JP2939485B2 - 複製ｒｎａに基づく増幅／検出系 - Google Patents
複製ｒｎａに基づく増幅／検出系Info
- Publication number
- JP2939485B2 JP2939485B2 JP1509398A JP50939889A JP2939485B2 JP 2939485 B2 JP2939485 B2 JP 2939485B2 JP 1509398 A JP1509398 A JP 1509398A JP 50939889 A JP50939889 A JP 50939889A JP 2939485 B2 JP2939485 B2 JP 2939485B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- sequence
- nucleic acid
- dna
- rna polymerase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6867—Replicase-based amplification, e.g. using Q-beta replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本出願は、1988年９月８日に出願された米国特許出願
第07/241942号と第07/241969号の継続出願である。
第07/241942号と第07/241969号の継続出願である。
PCT国際公報W087/06270号として公開された1986年４
月16日出願の米国特許出願第852692号と、1988年５月９
日出願のその一部継続出願である米国特許出願第191450
号も、本出願に関係しており、これらの出願の全開示内
容がここに参考文献として引用される。
月16日出願の米国特許出願第852692号と、1988年５月９
日出願のその一部継続出願である米国特許出願第191450
号も、本出願に関係しており、これらの出願の全開示内
容がここに参考文献として引用される。
発明の分野 本発明は、一般に分子生物学と組換え体DNA技術にお
ける進歩に関する。
ける進歩に関する。
さらに詳細には、本発明は、試験管内（インビボ）ま
たは生体外（インビボ）セッティングにおいて核酸種の
存在を検出し、核酸がコード化する対応ポリペプチドを
生物学的サンプル中で演繹するために必要な試薬および
手段を含むアッセイおよび薬剤学的キットを含めた方法
および手段に関する。本発明はこのような検出のために
複製RNAを利用し、このような複製RNAの利用に基づい
て、標的核酸のセグメントを一致（correspondence）に
よって増幅する、または同種セグメントを補足またはハ
イブリッド化する。したがって、本発明は特にRNA依存
性RNAポリメラーゼによって触媒される自己複製の鋳型
として役立つRNAを用いるレポーター系に関する。
たは生体外（インビボ）セッティングにおいて核酸種の
存在を検出し、核酸がコード化する対応ポリペプチドを
生物学的サンプル中で演繹するために必要な試薬および
手段を含むアッセイおよび薬剤学的キットを含めた方法
および手段に関する。本発明はこのような検出のために
複製RNAを利用し、このような複製RNAの利用に基づい
て、標的核酸のセグメントを一致（correspondence）に
よって増幅する、または同種セグメントを補足またはハ
イブリッド化する。したがって、本発明は特にRNA依存
性RNAポリメラーゼによって触媒される自己複製の鋳型
として役立つRNAを用いるレポーター系に関する。
本発明が利用される用途には、特定または一般の病原
性疾患もしくは状態に特徴的な核酸配列の分析であっ
て、そのために必要な標的核酸を含む体液もしくは組織
の試験管内または生体外核酸プローブハイブリッド化ア
ッセイによる分析がある。
性疾患もしくは状態に特徴的な核酸配列の分析であっ
て、そのために必要な標的核酸を含む体液もしくは組織
の試験管内または生体外核酸プローブハイブリッド化ア
ッセイによる分析がある。
発明の背景 RNA、DNAまたは両方を含む広範囲な他の核酸種中での
その存在に関して微量でいわゆる標的核酸として含まれ
る生物学的サンプル中の種々な核酸配列を検出すること
は、この技術分野の目的のひとつである。それゆえ、例
えばヒト免疫学的疾患または状態に関連したポリペプチ
ドをコードする核酸を検出することが望ましい。このよ
うなウィルス粒子をコードする核酸の検出の他に、例え
ば血友病のケースなどの欠陥遺伝子のような、病理学的
疾患または状態に特徴的な核酸の検出あるいはこのよう
な疾患または状態の抗病原体抗体の検出が望ましい。
その存在に関して微量でいわゆる標的核酸として含まれ
る生物学的サンプル中の種々な核酸配列を検出すること
は、この技術分野の目的のひとつである。それゆえ、例
えばヒト免疫学的疾患または状態に関連したポリペプチ
ドをコードする核酸を検出することが望ましい。このよ
うなウィルス粒子をコードする核酸の検出の他に、例え
ば血友病のケースなどの欠陥遺伝子のような、病理学的
疾患または状態に特徴的な核酸の検出あるいはこのよう
な疾患または状態の抗病原体抗体の検出が望ましい。
このような疾患または状態に関係する核酸は、例え
ば、被検特定固体の血液または他の体液若しくは組織サ
ンプルのような一定の生物学的サンプル中に存在すると
してもごく微量で存在する このような技術が用いられる他の重要なケースは、前
記米国特許出願第852692号に詳述されるので、ここで繰
り返し記載しない。
ば、被検特定固体の血液または他の体液若しくは組織サ
ンプルのような一定の生物学的サンプル中に存在すると
してもごく微量で存在する このような技術が用いられる他の重要なケースは、前
記米国特許出願第852692号に詳述されるので、ここで繰
り返し記載しない。
このような核酸種の検出は、このような核酸種が環境
的に関係した広範囲な他の核酸種の中から、存在すると
しても、検出可能であり、測定可能であるというような
特異性を必要とする。これらの種の一部は少なくとも単
離セグメントにおいて標的核酸と密接な相同関係（homo
logy）を有する。さらに、上述したように、これらの標
的核酸種は被検生物学的サンプル中にごく微量で検出さ
れることが非常に多い。しかも、既存疾患症状の適切な
診断のためには、このような微量の標的核酸もアッセイ
系の忠実性によって決定的に検出可能であることが重要
である。
的に関係した広範囲な他の核酸種の中から、存在すると
しても、検出可能であり、測定可能であるというような
特異性を必要とする。これらの種の一部は少なくとも単
離セグメントにおいて標的核酸と密接な相同関係（homo
logy）を有する。さらに、上述したように、これらの標
的核酸種は被検生物学的サンプル中にごく微量で検出さ
れることが非常に多い。しかも、既存疾患症状の適切な
診断のためには、このような微量の標的核酸もアッセイ
系の忠実性によって決定的に検出可能であることが重要
である。
技術分野のこの目的を達成するために、２種類の基本
的アプローチが開発されている。１つのアプローチで
は、サンプル中の核酸量が変化または影響されない。そ
のかわりに、レポーター系が用いられ、それによって検
出と測定を容易にするために核酸標的に対応する多数の
検出可能な分子が製造される。このようなレポーター系
は標的核酸に結合したシグナル発生系であり、標的配列
の分子の数を表示する検出可能なシグナルを発生する。
このような系は、標的核酸配列とハイブリッド化するオ
リゴヌクレオチドプローブに結合した発色団（chromoph
ore）形成部分を用いている。発色団部分は標的と適当
にハイブリッド化したオリゴヌクレオチドプローブから
単離され、測定される。このような発色団形成基の１つ
は、適当な条件下で検出可能でかつ測定可能な着色分子
を形成する色原体（chromogenic）基質を有する、例え
ばアルカリホスファターゼのような酵素である。他のこ
れに類似する系は、このような適当にハイブリッド化し
た標的核酸が発生するシグナルを検出、測定できるよう
に、核酸プローブの放射能標識を用いる。
的アプローチが開発されている。１つのアプローチで
は、サンプル中の核酸量が変化または影響されない。そ
のかわりに、レポーター系が用いられ、それによって検
出と測定を容易にするために核酸標的に対応する多数の
検出可能な分子が製造される。このようなレポーター系
は標的核酸に結合したシグナル発生系であり、標的配列
の分子の数を表示する検出可能なシグナルを発生する。
このような系は、標的核酸配列とハイブリッド化するオ
リゴヌクレオチドプローブに結合した発色団（chromoph
ore）形成部分を用いている。発色団部分は標的と適当
にハイブリッド化したオリゴヌクレオチドプローブから
単離され、測定される。このような発色団形成基の１つ
は、適当な条件下で検出可能でかつ測定可能な着色分子
を形成する色原体（chromogenic）基質を有する、例え
ばアルカリホスファターゼのような酵素である。他のこ
れに類似する系は、このような適当にハイブリッド化し
た標的核酸が発生するシグナルを検出、測定できるよう
に、核酸プローブの放射能標識を用いる。
標的核酸配列とともにサンプル中に存在する核酸配列
量よりもとくに多量に、標的核酸配列自体のコピー数を
増加させるという点で第１アプローチとは根本的に異な
る第２アプローチが開発されている。これは標的核酸配
列の選択的増幅によって行われる。サンプルの培養方法
を改良して、標的核酸配列を何らかの方法で他の核酸配
列よりも優先的に増幅させることができる。このような
方法はやっかいであり、時間を要し、困難や誤りを生じ
やすい。
量よりもとくに多量に、標的核酸配列自体のコピー数を
増加させるという点で第１アプローチとは根本的に異な
る第２アプローチが開発されている。これは標的核酸配
列の選択的増幅によって行われる。サンプルの培養方法
を改良して、標的核酸配列を何らかの方法で他の核酸配
列よりも優先的に増幅させることができる。このような
方法はやっかいであり、時間を要し、困難や誤りを生じ
やすい。
第２アプローチの他の例は、いわゆる「ポリメラーゼ
連鎖反応」（PCR）における標的核酸配列の増幅であ
る。この方法は、サイキ（Saiki）らのサイエンス、23
0、1350（1085）と、ムリス（Mullis）らのヨーロッパ
特許公報第200362号と第201184号（米国特許第4683195
号と第4683202号も参照）とによって報告されており、
とくに（１）標的核酸配列へのプライマーのハイブリッ
ド化；（２）前記プライマーのポリメラーゼによる伸
長；および（３）連鎖伸長反応から生じた二重鎖体の一
重鎖化を必要とする。この反応は多くのサイクルにわた
って繰り返して、基礎になる標的核酸配列を増幅するこ
とができる。この方法は少なくとも２種類の核酸プロー
ブと、１サイクルにつき３工程を必要とする。
連鎖反応」（PCR）における標的核酸配列の増幅であ
る。この方法は、サイキ（Saiki）らのサイエンス、23
0、1350（1085）と、ムリス（Mullis）らのヨーロッパ
特許公報第200362号と第201184号（米国特許第4683195
号と第4683202号も参照）とによって報告されており、
とくに（１）標的核酸配列へのプライマーのハイブリッ
ド化；（２）前記プライマーのポリメラーゼによる伸
長；および（３）連鎖伸長反応から生じた二重鎖体の一
重鎖化を必要とする。この反応は多くのサイクルにわた
って繰り返して、基礎になる標的核酸配列を増幅するこ
とができる。この方法は少なくとも２種類の核酸プロー
ブと、１サイクルにつき３工程を必要とする。
ある種のRNAは、例えば、Ｑβレプリカーゼ、ブロム
モザイクウィルス（BMV）からのレプリカーゼなどのバ
クテリオファージRNA依存性RNAポリメラーゼのような、
ある種のポリメラーゼによって増幅されやすいことが知
られている。この方法では、RNAは最初に存在する量の
指数関数的増加である量の複製RNA配列を生ずる、RNAポ
リメラーゼによる複製のための配列鋳型として役立つ。
ミール（Mile）らのジャーナル モレキュラー ビオロ
ジー、171、281（1983）を参照されたい。標的配列のた
めのプローブがＱβレプリカーゼによって複製されうる
RNAに結合する系はチュ（Chu）らのニュークレイック
アジトスリサーチ、14、5591（1986）に述べられてお
り、BMVレプリカーゼによって複製されうるRNAに結合す
る系はマーチ（March）らのポジティブ ストランド R
NAウィルセス、アランＲリス（発行者、ニューヨーク）
（1987:UCLAシンポジウム、1986年の会議録）に述べら
れている。
モザイクウィルス（BMV）からのレプリカーゼなどのバ
クテリオファージRNA依存性RNAポリメラーゼのような、
ある種のポリメラーゼによって増幅されやすいことが知
られている。この方法では、RNAは最初に存在する量の
指数関数的増加である量の複製RNA配列を生ずる、RNAポ
リメラーゼによる複製のための配列鋳型として役立つ。
ミール（Mile）らのジャーナル モレキュラー ビオロ
ジー、171、281（1983）を参照されたい。標的配列のた
めのプローブがＱβレプリカーゼによって複製されうる
RNAに結合する系はチュ（Chu）らのニュークレイック
アジトスリサーチ、14、5591（1986）に述べられてお
り、BMVレプリカーゼによって複製されうるRNAに結合す
る系はマーチ（March）らのポジティブ ストランド R
NAウィルセス、アランＲリス（発行者、ニューヨーク）
（1987:UCLAシンポジウム、1986年の会議録）に述べら
れている。
最近まで、（自動触媒）複製を用いて、便利で広範囲
に利用可能な、高感受性の核酸配列分析用レポーターを
形成できることは知られていなかった。上記米国特許出
願第852692号は、ヌクレオチドプローブと結合した複製
RNAの指数関数的複製方法を介した標的核酸配列の増幅
による標的核酸配列の検出への核酸プローブ複製RNAア
ダクツの使用を提案している。したがって、この発明は
RNA複製の技術とオリゴヌクレオチドハイブリッド化プ
ローブの使用とを結合させて、複合複製増幅によって標
的核酸を検出している。この発明の詳細は同時継続特許
出願またはその相対物である公開された国際出願（両方
とも上述）を参照することによって容易に提示される。
この方法の実際の欠点は、アッセイ環境で固有に不安定
であることが判明している、比較的長く、そのために敏
感な複製可能なRNAの使用を必要とすることにある。
に利用可能な、高感受性の核酸配列分析用レポーターを
形成できることは知られていなかった。上記米国特許出
願第852692号は、ヌクレオチドプローブと結合した複製
RNAの指数関数的複製方法を介した標的核酸配列の増幅
による標的核酸配列の検出への核酸プローブ複製RNAア
ダクツの使用を提案している。したがって、この発明は
RNA複製の技術とオリゴヌクレオチドハイブリッド化プ
ローブの使用とを結合させて、複合複製増幅によって標
的核酸を検出している。この発明の詳細は同時継続特許
出願またはその相対物である公開された国際出願（両方
とも上述）を参照することによって容易に提示される。
この方法の実際の欠点は、アッセイ環境で固有に不安定
であることが判明している、比較的長く、そのために敏
感な複製可能なRNAの使用を必要とすることにある。
本発明の目的は、増幅のための基本的複製方法を標的
核酸配列に対応する配列の検出に容易に利用することで
ある。本発明の他の目的は、結果として一定核酸配列の
増幅に役立つ、他の生物学的プロセスを利用することで
ある。特に、自然の転写プロセス（DNAの表現ではポリ
ペプチド生成物の産生の第１段階）を利用して、DNA依
存性RNAポリメラーゼによって識別されるプロモーター
配列を含む二重鎖核酸鋳型を用いて複数の対応RNA転写
体を製造する。また、この方法を用いて、それ自体が複
製可能である多くのRNA転写体を製造することもでき
る。
核酸配列に対応する配列の検出に容易に利用することで
ある。本発明の他の目的は、結果として一定核酸配列の
増幅に役立つ、他の生物学的プロセスを利用することで
ある。特に、自然の転写プロセス（DNAの表現ではポリ
ペプチド生成物の産生の第１段階）を利用して、DNA依
存性RNAポリメラーゼによって識別されるプロモーター
配列を含む二重鎖核酸鋳型を用いて複数の対応RNA転写
体を製造する。また、この方法を用いて、それ自体が複
製可能である多くのRNA転写体を製造することもでき
る。
本発明の他の目的は、対応する標的核酸の検出、測定
手段として、複製方法の利点と転写体形成方法の利点と
を結合することである。
手段として、複製方法の利点と転写体形成方法の利点と
を結合することである。
したがて、本発明の目的は、存在と量において標的核
酸配列に対応し、多数に複製可能であり、その検出と測
定を説明できるシグナル基（signal grouping）との結
合によって適応させたれる一定RNA転写体配列をあらゆ
る場合に製造することである。
酸配列に対応し、多数に複製可能であり、その検出と測
定を説明できるシグナル基（signal grouping）との結
合によって適応させたれる一定RNA転写体配列をあらゆ
る場合に製造することである。
したがって、この技術分野が今まで列挙した目的を見
たし、先行技術の研究者の努力が直面した欠点と問題を
克服することが、本発明の総合的目的である。本発明は
用いるとしても、複製可能であることを保証する配列を
含むこと以外は何も必要としない、比較的短い、そのた
めに安定な配列を用いる。したがって、本発明は受容で
きる短時間に安定した性格さで利用することができ、公
知の試薬の便利さを用い、一貫した科学的結果を得るた
めに必要な正確さを有する直接的方法であって、再現可
能なアッセイ設定で利用することができ、実験用／臨床
用分析のキットへの使用に適用可能である方法を提供す
ることである。それゆえ、自然の転写と複製方法自体が
提供する利点を利用して、試験管内または生体外系，に
おける標的配列の存在と結合した配列の増幅によって、
一定核酸配列（標的セグメント）の検出可能性を高める
ことである。
たし、先行技術の研究者の努力が直面した欠点と問題を
克服することが、本発明の総合的目的である。本発明は
用いるとしても、複製可能であることを保証する配列を
含むこと以外は何も必要としない、比較的短い、そのた
めに安定な配列を用いる。したがって、本発明は受容で
きる短時間に安定した性格さで利用することができ、公
知の試薬の便利さを用い、一貫した科学的結果を得るた
めに必要な正確さを有する直接的方法であって、再現可
能なアッセイ設定で利用することができ、実験用／臨床
用分析のキットへの使用に適用可能である方法を提供す
ることである。それゆえ、自然の転写と複製方法自体が
提供する利点を利用して、試験管内または生体外系，に
おける標的配列の存在と結合した配列の増幅によって、
一定核酸配列（標的セグメント）の検出可能性を高める
ことである。
発明の要約 本発明は、標的核酸配列のセグメントとのハイブリッ
ド化に適し、それらの多重自己複製を実施しうる配列を
それら自体が含む複製のRNA転写体の形成を開始しうる
部分をそれと結合して有するオリゴヌクレオチドプロー
ブの使用に基づいている。したがって、本発明は共有結
合した部分の新規なアダクツを用い、その１つの部分は
標的核酸配列とハイブリッド化しうるオリゴヌクレオチ
ドプローブであり、他の部分は自己複製しうる複数の転
写体を形成する転写プロセスを開始しうる部分である。
ド化に適し、それらの多重自己複製を実施しうる配列を
それら自体が含む複製のRNA転写体の形成を開始しうる
部分をそれと結合して有するオリゴヌクレオチドプロー
ブの使用に基づいている。したがって、本発明は共有結
合した部分の新規なアダクツを用い、その１つの部分は
標的核酸配列とハイブリッド化しうるオリゴヌクレオチ
ドプローブであり、他の部分は自己複製しうる複数の転
写体を形成する転写プロセスを開始しうる部分である。
１実施態様では、本発明は次の結合部分： （１）標的核酸配列を含むサンプル中で標的核酸配列と
ハイブリッド化しうるオリゴヌクレオチド配列；および （２）RNAポリメラーゼと核酸プロモーター配列とから
なる群から選択された、転写プロセスを開始しうる部分 からなる新規なアダクツ、その製造方法およびその使用
に関する。
ハイブリッド化しうるオリゴヌクレオチド配列；および （２）RNAポリメラーゼと核酸プロモーター配列とから
なる群から選択された、転写プロセスを開始しうる部分 からなる新規なアダクツ、その製造方法およびその使用
に関する。
したがって、この実施態様は１形式において、次の結
合部分： （１）標的核酸配列を含むサンプル中で標的核酸配列と
ハイブリッド化しうるオリゴヌクレオチド配列；および （２）任意の開裂されたときに、複製可能なRNAをコー
ドするDNAと作用可能に結合したプロモーター配列を介
して転写を開始しうるRNAポリメラーゼからなる新規な
アダクツ、その製造方法および使用に関する。
合部分： （１）標的核酸配列を含むサンプル中で標的核酸配列と
ハイブリッド化しうるオリゴヌクレオチド配列；および （２）任意の開裂されたときに、複製可能なRNAをコー
ドするDNAと作用可能に結合したプロモーター配列を介
して転写を開始しうるRNAポリメラーゼからなる新規な
アダクツ、その製造方法および使用に関する。
この実施態様は第２形式において、次の結合部分： （１）標的核酸配列を含むサンプル中で標的核酸配列と
ハイブリッド化しうるオリゴヌクレオチド配列；および （２）任意に開裂され、複製可能なRNAをコードするDNA
と作用可能に結合されたときに、対応RNAポリメラーゼ
によって標識されて複製可能なRNA転写体を形成する核
酸プロモーター配列 からなる新規なアダクツ、その製造方法および使用に関
する。
ハイブリッド化しうるオリゴヌクレオチド配列；および （２）任意に開裂され、複製可能なRNAをコードするDNA
と作用可能に結合されたときに、対応RNAポリメラーゼ
によって標識されて複製可能なRNA転写体を形成する核
酸プロモーター配列 からなる新規なアダクツ、その製造方法および使用に関
する。
生成物のRNA転写体は適当なレプリカーゼによって自
己複製し、例えば発色団部分または放射能によって検出
可能な部分の包含または結合によるような、それ自体公
知の方法によって検出、測定される。
己複製し、例えば発色団部分または放射能によって検出
可能な部分の包含または結合によるような、それ自体公
知の方法によって検出、測定される。
本発明はすべての形式において、DNA、RNAまたは両者
を含めた核酸混合物を含む生物学的サンプル中に存在し
うる対応標的核酸配列の演繹検出と測定への、自然の転
写体産生原理と転写体複製の新規な利用に関する。
を含めた核酸混合物を含む生物学的サンプル中に存在し
うる対応標的核酸配列の演繹検出と測定への、自然の転
写体産生原理と転写体複製の新規な利用に関する。
したがって、本発明はそれ自体として増幅され、検出
され、対応標的核酸配列の存在量の測定の基礎として測
定される複製可能なRNA転写体の製造と使用に関係した
すべての方法と手段に関する。本発明は前記標的核酸配
列とハイブリッド化しうるオリゴヌクレオチドプローブ
と複製可能なRNAをコードするDNAと作用的に結合したプ
ロモーター、すなわちRNAポリメラーゼ、識別可能なプ
ロモーターを識別しうるRNAポリメラーゼとからなる先
駆体アダクツ、すなわち結合アダクツに関する。本発明
はさらに、このようなアダクツの製造と、対応標的核酸
配列の演繹による検出と一定生物学的サンプル中のその
存在量の測定とへのこのようなアダクツの使用とに関す
る。
され、対応標的核酸配列の存在量の測定の基礎として測
定される複製可能なRNA転写体の製造と使用に関係した
すべての方法と手段に関する。本発明は前記標的核酸配
列とハイブリッド化しうるオリゴヌクレオチドプローブ
と複製可能なRNAをコードするDNAと作用的に結合したプ
ロモーター、すなわちRNAポリメラーゼ、識別可能なプ
ロモーターを識別しうるRNAポリメラーゼとからなる先
駆体アダクツ、すなわち結合アダクツに関する。本発明
はさらに、このようなアダクツの製造と、対応標的核酸
配列の演繹による検出と一定生物学的サンプル中のその
存在量の測定とへのこのようなアダクツの使用とに関す
る。
本発明は、さらにこのようなアダクツとそれらの複製
可能な転写体生成物とに基づくアッセイ系の考案に関連
した方法と手段、およびこのようなアッセイ方法論を実
験／臨床設定において標的核酸配列の測定のために必要
な試薬と手段とともに含むキットに関する。
可能な転写体生成物とに基づくアッセイ系の考案に関連
した方法と手段、およびこのようなアッセイ方法論を実
験／臨床設定において標的核酸配列の測定のために必要
な試薬と手段とともに含むキットに関する。
しがたって、本発明は核酸含有サンプル中の少なくと
も１つの特定核酸標的配列検出のために有用な方法であ
って、プロモーターと作用可能に結合した複製可能なRN
A転写体をコードするDNAを含む分子の転写生成物である
自己複製RNA転写体の検出からなり、前記プロモーター
が前記標的核酸配列とハイブリッド化しうるオリゴヌク
レオチドプローブとアダクツとして結合したポリメラー
ゼリポーター分子によって識別されやすいか、または前
記プローブが前記標的核酸配列とハイブリッド化しうる
オリゴヌクレオチドプローブとアダクツとして結合した
リポーター分子である方法に関する。
も１つの特定核酸標的配列検出のために有用な方法であ
って、プロモーターと作用可能に結合した複製可能なRN
A転写体をコードするDNAを含む分子の転写生成物である
自己複製RNA転写体の検出からなり、前記プロモーター
が前記標的核酸配列とハイブリッド化しうるオリゴヌク
レオチドプローブとアダクツとして結合したポリメラー
ゼリポーター分子によって識別されやすいか、または前
記プローブが前記標的核酸配列とハイブリッド化しうる
オリゴヌクレオチドプローブとアダクツとして結合した
リポーター分子である方法に関する。
本発明は主として、（１）適当なリポーター分子の製
造段階と増幅段階との間に転写段階を挿入することを含
み、（２）用いるとしても比較的短い、安定なRNAリポ
ーター分子として用いる。複製可能な転写体の複製後に
は必然的に、前記転写体の配列中にレプリカーゼ酵素に
よって識別されうる配列を挿入する。
造段階と増幅段階との間に転写段階を挿入することを含
み、（２）用いるとしても比較的短い、安定なRNAリポ
ーター分子として用いる。複製可能な転写体の複製後に
は必然的に、前記転写体の配列中にレプリカーゼ酵素に
よって識別されうる配列を挿入する。
本発明はさらに、前記検出された複製可能な転写体の
量の測定手段を含む。
量の測定手段を含む。
本発明の１形式において、核酸含有サンプル中の少な
くとも１つの特定核酸標的配列の検出のために有用な方
法であって、次の段階 核酸含有サンプル中の前記標的配列のセグメントに配列
において対応するオリゴヌクレオチドプローブと、これ
に結合したRNAポリメラーゼの機能的長さとから成るオ
リゴヌクレオチドーRNAポリメラーゼアダクツを適当な
条件下でハイブリッド化する段階； 過剰な、非ハイブリッド化オリゴヌクレオチドーRNAポ
リメラーゼアダクツを除去する段階； 前記標的核酸配列とハイブリッド化によって結合したRN
Aポリメラーゼ配列数を検定し、これを利用して、複製
可能なRNA転写体をコードするDNA配列に作用可能に結合
した前記RNAポリメラーゼによって識別されるプロモー
ターを含む二重鎖DNAの転写を開始する段階； 転写生成物を複製する段階；および 複製された転写体を検出する段階 から成る方法に関する。
くとも１つの特定核酸標的配列の検出のために有用な方
法であって、次の段階 核酸含有サンプル中の前記標的配列のセグメントに配列
において対応するオリゴヌクレオチドプローブと、これ
に結合したRNAポリメラーゼの機能的長さとから成るオ
リゴヌクレオチドーRNAポリメラーゼアダクツを適当な
条件下でハイブリッド化する段階； 過剰な、非ハイブリッド化オリゴヌクレオチドーRNAポ
リメラーゼアダクツを除去する段階； 前記標的核酸配列とハイブリッド化によって結合したRN
Aポリメラーゼ配列数を検定し、これを利用して、複製
可能なRNA転写体をコードするDNA配列に作用可能に結合
した前記RNAポリメラーゼによって識別されるプロモー
ターを含む二重鎖DNAの転写を開始する段階； 転写生成物を複製する段階；および 複製された転写体を検出する段階 から成る方法に関する。
本発明は１形式において、核酸含有サンプル中の少な
くとも１つの特定核酸標的配列の検出のために有用な方
法であって、次の段階 核酸含有サンプル中の前記標的配列のセグメントに配列
において対応するオリゴヌクレオチドプローブと、これ
に結合したRNAポリメラーゼの機能的長さとから成るオ
リゴヌクレオチドーRNAポリメラーゼアダクツを適当な
条件下でハイブリッド化する段階； 過剰な、非ハイブリッド化オリゴヌクレオチドーRNAポ
リメラーゼアダクツを除去する段階； 前記標的核酸配列とハイブリッド化によって結合したRN
Aポリメラーゼ配列数を検定し、これを利用して、複製
可能なRNA転写体をコードする、前記プロモーターの反
対鎖が作用可能に結合した一重鎖または二重鎖DNAの転
写を指示する段階； 転写生成物を複製する段階；および 複製された転写体を検出する段階 からなる方法に関する。
くとも１つの特定核酸標的配列の検出のために有用な方
法であって、次の段階 核酸含有サンプル中の前記標的配列のセグメントに配列
において対応するオリゴヌクレオチドプローブと、これ
に結合したRNAポリメラーゼの機能的長さとから成るオ
リゴヌクレオチドーRNAポリメラーゼアダクツを適当な
条件下でハイブリッド化する段階； 過剰な、非ハイブリッド化オリゴヌクレオチドーRNAポ
リメラーゼアダクツを除去する段階； 前記標的核酸配列とハイブリッド化によって結合したRN
Aポリメラーゼ配列数を検定し、これを利用して、複製
可能なRNA転写体をコードする、前記プロモーターの反
対鎖が作用可能に結合した一重鎖または二重鎖DNAの転
写を指示する段階； 転写生成物を複製する段階；および 複製された転写体を検出する段階 からなる方法に関する。
本発明は用途において、それ自体公知の放射能標識ま
たは発色団標識方法によるような、前記自己複製可能な
RNA転写体の検出を含む。
たは発色団標識方法によるような、前記自己複製可能な
RNA転写体の検出を含む。
本発明は、標的核酸配列が遺伝的または病原性疾患も
しくは状態の特徴に関係したサンプル中、およびとくに
核酸配列がヒトウィルスのセグメントであるかまたは欠
陥遺伝子のセグメントであるサンプル中の標的核酸配列
の検出を含む。
しくは状態の特徴に関係したサンプル中、およびとくに
核酸配列がヒトウィルスのセグメントであるかまたは欠
陥遺伝子のセグメントであるサンプル中の標的核酸配列
の検出を含む。
遺伝子欠陥の結果であるかまたは特定の遺伝子的対立
形質（allele）の存在に相関する多くのヒト疾患が存在
する。例えば、本出願に述べる方法はごく小さいDNAサ
ンプル中に一定標的遺伝子が存在するか否かの決定に用
いることができる。このことは、例えば胎児水症（αグ
ロビンDNAの欠損）またはレポール血色素障害［δとβ
グロビン遺伝子間の非相同交差（nonhomologous crossi
ng over）］のような遺伝的障害の胎児期診断に有用で
ある。この方法はまたmRNA種の検出にも利用可能であ
る。この方法は例えばクーリー貧血すなわちβグロビン
mRNAの欠損を特徴とする疾患の診断に有用である。他の
有用な用途は潜伏期のウィルス感染症の検出である。抹
消血液細胞からのDNAを宿主ゲノムに一体化したHIV−１
（エイズウィルス）DNAの存在に関して検査することが
できる。この方法はまた、小組織サンプルのHLA型の検
査に用いることもできる。この方法は例えば、強直性脊
椎炎およびライター症候群のような障害に対する固体の
遺伝敵要因の評価にも有用である。
形質（allele）の存在に相関する多くのヒト疾患が存在
する。例えば、本出願に述べる方法はごく小さいDNAサ
ンプル中に一定標的遺伝子が存在するか否かの決定に用
いることができる。このことは、例えば胎児水症（αグ
ロビンDNAの欠損）またはレポール血色素障害［δとβ
グロビン遺伝子間の非相同交差（nonhomologous crossi
ng over）］のような遺伝的障害の胎児期診断に有用で
ある。この方法はまたmRNA種の検出にも利用可能であ
る。この方法は例えばクーリー貧血すなわちβグロビン
mRNAの欠損を特徴とする疾患の診断に有用である。他の
有用な用途は潜伏期のウィルス感染症の検出である。抹
消血液細胞からのDNAを宿主ゲノムに一体化したHIV−１
（エイズウィルス）DNAの存在に関して検査することが
できる。この方法はまた、小組織サンプルのHLA型の検
査に用いることもできる。この方法は例えば、強直性脊
椎炎およびライター症候群のような障害に対する固体の
遺伝敵要因の評価にも有用である。
本発明は、バクテリオファージＴプロモーターのよう
な特定プロモーターの使用を含み、T7RNAポリメラーゼ
またはSP6プロモーターと対応SP6RNAポリメラーゼを用
いてRNA転写体を製造する。
な特定プロモーターの使用を含み、T7RNAポリメラーゼ
またはSP6プロモーターと対応SP6RNAポリメラーゼを用
いてRNA転写体を製造する。
本発明はまた、核酸含有サンプル中の少なくとも１つ
の特定核酸標的配列の検出のために有用なアッセイ系と
同アッセイ系含有キットであって、前記標的核酸配列と
ハイブリッド化しうるオリゴヌクレオチドプローブとア
ダクツとして結合したRNAポリメラーゼ リポーター分
子によって識別されやすいかまたは前記標的核酸配列と
ハイブリッド化しうるオリゴヌクレオチドプローブとア
ダクツとして結合したリポーター分子であるプロモータ
ーと作用可能に結合した、複製可能なRNA転写体をコー
ドするDNA分子から製造される自己複製RNA転写体の検出
手段と、前記プローブをハイブリッド化し、前記ハイブ
リッド化プローブの結合リポーターを利用して前記DNA
分子の転写を開始または誘発することによって、それか
らの前記複製可能なRNA転写生成物を検出および測定
し、演繹によって前記標的配列を検出および測定する手
段とを含むキットにも関する。
の特定核酸標的配列の検出のために有用なアッセイ系と
同アッセイ系含有キットであって、前記標的核酸配列と
ハイブリッド化しうるオリゴヌクレオチドプローブとア
ダクツとして結合したRNAポリメラーゼ リポーター分
子によって識別されやすいかまたは前記標的核酸配列と
ハイブリッド化しうるオリゴヌクレオチドプローブとア
ダクツとして結合したリポーター分子であるプロモータ
ーと作用可能に結合した、複製可能なRNA転写体をコー
ドするDNA分子から製造される自己複製RNA転写体の検出
手段と、前記プローブをハイブリッド化し、前記ハイブ
リッド化プローブの結合リポーターを利用して前記DNA
分子の転写を開始または誘発することによって、それか
らの前記複製可能なRNA転写生成物を検出および測定
し、演繹によって前記標的配列を検出および測定する手
段とを含むキットにも関する。
発明の詳細な説明 1.図面の簡単な説明 第１図は本発明の１形式：新規なオリゴヌクレオチド
−ポリメラーゼアダクツ、すなわち任意に開裂可能な−
−−ジチオスレイトール（DTT）によって−−−ポリメ
ラーゼ部分に結合したオリゴヌクレオチド部分（Ｔ′）
（構造上、T7RNAポリメラーゼと表す）がハイブリッド
化した標的核酸配列（Ｔ）を概略的に示す。
−ポリメラーゼアダクツ、すなわち任意に開裂可能な−
−−ジチオスレイトール（DTT）によって−−−ポリメ
ラーゼ部分に結合したオリゴヌクレオチド部分（Ｔ′）
（構造上、T7RNAポリメラーゼと表す）がハイブリッド
化した標的核酸配列（Ｔ）を概略的に示す。
第２図は本発明の１形式：新規なオリゴヌクレオチド
−プロモーターアダクツ、すなわち任意に開裂可能なプ
ロモーター（Ｐ−）に結合したオリゴヌクレオチド部分
（Ｔ′）（一重鎖として表す）がハイブリド化した標的
核酸配列を概略的に示す。
−プロモーターアダクツ、すなわち任意に開裂可能なプ
ロモーター（Ｐ−）に結合したオリゴヌクレオチド部分
（Ｔ′）（一重鎖として表す）がハイブリド化した標的
核酸配列を概略的に示す。
2.一般的方法と定義 例えば下記のように、本発明の基本的方法の実施のた
めの定義、方法および手段を含む分子生物学の標準的な
テキストを参照する： DNA合成または自然供給源からの制限酵素開裂による
配列の単離およびそれ自体としてまたは他のDNAと結合
したときに本発明でのプライマーまたはプローブとして
の使用に適切であるように配列の調節を含めた、DNAプ
ローブまたはプライマー製造； オリゴヌクレオチドプローブ／リポーター分子として
のハイブリッド化に用いるためのオリゴヌクレオチドと
核酸またはオリゴペプチドとの結合アダクツの製造； 標的DNA配列へのプライマーの相同性に依存して多か
れ少なかれハイブリッド化正確性をもたらすための厳密
な条件下での変更を含むハイブリッド化方法； プロモーター、とくに詳しくはバクテリオファージDN
A依存性RNAポリメラーゼおよびバクテリオファージRNA
依存性RNAポリメラーゼ、または真核系を用いた場合に
はウィルスDNA−およびRNA−依存性RNAポリメラーゼ、
例えばアデノウィルスコード化RNAポリメラーゼおよび
ブロムモザイクウィルスRNAポリメラーゼによって識別
されるプロモーターまたは部位の同定、単離または製
造； 上述した前記プロモーターを識別しうるRNAポリメラ
ーゼの同定、単離または製造； （誘発される）複数の機構と方法論；など 例えば、マニアチスらの分子クローニング：実験マニ
ュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、
コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨー
ク（1982）およびこれに引用されている種々の参考文
献；ホング、バイオサイエンスレポートＩ、243（198
1）；クックたのジャーナルオブバイオケミストリー、9
55、6502（1980）；および、ゾーラーら、メソッドスイ
ネンザイモロジー、100、468−500（1983）；クレアら
のニュークレイックアシッズレス、８、2331（1980）；
ナラングら、メソッドエンザイム、68、90（1979）；ビ
ューケージら、テトラヘドロンレターズ、22、1859（19
81）；ブラウンら、メト エンザイム、154、287（198
5）；ヒッツマンら、ジャーナルオブバイオケミストリ
ー、255、2073（1980）；リーら、サイエンス、239、19
88（1988）；ミリガンら、ニュークレイックアシッズ
レス、15、8783（1987）；ミラーらヴィロロジー、236
（1983）；アールクイストら、ジャーナルオブモレキュ
ラーバイオル、153、23（1981）；ミラーら、ネイチャ
ー313、68（1985）；アールクイストら、ジャーナルオ
ブモレキュラーバイオル３、37（1984）；オウら、PNA
S、79、5235（1982）；チュら、ヌークレイックアシッ
ズ レス、14、5591（1986）；ヨーロッパ特許出願公開
第19809号；マーシュら、ポジティブストランドRNAウィ
ルセス、327〜336、アランアール．リス（出版社；ニュ
ーヨーク）（1987;UCLAシンポジウム1986の会議録）；
ミラーら、ジャーナルオブモレキュラーバイオル、18
7、537（1986）；ストックレットら、サイエンス、23
9、491（1988）；クレーマーらジャーナルオブモレキュ
ラーバイオル、89、719（1974）；サリスらヌクレイッ
クアシッズ レス、10、4831（1982）；ブルッセルら、
PANS 80、6523（1983）；およびチューら、ニュークレ
イック アシッズリサーチ、16、3671（1988）；ならび
にこれらに引用されている参考文献を参照のこと。
めの定義、方法および手段を含む分子生物学の標準的な
テキストを参照する： DNA合成または自然供給源からの制限酵素開裂による
配列の単離およびそれ自体としてまたは他のDNAと結合
したときに本発明でのプライマーまたはプローブとして
の使用に適切であるように配列の調節を含めた、DNAプ
ローブまたはプライマー製造； オリゴヌクレオチドプローブ／リポーター分子として
のハイブリッド化に用いるためのオリゴヌクレオチドと
核酸またはオリゴペプチドとの結合アダクツの製造； 標的DNA配列へのプライマーの相同性に依存して多か
れ少なかれハイブリッド化正確性をもたらすための厳密
な条件下での変更を含むハイブリッド化方法； プロモーター、とくに詳しくはバクテリオファージDN
A依存性RNAポリメラーゼおよびバクテリオファージRNA
依存性RNAポリメラーゼ、または真核系を用いた場合に
はウィルスDNA−およびRNA−依存性RNAポリメラーゼ、
例えばアデノウィルスコード化RNAポリメラーゼおよび
ブロムモザイクウィルスRNAポリメラーゼによって識別
されるプロモーターまたは部位の同定、単離または製
造； 上述した前記プロモーターを識別しうるRNAポリメラ
ーゼの同定、単離または製造； （誘発される）複数の機構と方法論；など 例えば、マニアチスらの分子クローニング：実験マニ
ュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、
コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨー
ク（1982）およびこれに引用されている種々の参考文
献；ホング、バイオサイエンスレポートＩ、243（198
1）；クックたのジャーナルオブバイオケミストリー、9
55、6502（1980）；および、ゾーラーら、メソッドスイ
ネンザイモロジー、100、468−500（1983）；クレアら
のニュークレイックアシッズレス、８、2331（1980）；
ナラングら、メソッドエンザイム、68、90（1979）；ビ
ューケージら、テトラヘドロンレターズ、22、1859（19
81）；ブラウンら、メト エンザイム、154、287（198
5）；ヒッツマンら、ジャーナルオブバイオケミストリ
ー、255、2073（1980）；リーら、サイエンス、239、19
88（1988）；ミリガンら、ニュークレイックアシッズ
レス、15、8783（1987）；ミラーらヴィロロジー、236
（1983）；アールクイストら、ジャーナルオブモレキュ
ラーバイオル、153、23（1981）；ミラーら、ネイチャ
ー313、68（1985）；アールクイストら、ジャーナルオ
ブモレキュラーバイオル３、37（1984）；オウら、PNA
S、79、5235（1982）；チュら、ヌークレイックアシッ
ズ レス、14、5591（1986）；ヨーロッパ特許出願公開
第19809号；マーシュら、ポジティブストランドRNAウィ
ルセス、327〜336、アランアール．リス（出版社；ニュ
ーヨーク）（1987;UCLAシンポジウム1986の会議録）；
ミラーら、ジャーナルオブモレキュラーバイオル、18
7、537（1986）；ストックレットら、サイエンス、23
9、491（1988）；クレーマーらジャーナルオブモレキュ
ラーバイオル、89、719（1974）；サリスらヌクレイッ
クアシッズ レス、10、4831（1982）；ブルッセルら、
PANS 80、6523（1983）；およびチューら、ニュークレ
イック アシッズリサーチ、16、3671（1988）；ならび
にこれらに引用されている参考文献を参照のこと。
上記刊行物のすべてはこの記載によって、ここに参考
文献として関係する。
文献として関係する。
「プロモーター」なる用語は、識別した配列に結合し
て、転写プロセスを開始して、RNA転写体を製造するRNA
ポリメラーゼによって特異的に識別される核酸配列（天
然に発生するまたは合成的に製造されるまたは制限消化
の生成物である）を意味する。これは分解プロセスに対
する安定性を与えるために実際の標識部位を越えて伸び
るヌクレオチド塩基を任意に含み、また転写開始部位に
隣接した付加的プラス（＋）ヌクレオチドをも含む。原
則として、いかなるプロモーター配列を用いることがで
き、これに対して開始配列を識別できる公知の、利用可
能なポリメラーゼが存在する。典型的な公知の有用なプ
ロモーターは、例えばバクテリオファージT3、T4または
SP6のようなある種のバクテリオファージポリメラーゼ
によって標識されるプロモーターである。
て、転写プロセスを開始して、RNA転写体を製造するRNA
ポリメラーゼによって特異的に識別される核酸配列（天
然に発生するまたは合成的に製造されるまたは制限消化
の生成物である）を意味する。これは分解プロセスに対
する安定性を与えるために実際の標識部位を越えて伸び
るヌクレオチド塩基を任意に含み、また転写開始部位に
隣接した付加的プラス（＋）ヌクレオチドをも含む。原
則として、いかなるプロモーター配列を用いることがで
き、これに対して開始配列を識別できる公知の、利用可
能なポリメラーゼが存在する。典型的な公知の有用なプ
ロモーターは、例えばバクテリオファージT3、T4または
SP6のようなある種のバクテリオファージポリメラーゼ
によって標識されるプロモーターである。
シーベンリストらのセル、20、269（1980）を参照さ
れたい。これらのポリメラーゼはそれらの結合プロモー
ター配列とともに本発明の実施に用いることのできるポ
リメラーゼの例に過ぎない。
れたい。これらのポリメラーゼはそれらの結合プロモー
ター配列とともに本発明の実施に用いることのできるポ
リメラーゼの例に過ぎない。
本発明の１形式では、プロモーターがリポーター分子
であるので、プロモーターは存在のために、上述したよ
うに他の点では完全に作用可能な、典型的に定義された
二重鎖プロモーターの一重鎖形として定義される。
であるので、プロモーターは存在のために、上述したよ
うに他の点では完全に作用可能な、典型的に定義された
二重鎖プロモーターの一重鎖形として定義される。
本発明の「RNA転写体」は、プロモーター配列のRNAポ
リメラーゼ識別後の転写開始後に製造されるリボ核酸配
列である（上記参照）。このような転写体の製造は、多
かれ少なかれ連続的であり、ポリメラーゼの存在量に一
部依存する。
リメラーゼ識別後の転写開始後に製造されるリボ核酸配
列である（上記参照）。このような転写体の製造は、多
かれ少なかれ連続的であり、ポリメラーゼの存在量に一
部依存する。
本発明における「プライマー」なる用語は、適当なハ
イブリッド化条件下で標的配列とハイブリッド化しう
る、すなわち標的配列と結合しうるように、標的配列と
の十分な相同性を有する核酸配列（天然に発生するまた
は合成的に製造されるまたは制限消化の生成物である）
を意味する。典型的なプライマーは少なくとも約10ヌク
レオチドの長さであり、最も好ましくは約35以上のヌク
レオチド塩基の長さであり、最も好ましい実施態様では
プライマーは標的配列との同一性または非常に高度の相
同性を有する。例えば、ヨーロッパ特許出願第128042号
（1984年12月12日発行）を参照されたい。
イブリッド化条件下で標的配列とハイブリッド化しう
る、すなわち標的配列と結合しうるように、標的配列と
の十分な相同性を有する核酸配列（天然に発生するまた
は合成的に製造されるまたは制限消化の生成物である）
を意味する。典型的なプライマーは少なくとも約10ヌク
レオチドの長さであり、最も好ましくは約35以上のヌク
レオチド塩基の長さであり、最も好ましい実施態様では
プライマーは標的配列との同一性または非常に高度の相
同性を有する。例えば、ヨーロッパ特許出願第128042号
（1984年12月12日発行）を参照されたい。
とくにRNAコード化DNA配列中のプロモーター配列の結
合に関連した「作用可能に結合した」なる用語は、プロ
モーターが適当なポリメラーゼによって標識される場合
に適当なポリメラーゼによって識別される場合に対応RN
A転写体を製造するプロモーターの機能性を意味する
（上記参照）。
合に関連した「作用可能に結合した」なる用語は、プロ
モーターが適当なポリメラーゼによって標識される場合
に適当なポリメラーゼによって識別される場合に対応RN
A転写体を製造するプロモーターの機能性を意味する
（上記参照）。
放射能標識また発色しやすい酵素（chromogenic susc
eptible enzyme）を用いた発色手段によるような検出シ
グナルの形成方法も周知であり、この技術分野に報告さ
れている。
eptible enzyme）を用いた発色手段によるような検出シ
グナルの形成方法も周知であり、この技術分野に報告さ
れている。
本発明のアッセイ方法を実施しうるサンプルは例え
ば、血清その他の体液、組織培養培地または食品のよう
な生物学的物質の未処理試験体（raw specimen）であ
る。さらに典型的には、この方法は未処理試験体から例
えばアフィニティ分子の非特異的結合を誘発するよう
な、標的の検出を妨害する物質を除去する種々な処理に
よって誘導される処理試験体であるサンプルに実施され
る。本発明のアッセイ方法により適したサンプルを得る
ための未処理サンプルの処理方法は、技術上周知であ
る。したがって、この方法はグルンスタインらのプル
ク．ナトル．アンド．サイ（米国）、72、3961（1975）
（米国特許第4,358,535号と第4,562,159号も参照）のコ
ロニーハイブリッド化方法またはベントンらのサイエン
ス196、180（1977）のプラークリフト方法後の細胞から
の核酸に対して実施される。この方法はまた、試験体の
ウィロイド、ウィルスまたは細胞から単離され、固体支
持体に付着した核酸に対しても実施される［ジレスピー
らのジャーナル モル バイオル12、829（1965）］；
この固体支持体は計深棒およびマイクロタイタープレー
ト孔の内壁の固体支持体を含む。この方法はまた、試験
体から単離され、固体支持体上に「ドット」プロット法
によって「カファトスら、ヌクレイックアシッズ レ
ス、７、1541（1797）；ホワイトら、ジャーナル バイ
オル ケム、257、8569（1982）］、サザンプロット法
によって［ジャーナル モル バイオル、98、503（197
5）］、「ノザンプロット法」によって［トーマス、プ
ルク ナトル アカド サイ、77、5201（1980）］およ
びエレクトロプロット法によって［ステルヴィグら、ヌ
クレイックアシッズ レス、８、299（1980）］付着し
た核酸に対して実施される。試験体の核酸は本発明の方
法を水相ハイブリッド化［ブリッテンら、サイエンス、
161、527（1968）］および水／有機中間相ハイブリッド
化［コーンら、バイオケミストリー、16、5329（197
7）］に適用することによって分析することもできる。
水／有機中間相ハイブリッド化は非常に迅速な速度で進
行する利点を有するが、例えば、ビチオンのような有機
相に可溶な結合部分が核酸アフィニティ分子に結合する
場合には不適切である。
ば、血清その他の体液、組織培養培地または食品のよう
な生物学的物質の未処理試験体（raw specimen）であ
る。さらに典型的には、この方法は未処理試験体から例
えばアフィニティ分子の非特異的結合を誘発するよう
な、標的の検出を妨害する物質を除去する種々な処理に
よって誘導される処理試験体であるサンプルに実施され
る。本発明のアッセイ方法により適したサンプルを得る
ための未処理サンプルの処理方法は、技術上周知であ
る。したがって、この方法はグルンスタインらのプル
ク．ナトル．アンド．サイ（米国）、72、3961（1975）
（米国特許第4,358,535号と第4,562,159号も参照）のコ
ロニーハイブリッド化方法またはベントンらのサイエン
ス196、180（1977）のプラークリフト方法後の細胞から
の核酸に対して実施される。この方法はまた、試験体の
ウィロイド、ウィルスまたは細胞から単離され、固体支
持体に付着した核酸に対しても実施される［ジレスピー
らのジャーナル モル バイオル12、829（1965）］；
この固体支持体は計深棒およびマイクロタイタープレー
ト孔の内壁の固体支持体を含む。この方法はまた、試験
体から単離され、固体支持体上に「ドット」プロット法
によって「カファトスら、ヌクレイックアシッズ レ
ス、７、1541（1797）；ホワイトら、ジャーナル バイ
オル ケム、257、8569（1982）］、サザンプロット法
によって［ジャーナル モル バイオル、98、503（197
5）］、「ノザンプロット法」によって［トーマス、プ
ルク ナトル アカド サイ、77、5201（1980）］およ
びエレクトロプロット法によって［ステルヴィグら、ヌ
クレイックアシッズ レス、８、299（1980）］付着し
た核酸に対して実施される。試験体の核酸は本発明の方
法を水相ハイブリッド化［ブリッテンら、サイエンス、
161、527（1968）］および水／有機中間相ハイブリッド
化［コーンら、バイオケミストリー、16、5329（197
7）］に適用することによって分析することもできる。
水／有機中間相ハイブリッド化は非常に迅速な速度で進
行する利点を有するが、例えば、ビチオンのような有機
相に可溶な結合部分が核酸アフィニティ分子に結合する
場合には不適切である。
本発明のアッセイ方法は試験体から単離され、ドット
プロット法、「ウェスターン」プロット法によって、ま
たはマイクロタイタープレート孔壁もしくは計深棒上の
個定支持体上への吸着によって、固体支持体に付着した
蛋白質または多糖に対しても実施される。
プロット法、「ウェスターン」プロット法によって、ま
たはマイクロタイタープレート孔壁もしくは計深棒上の
個定支持体上への吸着によって、固体支持体に付着した
蛋白質または多糖に対しても実施される。
さらに、本発明の方法は試験体からの全細胞の表面上
の細胞蛋白質または多糖の検出、または例えばレプリカ
培養細菌若しくは公募のような、固体支持体上に固定さ
れた微生物からの蛋白質もしくは多糖の検出に適用可能
である。
の細胞蛋白質または多糖の検出、または例えばレプリカ
培養細菌若しくは公募のような、固体支持体上に固定さ
れた微生物からの蛋白質もしくは多糖の検出に適用可能
である。
ここでのバクテリオファージＱβに関する言及は特定
の変異体、突然変異体またはこれらの集団に限定されな
い。このような言及は、他に特に限定されないかぎり、
バクテリオファージＱβ感染されやすい大腸菌感染時に
RNA−依存性RNAポリメラーゼの産生を誘発しうる変異
体、突然変異体またはこれらの集団に関するものであ
る。
の変異体、突然変異体またはこれらの集団に限定されな
い。このような言及は、他に特に限定されないかぎり、
バクテリオファージＱβ感染されやすい大腸菌感染時に
RNA−依存性RNAポリメラーゼの産生を誘発しうる変異
体、突然変異体またはこれらの集団に関するものであ
る。
ファージに感染されやすい細菌感染時に、RNA依存性R
NAポリメラーゼと、試験管内で自己触媒的に複製されう
る、本発明に使用可能な、複製可能な関連RNAとを産生
する他のファージに関しては、例えば、ミヤケらのプロ
ク ナトル アカド サイ、68、2022（1971）を参照さ
れたい。
NAポリメラーゼと、試験管内で自己触媒的に複製されう
る、本発明に使用可能な、複製可能な関連RNAとを産生
する他のファージに関しては、例えば、ミヤケらのプロ
ク ナトル アカド サイ、68、2022（1971）を参照さ
れたい。
アダクツの部分に関する、ここでの「結合した」なる
用語は、共有結合および非共有結合の両方、好ましくは
共有結合を意味する。
用語は、共有結合および非共有結合の両方、好ましくは
共有結合を意味する。
共有結合の例にはとくに次の例がある； （ａ）結合部分がホスフェート基であり、結合がホスフ
ェートとプロモーターオリゴヌクレオチドの５′−ヌク
レオチドの５′炭素との間の直接結合である。プロモー
ターオリゴヌクレオチドの５′−ヌクレオチドの５′炭
素に結合したホスフェート結合部分は、通常プロモータ
ーオリゴヌクレオチドを核酸の３′−ヌクレオチドの
３′−炭素に、または核酸分子の３′−末端に結合する
と考えられる結合部分であり、５′−ヌクレオチドの
５′−炭素におけるホスフェートを介してアフィニティ
分子の３′−ヌクレオチドの３′−炭素に共有結合する
ヌクレオチドのセグメントの３′−ヌクレオチドの３′
−炭素に直接共有結合させることに関係する。または、
プロモーターを有する本発明のアダクツは技術上周知の
方法で全体的に合成される。
ェートとプロモーターオリゴヌクレオチドの５′−ヌク
レオチドの５′炭素との間の直接結合である。プロモー
ターオリゴヌクレオチドの５′−ヌクレオチドの５′炭
素に結合したホスフェート結合部分は、通常プロモータ
ーオリゴヌクレオチドを核酸の３′−ヌクレオチドの
３′−炭素に、または核酸分子の３′−末端に結合する
と考えられる結合部分であり、５′−ヌクレオチドの
５′−炭素におけるホスフェートを介してアフィニティ
分子の３′−ヌクレオチドの３′−炭素に共有結合する
ヌクレオチドのセグメントの３′−ヌクレオチドの３′
−炭素に直接共有結合させることに関係する。または、
プロモーターを有する本発明のアダクツは技術上周知の
方法で全体的に合成される。
（ｂ）結合部分はビオチニルまたはイミノビオチニルで
あり、結合はプロモーターオリゴヌクレオチドの５′−
ヌクレオチドの５′−炭素への、式−NH（CH2）aaNH（P
O2）Ｏ−、式−NH（CH2）bbSS（CH2）ccNH（PO2）Ｏ
−、または式−NH（CH2）cc（CO）（NH）（CH2）ccNH
（PO2）Ｏ−で表されるスペーサ基を介した結合であ
り、各場合にホスホラミデート基が５′−ヌクレオチド
に結合し、アミノ基はビオチニルまたはイミノビオチニ
ルに結合し、aaは２〜20であり、bbとccは同一または異
なる数であり、それぞれ２〜10である。式−NH（CH2）
aaNH（PO2）Ｏ−のスペーサー基を含むプロモーターオ
リゴヌクレオチドはチューとオンゲルのDNA、４、327
（1985）の教示にしたがって製造される。式−NH（C
H2）bbSS（CH2）ccNH（PO2）Ｏ−のスペーサー基を有す
る複製RNAについては例Ｉで述べる。式−NH（CH2）bbSS
（CH2）ccNH（PO2）Ｏ−のスペーサー基を含むプロモー
ターオリゴヌクレオチドは、５′−ヌクレオチドの５′
炭素に結合した式−Ｏ（PO2）NH（CH2）ccNH2の基を含
むプロモーターオリゴヌクレオチドを、式NH2（CH2）bb
COOHのアミノカルボン酸の活性エステルと反応させるこ
とによって得られる。第１アミノ基とのビオチン−アミ
ドまたはイミノビオチン−アミド結合を形成するための
ビオチンまたはイミノビオチンのＮ−ヒドロキシスクシ
ニモエステルの反応は技術上公知である。
あり、結合はプロモーターオリゴヌクレオチドの５′−
ヌクレオチドの５′−炭素への、式−NH（CH2）aaNH（P
O2）Ｏ−、式−NH（CH2）bbSS（CH2）ccNH（PO2）Ｏ
−、または式−NH（CH2）cc（CO）（NH）（CH2）ccNH
（PO2）Ｏ−で表されるスペーサ基を介した結合であ
り、各場合にホスホラミデート基が５′−ヌクレオチド
に結合し、アミノ基はビオチニルまたはイミノビオチニ
ルに結合し、aaは２〜20であり、bbとccは同一または異
なる数であり、それぞれ２〜10である。式−NH（CH2）
aaNH（PO2）Ｏ−のスペーサー基を含むプロモーターオ
リゴヌクレオチドはチューとオンゲルのDNA、４、327
（1985）の教示にしたがって製造される。式−NH（C
H2）bbSS（CH2）ccNH（PO2）Ｏ−のスペーサー基を有す
る複製RNAについては例Ｉで述べる。式−NH（CH2）bbSS
（CH2）ccNH（PO2）Ｏ−のスペーサー基を含むプロモー
ターオリゴヌクレオチドは、５′−ヌクレオチドの５′
炭素に結合した式−Ｏ（PO2）NH（CH2）ccNH2の基を含
むプロモーターオリゴヌクレオチドを、式NH2（CH2）bb
COOHのアミノカルボン酸の活性エステルと反応させるこ
とによって得られる。第１アミノ基とのビオチン−アミ
ドまたはイミノビオチン−アミド結合を形成するための
ビオチンまたはイミノビオチンのＮ−ヒドロキシスクシ
ニモエステルの反応は技術上公知である。
（ｃ）アミノ基結合部分は式−（CH2）aaNH（PO2）Ｏ−
または、式（CH2）bbSS（CH2）ccNH（PO2）Ｏ−のスペ
ーサー基を介して結合した、この場合ホスホラニデート
基はプロモーターオリゴヌクレオチドの５′−ヌクレオ
チドの５′−炭素に結合し、aa、bb、ccは上記で定義し
たとおりである。チューとオンゲルのDNA、４、327の方
法を用いてこのようなプロモーターオリゴヌクレオチド
を製造する。
または、式（CH2）bbSS（CH2）ccNH（PO2）Ｏ−のスペ
ーサー基を介して結合した、この場合ホスホラニデート
基はプロモーターオリゴヌクレオチドの５′−ヌクレオ
チドの５′−炭素に結合し、aa、bb、ccは上記で定義し
たとおりである。チューとオンゲルのDNA、４、327の方
法を用いてこのようなプロモーターオリゴヌクレオチド
を製造する。
（ｄ）硫黄結合部分は式−（CH2）ccNH（PO2）Ｏ−のス
ペーサー基によって結合した、この場合にホスホラニデ
ート基はプロモーターオリゴヌクレオチドの５′−ヌク
レオチドの５′炭素に結合し、ccは上記で定義した通り
である。チューとオンゲルのニュークレイックアシッズ
リサーチ、16、3671（1988）を参照されたい。
ペーサー基によって結合した、この場合にホスホラニデ
ート基はプロモーターオリゴヌクレオチドの５′−ヌク
レオチドの５′炭素に結合し、ccは上記で定義した通り
である。チューとオンゲルのニュークレイックアシッズ
リサーチ、16、3671（1988）を参照されたい。
蛋白質と核酸への結合部分の結合に関する技術上の他
の情報には、下記参考文献がある：例えば、ドレイヤー
らのプロク ナトル アカド サイ、82、968（198
5）；ホルスターらの、ヌクル アシズ レス、13、745
（1984）；ワァードら、ヨーロッパ特許出願公報第0097
373号；アラゴンら、バイオケミストリー、19、4341（1
980）；イマムら、カンサーリサーチ、45、263（198
5）；とくにチューら、ニュークレイックアシッズリサ
ーチ、16、3671（1988） 複製転写体（RNA）は多様な方法で検出することがで
きる。
の情報には、下記参考文献がある：例えば、ドレイヤー
らのプロク ナトル アカド サイ、82、968（198
5）；ホルスターらの、ヌクル アシズ レス、13、745
（1984）；ワァードら、ヨーロッパ特許出願公報第0097
373号；アラゴンら、バイオケミストリー、19、4341（1
980）；イマムら、カンサーリサーチ、45、263（198
5）；とくにチューら、ニュークレイックアシッズリサ
ーチ、16、3671（1988） 複製転写体（RNA）は多様な方法で検出することがで
きる。
特に、例えば、接触フォトプリンティング方法［クタ
テラズら、アナル バイ オケム、100、129（1979）］
にしたがって、複製RNAの紫外線吸収によって行われ
る。
テラズら、アナル バイ オケム、100、129（1979）］
にしたがって、複製RNAの紫外線吸収によって行われ
る。
複製RNAが放射性であるように複製反応に放射能標識
したリボヌクレオシド−５′−トリホスフェート（例え
ば3Ｈ標識またはａ−32PO4標識）を用いることによっ
て、複製RNAをその放射能を用いて多くの公知の方法に
よって検出することができる。
したリボヌクレオシド−５′−トリホスフェート（例え
ば3Ｈ標識またはａ−32PO4標識）を用いることによっ
て、複製RNAをその放射能を用いて多くの公知の方法に
よって検出することができる。
ビオチンまたはイミノビオチンを複製RNA中に導入し
て、次にこれを、RNA結合ビオチンと結合して検出され
やすい色原体の形成を触媒する酵素アビジンまたは酵素
ストレプトアビジンを用いた、公知の方法によって検出
することができる。
て、次にこれを、RNA結合ビオチンと結合して検出され
やすい色原体の形成を触媒する酵素アビジンまたは酵素
ストレプトアビジンを用いた、公知の方法によって検出
することができる。
ビオチンまたはイミノビオチンの導入は、複製反応の
レプリカーゼの基質としてのウラシル部分の炭素−５に
スペーサーを介してビチオニル化するUTPを用いて達成
される。このようなUTPは公知化合物である。さらに、
このようなUTPがＱβレプリカーゼの基質であること、
および炭素−５位に結合したスペーサー基によってビチ
オニル化したウラシルを含むRNAが、それらの合成にこ
のようなUTPを用いることによって、Ｑβレプリカーゼ
触媒複製の鋳型になることが公知である。
レプリカーゼの基質としてのウラシル部分の炭素−５に
スペーサーを介してビチオニル化するUTPを用いて達成
される。このようなUTPは公知化合物である。さらに、
このようなUTPがＱβレプリカーゼの基質であること、
および炭素−５位に結合したスペーサー基によってビチ
オニル化したウラシルを含むRNAが、それらの合成にこ
のようなUTPを用いることによって、Ｑβレプリカーゼ
触媒複製の鋳型になることが公知である。
複製反応から得られるRNAもフォトビオチンアセテー
トを用いてビチオニル化し、次に複製反応でビチオニル
化UTPを用いて合成した複製RNAと同ように、アビジン酵
素アダクツ発色化合物系によって検出することができ
る。
トを用いてビチオニル化し、次に複製反応でビチオニル
化UTPを用いて合成した複製RNAと同ように、アビジン酵
素アダクツ発色化合物系によって検出することができ
る。
複製プロセスから得られるRNAを、T4 RNAリガーゼ触
媒反応を用いて蛍光性であるように改質されたヌクレオ
チドを複製RNAの３′−末端に添加することによって、
蛍光性にすることもできる。コスチック（Cosstick）等
のヌクル．アシズ レス． 12、1791（1984）を参照のこ
と。生成RNAの蛍光を用いて、幾つかの標準方法のいず
れかによってRNAを検出することができる。
媒反応を用いて蛍光性であるように改質されたヌクレオ
チドを複製RNAの３′−末端に添加することによって、
蛍光性にすることもできる。コスチック（Cosstick）等
のヌクル．アシズ レス． 12、1791（1984）を参照のこ
と。生成RNAの蛍光を用いて、幾つかの標準方法のいず
れかによってRNAを検出することができる。
複製RNAの検出に用いられる他の方法には、特異的に
核酸と結合するリポーター物質を複製が行われる系また
は複製RNAをその上で単離する。例えばECTEOLAペーパー
のような、陽荷電サポート（positively charged suppo
rt）等の媒体（medium）に加え、リポーター物質からの
シグナルを測定する。このような物質には例えば「ステ
インズ オール（stains all）」［ダールベルグ（Dahl
berg）等のジェイ．モル．バイオル． 41、139（196
9）］、メチレンブルー［ジングマン（Dingman）等、バ
イオケミストリー 7、659（1968）、およびシルバー ス
テイン［サモンス［Sammons）等、エレクトロ フォレ
シス (Electro phoresis) 2、135（1981）；イグロイ
（Igloi）、アナル．バイオケム 134、184（1983）］が
あり、RNAに結合して蛍光を発生する蛍光発生化合物・
・・例えばシュウ化エチジウム［シャープ（Sharp）
等、バイオケミストリー 12、3055（1973）；バイレイ
（Bailey）等、アナル．バイオケム． 70、75（197
6）］；およびＱβレプリカーゼによる複製の鋳型とな
るRNAに特異的に結合する蛍光発生化合物・・・例えば
フィコビリプロテイン［オイ（Oi）等、ジェイ．セル
バイオル 93、981（1982）；ストリエル（Stryer）
等、米国特許第4,520,110号］、これはＱβレプリカー
ゼのウィルス ザブユニットに結合する。
核酸と結合するリポーター物質を複製が行われる系また
は複製RNAをその上で単離する。例えばECTEOLAペーパー
のような、陽荷電サポート（positively charged suppo
rt）等の媒体（medium）に加え、リポーター物質からの
シグナルを測定する。このような物質には例えば「ステ
インズ オール（stains all）」［ダールベルグ（Dahl
berg）等のジェイ．モル．バイオル． 41、139（196
9）］、メチレンブルー［ジングマン（Dingman）等、バ
イオケミストリー 7、659（1968）、およびシルバー ス
テイン［サモンス［Sammons）等、エレクトロ フォレ
シス (Electro phoresis) 2、135（1981）；イグロイ
（Igloi）、アナル．バイオケム 134、184（1983）］が
あり、RNAに結合して蛍光を発生する蛍光発生化合物・
・・例えばシュウ化エチジウム［シャープ（Sharp）
等、バイオケミストリー 12、3055（1973）；バイレイ
（Bailey）等、アナル．バイオケム． 70、75（197
6）］；およびＱβレプリカーゼによる複製の鋳型とな
るRNAに特異的に結合する蛍光発生化合物・・・例えば
フィコビリプロテイン［オイ（Oi）等、ジェイ．セル
バイオル 93、981（1982）；ストリエル（Stryer）
等、米国特許第4,520,110号］、これはＱβレプリカー
ゼのウィルス ザブユニットに結合する。
レプリカーゼの濃度が鋳型RNAの濃度より高く、リボ
ヌクレオシド−５′−トリホスフェート濃度が限界に達
しないならば、鋳型RNAの濃度はレプリカーゼ触媒RNA複
製中に経済的に指数関数的に増加する。鋳型RNA濃度が
レプリカーゼ濃度以上になった後には、リボヌクレオシ
ド−５′−トリホスフェート濃度が限界に達しないかぎ
り、鋳型RNAは経時的に直線的に増加する。例えばクレ
イマー等（1974）の上記文献参照のこと。
ヌクレオシド−５′−トリホスフェート濃度が限界に達
しないならば、鋳型RNAの濃度はレプリカーゼ触媒RNA複
製中に経済的に指数関数的に増加する。鋳型RNA濃度が
レプリカーゼ濃度以上になった後には、リボヌクレオシ
ド−５′−トリホスフェート濃度が限界に達しないかぎ
り、鋳型RNAは経時的に直線的に増加する。例えばクレ
イマー等（1974）の上記文献参照のこと。
レプリカーゼ触媒複製の条件下で、鋳型濃度が酵素濃
度を越えるまでMDV−1 RNAが36秒毎に倍加することが判
明した。
度を越えるまでMDV−1 RNAが36秒毎に倍加することが判
明した。
レプリカーゼ触媒複製反応系の鋳型RNAの濃度は、一
定反応時間後に鋳型RNAの初期濃度に比例する。複製反
応中常にレプリカーゼ濃度が鋳型濃度を越え（かつリボ
ヌクレオシド−５′−トリホスフェート濃度が限界に達
しない）ならば、反応終了時の鋳型RNAの濃度の対数は
鋳型の初期濃度（反応開始時の濃度）の対数に直接比例
する。レプリカーゼ濃度が鋳型濃度より低下した後は、
リボヌクレオシド−５′−トリホスフェート濃度が限界
に達しないかぎり、反応終了時の鋳型濃度は鋳型の初期
濃度の対数に直接比例する。さらに、鋳型濃度がレプリ
カーゼ濃度に等しくなる点に反応が達するために要する
時間は鋳型の初期濃度の負の対数（negative log）に比
例する。
定反応時間後に鋳型RNAの初期濃度に比例する。複製反
応中常にレプリカーゼ濃度が鋳型濃度を越え（かつリボ
ヌクレオシド−５′−トリホスフェート濃度が限界に達
しない）ならば、反応終了時の鋳型RNAの濃度の対数は
鋳型の初期濃度（反応開始時の濃度）の対数に直接比例
する。レプリカーゼ濃度が鋳型濃度より低下した後は、
リボヌクレオシド−５′−トリホスフェート濃度が限界
に達しないかぎり、反応終了時の鋳型濃度は鋳型の初期
濃度の対数に直接比例する。さらに、鋳型濃度がレプリ
カーゼ濃度に等しくなる点に反応が達するために要する
時間は鋳型の初期濃度の負の対数（negative log）に比
例する。
複製反応を長時間進行させることによって、大きな感
度（sensitivity）が得られる。
度（sensitivity）が得られる。
本発明によるアッセイでは、分析物として試験される
試験サンプルと対照サンプルとの両方に対して、できる
だけ近似した条件下で同時にアッセイを実施する。技術
上自明のことであるように、対照サンプルは分析物（al
alyte）を含まないかまたは既知量の分析物を含む以外
は試験サンプルと同じである。分析物を含まない対照は
「バックグラウンド」を表し、バックグラウンド未満で
は分析物を含まないサンプルと分析物を含むサンプルと
を区別することができない。試験サンプルのアッセイ中
に複製された複製可能なRNAの量または濃度を同時に分
析した対照サンプルによって生成した量または濃度と比
較することによって、試験サンプル中のバックグラウン
ドより高いレベルでの分析物の存在を測定することがで
きる。ある範囲の既知濃度の分析物を含む対照サンプル
を用いる場合には、試験サンプル中の分析物の濃度を算
出することができる。
試験サンプルと対照サンプルとの両方に対して、できる
だけ近似した条件下で同時にアッセイを実施する。技術
上自明のことであるように、対照サンプルは分析物（al
alyte）を含まないかまたは既知量の分析物を含む以外
は試験サンプルと同じである。分析物を含まない対照は
「バックグラウンド」を表し、バックグラウンド未満で
は分析物を含まないサンプルと分析物を含むサンプルと
を区別することができない。試験サンプルのアッセイ中
に複製された複製可能なRNAの量または濃度を同時に分
析した対照サンプルによって生成した量または濃度と比
較することによって、試験サンプル中のバックグラウン
ドより高いレベルでの分析物の存在を測定することがで
きる。ある範囲の既知濃度の分析物を含む対照サンプル
を用いる場合には、試験サンプル中の分析物の濃度を算
出することができる。
本発明のRNA転写体の複製の（自己触媒的）誘発への
［レプリカーゼ」の使用も、技術上周知である。本発明
に有用であるようなレプリカーゼの適当な例には、一定
RNA転写体の３′−末端と５′−末端の両方における一
定核酸配列部位を識別する、いわゆるＱβウイルスレプ
リカーゼ、いわゆるブロム モザイク ウイルス（BM
V）ならびに一定RNA転写体の３′−末端における核酸配
列部位を識別すると考えられるαウイルスレプリカーゼ
がある。これらのレプリカーゼはRNA転写体および補体
を複製すなわち再生して、そのコピーを増加させること
ができる。このような酵素が転写プロセス中に反応の座
（lows）に存在すると、転写中に製造された多重転写体
が複製されて、RNA転写体生成物量が指数関数的に増加
する。
［レプリカーゼ」の使用も、技術上周知である。本発明
に有用であるようなレプリカーゼの適当な例には、一定
RNA転写体の３′−末端と５′−末端の両方における一
定核酸配列部位を識別する、いわゆるＱβウイルスレプ
リカーゼ、いわゆるブロム モザイク ウイルス（BM
V）ならびに一定RNA転写体の３′−末端における核酸配
列部位を識別すると考えられるαウイルスレプリカーゼ
がある。これらのレプリカーゼはRNA転写体および補体
を複製すなわち再生して、そのコピーを増加させること
ができる。このような酵素が転写プロセス中に反応の座
（lows）に存在すると、転写中に製造された多重転写体
が複製されて、RNA転写体生成物量が指数関数的に増加
する。
3.特に好ましい実施態様の詳細な説明 T7 RNAポリメラーゼは開裂可能なリンカーによってオ
リゴヌクレオチドプローブに結合させることができる。
サンプル中に含まれる標的核酸を検定し、過剰な非ハイ
ブリッド化オリゴヌクレオチド−T7 RNAポリメラーゼ
アダクツを洗浄によって除去する。T7 RNAポリメラーゼ
を特に好ましい条件下でリンカーを開裂することによっ
て放出する。サンプル中に含まれる標的分子数は、放出
されるT7 RNAポリメラーゼ分子の分析によって測定され
る。これは例えばMDV1 RNAのような、ＱβRNAポリメラ
ーゼのRNA基質をコードするDNA配列に結合したT7プロモ
ーターから成る二重鎖DNAの転写にT7 RNAポリメラーゼ
分子を用いることによってなされる。複製可能なRNA
は、上記同時係属特許出願に述べられたやり方で、Ｑβ
RNAポリメラーゼを用いて分析される。この２先行酵素
段階単一ポット反応として実施することが特に好まし
い。開裂反応後に酵素がまだ活性であるように、開裂可
能なリンカーによってT7 RNAポリメラーゼにオリゴヌク
レオチド プローブを共有結合させる方法は、チュー等
がニュークレエイック アシズ リサーチ 16、3671
（1988）に述べている方法に従って行われる。この方法
には開裂不能リンカーの使用、ハイブリッド化プローブ
−T7 RNAポリメラーゼ アダクツの熱的変性（thermal
denaturation）による溶液中への放出をも含む。この方
法は明白に抗体依存性アッセイに進展する。
リゴヌクレオチドプローブに結合させることができる。
サンプル中に含まれる標的核酸を検定し、過剰な非ハイ
ブリッド化オリゴヌクレオチド−T7 RNAポリメラーゼ
アダクツを洗浄によって除去する。T7 RNAポリメラーゼ
を特に好ましい条件下でリンカーを開裂することによっ
て放出する。サンプル中に含まれる標的分子数は、放出
されるT7 RNAポリメラーゼ分子の分析によって測定され
る。これは例えばMDV1 RNAのような、ＱβRNAポリメラ
ーゼのRNA基質をコードするDNA配列に結合したT7プロモ
ーターから成る二重鎖DNAの転写にT7 RNAポリメラーゼ
分子を用いることによってなされる。複製可能なRNA
は、上記同時係属特許出願に述べられたやり方で、Ｑβ
RNAポリメラーゼを用いて分析される。この２先行酵素
段階単一ポット反応として実施することが特に好まし
い。開裂反応後に酵素がまだ活性であるように、開裂可
能なリンカーによってT7 RNAポリメラーゼにオリゴヌク
レオチド プローブを共有結合させる方法は、チュー等
がニュークレエイック アシズ リサーチ 16、3671
（1988）に述べている方法に従って行われる。この方法
には開裂不能リンカーの使用、ハイブリッド化プローブ
−T7 RNAポリメラーゼ アダクツの熱的変性（thermal
denaturation）による溶液中への放出をも含む。この方
法は明白に抗体依存性アッセイに進展する。
サンプル中の標的核酸は２種類の亜配列（subsequenc
e）：（１）標的配列の補体配列と（２）T7 RNAポリメ
ラーゼのプロモーターの適当な一重鎖［マイナス鎖（mi
nus strand）］を含むオリゴヌクレオチド アダクツを
用いて検定する。過剰な非ハイブリッド化アダクツは洗
浄によって除去する。ハイブリッド化物質を次に標的核
酸から、単純な変性によっておよび／または標的に大き
なアフィニティを有するオリゴジオキシヌクレオチドを
用いた置換による放出する。または、２亜配列が開裂可
能なリンカー（例えば、ジスルフィド結合）によって結
合している場合には、T7プロモーターに相補的である部
分を化学的方法によって放出して、標的に結合した残り
の部分を残す。
e）：（１）標的配列の補体配列と（２）T7 RNAポリメ
ラーゼのプロモーターの適当な一重鎖［マイナス鎖（mi
nus strand）］を含むオリゴヌクレオチド アダクツを
用いて検定する。過剰な非ハイブリッド化アダクツは洗
浄によって除去する。ハイブリッド化物質を次に標的核
酸から、単純な変性によっておよび／または標的に大き
なアフィニティを有するオリゴジオキシヌクレオチドを
用いた置換による放出する。または、２亜配列が開裂可
能なリンカー（例えば、ジスルフィド結合）によって結
合している場合には、T7プロモーターに相補的である部
分を化学的方法によって放出して、標的に結合した残り
の部分を残す。
T7プロモーターの補体である放出DNAは上首尾なハイ
ブリッド化段階のためのリポーター分子として役立つ。
このDNAをＱβRNAポリメラーゼのRNA基質をコードする
配列に結合したT7プロモーターの（プラス）鎖を含む一
重鎖DNA分子にハイブリッド化させる。このハイブリッ
ド化生成物はRNA転写体をコードする一重鎖鋳型に結合
した機能的二重鎖T7プロモーターである。
ブリッド化段階のためのリポーター分子として役立つ。
このDNAをＱβRNAポリメラーゼのRNA基質をコードする
配列に結合したT7プロモーターの（プラス）鎖を含む一
重鎖DNA分子にハイブリッド化させる。このハイブリッ
ド化生成物はRNA転写体をコードする一重鎖鋳型に結合
した機能的二重鎖T7プロモーターである。
T7 RNAポリメラーゼはこの二重鎖プロモーターに結合
し、一重鎖鋳型を転写し続ける［ミリガン（Milligan）
等のニュークレエイック アシズ リサーチ 15、8783
（1987）を参照のこと］。生成したRNAは上記特許出願
に述べられている通りに、ＱβRNAポリメラーゼを用い
て分析される。
し、一重鎖鋳型を転写し続ける［ミリガン（Milligan）
等のニュークレエイック アシズ リサーチ 15、8783
（1987）を参照のこと］。生成したRNAは上記特許出願
に述べられている通りに、ＱβRNAポリメラーゼを用い
て分析される。
4.実施例 参考例１ T7 RNAポリメラーゼとＱβRNAポリメラーゼとを用い
て、上首尾な標的ハイブリッド化段階によって発生され
たシグナルを増幅することを例示する。T7ポリメラーゼ
は次の有用な性質を有するDNA−依存性RNAポリメラーゼ
である： （１）T7プロモーターに隣接した部位において特異的に
作用を開始する； （２）開始されたならば、この酵素は一重鎖または二重
鎖鋳型のいずれかに作用する； （３）この酵素は高いターンオーバー速度（turn over
rate）を有し、DNA鋳型１モルにつき200〜1200モルのRN
A転写体を製造する； （４）T7 RNAポリメラーゼ遺伝子をクローン化し、これ
を比較的真直ぐにすると、非常に多量（２〜10MV）の酵
素が製造される； T7 ウイルスゲノムのクラスIII（高効率）プロモーター
は全て、−17〜＋３までの共通20塩基対を有する： ＋３位置を越えると、鋳型は転写効率に不利な影響を
与えず、一重鎖として存在する。合成は配列GGGから開
始され、５′−３′方向に進む。鋳型は転写生成物がMD
V−1RNAの（＋）鎖であるように設計される。MDV−１
（＋）RNAはその５′末端からの配列GGGから開始され、
221ヌクレオチドを含む。これはＱβRNAポリメラーゼ、
その基質のRNAの自己触媒増幅を実施するRNA依存性RNA
ポリメラーゼの理想的な基質として役立つ。T7 RNAポリ
メラーゼ素をＱβRNAポリメラーゼ素と結合すると、稀
有な分子イベント（rare molecular ivent）によって発
生するシグナルを増幅させる非常に強力なツールにな
る。
て、上首尾な標的ハイブリッド化段階によって発生され
たシグナルを増幅することを例示する。T7ポリメラーゼ
は次の有用な性質を有するDNA−依存性RNAポリメラーゼ
である： （１）T7プロモーターに隣接した部位において特異的に
作用を開始する； （２）開始されたならば、この酵素は一重鎖または二重
鎖鋳型のいずれかに作用する； （３）この酵素は高いターンオーバー速度（turn over
rate）を有し、DNA鋳型１モルにつき200〜1200モルのRN
A転写体を製造する； （４）T7 RNAポリメラーゼ遺伝子をクローン化し、これ
を比較的真直ぐにすると、非常に多量（２〜10MV）の酵
素が製造される； T7 ウイルスゲノムのクラスIII（高効率）プロモーター
は全て、−17〜＋３までの共通20塩基対を有する： ＋３位置を越えると、鋳型は転写効率に不利な影響を
与えず、一重鎖として存在する。合成は配列GGGから開
始され、５′−３′方向に進む。鋳型は転写生成物がMD
V−1RNAの（＋）鎖であるように設計される。MDV−１
（＋）RNAはその５′末端からの配列GGGから開始され、
221ヌクレオチドを含む。これはＱβRNAポリメラーゼ、
その基質のRNAの自己触媒増幅を実施するRNA依存性RNA
ポリメラーゼの理想的な基質として役立つ。T7 RNAポリ
メラーゼ素をＱβRNAポリメラーゼ素と結合すると、稀
有な分子イベント（rare molecular ivent）によって発
生するシグナルを増幅させる非常に強力なツールにな
る。
例２ M13mp8（＋）鎖DNA配列の一部である標的配列 標的配列 ５′−GTTGTGTGGAAT−３′ （Ｔ）を検出
する。Ｔ′（Ｔの補体）を開裂可能なジスルフィド結合
によってT7 RNAポリメラーゼに結合させ、このプローブ
−酵素アダクツによって標的を検出し、過剰なアダクツ
を洗浄し、T7 RNAポリメラーゼをプローブから放出し、
これを用いてMDV−１をコードするDNAに結合したT7プロ
モーターから成る二重鎖DNAを転写する。
する。Ｔ′（Ｔの補体）を開裂可能なジスルフィド結合
によってT7 RNAポリメラーゼに結合させ、このプローブ
−酵素アダクツによって標的を検出し、過剰なアダクツ
を洗浄し、T7 RNAポリメラーゼをプローブから放出し、
これを用いてMDV−１をコードするDNAに結合したT7プロ
モーターから成る二重鎖DNAを転写する。
M13mp8（＋）鎖DNAの配列の一部である標的配列
５′−GTTGTGTGGAATTGTG−３′ （Ｔ）検出する。Ｔ′
（Ｔの補体）はプロモーターの（−）鎖に結合する。本
発明の一般原理を用いて、適当なアッセイで製造された
MDV−1 RNAの製造を検出することによってＴを検出す
る。
５′−GTTGTGTGGAATTGTG−３′ （Ｔ）検出する。Ｔ′
（Ｔの補体）はプロモーターの（−）鎖に結合する。本
発明の一般原理を用いて、適当なアッセイで製造された
MDV−1 RNAの製造を検出することによってＴを検出す
る。
標的（プローブ）５′−CACAATTCCACACAAC−３′（配
列１）とプロモーターの（−）鎖５′−TAATACGACTCACT
ATAGGG−３′（配列２）との補体をRNAシンセサイザー
を用いて公知の固相ホスホアミジド（phospho amidit
e）によって合成する。
列１）とプロモーターの（−）鎖５′−TAATACGACTCACT
ATAGGG−３′（配列２）との補体をRNAシンセサイザー
を用いて公知の固相ホスホアミジド（phospho amidit
e）によって合成する。
プローブ−T7 RNAポリメラーゼアダクツの製造 公知の固相ホスホアミジト法によって合成されたプロ
ーブ、５′−ATTCCACACAAC−３をT7 RNAポリメラーゼに
前記方法［チュー等ニュークレエイック アシズ リサ
ーチ 16、3671（1988）］を用いてジスルフィド結合に
よって結合する。T7 RNAポリメラーゼを最初にイミノチ
オランによってチオール化し、次に５′−２−（pyr）
−SS−Ｐ−５′−ATTCCACACAACと反応させてアダクツを
得る。
ーブ、５′−ATTCCACACAAC−３をT7 RNAポリメラーゼに
前記方法［チュー等ニュークレエイック アシズ リサ
ーチ 16、3671（1988）］を用いてジスルフィド結合に
よって結合する。T7 RNAポリメラーゼを最初にイミノチ
オランによってチオール化し、次に５′−２−（pyr）
−SS−Ｐ−５′−ATTCCACACAACと反応させてアダクツを
得る。
T7 RNAポリメラーゼ−SS−CH2−CH2−Ｐ−５′−ATTCCA
CACAAC. T7 RNAポリメラーゼのチオール化方法は例３で抗−ル
ベラIgG（anti−rubella IgG）のチオール化に関して述
べた方法と同じである。５′−（２−pyr）−SS−Ｐ−
５′−ATTCCACACAACを例３で５′−（２−pyr）−SS−
５′−Ｐ−プロモータ．補体の製造に関して述べた通り
に合成する。
CACAAC. T7 RNAポリメラーゼのチオール化方法は例３で抗−ル
ベラIgG（anti−rubella IgG）のチオール化に関して述
べた方法と同じである。５′−（２−pyr）−SS−Ｐ−
５′−ATTCCACACAACを例３で５′−（２−pyr）−SS−
５′−Ｐ−プロモータ．補体の製造に関して述べた通り
に合成する。
M13mp8（＋）鎖DNA配列の一部である標的配列５′−G
TTGTGTGGAATTGTG−３′（Ｔ）を検出する。Ｔ′（Ｔの
補体）をT7 RNAポリメラーゼに結合させて、本発明の一
般原理を用いて、適当なアッセイ中に生じたMDV−1 RNA
の製造を検出することによってＴを検出する。
TTGTGTGGAATTGTG−３′（Ｔ）を検出する。Ｔ′（Ｔの
補体）をT7 RNAポリメラーゼに結合させて、本発明の一
般原理を用いて、適当なアッセイ中に生じたMDV−1 RNA
の製造を検出することによってＴを検出する。
プロモーターのマイナス鎖へのプローブの結合は次の
２方法によって実施する： （１）通常のホスホジエステル結合によって、次の配列
をDNAシンセサイザー中で合成する： （２）開裂可能なジスルフィド結合によって次のアダク
ツを製造する： アダクツはチュー等ニュークレエイック アシズ リ
サーチ 16、3671（1988）が述べている通りに形成す
る。配列１と２はポリヌクレオチド キナーゼとATPと
を用いて５′−のホスフェート誘導体に転化させる。
５′−ホスフェート誘導体（0.1〜100DU）を0.1M 1−メ
チルイミダゾール、0.15M 1−エチル−3,3−ジメチルア
ミノプロピル カルボジイミドおよび0.5Mシスタミンに
よるpH7、50℃における２時間の処理によって５′−シ
スタミンに転化させる。５′−シスタミン誘導体をRPC
−55上でのHPLCまたは変性ゲル電気泳動によって精製す
る。配列２の ５′−シスタミン誘導体１μＭと配列１
の 5′−シスタミン誘導体５〜８μＭとを含む混合物を
トリス−EDTAバッファー中5mMDTTによってpH7.2におい
て室温で１時間処理する。次に、反応混合物を0.1mM DT
T、1mMトリスおよび0.1mM EDTAを含むバッファーに対し
てpH7.2において30分間透析し、次に1mM トリスと0.1m
M EDTAとを含む新たなバッファ（pH7.2）に対してさら
に30分間透析する。次に混合物を必要に応じて、スピー
ド−バク（Speed−vac）濃縮器で濃縮し、プローブ−プ
ロモーター補体アダクツをゲル電気泳動で精製する。
２方法によって実施する： （１）通常のホスホジエステル結合によって、次の配列
をDNAシンセサイザー中で合成する： （２）開裂可能なジスルフィド結合によって次のアダク
ツを製造する： アダクツはチュー等ニュークレエイック アシズ リ
サーチ 16、3671（1988）が述べている通りに形成す
る。配列１と２はポリヌクレオチド キナーゼとATPと
を用いて５′−のホスフェート誘導体に転化させる。
５′−ホスフェート誘導体（0.1〜100DU）を0.1M 1−メ
チルイミダゾール、0.15M 1−エチル−3,3−ジメチルア
ミノプロピル カルボジイミドおよび0.5Mシスタミンに
よるpH7、50℃における２時間の処理によって５′−シ
スタミンに転化させる。５′−シスタミン誘導体をRPC
−55上でのHPLCまたは変性ゲル電気泳動によって精製す
る。配列２の ５′−シスタミン誘導体１μＭと配列１
の 5′−シスタミン誘導体５〜８μＭとを含む混合物を
トリス−EDTAバッファー中5mMDTTによってpH7.2におい
て室温で１時間処理する。次に、反応混合物を0.1mM DT
T、1mMトリスおよび0.1mM EDTAを含むバッファーに対し
てpH7.2において30分間透析し、次に1mM トリスと0.1m
M EDTAとを含む新たなバッファ（pH7.2）に対してさら
に30分間透析する。次に混合物を必要に応じて、スピー
ド−バク（Speed−vac）濃縮器で濃縮し、プローブ−プ
ロモーター補体アダクツをゲル電気泳動で精製する。
標的サンプルの製造 M13mp8DNA（＋）鎖DNA（7229塩基）、1fg、10fg、100
fg、1pg、10pg、100pg（４×10-7fmole〜４×10-5pmol
e）を200μｌに希釈して、10mMトリス、1mM EDTA、100m
M NaClを含む最終溶液（pH7.5）を得た。次に、3M NaOH
20μｌを加え、溶液を30分間60〜70℃においてインキ
ュベートした。冷却後に、溶液を2M酢酸アンモニウム
（pH7.0）200μｌで中和する。DNAを水とmM酢酸アンモ
ニウムで予め湿らせたニトロセルロース ペーパー上に
マニホルド スロット ブロッターによってスロット−
ブロットする。このペーパーを80℃の真空炉内で１時間
焼成する。
fg、1pg、10pg、100pg（４×10-7fmole〜４×10-5pmol
e）を200μｌに希釈して、10mMトリス、1mM EDTA、100m
M NaClを含む最終溶液（pH7.5）を得た。次に、3M NaOH
20μｌを加え、溶液を30分間60〜70℃においてインキ
ュベートした。冷却後に、溶液を2M酢酸アンモニウム
（pH7.0）200μｌで中和する。DNAを水とmM酢酸アンモ
ニウムで予め湿らせたニトロセルロース ペーパー上に
マニホルド スロット ブロッターによってスロット−
ブロットする。このペーパーを80℃の真空炉内で１時間
焼成する。
ハイブリッド化と放出 M13mp8（＋）鎖DNAを含むニトロセルロース ブロッ
トを100μg/mlのランダム開裂RNAを含むハイブリッド化
バッファー（900mM NaCl、6mM EDTA、90mMトリス、pH7.
5、0.1％SDS）中で25℃において１時間予備ハイブリッ
ド化する。次に、プローブ−T7 RNAポリメラーゼアダク
ツ１μg/mlによるハイブリッド化を25℃において１時間
実施する。ブロットを180mM NaClと18mM NaClを含むバ
ッファーで２回洗浄する。T7 RNAポリメラーゼをブロッ
ト スロットのトリス−EDTAバッファー中10mM DTTの30
μｌによる30分間のインキュベーションによって、ブロ
ットから放出する。放出ポリメラーゼを次に、MDV−1RN
AをコードするDNAに結合した二重鎖T7プロモーター1pmo
le、ＱβRNAポリメラーゼ0.5μｇ、12mM MgCl2、2mMス
ペルミジン、10mM DTTおよび50mMトリスを含む溶液（pH
7.5）中に加える。次に4dNTPを各1mMずつ含む溶液10μ
ｌを加え、全量を60μｌにする。一緒にした混合物を37
℃において20分間インキュベートし、次にMDV−１の製
造に関して分析する。
トを100μg/mlのランダム開裂RNAを含むハイブリッド化
バッファー（900mM NaCl、6mM EDTA、90mMトリス、pH7.
5、0.1％SDS）中で25℃において１時間予備ハイブリッ
ド化する。次に、プローブ−T7 RNAポリメラーゼアダク
ツ１μg/mlによるハイブリッド化を25℃において１時間
実施する。ブロットを180mM NaClと18mM NaClを含むバ
ッファーで２回洗浄する。T7 RNAポリメラーゼをブロッ
ト スロットのトリス−EDTAバッファー中10mM DTTの30
μｌによる30分間のインキュベーションによって、ブロ
ットから放出する。放出ポリメラーゼを次に、MDV−1RN
AをコードするDNAに結合した二重鎖T7プロモーター1pmo
le、ＱβRNAポリメラーゼ0.5μｇ、12mM MgCl2、2mMス
ペルミジン、10mM DTTおよび50mMトリスを含む溶液（pH
7.5）中に加える。次に4dNTPを各1mMずつ含む溶液10μ
ｌを加え、全量を60μｌにする。一緒にした混合物を37
℃において20分間インキュベートし、次にMDV−１の製
造に関して分析する。
ニトロセルロース ブロットを、ランダムに開裂した
RNA100μg/mlを含むハイブリッド化バッファー（900mM
NaCl、6mM EDTA、90mMトリス pH7.5、0.1％SDS）中で3
0℃において１時間予備ハイブリッド化する。次にプロ
ーブ−プロモーター補体アダクツ1ng/mlによるハイブリ
ッド化を45℃において１時間実施する。次にブロットを
180mM NaClを含む室温のバッファーで２回洗浄し、18mM
NaClを含む30℃のバッファーでさらに洗浄する。
RNA100μg/mlを含むハイブリッド化バッファー（900mM
NaCl、6mM EDTA、90mMトリス pH7.5、0.1％SDS）中で3
0℃において１時間予備ハイブリッド化する。次にプロ
ーブ−プロモーター補体アダクツ1ng/mlによるハイブリ
ッド化を45℃において１時間実施する。次にブロットを
180mM NaClを含む室温のバッファーで２回洗浄し、18mM
NaClを含む30℃のバッファーでさらに洗浄する。
ホスホジエステル結合によって結合したプローブ−プ
ロモーター補体を沸騰バッファー30μｌ中で標的スロッ
トから放出させ、室温において15分間冷却する。ジスル
フィド結合よってプロモーター補体に結合したプローブ
は標的スロットのトリス−EDTAバッファー中10mM DDT 3
0μｌによる30℃、１時間のインキュベーションによっ
て放出される。
ロモーター補体を沸騰バッファー30μｌ中で標的スロッ
トから放出させ、室温において15分間冷却する。ジスル
フィド結合よってプロモーター補体に結合したプローブ
は標的スロットのトリス−EDTAバッファー中10mM DDT 3
0μｌによる30℃、１時間のインキュベーションによっ
て放出される。
放出プロモーターのハイブリッド化 T7プロモーターのマイナス鎖を含む放出DNAは上首尾
な標的ハイブリッド化段階のリポーターとして役立つ。
このDNAを次に、MDV−1RNAをコードする221ヌクレオチ
ド配列に結合したT7プロモーターの17ヌクレオチド
（＋）鎖を含む一重鎖DNA分子にハイブリッド化させ
る。ハイブリッド化は1pmole（100ng）T7プロモーターM
DV−1 DNA、12mM MgCl2、2mMスペルミジンおよび50mMト
リスを含む40μｌ量中で生ずる。この混合物を65℃にお
いて５分間加熱し、次に５〜10分間にわたって30℃に冷
却する。20μｇ（100V）T7 RNAポリメラーゼ、0.5μgQ
βRNAポリメラーゼ、12mM MgCl2、2mMスペルミジン、10
mM DTT、50mMトリス（pH7.5）および4NTPの各々1mMを加
え、全量を60μｌにする。一緒にした混合物を37℃にお
いて20分間インキュベートし、MDV−1 RNAの製造に関し
て分析する。
な標的ハイブリッド化段階のリポーターとして役立つ。
このDNAを次に、MDV−1RNAをコードする221ヌクレオチ
ド配列に結合したT7プロモーターの17ヌクレオチド
（＋）鎖を含む一重鎖DNA分子にハイブリッド化させ
る。ハイブリッド化は1pmole（100ng）T7プロモーターM
DV−1 DNA、12mM MgCl2、2mMスペルミジンおよび50mMト
リスを含む40μｌ量中で生ずる。この混合物を65℃にお
いて５分間加熱し、次に５〜10分間にわたって30℃に冷
却する。20μｇ（100V）T7 RNAポリメラーゼ、0.5μgQ
βRNAポリメラーゼ、12mM MgCl2、2mMスペルミジン、10
mM DTT、50mMトリス（pH7.5）および4NTPの各々1mMを加
え、全量を60μｌにする。一緒にした混合物を37℃にお
いて20分間インキュベートし、MDV−1 RNAの製造に関し
て分析する。
複製RNAの検出 RNA量をその固有UV吸光度によって測定する［例えば
クタテラヅ等のアナル．バイオケム．100、129（1979）
による接触フォトプリンティング法によって］。また
は、RNAをETEOLAペーパー上で可視化する。複製反応の
アリコート（等量）を13、48または96フィンガー アリ
コッター（fingered aliquotter）によって、ジエチル
アミノエチルセルロース ペーパーのシート上に移す。
このシートを次に室温において200mM NaCl、300mM酢酸
アンモニウムの溶液（pH6）中で洗浄して、RNAに含まれ
ないリボヌクレオシドを除去する。次にシートをシュウ
化エチジウムの0.3μg/mlによって染色する。［シャー
プ等、バイオケミストリー 12 3055（1973）；バイレ
イ等、アナル．バイオケム． 70 75（1976）］ 最後に、個々のブロットからの蛍光をいずれかの公知
の方法によって測定する。対照ブロットより大きい染色
ブロットからの蛍光強度は分析物の存在を示す。シュウ
化エチジウムの代わりに他の染料を用いることもでき
る。これらの染料にはメチレンブルー［ジニングマン
（Dingman）とピーコック（peacock）、バイオケミスト
リー ７、659（1968）］、シルバーステイン［サモン
ス等、エレクトロフォレシス ２、135（1981）］また
はフィコビリプロティンＱβレプリカーゼ活性体［オイ
等、ジェイ．セル．バイオル．93 981（1982）］があ
る。
クタテラヅ等のアナル．バイオケム．100、129（1979）
による接触フォトプリンティング法によって］。また
は、RNAをETEOLAペーパー上で可視化する。複製反応の
アリコート（等量）を13、48または96フィンガー アリ
コッター（fingered aliquotter）によって、ジエチル
アミノエチルセルロース ペーパーのシート上に移す。
このシートを次に室温において200mM NaCl、300mM酢酸
アンモニウムの溶液（pH6）中で洗浄して、RNAに含まれ
ないリボヌクレオシドを除去する。次にシートをシュウ
化エチジウムの0.3μg/mlによって染色する。［シャー
プ等、バイオケミストリー 12 3055（1973）；バイレ
イ等、アナル．バイオケム． 70 75（1976）］ 最後に、個々のブロットからの蛍光をいずれかの公知
の方法によって測定する。対照ブロットより大きい染色
ブロットからの蛍光強度は分析物の存在を示す。シュウ
化エチジウムの代わりに他の染料を用いることもでき
る。これらの染料にはメチレンブルー［ジニングマン
（Dingman）とピーコック（peacock）、バイオケミスト
リー ７、659（1968）］、シルバーステイン［サモン
ス等、エレクトロフォレシス ２、135（1981）］また
はフィコビリプロティンＱβレプリカーゼ活性体［オイ
等、ジェイ．セル．バイオル．93 981（1982）］があ
る。
例３ 風疹抗原に最近暴露された患者において風疹抗体を検
出する。風疹抗原を塗布したマイクロタイター孔を患者
から単離したIgGの1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000
および1:3000希釈物の50μアリコート／孔によって室温
において３時間インキュベートする。希釈物はリン酸緩
衝生理食塩水中５％ウマ血清を用いて製造する。次に、
プレートをツィーン（Tween）20−NaClによって完全に
洗浄する。次に、各孔にジスルフィド結合によってT7 R
NAポリメラーゼに結合した抗風疹IgG 1μg/mlを含む溶
液50μｌを加える。室温において２時間インキュベーシ
ョンした後に、プレートをNaCl−ツィーン20によって３
回洗浄する。次に、トリス−EDTAバッファー中100mM DD
T 30μｌの溶液を孔に加え、室温において１時間インキ
ュベートする。放出されたT7 RNAポリメラーゼを次に例
２に述べたように分析する。
出する。風疹抗原を塗布したマイクロタイター孔を患者
から単離したIgGの1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000
および1:3000希釈物の50μアリコート／孔によって室温
において３時間インキュベートする。希釈物はリン酸緩
衝生理食塩水中５％ウマ血清を用いて製造する。次に、
プレートをツィーン（Tween）20−NaClによって完全に
洗浄する。次に、各孔にジスルフィド結合によってT7 R
NAポリメラーゼに結合した抗風疹IgG 1μg/mlを含む溶
液50μｌを加える。室温において２時間インキュベーシ
ョンした後に、プレートをNaCl−ツィーン20によって３
回洗浄する。次に、トリス−EDTAバッファー中100mM DD
T 30μｌの溶液を孔に加え、室温において１時間インキ
ュベートする。放出されたT7 RNAポリメラーゼを次に例
２に述べたように分析する。
ジスルフィド結合によって結合した抗風疹IgG−T7 RN
Aポリメラーゼアダクツの合成は米国出願第852,692号と
キング（King）等のバイオケミストリー 17、1499（19
78）に述べられている通りに実施する。抗風疹IgGを最
初にイミノ−チオランによってチオール化し、次に（２
−pyr）−SS−T7 RNAポリメラーゼと反応させて、ジス
ルフィド結合アダクツを得る： IgG−SS−T7 RNAポリメラーゼ チオール化抗風疹IgGの製造では、風疹抗IgG200mgを6
0mMトリエチルアミン、7mMホスフェート、100mM NaClお
よび1mM EDTMを含むバッファー中の1mMイミノチオラン
と、pH8、０℃において１時間反応させる［ブラットラ
ー（Blattler）等、バイオケミストリー 24、1517（19
85）］。チオール化蛋白質を未反応イミノチオランから
ゲルろ過によって分離し、窒素下に保存する。
Aポリメラーゼアダクツの合成は米国出願第852,692号と
キング（King）等のバイオケミストリー 17、1499（19
78）に述べられている通りに実施する。抗風疹IgGを最
初にイミノ−チオランによってチオール化し、次に（２
−pyr）−SS−T7 RNAポリメラーゼと反応させて、ジス
ルフィド結合アダクツを得る： IgG−SS−T7 RNAポリメラーゼ チオール化抗風疹IgGの製造では、風疹抗IgG200mgを6
0mMトリエチルアミン、7mMホスフェート、100mM NaClお
よび1mM EDTMを含むバッファー中の1mMイミノチオラン
と、pH8、０℃において１時間反応させる［ブラットラ
ー（Blattler）等、バイオケミストリー 24、1517（19
85）］。チオール化蛋白質を未反応イミノチオランから
ゲルろ過によって分離し、窒素下に保存する。
チオール化抗風疹IgG4.5μＭと（２−pyr）−SS−T7
RNAポリメラーゼ9.0μＭとを含む溶液400μｌを、1mM E
DTMを含む0.1M Na2（PO4）バッファー（pH6.6）中で25
℃において17時間反応させる。これを次に、バイオゲル
Ｐ−300カラムに塗布し、0.1M Na2（PO4）バッファー
（pH7.0）によって溶出させる。縮合生成物を未反応出
発物質からサイズに基づいて分離する。
RNAポリメラーゼ9.0μＭとを含む溶液400μｌを、1mM E
DTMを含む0.1M Na2（PO4）バッファー（pH6.6）中で25
℃において17時間反応させる。これを次に、バイオゲル
Ｐ−300カラムに塗布し、0.1M Na2（PO4）バッファー
（pH7.0）によって溶出させる。縮合生成物を未反応出
発物質からサイズに基づいて分離する。
例４ 風疹抗原に最近暴露された患者において風疹抗体を検
出する。風疹抗原を塗布したマイクロタイター孔を患者
から単離したIgGの1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000
および1:3000希釈物の50μｌアリコート／孔によって、
室温において３時間インキュベートする。希釈物はリン
酸緩衝生理食塩水中５％ウマ血清を用いて製造する。次
にプレートをツィーン20−NaClによって完全に洗浄す
る。次に各孔にジスルフィド結合によってプロモーター
のマイナス鎖に結合した抗風疹IgG1μg/ml含有溶液50μ
ｌを加える。室温において２時間インキュベートした後
に、プレートをNaCl−ツィーン20によって３回洗浄す
る。次に、トリス−EDTAバッファー中100mM DDT30μｌ
の溶液を孔に加え、室温において１時間インキュベート
する。プロモーターの放出マイナス鎖を次に、例２に述
べたように分析する。
出する。風疹抗原を塗布したマイクロタイター孔を患者
から単離したIgGの1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000
および1:3000希釈物の50μｌアリコート／孔によって、
室温において３時間インキュベートする。希釈物はリン
酸緩衝生理食塩水中５％ウマ血清を用いて製造する。次
にプレートをツィーン20−NaClによって完全に洗浄す
る。次に各孔にジスルフィド結合によってプロモーター
のマイナス鎖に結合した抗風疹IgG1μg/ml含有溶液50μ
ｌを加える。室温において２時間インキュベートした後
に、プレートをNaCl−ツィーン20によって３回洗浄す
る。次に、トリス−EDTAバッファー中100mM DDT30μｌ
の溶液を孔に加え、室温において１時間インキュベート
する。プロモーターの放出マイナス鎖を次に、例２に述
べたように分析する。
ジスルフィド結合によって結合した抗風疹IgGプロモ
ーターマイナス鎖アダクツの合成は、上記米国出願第85
2,692号に述べられた通りに実施する。抗風疹IgGを最初
にイミノチオランによってチオール化し、次に５′−
（２−pyr）−SS−Ｐ配列２と反応させて、ジスルフィ
ド結合アダクツを得る： IgG−SS−CH2CH2−Ｐ−５′−プロモーター補体 風疹抗IgG200μｇを、60mMトリエチルアミン、7mMホ
スフェート、100mM NaClおよび1mM EDTAを含むバッファ
ー中1mMイミノチオランとpH8および０℃において１時間
反応させる。［ブラッター等、バイオケミストリー 2
4、1517（1985）］。IgG1モルにつきチオール１モルを
含むチオール化抗体を未反応イミノチオランからゲルろ
過によって分離し、窒素下に貯える。
ーターマイナス鎖アダクツの合成は、上記米国出願第85
2,692号に述べられた通りに実施する。抗風疹IgGを最初
にイミノチオランによってチオール化し、次に５′−
（２−pyr）−SS−Ｐ配列２と反応させて、ジスルフィ
ド結合アダクツを得る： IgG−SS−CH2CH2−Ｐ−５′−プロモーター補体 風疹抗IgG200μｇを、60mMトリエチルアミン、7mMホ
スフェート、100mM NaClおよび1mM EDTAを含むバッファ
ー中1mMイミノチオランとpH8および０℃において１時間
反応させる。［ブラッター等、バイオケミストリー 2
4、1517（1985）］。IgG1モルにつきチオール１モルを
含むチオール化抗体を未反応イミノチオランからゲルろ
過によって分離し、窒素下に貯える。
配列２（プロモーターマイナス鎖）の５′シスタミン
アダクツ（0.01〜1.00DU）をトリス−EDTAバッファー
（pH7）10μｌ中の5mM DDTによって室温において１時間
処理する。次に、2,2′−ビリジルジスルフィドの3mM溶
液40μｌを加える。室温において１時間後に、５′−
（２−pyr）−SS−プロモーターマイナス鎖をゲル電気
泳動によって精製する。
アダクツ（0.01〜1.00DU）をトリス−EDTAバッファー
（pH7）10μｌ中の5mM DDTによって室温において１時間
処理する。次に、2,2′−ビリジルジスルフィドの3mM溶
液40μｌを加える。室温において１時間後に、５′−
（２−pyr）−SS−プロモーターマイナス鎖をゲル電気
泳動によって精製する。
５′−（２−pyr）−SS−プロモーター補体0.01〜1.0
0DUとチオール化抗風疹IgG1μＭとを含む溶液400μｌを
1mM NaCl、1mMトリスおよび0.1mM EDTAを含むバッファ
ーに対してpH7.2において１時間透析する。溶液を次に
スピードバク濃縮器において10μｌに濃縮し、室温に１
晩放置する。これを次にDEAEカラムに塗布する。未反応
IgGをpH7の50mMトリスによって溶出し、IgG−プロモー
ター補体アダクツを0.25M NaClを含む同バッファーによ
って溶出する。未反応オリゴヌクレオチドを0.5M NaCl
含有バッファーによって溶出する。
0DUとチオール化抗風疹IgG1μＭとを含む溶液400μｌを
1mM NaCl、1mMトリスおよび0.1mM EDTAを含むバッファ
ーに対してpH7.2において１時間透析する。溶液を次に
スピードバク濃縮器において10μｌに濃縮し、室温に１
晩放置する。これを次にDEAEカラムに塗布する。未反応
IgGをpH7の50mMトリスによって溶出し、IgG−プロモー
ター補体アダクツを0.25M NaClを含む同バッファーによ
って溶出する。未反応オリゴヌクレオチドを0.5M NaCl
含有バッファーによって溶出する。
上記説明は本発明の実施に用いることのできる特定の
方法を詳述し、最も良い形式を示すものである。しかし
本文中に記載された上記詳細な説明に関してこれが本発
明の全範囲を限定するものと見なすべきではなく、本発
明の範囲は請求の範囲の法律上有効な構成によってのみ
定められるものである。
方法を詳述し、最も良い形式を示すものである。しかし
本文中に記載された上記詳細な説明に関してこれが本発
明の全範囲を限定するものと見なすべきではなく、本発
明の範囲は請求の範囲の法律上有効な構成によってのみ
定められるものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 オーゲル，レスリー・エリーザー アメリカ合衆国カリフォルニア州92037, ラ・ホーラ，テリーヒル・ドライブ 6102 (56)参考文献 特表 平２−500565（ＪＰ，Ａ) Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．239，Ｐ. 491−494（Ｊａｎｕａｒｙ，1988) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68 - 1/70 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (21)
- 【請求項１】標的分析物の存在をRNAの製造の誘発によ
って報告するハイブリッド化アッセイに有用な付加物で
あって、標的とハイブリッド化しうるオリゴヌクレオチ
ド配列を含み、前記オリゴヌクレオチドが転写プロセス
を開始しうる部分に結合しており、前記部分が、RNAポ
リメラーゼと、検出可能なRNAをコードするDNA配列に作
用可能に結合したプロモーターセグメントを含むDNAセ
グメントとから成る群から選択されたものである付加
物。 - 【請求項２】標的とハイブリッド化しうるオリゴヌクレ
オチド配列が、DNA依存性RNAポリメラーゼと結合してお
り、該DNA依存性RNAポリメラーゼは、前記付加物のオリ
ゴヌクレオチドから任意に開裂されたときに、複製可能
なRNAをコードするDNA配列と作用可能に結合したプロモ
ーター配列を有するDNAセグメントの転写を開始しうる
ものである請求項１記載のオリゴヌクレオチド−RNAポ
リメラーゼ付加物。 - 【請求項３】標的とハイブリッド化しうるオリゴヌクレ
オチド配列が、複製可能なRNAをコードするDNA配列と作
用可能に結合したプロモーターセグメントを含むDNAセ
グメントと結合し、該プロモーター含有DNAセグメント
が、付加物のオリゴヌクレオチドから任意に開裂された
ときに、対応RNAポリメラーゼによって転写されて複製
可能なRNA転写体を製造する請求項１記載のオリゴヌク
レオチド−プロモーター含有付加物。 - 【請求項４】前記オリゴヌクレオチド配列がヒト免疫欠
損ウイルスに対応するDNAセグメントである請求項２ま
たは３に記載の付加物。 - 【請求項５】前記オリゴヌクレオチド配列が欠陥遺伝子
のセグメントである請求項２または３に記載の付加物。 - 【請求項６】前記RNAポリメラーゼがT7RNAポリメラーゼ
である請求項２または３に記載の付加物。 - 【請求項７】前記RNAポリメラーゼがSP6RNAポリメラー
ゼである請求項２または３に記載の付加物。 - 【請求項８】核酸含有サンプル中の少なくとも一つの特
定核酸標的配列の検出のために有用な方法であって、プ
ロモーターと作用可能に結合したDNA配列の転写生成物
である自己複製RNA転写体の検出から成り、前記プロモ
ーターが前記標的核酸配列とハイブリダイズすることが
できる付加物中においてオリゴヌクレオチドを伴うDNA
依存RNAポリメラーゼによって認識され、または、前記
プロモーターが前記標的核酸配列とハイブリダイズする
ことができる付加物中においてオリゴヌクレオチドを伴
う方法。 - 【請求項９】前記複製RNA転写体が転写と自己複製との
生成物である請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】核酸含有サンプル中の少なくとも一つの
特定核酸標的配列の検出のために有用な方法であって、
次の段階： 前記標的配列に、DNA依存性RNAポリメラーゼに機能的に
結合した、配列において前記標的配列に対応するオリゴ
ヌクレオチドプローブを含む付加物をハイブリッド化す
る段階； 非ハイブリッド化付加物を除去する段階； 前記RNAポリメラーゼを、複製可能なRNA配列をコードす
るDNA配列に作用可能に結合した前記RNAポリメラーゼに
よって識別されるプロモーターを含む二重鎖DNAと接触
させて、複製可能なRNA転写体を製造する段階； 前記複製可能なRNA転写体を、複製可能なRNAの複製を触
媒作用しうるRNA依存性RNAポリメラーゼと接触させて複
製RNA転写体を製造する段階；および、 複製されたRNA転写体を検出する段階 から成る方法。 - 【請求項１１】核酸含有サンプル中の少なくとも一つの
特定核酸標的配列の検出のために有用な方法であって、
次の段階： 前記標的配列に、複製可能なRNAをコードするDNA配列に
機能的に結合した、プロモーターセグメントに機能的に
結合した、配列において前記標的配列に対応するオリゴ
ヌクレオチドプローブを含む付加物をハイブリッド化す
る段階； 非ハイブリッド化付加物を除去する段階； 前記プロモーターにDNA依存性RNAポリメラーゼを接触さ
せて、複製可能なRNA転写体を製造する段階； 前記複製可能なRNA転写体を複製可能なRNAの複製を触媒
作用しうるRNA依存性RNAポリメラーゼと接触させて複製
RNA転写体を製造する段階；および 複製されたRNA転写体を検出する段階 から成る方法。 - 【請求項１２】前記サンプル中に含まれる標的配列の量
を測定するために、検出された複製転写体を標準方法で
測定する請求項10または11に記載の方法。 - 【請求項１３】遺伝的または病原性疾患もしくは状態の
特徴に関係した核酸配列中に前記標的配列が存在する請
求項10または11に記載の方法。 - 【請求項１４】前記核酸配列がヒト免疫欠損ウイルスに
対応するDNAセグメントである請求項13に記載の方法。 - 【請求項１５】前記核酸配列が欠陥遺伝子のセグメント
である請求項13に記載の方法。 - 【請求項１６】前記RNAポリメラーゼがT7RNAポリメラー
ゼである請求項10または11に記載の方法。 - 【請求項１７】前記RNAポリメラーゼがSP6RNAポリメラ
ーゼである請求項10または11に記載の方法。 - 【請求項１８】前記の検出された複製転写体を検出前に
標識する請求項10または11に記載の方法。 - 【請求項１９】前記転写体を放射能標識する請求項18記
載の方法。 - 【請求項２０】前記転写体が標識された発色団である請
求項18記載の方法。 - 【請求項２１】核酸含有サンプル中の少なくとも一つの
特定核酸標的配列の検出のために有用なキットであっ
て、自己複製可能なRNAをコードするDNA配列と機能的に
結合したプロモーターセグメントを含むDNAセグメント
から製造された自己複製RNA転写体を検出することを含
み、前記プロモーターが前記標的核酸配列とハイブリッ
ド化しうるオリゴヌクレオチドプローブと付加物として
結合したDNA依存性RNAポリメラーゼによって識別されや
すいか、または前記標的核酸配列とハイブリッド化しう
るオリゴヌクレオチドプローブと付加物として結合した
DNAセグメントを含有し、かつ前記プローブをハイブリ
ッド化し、前記ハイブリッド化プローブの結合部分を利
用して前記DNA分子の転写を開始または誘発して、それ
から前記複製可能なRNA転写体を製造し、前記サンプル
中の前記標的配列の存在を検出し、又はその存在量を測
定する手段を含むキット。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US24194288A | 1988-09-08 | 1988-09-08 | |
| US24196988A | 1988-09-08 | 1988-09-08 | |
| US241942 | 1988-09-08 | ||
| US241969 | 1988-09-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04500457A JPH04500457A (ja) | 1992-01-30 |
| JP2939485B2 true JP2939485B2 (ja) | 1999-08-25 |
Family
ID=26934704
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1509398A Expired - Lifetime JP2939485B2 (ja) | 1988-09-08 | 1989-09-06 | 複製ｒｎａに基づく増幅／検出系 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5532126A (ja) |
| EP (1) | EP0433363A4 (ja) |
| JP (1) | JP2939485B2 (ja) |
| ES (1) | ES2018916A6 (ja) |
| WO (1) | WO1990002819A1 (ja) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5503979A (en) * | 1984-05-25 | 1996-04-02 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method of using replicatable hybridzable recombinant RNA probes |
| US5356774A (en) * | 1986-04-16 | 1994-10-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Replicative RNA-based amplification/detection systems |
| US5359100A (en) * | 1987-10-15 | 1994-10-25 | Chiron Corporation | Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers |
| US5656731A (en) * | 1987-10-15 | 1997-08-12 | Chiron Corporation | Nucleic acid-amplified immunoassay probes |
| CA1339991C (en) * | 1988-09-08 | 1998-08-11 | The Trustees Of Columbia University | Replicative rna-based amplification/detection system |
| CA2001110A1 (en) * | 1988-11-18 | 1990-05-18 | Zvi G. Loewy | Compositions and process for amplifying and detecting nucleic acid sequences |
| DE69131596T2 (de) | 1990-01-10 | 1999-12-23 | Chiron Diagnostics Corp | Dns-abhängige rns-polymerase-transkripte als reportermoleküle zur signalverstärkung in nukleinsäure-hybridisierungsuntersuchungen |
| IE911534A1 (en) * | 1990-05-04 | 1991-11-06 | Chiron Corp | Protein-nucleic acid probes and immunoassays using same |
| WO1991018117A1 (en) * | 1990-05-23 | 1991-11-28 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Replicatable hybridizable recombinant rna probes and hybridization assay |
| AU738261B2 (en) * | 1990-12-31 | 2001-09-13 | Promega Corporation | Nucleic acid amplification with DNA-dependent RNA polymerase activity of RNA replicases |
| AU9165091A (en) * | 1990-12-31 | 1992-08-17 | Promega Corporation | Nucleic acid amplification with dna-dependent rna polymerase activity of rna replicases |
| US6100024A (en) * | 1991-02-08 | 2000-08-08 | Promega Corporation | Methods and compositions for nucleic acid detection by target extension and probe amplification |
| US6200753B1 (en) * | 1993-06-03 | 2001-03-13 | Intelligene Ltd. | Detection of nucleic acid sequences |
| US5871914A (en) * | 1993-06-03 | 1999-02-16 | Intelligene Ltd. | Method for detecting a nucleic acid involving the production of a triggering RNA and transcription amplification |
| US20050123926A1 (en) * | 1994-01-13 | 2005-06-09 | Enzo Diagnostics, Inc., | In vitro process for producing multiple nucleic acid copies |
| CA2140081C (en) * | 1994-01-13 | 2008-04-01 | Dean L. Engelhardt | Process, construct and conjugate for producing multiple nucleic acid copies |
| DE4409436A1 (de) * | 1994-03-19 | 1995-09-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Bearbeitung von Nukleinsäuren |
| FR2723591B1 (fr) * | 1994-08-10 | 1996-09-20 | Cis Bio Int | Methode d'amplification et/ou de detection d'une sequence d'acide nucleique, reactif de detection et ses applications. |
| US5665545A (en) * | 1994-11-28 | 1997-09-09 | Akzo Nobel N.V. | Terminal repeat amplification method |
| US6232104B1 (en) | 1999-08-17 | 2001-05-15 | Dade Behring Inc. | Detection of differences in nucleic acids by inhibition of spontaneous DNA branch migration |
| WO2005077125A2 (en) * | 2004-02-11 | 2005-08-25 | Applera Corporation | Methods and compositions for detecting nucleic acids |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4495280A (en) * | 1981-05-20 | 1985-01-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Cloned high signal strength promoters |
| US4556643A (en) * | 1982-07-26 | 1985-12-03 | Agracetus | Assay method and probe for polynucleotide sequences |
| US4859601A (en) * | 1984-03-05 | 1989-08-22 | Smithkline Beckman Corporation | Streptomyces Bgl protein gene promoter |
| US4957858A (en) * | 1986-04-16 | 1990-09-18 | The Salk Instute For Biological Studies | Replicative RNA reporter systems |
| US4647529A (en) * | 1984-06-01 | 1987-03-03 | Rodland Karin D | Hybridization method of detecting nucleic acid sequences with probe containing thionucleotide |
| US4761367A (en) * | 1984-11-07 | 1988-08-02 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Vectors suitable for detection of eukaryotic DNA regulatory sequences |
| IL86724A (en) * | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
| CA1339991C (en) * | 1988-09-08 | 1998-08-11 | The Trustees Of Columbia University | Replicative rna-based amplification/detection system |
-
1989
- 1989-09-06 JP JP1509398A patent/JP2939485B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-06 EP EP19890910273 patent/EP0433363A4/en not_active Withdrawn
- 1989-09-06 WO PCT/US1989/003833 patent/WO1990002819A1/en not_active Application Discontinuation
- 1989-09-08 ES ES8903082A patent/ES2018916A6/es not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-09-27 US US08/127,986 patent/US5532126A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0433363A1 (en) | 1991-06-26 |
| US5532126A (en) | 1996-07-02 |
| JPH04500457A (ja) | 1992-01-30 |
| EP0433363A4 (en) | 1992-05-06 |
| ES2018916A6 (es) | 1991-05-16 |
| WO1990002819A1 (en) | 1990-03-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2939485B2 (ja) | 複製ｒｎａに基づく増幅／検出系 | |
| JP2846018B2 (ja) | 核酸配列の増幅および検出 | |
| JP3205555B2 (ja) | 複製型ｒｎａのターゲット依存合成 | |
| US6048687A (en) | Cycling DNA/RNA amplification electrochemiluminescent probe assay | |
| EP0373960B1 (en) | Self-sustained, sequence replication system | |
| JP3903059B2 (ja) | Ｈｃｖ核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー | |
| JPH04503451A (ja) | 自己持続性、配列複製システム | |
| JPH02500565A (ja) | 転写に基づいた核酸増幅／検出系 | |
| JP3968810B2 (ja) | 核酸配列分析方法 | |
| US5620851A (en) | Replicative RNA-based amplification/detection systems | |
| KR20040036676A (ko) | 시그날링 압타머의 시험관내 선별 방법 | |
| JPH04211400A (ja) | 修飾核酸の製造方法 | |
| JP3071797B2 (ja) | 複製ｒｎａベースの増幅／検出系 | |
| US20050181430A1 (en) | Rapid nucleic acid assay | |
| JP3020602B2 (ja) | ターゲット核酸増幅／検出システム | |
| US5631129A (en) | Target nucleic acid amplification/detection systems and methods for the use thereof | |
| WO1990003445A1 (en) | Target nucleic acid amplification/detection systems | |
| US7049067B2 (en) | Oligonucleotide for detection of HIV-1 and detection method | |
| JP3146565B2 (ja) | 核酸の検出方法 | |
| US20020123038A1 (en) | Oligonucleotide for highly sensitive detection of hepatitis C virus and method for detection thereof | |
| JPH04135491A (ja) | オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた非ａ非ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の検出方法 |