong WANG Protein markers for estrogen receptor (er)-positive luminal a(la)-like and luminal b1 (lb1)-like breast cancer
WO2022216846A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Berg Llc Protein markers for estrogen receptor (er)-positive-like and estrogen receptor (er)-negative-like breast cancer
CA3214833A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Bpgbio, Inc. Protein markers for the prognosis of breast cancer progression
EP4375675A1 (en) 2021-07-21 2024-05-29 Seegene, Inc. Assembled analysis system, method, and computer readable recording medium
WO2023010008A1 (en) 2021-07-27 2023-02-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting gastrointestinal pathogens
EP4411386A1 (en) 2021-09-30 2024-08-07 Seegene, Inc. Method for processing and analyzing sample in molecular diagnostic system
KR20240090267A (ko) 2021-10-29 2024-06-21 주식회사 씨젠 검체 채취 스왑 도구 및 호흡기 병원체의 검출 방법
US20230357851A1 (en) 2022-04-06 2023-11-09 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring frataxin-replacement therapy
EP4282980A1 (en) 2022-05-23 2023-11-29 Mobidiag Oy Methods for amplifying a nucleic acid
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells
WO2023240201A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Larimar Therapeutics, Inc. Frataxin-sensitive markers for monitoring progression and treatment of leigh syndrome
WO2023239940A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Research Development Foundation Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof
WO2024054924A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Gen-Probe Incorporated Method of detecting nucleic acid analytes using dual-specificity primers
WO2024161179A1 (en) 2023-01-31 2024-08-08 Mobidiag Oy Compositions and methods for detecting stx nucleic acids

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0128042A3 (en) 1983-06-06 1985-01-16 Genentech, Inc. A process for indentifying or isolating a dna sequence, and a dna hybridization probe therefor
CA1288073C (en) 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
AU606043B2 (en) * 1985-03-28 1991-01-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of viruses by amplification and hybridization
DK171161B1 (da) 1985-03-28 1996-07-08 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
CA1339653C (en) * 1986-02-25 1998-02-03 Larry J. Johnson Appartus and method for performing automated amplification of nucleic acid sequences and assays using heating and cooling steps
FI76119C (fi) 1986-02-27 1988-09-09 Orion Yhtymae Oy Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet.

Also Published As

Publication number Publication date
ATE114335T1 (de) 1994-12-15
DE3856428D1 (de) 2000-11-02
JPH02500565A (ja) 1990-03-01
DK175614B1 (da) 2004-12-27
EP0368906B1 (en) 1994-11-23
KR890701741A (ko) 1989-12-21
NZ225077A (en) 1991-06-25
PT87769B (pt) 1992-10-30
DE3852177D1 (de) 1995-01-05
HUT52823A (en) 1990-08-28
NO895090L (no) 1990-02-19
ATE196657T1 (de) 2000-10-15
IL86724A0 (en) 1988-11-30
IE950293L (en) 1988-12-19
BR8807097A (pt) 1989-10-17
EP0623683A1 (en) 1994-11-09
DE3852177T2 (de) 1995-04-06
DK644489D0 (da) 1989-12-19
IE65089B1 (en) 1995-10-04
FI93743B (fi) 1995-02-15
DK644489A (da) 1990-02-19
ES2009286A6 (es) 1989-09-16
IE881848L (en) 1988-12-19
JP2843586B2 (ja) 1999-01-06
KR960014107B1 (ko) 1996-10-14
NO895090D0 (no) 1989-12-18
IL86724A (en) 1995-01-24
EP0623683B1 (en) 2000-09-27
NO303068B1 (no) 1998-05-25
PT87769A (pt) 1989-05-31
WO1988010315A1 (en) 1988-12-29
HU216317B (hu) 1999-06-28
EP0368906B2 (en) 1999-08-04
DE3852177T3 (de) 2000-06-15
DE3856428T2 (de) 2001-04-19
GR880100396A (el) 1989-03-08
EP0368906A1 (en) 1990-05-23
FI896077A0 (fi) 1989-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI93743C (fi) Transskriptioon perustuvia nukleiinihappoamplifikaatio-/detektointijärjestelmiä
JP3152927B2 (ja) 自己持続性、配列複製システム
JP3689333B2 (ja) Ｈｉｖ−１の全てのサブタイプを増幅及び検出するためにプライマー及びプローブとして使用できる核酸配列
DK175944B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af en dobbeltstrenget nucleinsyre som inkluderer en promotor der er operabelt forbundet til en sekvens, som skal detekteres, og en fremgangsmåde, der er anvendelig til detektion af en specifik nucleinsyresekvens ......
JPH04503451A (ja) 自己持続性、配列複製システム
JP2000512160A (ja) Ｈｉｖ−１およびｈｉｖ−２を検出するための核酸プライマーおよびプローブ
CN113215308A (zh) 检测人细小病毒核酸和甲型肝炎病毒核酸的组合物和方法
JP2011078389A (ja) サポウイルスｒｎａの検出方法および検出試薬
AU623602B2 (en) Transcription-based nucleic acid amplification/detection systems
AU2005201742B2 (en) Detection and identification of enteroviruses
IE19950293A1 (en) Transcription-based nucleic acid amplification/detection systems
IE83297B1 (en) Transcription-based nucleic acid amplification/detection systems
WO2021224873A1 (en) Methods and compositions for detecting sars-cov-2 nucleic acid
JP2022017961A (ja) コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）検出に用いるオリゴヌクレオチド及びその検出方法
EP0879894A2 (en) Sample preparation for nucleic acid based diagnostic tests
JPH10327898A (ja) 核酸ベースの診断試験のための試料調製

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
PC Transfer of assignment of patent

Owner name: AKZO NOBEL N.V.

FG Patent granted

Owner name: AKZO NOBEL N.V.